Introducción al estudio de las Proteínas

Introducción al estudio de las Proteínas

Introducción al estudio de las proteínas

Mulder (1838):

Describe un material presente en todos los seres vivos, con la siguiente composición porcentual en peso:

C: 55 % H: 6.5 % O: 22 % N: 15 % S: 0.5 %

Dado el contenido en azufre (0.5 %) el peso molecular mínimo dedicho material debería ser 32*100/0.5 = 6400

Las proteínas son susceptibles de hidrólisis ácida:

HCl 6N, 90ºC, 18 horas

En el hidrolizado aparecen aminoácidos, compuestos quecontienen una función amino -NH2 y una función carboxilo,-COOH

En las proteínas hay 20 aminoácidos distintos: los llamadosaminoácidos proteicos

Hay asimismo muchos otros aminoácidos que no forman partede proteínas, los aminoácidos no proteicos

Con frecuencia los aminoácidos proteicos aparecen modificados:son las modificaciones postraduccionales

H2N C

H

R1

COOH H2N C

H

COOH

R2

H2N C

H

COOH

R3

H2N C

H

R1

CO NH C

H

CO

R2

NH C

H

R3

COOH + 2H2O

Teoría del Enlace Peptídico

H2NC

CN

CC

NC

COOH

R1

O

H

Ri

O

H

Rn

HH

H

n-2

N-término

C-término

Teoría del Enlace Peptídico - Pruebas experimentales, 1

1. Las proteínas nativas tienen relativamente pocos gruposácido-base titulables. A medida que progresa su hidrólisis, van apareciendo grupos -NH2 y -COOH en cantidad equimolar

2. En hidrolizados parciales se encuentran di- y tripéptidos cuya estructura puede determinarse directamente

3. Las enzimas que hidrolizan proteínas (tripsina, quimotripsina,pepsina, papaína) atacan al enlace -CO-NH-, tal como puede observarse en compuestos sintéticos (p.e. BAPNA)

4. Las proteínas dan positiva la reacción de biuret

Funciones biológicas de las proteínas

- Biocatalizadores (enzimas)- Receptores de señales químicas- Transportadores- Estructurales (citoesqueleto, colágeno)- Defensa (inmune, restricción bacteriana, etc.)- Motilidad (motores moleculares)- Transducción- Adherencia celular y organización tisular- Plegamiento correcto de otras proteínas- Otras: anticongelante

Clasificación de las proteínas

I. Según solubilidad (obsoleta): Albúminas, Globulinas, Prolaminas, Gliadinas, Escleroproteínas, etc.

II. Según presencia o no de un grupo prostético: Proteínas simples y Proteínas conjugadas Holoproteína = Apoproteína + Grupo prostético

III. Según presencia o no de subunidades: Proteínas monoméricas y proteínas oligoméricas

IV. Según estructura global: Proteínas fibrosas y proteínas globulares

Aminoácidos

COO-

C

R

H3N+ H

AminoácidosGrupo carboxilo

(disociado)

Grupo amino(protonado)

Cadenalateral

Carbono

L-Alanina L-Gliceraldehido

Aminoácidos: estereoisomería

CH2N H

COOH

R

CHO H

CHO

CH2OH

L-Alanina D-Alanina

Aminoácidos: estereoisomería

C

COO-

+H3N H

CH3

C

COO-

CH3

NH3+H

COO-

C+H3N H

CH OH

CH3

COO-

C+H3N H

CH CH3

CH2

CH3

L-Treonina L-Isoleucina

COO-

CH3N+ H

H

COO-

CH3N+ H

CH3

COO-

CH3N+ H

CHH3C CH3

GlicinaGly, G

NE

AlaninaAla, A

NE

ValinaVal, V

E

Aminoácidos alifáticos o neutros, 1

Aminoácidos alifáticos o neutros, 2

COO-

CH3N+ H

CH2

CHH3C CH3

COO-

CH3N+ H

CHH3C CH2

CH3

LeucinaLeu, L

E

IsoleucinaIle, I

E

Aminoácidos alifáticos

Su característica fundamental es la hidrofobicidad dela cadena lateral (con excepción de G)

