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Invalidation du gène Tph1 chez la souris. Rôle de la sérotonine circulante et implication de la sérotonine maternelle dans la fonction cardiaque. Cécile FLIGNY – 14 JUIN 2007. La découverte de la sérotonine. Erspamer & Vialli, 1937 - PowerPoint PPT Presentation
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Invalidation du gène Invalidation du gène Tph1 Tph1 chez la sourischez la souris
Rôle de la sérotonine circulante et implication de la sérotonine maternelle dans la fonction cardiaque.
Cécile FLIGNY – 14 JUIN 2007
La découverte de la sérotonineLa découverte de la sérotonine
Erspamer & Vialli, 1937 Une substance isolée de la muqueuse gastrique provoque des contractions des
muscles lisses: elle est nommée entéramine.
Rapport et coll., 1948 Une substance présente dans le sang provoque la contraction des vaisseaux:
elle est appelée sérotonine.
Erspamer & Asero, 1952 Entéramine et sérotonine sont une seule et même substance.
Twarog & Page, 1954 La sérotonine est un neurotransmetteur dans le cerveau des mollusques et est
présente dans le cerveau des mammifères.
La sérotonine: fonctions biologiquesLa sérotonine: fonctions biologiques Système nerveux central
thermorégulation nociception mémoire et apprentissage cycle veille/sommeil
comportement sexuel/maternel prise alimentaire humeur
contractilité cardiaque tonus vasculaire
Système cardiovasculaire Système sanguin fonction des lymphocytes hémostase
Système gastro-intestinal
péristaltisme
Développement embryonnaire différenciation neuronale synaptogenèse division cellulaire morphogène développement cardiaque
La sérotonine: pathologies associéesLa sérotonine: pathologies associées
Système nerveux central schizophrénie douleur anxiété dépression
comportements suicidaires agressivité migraine alcoolisme
hypertension artérielle systémique et pulmonaire cardiopathie hypertrophique cardiopathie dilatée
Système cardiovasculaire Système sanguin asthme thrombose
Système gastro-intestinal tumeurs carcinoïdes syndrome du colon irritable
Développement embryonnaire retard de croissance
Les acteurs du système 5-HTLes acteurs du système 5-HT1/ des récepteurs spécifiques1/ des récepteurs spécifiques
15 récepteurs 5-HT différents, répartis en 7 classes.
5-HTNa+
Na+R.à 7 domaines transmembranaires
R. canaux (5-HT3)
Signalisation intracellulaire
Récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G, à l’exception du récepteur 5-HT3.
Expression dépendante de l’organe et de l’espèce considérés.
Les récepteurs de la classe 2 sont spécialement impliqués dans la régulation des fonctions cardiaques chez la souris.
Les acteurs du système 5-HTLes acteurs du système 5-HT2/ des mécanismes d’inactivation2/ des mécanismes d’inactivation
Na+
Na+R. à 7 domaines transmembranaires
R. canaux (5-HT3)
Signalisation intracellulaire
Un mécanisme de recapture: Le transporteur de haute affinité SERT
SERT
5-HT
5-HT
R. 5-HT
5-HT
Recapture
Ext.
Int.
Les acteurs du système 5-HTLes acteurs du système 5-HT2/ des mécanismes d’inactivation2/ des mécanismes d’inactivation
Na+
Na+R. à 7 domaines transmembranaires
R. canaux (5-HT3)
SERT
5-HT
5-HT
R. 5-HT
5-HT
Signalisation intracellulaire
Recapture
5-HT
Un mécanisme de dégradation: La monoamine oxydase MAO
5-HIAA
MAO
VMAT
Les acteurs du système 5-HTLes acteurs du système 5-HT3/ une enzyme de synthèse limitante: la TPH3/ une enzyme de synthèse limitante: la TPH
Enzyme limitante de la voie de biosynthèse de la 5-HT
tryptophane
Décarboxylase des aa
aromatiques
5-hydroxytryptamineSÉROTONINE
noyaux du raphé
neurones myentériques cellules entérochromaffines
Mélatonine
glande pinéale
5-hydroxytryptophane5-HTP
Tryptophane hydroxylase
Inactivation du gène Inactivation du gène TphTph chez la souris chez la souris
locus Tph endogène
locus Tph muté
Vecteur de ciblage
Stratégie de « knock-in »
Les souris Tph-/-(+/-) sont viables
♂ Tph1+/- x ♀ Tph1+/-
Deux gènes Deux gènes TphTph……
glande pinéale
***
neurones myentériques cellules entérochromaffines
***
Effondrement du taux de 5-HT.
Tph2 noyaux du raphé
Taux de 5-HT normal.
