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Introduction aux radicaux libres et espèces réactives de l’oxygène. Pr H Puy. OXYGENE espèces réactives de l'oxygène (ROS). Il existe des micro-organismes pour lesquels l’oxygène est inutile, et même toxique: anaérobies. - PowerPoint PPT Presentation
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Introduction aux radicaux libres et espèces réactives de l’oxygène
Pr H Puy
OXYGENEespèces réactives de l'oxygène (ROS)
Il existe des micro-organismes pour lesquels l’oxygène est inutile, et même toxique: anaérobies.
L’oxygène est indispensable à la vie des êtres pluricellulaires (aérobies)
L’oxygène est nécessaire à au Tfert d’e- couplé aux phosphorylations oxydatives : source principale de leur énergie
L ’ANOXIE EST MORTELLE A COURT TERME
• Entraîne une chute de l’ATP cellulaire
• Les tissus résistent inégalement à l’anoxie : – Le cerveau est détruit en 3 minutes– Foie, rein et myocarde en qq heures– Muscle, peau et phanères, bcp plus tard.
CARACTERE TOXIQUE DE L ’OXYGENE
• Cependant, l’oxygène est toxique pour les organismes
• Son utilisation requiert des mécanismes protecteurs
• Le caractère toxique de l’oxygène participe à la pathogénie de nombreuses maladies
ROS: PRODUITS ACCIDENTELS
• Toutes les réactions impliquant O2 et des ions métalliques peuvent induire des «bavures»
• En particulier les flavoprotéines, et surtout les oxydases
Principales ROS
• ROS (Reactive Oxygen Species)
– Ion superoxyde (O2-.)
– Radical hydroxyle (OH.)– Ion hydroxyle (OH-), – Peroxyde d ’hydrogène (H2O2)
• Origines : chaînes respiratoires mais pas uniquement
Un radical libre (RL) est constitué par tout atome, groupe d’atomes ou molécules où au moins un électron non apparié occupe une orbitale externe []
Le radical s’en trouve doté d’une réactivité particulière et peut ainsi réagir avec d’autres atomes ou molécules et se comporter, selon le cas, comme un oxydant ou comme un réducteur, afin d’apparier son électron célibataire
Notion de radical libre et définitions I
L'oxygène moléculaire diatomique (O2) joue un rôle essentiel dans le métabolisme aérobie comme accepteur terminal d’électrons
O2 peut former des espèces partiellement réduites, les espèces oxygénées réactives [EOR] radicalaires ou non:
anion superoxyde (O2º-), peroxyde d'hydrogène (H2O2) et radical hydroxyle (HOº)
Les espèces oxygénées réactives sont des produits normaux du métabolisme. Leur production basale correspondrait à 3 % de la quantité totale d'oxygène consommé
Notion de radical libre et définitions II
Le stress oxydant est observé lorsque la production des espèces oxygénées réactives dépasse les capacités de défense des tissus
Il entraîne des altérations des composants cellulaires, dues aux réactions chimiques des espèces oxygénées réactives avec les lipides, les protéines et les acides nucléiques cellulaires
Notion de radical libre et définitions III
un "radical libre" (RL) est une espèce chimique - qui possède un électron non apparié ('célibataire') - qui a une existence indépendante ('libre')
nb:
1/ un RL est généralement écrit R.
2/ certains radicaux sont électriquement neutres tandis que d'autres sont chargés : il existe des radicaux
cationiques R.+ et des radicaux anioniques R.-
Radicaux libres (RL)
Espèce réactives de l'oxygène (ROS) et Radicaux libres oxygénés (RLO)
Formes réactives de l'oxygène (ROS) _______________________________________________________
Formes radicalaires (RLO) Formes non radicalaires _______________________________________________________
superoxyde O°- peroxyde d'hydrogène H2O2
hydroxyle OH° acid hypochloreux HOClperoxyle ROO° ozone O3
alkoxyle RO° oxygène singulet 1ghydroperoxyle HOO° peroxynitrite ONOO-
_______________________________________________________
O2 O.-2
H2O2 HOCl
OH. 1O2
NADPH Oxydaseet autres systèmes
SOD ou Spontanée en+H+ MPO
NADPH NADP - + H + Fe2+ / Cu2+
LES FORMES REACTIVES DE L’OXYGENE (FRO/ROS)
O.-2 anion superoxyde; H2O2 péroxyde d’hydrogène ou eau oxygénée; OH.radical hydroxyl; HOCl acide
hypochloreux; 1O2 oxygène singulet, SOD superoxyde dismutase, MPO myélopéroxydase
Les radicaux libres (RLO): atomes ou molécules ayant un électron non apparié ou célibataireLes dérivés non radicalaires
Métabolites réactifs de l’oxygène
Toute fuite d’électrons en présence d’O2 conduità la formation d’ERO (Espèces Réactives de l ’Oxygène)
O2 H2O2
Métaux
Quinones
SOD
Fenton
Oxydases
Monooxygénases h 1O2
UVA
O2-. OH .