Suelen ocupar el interior de las proteínas globulares, donde contribuyen a la estructura global de la proteínadebido al efecto hidrofóbico (“micela proteica”)

Reactividad química muy escasa

Glicina tiene un destacado papel estructural: suele serinvariante en series filogenéticas

COO-

CH3N+ H

CH2

COO-

CH3N+ H

CH2

OH

COO-

CH3N+ H

CH2

NHFenilalanina

Phe, FE

TirosinaTyr, Y

NETriptófano

Trp, WE

Aminoácidos aromáticos

Aminoácidos aromáticos

La presencia de sistemas aromáticos hace que absorbanluz UV en torno a 280 nm; la absorción UV de las proteínasse debe a su contenido en estos aminoácidos

F y W son hidrofóbicos

COO-

CH3N+ H

CH2OH

COO-

CH3N+ H

C OHH

CH3

SerinaSer, S

NE

TreoninaThr, T

E

Hidroxiaminoácidos

Hidroxiaminoácidos

El grupo -OH de la serina es fundamental en el centroactivo de muchas enzimas (serin proteinasas, p.e.)

Forma enlaces glicosídicos con oligosacáridos en ciertasglicoproteínas

El grupo -OH tanto de S como de T es susceptible defosforilación: importante modificación postraduccionalque regula la actividad de muchas proteínas

COO-

CH3N+ H

CH2

SH

COO-

CH3N+ H

CH2

CH2

S

CH3

CisteínaCys, C

NE

MetioninaMet, M

E

Tioaminoácidos

Tioaminoácidos

Importante papel estructural de la cisteína por la posibilidad de formar enlaces disulfuro con otro residuo de cisteína

La cisteína participa en el centro activo de muchasenzimas

La metionina es el aminoácido iniciador de la síntesisde proteínas (codon AUG)

Aminas secundarias (“Iminoácidos”)

ProlinaPro, P

NE

NH2+

COO-

Prolina

Importante papel estructural: su presencia dificultala formación de estructura secundaria

Por esa misma razón suele ser invariante en seriesfilogenéticas

Como tal o modificado por hidroxilación (4-hidroxi-prolina) es muy abundante en el colágeno

COO-

CH3N+ H

CH2

COO-

COO-

CH3N+ H

CH2

CONH2

COO-

CH3N+ H

CH2

CH2

COO-

COO-

CH3N+ H

CH2

CH2

CONH2

Ác.AspárticoAsp, P

NE

AsparraginaAsn, N

NE

Ác.GlutámicoGlu, E

NE

GlutaminaGln, Q

NE

Aminoácidos dicarboxílicos y amidas

Aminoácidos dicarboxílicos y sus amidas

Todos ellos son importantísimos intermediarios en elmetabolismo nitrogenado, sobre todo E y Q

Forman parte del centro activo de las glicosidasas y de las serin enzimas (tríada SHD)

Proveen a la proteína de superficies aniónicas quesirven para fijar cationes (p.e., Ca++)

COO-

CH3N+ H

CH2

CH2

CH2

CH2

NH3+

COO-

CH3N+ H

CH2

CH2

CH2

NH

C+H2NNH2

COO-

CH3N+ H

CH2

HNNH+

LisinaLys, K

E

ArgininaArg, RE(?)

