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Maria MercedesMartín Pedrosa
IIIIIUUtiNIVERSID4D COMPLUTENSE
ISOFORMASDE ARGINASA DE EVIYRNL4PRUAJASTRJ(L.) Ach.:
CARACTERIZACION Y REGULACION PORFENOLES
Directora:Prof Dra. DM. Maria EstrellaLegazGonzález
Titular de FisiologíaVegetal de la Facultad
de CienciasBiológicas
UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID
Facultad de Ciencias Biológicas
Departamento de Biologia Vegetal1
1993
UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID
Facultad de CienciasBiológicas
Departamentode Biología Vegetal 1
(Cátedrade Fisiología Vegetal)
ISOFORMAS DE ARGITNASA DE EVERJVL4 PRUNASTRJ(L) ¡Ich.:
CARACTERIZACION Y REGULACION POR FENOLES
MaríaMercedesMartín Pedrosa
Madrid, 1993
Trabajo realizado en ¡a Cátedra
Vegetal de la Facultad de Ciencias
de Fisiología
Biológicas.,
Universidad Complutense, que presenta para optar al
grado de Doctor en Ciencias Biológicas
Madrid, Junio de 1993
a’ -:
Edo: Maria Mercedes Martin Pedrosa
Conforme, la directora de la Tesis
yEdo: Prof Dra, María Estrella Legaz González
La entrada del sendero era una suerte de arco que llevaba a un túnellóbrego formado por dos árboles inclinados, demasiado viejos yahogados por la hiedra y los líquenes colgantes para tener más queunas pocas hojas ennegrecidas.
(J.R.R. Tolkien, Jt’iHobhit)
A mis padres y a Clara, con todo miamor,A Alfonso, Pili y Angel, por vuestrocauiflo y por estar siempre a mi lado.
La realización de esta Tesis Doctoral recoge el trabajo, tesón e ilusiones de otras personas
a las que no deseo ni debo olvidar.
En primer lugar, quiero agradecer a la Dra. M~ Estrella Estrella Legaz González, Prof
Titular de Fisiología Vegetal, la confianza que depositó en mí y la oportunidad ofrecida para
realizar esta Tesis Doctoral. Gracias por tu ayuda, tus desvelos, cuidados y enseñanzas para que
el trabajo saliese siempre adelante. Ojalá que la semilla que en su día sembraste haya dado los
frutos que esperabas.
Quiero agradecer al Prof Dr. Carlos Vicente Córdoba, Catedrático de Fisiología Vegetal,
no sólo sus acertados e inestimables comentarios aportados durante la realización de esta.
Memoria Doctoral, sino también el esifierzo y las ilusiones puestas en este trabajo durante estos
años, Gracias por escuchar mis interminables charlas, por tu ayuda, tus consejos y, cómo no, por
tus silencios.
También quiero agradecer a los Profs. Dr. José Gavilanes y Dra. Rosalía Rodríguez, del
Departamento de Bioquímica, la ayuda prestada en la realización de los análisis de aminoácidos de
las isoformas de arginasa, así como en su interpretación.
A Carlos y Estrella, por vuestros ánimos en los momentos diticiles, vuestras alegrías y,
sobretodo, por vuestra amistad.
también quiero recordar a Bernabé Bodas, por ayudarme a sobrellevar el sufrimiento del
cromatografista en este mundo. Gracias por tus explicaciones y por acudir en mi auxilio cuando
‘Berni’ o “Barbie’ me hacían sufrir.
A mis compañeros, a los que hoy están conmigo y a los que se frieron. A José Luis, Silvia,
Maria del Carmen, Elena, Adolfo, Luisa, Maria, Lourdes, Teresa, Aurelio y Raquel; gracias por
compartir conmigo el día a día del trabajo, las ilusiones y los sinsabores de la investigacion.
A Angel; gracias por acceder a todos nuestros deseos en la elaboración de esta Memoria
Doctoral y, sobre todo, por tu enorme paciencia; estas ya son las páginas definitivas.
Deseo también expresar mi gratitud a todas aquellas personas que de un modo u otro han
contribuido a la realización de esta Tesis Doctoral.
vi
ABREViATURAS
Ala AianinaArg ArgininaAsx Acído aspárticoo asparaginaCys Cisteinadi. DiámetrointernoDa DaltonDO DensidadópticaFC ElectroforesiscapilarGlx Acido glutamico o glutaminaGly Glicocolafis HistidinaH~PLC High performance liquid chromatography (Cromatografia líquida de alta resolución)Ile IsoleucinaKm Constante de Michaelis-MentenK01(ap) Constante de Michaelis-Menten aparente~L] Concentración de ligando libre en equilibrioLev Leucina[L]i Concentración inicial del ligando en su compartimento
Moles de ligando unido a la proteína¡4 Moles totales de ligando en su compartimentoLys LisinaMr MasamolecularMet MetioninaPhe Fenilalaninapl Punto isoeléctricoPro Prolina
Moles totales de proteínar Moles de ligando unido por molécula de proteína[Sa] Concentración de sustrato
Concentración de sustrato que produce el 50% de la velocidad máxima dereaccion
SDS Dodecil sulfato sódicoSer Serma‘1hr TreoninaTris Tri-hidroximetil-aminometanoTrp TriptófanoTyr TirosinaUAFE Unidades de absorbancia a fondo de escalaLIV Luz ultravioletayo Velocidad inicial de reacciónVal Valina~max Velocidad máxima de reacciónvmax(ap) Velocidad máxima de reacción aparenteVt Volumen total de la subcámaraV1.[L] Moles totales de ligando libre en ambas subcámaras
vii
INDICE
1.- INTRODUCCION,. .
1.1< CONCEPTO DE ISOFORMA E ISOENZIMA,
1.2.- ANALíTICA DE LA DETECCIONDE ISOFORMAS, 4
1.3<- ELECTROFORESISCAPILAR Y CROMATOGRAFíA LíQUIDA DE ALTARESOLUCIONEN EXCLUSION MOLECULAR, 6
1.4- ESTUDIO DE LAS INTERACCIONESLIGANDO-PROTEíNA, II
[.5.- ARGINASAS Y SUS ISOFORMAS, ¡2
1.6< CATABOLISMO DE LA ARGININA EN LIQUEÑES, 161.6.1 .- Arginasa y ornitina descarboxilasa 181.6.2.- La vía descarboxílativa de la argínina ¡91.6.3< La síntesis y translocación de poliaminas, 211.6.4. - La función de la arginasa segregable 221.6.5< Isoformas como factores de desarrollo o de regulación metabólica,,,,.. 26
lí>. MATERIAL Y MF.TODOS 30
11.1.- MATERIAL VEGETAL, 32
11.2. - CONDICIONESDE JNCUBACION, 32
11.3.- VALORACION DE LA ACTIVIDAD ARGINASA, 32
11.4.- VALORACION DE PROTEíNAS, 33
II 5.- PURIFICACIONDE LAS ISOFORMASDE LAS ISOFORMASDE ARGINASA, 3311.5.1.- isoformas [y II de arginasa 33
[.5. 1.1. - Obtención del extracto libre de células 3311 5.1.2 - Precipitación con sulfato amónico 3411.5.1.3< Adsorción sobre gel de fosfato cálcico 3411.5.1.4< Electroenfoque en columna 35
11.5.2< Isoforma III de argínasa 3611.5.2.1.- Obtención del extracto libre de células 3611.5.2.2< Precipitación con sulfato amónico 36II 5 2.3 - Adsorción sobre gel de fosfato cálcico 3611.5.2.4< Electroenfoque en columna 36
11.5.3< isoforma IV de arginasa 37II 5 3 1 - Obtención del extracto libre de células 371153 2 - Precipitación con sulfato amónico 3711 5 3.3 - Adsorción sobre gel de fosfato cálcico 37¡1.5 3 4 - Electroenfoque en columna 37
vi~ii
11.6< DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTR.ICO, 383811.6.1. - Mediante electroenfoque en columna3811.6.2.- Mediante electroforesis capilar
II.? - ANALISIS DE AMINOACIDOS, 39
11.8< DETERMINACION DEL PESO MOLECULAR DE LAS DIFERENTESISOFORMAS DE ARGINASA MEDIANTE CROMATOGRAFíA LíQUIDA DEALTA RESOLUCION (HPLC), 40
11.9. - CARACTERIZACION ESPECTROSCOPICA., 434311.9.1.- Espectros de absorción ultravioleta4311.9.2< Espectros de emisión de fluorescencia,
11.10<VALORACION DE FENOLESLIQUENICOS MEDIANTE HPLC, ,..,,.,.,,. 4411.10 1 - Extracciónde fenoles con diferentes mezclas de disolventesorgánicos, 44
1110 1 1 - A partir de talos 441110 1,2<A partir del medio de incubación 44
451110 1 .3 - A partir del extracto libre de células
l1.10.2< Estabilidad de los fenoles en disoluciones acuosas 4611.10.3<Espectrode absorción ultravioleta de fenoles liquénico 48II. 10.4< Valoración de fenoles liquénicos mediante HPLC 48
[1.11<CINETICA DE SATURACION EN AUSENCIA DE EFECTOR.ES, . 49
11.12<CINETICA DE SATURACION EN PRESENCIADE EFECTORESATRANORINA, ACIDO EVERNICO Y ACIDO USNICO, .. 50
II. 13 - DETERMINACION DE LA CONSTANTEDE MICHAELIS-MENTEN (Km) YLA VELOCIDAD MAXIMA (vmax) DELAS DIFERENTESISOFORMASDE
51ARGINASA
11.14<ESTUDIOSDE LIGAMIENTO, 5111.14.1<Preparación de la membranade diálisis, 5211.14.2<Célulasde diálisis 5211.14.3< Determinacióndel tiempo de equilibrio, 5211.14.4< Cálculo del ligando unido 5411.14.5 - Representaciones gráficas de los datos de ligamiento, . 5611.14.6< Análisis estadísticos y proceso de datos 57
111< RESULTADOS, .. . 58
III. l - PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE LAS DIFERENTESISOFORMASDE ARGINASA 59III 1.1 . - Purificación y caracterización de las isoformas 1 y II de arginasa,..... 60
III. 1.1 1< Determinación del punto isoeléctrico 611l[ 1.1 2- Composición de aminoácidos ...... 62III 1,1 3 - Determinación del peso molecular 63
ix
111. 1.2< Purificación y caracterización de la isoforma III de arginasa 64Iii. ¡ .2.1< Determinación del punto isocléctrico 65
66111.1 2.2< Composición de aminoácidosIII 1.2.3< Determinación del peso molecular 67
111. 1.3.- Purificación y caracterización de la isoforma IV de arginasa, 67111,1.3,1< Determinación del punto isoeléctrico 68fIl. 1 3 2 - Composición de aminoácidos 69IR. 133 - Determinación del peso molecular,.... 70
111.2< CARACTERíSTICASESPECTROSCOPICASDE LAS ISOFORMAS1, 111 Y IVDE ARGINASA, 121111.2,1.-Espectros de absorción ultravioleta 122111 2 2 - Espectros de fluorescencia 122
111.3< ANALISIS Y CUANTIFICACION DE ATRANORINA, ACIDO EVERNICO YACIDO USNICO ¡34111.3.1< Espectros de absorción ultravioleta 135111.3.2< Estabilidad en disoluciones tamponadas 135111.3.3< Separación y cuantificación mediante HPLC 136111.3.4< Valoración del contenido de fenoles en muestras de córtex, talo y medio de
incubación 137111.3.5< Valoración del contenido de fenoles solubles en el extracto libre de cédulas, . 138
111.4< EFECTODE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDADDE REACCION DE LAS ISOFORMAS DE ARGINASA EN AUSENCIA YPRESENCIADE EFECTORES 157
111.4.1< Sobre la isoforma 1 de arginasa ¡58Iii 4.2 - Sobre Ja isofornia III de arginasa 160III 4 3 - Sobre la isoforma IV de arginasa 161
111.5< EVALUACION DE LA COOPERATIVIDAD. ECUACION DE HILL 180
111.6. - LIGAMIENTO DE ATRANORINA, ACIDO EVERNJCO Y ACIDO USNICO ALAS ISOFORMAS 1,111 Y IV DE ARGINASA, 182111.6 1 - Ligamiento a la isoforma 1 183
111.6,1.1< Atranorina como ligando 183111 6 ¡ 2 - Acido evérnico como ligando 184111.6.1.3< Acido úsnico como ligando, 184
111.6.2.- Ligamiento a la isoforma III, . 185111.6.2.1< Atranorina como ligando 185111.6.2.2< Acido evérnico como ligando 185111.6,2,3< Acido úsnico como ligando, 186
111.6.3< Ligamiento a la isoforma IV, . 186111.6.3. 1< Atranorina como ligando, 186111.6.3.2< Acido evémico como ligando 187[¡1.6.3.3<Acido ósnico como ligando 187
x
111.7< EFECTO DEL LIGAMIENTO DE ATRANORINA, ACIDO EVERNICO YACIDO USNICO PRODUCIDOENLAS ISOFORMASDE ARGINASA 226111.7.1<[soforma1, . . 227LII 72- Isoforma 111, .. 227II] 7 3 - Isofornia IV, .. 228
¡Y- DISCUSION, 232
V< CONCLUSIONES, 253
VV BIBLLOGRAF¡A,.,... 262
xi
INDICE DE FIGURAS Y TABLAS
Esquema del catabolismo de arginina en Evernia prunastrí 17Figura 1 . - Ejemplar de E.prunaslr¡ 31Figura 2.- Diagrama de flujo de extracción de fenoles 47Tabla 1< Cantidad de efector en las mezclas de reacción utilizadas en la valoración de la
actividad arginasa 50Tabla II. - Representaciones gráficas para la determinación de Km y Vmax de las
isolbrmas de arginasa .. . , . 5153
Figura 3,- Esquema del equilibrio de diálisisTabla II]. - Representaciones gráficas de los datos del ligamiento 57Tabla 1V- Purificación de las isoformas 1 y II de arginasa 72Figura 4.- Purificación de las isoforroas í y 11 de arginasa mediante HPLC de exclusión
molecularFigura 5< Electroenfoque en columna de la isoforma ¡ de arginasa 75Figura 6.- Electroenfoque en columna de la isoforma II de arginasa 77Figura 7< Esquemas de capilares de sílice fundida 79Figura 8 - A.natomia interna de los capilares de sílice Ñndida 81Figura 9.- Electroforegramas de la isoforma 1 de arginasa 83Figura 10.- Rectas de calibrado en electroforesis capilar para las isoformas 1 y II
de arginasa 85Tabla V- Composición de aminoácidos de las isoformas 1 y II de arginasa 87Figura II . - Cromatograma de proteínas patrón separadas en I-IPLC de exclusión
molecular utilizando una columna TSK G5000 PWXL 88Figura 12< Cromatograma de proteínas patrón separadas en HPLC de exclusión
molecular utilizando dos columnas Zorbax-diol en serie, GF450-GF250 ...,.......... 90Tabla VI. - Eficiencia de las columnas TSK GSOOO PWXL y Zorbax-diol GF4SO-GF250,
analizada como número de platos teóricos 92.Figura 13< Cromatogramas de la isoforma Ide arginasa desnaturalizada, obtenidos
mediante I-IPLC de exclusión molecular utilizando dos columnas Zorbax-diolen serie, GF4SO-GF250 93
Figura 14<- Rectas de calibrado en HPLC de exclusión molecular para las isoformaslylldearginasa 95
Tabla VII.- Purificación de la isoforma III de argmasa 97Figura Ii- Purificación de la isoforma III de arginasa mediante I-IPLC de exclusión
molecular 98Figura 16< Electroenfoque en columna de la isoforma III de arginasa 100Figura ¡7< Electroforegramas de la isofonna III de arginasa 102Figura 18< Recta de calibrado en electroforesis capilar para la isoforma III de arginasa 104Tabla VIII.- Composición de aminoácidos de la isofornia III de arginasa 106Figura 19.- Rectas de calibrado en HIPLC de exclusión molecular para la isoforma III
de arginasa 107Tabla IX.- Purificación de la isoforma IV de arginasa 1 09Figura 20.- Purificación de la isoforma IV de arginasa mediante I-IIPLC de exclusión
molecular . 110Figura 21 . - Electroenfoque en columna de la isoforma IV de arginasa 112Figura 22.- Electroforegramas de la isoforma IV de arginasa 114Figura 23< Rectas de calibrado en electroforesis capilar para la isoforma IV de arginasa. . .116Tabla X< Composición de aminoácidos de la isoforma IV de arginasa ¡18
xii
Figura 24< Rectas de calibrado en HIPLC de exclusión molecular para la isoforma IVde arginasa 119
Figura 25.- Espectros de absorción ultravioleta de las isoformas 1, III y IV de arginasa. . , 124Figura 26< Espectro de emisión de fluorescencia de las isoformas 1, III y IV
de arginasa, excitando a 275 nm 126Figura 27.- Espectro de emisión de fluorescencia de las isoformas 1, III y IV de arginasa,
excitando a 295 nm 128Figura 28< Espectro de emisión de fluorescencia de las isoformas 1, III y IV de arginasa,
130excitando a 257 nm
Figura 29< Espectros de emisión y excitación simultánea de fluorescencia de lasisoformas 1, 111 y IV de arginasa 132
Figura 30< Espectros de absorción ultravioleta de atranorina, ácido evérnicoy ácido usnico 141
Figura 31.- Estabilidad de atranorina en disolución acuosa 143Figura 32< Estabilidad de ácido evérnico en disolución acuosa 145Figura 33.- Estabilidad de ácido úsnico en disolución acuosa 147Figura 34- Cromatogramas representativos de los fenoles de E. prunasirí ... 149Tabla XI. - Ecuaciones de las rectas de calibrado empleadas en la cuantificación
de fenoles 151Figura 35.- Variación de la cantidad de fenoles en función del tiempo de incubación
de los talos de E. prunastrí en L-arginina 40 mM 152Figura 36< Variación de la cantidad de fenoles en función del tiempo de incubación
de los talos de E. prunastr¡ en cicloheximida 40 gM .. 154Tabla XII. - Cantidad de fenoles endógenos en talos de E. prunastrí 156Figura 37.- Efecto de la concentración de L-arginina sobre la velocidad de reacción
de la isoforma 1 de arginasa en presencia y/o ausencia de efectores 163Figura 38< Representación de Eisenthal-Cornish-Bowden de la isoforma 1 de arginasa 165Figura 39.- Representación de Hanes de la isoforma 1 de arginasa en presencia
y/o ausencia de efectores 167Figura 40.- Efecto de la concentración de L-arginina sobre la velocidad de reacción
de la isoforma III de arginasa en presencia y/o ausencia de efectores 169Figura 4 1.- Representación de Hill de la isoforma III de arginasa en presencia
y/o ausencia de efectores 171Figura 42.- Efecto de la concentración de L-arginina sobre la velocidad de reacción
de la isoforma IV de arginasa en presencia y/o ausencia de efectores 173Figura 43.- Representación de Eisenthal-Cornish-Bowden de la isoforma IV de arginasa 1 75Figura 44< Representación de Hanes de la isoforma IV de arginasa en presencia
y/o ausencia de efectores 177Tabla XIII.- Constantes cinéticas de las isoformas 1, III y IV de arginasa 179Tabla XIV. - Ecuaciones de las rectas obtenidas mediante la representación
de Hill para la evaluación de la cooperatividad 181Tabla XV.- Tiempo para el equilibrio del ligando libre ¡89Figura 45< Ligamiento de atranorina a la isoforma 1 de arginasa. En (A),
representación directa; en (B), representación de dobles-inversas 190Figura 46< Ligamiento de atranorina a la isofonna 1 de arginasa. En (A),
representación de Scatchard; en (B), representación semi-logaritmica 192Figura 47< Ligamiento de ácido evérnico a la isoforma ¡ de arginasa. En (A),
representación directa; en (B>, representación de dobles-inversas 194
xiii.
Figura 48.-
Figura 49<
Figura 50<
Figura 51 -
Figura 52<
Figura 53<
Figura 54 -
Figura SS-
Figura 56<
Figura 57<
Figura 58<
Figura 59<
Figura 60.-
Figura 61<
Figura 62<
Ligamiento de ácido evérnico a la isoforma 1 de arginasa. En (A),representación de Scatchard; en (B), representación semi-logaritmica 196Ligamiento de ácido Osnico a la isoforma 1 de arginasa. En (A),representación directa; en (B), representación de dobles-inversas 198Ligamiento de ácido Osnico a la isoforma 1 de arginasa. En (A),representación de Scatchard; en (E), representación semi-logaritmica 200Ligamientode atranorina a [aisoforma III de arginasa. En (A),representación directa; en (B), representación de dobles-inversas 202Ligamiento de atranorina a la isoforma III de arginasa. En (A),representacion de Scatchard; en (B), representación semi-logaritmica 204Ligamiento de ácido evérnico a la isoforma [U de arginasa. En (A),representación directa; en (B), representación de dobles-inversas 206Ligamiento de ácido evérnico a la isoforma 111 de arginasa. En (A),representación de Scatchard; en (E), representación semi-logarítmica 208Ligamiento de ácido úsnico a la isoforma III de arginasa. En (A),representación directa; en (E>, representación de dobles-inversas 210Ligamiento de ácido úsnico a la isoforma III de arginasa. En <A).representación dc Scatchard; en (E), representación semi-logaritmica 212Ligamiento de atranorina a la isoforma IV de arginasa. En (A),representación directa; en (E), representación de dobles-inversas 214Ligamiento de atranorina a la isoforma IV de arginasa. En (A),representación de Scatchard; en <E), representación semi-logaritmíca 2 ¡6OLigamiento de ácido evérnico a la isoforma IV de arginasa. En (A),representación directa; en (E>, representación de dobles-inversas 2 1 8Ligamiento de ácido evérnico a la isoforma IV de arginasa. En (A),representación de Scatchard; en (E), representación semi-logarítmica 220Ligamiento de ácido Osnico a la isoforma IV de arginasa. En (A),representación directa; en (E), representación de dobles-inversas. .. 222Ligamiento de ácido úsnico a la isoforma IV de arginasa. En (A),representación de Scatchard; en (E), representación semi-logaritmica . . , 224
Tabla XVI< Formación dc distintos agregados de arginasa como consecuenciadel ligamiento 229
Figura 63< Cromatogramas de los distintos agregados de arginasa tras el ligamientodel efector. . , 230
Tabla XVI[< Conclusiones 257
U INTRODUCCION
2
LI.- CONCEPTO DE ISOFORMA E ISOENZIMA.
Las isoenzimas fueron definidas hace más de 30 años como sucesos interesantes,pero
raros, en los procesos de purificación de proteínas. El término isoenzima fue acuñado por
Markert y Ivioller (1959) como una definición operacional que agrupaba múltiples formas
enzimáticas con la misma especificidad de sustrato. Desde entonces, cientos de enzimas han sido
resueltas en formas moleculares varias, provocando controversias en el campo de la Genética y la
Evolución, Por otro lado, el estudio de las isoenzimas ha permitido ampliar el conocimiento de
mecanismos sofisticados de regulación metabólica en bacterias, plantas y animales.
Se definen como isoenzimas diversas formas de una proteína que catalizan la misma
reacción, pero que difieren ligeramente en su composición de aminoácidos o en su estructura. Por
ello, pueden separarse mediante electroforesis o cromatografla y pueden distinguirse al estudiar la
variación en la secuencia de sus aminoácidos o las diferencias en el segmento de los DNAs que las
codifican (Scandalios, 1974). Secundariamente, pueden encontrarse isoenzimas en el mismo o
diferente compartimento celular, en diferentes células o tejidos de un organismo, o bien pueden
ser producidas durante estados diferentes del desarrollo de un único individuo (Weeden, 1983).
Dos formas de una única enzima pueden ser originadas por mecanismos genéticos
(múltiples bel o múltiples genes) o por mecanismos post-traduccionales, siendo este último
procedimiento el más sencillo. Algunas de estas modificaciones post-traduccionales incluyen
glicosilaciones, proteolisis limitada, agregaciones, modificaciones covalentes de la cadena
polipeptidica (Cerft 1978; Gockel y Lebherz, 1981; Motojima y Sakaguchi, 1982; Sticher y
Jones, 1992>, etc. En el caso concreto de enzimas de origen vegeta], estas modificaciones
representan una importante fUente de variabilidad isoenzimática. Así, las isoenzimas de
aminopeptidasas, endopeptidasas y peroxidasas han sido estudiadas en profundidad muy
especialmente (Beevers, 1982).
El término isoenzima es, a menudo, utilizado libremente en un sentido operativo y se
tiende a aplicar a cualquier tipo de multiplicidad enzimática observada. Normalmente, desde la
primera sospecha de existencia de una isoenzima, es necesario realizar numerosas pruebas
3
experimentales para establecer claramente su naturaleza y origen. En este sentido, la
nomenclatura establecida por la IUPAC-IUB (1971) recomienda el uso restringido del término
isoenzima a productos de multiplicidad debidos a causas genéticas. Esto, por tanto, excluye todas
las múltiples formas originadas por modificaciones post-traduccionales, aunque muchas enzimas,
con un importante papel fisiológico y regulador, sufran estas últimas modificaciones (Newton y
Schwartz, 1980). De acuerdo con estas recomendaciones, las múltiples formas detectadas para
una enzima no pueden ser denominadas isoenzimas hasta haber demostrado que su origen se debe
a diversidad genética. Griff¡ths y Black (1987), tras estudiar las diferentes formas de fosfatasa
alcalina en suero humano, proponen el término isoforma para todas aquellas formas de una misma
enzima cuyo origen no está totalmente establecido o es claramente post-traduccional.
Antes del descubrimiento de las isoformas, las diferencias metabólicas entre diferentes
tejidos eran explicadas en términos de variación de la cantidad relativa de cada enzima, aunque
también se consideraban importantes, en este contexto, sucesos de permeabilidad,
compartimentación o concentración y modulación por diferentes metabolitos, La amplia
distribución de isoformas y el hecho de que aquellas difieran, no sólo en su distribución tisular.,
sino también en sus propiedades cinéticas, permitió a los enzimólogos establecer su papel
metabólico dependiendo más de la “calidad’ que de la ‘cantidad’ de la proteína. Uno de los
primeros y más claros ejemplos del papel de las isoformas fue su acción en la regulación
metabólica de una célula o tejido. Una única ruta metabólica debe, por definición, consistir en la
misma secuencia de reacciones enzimáticas. Sus características reguladoras pueden variar
fUertemente dependiendo de qué isoforma en particular actúe en cada paso. En una ruta bien
conocida, como es la glucolisis, nueve de las diez enzimas implicadas en la conversión de glucosa
en piruvato presentan isoformas o isoenzimas. Quizá uno de los hechos más importantes a este
respecto sea la existencia de diferentes isoenzimas (o isoformas) en un único tejido, lo cual
proporciona una complicación temporal adicional al hecho de la diferenciación (Rider y Taylor,
1980).
4
U.- ANALITICA DE LA DETECCION DE ISOFORMÁS
Las isoformas pueden diferir unas de otras en algunas de sus propiedades fisicas y
cinéticas, así como en su distribución tisular. Aunque algunas de sus propiedades puedan parecer
más relevantes que otras, cualquier diferencia o similitud, en términos metabólicos, resultará
importante para determinar su función fisiológica.