2 gènes Tph
Lieux d’expression des gènes Lieux d’expression des gènes TphTph
65% d’identité
TPH2 4 5 6 7 8 9 10 11
TPH1
Domaine catalytique83% d’identité
Domaine de régulationet d’interaction
1 2 3
4 5 6 7 8 9 10 112 3
Région 3’ non traduite
Biosynthèse de 5-HT
TPH1 non neuronaleGlande pinéaleCellules entérochromaffines
TPH2 neuronale Neurones 5-HT du raphéNeurones myentériques
90%
5%
5%
Souris invalidées pour le gène Tph1
Temps d’expression des gènes Temps d’expression des gènes TphTph
SNC Tph2 E10.5
intestins
Tph1 E14.5
Naissance2.5 4.5 6.5 8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 18.50.5
Sérotonine de l’embryon
glande pinéale
Tph1CE
E15.5
Tph2 E12.5
NM
En résumé …En résumé …
parents
adultes
100% de survieSouris viables
Tph1-/-(+/-)
3-15%
50%
Tph1+/-
***
***
***
3%
15%
Conséquences du faible taux Conséquences du faible taux de 5-HT circulante?de 5-HT circulante?
Problèmes cardiaques
Faible taux de 5-HT circulante
Tph1-/-(+/-)
3-15%
dysfonctionnement?
La cathéterisation de conductanceLa cathéterisation de conductance
Volume
Pression
remplissage
contraction
éjection
relaxation
Volume
Pression
Courbe de fonction ventriculaire gauche
= contractilité
Insuffisance cardiaque
Le phénotype cardiaque Le phénotype cardiaque est hétérogèneest hétérogène
Phase de compensation
Tph1-/-(+/-)
3-15%
Tph1+/+
Tph1-/-
Souris 273
Phase de décompensationTph1-/-
Souris 296
Le phénotype cardiaque Le phénotype cardiaque est hétérogèneest hétérogèneTph1-/-(+/-)
3-15%
n=30n=7n=30n=7
Conclusion (1)Conclusion (1)
parents
adultes
100% de survieSouris viables
Tph1-/-(+/-)
3-15%
50%
Tph1+/-Diminution contractilité cardiaque
Insuffisance cardiaque
Hétérogénéité importante
Origine de l’hétérogénéité du Origine de l’hétérogénéité du phénotype cardiaque?phénotype cardiaque?Tph1-/-(+/-)
3-15%
Le stress, un facteur aggravant de la cardiopathie? exacerbation du phénotype cardiaque en période de stress
Le taux individuel de 5-HT, prédicateur de la sévérité du phénotype cardiaque?
Le stress, facteur aggravant Le stress, facteur aggravant de la cardiopathie?de la cardiopathie?Tph1-/-(+/-)
3-15%
Protocoles envisageables: Exercice physique (marche forcée, nage). Une stimulation adrénergique.
Protocole expérimental choisi: Test pharmacologique d’effort avec la dobutamine.
dobutamine Catécholamine de synthèseAgoniste 1-adrénergique
Inotrope + ( force de contraction)Bathmotrope + ( conduction)Chronotrope + ( fréquence)
Aucune réserve contractile Aucune réserve contractile cardiaque…cardiaque…Tph1-/-(+/-)
3-15%
Surv
ie (m
in)
Souris Tph1-/-(+/-)non sensibles sensibles
Souris contrôles
Survie moyenne des souris Tph1-/-
(+/-) après dobutamine:
11.4 ± 2.8 min.
Souris Tph1-/-
Non sensibles
Souris Tph1-/-
sensibles
Modification de la signalisationModification de la signalisation 5-HT cardiaque 5-HT cardiaqueTph1-/-(+/-)
3-15%
Étude de liaison des récepteurs -adrénergiques cardiaques
Tph1+/+ Tph1-/-
Kd (nmol/l) 0.03 ± 0.00 0.045 ± 0.02
Bmax (fmol/mg prot.) 39.66 ± 2.24 42.42 ± 3.08
β1/β 2 (%) 51 ± 49 52 ± 48
Tph1+/+ Tph1-/-
5-HT2A (fmol/mg prot.) 67 51
5-HT2B (fmol/mg prot.) 107 211
SERT (fmol/mg prot.) 13 57
Ø modification de la signalisation -AR.
Étude de liaison des récepteurs 5-HT cardiaques
x 2
néoexpression
Conclusion (2)Conclusion (2)
parents
adultes
100% de survieSouris viables
Tph1-/-(+/-)
3-15%
50%
Tph1+/- Absence de réserve contractile cardiaque
Hétérogénéité importante
stress, facteur aggravant de la cardiopathie
5-HT2B
SERT
Diminution contractilité cardiaqueInsuffisance cardiaque
Taux individuel de 5-HT, Taux individuel de 5-HT, prédicateur de la cardiopathie?prédicateur de la cardiopathie?Tph1-/-(+/-)
3-15%
Protocole expérimental: Mesure des paramètres cardiaques de chaque animal par échocardiographie. Détermination des taux individuels de sérotonine circulante.