NO. ONOO-NOS
Arg
Demi Vie de Différentes EORDemi Vie de Différentes EOR
EspEspèèces rces rééactivesactives Demi-vieDemi-vie (s)(s) Demi-vieDemi-vie (s)(s)
Hydroxyl radical (OH)Alcoxyl radical (RO)Singlet oxygen (1O2)Peroxynitrite anion (ONOO-)Peroxyl radical (ROO)Nitric oxide (NO)Hydrogen peroxide (H2O2)
Superoxide anion (O2-)
Hypochlorous acid (HOCl)
Hydroxyl radical (OH)Alcoxyl radical (RO)Singlet oxygen (1O2)Peroxynitrite anion (ONOO-)Peroxyl radical (ROO)Nitric oxide (NO)Hydrogen peroxide (H2O2)
Superoxide anion (O2-)
Hypochlorous acid (HOCl)
1010-9-9
1010-6-6
1010-5-5
0.05 – 1.00.05 – 1.077
1 - 101 - 10spontan. heures/jourspontan. heures/jour
(accelere par enzymes)(accelere par enzymes)
spontan. heures/jourspontan. heures/jour(SOD accel. 10(SOD accel. 10-6-6))
1010-9-9
1010-6-6
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1 - 101 - 10spontan. heures/jourspontan. heures/jour
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spontan. heures/jourspontan. heures/jour(SOD accel. 10(SOD accel. 10-6-6))
Conc.Conc. PhysiolPhysiol (mol/l)(mol/l)Conc.Conc. PhysiolPhysiol (mol/l)(mol/l)
1010-9-9
1010-9 -9 - 10- 10-7-7
1010-12 -12 - 10- 10-11-11
L’oxygène singulet : Il existe sous deux formes :
• l’oxygène noté 1Σ g+ où les deux électrons célibataires sont de spin opposé. Cette forme très instable se transforme en :
• 1Δg non radicalaire
Formes activées de l’oxygène
L’anion super oxyde (O2º-) :
Par capture d’un électron, l’oxygène triplet est réduit en anion superoxyde
O2 + 1e- O2 º-
Il est produit majoritairement par la chaîne mitochondriale, mais également par les oxydases
Formes activées de l’oxygène
Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) :
Par réduction divalente de l’oxygène:
O2 + 2e- + 2H+ H2O2 (oxydases)
Par dismutation de O2.- :
2 O2º- + 2H+ H2O2 + O2
Le radical hydroxyle (OH.) :
La coexistence de l’anion superoxyde et du peroxyde d’hydrogène peut engendrer cette espèce oxygénée très réactive
Cette réaction est catalysée par des métaux de transition (comme Fe2+ et Cu+):
Réaction de Fenton
H2O2 + Fe2+ Fe3+ + OH- + OHº
Fe2+ est reconstitué par divers réducteurs dont l’anion superoxyde.
Fe3+ + O2- Fe2+ + O2
L’ensemble de ces réactions donne le bilan de Haber Weiss ou cycle de Haber Weiss.