En el análisis de isoformas deben utilizarse métodos que no compliquen su separación
fisica. Así, los métodos basados en las características inmunológicas de la proteína pueden
aplicarse a mezclas o extractos parcialmente purificados. Goffner el al. (1992> mostraron las
relaciones inmunológicas entre dos isoformas de cinamilalcohol deshidrogenasa en un extracto
crudo obtenido de xilema de Eucal¡ptusgunñ o bien entre dichas isoformas parcialmente
purificadas. Sin embargo, la mayoría de los análisis requieren la separación de cada una de las
isoformas enzimáticamente activas. La purificación y caracterización de isoformas no difiere, en
principio, de los protocolos comunes de purificación de cualquier otra proteina. La única
precaución especifica consistiría en evitar concienzudamente la inactivación de alguna de las
isoformas. ya que dicha inactivación, de suceder, llevaria a la suposición errónea de su ausencia
(Botha y Turpin. 1990). Inicialmente, pueden separarse isoformas mediante técnicas que
discriminen entre sus propiedades fisicas, como puede ser la cromatografia por interacción
hidrofóbica (Gofiher ci al., 1992) o de intercambio jónico (Botha y Turpin, 1990). Si las
isoformas tienen una diferente localización subeelular, suele ser suficiente con un protocolo de
separación de cada uno de los orgánulos (Li etal., 1991).
Dado que la diferencia real entre isoformas se establece a nivel de su actividad específica
(vn~< y Km), pH óptimo de reacción, punto isoeléctrico, peso molecular y composición de
aminoácidos, una primera aproximación a la caracterización de diferentes formas enzimáticas debe
contemplar estos parámeo-os. Por ejemplo, una de las isoformas de fructosa- 1 ,6-bifosfatasa <le
Selenastrumm¡nutum essoluble en ácido y dependiente de un medio reductor para su actividad y
estabilidad a altas temperaturas (600C). Por ello, concentraciones suficientes de ditiotreitol (DTT)
deben estar en contacto con la enzima en todos los pasosde su purificación. Su pH óptimo es
5
cercano a la neutralidad y muestra ser cuatro veces más aun por su sustrato que la isoforma
insoluble en ácido, la cual posee características opuestas a la anterior (Botha y Turpin, 1990;
Turpin el a)?, 1990). También se han descrito diferencias a nivel de pH óptimo, constantes
cinéticas y localización celular (mitocondrial y citosólica) para isoformas de ATP sulfurilasa de
Englenagracilis, siendo la forma mitocondrial cuatro veces más aun por su sustrato que la
citosólica (Li el al., 1 99 1). Los autores relacionan estas diferencias con el metabolismo del alga,
pues la reducción del sulfato es mucho más activa en las mitocondrias. Sin embargo, hay
isoformas que no presentan diferencias en sus parámetros cinéticos, como es el caso de dos
descritas para la almidón sintasa, aisladas de embriones de guisante (Denyer y Smith, 1992).
Ambas poseen el mismo valor de pH óptimo, el mismo valor de Km para A.DPglucosa y
amilopectina, ambas son termolábiles y reconocidas por los mismos anticuerpos, pero difieren
claramente en su localización celular (soluble o ligada a gránulos) y en su peso molecular.
Junto con la caracterización cinética y la localización subcelular, el estudio electroforético
de isoformas es otro punto clave para su correcta determinación. La electroforesis es utilizada
para poner de manifiesto la existencia de varias formas enzimáticas, para valorar el pl de cada una
de esas formas y su peso molecular. El soporte utilizado es generalmente variado: almidón,
agarosa, acetato de celulosa o poliacrilamida son los más utilizados. Una práctica habitual en
estos estudios es el empleo de diferentes técnicas electroforéticas en el mismo análisis. Accorsi el
al. (1987) realizaron un estudio de las isoformas de fosfoglucomutasa de eritrocitos mediante
electroforesis en geles de almidón y electroenfoque en columna o en geles de poliacrilamida. En
todos los casos fueron identificadas cuatro isoformas de la enzima. Ya que la movilidad
electroforética en los geles de almidón es utilizada como un reflejo de las diferencias de pl de las
diferentes isoformas, las descritas para fosfoglucomutasa eran de carácter ácido, si bien las
pequeñas diferencias detectadas en los valores de pl (±0.3> fUeron atribuidas a diferencias entre
las técnicas utilizadas, Sticher y iones (1992) también emplearon el isoelectroenfoque en geles de
poliacrilamida para determinar el valor de pl de las diferentes isoformas de a-amilasa de
embriones de guisante, revelando el carácter ácido de todas ellas. Trudel el al (1989)
desarrollaron un sistema de electroenfoque bidiniensional en poliacrilamida para la detección de
6
isoformas ácidas y básicas de quitinasa de tabaco, de las cuales, Majeau el al. (1990) lograron
determinar 13 diferentes a partir de semillas de pepino, usando la misma técnica.
Otro punto a considerar en la determinación de isoformas de enzimas es la diferencia de
peso molecular que aquellas presentan entre sí. Habitualmente se emplea la electroforesis en geles
de poliacrilamida (PACE), con o sin agentes desnaturalizantes, como por ejemplo, dodecilsulfato
sódico (SI)S), o bien filtración a través de columnas de Sephadex para estimar el peso molecular
de las proteínas. Normalmente, el empleo de columnas de filtración produce una sobreestimación
del peso molecular de una isoforma panicular frente a SDS-PAGE. Las diferencias de peso
molecular entre formas monoméricas cubren un amplio rango, desde 3 kDa, aproximadamente,
para la forma CADI de la cinamilalcohol deshidrogenasa (O’Malley y Sederoff, 1990) a más de 10
kDa para las isoformas de ATP sulfitrilasa de E. racilis (Li el al., 1991), Las diferencias entre
isoformas se establecen usualmente por comparación entre los pesos moleculares obtenidos en
SDS-PAGE. Así, las dos isoformas de almidón sintasa analizadas por Denyer y Smith (1992)
difieren en 17 ld)a. Menores diferencias se obtienen para las isoformas de arginasa de higado de
ratón, 3 kDa aproximadamente (Spolarics y Bond, 1988).
La composición de aminoácidos proporciona una primera visión de la similitud entre
isoformas, si bien las homologías y las diferencias deben establecerse sobre la base de la secuencia
de aminoácidos. Algunos autores comparan los patrones polipeptidicos obtenidos en PACE tras
una proteolisis parcial (Borkovich y Weiss, 1987a; Gofiher el al., 1991) o un fraccionamiento
quimico (Lischwe y Ochs, 1982,) de las isoformas para establecer homologias.
L3- ELECTROFORESIS CAPILAR Y CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA
RESOLUCION EN EXCLUSION MOLECULAR
La estimación de los valores de pi y peso molecular de isoformas son dos criterios básicos
para su caracterización. El empleo de la electroforesis en geles de poliacrilamida para determinar
ambos parámetros require un largo periodo de tiempo, tanto para la preparación de los geles
como para el desarrollo de la separación y la posterior tinción de la muestra. El desarrollo de
.7
técnicas como la cromatografla líquida de alta resolución (IIPLC) para la separación de proteinas
y péptidos y la electroforesis capilar ofrecen la posibilidad de un análisis rápido, eficaz y altamente
sensible de proteinas frente a métodos tradicionales.
En la última década, la cromatografia líquida de alta resolución ha sido ampliamente usada
en el análisis y la purificación de las proteínas. Básicamente se han descrito tres diferentes
estrategias para lograr una buena separación. La primera se centra en mecanismos de intercambio
jónico: la proteina se comporta como un lón y su retención, resolución y detección se produce
gracias a su interacción, como tal ión, con la fase estacionaria (Vuan y Pietrzyk, 1990). La
segunda aproximación se realiza mediante columnas de fase reversa. El interés principal de este
procedimiento reside en la hidrofobicidad de la fase estacionaria, su estabilidad frente a posibles
hidrólisis proteicas, así como la estructura del poro de la matriz de sílice. Sin embargo, no hay
relación alguna entre la retención de la muestra en la columna y su peso molecular, por lo que la
separación se lleva a cabo sobre la base de la hidrofobicidad de la proteína (Davankov el al.,
1 990; Pedroso el c’l., 1 987). En la tercera estrategia, la cromatografia de exclusión molecular, la
más usada en el análisis y caracterización de proteínas, la separación se lleva a cabo de acuerdo
con el peso molecular de la muestra.
La cromatografia de permeación o filtración se estableció inicialmente con el uso de geles
formados por entrecruzamiento y unión de dextranos con epiclorhidrina (Sephadex). Sin
embargo, el proceso de preparación de estos geles no rinde matrices totalmente homogéneas, lo
que limita en gran medida la resolución de la columna (Warzecha e/al., 1990). Por el contrario, la
cromatografia de exclusión molecular emplea fases estacionarias generalmente rígidas, basadas en
resinas polirnéricas como el polimetracrilato, o bien en micropartículas de sílice que son estables
en fases acuosas para un intervalo de pH de 4 a 9. Mediante el uso de estas fases se logra una alta
resolución, eficacia y reproducibilidad frente a los sistemas tradicionales de filtración (Fallon cl
al., 1 987), además de permitir la recuperación de más del 90% de la muestra empleada.
La separación de muestras en 1-IPLC de exclusión molecular (SE-HPLC) requiere un
soporte inerte frente a interacciones iónicas, hidrofóbicas o de adsorción. Esto implica una
elección adecuada de la columna así como de la fase móvil para obtener la máxima eficacia
8
(Fallon el al., 1987; Wu el al,, 1989). La columna debe contener un relleno altamente hidrofilico,
como es el caso de las columnas TSK-PWXL o Zorbax-diol. La presencia de grupos residuales
carboxilo en la superficie de empaquetamiento para la primera y los grupos dialcohol para la
segunda dan como consecuencia una correcta relación entre los tiempos de retención obtenidos
para cada proteina y el peso molecular de la misma (Nagy, 1990). La fase móvil puede afectar a la
resolución a través de la interacción directa con la fase estacionaria y con el soluto. La
manipulación del ph y de la fUerza iónica del tampón utilizado como eluente evitará otras
interacciones indeseables (Ujházy e/al., 1989). Por otro lado, se recomienda el uso de columnas
cortas con un diámetro de partícula pequeño, pues éstas permiten operar con bajos valores de
flujo (0,3-1,0 mLmin-1), reduciendo el término de transferencia de masas, de gran importancia
para optimizar las separaciones de proteínas (Failon e/al., 1987; Yamamoto e/al., 1990).
I.~a posibilidad de incluir agentes fuertemente desnaturalizantes, como SDS al 0. 1~o o
cloruro de guanidina 6M en las fases móviles utilizadas en SE-HPLC, supone otra ventaja de esta
técnica. La adición de agentes desnaturalizantes reduce cualquier interacción química del soluto
con la fase estacionaria, elimina las interacciones hidrofóbicas y la proteina se comporta de forma
ideal. En el caso de proteínas formadas por varias subunidades, la combinación de fases
conteniendo SDS con la desnaturalización previa de la proteína nos permitirá calcular el peso
molecular del monómero. La comparación de este método con SDS-PAGE permite concluir,
razonablemente, que la cromatografla es más adecuada, sobre todo si se conocen previamente un
cierto número de propiedades de la proteína sujeto de la separación (Fallon el al., 1987).
La electroforesis es una poderosa herramienta para la separación de especies iónicas,
especialmente biopolímeros como proteínas y ácidos nucleicos. Durante los últimos cuarenta
años, electroforesis en papel, almidón, acetato de celulosa, agarosa o poliacrilamida han sido
empleadas para separar péptidos, proteínas y polinucleótidos. A pesar de su versatilidad y
utilidad, la realidad es que se trata de un método laborioso y relativamente lento.
Desde su descripción, en los años 30, la técnica electroforética ha experimentado
importantes avances. La electroforesis capilar zonal flie desarrollada por Mikkers el al. (1979)
para la separación de pequeños aniones como, por ejemplo, el anión cloruro, por detección
9
conductimétrica en un capilar de Teflon, de 200 ~imde diámetro interno. Jorgenson y Lukacs
(1981) realizaron detallados estudios en electroforesis capilar utilizando columnas de vidrio y
sílice fundida y acoplando sistemas de detección óptica. Algunos de sus primeros estudios con
mezclas de aminoácidos dansilados muestran eficacias de — 250.000 platos teóricos, empleando
voltajes de 300 Vcm-1 de capilar.
El diseño experimental para llevar a cabo una electroforesis capilar es relativamente
sencillo: un capilar cuyos extremos están sumergidos en un reservorio lleno de un electrolito y un
electrodo de alto voltaje. Cerca de uno de los extremos del capilar se construye una ventana
frente a la que se sitúa el detector, habitualmente espectrofotométrico en la zona ultravioleta
(Compton y Browlee, 1988; Lux el al, 1990). El capilar, lógicamente, representa la columna de
separación. Se trata, en general, de un capilar de sílice fundida cubierto de poliimida, lo que le
proporciona gran flexibilidad. La sílice fUndida posee una alta transparencia en el UV-visible y es,
por tanto, un material deseable para estos sistemas de detección. El desarrollo reciente de
columnas capilares ha representado un importante avance técnico en la electroforesis capilar zonal
(Ewin e/al, 1989; Gordon el al, 1988; Grossy Yeung, 1990; Grossman elal, 1989). La técnica
con columnas capilares es deseable por su automatización con datos de análisis a tiempo real. Las
cantidades de muestra usadas son del rango de nanolitros y el volumen de tampón usado suele
estar en el rango de los mililitros. El tampón, usado como electrolito, es estable dentro del capilar
frente a movimientos de convección o difUsión.
En general, las sustancias a separar, al encontrarse a un determinado pH, adquieren una
carga neta (positiva o negativa) en fUnción de la cual se desplazan a lo largo del capilar cuando se
aplica en éste una diferencia de potencial entre sus extremos. La carga de un pequeño péptído
puede ser estimada a partir de los valores de pKa de los aminoácidos individualmente
considerados y en función de la relación carga/masa se puede predecir su movilidad
electroforética en un electrolito determinado, Por el contrario, la movilidad electroforética en el
análisis de proteínas viene modificada por su hidrofobicidad, secuencia primaria o conformación
(Rickard el al., 1991). Además, la carga de una proteina puede variar en función del pl-> del
electrolito. Deyl el al. (1989)han estudiado la movilidad electroforética de proteinas de diferente
10
peso molecular en capilares de sílice sin tratar, con un rango de pH para el electrolito
comprendido entre 6,9 y 10.5, llegando a demostrar la existenca de una relación lineal entre
movilidad electroforética y pl.
Uno de los principales problemas en electroforesis capilar de proteinas usando capilares de
sílice sin tratar, es la adsorción de Ja proteína a través de sus cargas positivas a los grupos silanol
de la pared del capilar. Este mecanismo produce un ensachamiento de la banda, lo que se traduce
en una eficacia pobre. Lauer y MeManigilí (1986) propusieron realizar la separación de una
proteina con altos valores de pH del electrolito, de manera que proteína y paredes del capilar
presentasen cargas negativas. A valores de pH superiores a 8,0 se genera un fUerte flujo
electroosmótico (movimiento global del electrolito en el interior del capilar) que proporciona una
velocidad constante de migración. Esto facilita el avance de proteinas con fUerte carga negativa,
acortando así el tiempo de análisis (Chen el al., 1991). Chen el al. (1992) emplearon como
electrolito tampones de alta fUerza iónica (por ejemplo, tampón fosfato sódico 0,12 M) para
mejorar asi la eficacia en la separación de proteinas. En estas condiciones, la sal compite con la
proteína por los sitios de adsorción sobre la pared del capilar. La única limitación es la generación
de un efecto Joule intolerable para capilares con un diámetro interno superior a 75 gm. Otra
alternativa es eliminar las proteínas adsorbidas mediante el lavado del capilar con disoluciones
ácidas (ácido fosfórico) o básicas (hidróxido sódico) entre cada análisis, con objeto de restaurar
las condiciones iniciales del capilar (Zhu el al., 1990). El principal inconveniente de esta técnica es
el acortamiento de la vida media del capilar.
Las proteínas también pueden ser separadas en electroforesis capilar sobre la base de su
peso molecular, para lo cual se utilizan capilares rellenos de geles, como poliacrilamida (Hjerten e~
al., 1987; Widhalm el al., 1991). Estos geles, además de eliminar los efectos de carga en
superficie, introducen un nuevo factor, como es el tamaño del poro creado por el gel. Igualmente,
el empleo de geles de poliacrilamida con SDS como relleno de los capilares permite utilizar la
electroforesis capilar para el estudio de las proteínas en condiciones desnaturalizantes, de manera
similar a la electroforesis convencional con SDS (Cohen y Karger, 1987; Cohen el al., 1987;
Tsuji, 1991).
11
1.4.- ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES LIGANDO-PROTEINA
Una caracteristica común de la proteinas es que, de forma invariable, interaccionan
fisicamente con otras nrnléculas. Una proteina nunca actúa sola, sino que siempre actúa en un
entorno molecular heterogéneo. Por tanto, un punto de interés es caracterizar la interacción de la
proteína con esas otras moléculas.
Además de la interacción sustrato-enzima. que determina la función de esta última, pueden
encontrarse interacciones entre la enzima y moléculas reguladoras o efectoras que, de manera
habitual, son estructuralmente diferentes del sustrato o de los productos de reacción. Estos
efectores pueden activar o inhibir la enzima de diferentes maneras, competitiva., acompetitiva, no
competitiva o mixta, en función del sitio de unión del efector a la proteína (¡‘rice y Stevens,
1986).
Diferentes métodos permiten estudiar la unión de una molécula efectora a una enzima
Uno de estos métodos se basa en la medición de los cambios producidos en el espectro
ultravioleta de la enzima. Por ejemplo, la unión de Leu a a-isopropilmalato sintasa produce
cambios conformacionales detectables mediante variaciones en su espectro ultravioleta. Estas
variaciones se identifican como un cambio en la exposición de ciertos residuos aminoacídicos (Tyr
y Trp, principalmente) en la enzima (Teng-Leary y Kohlhaw, 1973). El ligamiento de sales biliares
a seroalbúmina de vaca se ha estudiado mediante fluorescencia y dicroismo circular. La unión de
las sales produce un descenso de la fluorescencia natural de la enzima a 350 nm, lo cual implica
que el ligamiento se produce en un entorno próximo a los residuos Trp de la proteína. Así mismo,
se han observado cambios en el espectro de dicroismo circular (Pico y Houssier, 1989). Esta
última técnica, junto con los espectros ultravioleta de la proteína, también se ha utilizado para
estudiar el ligamiento de varios efectores a la enzima indolamina-2,3-dioxigenasa (Sono, 1989),
Todas estas técnicas son indicativas de que existe unión efector-enzima, pero por sí
mismas no permiten cuantificar el número de moléculas efectoras que se unen a la proteína ni la
cinética de su unión. Este tipo de estudios se realiza habitualmente mediante equilibrio de diálisis.
Para ello, se utiliza un sistema bicameral, separadas ambas cámaras mediante una membrana
12
semipermeable. Un volumen conocido de una disolución de proteína, de concentración también
conocida, se sitúa a un lado de la membrana y al otro, un volumen conocido de una disolución de
ligando, de concentración también conocida. La cantidad de efector unido a la proteina se
determina, una vez alcanzadas las condiciones de equilibrio de diálisis, mediante la valoración del
efector libre (Klotz, 1989). Los datos obtenidos a partir de estos estudios se representan,
habitualmente, mediante gráficas de Scatchard (Scatchard, 1949). Cuando dicha representación
gráfica proporciona una linea recta, los sitios de unión por molécula de proteína se calculan como
el punto de intersección de dicha recta con el eje de abscisas. Sin embargo, numerosos casos
experimentales muestra un claro alejamiento de la linearidad, produciendo curvas cóncavo••
convexas, como ocurre para la unión del laurato a seroalbúmina de vaca (Pedersen el al,, 1986> o
bien curvas parabólicas, como en la unión de Leu a a-isopropilmalato sintasa (Teng-Leary y
Kohlhaw, 1973). En el primer caso, la forma cóncava se interpreta como existencia de
cooperatividad negativa en la unión mientras que en el segundo, la curvatura obtenida indicaria
cooperatividad positiva en el ligamiento. Los dos tipos de cooperatividad pueden ser mimetizados
por diferentes artefactos (Mendel el al, 1985; Ishida el al, 1988; Price y Stevens, 1986), por lo
que es habitual recurrir a varias, no solo a una, representaciones gráficas de los datos de
ligamiento que pongan de manifiesto estos posibles artefactos (Klotz, 1989>. De esta forma se
determinan tanto la existencia de cooperatividad real como el número de sitios de unión en la
proteína para la molécula efectora.
1.5.- ARGINASAS Y SUS ISOFORMAS
La arginasa, L-arginina amidinohidrolasa (EC. 3.5,3.1), está ampliamente distribuida en la
naturaleza. Fía sido particularmente estudiada en tejidos animales, en relación con la excreción de
nitrógeno y el ciclo de la urea. También se ha purificado y caracterizado en plantas, en sus
semillas y en muchos microorganismos.
En la formación de semillas de leguminosas, un suceso de capital importancia es la
acumulación de proteínas de almacenamiento, ricas en arginina, que serán la principal fuente <le
13
nitrógeno para el crecimiento del eje embrionario durante Ja germinación (Bewley y Black, 1983).
Esto implica una clara dependencia entre germinación y las enzimas del metabolismo de la
arginina. Por ejemplo, la actividad arginasa incrementa (Matsubara y Suzuki, 1984) o permanece
constante (De Ruiter y Kollófell, 1983) durante la germinación de semillas de soja y guisante,
respectivamente. Ya que los cotiledones y el eje embrionario son metabólicamente diferentes
durante el proceso, la enzima puede tener papeles metabólicos también diferentes. Pawashe y
Srivastava (¡987) describieron una actividad arginasa en semillas de garbanzo (ti¿cer ar¡el¡num)
que incrementa rápidamente en los cotiledones como respuesta a la movilización de las proteínas
ricas en arginina, mientras que dicha actividad desciende rápidamente en el eje embrionario
durante los primeros estadios del desarrollo.
Kang y Cho (1990) purificaron y caracterizaron esta enzima a partir de cotiledones de soja
((3/peine mcix). Su peso molecular era de 220 kDa, estimado por filtración a través de Sephadex
G-200. La electroforesis desnaturalizante de la proteína purificada dio una única banda de 55
kDa, lo que indicaba que la proteína estaba presente como un tetrámero. Su Km fue estimada en
83 mM, siendo activada por putrescina. La enzima resultó ser dependiente de Mn21 para
desarrollar su actividad, lo cual es una característica que se repite para todas las arginasas,
independientemente de la fuente, como podrían ser higado de rata (Kanyo el al., 1992) o las
arginasas codificadas por el plásmido TiCS8 de Agrobacíerizem (Shrell el al., 1989). La única
excepción conocida resultó ser la arginasa de Bac/Ibiscaldovelox (Patchett el al,, 1991). Aunque
la función del catión no está totalmente esclarecida, Green et al. (1990, 1991) sugirieron un doble
papel catalítico y estructural para el Mn2±respecto a la arginasa de Saccharoi’nyces cerevisicie.
Maggini el al, (1992) describieron una arginasa presente en hígado de rata, dependiente de Mn2+,
para cuyo sustrato mostraba una fuerte cooperatividad positiva (~o~ = 6,5 pM). Sin embargo, en
ausencia de Mn2~, la Km de la enzima aumentaba hasta 21 ~íM, lo que indicaría un importante
papel regulador del catión.
Soru (1983) estudió las propiedades químicas e inmunológicas de la arginasa de Bacillus
aníhracis y de Síaphyllococcus aureus, llegando a la conclusión de que desempeñaban funciones
distintas en sus respectivos organismos. En ái aureus se encontraron otras enzimas del ciclo de la
14
urea, no así en B. aníbracis. Respecto a esta última especie bacteriana, sus cepas patógenas eran
siempre encapsuladas y, además, mostraban una elevada actividad arginasa. Por el contrario, las
cepas no encapsuladas tenían niveles casi inapreciables de dicha actividad.
I?hodobacíer capsulo/ns posee una arginasa inducible por L-arginina y L-homoarginina
(Moreno-Vivían el al., 1992), dependiente de Mn2±pero fUertemente inhibida por Zn2±,Cu2±,
Cys y Orn. La enzima estaba formada por cuatro subunidades idénticas, de 3 1 kDa de peso
molecular. Su Km era de 16 mM, valor muy similar al obtenido para la arginasa de S. cerevisicie
(Creen el al., 1990). Sin embargo, la enzima de esta última especie era un trimero que se
encontraba formando un complejo con ornitina transcarbamilasa (Duong el al., 1986; Lisenstein
el al., 1986). La arginasa de levadura también mostró ser una enzima sujeta a inducción
nutricional por su sustrato (Whitnery y Magasaniki, 1973). Cooper el al. (1992), empleando
diferentes mutantes de 5. cerevisicie, demostraron la existencia de un control transcripcional de la
enzima por arginina. tinto en plantas como en microorganismos, la arginasa parece ser una
enzima inducible. También son inducibles las de higado de rata (Spolarics y Bond, 1988) e higado
humano (lkemoto ei~ al.. 1989). En Neurospora cra&~a, la arginasa está siempre presente en
cantidades significativas y es activada por liberación de arginina desde la vacuola (Weiss y Davis,
1977). A, este respecto. Borkovich y Weiss (1 987a) describieron un aumento de actividad de hasta
3 veces sobre los niveles basales de arginasa cuando el micelio crece en un medio con L-arginína
como única fuente de nitrógeno.
La estimación del peso molecular de las diferentes arginasas purificadas mediante filtración
por gel o electroforesis con SDS indican que todas ellas poseen una subunidad básica, cuyo peso
molecular oscila entre 30 kDa para la de hígado de rata a 55 kDa para la de soja. La enzima
nativa, a su vez, podrá estar formada por un número variable de subunidades, entre 3, para la de
hígado humano, y 7, para la de N. crassa Ikemoto et al. (1990) purificaron a homogeneidad una
arginasa de hígado humano a partir de cepas donadas de Escherichia colí. El peso molecular de
esta proteína fUe estimado en 35 kDa, no aislándose en ningún caso formas poliméricas. Los
autores concluyeron que este monómero debería ser la auténtica forma de arginasa, mientras que
15
dímeros, trímeros o tetrámeros detectados para la arginasa humana se debían a artefactos en el
proceso de purificación, que favorecerían la autoasociación de la enzima.
Se ha descrito con frecuencia la aparición de isoenzimas como mecanismo regulador de
ciertas rutas metabólicas. No se han descrito isoformas de arginasa en bulbos de Iris (Boutin,
1982), J>isumsatirum (Talory Stewart, 1981), en alcachofa(Wright el al., 1981)0 en soja (Kang
y Cho, 1990). Por el contrario, se han descrito isoformas de arginasa en microorganismos y
tejidos animales. Así, Borkovich y Weiss (1987a y b) describieron en N. craxw.¡ dos isoformas de
arginasa que diferían en su peso molecular (26,8 RDa y 31,7 RDa) y que estaban
inmunológicamente relacionadas con la arginasa de S. cerevisiae. El empleo de cepas de
Neurospora deficientes en arginasa puso de manifiesto que ambas formas eran codificadas o
reguladas por el mismo locus regulador, aga (Borkovich y Weiss, ]987b>.
La variación en las propiedades de las isoformas de arginasa durante el desarrollo ha sido
estudiada en tejidos fetales y adultos humanos, encontrando diferencias en sus propiedades
inmunológicas; sin embargo poseen idéntica Km, termoestabilidad, requerimiento de cationes para
su actividad y ambas son inhibidas por ornitina (Spector el al., 1982). En riñón de rata, Skrzypek-
Osiecka el al (1983) estudiaron dos isoenzimas de arginasa, j o citoplásmica y A2 o
mitocondrial, concentrando esta última el 98% de la actividad total. Las dos formas se
diferenciaban en sus propiedades inmunológicas y electroforéticas. Sin embargo, las arginasas de
hígado y eritrocito humano eran similares en cuanto a peso molecular y propiedades
inmunológicas (Ikemoto ci al., 1990).