HistidinaHis, H

E

Aminoácidos dibásicos

Aminoácidos dibásicos

Lisina sirve para formar intermediarios covalentes encatálisis enzimática (bases de Schiff)

Lisina es el aminoácido que une determinadas coenzimasa la estructura de la proteína

Arginina es un importante intermediario en el ciclo dela urea

Histidina forma parte del centro activo de muchas enzimas,debido al carácter nucleófilo del imidazol

Histidina contribuye al tamponamiento de los medios biológicos por tener un pKa cercano al pH intracelular

Aminoácidos apolares o hidrofóbicos:

- A, V, L, I, F, W, M, P

Aminoácidos polares sin carga eléctrica:

- G, Y, S, T, C, N, Q

Aminoácidos polares con carga eléctrica:

- Aniónicos (-): D, E- Catiónicos (+): K, R, H

Clasificación de aminoácidos según polaridad

C

COO-

+H3N H

CH2

OH

HO

Aminoácidos no proteicos: DOPA

L-DOPA(dihidroxifenilalanina)

Catecolaminas

Hormonastiroideas

Melanina

COO-

CH2

CH2

NH3+

COO-

CH2

CH2

CH2

NH3+

-Aminoácidos

-Alanina GABA-Aminobutirato

Propiedades de las proteínas

Base añadida (uu.arbitrarias)

0 20 40 60 80 100

pH

0

2

4

6

8

10

12

14

Titulación ácido-base de una proteína

pI

Carga positiva neta

Carga negativa neta

Grupos disociables de una proteína

Ácidos(aniónicos, - )

Asp 3.86Cys 10.78Glu 4.25Tyr 10.07

Básicos(catiónicos, + )

Arg 12.48His 6.00Lys 10.53

Aniónicos: carga negativa neta por encima de su pKa

Catiónicos: carga positiva neta por debajo de su pKa

(Se indica el pKa de la cadena lateral en cada caso)

Proteínas ácidas: punto isoeléctrico (pI) inferior a 7Ricas en Asp y Glu; al pH celular presentancarga negativa neta.

Proteínas básicas: punto isoeléctrico (pI) superior a 7Ricas en Arg y Lys; al pH celular presentancarga positiva neta.

En el medio biológico, son, porlo general, más abundantes lasproteínas ácidas.

Electroforesis

1. Se realiza sobre un soportesólido o semisólido, para mini-mizar efectos de difusión

Muestra

+-2. Se somete el conjunto aun campo eléctrico constante, a un pH fijo; las proteínas migranconforme a su carga eléctrica

3. Terminada la carrera electro-forética, las proteínas se tiñencon un colorante adecuado(p.e., Azul de Coomassie)

Fundamento de la cromatografíaMuestra:

tres componentesmezclados

Fase móvil

Faseestacionaria

Se hace fluir una fasemóvil sobre la estacionaria

Dependiendo de la afinidadrelativa por ambas fases, loscomponentes de la mezcla

primitiva se separan

Se dispone una mezclasobre una fase estacionaria

1. Intercambio iónico- Separa según carga eléctrica- Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insoluble- Fase móvil: gradiente de sal o de pH

2. Partición- Separa según solubilidad en solventes- Fase estacionaria: Un solvente sobre un soporte sólido- Fase móvil: El otro solvente fluyendo

Tipos de cromatografía

3. Afinidad- Separa según la afinidad de la proteína por un ligando inmovilizado- Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble- Fase móvil: (1) solución sin ligando (2) solución con ligando libre

4. Hidrofóbica- Separa según hidrofobicidad- Fase estacionaria: grupos hidrofóbicos unidos a un soporte insoluble- Fase móvil: gradiente inverso de sal

5. Exclusión molecular- Separa según tamaño molecular- Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados- Fase móvil: solución tamponada

+

+

+

+

++

+

+

+

---

-

----

--

-

+

+

+

+

++

+

+

+

-

--

-

---

---

- -- -

-

-

--

-

+

+

+

+

++

+

+

+

-

-

--

-

-

---

-

-

---

-

- -

--

-

Proteínas adsorbidasal intercambiador

iónico

A baja concentraciónde sal, se desprenden las proteínas menos

electronegativas

A mayor concentraciónde sal se desprenden

las proteínas máselectronegativas

Intercambio iónico

O

OH

HOCH2

OHH

H

HOO

O

OH

HOCH2

OH

O

H

H

H

H

nCelulosa

O

O

H

H

OH

CH2

O

H

O

O

OH

OH

HOCH2

H

O

H

H

n

AgarosaO

OH

CH2

OH

H

HOH

O

OH

OH

H

H

CH2

O

H

O

H

H

OH

H

O

n

Dextrano

Soportescromatográficos

CH2 CH2 NH+CH2

CH2 CH3

CH3

Dietilaminoetil (DEAE)