H2O2 + O2º- O2 + OH- + OHº
L’acide hypochloreux (HOCl) :
Par l’action des myéloperoxydases, H2O2 donne naissance à HOCl au cours de la réaction suivante
H+ + Cl- + H2O2 HOCl + H2O
Pathologies inflammatoires: granulomatosesAbsence de MyeloperoxidaseAugmentation de la susceptibilite aux infections
Le monoxyde d’azote (NO) :
L-arginine + 2 NADPH + O2 L-citrulline + NOº + 2NADP+
La production concomitante de NOº et de superoxyde à un même site entraîne la formation du peroxynitrite (OONO-) qui est hautement cytotoxique
NOº + O2º- ONOO-
Synthèse des Voies de formation des EOR
Cyclo-oxygénases
Lipo-oxygénases
Echappement
chaîne respiratoire
Les multiples origines des ERO
•Physiologiques: respiration, hormones, cytokines, phagocytose
•Physiopathologiques: déficit en GSH, déficit enzymatique, maladie mitochondriale, inflammation
•Physique ou chimique: irradiation, xénobiotiques oxydants (médicaments, polluants)
•Autres stress: stress du réticulum, stress thermique, hypoxie,stress mécanique….
CERTAINES OXYDORÉDUCTASES UTILISENT L’O2 SANS PRODUCTION D’ÉNERGIE
• Les oxygénases fixent une molécule d’O2 sur les substrats
• Les oxydases oxydent les atomes d’hydrogène des substrats en H2O2
• Les hydroxylases fixent un OH sur une chaîne carbonée
Réactions de synthèse : hormones, neurotransmetteurs,….Réactions de dégradation : acides aminés aromatiques, cholestérol, hème, purines,….
Autres systèmes de productionAuto-oxydationCyclo-oxygénase et lipo-oxygénaseSystème de transport des électrons dans la
membrane nucléaireXanthine/xanthine oxydase
Hypoxanthine Guanine
Xanthine
Acide urique
Xanthineoxydase
O2
H2O2
O2.
Guanase
H2O
NH3
O2
H2O2
O2.
NAD+
NADH
NAD+
NADH
HN
NH NH
NH
O
O
O
Origine des EOR
Sources endogènes exogènes
peroxysome radiation, ultrasons
mitochondrie cigaretteautooxydation drogues
EOR
phagocytes chaleur oxyhemoglobine pesticides enzymes oxydantes infections detoxification hyperoxie,
exercice
pollution (NOx, O3)
Les mitochondries sont la principale source de production de radicaux libres
Exception pour le foie, où les microsomes sont les principaux producteurs
Mitochondries microsome peroxysome cytosol
45% 20% 30% 5%
Mitochondries microsome peroxysome cytosol
15% 45% 35% 5%
Chaîne respiratoire et production radicalaire au niveau mitochondrial
95%
3-5%
Tetraréduction
Monoréduction OH
Ion superoxyde
Peroxyde d ’hydrogène
Radicale hydroxyle
ROLES DES PEROXYSOMES
• Métabolisme des peroxydes, des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote
• Synthèse des plasmalogènes
-oxydation des acides gras
-oxydation des acides gras
• Métabolisme du glyoxylate
• Métabolisme des acides aminés (dégradation des isomères D des acides aminés, catabolisme de la L-lysine, dégradation des polyamines)
Oxydases peroxysomales
Glycolate oxydase, D-amino acide oxydase, urate oxydase…
Les peroxysomes utilisent une part importante de l’O2
Production majoritaire de l’ H2O2
Cytochrome P450 du réticulum endoplasmique
Réaction de mono-oxygenation:
A-H + O2 + NADPH,H+ A-OH + H2O + NADP+
Le réticulum endoplasmique est riche en cytochromes P450 impliqués dans les processus de détoxification.