Spolarics y Bond (1988) detectaron dos formas de arginasa en el citosol de células de
hígado de ratón que se diferenciaban en su peso molecular ( 35 RDa y 38 kDa, respectivamente) y
en su punto isoleléctrico (7,8 y 5,8). La proteolisis limitada con tripsina eliminaba un fragmento
de aproximadamente 3 kDa que no afectaba a la actividad o al pl de la isoforma. La composición
de aminoácidos de las dos formas era similar (— 87% de homologia) a las arginasas de hígado de
rata y humano. Los autores relacionaron la aparición de varias isoformas de diferente tamaño y
carga en hígado de rata con la fUnción de la enzima en diferentes rutas metabólicas: ciclo de la
urea, síntesis de prolina o ácido glutámico o síntesis de poliaininas, ya que estas rutas deberian ser
16
independientemente reguladas. La existencia de isoformas implica la posibilidad de regular
arginasa bajo diferentes condiciones fisiológicas o patológicas, ya que también se han detectado
cambios en estados iniciales de diabetes o hiperargininemia.
1.6.-CATABOLISMO DE LA ARGININA EN LIQUENES
Para los liquenes que contienen cianobiontes. glutamato y glutamina son los productos
primarios de asimilación del nitrógeno (Rai, 1988). Sin embargo, los liquenes que contienen un
alga verde acumulan grandes cantidades de arginina (Evernia prunasírí) mientras que otras
especies (Roce/la mon/agnel, (Jadoiña rang¡/érina, U. gracilis. Parmelia ¡mc/omm, 1>.
nepalensis) acumulan Glx y Asx como los más abundantes en el conjunto de aminoácidos libres
(Vicente y Legaz, 1988b). aunque el contenido en arginina suele ser también alto. La abundancia
relativa de cada uno de los aminoácidos de este conjunto está sometida a variaciones estacionales
(Legaze/a/., 1986).
A continuación se muestra un esquema sobre las diferentes rutas del catabolismo de
arginina en It. primas/rl.
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7
18
1.61.- Ar2¡nasa y oniltina descarboxilasa
.
Los estudios sobre el contenido en poliaminas de varias especies de líquenes indican que la
arginina es rápidamente metabolizada tras la hidratación del talo. La hidrólisis de arginina por
arginasa produce ornitina y urea. La enzima es inducida por su sustrato en 1<1 prunaslri en
oscuridad (Lega.z y Vicente, 1980), aunque también se detecta actividad tras la incubación en luz.
La adición de urea a los medios de cultivo previene, o disminuye, la inducción de arginasa
causada por el aminoácido. Una arginasa purificada 158 veces (peso molecular ¡ 80 kDa) muestra
un valor de K~1 para arginina de 0,2 mM. El pH óptimo de la reacción es bimaximal, con un pico
principal a pH 9.0 y un maxímo secundario a pH 6,5 (Legaz y Vicente, 1982). La urea se
comporta como un inhibidor competitivo de la enzima, con un valor de Ki de 2,58 mM, mientras
que la agmatina se comporta como inhibidor no competitivo, con una Ki de 21,54 mM. Ornitina y
putrescína son activadores de la enzima, mientras que la fuerte inhibición producida por urea debe
interpretarse como un mecanismo de retroinhibición que asegura una completa y efectiva
regulación de la actividad arginasa (Vicente y Legaz, 1983).
Una segunda forma de arginasa, ésta constitutiva, está presente en talos de E. prunastri.
La proteina, pre-existente e inactiva, es activada por la liberación de la arginina, probablemente
secuestrada en las vacuolas, al citosol tras la hidratación de los talos. La enzima ha sido purificada
920 veces a partir de talos incubados sobre cicloheximida para evitar la aparición de la forma
inducible. Su peso molecular es de 330 RDa. Las curvas de saturación por sustrato muestran una
cinética típicamente micaeliana con un valor de Km para arginina de 2,5 mM (Martin-Falquina y
Legaz, 1984). Ornitina, agmatina y putrescina se comportan como activadores no esenciales de la
enzima. Los valores de Ka aparente, estimados mediante la representación de Dixon, son 1,1 mM
para ornitina, 5,88 mM para agmatina y 2,7 mM para putrescina. La arginasa constitutiva, así
como la inducible, requieren específicamente Mn2±como cofactor, La contaminación con
arginasas bacterianas ha sido descartada en ambos casos, ya que incubaciones en presencia de
penicilina rebajan enormemente el número de bacterias vivas sin afectar la actividad arginasa
recuperable (Vicente y Legaz, 1 988a).
19
Los fenoles liquénicos mayoritarios en los extractos libres de células correspondientes a
cada una de las formas de arginasa descritas muestran ser activadores de sus correspondientes
arginasas en los rangos de concentración fisiológicos (Legaz, 199!). Dado que algunas de estas
activaciones producen un incremento aparente en el valor de h, por ejemplo, de 1,0 a 1,7 para la
arginasa de inducible, la hipótesis de diferentes formas poliméricas va tomando carta de
naturaleza, siendo posiblemente los fenoles accesibles a la enzima citosólica los responsables de
tal polimerización (Legaz, 1991).
Ornitina, uno de los productos de hidrólisis de arginina, puede ser posteriormente
descarboxilada para producir putrescina y urea. Escribano y Legaz (1984) encontraron actividad
ornitina descarboxilasa en talos de ¡ti prunasírí incubados sobre ornitina en oscuridad. La enzima
era también detectable cuando los talos se incubaban sobre tampón Tris-HCI, aunque la actividad
final desarrollada era 2,5 veces menor que la encontrada tras la incubación sobre el aminoácido.
La adición de cicloheximida 40 1tM a los talos cultivados sobre ornitina no anula la actividad
descarboxilasa. Sin embargo, cloranfenicol 0, 1 mM provoca una pérdida del 95% de la actividad
descarboxilasa. Por ello, los autores especulan acerca de la existencia de dos enzimas, una de
síntesis citosólica y otra organular. Aproximadamente el 80% de la actividad descarboxilasa total
depende de la proteína sintetizada en orgánulos.
1.6.2.- La vía descarboxilativa de la arilinina
.
Una vía alternativa a la hidrólisis de la arginina es su descarboxilación para producir
agmatina. Talos de E prunasírí incubados sobre arginina 40 mM en oscuridad desarrollan una
actividad arginina descarboxilasa inducible, aunque dicha actividad comienza a decrecer a las 4h
de incubación, Vicente y Legaz (1981) purificaron esta enzima 117 veces. Su pH óptimo es 7,1 y
su temperatura óptima, 260C. La masa molecular de esta proteína se ha estimado en 300 RDa. La
cinética de saturación por sustrato indica que se trata de una enzima micaeliana cuyo valor de Km
ha sido estimado en 12,5 mM para arginina. Por ello, a nivel de afininad por el sustrato, parece
más efectiva la vía hidrolitica que la descarboxilante. Putrescina y urea inhiben significativamente
20
la descarboxilasa, lo que sugiere un posible mecanismo regulador de actividad por retroinhibición.
La agmatina, que era un potente inhibidor de arginasa. sólo muestra en este caso una moderada
acción inhibitoria de la descarboxilasa.
La agmatina producida por descarboxilación de la arginasa puede ser hidrolizada por una
agmatina amidinohidrolasa para dar putrescina y urea. Una enzima purificada 485 veces de talos
de ¡tI prunaslri muestra un pu óptimo de 6,9, y temperaturas óptimas entre 350C y 400C, aunque
a 00C se mantiene un 6% de la actividad máxima de la preparación purificada, así como un 20% a
700C. La masa molecular de esta enzima ha sido estimada en 320 kDa. A partir de la
representación de Woolf, el valor de Km calculado para la agmatina es de 6,4 mM (Vicente y
Legaz, 1982). La enzima muestra especificidad por agmatina y no hidroliza arginina, ornitina o
putrescina. Estos últimos tres análogos se comportan como activadores de la hidrolasa para
concentraciones de agmatina menores de 14 mM, pero para valores más altos, los tres
compuestos se comportan como inhibidores de la enzima. La urea inhibe completamente la
actividad agmatina amidinohidrolasa.
La agmatina producida por acción de una arginina descarboxilasa puede ser también
convertida en N-carbamil putrescina por acción de una agmatina iminohidrolasa. Esta vía, que fue
descrita para plantas superiores como Hordeum vulgare, Zea mays and (Jlycine mcix, ha sido
también encontrada en talos de ¡ti prunas/rí incubados durante 2h en tampón Tris-HCI, No
obstante, la adición de arginina soporta un fuerte incremento de actividad hasta las 4h de
incubación. La aparición de actividad hidrolasa era dependiente de la síntesis actual de proteínas.
Tal hidrolasa fue purificada 34,5 veces, obteniéndose un valor de Km para agmatina de 0,8 mM.
La urea se comporta como un activador de la enzima mientras que arginina inhibe la hidrolasa
para concentraciones de agmatina superiores a 4 mM. Para concentraciones de sustrato inferiores
a 2 mM, arginina se comporta como un activador de la enzima (Legaz e/al., 1983).
21
1.6.3.- Síntesisy transiocación de poijaininas
.
Sobre la base de los pH óptimos para las enzimas clave del metabolismo biosintético de la
putrescina, se han establecido dos rutas principales, una alcalina. fungica, que parece ser
mayoritaria, y otra, neutra, alga! y minoritaria (Legaz, 1985, ¡991). 1’]. primas/rl sintetiza
putrescina, espermidina y espermina, siendo la espermidina el compuesto que se encuentra
siempre en mayores cantidades en talos recién recolectados. Valores ácidos de pH (5,5) producen
un descenso en la cantidad de putrescina y espermina tanto libres como conjugadas, mientras que
los niveles de espermidina permanecen prácticamente inalterados, al menos tras 8 Ii de incubación
de los talos a este pH. En estas condiciones, la putrescina es la única poliamina segregada a los
medios de incubación. Valores neutros de pH permiten tina lenta pero constante y significativa
producción de putrescina y favorecen la conjugación con macromoléculas tanto de putrescina
como de espermina. A estos valores de pH, la secreción de las tres poliaminas al medio es
promovida, principalmente como formas libres. Los niveles de poliaminas libres en talo
permanecen estables a valores de pH en el rango de la alcalinidad, mientras que disminuye
marcadamente la conjugación de putrescina y espermina a pequeñas moléculas. En estas
condiciones, la principal poliamina segregada a los medios de incubación resulta ser la
espermidina (Escribano, 1991).
Las poliaminas en líquenes parecen estar envueltas en la regulación del crecimiento del
talo, viabilidad de los fotobiontes y en la estabilidad del equilibrio de la simbiosis (Escribano y
Legaz. 1985; Legaz, 1985; Legaz el al., 1985). Aunque ambos simbiontes pueden sintetizar
putrescina (Legaz, 1985), sólo un 0.6% de la diamina total suministrada de forma exógena a talos
de E. pruna4lri es posteriormente localizada como putrescina libre en el ficobionte. Esto parece
indicar que las algas controlan el influjo de la poliamina quizá como un mecanismo de defensa
frente a los efectos tóxicos de la diamina sobre su metabolismo (Vicente y Legaz, 1983). Esto
está de acuerdo con la hipótesis según la cual la putrescina, cuando es producida por el
micobionte, o se mueve hacia él, va a ser conjugada en un alto porcentaje (Escribano and Lega.z,
1988). Por otra parte, se ha demostrado que cuando talos de It. prunaslr¡ son incubados en
22
medios líquidos a pH 5.0 (Legaz and Escribano, 1987), la putrescina diprotonada es atrapada en
la pared celular y allí puede ser, en parte, degradada a 1-pirrolina, antes de su entrada en la célula,
por acción de una diamino oxidasa segregable.
Recientemente se ha identificado y caracterizado parcialmente un sistema de transporte
para putrescina en talos de It. primas/rí midiendo el consumo de putrescina marcada
radiactivamente (Legaz e/ al,, 1 993a). La captación de la diamina muestra ser independiente de la
temperatura y alcanza su máximo valor para pH alcalinos. Los valores de Kni y vmax para el
transporte de putrescina en estas condiciones experimentales son 5.3 mM y 12.5 ~tmolir1,
respectivamente. No se ha observado ningún efecto sobre el transporte y la adsorción al tratar los
talos con algunos inhibidores metabólicos, como cianuro sódico y 2,4-dinitrofenol, así como con
el fungicida nistatina. Esto sugiere que la captación de putrescina es independiente de energía,
muy rápida y mediada por un transportador. La putrescina transportada queda principalmente
localizada en el citosol y airededor del 65% de la putrescina total captada se encuentra en las
células del micobionte.
De igual forma, se ha estudiado la posibilidad de competición de este sistema de
transporte con otros metabolitos. Los experimentos de competición para la captación incluyen
tanto transporte como adsorción sobre paredes celulares (Escribano e/al., 1993). En este sentido
espermidina y esperniina se comportan como inhibidores competitivos del sistema de transporte
de putrescina con valores de Ki de 1.55 mM y 1.34 mM, respectivamente. Los aminoácidos
básicos, como arginina, ornitina y lisina, no compiten por el mismo sitio de adsorción. La
putrescina captada no parece ser convertida eficientemente en otras poliaminas después de su
transporte. Estos resultados sugieren que la movilidad de putrescina dentro del talo está primada
hacia el micobionte.
L&4- La función de la arsinasa se2re2able
.
No existe, hasta la actualidad, ningún trabajo experimental que aporte resultados sobre
secreción macromolecular en liquenes en condiciones naturales. Sin embargo, la experimentación
23
llevada a cabo en condiciones de laboratorio, mediante la cual se intenta estudiar las
características bioquímicas de síntesis de material preferentememente enzimático. utiliza a menudo
cultivos de talo sobre medios líquidos durante cortos períodos de tiempo. En estas condiciones, se
ha observado secreción de algunas actividades enziniáticas, aunque el papel fisiológico que tal
secreción pueda tener es materia sujeto de controversia.
Cada vez son más las proteínas extracelulares que, tras su análisis bioquimico, aparecen
glicosiladas con una cantidad variable de carbohidratos unidos covalentemente a la secuencía
polipeptidica. La glicosilación primaria se realiza a su paso por la membrana del retículo
endoplásmico, topográficamente muy cerca del punto de unión del ribosoma a la membrana. La
síntesis del enlace covalente depende del reconocimiento de una secuencia particular de
aminoácidos. Las glicosilaciones subsecuentes son catalizadas por enzimas particuladas en la
membrana, siendo la secuencia final de monosacáridos, regida por la especificidad de cada enzima
por el nucleótido de azúcar y el aceptor. Detecciones citoquimicas del proceso completo
confirman que la formación del oligosacárido inicial ocurre en el retículo endoplásmico rugoso
mientras que las restantes adiciones se realizan al paso de la proteína por el resto de las
membranas y dentro de las vesículas de Colgi, que actuarán después como vesiculas secretoras
(Priest, 1987). La secreción de glicoproteinas debe ser mirada, entonces, como un mecanismo de
pinocitosis reversa (Winterburn y Phelps, 1972). Glicosilación como señal de secreción no sólo
afecta a proteínas enzimáticas. La existencia y función de proteínas glicosiladas, producidas por
los fotobiontes de E. prunas/rí y Pseudeverniafur¡uracea, que actúan como proteinas represoras
sin actividad enzimática conocida, ha sido recientemente demostrada (Pérez-Urria el al., 1 989a;
Rodríguez el aL, 1989).
En todos los casos, las enzimas segregadas por liquenes parecen ser formas modificadas
de una enzima inducible. Cuando se hacen flotar talos de ¡ti prnnas/ri sobre urea, la ureasa es
inducida y, después de esto, una parte de dicha ureasa es segregada al medio como una función
inversa de la cantidad de enzima retenida por el talo (Blanco e/ al., 1984; Vicente y Blanco,
1985). Cuando la producción de la enzima es inhibida por cicloheximida, un inhibidor de la
traducción en ribosomas SOS, la secreción de la enzima es inmediatamente anulada (Vicente y
24
Pérez-Urna. ¡989). La misma especie de liquen produce, al menos, dos formas de arginasa
cítosólica. siendo una de ellas constitutiva mientras que la otra se comporta como inducible por
arginina (Legaz y Vicente, 1982). Simultáneamente, se ha podido verificar la existencia de
actividad arginasa en los medios de incubación de los talos. Pues bien, el análisis del peso
molecular de la arginasa segregada indica claramente que la enzima inducible es la única forma
recuperada como enzima extracelular (Planelles y Legar., 1987). La enzima muestra ser una
glicoproteina que contiene 280 residuos de glucosa, 27 de fructosa y 85 de manosa por molécula
de proteína. El heteroglicopolimero tiene un peso molecular de 65 kDa (Planelles y Legaz, 1987)
por lo que el peso molecular de la glicoproteina se ha estimado en 245 RDa, El valor de Km para
esta enzima ha sido estimado en 1,5 mM para L-arginina, mientras que la de la enzima cítosólica
soluble es 0.2 mM. En este caso, la glicosilación implica una pérdida en la afinidad de la enzima
por su sustrato.
Es interesante describir que pueden establecerse buenas correlaciones entre el contenido
hídrico relativo del talo y la secreción de ureasa para dos especies diferentes de liquenes que
crecen sobre el mismo sustrato. Por ejemplo, (‘tararia niva/ls segrega mayor cantidad de ureasa
que la encontrada segregada de S/ereocaulon pascha/e, creciendo ambas sobre podzol. (‘ladonia
síellaris, creciendo sobre un suelo mineral, satura su talo alcanzando muy altos valores de
contenido hídrico relativo y segrega ureasa de forma continua. Por el contrario, (1,. rangi/eré’na no
segrega la enzima mientras que, paralelamente, necesita muy bajas cantidades de agua para
alcanzar la saturación del talo (Pérez-Urna el al., 1989).
Usando tres diferentes ecotipos de Xanlhor¡a parielmna, Rodriguez y Vicente (199!)
intentaron correlacionar secreción de ureasa con contenido relativo de agua después de una
inmersión durante 1 5 mm antes del suplemento de urea. De esta manera se estableció una relación
lineal entre ureasa segregada y contenido relativo de agua para los tres ecotipos usados (Legar y
Vicente, 1991). Por otra parte, la secreción de urea por talos de Mas/odia lesellata es
drásticamente abolida cuando la inmersión del talo se realiza en una mezcla de
agua:polietilenglicol (50:50, vii’). En estas circunstancias, el contenido hidrico relativo de los talos
es inferior al 40% del observado cuando dichos talos se sumergen en agua o en una disolución 40
25
mM de urea, relacionándose entonces la ausencia de secreción con la insaturación de agua del talo
en estas condiciones. Por todo ello, parece razonable relacionar secreción de ureasa con el estado
hídrico de los talos, siendo éste un reflejo de la cantidad de agua contenida por las células y en los
espacios intercelulares y concluir que la secreción seria una consecuencia del movimiento de las
enzimas en el talo, desde un simbionte a otro, saliendo la proteína de aquel a través del con/inuum
espacio intercelular hidratado-medio líquido externo (Vicente. 1990; Vicente y Legaz, 1988a).
La posibilidad de movimiento de enzimas entre simbiontes puede tener importantes
implicaciones metabólicas, aún sin excluir que ambos simbiontes puedan sintetizar la misma
enzima a tiempos de inducción diferentes (A.hmadjian, 1977; Vicente y Legar., 1 988b; Vicente y
Pérez-Urna, 1989>. también es particularmente interesante el que estas enzimas, de forma
transitoria (Vicente y Pérez-Urna, 1989) o permanente (Legaz y Vicente, 1989), puedan ser
localizadas en las paredes celulares de los ficobiontes. Las interacciones proteína-proteína en las
paredes celulares de los ficobiontes liquénicos han sido, desde antiguo, relacionadas con sistemas
de reconocimiento de ficobiontes compatibles <Lockhart et al., 1978; Bubrick e/ al., 198 1;
Bubnick e/al., 1982; Bubrick e/al., 1985). Ahora bien, existía un hecho particularmente curioso.
Cuando se usaba una proteína de reconocimiento, producida por el hongo de Y parieíñu,
marcada con un trazador fluorescente, sólo se unía a su Iicobionte compatible cuando éste
procedía de un cultivo axénico, nunca cuando había sido recientemente aislado del talo (Bubrick y
Galun ¡980). Una conducta semejante era observada para el ligamiento de lectinas comerciales
sobre diferentes especies de ficobiontes (Marx y Peveling, 1983) mantenidos en cultivo axénico
durante largos periodos. Esto parecía indicar que el receptor de pared era una glicoproteina,
inducida en cultivo y probablemente reprimida en el holobionte (Vicente y Legaz, 1992).
Recientemente. Molina el al. <1993) han demostrado que una lectina parcialmente purificada de
Y. paríelma, que contiene una arginasa glicosilada (susceptible de ser segregada), es capaz de
unirse a las paredes celulares de ficobiontes compatibles recientemente aislados del talo si son
mantenidos durante sólo 2h en una disolución de urea. Simultáneamente a la unión, tanto la
ureasa particulada en las paredes del alga, como una actividad arginasa detectada en la
preparación de lectina son completamente anuladas. Esto está de acuerdo con el hecho de que
26
muchas lectinas hayan sido identificadas como glicoproteinas con actividad enzimática (Shannon
and Hankins 1981 y lo que podría relacionarse con la hipótesis de que el verdadero papel de estas
lectinas no sería el de reconocimiento de especies compatibles (Lerouge el al. 1990), sino un
mecanismo de defensa de la planta frente a potenciales parásitos (Chrispeels and Raikhel 1991,
Franz 1990), incluidos, en el caso de los líquenes, los propios micobiontes (Ahmadjian 1987). La
putrescina ha sido claramente relacionada con el grado de infectividad fungica (Rajam e/al. 1985;
West y Wahers, 1989)> y en el caso de los líquenes, la arginasa fúngica segregable, cuando
penetra en ficobiontes aislados, desorganiza el cloroplasto y produce degradación de clorofilas en
paralelo al aumento del nivel de putrescina en el ticobionte (Molina y Vicente, 1993), cuyo
contenido natural es bajo, derivado de la via neutra del catabolismo de la arginina (Legaz, 1991).
Aún la posibilidad de interacción de esta arginasa segregable con los fenoles existe, dado
que muchos de ellos cristalizan de forma normal sobre las paredes celulares de los fotobiontes
liquenizados, como ha sido demostrado por Ahmadjian y Jacobs (1985) para (Isneasirigosa y por
Honegger (1986) para dilérentes especies de Parmeliacecie.
1.6.5.-Isoformascomo(actoresdedesarrolloo de reeulación metabólica
.
La situación metabólica descrita hasta este punto se revela como extraordinariamente
compleja. Por una parte, la mayoría de los liquenes son plantas adaptadas a condiciones de
extremada sequedad, por lo que la rehidratación de sus células y de sus espacios intercelulares
queda restringida a muy pocas horas, a veces incluso minutos, al día (Blum, 1973>. Esto
condiciona la solubilización de arginina, la inducción de arginasa y su secreción, a periodos de
tiempo muy restringidos. La sintesis y secreción de fenoles viene también condicionada por otro
factor externo, como es la densidad de flujo fotónico incidente sobre el córtex (Fahselt, 1981).
Quizá por ello, enzimas que juegan un papel decisivo en el metabolismo del nitrógeno y en el
mantenimiento del equilibrio simbiótico responden a las variaciones en las circunstancias
ambientales mediante la producción de isoformas (modificaciones post-traduccionales) antes que
de auténticos isoenzirnas (multiplicidad debido a causas genéticas), de acuerdo con Rider y Taylor
27
(1980>. En este sentido, la firmación de agregados poliméricos de ciertas enzimas, con la
consiguiente modulación de su actividad, parece ser un mecanismo rápido de adaptación
metabólica en líquenes (Vicente y Legaz, 1988a). A nivel genético, la opción de la represión
catabólica parece ser la preferida en los sistemas rápidos de regulación. El descenso en la
velocidad de respiración causada por la desecación, o el incremento en la intensidad de luz
recogida por el talo, puede aumenta el contenido celular en glucosa (Tapper, 1981), lo que
redunda en mecanismos de represión catabólica que afectan, tanto a arginasa y otros enzimas
biosintéticos de poliaminas (Legar. y Vicente, 199 Ib; Vicente y Legaz. ¡985), como a enzimas del
metabolismo de los fenoles (Herrero el al?, 1989; Legar. el aL, ¡992).
Las investigaciones acerca de las relaciones entre variabilidad alélica y genotípíca y los
factores externos, bióticos y abióticos, han sido realizadas frecuentemente utilizando diferentes
plantas (Anderson, 1991; Samuel e/al,, 1991) y animales (Gilbert y Richmond, 1982; Oakeshott
id al., 1982; David el al., 1989). No obstante, estas investigaciones han sido llevadas a cabo
utilizando especies de fácil reproducción en condiciones de laboratorio, en orden a realizar análisis
genéticos. Por esto, los líquenes han sido excluidos hasta ahora de este tipo de investigaciones, ya
que la batería enziniática está, salvo casos, localizada en ambos simbiontes (Fahselt, 1985; Legar.
y Vicente. 198 1; Vicente y Legar., 1 988b> y, además, porque ha sido imposible hasta la fecha
llevar a cabo experimentos de cruzamiento mendeliano usando especies de liquenes. Culberson el
al. (1988) intentaron resolver este problema por medio de hibridaciones entre algunas especies de
(‘ladonía en cultivos resintetizados y el análisis subsecuente de los fenoles producidos por el
híbrido. No obstante, el flujo genético no pudo ser más que supuesto. Alternativamente, el análisis
de los zimogramas obtenidos mediante el uso de técnicas electroforéticas produce información
isozimática de la que deriva algún conocimiento evolutivo <Gottlieb, ¡977). De esta forma,
Fahselt (1987) encontró diferencias genéticas estudiando parámetros electroforéticos para
esterasas y fosfatasas alcalinas que podrían ser explicados mediante recombinación meiótica entre
bel polimórficos en una determinada población.
Varios sistemas enzimáticos han sido estudiados mediante isoelectroenfoque en geles de
poliacrilamida (Hageman y Fahselt, lQSów Killias el al 1988; Skultz el cii?, 1990) en orden a
28
obtener información sobre variabilidad enzimática como una función de diferencias temporales
(Hageman y Fahselt, 1986a y b) y geográficas o climáticas (Fahselt, 1986). En relación con estas
últimas, se ha demostrado que el patrón de bandeo para una enzima particular puede ser único
para determinadas especies de liquenes (MacFarlane e, al., 1983; Kershaw el al,. 1983; Fahselt y
Hageman, 1983) mientras que se encontraba variabilidad suficientemente significativa entre
diferentes poblaciones de una sola especie de liquen geográficamente separadas (Hageman y
Fahselt, 1984, 1986a y b). Sin embargo, en ninguno de los casos descritos se ha investigado el
origen de las diferentes isoformas encontradas.
29
OBJETIVOS
Estudiar la multiplicidad de la arginasa de Jgí’erma primas/rl y caracterizar a nivel
bioquímico las diferentes isofornias
Dada la relación biogenésica entre actividad arginasa y síntesis de fenoles, determinar el
papel efector de estas moléculas y si existe especificidad de forma.
Aclarar el anterior punto, estudiar los mecanismos de regulación de arginasa por los
fenoles a nivel de actividad y de estructura.
Determinar las pautas de ligamiento del efector a la isoforma y los cambios
conforniacionales que ello conlleve.
A la vista de los resultados obtenidos, tratar de construir una hipótesis coherente y
comprobable que relacione la funcionalidad bioquímica con su proyección fisiológica.
II.- MA TERJAL 1’ METODOS
32
11.1.- MATERIAL VEGETAL
El material vegetal objeto del presente trabajo fue el lkíuen epifito l&i’ernia prunas/rí (L.)