CH2 CH2 N+ CH2 CH3

CH2

CH3

CH2

CH3

Trietilaminoetil (TEAE)

CH2 CH2 N+ CH2

CH2

CH3

CH2

CH3

CHOH CH3

Dietil 2-hidroxipropil aminoetil (QAE)

CH2 COO-

Carboximetil (CM)

CH2 CH2 S

O

O

O-

Sulfoetil (SE)

CH2 CH2 CH2 S

O

O

O-

Sulfopropil (SP)

O P

O

O-

O-

Fosfo (P)

Bo m b a p e ristá ltic a

G e ne ra d o rd e g ra d ie nte

C o lum na

C o le c to r d efra c c io ne s

Re sina d einte rc a m b ioió nic o

Cromatografía deintercambio iónico

O

O HN NH

SO3-

N

N

N

NH

SO3-

O CH2

Cibacron Blue F3GA

Matriz de agarosa

Cromatografía de adsorción a colorantes

1 2 3

Cromatografía de afinidad

Solubilidad

pHpI

Punto isoeléctrico

Solubilidad

Fuerzaiónica, (M)

Salting in

Salting out

Solubilidad,g/L

Temperatura, ºC

00 100

100

Peso molecular de las proteínas

1. Métodos primitivos: presión osmótica, ultracentrifugación analítica, etc.

2. Cromatografía de exclusión molecular

3. Electroforesis SDS-PAGE

4. Cálculo directo a partir de estructura primaria

Cromatografía de exclusión molecular

Glucagon

Citocrom o c

Ribonucleasa

Seroalbúm ina

IgGTiroglobulina

Volumen

Peso molecular

280

240

200

160

120

80

40

103

104

105

106

BSDS

M ovilidad (cm)

Pesom olecular

Electroforesis en poliacrilamida-SDS (PAGE)

+

-

+

-

+

-

Método de Kjeldahl

Digestión ácida total de la proteína y conversión cuantitativa de nitrógeno

a NH3, que se valora por titulación.

Poco sensible. En desuso. Se sigue empleando para análisis

elemental (p.e., alimentos)

Proteína total= N x 100/16

Absorción a 280 nm

Se fundamenta en la absorción a 280 nm producidapor los aminoácidos aromáticos Phe, Tyr y Trp

- Sensible y fácil de practicar- Requiere soluciones puras de proteína; no es aplicable a mezclas- Distintas proteínas dan diferente grado de absorción, dependiendo de su contenido en aa. aromáticos

H2N C

O

NC

O

NH2

H O

C

NH

C

O

HN

HN

-O

C

HN

C-O

NH

NH

Cu++

OHH

OHH

BiuretComplejo cúprico coloreado

Reacción del biuret

Al tratar con Cu++ en medio alcalino, los compuestoscon grupos -CO-NH- dan una coloración violeta.Muy específica; relativamente poco sensible

Método de Lowry

Reacción en dos fases:

1. Reacción del biuret2. Tratamiento con reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteu

- Muy sensible (muestras de 10 g) y sencillo- Resultados variables con distintas proteínas, pues depende del contenido en aminoácidos aromáticos

400 500 600

0.2

0.3

0.4

400 500 600

0.2

0.3

0.4

700

Colorante Colorante + proteína

Método de Bradford

La fijación de un colorante (Azul de Coomassie) a una proteínamodifica las características de absorción visible de aquél.

Sensible, fácil de practicar y resultados muy constantes