P450FeIII P450 –FeIII-SH
2e- NADPHCytP450reductase
O2
P450-FeIII-SHO2
2-
P450-FeIII-SH + O2- et/ou H2O2P450-FeIII
SOH
Mécanisme génèse EROS
ROS ET DÉFENSE CONTRE LES MICRO-ORGANISMES
• Les globules blancs utilisent l’O2 pour tuer les bactéries qu’ils ont phagocytés
• Les monocytes et polynucléaires neutrophiles ont un mécanisme spécial pour créer des radicaux libres oxygénés
ROS et défenses anti-infectieuses
Comment se forment les RL, les RLO et les ROS ? (7)
Exemples de systèmes enzymatiques générateurs de ROS NADPH oxydase
P
Pp47
p67P
p40
Rac
GTP
gp91 p22Rap1A
Assemblage et activation de la NADPH oxydase des phagocytes d'après MH Paclet et F. Morel
PPP
p40
gp91p22
p47
PP
P
PP
p67
Rap1ARap1ARacGTP
activation
Complexe actif
NADPH + H+
NADP
O2
O2.-
H2O2 + Cl- HOCl + OHº
production O2º- , OH º
Activation des polynucleaires
NADPH + 2O2 2O2º- + NADP
+ + H +
La NADPH oxydase (FAD, cytochrome b)
H2O2
La myeloperoxydase
MEFAITS DES ROS
• Stimulées par les radiations ionisantes
• Mutations de l’ADN
• Peroxydation des lipides
• Altération des protéines
• Perturbent la transduction des signaux
• Modulent les gènes et les protéines de stress régulant la prolifération la différenciation cellulaire et l’apoptose
Les effets des ERO
•Effets physiologiques: croissance cellulaire, inflammation
•Effets toxiques: ADN, ARN, lipides, protéines
•Adaptation au stress oxydant: induction des gènes « anti-oxydants »répression des gènes « pro-oxydants »
Toxicité des ERO
•ADN: génotoxicité; 8-OH-Guanine, Mutagenèse, cancer
•ARN: oxydation et altération
•Lipides: peroxydation, toxicité des produits oxydés, signalisation, athérosclérose ?
•Protéines: oxydation des acides aminés (Cys, Met…) Nitrosylation (NO), Carbonylation dénaturation (protéines chaperon), agrégation, maladies dégénératives ?
•Glucides: glycation et dérivés Diabète
- Quelque exemples de dérivés d’oxydation des bases du DNA par les ROS.
Les cibles Moléculaires des espèces réactives de l'oxygène (ROS)
Les altérations du DNA peuvent induire des mutations ou la mort de la cellule
Exemples d’effets
des ROS sur les
lipides: exemple de la formation de l’isoprostane
Les cibles Moléculaires des espèces réactives de l'oxygène (ROS).
- Oxydation des lipides par les ROS
Les cibles Moléculaires des Radicaux libres (RL) et radicaux oxygénés (RLO),
espèces réactives de l'oxygène (ROS),
Aldéhydes dérivés d’acides gras polyinsaturés
Dérivés du cholestérol: oxystérols
- Exemples d’effets
des ROS sur les protéines:dérivés d’acides aminés
Les cibles moléculaires des espèces réactives de l'oxygène (ROS)
Les modifications des protéines peuvent induire des altérations fonctionnelles
Stress oxydant: adaptation et défense
•1ère ligne: molécules anti-oxydantes; GSH, Vit C, Vit E, biliverdine ….
•2ème ligne: induction ou répression des gènes Activités enzymatiques anti-oxydantes: GPx, Cat, SOD, Hox… Activités enzymatiques pro-oxydantes: CYP, oxydases… Réparation: ADN, protéines (Trx, Trx réductase, chaperon)
•Dernière ligne: apoptose
Adaptation cellulaire au stress oxydant
inductionde gènes
Répression de gènes
augmentation des enzymes
anti-oxydantes et de réparation
diminution des enzymes
productrices des espèces réactives
de l’oxygène
stressoxydant Adaptation
Toxicité: ADN,ARN Protéines Lipides
PROTECTIONS
Confinement en organelles
Protections non spécifiques
Protections spécifiques
CONFINEMENT EN ORGANELLES
• Mitochondrie
– COX, certaines oxydases
– Sensibilité de l’ADN mitochondrial
• Peroxysomes
– Contiennent de nombreuses oxydases
– Mais aussi catalases et peroxydases
Reparation des lipides oxydésExcision des bases oxydéesRéparation des protéines oxydées
En aval, non spécifique:les systèmes de réparation
PROTECTIONS NON SPECIFIQUES
• Certaines molécules naturelles se comportent comme des épurateurs de ROS (« scavengers»)
• Alcools et aldéhydes variés
• Glucose
• Acide urique, hème, bilirubine
• Bicarbonate
PROTECTIONS SPECIFIQUES
• L’évolution a sélectionné des mécanismes de protection qui ont permis l’aérobiose
• Vitamines antioxydantes
• Enzymes destructrices de ROS
• Le système Glutathion
VITAMINES ANTIOXYDANTES
• C’est une partie essentielle de leur rôle biologique
• Vitamines hydrophiles
– C’est l’acide ascorbique (vitamine C).