Ach, recogido de la corteza de Quercus pyrenaiúa Lam. en Valsain (Segovia). Los talos, secos
en corriente de aire, se almacenaron en oscuridad a PC, hasta su utilización, durante un periodo
nunca superior a un mes. En la Figura 1 se muestra un ejemplar de esta especie.
11.2.- CONDICIONES DE INCUBACION
Muestras de 1,0 g de talo seco fueron sumergidas en 25 ml de disoluciones tamponadas
con Tris-HCI 0.1 M, pH 9,1 (Merck), conteniendo L-arginina 40 mM (Sigma Chem. Co.) o.
cuando se indique, cicloheximida 40 ~iM (Sigma Chem.Co,), y mantenidas en oscuridad a 260C
durante diferentes tiempos de incubación.
11.1— VALORACION DE LA ACTIVIDAD ARGINASA
La actividad arginasa se valoró mediante el método de Greenberg (1955), modificado por
Legazy Vicente(1980), incluyendo ureasa cristalina tipo 111 (Sigma Chem. Co.) en las mezclas de
reacción. Dichas mezclas contenían, en un volumen final de 3,0 mí: 10 gmoles <le tampón Tris-
HCI, pH 9, 1, para las muestras incubadas en L-arginina 40 mM o bien pH 6,5 para las muestras
que fueron incubadas en cicloheximida 40 pM; 0,5 jimoles de L-arginina; 7,5 pmoles de ácido
maléico; 5,0 ¡imoles de sulfato de manganeso; 33,8 mg de ureasa cristalina y 20,0 pg de proteína
liquénica.
Como control se Litilizaron las mismas mezclas de reacción en las cuales el sustrato
(L-arginina) era sustituido por igual volumen del tampón correspondiente.
La reacción se llevó a cabo a 300C y fue detenida tras 25 mm (tiempo determinado como
óptimo), mediante la adición de K2C03 saturado. Después se dejaron transcurrir 2 h para
completar la difusión del amonio formado y posterior fijación sobre H2504 0,02 N, según el
método de microdifusión de Conway (1962).
33
La valoración del amonio se llevó a cabo utilizando el reactivo de Nessler (Standard
Methods, 1955) midiendo el color desarrollado a 440 nm en un espectrofotómetro Zeiss PM-2.
La absorbancia así obtenida se transformó en jimoles de amonio mediante tina recta patrón
construida a partir de concentraciones crecientes de sulfato amónico químicamente puro.
Una unidad de actividad específica fue definida como 1.0 ¡imol de amonio producido por
mg de proteína y por minuto
11.4.- VALORACION DE PROTEíNAS
La valoración de proteínas, tanto en el extracto libre de células como en las distintas
fracciones del proceso de puriticación, se llevó a cabo mediante el método de Lowry et al. (1951).
El patrón fue en todos los casos seroalbúmina bovina de Sigma Chem.Co.
11.5.- PURIFICACION DE LAS ISOFORMAS DE ARCINASA
11.5.1.-Isoformas Iv II de ar~inasa
11.5 LI.- Obtención del extracto libre de células
Muestras de 50 g de talo seco se incubaron en 1 .250 ml de una disolución de L-arginina
40 mM. tamponada con Tris-HCI 10 mM, pH 9,1, durante 6 h, a 26’C en oscuridad.
Tras la incubación, los talos se lavaron con agua destilada y se secaron ligeramente con
papel de filtro, Después, se maceraron con acetona (15 ml por g de talo) durante 5 mm con objeto
de eliminar los fenoles corticales. Los homogeneizados fueron filtrados y los residuos se secaron
en corriente de aire. Una vez secos, fueron nuevamente macerados con tampón T’¡is-HCI lO mM,
pH 9,1 (12 ml por g de talo), conteniendo sulfato de manganeso 0,5 mM y ácido maléico 0.75
mM (Greenberg, 1955). Los homogeneizados se centrifugaron durante 20 mm a 24.000 x g en
una centriftiga Beckman J2-2 1 (rotor JA 21). Los sobrenadantes se recogieron y filtraron a través
de un filtro Millipore GS (0.22 ~tmde diámetro de poro>. La temperatura durante todo el proceso
34
fue de 40C. El filtrado se utilizó como extracto libre de células y en él se valoró la actividad
arginasa y la cantidad de proteínas, de acuerdo a lo descrito en los apartados 11.3 y 11.4,
respectivamente,
11.5.1.2.- Precipitación con sulfato amónico
El extracto libre de células se precipitó con sulfato amónico a distintos porcentajes de
saturación, entre el 10% y el 95O/~ (p/v). El sobrenandante del 85% resultó contener la mayor
parte de la actividad arginasa. La sal se fue disolviendo en condiciones de agitación suave con
protección de hielo fundente, Una vez disuelta completamente, el extracto se mantuvo dos horas
más en agitación para, posteriormente, ser almacenado durante un período no inferior a 2 h. Por
último, se centrifugó durante 1 h a 43.000 X gv
El precipitado obtenido tras la centrifugación fue resuspendido en un volumen igual al del
sobrenadante. Ambas fracciones, sobrenadante y precipitado, se dializaron frente a tampón
Tris-HCI lO mM, pH 9, 1, renovando el baño cada 4 h hasta la completa eliminación de sulfato
amónico (72 h aproximadamente). La temperatura durante todo el proceso fue de 40C.
En los extractos dializados se valoró la actividad arginasa y la cantidad de proteínas
(apartados 11.3 y 11.4, respectivamente).
¡¡.5.1.3.- Adsorción sobre gelde fosfato cálcico
De las dos fracciones resultantes de la precipitación con sulfato amónico, se escogió el
sobrenadante, por contener la mayor actividad arginasa.
La proteína del dializado fue adsorbida sobre gel de fosfato cálcico (Legget-Bailey, 1967)
preparado en tampón Tris-HCI 10 mM, pH 9,1, en la proporción de 100 mg de gel seco por cada
mg de proteína del extracto, mediante agitación fuerte durante 2 h. Posteriormente se centrifugó a
12.000 >< g durante 7 mm. El precipitado de esta centrifugación, que contenía la mayor parte de
la proteína, era resuspendido, mediante agitación, en tampón Tris-HCI 0,02 M, pH 9, 1. Tras 1 h
de agitación, se dejaba reposar y después se centrifugaba, en las mismas condiciones, con objeto
35
de desorber la proteína. El proceso se repitió sucesivas veces empleando molaridades crecientes
del mismo tampón (entre 0,04 M y 3,0 M), El sobrenadante de cada centrifugación era filtrado
por papel Whatman n0 1 y en él se valoraban tanto la actividad arginasa como la cantidad de
proteínas (apartados 11.3 y 11.4, respectivamente). La temperatura durante todo el proceso fue de
40C.
11.5.1.4.- Electroenfoque en columna
Las fracciones en las cuales se recuperó la mayor actividad arginasa fueron
electroenfocadas en una columna LKB 8100 de Pharmacia, El gradiente de pH se preparó con
anfolitas (Servalyte) al 1% (p/v) en un rango comprendido entre pH 3,5 y 10,0.
Para prevenir movimientos de convección no deseados o el mezclado de diferentes
fracciones de proteína próximas, el gradiente de pH se estabilizó con otro gradiente de densidad
de sacarosa. La muestra se introdujo al mismo tiempo que las disoluciones de llenado de la
columna, La temperatura fue de 40C y el voltaje aplicado de 1 .000V durante 48 h, tiempo al cabo
del cual, la muestra estaba electroenfocada (carga neta 0).
Se recogieron fracciones de 2,0 ml que fueron filtradas a través de una columna de
Sephadex 0-25 (40 mm de longitud X lO mm d. i.) (Pharmacia) con objeto de eliminar las
anfolitas presentes en cada fracción, así como el exceso de sacarosa. En cada una de las
fracciones filtradas~ se midió el pH y el contenido de proteínas. Aquellas fracciones que contenían
proteína fueron dializadas frente a tampón Tris-HCI 0,1 M, pH 9,1, durante 24 h para eliminar los
restos de anfolitas y sacarosa que pudiesen quedar y, posteriormente, se valoré en ellas la
actividad arginasa y la cantidad de proteínas, según lo descrito en los apartados 11.3. y 11.4.,
respectivamente.
36
1l.5.L- Isofornia 111 dc arginasa
11.5.2.1.- Obtención del extracto libre de células
Muestras de 50 g de talo seco se incubaron en 1.250 ml de una disolución de
cicloheximida 40 ¡iM. tamponada con Tris HCI- lo mM, pH 9.1, durante 16 h. a 260C en
oscuridad.
A partir de este momento, para la obtención del extracto libre de células se procedió de
igual manera a la descrita en el apartado 11.5,1.1.
11.5.2.2.- Precipitación con sulfato amónico
El extracto libre de células obtenido en el paso anterior, se precipitó con sulfato amonico a
distintos porcentajes de saturación, entre el 10% y el 95% (plv). El sobrenadante del 70% resultó
contener la mayor parte de la activadad arginasa. Para ello se procedió de forma idéntica a la
descrita en el apartado 11.5.1.2.. con la salvedad que el pH del tampón de diálisis fue de 6,5.
11.5.2.3.- Adsorción sobre gel de fosfato cálcico
El sobrenadante del sulfato amónico dializado, el cual contenía la mayor parte de la
actividad arginasa, fue utilizado para la adsorción de la proteína sobre gel de fosfato cálcico. El
procedimiento empleado fue idéntico al descrito en el apartado 11.5.1.3, En esta ocasión la
molaridad del tampón utilizada para desorber la proteína varió entre 0,02 M y 0,3 M.
11.5.24.- Electroenfoqee en columna
La fracción de la cual se desorbió la mayor actividad arginasa fue electroenfocada de
acuerdo a lo descrito en el apartado 11.5.1.4., con la salvedad que el pH del tampón de diálisis fue
de 6,5.
.37
11.53.-Isoforma IV de ar2inasa
11.5.3.1.-Obtención del extracto libre de células
Muestras de 50 g de talo seco se incubaron en 1.250 ml de una disolución de L-arginina
40 mM, tamponada con Tris-IICI lo mM, pH 9,1, durante 8 h. a 260C en oscuridad.
Al cabo de este tiempo se recogió el medio de incubación, se filtró a través de un filtro
Whatman n0 3 y se concentró a 300 ml. En este extracto se valoré la cantidad de proteínas y la
actividad arginasa. según lo descrito en los apartados ¡1.3 y 11.4, respectivamente.
11.5.3.2.- Precipitación con sulfato amónico
El filtrado obtenido fue precipitado con sulfato amónico a distintos porcentajes de
saturación, entre cl 10% y el 95% (p/v). El sobrenadante del 50% resulté contener la mayor parte
de la actividad arginasa. El procedimiento empleado fue el mismo que se describió en el apanado
11. 5. 1.2
11.5.3.3.-Adsorción sobregel de fosfato cálcico
La fracción que contenía la actividad arginasa mayoritaria (sobrenadante) fue adsorbida
sobre gel de fosfato cálcico de acuerdo a lo descrito en el apartado 11.5.1.3. La molaridad del
tampón empleado en la desorción varió entre 0,02 M y 0,3 M.
¡15.3.4.-Electroenfoqueen columna
El sobrenadante de mayor actividad arginasa, obtenido tras la desorción, fue
electroenfocado según lo descrito en el apartado 11.5,1.4.
38
11.6.- DETERMINACION DEI PUNTO ISOELECTRICO
¡1.6].- Mediante electroenfogne en columna
El punto isoeléctrico de cada una de las isoformas (1, 11, III y IV) de arginasa se determinó
mediante un electroenfoque en columna, idéntico al descrito en el apartado 11.5.1.4.
11.6.2.- Mediante electroforesis caDilar
El punto isoeléctrico de las cuatro isoformas de arginasa, obtenido mediante eletroenfoque
en columna, fue corroborado en electroforesis capilar.
El equipo utilizado fue un Spectraphoresis 500 de Spectra Physics, equipado con un
integrador SP 4290 (Spectra Pliysics), bajo las siguientes condiciones de análisis:
i) Caracteristicas del capilar: Tubo de sílice fundida,
recubierto de poliimida.
• diámetro interno: 75 ¡im
• diámetro externo: 190 ¡im
u) Longitud del capilar hasta la ventana de detección: 60 cm
iii) Electrolito: tampón borato sódico 25 mM, pH 9,0 ó bien
tampón borato sódico 15 mM, llevado a pH 7,1 con ácido
fosfórico 14.7 M.
lv) Temperatura: 300C.
y) Voltaje aplicado: 17 kV ó 25 kV
vi) Detección: UV-ton column’ a 200 nm.
vii) Tipo de inyección: Hidrodinámica durante 9 s.
viii) Volumen de inyección: 36 nl.
Las muestras fueron dializadas frente a agua-HPLC (tridestilada y filtrada a través de
filtros Millipore GS de 0,22 pm de diámetro de poro), llevadas a sequedad en corriente de
nitrógeno y resuspendidas nuevamente en tampón Tris-HCI 10 mM, pH 9,0 ó 7,1. según se
39
indique.
La determinación del punto isoeléctrico se llevó a cabo interpolando el valor obtenido de
movilidad electroforética (l’e) en una recta de calibrado construida con proteínas de punto
isoeléctrico conocido. Las proteínas utilizadas fueron: Mioglobina de caballo (pl 7,0), aldolasa de
conejo (pl 6,6), anhidrasa carbónica dc eritrocito de vaca (pl 5,9), alcohol deshidrogenasa de
levadura (pl 5,4) y tiroglobulina de vaca (pI 4,6) (todas ellas de Sigma Chem.Co.) y benzol (Carlo
Erba) como marcador neutro.
La movilidad electroforética viene definida como:
ye tj-i...~ en cm2 •s’~ y” - donde:
L longitud del capilar (cm)
t,,= tiempo de migración (s)
voltaje aplicado (V)
11.7.- ANALISIS DE AMINOACIDOS
Alícuotas (1 mi) de cada una de las cuatro isoformas de arginasa purificadas, se dializaron
frente a agua-HPLC durante 24 Ii con objeto de eliminar las sales procedentes del tampón en el
cual se hallaban disueltas. A continuación se liofilizaron y, después, se disolvieron en 0,2 ml de
HCI 6 N conteniendo fenol al O,í~ o (p/v) y 20 nmoEmh1 de nor-leucina como patrón interno. La
hidrólisis se llevó a cabo a l050C durante 24 h en ampollas herméticas (Gavilanes et al.. 1982).
Los hidrolizados se llevaron a sequedad, sometiéndolos después a dos lavados con 200 ¡il de agua
destilada, seguidos del correspondiente secado. Las muestras así obtenidas, fueron procesadas en
un analizador de aminoácidos Heckman System 6300 con un módulo de interfase analógica
(System GoId). La duración del análisis fue de 100 mm. Los residuos de Cys fueron determinados
como contenido en ácido cistéico, Para ello, antes de la hidrólisis, fue necesario oxidar la proteína
con ácido perfórmico (Hirs, 1967).
Para preparar el ácido perfórmico se tomaron cantidades de agua oxigenada de 30
40
volúmenes y ácido fórmico al 99% (y/y) en proporción 1:9, manteniéndose esta mezcla a 250C
durante 2,5 h. Transcurrido este tiempo se mantuvo a -1 00C durante 15 mm como mínimo,
La oxidación de la proteína se llevó a cabo disolviéndola en ácido fórmico al 99%, a una
concentración de 10-30 mgmh1. Para una cantidad de proteína inferior a 0,1 mg, se utilizaban
12,5 ¡il de ácido fórmico. La disolución se mantenía en un baño de hielo. Por cada mg de proteína
se añadia una alícuota de lOO ¡u de ácido perfórmico preparado, manteniéndola a -1 00C durante
2,5 h.
Por último, se procedió a la eliminación del ácido por liofilización, para lo cual se diluía la
muestra, al menos, 25-30 veces con agua destilada.
Posteriormente, la proteína se sometió a hidrólisis ácida durante 24 h, en las condiciones
ya descritas,
El Trp fue determinado espectrofotométricamente de acuerdo con el método de Beaven y
Holiday (1952). Se preparó una disolución de proteína en NaOH 0,1 N, cuya absorción a 280 nm
estuviera comprendida entre 0,2 N y 0,5 N. Se determinó la absorbancia de esta disolución a
294,4 y a 280 nm, calculándose el contenido en Trp a partir de la ecuacion:
0,592 XZSns.4 —0,263 X&ao,oMTyrIMTrp 0,263 XAnO.O —0,170 ><&9s.4
donde MTyr y MTrp son los moles de Tyr y Trp por mol de proteína, respectivamente. MTyr se
calculó a partir del análisis de aminoácidos de la proteína.
11.8.- DETERMINACION DEL PESO MOLECULAR DE LAS DIFERENTES
ISOFORMAS DE ARGINASA MEDIANTE CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE
ALTA RESOLUCION (HPLC)
El peso molecular de las diferentes isoformas se determinó mediante HPLC a partir de las
enzimas purificadas obtenidas por electroenfoque en columna. Las isoformas nativas 1, II, III y IV
de arginasa fueron desnaturalizadas con dodecil sulfato sádico, SDS (Sigma Chem.Co.) al 1%
41
(plv) en presencia de [3-mercaptoetanol (Fluka) al 2,50 o (p/v). Las muestras se mantuvieron en
agua hirviendo durante 5 mm y después se filtraron por filtros de 0,45 gm de diámetro de poro
(Alltech) antes de ser inyectadas en la columna cromatográfica. Mediante mecanismos de
I-IPLC-exclusión molecular también se determinaron los pesos moleculares de las isoformas de
arginasa tras cl ligamiento a los diferentes efectores. El equipo empleado fue un cromatógrafo de
líquidos Spectra Physics compuesto por una bomba de gradiente ternario 51> 8800. un detector
UV-Vis sp 8490 y un inyector Rheodyne 7125 acoplado a un integrador SP 4290 también de
Spectra Physics. Las condiciones de análisis fueron las siguientes:
a) Columna TSK gel G5000 PWXL (Supelco).
i> Partícula: gel de vinilo-polimérico.
u> Diámetro de poro: iOOo A.
iii) Diámetro de partícula: 10 ¡m.
iv) Configuración de la columna:
• diámetro interno: 7,8 mm.
• longitud: 300 mm.
- Presión: 7 bares.
- Fase móvil: Tampón Tris-RU 75 mM, pH 9,1 ó 6,5.
- Flujo: 0,3 nibminI
- Temperatura: Ambiente.
- Volumen de inyección: 10 ¡il.
- Detector: 11V a 280 nm.
b) Columna Zorbax GF-450 (Du Pont).
i) Partícula: sílice esférica,
u) Modificación de la superficie: Zirconio.
iii) Fase estacionaria ligada: monocapa hidrofilica de
tipo diol.
iv) Diámetro de poro: 300 A.
y) Diámetro de partícula: 6 pm.
vi) Configuración de la columna:
42
• diámetro interno: 9,4 mm.
• longitud: 250 mm
Conectada en serie con la.
Columna: Zorbax GF-250 (Du Pont).
i> Particula: sílice esférica.
u) Modificación de la superficie: Zirconio.
iii) Fase estacionaria ligada: monocapa hidrofilica de
tipo dm1.
iv) Diámetro de poro: 150 A.
y) Diámetro de particula: 4-4,5 pm.
vi) Configuración de la columna:
• diámetro interno: 9,4 mm.
• longitud: 250 mm.
- Presión: 65 bares.
- Fase móvil: Tampón Tris-E-Rl 200 mM, pH 7,6 ó 9,1.
— Flujo’ 1 ¡nl mirr
- Temperatura: Ambiente.
- ‘volumen de inyección: 10 pl.
- l)etector: UV a 280 nm.
La configuración a) se utilizó en el análisis paralelo de los distintos pasos del proceso de
purificación y para determinar el peso molecular de la forma nativa de cada isoforma de arginasa.
La configuración b) se utilizó para determinar eJ peso molecular de las formas nativa y
desnaturalizada, También se empleó para calcular el peso molecular de los diferentes polímeros de
arginasa tras el ligamiento del fenol correspondiente. En los análisis de proteínas desnaturalizadas,
las columnas fueron equilibradas con fase móvil conteniendo SDS al 1% (plv).
El peso molecular se determinó interpolando el volumen relativo de elución obtenido
(Ve/Vo) en una recta de calibrado construida con proteínas de peso molecular conocido, Las
proteínas utilizadas fueron: Tiroglobulina de vaca (Mr%ÓO kDa); Apoferritina de bazo de caballo
(Mrz44O kDa); [3-amilasade batata (Mr~2OO kDa); Albúmina de huevo (Mr%7 kDa); Anhidrasa
43
carbónica de eritrocito de vaca (Mr~<2O kDa) y Citocromo cdc corazón de vaca (M~ 12,4 kDa).
11.9.- CARACTERIZACION ESPECTROSCOPICA
¡1.9. 1.- Espectros de absorción ultravioleta
La obtención del espectro ultravioleta de las distintas isoformas (1, III y IV) de arginasa se
llevó a cabo cii cubetas de cuarzo de 10 mm de paso óptico (Starna Ltd.), empleándose un
espectrofotómetro Varian, modelo DMS 90. La determinación se realizó con una disolución de
proteína de 42, 37 y 25 pginh1 para las isoformas 1, III y IV. respectivamente, en tampón Tris-
HCI lO mM. pH 9,1, para las isoformas 1 y IV, y pH 6,5 para la isoforma 111. Las muestras se
filtraron a través de filtros de 0,45 ¡m de diámetro de poro. Para sustraer la absorción de tampón,
se realizó una corrección de la línea base del espectro.
[¡.9.2.- EsDectros de emisión de fluorescencia
Estas medidas se hicieron en un espectrofluorímetro Kontron, modelo SFM 25, equipado
con un tbtomultiplicador de referencia. El equipo poseía una lámpara de xenon, con una rendija
de emisión y excitación de lO y 15 nm, respectivamente. Las cubetas de cuarzo, de 5 caras
pulimentadas, eran de JO mm de paso óptico (Starna Ltd.). Los análisis se realizaron a
temperatura ambiente y la concentración de proteína fue dc 42, 37 y 25 pgmh1 para las
isoformas 1. III y IV, respectivamente, en tampón Tris-1-ICI lO mM, pH 9,1, para las isoformas 1 y
IV, y pH 6,5 para la isoforma III. Todas las muestras se filtraron a través de filtros de 0,45 ¡m de
diámetro de poro, como paso previo a la realización de los espectros. Para sustraer la
fluorescencia del tampón se realizó una corrección de línea base.
Los espectros se registraron empleando alternativamente como longitud de onda de
excitación 257. 275 y 295 nm. Para realizar el espectro simultáneo de emisión y excitación se
eligió un rango de longitudes de onda comprendido entre 410 y 285 nin para la emisión y entre
330 y 205 nm para la excitacion.
44
ILIO.- VALOHACION DE FENOLES LIQUEN ICOS MEDIANTE IIPLC
11.10.1.-Extracción de Fenolescon diferentes mezclasde
disolventesor2ánicos
11.10.1.1.-A partir de talos
Muestras de 0,3 g de talo fueron incubadas en 7,5 ml de tampón Tris-HCI 10 mM. pH 9,1,
conteniendo L-arginina 40 mM o cicloheximida 40 ¡iM, a 260C en oscuridad. A diferentes
tiempos, las muestras fueron lavadas superficialmente durante 5 mm con 1 5 ml de acetona a
temperatura ambiente. La fase acetónica se filtró a través de papel Whatman n0 2, fue secada en
corriente de aire y el residuo seco se almacenó a -1 30C hasta su utilízacion.
Una vez eliminados los fenoles corticales, se procedió a extraer aquellos retenidos en el
talo mediante tres pasos. En primer lugar, los talos fueron macerados con 15 ml de éter
dietílico acetato de etilo (65:3 5, y/y) durante 15 mm. La fase orgánica se filtró a través de papel
Whatman n0 2 y se guardó. El residuo sólido se maceró con otros 15 ml de
cloroformo : acetonítrilo (60:40, y/y) durante 15 mm. La fase orgánica fue filtrada como la
anterior y guardada y el residuo sólido fue nuevamente macerado durante ¡5 mm con
cloroformo : acetonitrilo (60:40, y/y). La fase orgánica se filtró y guardó como las anteriores.
Este último residuo sólido se descartó y las fases orgánicas mezcladas se llevaron a sequedad en el
mismo tubo. El extracto orgánico seco se almacenó a -130C hasta su utilización.
1110.1.2.-A partir del medio de incubación
Los fenoles segregados al medio de incubación, procedentes de talos incubados en las
condiciones descritas en el apartado anterior, fueron extraídos mediante reparto con diferentes
mezclas de disolventes orgánicos de la manera que se describe a continuación,
A cada medio (entre 5 y 6 mí) , se añadieron 10 ml de éter dietílico : acetato de etilo
45
(65:35. y/y) y después se agité fuertemente durante 30 s. La fase orgánica se recuperé y la fase
acuosa del medio se utilizó para una segunda extracción con 10 ml de clorotbrmo : acetonitrilo
(60:40, y/y). Después de otros 30 s de agitación fuerte, se recuperó la fase orgánica y los fenoles
remanentes en el medio fueron nuevamente extraídos con lO ml de cloroformo : acetonitrilo
(60:40, y/y). Las tres fases orgánicas se recogieron en el mismo tubo y se llevaron a sequedad
bajo corriente de aire El residuo orgánico seco se alínacenó a -130C hasta su utilización.
IL1O.1.3.- A partir del extracto libre de células
Para la valoración de los fenoles liquénicos presentes en los extractos libres de células
procedentes de talos y medios de incubación, fragmentos de talo de 0,3 g de peso seco se hicieron
flotar en los medios descritos en el apartado 11.2 durante diferentes tiempos. El tiempo de
incubación fue aquel donde existía la mayor actividad de cada isoforma de arginasa:
i) 6 h para las isoformas 1 y 11, recogiendo el talo.
it) 16 h para la isoforma 111, recogiendo el talo.
iii) 8 h para la isoforma IV, recogiendo el medio de incubación.
El extracto libre de células se obtuvo según lo descrito en los apartados 11,5.1.1, 11,5.2.1 y
11.5.3.1, respectivamente, tras haber eliminado los fenoles corticales de acuerdo con el apartado
11. lO. 1. 1. Los fenoles presentes en los extractos fueron extraídos mediante reparto en fases
orgánicas, según lo descrito en el apartado II.lO.l.2. Una vez eliminados los fenoles corticales, en
el talo todavía se pueden localizar fenoles extracelulares. Estos fenoles se encuentran cristalizados
sobre las paredes del micobionte y del fotobionte y pueden disolverse parcialmente en el proceso
de obtención del extracto libre de células. Con objeto de valorar la contribución aproximada de
los fenoles extracelulares a dicho extracto, se procedió a retirar los fenoles corticales (apartado
11.10.1.1); macerando ligeramente los talos a continuación con 5 ml de éter etílico: acetato de
etilo (65:35, y/y) durante 2 mm. La fase orgánica se filtré a través de papel Whatman n0 2 y se
guardó. El residuo sólido se lavé con 5 ml de cloroformo: acetonitrilo (60:40, y/y) durante 2 mm
y la fase orgánica fue filtrada como la anterior. Las dos fases fueron mezcladas y llevadas a
sequedad en el mismo tubo. El residuo sólido se utilizó para obtener un extracto libre de células
46
según lo descrito en losapartados 11.5.1.1, 11.5.1.2.1 y 11.5.3.1, respectivamente.
En la Figura 2 se puede observar el diagrama de flujo explicativo del proceso de
extracción de los fenoles.