Contrainte: Analyser un nombre important d’animaux .
Analyse des souris Tph1-/- issues de mères Tph1-/-.
Générer un nombre important d’animaux mutés dans une même portée Diminuer l’hétérogénéité entre les individus d’une même portée.
Seuls 20% des souris Seuls 20% des souris Tph1Tph1-/--/-(-/-) (-/-) survivent !survivent !
parents
adultes
100% de survieSouris viables
Tph1-/-(+/-)
3-15%
50%
Tph1+/-
5-HT2B
SERT Tph1-/-(-/-)
Tph1-/-(+/-)
3-15%
Tph1-/-(-/-)
Diminution contractilité cardiaqueInsuffisance cardiaqueStress aggrave la cardiopathie
Très peu de naissance
20% de survie
Conséquences du faible taux de Conséquences du faible taux de 5-HT maternelle?5-HT maternelle?
Génotype maternel
Génotype paternel
Nombre de croisements
Génotype des embryons% d’embryons
petits / malformés+/+ +/- -/-
+/+
+/+ 3 28 - - 3.6
+/- 1 4 6 - 0
-/- 2 - 27 - 3.7
+/-
+/+ 1 6 4 - 0
+/- 4 11 24 10 6.7
-/- 2 - 4 3 0
-/-
+/+ 3 - 10 80
+/- 2 - 9 9 88.9
-/- 2 - - 15 86.7
malformations létales à ~E12
Tph1-/-(-/-)
Tph1+/+(+/+) Tph1+/+(+/-)Tph1-/-(-/-) Tph1+/-(-/-)
La 5-HT maternelle est indispensable pour le développement embryonnaire normal.
Embryons normaux
Seuls 20% des souris Seuls 20% des souris Tph1Tph1-/--/-(-/-) (-/-) survivent !survivent !
parents
adultes
100% de survieSouris viables
Tph1-/-(+/-)
3-15%
50%
Tph1+/-
5-HT2B
SERT Tph1-/-(-/-)
Tph1-/-(+/-)
3-15%
??
Diminution contractilité cardiaqueInsuffisance cardiaqueStress aggrave la cardiopathie
Très peu de naissance
20% de survie
Tph1-/-(-/-)
??
Quel phénotype cardiaque?Quel phénotype cardiaque?
Tph1+/+ Tph1-/-(+/-) Tph1-/-(-/-)2 mois 5 mois 5 mois 2 mois 5 mois
PPVGd (cm) 0.07 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.06 ± 0.01 Ұ
PPVGs (cm) 0.10 ± 0.01 0.10 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.10 ± 0.02 0.07 ± 0.01 *** Ұ Ұ Ұ
Sd (cm) 0.08 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.07 ± 0.01
Ss (cm) 0.10 ± 0.01 0.10 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.08 ± 0.01 * Ұ Ұ
DIVGd (cm) 0.41 ± 0.01 0.42 ± 0.01 0.41 ± 0.04 0.43 ± 0.05 0.48 ± 0.05 ** Ұ
DIVGs (cm) 0.25 ± 0.01 0.25 ± 0.03 0.25 ± 0.05 0.29 ± 0.04 0.35 ± 0.05 ** Ұ
Longueur VG (cm) 0.82 ± 0.03 0.80 ± 0.06 0.77 ± 0.07 0.86 ± 0.07 0.84 ± 0.05
Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5 mois: données anatomiques.
Signes anatomiques de cardiopathie dilatée (CMD). Se développe entre 2 et 5 mois.
Tph1-/-(-/-)
??
Ø signe anatomique de cardiopathie à 2 mois.
Quel phénotype cardiaque?Quel phénotype cardiaque?
Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5 mois: données fonctionnelles.
Signes fonctionnels de CMD:• FS (index de contractilité)
5 mois
FS (%
)
FC (b
pm)
2 mois
Tph1-/-(-/-)
??
Quel phénotype cardiaque?Quel phénotype cardiaque?
Mesure des marqueurs plasmatiques précoces d’insuffisance cardiaque.
5 mois
Tph1-/-(-/-)
??
BN
P (p
g/m
l)
CK
-MB
(µg/
l)
Trop
onin
e Ic
(ng/
ml)
Influence du génotype maternel
Augmentation plus importante chez les Tph1-/-(-/-).
Augmentation des marqueurs précoces d’IC chez les Tph1-/-(+/-)
Les souris Tph1-/-(+/-) développent une cardiopathie à un âge plus avancé
Conclusion (3)Conclusion (3)
parents
adultes
100% de survieSouris viables
Tph1-/-(+/-)
3-15%
50%
Tph1+/-
5-HT2B
SERT Tph1-/-(-/-)
Tph1-/-(+/-)
3-15%
??