• Vitamines liposolubles
– vitamines A & E
• Vitamine E
Systèmes anti-oxydants non enzymatiques Systèmes anti-oxydants non enzymatiques (3)(3)
OCH3CH2(CH2CH2CHCH2)3H
R3
OH
R2
R1
CH3
Vitamine E
-tocophérol = R1, R2, R3 : CH3
-tocophérol = R1, R3 : CH3; R2 : H
-tocophérol = R1, R2 : CH3; R3 : H
-tocophérol = R1 : CH3; R2, R3 : H
- hydrosoluble- piégeur de radicaux superoxyde, hydroxyle, peroxyle- grande oxydabilité précautions lors du dosage
- carotène: anti-oxydant liposoluble, dosable dans plasma et lipoprotéines.
Systèmes anti-oxydants non enzymatiquesSystèmes anti-oxydants non enzymatiques
• Ubiquinol (coenzyme Q10) : anti-oxydant liposoluble
(particulièrement important dans la résistance des LDL à l’oxydation)
MeO
MeO
OH
(CH2-CH=C-CH2)10H
OH
CH3
H2O2
H2O + O2 H2O
O2.-
.OH
Superoxide
dismutases (Cu/Zn-Mn)
Catalase GSH-PeroxidaseGSH
GSSG
Fe2+ Fe3+
Première ligne de défense
Systèmes de Défense enzymatiques
ENZYMES PROTECTRICES DES ROS
• Superoxyde dismutases (SOD): Détruit l’ion
superoxyde O2.- en le métabolisant en H2O2 par une
réaction de dismutation :
2H+ + O2-. + O2
-. H2O2 + O2
• Trois isoenzymes :– SOD1 cytosolique CuZn-dépendante
– SOD2 Mitochondriale Mn-dépendante
– SOD3 extra-cellulaire CuZn-dépend.
• Peroxydases : RH + H2O2 --> ROH + H2O
Catalase
Ce sont des enzymes tétramériques, chaque unité portant une molécule d'hème et une molécule de NADPH
La réaction se fait en deux étapes:
Catalase-(Fe III) + H2O2 --------> O=Fe(IV)-E + H2
O=Fe(IV)-E + H2O2 --> Fe(III)-E + H2O
H2O2 2 H2O 2 ------------> O2 + 2 H2O
Les catalases sont présentes dans un grand nombre de tissus mais sont particulièrement abondantes dans le foie et les globules rouges
Elles sont localisées dans les peroxysomes et sont aussi impliquées dans la detoxification de
différents substrats
H2O2 + R’H2 R’ + 2H2OCat
– Le glutathion est un tripeptide (glycine, glutamate, cystéine)
– Dans toutes les cellules à des concentrations élevées
– Forme réduite: groupement –SH
– Forme oxydée: 2 tripeptides se lient de manière covalente (S-S, pont disulfure)
– 2 atomes d ’H libérés: H2O2 --> 2H20
LE SYSTEME GLUTATHION
Forme Réduite (GSH)
Le Glutathion: tripeptide formé à partir de glutamate, cysteine et glycine.
La forme réduite (GSH) maintien l’état réduit normal de la cellule.
LE SYSTEME GLUTATHION
Le produit de l’oxydation de la GSH conduit à un dimère lié par un pont disulfure: GS-SG.
L’enzyme glutathion reductase utilise le NADPH comme cofacteur pour réduire le GSSG en 2 GSH.
LE SYSTEME GLUTATHION
• Le Glutathion réduit H2O2 en deux étapes
• Glutathion peroxydase (GS Px Se ou glutathion-S-transférases non
sélénodépendantes) :
• H2O2 + 2GSH 2H2O + 1GSSG
• Il existe une Glutathion peroxydase cytosolique, une plasmatique, une gastrointestinale et un isoenzyme spécifique des
phospholipides oxydés: la HPGPx
• Glutathion réductase :
GS-SG + NADPH2 --> 2GSH + NADP+
Glutathion & Erythrocytes • GSH importance +++ en environnement oxygéné+fer => GR +++++
• RBCs matures n’ont pas de mitochondrie et sont dépendant de [NADPH] pour régénérer le GSH à partir du GSSG via la glutathion reductase.