11.10.2.- Estabilidad de los fenoles en disoluciones acuosas
La estabilidad de los fenoles liquénicos en medios acuosos se estudió en disoluciones de
fenoles patrón comerciales: atranorina, ácido evérnico (Sigma Chem.Co.) y ácido úsnico
(Sarsintex) de concentración conocida; tamponados con Tris-HO 0,1 M, pH 9,1, o bien, pH 6,5.
Las disoluciones se mantuvieron en agitación constante 120 h en oscuridad a 260C. Durante este
tiempo, se tomaron alícuotas cada 24 h y en ellas se valoré la concentración remanente de fenol,
así como la de sus posibles productos de degradación, mediante HPLC.
OHC OH H,C OH
HO O CCC O COOCH.
H. CH.
Atranorina
OH CH.
14.C-.O O COO O COOH
CH. OH
Acido evérnico
Acido usnico
47
con 1 5 mleteretílico/acetatoetilo(65135,vA)
Iii trar por Whalniann’2
Macerari 5 mm5 ni1 dc
cl o,’olorn,<,!acetomtnlo<6(1/40. y/y)
Filtrar porWhatnnrnn’’2
Macerar1 5 ¡mucon 1 5 ml dcclOr<>t<MTflO/aCCt<),1,tflIO(60/4<).y/y)
FiltrarporWhatxnann”2
tI tul éteretiicc¡aeetatoetilo
Agitar 3<)
Reposar315 mm
o tul clorIor¡no/
(611/40, vN)
Agitar 30
Rej>osar3<) mio
lO ¡INI cIotoÍónuo/accíota1 ri.I e
(6<1/40. NC/VI
Reposar30 mm
Agitar 30
Fig. 2.- Diagrama de flujo de extracción de fenoles
48
11.10.3.-Espectrodeabsorciónultravioletade fenolesIiauénicos
La obtención del espectro ultravioleta de las distintas isoformas (1, III y IV) de arginasa se
llevó a cabo en cubetas de cuarzo de 10 mm de paso óptico (Starna Ltd.), empleándose un
espectrofotómetro Varian DMS 90. La determinación se realizó empleando una concentración de
0,1 mg~mh1 de atranorina, ácido evérnico y ácido úsnico, disuelta en una mezcla de agua: ácido
acético (99:1, v/v)/acetonitrilo (70/30, y/y). Las muestras se filtraron a través de filtros de 0.45
gm de diámetro de poro. Para sustraer la absorción de la fase móvil se realizó una corrección de
la línea base del espectro.
11.10.4.-Valoración de fenoleslionénicosmediante IIPLC
El análisis y cuantificación de sustancias liquénicas se llevó a cabo mediante HPLC, en un
cromatógrafo de líquidos Varian 5060, equipado con un integrador Vista CDS 401 (Varian), bajo
las siguientes condiciones de análisis:
i) Columna: Fase reversa, Nucleosil 5C8 (Scharlau)
• Diámetro de partícula: 5 ~.tm.
• Dimensiones: longitud: 125 mm,
u diámetro interno: 4 mm.
u) Fase móvil: Agua-HPLC : ácido acético (99: l,v/v)
/acetonitrilo (30/70, y/y).
iii) Flujo: 0,7 mbínin1.
iv) Temperatura: 26’C.
y) Presión: 60 atm.
vi) I)etector: Uy; - de O a 2,6 mm a 270 nm.
- de 2,6 mm a lO mm a 280 nm.
UAFE: 0,002.
vii) Volumen de inyección: lO ~d.
49
viii) Como patrón externo se utilizó ácido o-ftálico a una
concentración fija de 0,05 mgmh1, o el fenol que se
indique en cada caso (atranorina 0,02 mwmk1; ácido
evérnico 0,01 mgnik1).
La cuantificación de atranorina, ácido evérnico y ácido úsnico se llevó a cabo mediante la
interpolación de la respuesta del detector, en cuentas de área, en una recta de calibrado construida
con cada uno de los fenoles comerciales patrón indicados en el apartado 11.10.2.
¡LII.- CINETICA DE SATLJRACION EN AUSENCIA DE EFECTORES
El efecto de la concentración de sustrato (L-arginina) sobre las isoformas 1 (ya que las
isoformas 1 y II demostraron ser prácticamente iguales), III y IV de arginasa se estimó en
mezclas de reacción conteniendo enzima purificada y concentraciones crecientes de L-arginina
entre 1,0 y 9,0 mM, según la isoforma. Las mezclas de reacción, en un volumen final de 3 mi,
contenian: lO pmoles de tampón Tris-HCI (pH 9,1, para las muestras incubadas en L-arginina 40
mM o bien pH 6,5 para las ¡nuestras que fueron incubadas en cicloheximida 40 MM); 7,5 umoles
de ácido ¡naléico: 5,0 jamoles de sulfato de manganeso; 33,8 mg de ureasa cristalina; 20,0 ~.tgde
proteína liquénica y las siguientes concentraciones de sustrato:
- entre 0,5 y 3,5 pmol (isoforma 1)
entre 0.5 y 4,5 pmol (isoforma III)
- entre 0,5 y 4,5 pmol (isoforma IV)
Las mezclas se incubaron a 300C y la reacción fue detenida, tras 25 mm, mediante la
adición de K2C03 a saturación. Después se dejaron transcurrir 2 h para completar la difusión del
amonio formado y posterior fijación sobre F12S04 0,02 N, según el método de microdifusión de
Conway (1962).
Como control se prepararon mezclas de reacción en las cuales el sustrato era sustituido
por igual volumen de tampón al pH correspondiente en cada caso. La valoración cuantitativa del
amonio resultante se estimé de idéntica manera a lo descrito en el apartado 11.3.
50
11.12.- CINETICA DE SATURACION EN PRESENCIA DE EFECTORES:
ATRANORINA, ACIDO EVERNICO Y ACIDO tISNICO.
Para estudiar el efecto de la concentración de L-arginina sobre las isoformas 1. 111 y IV de
arginasa en presencia de los distintos efectores (a concentración fija) se incubaron mezclas de
reacción que contenían enzima purificado, efector y concentraciones variables de sustrato, Las
mezclas de reacción, en un volumen final de 3 mí, contenian: 5 gmoles de tampón Tris-1-ICI (pH
9,1 para las muestras incubadas en L-arginina 40 mM o bien pH 6,5 para las muestras incubadas
en cicloheximida 40 pM); 7,5 j.tmoles de ácido maléico; 5,0 gmoles de sulfato de manganeso;
33.8 mg de ureasa cristalina; 20,0 ~.tgde proteina liquénica y la concentración de efector que se
especifica en la Tabla 1:
TABLA 1
ISOFORMA DEARGIN AS A
EFEC TOR
ATRANORINA ACIDOEVERNICO
ACIIDO USNICO
0,10* 0,39 0,52
III 0.57 1.17 1,41
IV 5,06 3,46 3,82
* umol dc electorcii la mezcla dc reaccion
de reacción en las cuales el elector era
para las isoformas 1 y IV ó bien pH 6,5
Como control se utilizaron las mismas mezclas
sustituido por 60 Mmoíes de tampón Tris-HCI, pH 9.1,
para la isoforma III.
Tras 20 mm de preincubación enzima-elector a 300C. se añadió el sustrato (L-arginina) en
el rango de concentraciones especificada en el punto II. II. de este mismo apartado. Las mezclas
se mantuvieron otros 25 mm a 300C y tras este tiempo se detuvo la reacción añadiendo K2C03
saturado. La valoración cuantitativa del amonio resultante de la reacción se efectuó según lo
descrito en el apanado 11.3.
51
1I.t3.- DETERNIINAC[ON DE LA CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN (Km) Y LA
VKLOCIDAD MAXIMA ~~‘maODE LAS DIFERENTES ISOFORMAS DE
ARGINASA
Para el cálculo de K1~ y ~nNaxse eligieron las siguientes representaciones gráficas:
TABLA II
REPRESENTACIONGRAFICA
ORDENADAS (y) ABSCISAS (x)
Michaelis-Menten y0 [sa]
Hanes [s0]/v0 [sa]
Eisenthal-Cornish-Bowden
y
justificando, en cada caso, el empleo de una u otra.
La representación de Hill (log( )~ y0frente a log [so])se eligió, como primera
aproximación, para explicar la existencia de cooperatividad de las diferentes isoformas de
arginasa.
A partir de estas mismas representaciones gráficas se calcularon K~(ap) (1<¡u aparente, en
presencia del elector) y ví~ax(ap) (vniax aparente en presencia del efector).
11.14.-ESTUDIOS DE LIGAMIENTO
Con objeto de estimar la afinidad entre los distintos efectores (atranorina, ácido evérnico y
ácido úsnico) y la proteína (isoformas 1, III y IV de arginasa) se realizaron estudios de ligamiento
mediante el procedimiento clásico del equilibrio de diálisis,
.52
11.14.1.-Preparación de la membrana de diálisis
La membrana, de celulosa regenerada, suplementada en glicerol (Tubo Visking 27/32,
Serva), se cortó en trozos de 6,0 cm de diámetro y se calentó a 700C en agua destilada durante 1
hora. El proceso se repitió. Después se transfirió nuevamente a agua destilada y se mantuvo a
temperatura ambiente durante 10 h. Por último la membrana se dejó en tampón Tris-1-ICI 0,1 M,
pH 9,1 (para isoformas 1 y IV) o pH 6,5 (para la isoforma III) hasta su utilización (entre 20 y 24
11.14.2.- Células dediálisis
t.as células de diálisis, dos submitades (A y B) de metacrilato, se fabricaron
artesanalmente; admitiendo cada mitad exactamente 1,0 ml de volumen (Fig. 3). Ambas mitades
quedaron separadas por la membrana semipermeable y permanecieron herméticas, con objeto de
evitar alteraciones de volumen, una vez rellenas con la proteína y el ligando.
11.14.3.- Determinación del tiempo de equilibrio
Para determinar el tiempo de equilibrio se rellenaron las dos submitades (A y B) de las
células de diálisis con una disolución de concentración fija de proteína en A:
- 2.55 gM de isoforma ¡
- 1,42 gM de isoforma III
- 1.50 ~iMde isoforma IV
y la misma concentración de ligando (atranorina, ácido evérnico o ácido úsnico) en B. Se
prepararon 20 cámaras de la misma manera y éstas se pusieron en agitación lenta a temperatura
ambiente, recogiendo el ligando libre en equilibrio en las dos subcámaras tras 1-20 h en las
condiciones descritas. LI tiempo de equilibrio se definió como aquel después del cual la
concentración de ligando libre recuperado de ambas subeámaras era el mismo. Con objeto de
descartar la auto-asociación del ligando (atranorina, ácido evérnico o ácido úsnico) se determinó
el tiempo de equilibrio en ausencia de la proteína: en este caso la subcámara A se rellené con
53
QL
Figura 3.- Representación gráfica del principio del equilibrio de
diálisis. En el medio se encuentra la membrana de
diálisis que es permeable al ligando. L (atranorina,
ácido evérnico y ácido úsnico) pero no a la proteína. P
(isoformas 1, III y IV de arginasa).
54
tampón Tris-HCI 0,1 M, pH 9.1 o pH 6,5. El tiempo de equilibrio obtenido en estas condiciones
no difirió en más de una hora respecto al calculado en las otras condiciones.
La extracción del fenol se llevó a cabo según lo descrito en el apartado 11.10.1.3.,
valorándolo cuantitativamente mediante HPLC (apartado 11.9.3.).
11.14.4.-Cálculo del li2ando unido
Para cada subcámara A (subcámara de la proteína) y B (subcámara del ligando) se
realizaron los siguientes cálculos:
a) Subcámara de la proteína (A):
• Pt moles totales de proteína (la indicada en el apartado
11.14.3>
• ¡U concentración de ligando libre en equilibrio
• Vt[LI moles totales de ligando libre en ambas
subeámaras (el mismo en A y 8)
• L~ = moles de ligando unido a la proteina
Lt - Vt[LI
• r ~‘r moles de ligando unido por mol de proteina
b) Subcámara del ligando (B):
• [Lii concentración inicial del ligando en su
compartimento (FIM)
• Lt moles totales de ligando en su compartimento
• [U] concentración de ligando libre en equilibrio
• V< volumen total de la subcámara (1 mí)
Vt[LI moles totales de ligando libre en ambas
subcámaras (el mismo en A y B)
La preparación de concentraciones crecientes de ligando total requiere especial atención
ya que la solubilidad de los fenoles en disoluciones acuosas es muy baja y se puede correr el
riesgo de precipitación no deseada durante el equilibrio de diálisis. En el diagrama de flujo
55
siguiente se explica el proceso seguido de forma detallada.
Preparación de concentraciones crecientes de ligando total:
conccíígracionescrecientesdc ligandoen disolucioneslamponadascon iris—! ¡CI. (P~0 1 para isobitHa II e ¡t4Oléi’tlltt IV o pI1 6,5 para isolérmaiii deargínasa1
Agitación enoscuridada teníperníura ambiente
durairle24o 48 Ir
1~ii Itraci6,, a través de
ti ¡ (ros 0.45 k’ nl (dii meir dc polo)
1 ________________________________________________
1 uvecciondc 1) o~cii sistema HPI.C
4/Scí
U t>iflali vái’ica
(‘ter apartadou .104>
1~(1 IANiiI”It/AUION
SL4rtcc,owpa repartoen
faseor5anie¡I
~a ¡panado¡¡101.2)
4/Secado faseorgánicaen
caí rl c rile dc ai rc
51/Resuspeosión del ~ din, ci’ 0.2 mi
de firsemdvii agoa-Iii’I.C ácidoacético
(0<) i x) ~‘cctoníiríIo(30/70. y)
4/1,í”eceióri de ~0<¡í¡ii en
sistema¡¡PI (1
4/Separación ci’oniatográiica
ver apartado11.10.4)
4/CIJANTIIICACJON
2
a citan) iiica ci60 sin extracción previa da íes’’ 1 tadosalea)orios a tí ‘e la haíída cnanalogrófl ca esdc ira (tirale/a
distin la a la fasemdxii empleada ci el procesodesqaracón.
2 (‘¡í~mniític,ícióíí t<>t’iet’tíi
56
I.a cuantificación del ligando total ha de ser un paso previo al equilibrio de diálisis
y. en función del rendimiento obtenido en el proceso de preparación, calcular la concentración
inicial de ligando que estará en contacto con la proteína durante el proceso de ligamiento,
Transcurrido el tiempo necesario para la obtención de concentraciones iguales de ligando
libre (equilibrio) en las dos subcámaras (ver apartado 11,14.3), el proceso se detuvo extrayendo el
ligando libre de las subcámaras A y B y la proteina con ligando unido (en el caso que se indique)
de la subcámara A.
La extracción del ligando libre se realizó mediante reparto en fase orgánica (apartado
11.10.1.2> cuantificándolo por I-IPLC mediante interpolación del número de cuentas de área en la
recta de calibrado correspondiente.
La disolución conteniendo proteína con ligando unido se llevó a sequedad en corriente de
nitrógeno. El residuo seco se resuspendió en agua-HPLC (agua utilizada en la preparación de la
fase móvil para cromatografla de exclusión molecular) y se inyectó en la columna. cromatográfica
(configuración (b) del apartado 11.8 de Material y Métodos). El volumen de elución relativo de los
diferentes picos obtenidos se interpolé en la recta de calibrado correspondiente a las columnas
diol GF450-6F250 con objeto de calcular su peso molecular (Mr).
11.14.5.-Representacionesilráficas de los datosde li2amiento
La gráfica de saturación se obtuvo representando los moles totales de ligando unido (Lp)
frente al ligando total (Lt), obteniéndose una hipérbola.
Con objeto de estimar la respuesta biológica de la proteína al ligando elector, se eligieron
las siguientes representaciones gráficas (Tabla III), una vez alcanzada la correspondientc
saturación isoforma de arginasa/fenol.
57
TABLA III
REPRFSENTACIONGRÁFICA
ORDENADAS(y) ABSCISAS (x)
Dobles-inversas r [U 1
Logarítmica r log IL)
Scatchard rI[LJ y
El número de sitios de unión por molécula de proteína (n) se estimó como la inversa del
punto de corte con el eje de ordenadas en la representación de dobles inversas (Klotz y Hunston,
1971)
11.14.6.-Análisis estadísticosy procesodedatos
Con el conjunto de los valores obtenidos (n=3) para los diferentes ensayos, se calculó la
media aritmética (valor representado o dato numérico) y la desviación típica (indicada mediante
una barra para cada valor en las representaciones gráficas o por números en las tablas). El
coeficiente de variación media obtenida resultó ser 8,6% (oscilando entre valores del 1% y 20%).
Se procedio a estudiar la significación de los datos (nivel de significación del 95%)
mediante análisis de varianza o test de Newman-Keuls (paquete estadístico Kiwikstat 1.0, para
ordenadores IBM AT)
El ajuste de rectas fue realizado por el método de mínimos cuadrados. Se aplicó el test de
Student para comprobar que las pendientes eran significativamente diferentes.
Hl.- RESULTADOS
59
111.1.- I’URIFICACION Y CARACTERIZACION DE LAS DIFERENí’ES ISOFORMAS
DE ARGINASA
En este bloque se presentan las Figuras 4 a 24 y las
Tablas ¡VaX
60
Se detallarán en primer lugar las características particulares de cada isoforma y después se
analizarán las cualidades espectrofotométricas y espectrofluorimétricas de todas ellas en conjunto.
111.1~1.-Purificación y caracterizaciónde las isoI’ormas 1 y II de arainasa
Las isoformas 1 y II de arginasa han sido purificadas a partir de extractos libres de células
procedentes de talo de I’i. prunastrí tras su incubación en disoluciones tamponadas de L-arginina.
40 mM durante 6 h en oscuridad (apartado ¡¡.5 1.>. En la Tabla IV se muestran los resultados
obtenidos.
El extracto libre de células, concentrado a 150 ml de volumen, se precipitó con sulfato
amónico a distintos porcentajes de saturación; el sobrenadante correspondiente al 85% (p/v)
resultó contener la mayor actividad arginasa. Dicho sobrenadante se adsorbió sobre gel de fosfato
cálcico, eluyendo del mismo las isoformas 1 y LI con tampón Iris-HCI, pH 9,1, de molaridades 0,1
M y 2,0 M, respectivamente. Cada una de estas fracciones se concentró y fue electroenfocada,
como último paso en el proceso de purificación. Las isoformas 1 y II de arginasa fueron
purificadas 148 y 359 veces, con rendimientos del 4,5% y 1,80 o, respectivamente. Las fracciones
obtenidas del eiectroenfoque en columna se emplearon como fuente de proteína pura para los
estudios de caracterización cinética posterior.
El proceso de purificación se analizó de forma paralela en HPLC-exclusión molecular en
una columna TSK (1-5000 PWXL. La Figura 4 A-D muestra los resultados obtenidos. El
cromatograma correspondiente al extracto libre de células muestra 4 picos mayoritarios, los
cuales no se corresponden con proteína pura por la mera observación de su asimetría. El pico que
eluye a 31,54 mm representa la arginasa contaminada con otras proteínas. En la Figura 4 C y 4 D
se representan los cromatogramas procedentes de las arginasas 1 y II obtenidas tras desorción con
Tris-HCI 0,1 M y 2,0 M, pH 9,], respectivamente, del gel de fosfato cálcico. En C, los 3 picos
que eluyen tras 32 mm corresponden al tampón, el cual presenta una fuerte absorción a 280 nm
debido a su grupo amino (pK Tris = 8,1). Tras diálisis frente a agua-HPLC durante 2 h, no se
61
observan estos picos~; fenómeno que viene representado en la Figura 4 D. Los picos mayoritarios
en las Figuras 4 U y 4 1) representan el 99,9% y 99.000, respectivamente, de proteína inyectada.
IIJ.LI.l.- Determinación del punto isoeléctrico
El punto isoeléctrico (pl) de las isoformas 1 y II de arginasa fl~e determinado mediante
electroenfoque en columna y corroborado por electroforesis capilar.
En la Figura 5 se representa el electroenfoque correspondiente a la isoforma 1. De las dos
fracciones, cuya concentración de proteina fue superior a 10,0 ~igmL1, sólo aquella eluida a pH
5,86 presentaba actividad arginasa (112,9 unidades>. El pl de la isoforma ide arginasa es de 5,86.
El punto isoeléctrico de la isoforma 11 de arginasa es de 5,8, ya que a este pH eluye el
único pico con actividad arginasa (275,4 unidades) (Fig. 6).
La estimación del punto isoeléctrico mediante electroforesis capilar (FC) presenta la
ventaja, sobre el electroenfoque en columna convencional, de una muy superior eficacia (5.500
platos teóricos para el pico de la isoforma 1 de arginasa en FC frente a 15,0 platos teóricos en
electroenfoque en columna para el mismo pico) Por otro lado, al ser los picos tan eficaces es
posible separar proteinas de pí muy similar con una gran resolución. Sin embargo, la FC tiene la
desventaja de, al ser una técnica de microanálisis, admitir pequeños volúmenes y bajas.
concentraciones de muestra (volúmenes de inyección 36 nl) a inyectar en el capilar. El problema
se soslaya en parte empleando capilares de sílice de mayor diámetro interno, pero en éstos, la
disipación del calor producido por el efecto Joule es más dificil, requiriendo el aparato un mejor
sistema de refrigeración. En la Figura 7 A y B se representan los esquemas de capilares de sílice
fundido recubierto de poliimida con distinto diámetro interno, 75 y 50 um empleados en la
valoración de! pl de las isoformas de arginasa. A la vista de los electroforegramas de ambos
capilares, se eligió el capilar de sílice de 75 gm de diámetro interno con un recubrimiento externo
de 60 ~m de poliimida y una longitud de 60 cm (Fug. 7A). La vida media de utilización del capilar
es función de n1uchas variables: fuerza iónica del tampón empleado como electrolito, temperatura
y voltaje aplicados, naturaleza de la muestra, etc. Por ello, es conveniente evaluar e! estado del
62
capilar tras varios análisis con objeto de comprobar si sus características estructurales son las
iniciales. Al microscopio óptico se pueden observar las posibles alteraciones. En la Figura 8 se
representan algunas de ellas, donde la situación más grave (Ng. 8 1) es la ruptura del tubo interno
que ocasiona una interrupción automática de flujo, hecho que ocurre con más frecuencia en
capilares de 50 im (Ng. 7 B). La vida media de uso se estimó en aproximadamente lOO
inyecciones en los capilares de 75 ~m donde el diámetro total, contabilizado el recubrimiento
externo es de 190 M~
En la Figura 9 A se representa el electroforegrama correspondiente a la isoforma 1 de
arginasa obtenido a 300C y 25 kV de voltaje aplicado, empleando como electrolito tampón borato
sódico 15 mnMlácido fosfórico; pH 7,1. La arginasa ¡ eluye en estas condiciones a 6,85 mm con
carga negativa. Cuando el electrolito empleado es tampón borato sódico 25 mM, pH 9,0, a 300<?
y 17 kV de voltaje aplicado, la isoforma 1 eluye a 11,16 mm, con carga negativa también (Fig. 9
B).
El tiempo de retención se transformó en movilidad electroforética (Me ) según lo descrito
en el apartado 11.6.2 de Material y Métodos. La interpolación de Me en Ja correspondiente recta
de calibrado (Fig. ¡O A. a pH 7,1 y Fig. 10 B a pH 9,0) construida con proteínas de punto
isoeléctrico conocido dio valores de pl 5,3 y pl 4,5, respectivamente. El valor medio,.
pI 4,9, se eligió corno punto isoeléctrico determinado en electroforesis capilar.
La concentración de isoforma de arginasa 11 no fue suficiente como para deducir su pl en
FC ya que, como se ha comentado anteriormente, el volumen de inyección que admite el capilar
es muy pequeño y la concentración de proteína en ese volumen no era suficiente para detectar
pico significativo de altura superior a la relación señal/ruido del detector, No obstante, los
mejores electroforegramas obtenidos indicarian un pl alrededor de 5,0.
111.1.1.2.- Composición de aminoácidos
La composición de aminoácidos de las isoformas 1 y II de arginasa se estimó a partir de las
fracciones del electroenfoque en columna, mediante el análisis de los productos obtenidos por
63
hidrólisis ácida a 24 h. Los resultados se recogen en la Tabla V. Las dos isoformas poseen una
composición semejante, ya que el porcentaje de moles de la mayoria de los aminoácidos es
similar. Las mayores diferencias se encuentran en Ser, Glx, Gly, Leu y ~1yr.El porcentaje de
moles más elevado corresponde a los restos ácidos, Asx y Clx, que representan el 11,4 y el
16,6%, respectivamente, en la isoforma de arginasa 1 y el 10,4 y 11,7%, respectivamente, en la
isoforma II.
Otro aspecto a destacar de la composición de aminoácidos es la elevada proporción de
residuos con grupos polares, Ser y Gly, los cuales representan el ¡0,4% y 15,6%,
respectivamente, en la isot’orma 1 y el 6,5% y 11,7%, respectivamente, en la isoforma 11. La Cys
representa el 1,3% y 1,9%, respectivamente, en las isoformas 1 y 11. El número de residuos de l’rp
por cadena polipeptidica es de 1 en la isoforma 1 y de 3 en la isoforma II.
111.1.1.3.- Determinación del pesomolecular
El peso molecular de las isoformas 1 y ¡1 de arginasa nativas fue estimado mediante
exclusión molecular en HPLC utilizando dos tipos de columnas: a) una columna TSK G5000
PWXL y b) dos columnas en serie Zorbax-diol, según la configuración y condiciones de análisis
descritas en el apartado 11.8 de Material y Métodos. El peso molecular de las isoformas
desnaturalizadas con SDS al 1% (p/v) fue calculado utilizando sólo la configuración b)
equilibrando la columna con SDS al 1% (p/v). Las figuras II y 12 muestran los cromatogramas
de proteínas patrón de peso molecular conocido separadas en las columnas [SK a) y Zorbax-diol
b), respectivamente.
La columna 15K G5000 PWXL proporciona una mayor retención que las columnas
Zorbax-diol GF450-GF2SO, ya que la tiroglobulina (Mr6ÓO kDa) eluye a 22,5 mm y el
citocromo c (Mr 12,4 kDa) a 33,4 mm (Fig. II). Entre ambas proteínas, el tiempo de retención
es de 11,0 mm. Las mismas proteínas, tiroglobulina y citocromo c, eluyen a 14,3 mm y 23,3 mm,
respectivamente, en las columnas Zorbax-diol, lo cual indica que el tiempo de retención entre
ambas es de 9.0 mm (Fig. 12). Sin embargo, la eficacia de los picos es mayor en las columnas con
64
fase estacionaria de tipo diol, según se deduce del número de platos teóricos calculado para cada
columna (tabla VI).
Las fracciones del electroenfoque correspondientes a las isoformas 1 y II de arginasa
(Tabla IV y Figs. 5 y 6), fueron dializadas en agua-1-IPLC durante 2 h y después concentradas.
Las formas de arginasa nativa y la desnaturalizada con SDS al 1% (p/v) se inyectaron en las
columnas correspondientes. según lo descrito anteriormente. En la Figura 13 se muestran los
resultados obtenidos en las columnas Zorbax-diol 0F450-GF250. El pico mayoritario de SDS al
10/o (p/v) eluye a ¡4,4 mm, ya que forma una especie de lagregado micela? de elevado peso
molecular en la fase móvil (Fig. 13 A). La isoforma 1 de arginasa eluye tanto nativa (Hg. 13 B)
como desnaturalizada (Fig. 13 U) a 21,9 mm; los tres picos que eluyen antes que la proteína
corresponden a los distintos grados de agregación de la micela de SDS. El tiempo de retención de
la isoforma ¡1 de arginasa, tanto nativa como desnaturalizada, fue de 22,2 mm.