20% de survieTrès peu de naissance
Diminution contractilité cardiaqueInsuffisance cardiaqueStress aggrave la cardiopathie
Augmentation ± des marqueurs d’IC
Augmentation +++ des marqueurs d’IC
Cardiopathie dilatée
La sérotonine circulanteLa sérotonine circulante
5-HT
99% plaquettes sanguines
1% plasma
Neuronesmyentériques
(TPH2)
Cellulesentérochromaffines
(TPH1)
90% de la sérotonine circulante est synthétisée dans les cellules entérochromaffines par la TPH1.
Taux de sérotonine plaquettaire?Taux de sérotonine plaquettaire?Tph1-/-(-/-)
??
> 99% de la sérotonine circulante stockée dans les plaquettes sanguines.
5 mois
Pas de corrélation entre la sévérité de la cardiopathie et le
taux de 5-HT plaquettaire.
5-H
T sa
ng to
tal (
µM)
Même taux de 5-HT entre les souris Tph1-/-(+/-) et Tph1-/-
(-/-).
Taux de sérotonine plasmatique?Taux de sérotonine plasmatique?Tph1-/-(-/-)
??
< 1% de la sérotonine localisée dans le plasma sanguin.
5 mois
5-H
T pl
asm
a (n
M)
Taux de 5-HT plasmatiques significativement diminués entre les Tph1-/-(+/-) et -/-(-/-).
Corrélation 5-HT / cardiopathie?Corrélation 5-HT / cardiopathie?Tph1-/-(-/-)
??
5-HT plasma
BN
P corrélation inverse entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique.
La sérotonine active pour la régulation de la fonction cardiaque est localisée dans le compartiment plasmatique sanguin.
Conclusion (4)Conclusion (4)
parents
adultes
100% de survieSouris viables
Tph1-/-(+/-)
3-15%41%
50%
Tph1+/-
5-HT2B
SERT Tph1-/-(-/-)
Tph1-/-(+/-)
3-15%
20% de survieTrès peu de naissance
Diminution contractilité cardiaqueInsuffisance cardiaqueStress aggrave la cardiopathie Augmentation ± des marqueurs d’IC
Cardiopathie dilatéeAugmentation +++ des marqueurs d’IC
corrélation inverse entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique.
Le génotype maternel influence le taux de 5-HT plasmatique
3-15%20%
Le génotype maternel réguleLe génotype maternel régule le taux de 5-HT plasmatique? le taux de 5-HT plasmatique?
Naissance2.5 4.5 6.5 8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 18.50.5
Sérotonine de l’embryon
Sérotonine maternelle
Tph2
Tph1
E10.5
Tph1
Tph2
E14.5
E15.5
E12.5
5-HT2B SERT
diminution de la production de 5-HT dans les intestins des souris Tph1-/-(-/-)? augmentation du catabolisme de la 5-HT?
Peu probable car la concentration plaquettaire de 5-HT est la même entre les groupes de souris Tph1-/-.
modification du nombre, de la fonction (capture de 5-HT, capacité de dégranulation) et/ou de la structure (capacité de stockage de la 5-HT) des plaquettes?
La 5-HT maternelle régule La 5-HT maternelle régule le taux de 5-HT plasmatique?le taux de 5-HT plasmatique?Tph1-/-(-/-)
Les plaquettes sanguinesLes plaquettes sanguinesTph1-/-(-/-)
20%
•Diminution du nombre de plaquettes en fonction du génotype maternel .
5 mois
Plaq
uette
s (1
03 /µl)
Nombre de plaquettes sanguines.
La sérotonine maternelle régule le nombre de plaquettes sanguines
… … une première piste?une première piste?
Plaquettes sanguines
mégacaryocytes proplaquettes plaquettes
Réarrangement
du cytosquelette
Réarrangement
du cytosquelette
5-HT2A
SERT
5-HT2A?
5-HT2B?
SERT
5-HT2B
SERT
5-HT
Sérotonine
L’implication des petites protéines G?L’implication des petites protéines G?
cardiomyocytes adultes
5-HT2B x 2
5-HT
SERT x 5
mégacaryocytes
5-HT
5-HT2B SERT
Maintien du phénotype 5-HT foetal
Réarrangement anormal du cytosquelette
Formation anormale du cytosquelette
activation petites protéines G (RhoA?)
contractilité
cardiomyocytes
maturation
Mégacaryocytes / proplaquettes
sérotonine maternelle
Études épidémiologiques Environnement maternel
AutismeMaladies psychiatriquesDiabèteObésite…
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