• Plus de 10% du glucose consommé par les erythrocytes => voie des pentoses.
• Maintien des résidus cysteines de l’hémoglobine à l’état réduit.
• GSH essentiel pour la structure normale des RBC en gardant l’Hb sous forme Fe++
• Les GR à taux bas en GSH sont + hémolysables => Patients avec réduction GSH sont sujets à hémolyse accrue.
Système Thioredoxine /thioredoxine reductaseCofacteur: Acide lipoïque
Substratox
NADPH+H+ NADP+TrxR
Produitrex
Trx-S2Trx-(SH)2
Proteine-(SH)2 Proteine-S2
Thiorédoxine-SH GSHAcide Lipoique-SH...
Déhydro-lipoateGS-SGThiorédoxine oxydée…
EROS en pathologie: ORGANES CIBLES EROS en pathologie: ORGANES CIBLES
OO22--
HH22OO22
HOClHOClOOHH
intestinintestin
Coeur et Coeur et vaisseauxvaisseaux
Voies respiratoiresVoies respiratoires
Cerveau et Cerveau et nerfsnerfs
reinrein
NONO
PATHOLOGIES: CANCER• Les mutations sur l’ADN peuvent
activer des oncogènes
ou inactiver des antioncogènes
altérer des gènes de réparation de l’ADN et ceux du déclenchement de l’apoptose
ATHEROSCLEROSE• La peroxydation des lipides des lipoprotéines en
relation avec la formation des plaques d’athérome qui obstruent les vaisseaux sanguins
INFLAMMATIONL’apparition de ROS aggrave l ’inflammation
VIEILLISSEMENT• Altération de l ’ADN, des lipides et des protéines• Altération mitochondriale (ROS ++)• Athérosclérose, inflammation, Cancer• Théorie radicalaire somatique du vieillissement: les
ROS seraient responsables du vieillissement et des maladies qui lui sont associées
Certaines conditions physiopathologiques vont modifier les conditions de fonctionnement de ces
systèmes
Cas de l’ischémie reperfusion
I II III
e- e-
IV V ANT
Désynchronisation de la chaîne respiratoire durant l’ischémie reperfusion (1)
A l’ischémie: découplage avec excés e- et anoxie
I II III
O2º-
IV V ANT
Modifications de la chaîne respiratoire durant l’ischémie reperfusion (2)
O2
O2º-
A la reperfusion: apport massif O2 sur les e- accumulés
MnSOD
H2O2
CONCLUSIONS
les substances réductrices protègent les organismes aussi bien contre le vieillissement que contre l’athérosclérose et les effets des radiations ionisantes
vitamine C, carotènes, la vitamine E, Sélénium, Melatonine
Le désequilibre entre production et élimination des EOR survient durant: inflammation, ischemie/reperfusion, alterations du metabolisme, toxiques, polluants, etc.
Techniques d’exploration des systèmes anti-oxydants
1- Dosage des Isoprostanes : La peroxydation de l’acide arachidonique , indépendante de l’action des
enzymes cyclooxygénase et lipooxygénase , conduit à la formation de dérivés de la famille des prostacyclines les Isoprostanes, dont la 8-epi PGF2 alpha.
2- Dosage des hydroperoxydes lipidiques :Aldéhydes stables comme le Malondialdéhyde (MDA) et les 4 hydroxyalkenals
comme le 4 HNE (4hydroxynonenal). 3- Dosage du glutathion :Stress oxydant rapport glutathion
réduit/glutathion oxydé4- Dosage des défenses: acide ascorbique, -tocophérol, -carotène,
ubiquinol, …
.
Techniques d’exploration de la peroxydation (2)
Total antioxydant status : mesure la capacité totale antioxydante du plasma à défaut de
mesurer chaque antioxydant individuellement.Marqueurs de la peroxydation des protéines: Protein adducts on protéines carbonylées. Marqueurs de la peroxydation des acides nucléiques: 8-0H-deoxyguanosine.Marqueurs de l’activation des PN: Dosage de la myeloperoxydase, de la Lactoferrine et de
l’elastase.Dosages d’enzymes anti oxydantes:la SODs, la Glutathion peroxydase selenium dept ou indept, la
catalase.
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