La interpolación de los valores del volumen de retención relativo de la isoforma 1 de
arginasa nativa (1,89> y de la isoforma 11 de arginasa nativa (1,91). obtenidos en la columna TSK
y los obtenidos en las columnas Zorbax-diol (1,77 y 1,79, respectivamente), en las rectas de
calibrado correspondientes (Figs. 14 A y 13, respectivamente>, permitió estimar el peso molecular
de las isoformas 1 y 11 de arginasa en 18,0 kDa y 16,0 kDa, respectivamente. Los volúmenes de
retención relativos de las isoformas 1 y U desnaturalizadas con SDS, obtenidas en las columnas
Zorbax-diol, fueron los mismos que los de las formas nativas. Las isoformas 1 y II de arginasa
están compuestas de una sola subunidad, según se deduce de su tratamiento con SDS.
111.1.2.- Purificación y caracterización de la isoforma III dearainasa
La isoforma III de arginasa tite purificada a partir de extractos libres de células
procedentes de talos de E. prunastrí tras su incubación en disoluciones tamponadas de
cicloheximida 40 MM durante 16 h en oscuridad (apartado 11.5.2.>. En la Fabla VII se muestran
los resultados obtenidos.
65
El extracto libre de células se concentró a 150 ml y se sometió a fraccionamiento con
diferentes porcentajes (p/v) de sulfato amónico, La mayor actividad arginasa se obtuvo en el
sobrenadante correspondiente al 70% (p/v) de saturación de la sal. Dicho sobrenadante se
adsorbió sobre gel de fosfato cálcico, eluyendo del mismo la mayor actividad arginasa con tampon
‘Iris-HUí 0, 1 6 M, pH 6,5 Esta fracción se concentró y fue electroenfocada en columna, como
último paso en el proceso de purificación. Del electroenfoque se obtuvieron dos fracciones con
actividad arginasa; una de ellas con actividad específica de 66,1 unidades y la otra con 11,2
unidades. A partir de este momento, se eligió la fracción de mayor actividad arginasa, a la cual se
denominó isoforma 111, para análisis posteriores. La isoforma III de arginasa se ha purificado 259
veces con un rendimiento del 2%.
Los distintos pasos del proceso de purificación fueron analizados paralelamente mediante
HPLC en una columna de exclusión molecular TSK 05000 PWXL. La Figura 15 A-U muestra los
resultados obtenidos. Los cromatogramas correspondientes al extracto libre de células (Fig. 15 A)
y al sobrenadante de sulfato amónico al 70% (p/v) (Fig. 15 13) muestran diferentes picos
correspondientes a distintas proteínas. En la Figura 15 C se muestra un pico mayoritario, el cual
representa el 95% aproximadamente, que eluye a 28,5 mm y corresponde a la isoforma [11de
arginasa; el pico que eluye a 38 mm corresponde al tampón contenido en la muestra.
111.1.2±-Determinación del punto isoeléctrico
El punto isoeléctrico (pl) de la isoforma III de arginasa fue determinado mediante
electroenfoque en columna y corroborado por EC.
En la Figura 16 se representa el electroenfoque de la fracción de arginasa de 66,1 unidades
de actividad obtenida tras desorción con tampón “l’ris-HCI 0,16 M, pH 6,5 del gel de fosfato
cálcico. Como puede observarse, se detectan tres fracciones cuya concentración de proteína oscila
entre 25,0 y 60,0 ~gmh1, pero sólo dos de ellas presentan actividad arginasa (66,1 unidades la
que eluye a pH 6,18 y 11,2 unidades la que eluye a pH 4,68). El valor de pH al que eluye la
66
fracción con mayor actividad arginasa fue estimado como pl de la isoforma 111 de arginasa (pl
— 6 18).
En la Figura 1 7 A y 13 se representan los electroforegramas correspondientes a la isoforma
111 de arginasa utilizando capilares de 75 pm de diámetro interno (Fig. 7 A), Cuando el electrolito
empleado es tampón borato sódico 15 mM/ácido fosfórico, pH 7.1, Ja temperatura 300C y el
voltaje 25 kV, la arginasa eluye a 6,33 mm (Fig. 17 A), lo que demuestra que está cargada
negativamente. Si el electrolito empleado como fase móvil es tampón borato sádico 25 mM, pH
9,0, a 300C y aplicando 17kV. el pico de arginasa eiuye a 10,33 mm (Hg. 1713). lo cual vuelve a
indicar que está cargada negativamente.
Los tiempos de retención, 6,33 mm y 10,33 mm se transformaron en Me’ en función de las
dimensiones del capilar (apartado 11.6.2 de Material y Métodos). La interpolación de la movilidad
electroforética en la correspondiente recta de calibrado a pH 7,1 (Fig. 18 A) y pH 9,0 (Fig. 18 B)
permite deducir un valor medio dep1 entre 5,0 (con electrolito a pH 7,1) y 5,7 (con electrolito a
pH 9,0). El valor de pl de la isoforma 111 de arginasa, detenninado mediante EC es de 5,35.
111.1.2.2.- Composición de aminoácidos
La composición de aminoácidos de la isoforma 111 de arginasa se estimó a partir de la
fracción del electroenfoque en columna que contenía mayor actividad (66,1 unidades), mediante el
análisis de los productos obtenidos por hidrólisis ácida a 24 h. Los resultados obtenidos se
recogen en la Tabla VIII. La enzima es rica en aminoácidos con grupos no polares, como son Ala
(~o moles 8,7), Val (% moles = 6,6) y Leu (% moles = 7,2), aminoácidos, por otra parte, típicos
de pre-proteina. La isoforma III de arginasa presenta menor proporción de residuos ácidos, Asx y
Glx, que las isoformas 1 y II. El contenido en Ser (6,6%) y Gly (11,2%) también es elevado
respecto a otros aminoácidos. La Cys representa el 2,7% del total. El número de residuos de ‘Frp
por cadena polipeptídica es de 9.
67
111.1.2.1-Determinación del pesomolecular
El peso molecula.r de la isoforma III de arginasa fue estimado mediante HPLC-exclusión
molecular utilizando dos tipos de columnas: a> una columna 15K G5000 PWXL y b) dos
columnas en serie Zorbax-diol GF450-GF250, según la configuración y condiciones de análisis
descritas en el apartado 11.8 de Material y Métodos. El peso molecular de la isoforma 111
desnaturalizada con SDS al 1% (p/v) tite calculado utilizando sólo la configuración b)..
equilibrando la columna con SDS al 1% (p/v).
La fracción del electroenfoque (Tabla VII y Fig. 16) de mayor actividad arginasa,
correspondiente a la isoforma 111, fue dializada frente a agua-HPLC durante 2 h y después
concentrada. La forma nativa y la enzima desnaturalizada con SDS al 1% (p/v) se inyectaron en
los dos sistemas de columnas descritos anteriormente. La interpolación del valor del volumen de
retención relativo de la arginasa nativa (1,71), obtenido en la columna 15K y el obtenido en las
columnas Zorbax-diol (1,70) en las rectas de calibrado correspondientes (Figuras 19 A y 13,
respectivamente), permitió estimar el peso molecular de la isoforma ¡U de arginasa en,
aproximadamente, 26.0 kDa. El peso molecular deducido de cada columna difiere en — 1,0 RDa.
El volumen de retención relativo de la isoforma III desnaturalizada con SDS, obtenido en las
columnas Zorbax-diol, fue el mismo que el de la forma nativa (1,68). La isoforma III de arginasa
está compuesta de una sola subunidad, según se deduce de su tratamiento con 51)5.
111.13.- Purificación y caracterización de la isoforma IV de ar2inasa
La isoforma IV de arginasa fue purificada a partir de extractos libres de células
procedentes de los medios de incubación de talos sumergidos en disoluciones tamponadas de
L-arginina 40 mM durante 8 h en oscuridad (apanado 11.5,3. de Material y Métodos). En la Tabla
IX se muestran los resultados obtenidos.
El extracto libre de células se concentró a 310 ml y se sometió a fraccionamiento con
sulfato amónico de diferente porcentaje de saturación, entre el 10% y el 95% (p/v). La mayor
68
actividad arginasa se observó en el sobrenadante correspondiente al 50% (p/v) de saturación de la
sal. Dicho sobrenadante se adsorbió sobre gel de fosfato cálcico, eluyendo del mismo la mayor
actividad arginasa con tampón Tris-HCI 0,14 M, pH 9,1. Esta fracción se concentró y fue
electroenfocada en columna, como último paso en el proceso de purificación. Del electroenfoque
en columna se obtuvieron tres fracciones con actividad arginasa: una de 26,2 unidades, otra de
9.6 unidades y otra dc 123.2 unidades. A partir de este punto, se eligió la Iraecion de mayor
actividad específica < 2 ~. 2 unidades). a la ctiaí se denomino isotornia l\ de an.zi nasa, ~nn~
íoí es =tna¡isís l)iclia aI’u¡nasa La sido purificada Oíd veces con un ¡endi m¡eíito del 5 (¡‘o.
aproximadamente
Los distintos pasos del proceso de purificación fueron analizados paralelamente mediante
HPLC en una columna de exclusión molecular TSK 65000 PWXL. La Figura 20 A-D muestra
los resultados obtenidos, Los cromatogramas correspondientes al extracto libre de células (Fig. 20
A) y al sobrenadante del 50% (p/v) de saturación de sulfato amónico (Fig. 20 13) muestran un
mayor número de picos que en las Figuras 4 A-B y 15 A-E, correspondientes a las isoformas ¡ y
III de arginasa, lo cual indicaría una gran secreción de proteinas al medio de incubación. En la
Figura 1 5 U se ¡nuestra el cromatograma correspondiente a la fracción de arginasa desorbida con
tampón Iris-HCI 0,14 M. pH 9,1, del gel de fosfato cálcico. En este caso, a diferencia de las
anteriores purificaciones, la pureza de esta fracción no es tan grande, ya que se pueden apreciar
claramente tres picos de tiempos de retención a 26,8, 29,55 y 29,85 mm, respectivamente, con
actividad arginasa. I’ras el electroenfoque, logra obtenerse la proteina pura, como demuestra el
cromatograma de la Figura 20 D, donde el pico en solitario que eluye a 29,85 mm representa el
99,9% frente al 32% del pico que eluye al mismo tiempo en la Fig. 20 C.
111.1.3.1.- Determinación del punto isoeléctrico
El punto isoeléctrico (pl) de la isoforma IV de arginasa fue determinado mediante
electroenfoque en columna y corroborado por EC.
69
En la Figura 2 1 se representa el electroenfoque de la fracción de arginasa de 68,9 unidades
de actividad <Tabla IX) obtenido tras desorción con tampón Tris-HUí 0,14 M, pH 9,1, del gel de
fosfato cálcico. Corno puede observarse, se obtienen tres fracciones de 26,2, 9,6 y 123,2 unidades
de actividad, cuya concentración de proteina oscila entre 25 y 65 ~gmh1. Estas tres fracciones
eluyen a pJ-l 8,3, 7.9 y 5,6, respectivamente. La fracción correspondiente a pH 5,6. valor que se
asimiló al pl, que presentaba la mayor activ¡dad arginasa. fue denominada isoforma IV.
eIl1j)leaiRh ise para los analisis poste! ioí’es
¡ 1 l:ís 1’ í~tíí as 1? A ~ [3 se representan los eleclroforegi’amas correspondientes a la
isoforma IV de arginasa utilizando capilares de 75 ~m de diámetro interno (Fig. 7 A). Cuando el
electrolito empleado corno fase móvil es tampón borato sódico [5 mM/ácido fosfórico, pR 7,1, a
30<’U y aplicando 25 kV de voltaje, la isoforma IV de arginasa eluye a 7,6 mm (Fig. 22 A), lo que
demuestra que está cargada negativamente. Si el electrolito utilizado es tampón borato sódico 25
mM, pH 9,0. a 3O~’C y con un voltaje de 17 kV, el pico de arginasa aparece a ¡0,5 mm (Fig. 22
13), lo que corrobora su carga negativa.
Los tiempos de retención, 7,6 mm y 10,5 mm, se transformaron en Me (apartado 11.6.2 de
Material y Métodos). La interpolación de la movilidad electroforética en la recta de calibrado a
pH 7,1 (Hg. 23 A) ya pH 9,0 (Hg. 23 13) permite determinar un valor de pl, en ambos casos, de
4,8 para la isotbrma IV de arginasa.
IILI.3.2.- Composicióndeaminoácidos
La composición de aminoácidos de la isoforma IV de arginasa se calculó a partir de la
fracción del electroenfoque en columna que poseía la mayor actividad (123,2 unidades), mediante
el análisis de los productos obtenidos por hidrólisis ácida a 24 h. Los resultados obtenidos se
recogen en la ‘Fabla X. La isoforma IV de arginasa es rica en aminoácidos ácidos, Glx y Asx, los
cuales representan el 14,9% y 11,6%, respectivamente, del contenido total. También presenta una
alta proporción de Ser (9,8%) y Gly (15,4%). Un aspecto a destacar de la composición
aminoacidica es la similitud que presenta con la isofornia 1 (‘Fabla V) ya que prácticamente no
‘70
existen diferencias. La Cys representa el 0,8% del total de aminoácidos. El número de residuos de
‘lrp por cadena polipeptídica se estimó entre 1 y 2.
111.1.3.3.- Determinación del pesomolecular
El peso molecular de la isoforma IV de arginasa nativa Fue estimado mediante HPLU-
exclus¡ori riiulecijlar itílízindo tíos tipos de columnas a) una columna ‘l’SK (1566(> l~W.\ 1, ~ b)
tíos columnas ~ SCI OS ha hax’Átíol (W’4504i1’25ú, segun la eonfigw aciOti ‘Y condiciones analisis
descritas en el apartado 11.8 de Material y Métodos, El peso molecular de la isoforma IV
desnaturalizada con SDS al 1% (p/v) fue calculado utilizando sólo la configuración b),
equilibrando la columna con SDS al 1% (p/v). La fracción del electroenfoque (Tabla IX y Fig. 21)
de mayor actividad arginasa, correspondiente a la isoforma IV, fue dializada en agua-HPLC
durante 2 Ii y después concentrada. Las formas nativa y desnaturalizada con SDS al 1% (plv) de
arginasa fueron inyectadas en las columnas correspondientes, según lo descrito anteriormente. La
interpolación del valor’ del volumen de retención relativo de la arginasa nativa (1,79), obtenido en
la columna TSK y el obtenido en las columnas Zorbax-diol (1,75), en las rectas de calibrado
correspondientes (Figs. 24 A y 13, respectivamente), permitió estimar el peso molecular de la
isoforma IV de arginasa en aproximadamente 20 kDa. El volumen de retención relativo de la
isoforma IV desnaturalizada con SDS, obtenido en las columnas Zorbax-diol fUe el mismo que el
de la forma nativa. La isoforma IV de arginasa está compuesta de una sola subunidad, según se
deduce de su tratamiento con SDS.
Llegados a este punto podemos suponer que las isoformas 1 y II de arginasa son la misma
proteína, según podemos deducir de su similitud en el punto isoeléctrico (pi = 5,83 y pl 5,86,
respectivamente) y en el peso molecular (Mr 18,0 RDa y Mr 16,0 kDa). El hecho de que
eluyan con diferente fuerza iónica (0,1 M la isoforma 1 y 2,0 M la isoforma II, de tampón Tris-
HCI, pH 9, 1) del gel de fosfato cálcico puede deberse a la microheterogeneidad derivada de
purificar las enzimas a partir de una amplia población de individuos no donados.
71
Desde este momento, nos referiremos siempre a las isoformas 1, III y IV de arginasa,
entendiendo que la 1 y II son la misma proteína. Los estudios espectroscópicos, así corno los que
se comentarán más adelante sobre ligamiento, se referirán a estas tres isoformas.
72
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Figura 4.- (‘romatogramas obtenidos mediante HPLC de exclusión molecular en columna
‘[SIC 65000 PWXL, según las condiciones de análisis descritas en el apartado
11.8 de Material y Métodos, de las distintas fracciones del proceso de
purificación de las isoforma 1 y II de arginasa. En (A), extracto libre de
células; en (13), sobrenadante dializado del 85% (p/v) de saturación con sulfato
amónico~ en (C), fracción eluida con tampón ‘l’ris-HCI 0,1 M, pH 9,1, del gel
de fosfato cálcico y en (D), fracción eluida con tampón Tris-HCI 2,0 M, pH
9, 1 del gel de fosfato cálcico, Las flechas indican los picos identificado como
isoformas 1 y ¡1. i = inyección.
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75
Figura 5.- Electroenfoque en columna de la isoforma 1 de arginasa obtenida por desorción
del gel de fosfato cálcico con tampón Tris-HCI 0,1 M, pH 9,1. Proteinas (O),
pu (O). AL. indica actividad especifica expresada en unidades: la flecha
muestra el pl de la fracción correspondiente a la isoforma 1.
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77
Figura 6 - Electroenfoque en columna de la isoforma II de arginasa obtenida por
desorción del gel de Fosfato cálcico con tampón 1ris-HCI 2.0 M, pI 1 9,1.
Proteínas (@), pH (O). A.E. indica actividad específica expresada en
unidades; la flecha muestra el pl de la fracción correspondiente a la
isotermaII.
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Figura 7<- Representación esquemática de <A>, capilar de 75 ~tmde diámetro interno y
(8), capilar de 50 ~m de diámetro interno. Pl ~‘poliimida, S “ sílice fundida.
A
Pl -ctvnS 75 130 l9Opm
aPl
S _________________________________ 50 300 360
________________________ -c-a
SI
Figura 8.- Anatomía interna de los capilares de sílice fUndida vistos a microscopio óptico.
En (a) y (b) capilares de 75 m de diámetro interno; en (c-l), capilares de 50
pm de diámetro interno. En (a), capilar vacío intacto; en (b), corte correcto
del extremo; en (c), corte defectuoso que distorsiona la capa de poliimida; en
<d), aspecto del capilar lleno (flecha rellena) y vacío (flecha vacía); de (e> a
(k>, diferentes irregularidades de la pared interna del capilar; en (1), formación
de poro a través de la pared del capilar. Pl poliimida; S silice fundida. Las
fotogratias fueron tomadas con un sistema Nikon Labophot utilizando un
objetivo acromático 20x de apertura numérica 0,4 (Ref 160/O. 17,Nikon).
83
Figura 9- Electroforegramas de la isoforma 1 de arginasa obtenidos con tampón borato
sodico 15 mM/ácido fosfórico pH 7,1 (A> ó con tampón borato sódico 25
mM, pH 9,0 (B), como electrolito. La electroforesis se llevó a cabo en
capilares de sílice fundida de 75 pm de diámetro interno por 60 cm de longitud
<hasta la ventana de detección). La temperatura fue de 300C y el voltaje
aplicado fue de 25 kV en (A) y de 17 kV en (8). I..as flechas indican el pico
identificado como isoforma 1.
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Rectas de calibrado para la determinación del punto isoeléctrico en función de
la movilidad electroforética (Pe), constniidas con proteínas de pl conocido. 1.,a
separación de proteínas se obtuvo mediante electroforesis capilar, utilizando
como electrolito (A), tampón borato sódico 15 mM/ ácido fostbrico, pH 7,1, a
30<X’ y 25 kV; y -4,23 + 1,06x; r 0,96. En (8) - el electrolito fue tampón
borato sódico 25 mM, pH 9,0 a 300(7 y 17 kV; y ~3,9+ 0,75x : r 0,99. El
capilar de silice Fundida y 60 cm de longitud. 1 tiroglobulina (pl = 4,5):,
2 alcohol deshidrogenasa (pl s’.~ 5,4); 3 = anhidrasa carbónica (pi 5.9);
4 aldolasa (en A) (pl 6,6), mioglobina (en B) (pl 7,0); 5 benzol (pl
igual al del electrolito). Las [lechasindican la posición de la isoforma 1 de
arginasa (O) en las rectas de calibrado obtenidas a pH 7,1(A) y pH 9,0 <B).
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¡‘abla 1/.- Composición de aminoácidos de las isoformas 1 y II de arginasa.
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* El número de residuos se expresa como el valor entero mas próximo, asumiendo un
** peso molecular de 18.000 y 16.000 Da para las isoformas 1 y II, respectivamente.Determinado como ácido cistéico.
***Determinado espectrofotométricamente por el método de Beaven-I’loliday.
88
Figura II.- (‘romatograma obtenido mediante HPLC de exclusión molecular de proteínas
patrón de peso molecular conocido. Columna TSK 05000 PWXL <300 mm x
7,8 rmn de di.). Fase móvil, tampón Tris-HUí 75 mM. pH 9,1; flujo 0,3
ml.m¡rv detección UV a 280 nm. ‘liroglobulina (Mr=ÓÓO kDa);
2 “ Apoferritina (Mr44O kDay 3 13-amilasa (M~200 kDa); 4 Albúmina
<Mr -67 kDa), 5 Anhidrasa carbónica (Mrz’29 k[)a) y 6 Citocromo e
(Mr’> ¡2,4 kDa)
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0 10 20 30 40 50
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Figura 12.- (‘romatograma obtenido mediante HPLC de exclusión molecular de proteínas
patrón de peso molecular conocido. Columnas Zorbax (3F450-6F250 2 x
(250 mm x 9,4 mm di.). Fase móvil, tampón Tris-HCI 200 mM, pH 8,5; tiujo
1,0 nilmirn 1; detección Uy a 280 nnx. 1 Tiroglobulina (Mñ66O kDa);
2 = Apoferritina (Mñ44O kDa); 3 = 13-amilasa (M<200 kDa); 4 = Albúmina
(Mv67 kDa); 5 y’. Anhidrasa carbónica (Mñ29 kDa) y 6 = (‘itocromo c
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labia Vi.- Eficacia de las columnas TSK 05000 PWXL y Zorbax-diolcon Zorbax-diol UF 250, analizada como número de platoslos picos de tiroglobulina y citocromo c (númeroscroniatogramas de las Figuras II y 12. respectivamente).análisis descritas en el apartado 11.8, de Material y Métodos
(iF450 en serieteóricos (N) para
1 y 6 en losCondiciones de
Columna(s) Proteina
‘liroglobulina 107904 + 650‘lSK 05000 PWXL
Citocromo c 85,931 + 730
‘liroglobulina 163.592 + 593Zorbax (iF450-Zorbax (iF250
Citocromo c 108484 + 687
* N ¡tic calculado mediante Ja expresión ¡6
93
(‘ronlatogramas obtenidos mediante HPLC de exclusión molecular de SDS al
1% (Vv> (A), de la isoforma 1 de arginasa nativa (8) y desnaturalizada con
SOS al 1% (p/v) (Cl. Columnas Zorbax <3F450-6F250, 2 x (250 mm x 9,4
mm di.>; fase móvil . tampón Tris-HO 20<) mM, pH 8,5, conteniendo SDS al
1% (pA’); flujo 1 ml.niirr1; detección 13V a 280 nm. Las flechas rellenas
indican el pico identificado como isoforma 1 de arginasa y las flechas vacias el
agregado de SDS. ix inyeccion.
Figura 13 -
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95
Figura 14 - Rectas de calibrado para la determinación del peso molecular en función del
volumen de elución relativo, construidas con proteínas de Mr conocida. La
separación de proteínas se obtuvo mediante I’IPLC de exclusión molecular,
según las condiciones de análisis descritas en el apanado 11.8 de Material y
Métodos. En (A), columna TSK G500() PWXL; y 6,49 - 8,65x; r 0,98. En
(B), dos columnas Zorbax-diol GF4SO-0F250, conectadas en serie; y 6,43 -
8,74x, r’~ 0.98. 1 = tiroglobulina (Mr 660 kDa);2 apoferritina (Mr 440
kl}a>; 3 13-amilasa (Mr 200 kDa); 4 albúmina de huevo(Mr 67 kfla);
5 anhidrasa carbónica (Mr uy 29 kDa); 6 citocromo c <Mr 12,4 kDa).Las
flechas indican la posición de las isoformas 1(0) y 11< .) de arginasa en las
rectas de calibrado
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6,0
5,5
5,0
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98
Cromatogramas obtenidos mediante HPLC de exclusión molecular en columna
‘[5K 65000 PWXL, según las condiciones de análisis descritas en el apartado
¡1.8 de Material y Métodos, de las distintas fracciones del proceso de
purificación de la isoforma III de arginasa. En (A), extracto libre de células; en
(8). sobrenadante dializado del 70% (p/v) de saturación con sulfato amónico y
en (C), fracción eluida con tampón i’ris-HCI 0,16 M, pH 6,5 del gel de fosfato
cálcico. Las flechas indican el pico identificado como isoforma III.
inyección
Figura 15<
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Figura 16.- Electroenfoque en columna de la isoforma III de arginasa obtenida por
desorción del gel de fosfato cálcico con tampón Tris-H(’l 0,16 M, pH 6,5.
Proteinas (e), pH (O). A.E. indica actividad especitica expresada en
unidades; la flecha muestra el pl de la fi-acción correspondiente a la isoforma
III.
pH (O)
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102
lilectroforegramasde la isoforma III de arginasaobtenidoscon tampónborato
sádico 15 mM/ácido fosfórico, pH 7,1 (A) o con tampón borato sádico25
mM, pH 90 (B), como electrolito. La electroforesisse llevé a cabo en
capilaresde sílicefundidade 75 pm de diámetrointernopor60 cm de longitud
<hasta la ventanade detección).La temperaturafue de 300C y el voltaje
aplicadofue de 25 kV en (A) y de 17 kV en (B). Las flechasindican el pico
identificadocomoisoformaIII.
Figura 17-
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1~04
Rectasde calibradoparala determinacióndel puntoisoeléctricoen función de
la movilidad electroforética(I’e)’ construidascon proleinasde pl conocido.La
separaciónde proteínasse obtuvo medianteelectroforesiscapilar, utilizando
comoelectrolito(A>, tampónboratosádico 15 mM! ácidofosfático,pH 7,1, a
30<t’ y 25 kV; y -4,23 + l,06x; r 0,96. En (8) , el electrolito fue tampón
boratosádico25 mM, pH 9,0 a 300C y 17 kV; y -3,9 + 0,75x ; r 0,99~ El
capilar, de sílice fundida y 60 cm de longitud. 1 tiroglobulina (pl 45)
2 alcohol deshidrogenasa(pl = 5,4): 3 anhidrasacarbónica(pl 5,9);
4 - aldolasa(en A) (pl 6,6), mioglobina<en B) (pl 7,0); 5 benzol (pl
igual al del electrolito).Lasflechasindican la posiciónde la isoforma III de
arginasa(O) en las rectasde calibradoobtenidasa pH 7,1(A) y pl-l 9,0 (II).
Figura 18.-
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1.06
Tabla VIII.- Composiciónde aminoácidosdela isoformaIIIde arginasa
Aminoácido % moles Residuos*
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PIlE 3,1 7
1-JIS 2,1 5
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ARG 4,7 lo
‘FRP * * * 9
* El número de residuossc expresacorno el valor entero más próximo
asumiendoun pesomolecularde 26.000 Da.** Determinadocomo ácido cistéico.
Determinadoespectrolotométricarnenteporel métododeBeavcn-Holiday
1. 07
Figura 19,- Rectasde calibradoparala determinacióndel pesomolecularen función del
volumen de elución relativo, construidascon proteínasde Mr conocida. La
separaciónde proteínasse obtuvo medianteHPLC de exclusión molecular,
segúnlas condicionesde análisis descritasen el apartado11.8 de Material y
Métodos.En (A), columnaTSK 05000 PWXL; y 6,49 - 8,65x; r 0,98, En
(B), doscolumnasZorbax-diol6F450-GF250,conectadasen serie;y = 6,43 -
8,74x; r — 098. 1 = tiroglobulina(M~ 660 kDa); 2 = apoferritina(Mr 440
kfla); 3 13-amilasa(Mr 200 kDa); 4 albúminade huevo(Mr~ 47 kl)ag 5
anhidrasacarbónica(Mr = 29 kDa); 6 citocromoc (Mr 12,4 kDa). Las
flechasindican la posiciónde la isoformaIii (O) de arginasaen las rectasde
calibrado.
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(romatograrnasobtenidosmedianteHPLC de exclusiónmolecularen columna
TSK 65000 PWXL, segúnlas condicionesde análisisdescritasen el apartado
118. de Material y Métodos, de las distintas fracciones del proceso de
purificaciónde la isoformaIV de arginasa.En (A), extractolibre de células;en
(B), sobrenadantedializadodel 50% (p/v) de saturacióncon sulfato amónico;
en (U). fracción eluida con tampón Tris-HUí 0,14 M, pIl 9.1, del gel de
tbsfato cálcico; en (D), fi-acción eluida del electroenfoqueen columna a pH
5.5. Las flechasindicanel pico identificadocomoisoformaIV. i “inyección.
Figura20<
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Figura 21.- Eiectroenfoqueen columna de la isoforma IV de arginasaobtenida por
desorcióndel gel de fosfato cálcico con tampón Iris-HUí 0.14 M, pH 9, 1.
Proteínas(e), pH (O). A.E. indica actividad específica expresadaen
unidades;Jaflecha muestrael pl de la fracción correspondientea la isoforma
lv.
pH (0)10
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3.4
Electrofo¡egramasde la isoformaIV dearginasaobtenidoscon tampónborato
sádico¡5 mM/ácidofosfóricopH 7,1(A) o con tampónboratosádico25 mM
ph 9,0 (B), comoelectrolito. La electroforesisse llevó a caboen capilaresde
sílice fundida de 75 pm de diámetrointerno por60 cm de longitud (hastala
ventanadedetección).La temperaturafue de 300C y el voltaje aplicadofue de
25 kV en (A) y de 17 kV en (13). Las tiechasindican el pico identificado como
isoformaIV
Figura22.-
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Figura 23.- Rectasde calibradoparala determinacióndel puntoisoeléctricoen funciónde
la movilidadelectroforética(Pet construidascon proteinasde pl conocido.
la separaciónde proteínasse obtuvo medianteelectroforesiscapilar,
utilizando como etectrolito (A) tampón borato sádico 15 mM! ácido
fostiSrico, pH 7,1, a 300C y 25 kV; y -4,23+ l,06x; r -v 0.96. En (B) , el
electrolito fue tampónborato sádico25 mM, pH 9,0 a 300C y ¡7 kV: y”
-3,9 + 0,75x ; r 0,99. El capilar, de sílice fundida y 60 cm de longitud.
tiroglobulina (pI 4.5): 2 alcohol deshidrogenasa(pl 5,4);
3 —. anhidrasacarbónica(pI 5,9); 4 = aldolasa (en A) (pl = 6,6),
mioglobina (en B) (pl = 7,0); 5 = benzol (pl al del electrolito). Las
flechasindican la posiciónde la isoformaIV de arginasa(O ) en las rectas
de calibradoobtenidasa pH 7,1(A) y pH 9,0 (B).
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11.8
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molecuiardc 18.000Da.**
Determinadocomoácidocistéico.tL)eterni¡nadoespectrofotométricamentepor el métodode E3caven-J-{olidav.
enteromi~s próximo. asumiendoun peso
.1 .1. 9
Rectasde calibradoparala determinacióndel pesomolecularen función del
volumen de elución relativo, construidascon proteínasde Mr conocida. La
separaciónde proteínasse obtuvo medianteHPLU de exclusión molecular,
segúnlas condicionesde análisisdescritasen el apanado¡1.8 de Material y
Métodos. En (A), columna15K (35000PWXL; y = 6,49 - 8,65x; r” 0,98. En
(8), doscolumnasZorbax-diol GF450-GF250,conectadasen serie;y” 6,43 -
8,74x; r xx 0.98. 1 “tiroglobulina (Mr 660 kDa); 2 apoferritina(Mr = 440
kDa), 3 - B-aniilasa(Mr “ 200 kDa);4” albúminade huevo (Mr” 67 kDa); 5
= anhidrasacarbónica(Mr 29 kDa); 6 “ citocronio ~ (Mr “ 12,4 kDa). Las
flechasindican la posiciónde la isoforma IV (O) de arginasaen las rectasde
calibrado.
Figura 24.-
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121
¡ff2.- CARACTERISTICAS ESPECTROSCOPICASDE LAS ISOFORMAS 1, 111 Y IV
DE ARO INASA
En estebloquesepresentanlas Figuras25 a 29
122
lIl.2.l.— Espectros de absorción ultravioleta
Los espectrosde absorciónde las isoformas 1, III y IV de arginasaen el rango de
longitudesde onda del ultravioleta(190-340nm) semuestranen la Figura 25. En ellos sepuede
observarun máximocentradoa 215-278nm paralastres isoformas.Estemáximo de absorciónse
encuentraligeramentedesplazadohacia longitudes de onda inferiores al valor que posee el
maxímo en el espectro(le absorciondel lrp libre. Ello indica la existenciade iyr (ver ~lablas\.T
VII y Y), cuyaabsoicionmáximasc encuentraa 277 nm
Otro aspectoa destacaresJa existenciade una discretaabsorcióna partir de los 3 lO nm,
hechoque podríareflejaruna ciertatendenciaa la agregaciónde las proteínas.
11L2.2.- Espectrosde fluorescencia
1.~os espectrosde emisión de fluorescenciade las isoformas 1, III y IV de arginasa,
excitandoa diferenteslongitudesde ondasemuestranen las Figuras26, 27 y 28.
Uuandola longitud de onda de excitaciónes de 275 nm (Fig. 26), es decir, excitando
simultáneamente¡Vr y irp, los espectrosde emisiónde las tres isoformasde arginasapresentan
dosmáximos,uno centradoa 342-346nm y otro a 305 nm. Debedestacarsela emisióna 288-290
nm que presentala isoforma¡II de arginasa.
Uuandola muestraseexcitacon luz de longitud de onda de 295 nm (Fig. 27), esdecir,
analizandoexclusivamentela contribuciónde Trp. se detectaun máximo de emisión a 351 nm y
un hombroa416 nm en la isoforma1. Las isoformasIII y IV tambiénemitenfluorescenciaa351
nm, pero su máximo principal seencuentraa 331 nm; se puedetambiénobservarotro máximo
secundarioa 397-401mu.
Al analizarla contribuciónde la Phe al espectrode emisiónde fluorescencia,excitandoa
257 nm (hg. 28), seobservaquelas tres isoformasde arginasapresentanun máximo de emisión
en el entornode 345-350 nm. Las isoformas1 y IV poseenotro máximo secundariode emisión a
290-300 nm, perola isoforma111 no lo posee.
123
En la Figura 29 se recogeel espectrode emisión y excitación simultáneas(espectro
— — h, —síncronicoo smerosean’)de las isoformas1. III y IV. Las tres presentanun máximo de emisión
principal alrededorde los 3 55-356nm y un máximo de emisión secundarioen la zonade los 305-
307 nm, quela isoformaIII no posee.
24
Figura 25.— Espectros de absorción ultravioleta de: 42 jíg-mh1 de isoforma ¡ (A); 37
~Ág-mU’de isoforma III (u) y 25 ~ig-mh1 de isoforma IV (e) de arg~nasa,
disueltasen tampón Tris-HUí 10 mM. pH 9,1 (isoformas 1 y IV) o pH 6.5
<isotorniaIII).
fi fi ~.j.
275 -2 781’
1 1 1
190 215 240 265 290 3[5 340
275—278275-278
u
0,1;’ o
o 1. 0 5
0, 090
0 075
0, 060
0 045
0, 030
cf)a;
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2
o
O
O , (11 .5
ci)
>~ (nrn)
L26
Figura 26<- Espectrode emisión de fluorescenciade: 42 ~igmk1 de isoforma 1 <@); 37
gg.rnh1 de isoforma III (u) y 25 pg.ntL1 de isoforma IV (A) de arginasa,
disueltasen tampón Tris-HUí lO mM, pH 9,1 (isoformas 1 y IV) o pH 6,5
(isoformnaIII) Longitud de ondade excitación275 nm.
80
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440 415 390 365 340 315 290
>. (ini)
].28
Figura27- Espectrode emisión de fluorescenciade: 42 pgmh1 de
~g-mL1 de isoforma III (u) y 25 pg-mh1 de isoforma IV
disueltasen tampón Tris-HUí lO mM, pH 9,1 (isoformas
(isoformaIII) Longitud de ondade excitación295 nm.
isoforma 1 (@); 37
(A) de arginasa.
1 y IV) o pH 6,5
80
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A(¡ím )
130
Figura 28.- Espectrode emisión de fluorescenciade: 42 pg-mh1 de isoforma 1 (@); 37
pg-mh1 de isoforma III (u) y 25 ~ig-mL1 de isoforma IV (A) de arginasa,
disueltasen tampón Tris-HUí lO mM, pH 9,1 (isoformas ¡ y IV) o pH 6,5
(isot’ornia III). l.Jongitudde ondade excitación257nm.
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¿7A1 u
440 415 390 365 340
2. (nín)
132
Figura 29.— Espectrosde emisión y excitación simultáneos de fluorescencia de las
isoformas1(e), III (u) y IV (A) de arginasadisueltasen tampón Tris-HUí
10 mM. pH 9j (isoformas1 y IV) o pH 6,5 (isoformaIII).
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41<) 385 360 335 310 285 2. em (íim)
134
IILI- ANALISIS Y CUANTIFICACION DE ATRANORINA, ACIDO EVERNICO Y
ÁCIDO USNICO
En estebloquese presentanlas Figuras30 a 36 y las
TablasXl y XII
2.35
111.3±-Espectrosde absorción ultravioleta
Los espectrosde absorciónde los fenolesatranoririay ácidosevérnico y úsnico, en el
rangode longitudesde ondadel ultravioleta(210-350nm), serecogenen las Figuras30 A-U.
En todos ellosseobservaun máximoalrededorde 270-280nm, que se correspondecon el
máximo de absorciónde los compuestosaromáticos.La atranorina(Fig. 30 A) presentaun
máximo a los 280 nm; el ácido evérnico(Eig 30 13) absorbea los 210 nm, mientrasque el ácido
úsnico (Fig. 30 U) presentael máximoa 280 nm.
A la vista de estosresultadosse eligieron las longitudesde ondade máximaabsorciónde
cadafenol en los análisisde HPLU.
HiL3.2.- Estabilidad en disolucionestaniponadas
La estabilidadde unadisolución de atranorina(0,5 mg-mí-1) en tampónTris-HUí 0,1 M,
pH 9,1 y pH 6,5. semuestraen las Figuras31 A y B, respectivamente.La atranorina,a la citada
concentración,tardaen disolversepor completo48 ti, independientementedel pH. Entre las 48 ti
y las 120 h, la cantidadde atranorinaque sedetectaes la misma, lo cual indica que no se está
degradandoo convirtiendoen otrosproductos.
La estabilidadde unadisolución de ácido evérnico(0,2 mg-mV1) en tampónTris-HUí 0,1
M, pH 9, y 6.5, semuestraen las Figuras32 Ay 13, respectivamente.
Cuandoel pH de la disolución es9,1 (Fig. 32 A), la cantidadde ácidoevérnico,registrada
como cuentasde área,descienderápidamentedurantelas 24 primerashorashastaalcanzarun
tercio de la cantidadinicial. A estetiempo sedetectanácidosorselínico y evernínico,productos
de degradacióndel ácidoevernico. La cantidadde ácidoorselínicodesciendea partir de las 72 ti,
momentoen el cual seempiezaa detectarorcinol, productode degradacióndel ácidoorselinico.
El ácidoevernínicono se degrada,al menoshastalas 120 h de análisis.
Uuandola disolución se hacea pH 6,5 (Fig. 32 13), la estabilidaddel ácido evérnicoes
mayor. Los ácidosorselinico y evernínicotambiénse detectana partir de las 6 primerashoras
136
pero en menorcantidadquea pH 9, 1. El ácidoevórnico sedegradaa partir de las 24 h, pero no
apareceorcinol en cantidaddetectable,al menosdurantelas ¡20 h de análisis.
En las Figuras 33 A y E se muestrala estabilidaddel ácido úsnieo (0,3 mg-mí-1) en
disolucionestamponadascon Tris-HUí 0,1 M a pH 9,1 (Fig. 33 A) y pH 6,5 (Fig. 33 B). La
máximasolubilidad del ácido úsnicose alcanzaa tiemposmayores(48 h) a pH 6,5 que a pH 9,1
(24 h). A partir de entonces,el ácido úsnico no parece degradarsey es estable, como lo
demuestrael hechode no observarni aparición deproductosde degradaciónni variaciónen su
cantidad.
111.33.-Seuaracióny cuantificaciónmedianteHPLC
Los fenolesextraidosdel córtex,del talo y del medio de incubación,segúnlo descritoen
el apartado11.10. 1 de Material y Métodos,procedentesde talosincubadosen L-arginina40 mM
durantediferentestiemposen oscuridad,fueron analizadospor HPLU. La separaciónse realizóen
fasereversa,empleandounacolumnaNucleosil 5C8, en las condicionesde análisisdescritasen el
apartado11.10.4.
Las Figuras34 A-U muestrancromatogramassignificativos. El análisisdura6 mm, ya que
a estetiempo ha eluido el ácidoúsnico(cuandoestápresente),último fenol en aparecerdebido a
la menor polaridad que presentaen comparacióncon la atranorinay los ácidos orselínico,
everninicoy evérnico, La proporciónde cada pico varía en relación a la procedenciade la
muestra.
La cuantificaciónde la atranorinay los ácidos evérnico y tisnico se realizó mediante
interpolaciónde los valoresde cuentasde áreaobtenidosen una rectade calibradoconstruidacon
concentracionescrecientesde cadapatrón. Se eligió el rangode linearidaddel detectoren todos
los casos.Las rectasde calibradoque representancuentasde áreaen función de la concentración
fueron ajustadaspor minimos cuadradosy utilizadasen la cuantificaciónde los fenoles. Estas
rectasde calibrado semuestranen la TablaXI.
137
111.3.4.-Valoración del contenido de fenolesen muestras de córtex. talo y medio de
incubación
Con objeto de relacionarel contenidode fenolesy la máximaactividadde cadaisoforma
de arginasa,se estudió la variación temporalde atranorinay ácidosevérnico y úsnico en función
de las condicionesde incubación. El análisis se realizó a tres niveles: valorandolos fenoles
presentesen el córtex, en el talo (una vezeliminadoslos corticales)y los disueltosen los medios
de incubación,segúnlo descritoen los apartados11.10.1.1y 111012.
En la Figura35 se muestranlos resultadosde la variación temporalde fenolesen muestras
de talo incubadasen L-arginina 40 mM tamponadascon Tris-HUí 0,1 M, pH 9,1. El ácido
evérnico y la atranorinarepresentanel 70% y el 30%, respectivamente,de los fenoles totales
extraídosdel córtexen ausenciade cualquiertratamiento.La cantidadde ácidoúsnico aumenta
progresivamentedesdeel comienzode la incubación,mientrasque el contenidode ácidoevérnico
disminuyeen la misma medidaen el córtex(Fig. 35 A-U).
En el talo (Figs. 35 D-F), la atranorinaes,sin embargo,el fenol queseencuentraen mayor
cantidad;el ácido evérnicoapareceen trazasy de ácido úsnicosedetectanvaloresalrededorde
2,5 mg-g-1 de talo seco.
En el medio (Figs. 35 0-1) sedisuelveprincipalmenteel ácido evérnico, cuyo contenido
alcanzaaproximadamentelos 12,5 mg-g1 de talo seco entre las 4 ti y 8 h de incubación.La
atranorina sólo se deteeta a tiempos cortos y el contenido en ácido úsnico aumenta
progresivamentedesdelas lO h de incubaciónde los talos.
Cuando éstos son incubadosen disoluciones de cicloheximida 40 uM, en medios
tamponadoscon Tris-HUí 0,1 M, pH 9,1, el patrón de distribución de los fenoles, en los
diferentes extractos, es muy distinto al obtenido cuando hay L-arginina en el medio. Los
resultadospuedenobservarseen las Figuras36 A-I.
En el córtex (Figs. 36 A-U) se puedendetectarcantidadesapreciablesde atranorinay
ácidoúsnicoqueoscilanentre8 y 30 mg-g 1 de talo seco. El contenidode ácido evérnicoesalgo
138
mayor,alrededorde 40 mg-g’ de talo seco,exceptoa las 2 ti de incubación,cuandose detectan
unos 140 mg-g1 de talo seco.
La cantidadde fenoles(atranorinay ácido úsnico) detectadaen talo (Figs. 36 E y F) en
muestrasincubadasen presenciadel inhibidor de la traducciónes semejantea la de aquellas
incubadasen L-arginina. El contenidode ácido evérnicoen el talo (Hg. 36 D) es, sin embargo,
mayory puedenapreciarsedosmáximosa4 y 10 h deincubación.
Atranorinay ácidosevémicoy úsnico se solubilizanen menorcantidaden el medio (Figs.
36 G-I) que en el casoanterior (Figs. 35 G-I) como puedeapreciarsepor la diferenciade escala
gráfica.
El ácido úsnico es el fenol detectadoen mayor cantidaden el medio de incubación. Su
contenidooscilaentre0,1 y 0,3 mg-g-1 de talo seco.
111.35.-Valoración del contenido de fenolessolublesen el extracto libre de células
La solubilidad de los fenoles en disolucionesacuosases muy baja aunque,como se ha
señalado,variaen fUnción del pH (Figs. 31,32y 33). Uomo unaprimeraaproximación,se caleuló
la cantidadde atranorina,ácidoevérnicoy ácidoúsnicoque se solubiliza en los extractoslibres de
célulasprocedentesde muestrasde talo a los tiemposen que se detectala máximaactividadde
cadaisoformade arginasa.Estosson:
i) Máxima actividadde la isoforma1 de arginasa:talo incubado6 h en L-arginina
40 mM tamponadacon Tris-HUí 0,1 M, pH 9,1.
u) Máxima actividad de la isoforma III de arginasa: talo incubado 16 ti en
cicloheximida40 pM tamponadacon Tris-HUí 0,1 M, pH 9,1.
iii) Máxima actividad de la isoforma IV de arginasa: medio de incubación
procedentede talos incubados8 h en L-arginina 40 mM tamponadacon
Tris-HUí 0,1 M, pH 9,1.
La cantidadde cadafenol detectadaen estascondicionespuede serun indicativo de la
concentraciónaccesiblea la proteínay, en principio, aquellacapaz de ejercerun determinado
139
efectofisiológico. La extracciónse realizó segúnlo descritoen el apartado11.10.1.3.de Material
y Métodos. Los resultadosobtenidosse muestranen la Tabla XII. En las condicionesde máxima
actividadde la isoforma1 de arginasa(i) sedetectan0,19 nmol de atranorina,0,75 nmol de ácido
evérnicoy 1,0 nmol de ácidoúsnico.Estascantidadesson mayoresen las condicionesde máxima
actividad de la isoformaIII de arginasa(u), ya que se detectan1,1 nmol de atranorina,2,3 nmol
de ácido evérnico y 2,7 nmol de ácido úsnico. En las condicionesde máxima actividad de la
isoformaIV de arginasa(iii), el extractolibre de célulascontiene5,4 nmol de atranorina,3,7 amol
de ácidoevéinico y 4,0 nmol de ácidoúsnico. Todos los valoresvienenexpresadospor g de peso
de talo seco.
Fin estepunto convienepuntualizarque los fenoles liquénicos están localizadosen tres
posicionesespecificas:
a) Fenoles corticales, exocelulares,cristalizadossobre las hifas que forman el
córtex, en donde actúana modo de pantallapara filtrar densidadesde flujo fotónico no lesivas
paralas algas.
b) Fenolesintratalinosque, a su vez, puedenestarcristalizadossobrelas paredes
celulares,tanto del fotobionte como del micobionte, o puedenestar localizadosen el interior
celular, solubilizados en el citosol, tanto de las algas como del hongo. Sólo en esta última
localizaciónpodrátenerefectofisiológico sobrelas enzimascitosólicas.
La estimaciónde la concentraciónde fenoles en los extractoslibres de célulaspuededar
una ideaaproximadade la concentraciónde fenolesintracelulares,aunqueno exacta,dado que
partede los fenolesparietalespuedendisolverseduranteel procesode preparación.Porello, se ha
estimado la concentraciónde fenolescorticales(apartado11.10.1 de Material y Métodos) y
fenoles intracelularespor comparacióna la encontradaen los extractoslibres de células. La
concentraciónde fenoles en córtex resultó ser aproximadamente47 veces superior, y la de
medulares1,9 vecesinferior a la del extractolibre de células.Por ello, para estimarla acción de
los diferentesefectoressobrela hipotéticacooperatividadde unaisoformacon el sustrato,se han
utilizado concentracionesde fenol aproximadamentemitad de las encontradasen los extractos
140
libres de células paralas isoformas1 y III talmas,y prácticamenteigual a la encontradaen los
mediosde cultivo parala isoformaIV, segregable,segúnseespecificaenlas Tablas 1 y XII.
141
Figura 30.- Espectrosde absorciónultravioleta de atranorina(A), ácido evérnico (8) y
ácido usnico (U) preparados en agua-HPLC:ácido acético (99: l,v/v)
¡acetonitrilo (30/70,v/v). La concentraciónempleadafue de 0,1 mg-mL1.
DO. densidadóptica.
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0, 5
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2. (orn)
1.43
Estabilidadde unadisolución de atranorina(0,5mg-mV1) en tampónTris-RU!
0,1 M a pH 9,1 (A) y pH 6,5 (13) en fUnción del tiempo en oscuridad. La
cuantificaciónde atranorinase llevó a cabo medianteHPLC utilizando una
columna de fase reversa Nucleosil 5U8 en las condiciones de análisis
especificadasen el apanado11.10.4 de Materialy Métodos.
Figura3! -
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1 , (1
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145
Figura 32< Estabilidad de una disolución de ácidoevérnico(0,2 nig.nih1) (•) en tampón
Tris-RU! 01 M a pH 9,1 (A) y pH 6,5 (B) en función del tiempo en
oscuridad.La cuantificaciónde atranorinase llevó a cabo medianteHPLU
utilizandounacolumnade fasereversaNucleosilSUS en las condicionesde
análisisespecificadasen el apartado11.10.4 de Material y Métodos. (O),
ácidoevernínico;( ), ácidoorselinico,(±),orcinol.
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147
Figura 33<- Estabilidadde una disoluciónde ácido úsnico(0,3 mg-mí-1)en tampónTris-
HUí 0,1 M a pH 9,1(A) y pH 6,5 (B) en función del tiempo en oscuridad.La
cuantificaciónde ácidoúsnico se llevó a cabomedianteITIPLU utilizandouna
columna de fase reversa Nucleosil SUS en las condiciones de análisis
especificadasen el apartado11.10.4de Materialy Métodos.
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149
Figura 34.- Uromatogramasrepresentativosde los fenolesde LI prz¡na~tri obtenido a
partir de diferentesmuestras,según lo descrito en el apartado 11.10.1 de
Material y Métodos. En (A) , córtexobtenido de talos incubados¡6 E en 1..—
arginina 40 mM; en (13), talo incubado2 E en L-arginina 40 mM; en (U),
medio obtenidode talosincubados6 E en L-arginina 4OmM. La separaciónse
realizó en HPLU utilizando una columnaNucleosil 5U8 de fase reversaen las
condicionesde análisisdescritasen el apanado11.10.4 de Materialy Métodos.
1, ácido orselinico; 2, ácido everninico;3, ácido evérnico; 4, atranorina,5,
ácidoúsnico. i “inyección.
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3
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151
Tabla NL- Ecuacionesde las rectasde calibrado, ajustadaspor mínimos cuadrados,empleadasen la cuantificaciónde atranorina,ácidoevémicoy ácidoúsnicoseparadosmedianteHPLU en una columna Nucleosil SUS de fase reversaen las condicionesdescritasen el apartado11.10.4. de Materialy Métodos.
Fenol Ecuaciónde la rectade calibraciónindirecta*
Atranorina(con ácidoevérnico0,01 mg-mb1 y - 0,039+ 0,55 x; r = 0,99
como patrónexterno)
Acido evérnico(con atranoñna0,02 mg-mH y = - 0,196+ 3,66 x; r = 0,98
como patrónexterno)
Acido úsnico(con ácidoevérnico0,01 mgmh’ y = - 0,377+ 2,34 x; r = 0,97
como patrónexterno)
(?alibraciónreteridaal patrónexterno
152
Figura35< Variación de la cantidadde ácidoevémico(e), atranorina(A) y ácidoúsnico
(u) en función del tiempo de incubaciónde talos de E. prunas-iri, en tampón
Iris-HUí 0,! M, pH 9,1, conteniendoL-arginina 40 mM. En (A,B y U),
fenolesdel córtex; en (D,E y F), fenoles de talo una vez extraídoslos del
eórtexy en (G,H e 1), fenolesen el medio de incubación.
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¡1 cm ~io (fi)
154
Figura 36< Variación de la cantidadde ácidoevérnico(e), atranorina(A) y ácidoúsnico
(a) en función del tiempo de incubaciónde talos de E. primas-/rl, en tampón
Tris-HUí 0,1 M, pH 9,1, conteniendocicloheximida40 gM. En (A,B y U).
fenolesdel córtex; en (D,E y F), fenolesde talo una vez extraídoslos del
córtexy en ((31-1 e 1), fenolesen el medio de incubación.
(5<)
1. 2 (.3
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ci.) , 1
1)
0 4 8 12 16 0 4 8 12 16
tiempo (fi)
156
Tabla XIL- Cantidadde fenolesendógenosdetectadaen los extractoslibres de células(medio de incubación) de talos de fil prunastrí incubados en lascondicionesde máximaactividadde cadaisoformade arginasa.
Isoformadearginasa
Condicionesde máximaactividad*
Fenol(nmol-w1 pesoseco)
atranorina ácidoevérnico acidoúsnico
6k
en L—arginina 40 mM
019+0020 075+0008 100+0030
Hl 16ken cicloheximida40 uM 110 + 0015 226 + 0007 272 + 0020
IV Shen L-arginina4omM 537±0012 367 + 0008 405 + 0030
* Detallesenapartado11101.3 de Materialy Métodos
157
HL4.- EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD
I)E REACCION DE LAS ISOFORMAS DE ARGINASA EN AtJSENCIA Y
PRESENCIA DE EFECTORES
En estebloquese presentanlas Figuras37 a 44 y la
TablaXIII
158
La caracterizacióncinética de una enzimaincluye habitualmentela determinaciónde su
velocidadmáxima (vmax) de reaccióny de su constantede Michaelis-Menten(Km) para cada
sustrato.Estos datos resultanmuy útiles a la hora de comparardiferentesisoformas, Por otro
lado, la presenciade uno o varios efectorespuedemodificar la cinéticade la enzima,pudiéndose
comportaréstos como activadoreso inhibidores. Los cambios producidospor el efector se
puedenobservara nivel de vmax y Km, encontrándosediferente tipo de acción sobre cada
soforma
Ya que existen variaciones del contenido de fenoles en las condiciones de máxima
actividad de cada isoforma particular, se trató de ligar estos dos hechos estudiando el
comportamientocinéticode cadaisoformaen presenciay/o ausenciade efector.
ILLtL- Sobre la isoforma ide arginasa
La estimaciónde velocidad de reacción de la isoforma 1 frente a concentraciones
crecientesde sustrato(L-arginina) serealizó segúnlo descritoen los apartados11.11. y 1112. En
la Figura37 semuestranLos resultadosobtenidos.
La variación de la velocidadde reacciónen función de la concentraciónde sustratose
puedeasimilara una hipérbola,lo cual demuestraque la isoforma1 es una enzima micaeliana,A
partir de concentracionesde L-arginina superioresa6 mM sepuedeapreciaruna Ligera inhibición
por excesode sustrato.El valorde Km. estimado a partir de estarepresentacióndirecta,es de 1,5
mM y el de vmaxde 2~49 pmolesde anlonio-miv1.
La representacióndirectade los datos, concentraciónde sustratofrente a velocidad de
reacción, es el mejor sistema para calcular Km y vmax, ya que no es necesario hacer
transformacionesdc los resultadosexperimentalesque distorsionanlos posibleserrorescometidos
en las medidas.Una variaciónde la representacióndirectade Michaelis-Mentenesla sugeridapor
Eisenthal-Uornish-Bowden,dondeKm y vmax vienen definidascomo la media de las diferentes
interseccionesobtenidasal representarlas rectasformadaspor los pares(yo, [si:>.La manerade
representarlos datos es la siguiente:cadavalor de velocidad se dibuja en el eje de ordenadas
159
(vmax) y los correspondientesvaloresnegativosde sustrato(-[S]) sedibujan en el eje de abcisas
(Km). Los dos puntosse unenextrapolandola línea en el espaciovmax e Km. En la Figura 38 se
muestraestarepresentación,obtenidaa partir de los resultadosde velocidad de reacciónde la
isoforma 1 de arginasa.Los valoresde Km y vmax que se obtienenson4,9 mM y 5,25 MmoIes de
amonio- mirr respectivamente.
La representaciónde dobles recíprocasde Lineweaver-I3urk es la más utilizada; sin
embargo,produceimportantesdesviacionesde los valoresde Km y Vmax, ya que los posibles
errorescometidosen las medidasafectanen mayor grado a las doblesinversasde velocidady
concentraciónde sustrato.
La tercerarepresentaciónelegida parael cálculo de los valoresde Km y vmax fUe la de
Hanes,una transformaciónde los datosdirectosen la que se eligen los pares[S]-v<y1/[SJ.Los
resultadosobtenidosse muestranen la Figura 39. El valor de Km obtenido fUe de 1,25 mM y el
de vrnax de 2,79 pmolesde amonio-mirA.
El efectode la atranorinay los ácidosevérnicoy úsnico sobrela velocidadde reacciónde
la isoforma ¡ de arginasasemuestranen las Figuras37 A-U (representacióndirecta)y 39 A-U
(representaciónde Hanes).La concentraciónfija de cadaefector, utilizada en este estudio,es la
que sedetallaen la Tabla [de Materialy Métodos(apartado11.12).
La atranorina 33,3 nM (Figs. 37 A y 39 A) se comporta como un activador no
competitivo.Los valoresde Km y vmax de la isoforma1 varian en presenciadel efector y, según
la representaciónde Hanes(Fig. 39 A), los valores estimados son: Km(ap) 1,1 mM y
vmax(ap) 6,64 utmolesde amonio-rniiv1.
El ácidoevérnico 130,0 nM (Figs. 37 B y 39 13) produceuna pequeñaactivacióny podría
tratarsede un activadormixto. El valor de Km(ap) de la isoforma 1 en presenciadel efectores
0,68 mM segúnla representaciónde Hanes(Fig. 39 B); el valor de vntax(ap)que se obtienees de
2,75 pmoles de amonio-mirA.
A diferenciade la aciranorinay el ácidoevérnico,el ácidoúsnico ¡73,3 nM (Figs. 37 U y
39 U) se comportacomo un inhibidor competitivo de la isoforma1 de arginasa.Los valoresde
160
Km(ap) y vmax(ap)en presenciadel efectorobtenidosapartir de la representaciónde Hanes(Fig.
39 U> son de 3,4 mM y 3,32 umolesde amonio-mint,respectivamente.
111.4.2.-Sobrela isoforma111 de ar2inasa
La estimaciónde la velocidad de reacciónde la isoformaHl frente a concentraciones
crecientesde sustrato(L-arginina) serealizó segúnlo descritoen los apanados11.11. y 11.12 En
la Figura 40 semuestranlos resultadosobtenidos.
La variación de la velocidad de reacciónen fUnción de la concentraciónde sustrato
muestrauna cinética sigmoidal, caracteristicade enzimasalostéricas.A concentracionesde L—
arginina superioresa 7 mM seapreciauna ligera inhibición por excesode sustrato.El valor de
So,S (zy Km), estimadoa partir de estarepresentacióndirecta,es de 4,5 mM y el de vmax de 2,12
jimoles de amonio-mm-1
La representaciónde Hill (Fig41) enfrentando log(~v~) log [s], normalmente
utilizada en los análisis de cinéticasde tipo alostérico,da valoresde pendientede las rectas
ajustadaspor mínimoscuadradossuperioresa uno. Uomo sediscutiráampliamente,estaseriaJa
primerapruebasobreexistenciade cooperatividadpositivaenel ligamientodel sustrato.
EL efectode la atranorinay [osácidosevérnicoy úsnico sobrela velocidadde reacciónde
la isoforma111 de arginasasemuestranen las Figuras40 A-U (representacióndirecta)y 41 A-U
(representaciónde Hill). La concentraciónfija de cadaefector, utilizadaen esteestudio,es la que
se detallaen la ‘-labIa 1 de Material y Métodos(apartado11.12). Los tres fenoles:atranorina190
nM, ácidoevérnico390,0 nM y ácidoúsnico 470 nM, se comportancomo inhibidores,ya que la
velocidadde reacciónde La isoforma 111 de arginasadisminuyeen su presencia.Los valoresde
S0 5(ap) son: 4) mM en presenciade atranorina;4,4 mM en presenciade ácidoevémicoy 4,5
mM en presenciade ácido úsnico(TablaXIII).
161
111.4.1— Sobre1» isoformaIV de ar2inasa
La estimaciónde la velocidad de reacciónde la isoforma IV frente a concentraciones
crecientesde sustrato(L.arginina)serealizó segúnlo descritoen los apartadosliii. y 11.12. Fn
la Figura42 semuestranlos resultadosobtenidos.
La variación de la velocidadde reacciónen fUnción de la concentraciónde sustratose
puedeasimilar a una hipérbola, lo cual demuestraque la isoforma Iii es una enzima micaeliana.
En estecaso,a diferenciade los anteriores(Figs. 37 y 40), no seapreciainhibición por excesode
sustratoen cl rango de concentracionesensayadas.El valor de K1~, estimado a partir de esta
representacióndirecta,es de 4,45 mM y el de vmaxde 3,0 imolesde amonio-mirr
En la Figura 43 se muestrala representaciónde Eisenthal-Uornish-Bowdenobtenidaa
partir de los resultadosde velocidadde reacción.Los valoresde Km y Vmax que se obtienenson
4,0 mM y 4,7 íimoles de amonio-muy1,respectivamente.Los valoresde Km y vmax obtenidos
mediantela representaciónde Hanes(Fig. 44) frieron: Km = 3,0 mM y vmax = 4,2 ~imolesde
amonio-muy
El efectode la atranorinay los ácidosevérnicoy úsnicosobrela velocidadde reacciónde
la isoforma IV de arginasasemuestranen las Figuras42 A-U (representacióndirecta)y 44 A-U
(representaciónde Banes). La concentraciónfija de cadaefector,utilizada en esteestudio,es la
que sedetallaen la Tabla1 de Materialy Métodos(apartado11.12).
La atranorina1,69 mM secomportacomo un activadormixto (Figs 42 A y 44 A). Los
valoresde Km y vmax de la isoformaIV varíanen presenciadel efector y, segúnla representación
de Hanes(Fig. 44 A). los valoresestimadosson Km(ap> = 0,96 mM y vmax(ap)= 3,95 timoles de
amonio-muy
El ácidoevérnico LIS mM (Figs. 4213y 4413) y el ácidoúsnico 1,27 mM (Figs. 42 U y
44 U) se comportancomo inhibidoresno competitivosde la isoformaIV. Los valoresde Km(ap)
que seobtienena partir de la representaciónde Hanes(Figs. 4413y C) son 3,16 xnN4 y 3,05 mM,
respectivamente.Los valoresde vmadap)de la misma representaciónson 3,69 y 3,39 gmoiesde
amonio-miw , respectivamente.
162
En la Tabla XIII seespecificanlos valoresde Km y vmaxen ausenciay presenciade cada
efector.obtenidasde cadauna de las distintasrepresentacionesgráficas.
1.63
Efecto de la concentraciónde L-arginina(O) sobreJa velocidadde reacciónde
la isoforma 1 de arginasaa una concentraciónde 13 gg-mV1. En (A). en
presenciade atranorina33,3 nM (e); en (13), en presenciade ácido evérnico
130,0nM (@)y en (U), en presenciade ácidoúsnico 173,3 nM (e).
Figura 37.-
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2 4- 6 8
165
Figura 38.- Representaciónde Eisenthal-Uornish-Bowdenparala determinaciónde Km Y
vmax de la isoforma1 de arginasa.
yUd X
*
y[U¿IX
(y )Ci)
*k
U’(1 0 1< m
167
Representaciónde Hanessobrela variación de la velocidadde reacciónde la
isoforma1 de arginasa(13 ~g-.mh1)(O) en función de la concentraciónde L-
arginina, y = 0,45 + 0,36x; r = 0,97. En (A), en presenciade atranorina33,3
nM (@>, y 0,17 +0,15x; r = 0,99; en (B), en presenciade ácido evérnico
130,0 nM (e), y = 0,25 = 0,36x; r = 0,99; y en (U), en presenciade ácido
Osnico 73,3 nM (@),y 1,02 = 0,30x; r 0,96.
Figura 39<
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169
Figura 40< Efecto de la concentraciónde L-arginina(O) sobrela velocidadde reacciónde
la isoforma [II de arginasaa una concentraciónde 93 ~igmL1. En (A), en
presenciade atranorina190 nM (e); en (13), en presenciade ácido evérnico
390,0nM (@) y en (U), en presenciade ácidoúsnico470,0nM (@).
4 6
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~, 2
ci) 1
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ci), 5
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L—arqtni na (m M>
171
Figura 41- Representaciónde Hill sobrela variación de la velocidad de reacciónde la
isoformaIII de arginasa(93 pg-m11) (O) en fUnción de la concentraciónde
L-arginina. En (A), en presenciade atranorina 190 nM (e); en (B), en
presenciade ácido evérnico 390,0 nm (•) y en (U), en presenciadc ácido
úsnico470 nrn (@).
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1 oc; L— dr ~3 ni na (mM
173
Figura42< Efectode la concentraciónde L-arginina(O) sobrela velocidadde reacciónde
la isoforma IV de arginasaa una concentraciónde 6 pg-mh1. En (A), en
presenciade atranorina1,69 mM (@); en (B), en presenciade ácido evérnico
1,15 mM (@)y en (U), en presenciade ácido úsnico 1,27 mM(S).
A
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175
Figura 43< Representaciónde Eisentbal-Uornish-Bowdenparala determinaciónde Km Y
Vinax de la isoformaIV de arginasa.
yHl dX
YIII ¿1 X
(y )o it
1< 1k
m ji)
177
Representaciónde Hanessobrela variaciónde la velocidadde reacciónde la
isoforma IV de arginasa(6 ~g-mh1)(O) en función de la concentracióndc L-
arginina, y 0,72 + 0,24x; r 0,98. En (A), en presenciade atranorina1,69
mM (@), y 0,24 ±0,25x; r = 0,99; en (B), en presenciade ácido evérnico
1,15 mM (@), y 0,86 + 0,27x; r 0,99; y en (U), en presenciade ácido
úsnico 1,27 mM (e), y = 0,90±0,29x; r = 0,98.
Figura 44<
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**
180
¡JIS- EVALUACION DE LA COOPERATIVIDAD. ECUACION DE HILL
En estebloquesepresentala TablaXIV
181
En algunasenzimas,la presenciade efectoresmodifica el patrónde unión al sustrato,bien
facilitándola (cooperatividadpositiva), bien dificultando dicha unión (cooperatividadnegativa)-
Con objeto de evaluarestaposiblecooperatividadseeligió la representaciónde Hill. En la Tabla
XIV se muestranlas ecuacionesde las rectas,ajustadaspor mínimos cuadrados,resultantesde la
representacionde los resultadoslog~ VO) frente a log [L-arginina]de las tres isoformas,1,
III y IV, de arginasa,en ausenciay presenciade los tres efectores(atranorinay ácidosevérnicoy
úsnico).
Como puedeobservarse,el valor de ItA, pendientede la recta, es menor de 1,5 en las
rectascorrespondientesa las isoformas1 y IV. Estapendienteadquiereun valorde 4,4 en la recta
correspondientea la isoformade arginasa111.
Las pendientesde las rectasque correspondena la isoforma1 en presenciade efectoresno
se modifica sustancialmenterespectoa aquellaobtenidaen su ausencia.Las pendientesde las
rectasque correspondena la isoforma III son 3,75 en presenciade ácido evérnico; 5,15 en
presenciade atranorinay 5,74 en presenciade ácidoúsnico.
Las pendientesde las rectascorrespondientesa la isoforma IV no varianen presenciade
ácidoevérniconi de ácidoúsnico(1,25 y 1,20, respectivamente),pero en presenciade atranorina
adquiereun valor de 1,94. Estosvaloreshande compararsecon la pendienteobtenidaen ausencia
de efector,igual a l,24.
iSla
‘labia XIXk- Ecuacionesde las rectas, ajustadaspor mínimos cuadrados,obtenidasmediantela representaciónde Hill, parala evaluaciónde la cooperatividadde las isoformas 1, III y IV de arginasaen presenciay/o ausenciadeeféctores.
1 soforí na
Ecuaciónde la recta
dearginasa
Sin efectoi Uon efector
- 0,358 Y 0,42*x
Atranorina(pM) Acido evérnico(pM) Acido úsnico(pM)
y - 0,45 + l,55x y -0,33+ l,65x y -0,49±0,93xr=0.98 r=0,98 r0,97 mO,98
111 y>’ -2.67± 4,40x y = -3,41 + 5,15x y = - 1,88±3,75x y -3,34+ 5,74xr=0,96 r=0,99 r=C,97 r=0,95
[V y~’—O,68± 1,24x yz~-O,79±],94x y-O,55+ l,25x y=-O,52+ l,20xr=099 r=0,98 r=0,97 r=0,97
* EL valor de la pendiente.ti (constantede Hill). da una ideadel grado de coeper-atixidad.Para valores
dcli — 1. no hay cooperatividad.(Fersht,1985)
182
11L6.— LIGAMIENTO DE ATRANORINA, ÁCIDO EVERrNICO Y ÁCIDO USNICO A
LAS ISOFORMAS 1, III Y IV DE ARGINASA
En estebloquesepresentanlas Figuras 45 a 62 Y la
TablaXV
183
La unión de una moléculade efectora una proteínaes el primer pasode su regulación.
Con objeto de analizaresteposiblefenómeno,serealizaronestudiosde ligamiento medianteel
métodotradicionalde equilibrio de diálisis, descritoen el apanado11. 14 de Material y Métodos.
Parala elaboraciónde los resultadosseeligieron diferentesrepresentacionesgráficas.
IIL&L- Lisamiento a la isoforma 1
Parapoderdeterminarla unión efector-proteinaesindispensableconocer,en primerlugar,
el tiempo necesariopara que el ligando libre se encuentreen equilibrio. En la Tabla XV se
recogenestosresultados.El tiempo requeridoparadetectaratranorinalibre en equilibrio entrelas
dossubcámarasde diálisis esde 6 h, el del ácido evérnicode 4,5 Fi y el del ácido úsnicode 14 b.
Los tiempos de equilibrio no varian en función de la isoforma de arginasa,siendoel mismo en
todos los casos.
111.61.1.-Atranorina como ligando
La cinética de saturación del ligamiento (ligando unido frente a ligando total) de
atranonnasemuestraen la Figura 45 A. La saturaciónde los sitios de la isoforma1 seobtiene a
partir de los 0,1 jimoles de atranorinatotal. En la Figura 45 B se muestrala representaciónde
dobles inversas( r’ frente a [L]1) de los resultadosdel ligamiento de atranorina.Los puntos
obtenidosse puedenajustara una curvaexponencial.La inversadel punto de cortecon el eje de
ordenadas,igual a 4,0, proporcionael número aproximadode sitos de unión que posee la
proteínaparael efector. Por tanto, el númerode sitios de unión paraatranorinaen la isoforma1
de arginasaescuatropormoléculade proteína.
La representaciónde Scatchard(r/[L] frentea r) del ligamientode atranorinase muestra
en la Figura 46 A. Los puntos obtenidosno puedenasimilarsea una recta, hecho que sera
explicadoposteriormente,sino que seajustanaunaparábola.
184
La representaciónsemilogaritmica(r frentea log [efector]) permiteobtenerun espaciado
uniforme de los resultados,lo que facilita la valoración del número de sitios de unión por
moléculade proteína,hechoque, en otrotipo de representaciones.puedequedarenmascarado.La
representaciónsemilogaritmicadel ligamiento de atranorinaa la isoforma 1 se muestraen la
Figura46 8. El númerode sitios de unión pormoléculade proteína,estimadopor intersecciónen
el ejede ordenadasdel nivel de saturación,es de — 4 0
IH.ÓAZ- Acido evérnicocomoligando
La cinética de saturacióndel ligamientode ácidoevérnicoa la isoforma1 se muestraen la
Figura 47 A Uomo puedeobservarse,dichasaturaciónseproducea partir de 0,05 timoles de
ácidoevérnicototal, En la Figura47 13 semuestrala representaciónde doblesinversas,El número
de sitios de unión por moléculade proteina,estimadoen estacurva exponencial,esde — 4 0 La
representaciónde Scatchardse muestraen la Figura 48 A. Uomo puedeobservarse,existe
igualmenteun alejamientode la linearidaden los puntos. La representaciónsemilogarítmicadel
ligamiento del ácidoevérnicoa la isoforma1 se muestraen la Figura48 B. El númerode sitios de
unión por moléculade proteinaseestimóentre4 y 5.
111.613.-Acido úsnicocomo ligando
La cinética de saturacióndel ligamiento de ácido úsnicoa la isoforma 1 de arginasase
muestraen la Figura 49 A. La saturaciónse producea partir dc 0,05 límoles de ácidoúsnico
total. En la Figura49 B se muestrala representaciónde doblesinversas.Lacurvaexponencialque
seobtieneal ajustarlos puntosproporcionaun valor estimadode 10 sitios de unión por molécula
de proteína.En la representaciónde Scatchard(Fig. 50 A), los puntosseajustancasi a unarectay
no a una parábola,como ocurre con el ligamientode atranorinay ácido evérnico. El punto de
cortecon el eje de abcisasda un númerode sitios de unión parael ácidoúsnicopor moléculade
isoforma1 — 10,0. Estevalor tambiénconcuerdacon el obtenidoa partir de la representación
185
semilogaritmica(Fig. 50 13). También debe resaltarseen este punto que el ácido úsnico es
inhibidor competitivo de la isoforma 1 de arginasa,es decir compite con la L-arginina por el
centroactivo de la proteina<TablaXIII).
lI1.62.- Ligamiento a la isoforma III
1W62,I- Atranorina como ligando
La Figura 5 1 A muestrala cinéticade saturacióndel ligamiento de atranorinaa la isoforma
111 de arginasa.Los sitios de unión en la proteínasesaturana partir de 0,07 pmolesde atranorina
total. Sin embargo,paravaloressuperioresde ligando total, puedeverseuna disminuciónde la
cantidad de atranorina unida. Este fenómeno también se observa en la representación
semilogarítmica(Fig. 52 B). En la representaciónde dobles inversas(Fig 5 1 B), los puntos se
puedenajustara una cunaexponencial,cuya inversadel punto de corteen el ejede ordenadasda
un valor de 26 sitios de unión por molécula de enzima. O, lo que es lo mismo, una alta
inespecificidadde unión. La representaciónde Scatchardsemuestraen la Figura 52 A. En este
casose puedeobservarunaclaradesviaciónde la linearidadde los puntos.Estospodrianajustarse
bien a una parábolao, como se intentaexpresarcon la línea discontinua,a un posible ciclo de
— —AV
histéresis
1W62.L-Acido evérnicocomoligando
La cinéticade saturacióndel ligamientode ácidoevérnico a la isoforma111 de arginasase
muestraen la Figura 53 A. La cinética, queeshiperbólica,muestrala saturacióna partir de 0,075
pmolesde ácidoevérnicototal. En la Figura 53 13 semuestrala representaciónde doblesinversas.
La curvaexponencialque seobtieneen el ajustede los puntosproporcionaun valor estimadode
8 sitios de unión pormoléculade proteína. En la representaciónde Scatchard(Fig. 54 A), los
puntos se alejan de la linearidad,ajustándosea una parábola.El valor del númerode sitios de
186
union del ácido evérnico a la isoforma III de arginasa,obtenido mediantela representación
sernilogaritmica,da un valor de 6 (Fig 54 B), algo menor que el obtenido a partir de la
representaciónde doblesinversas(rr’8).
111.6.2.1-Acido úsnicocomo ligando
La Figura 55 A muestrala cinética de saturacióndel ligamiento del ácido úsnico a la
isoforma111 de arginasa.Los sitios de unión de la proteínase saturana partir de 0,14 pmolesde
ácido úsnico total. En la representaciónde dobles inversas(Fig. 55 13), el ajustede los puntos
coincide con una curva exponencialcuya inversa del punto de corte con el eje de ordenadas
permite estimar en 26 el númeroaproximado de sitios de unión por moléculade proteína. Es
decir, en estecaso existe una alta inespecificidadde unión. En la representaciónde Scatchard
(Hg. 56 A) los puntos se puedenajustara una parábola, tal como ocurre en los casosdel
ligamiento del ácidoevérnico a la isoformaIII. El númerode sitios de unión parael ácido úsnico
por moléculade isoforma III es de — 28 según se deducede los resultadosobtenidosen la
representaciónsemilogaritmica.
11L63- Ligamiento a la isoforma 1V
111.63.1.-Atranorina como ligando
La cinética de saturacióndel ligamiento de atranorinaa la isoforma IV de arginasase
muestraen la Figura 57 A. Uomo puedeobservarse,dichasaturaciónse producea partir de 0,18
gmolesde atranorinatotal. En la Figura 57 B se muestrala representaciónde doblesinversas.El
númerode sitios de unión para atranorinaes de — 23, lo que nuevamentedemuestrauna alta
inespecificidaden la unión. La representaciónde Scatchardse muestraen la Figura 58 A. Uomo
puede observarse, existe igualmente un alejamiento de la linearidad en los puntos. La
187
representaciónsemilogaritmicadel ligamientode la atranorinaa la isoformaIV se muestraen la
Figura 58 B. El númerode sitios de unión pormoléculadeproteínaseestimóen 16.
111.63.2.-Ácido evérnicocomo ligando
La figura 59 A muestrala cinética de saturacióndel ligamiento de ácido evérnico a la
isoformaIV de arginasa.Los sitios de unión en la proteínasesaturanapartir de 0,015 pmolesde
ácido evérnicototal. Sin embargo,como ocurreen el ligamientode atranorinaa la isoforma III
(Fig. 51 A), paravaloresdel ligando total superioresa 0,015 jimoles, existe un descensode la
cantidad de ácido evérnico ligado. Este fenómeno también se observa en la representación
semilogaritmica(l-lg. 60 13>. En la representaciónde dobles inversas(Fig. 59 13) los puntos se
puedenajustara unacurvaexponencialcuya inversadel punto de corteen el eje de ordenadasda
un valor de 5 sitios de unión por moléculade enzima. La representaciónde Scatchardse
muestraen la Figura60 A. En estecasose puedeobservarunaclaradesviaciónde la linearidaden
los puntos. Estos podríanajustarsea una parábola o, según se muestracon la representación
discontinua,a un posible ‘ciclo de histéresis.Recordemosque el ácido evémicoactua como
inhibidor no competitivode la isoformaIV, mientrasque se comportacomo activadormixto de la
isoforma1 (TablaXIII),
111.63.3.-Ácido úsnicocomo ligando
La Figura 6 1 A muestrala cinética de saturacióndel ligamiento del ácido úsnico a la
isoformaIV de arginasa.Los sitios de unión de la proteínaparaesteefectorsesaturana partir de
0,075 pmolesde ácidoúsnico total. En la representaciónde doblesinversas(Fig. 61 B) el ajuste
de los puntos coincidecon una curva exponencialcuya inversa del punto de corte en el eje de
ordenadaspermiteestimaren — 32 el númerode sitios o, lo que es lo mismo, vuelvea existir una
altísima inespecificidaden la unión. En la representaciónde Scatchard(Fig. 62 A), los puntosse
puedenajustara unaparábola.El númerode sitios de unión parael ácidoúsnicopor moléculade
188
isoenzimaIV es de — 24. segúnse deducede los resultadosobtenidosen la representación
semilogaritmica(Fig. 62 13).
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Figura45< Ligamientode atranorinaa la isoforma1 de arginasaa una concentración2,55
~íM.En (A), representacióndirecta; en (B), representaciónde dobles-inversas
dondeel alustede la curvaexponencialesy = O,25.e28-2~> X ; r = 0,89.
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192
Figura 46< Ligamientode atranorinaa la isoforma1 de arginasaa unaconcentración2,55
Um. En (A>, representaciónde Scawhard; en (B), representacionserni—
logaritn1ica.
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194
Figura 47.- Ligamiento de ácidoevérnicoa la isoforma1 de arginasaa una concentración
de 2,55 ÁM. En (A), representacióndirecta; en (B), representaciónde dobles-
inversasdondeel ajustede la curvaexponencialesy = 0,23 e4’~ X ; r = 0,93.
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196
Figura 48- Ligamiento de ácidoevérnicoa la isoforma1 de arginasaa una concentración
2,55 pM. En (A), representaciónde Scatchard,en (13), representaciónsemi-
logaritmica.
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Figura 49.- Ligamiento de ácidoúsnico a la isoforma1 de arginasaa una concentración
2,55 pM En (A), representacióndirecta; en (13), representaciónde dobles—
inversasdondeel ajustede la curvaexponenciales y -= 0,11. e4-76 X ~ 0,92.
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Figura 50.- Ligamiento de ácidoúsnico a la isoforma1 de arginasaa una concentración
2,55 MM. En (A>, representaciónde Scatchard;en (B). representaciónsemi—
logar¡tmica.
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Figura 5 1.. Ligamiento de atranorinaa la isoforma III de arginasaa una concentración
1,42 MM. En (A), representacióndirecta; en (13), representaciónde dobles--
inversasdondeel ajustea la curvaexponenciales y 0,04. e3938N; r = 0,96~
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204
Figura 52.- Ligamiento de atranorinaa la isoforma 111 de arginasaa una concentración
1,42 pM. En (A), representaciónde Scatchard;en (13), representaciónsemi-
logaritmica.
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206
Figura 53.- Ligamiento de ácido evémico
concentración 1,42 uM. En
representaciónde dobles-inversas
=0,l3.e~144~;r =0,96.
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208
Figura 54.- -Ligamientode ácido evérnico a la isofornia III de arginasa a una
concentración 1,42 pM. En (A), representaciónde Scatchard;en (8).
representaciónsemi-logaritmica.
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210
Figura 55< Ligamientode ácidoúsnico a la isoformaIII de arginasaa unaconcentración
1,42 MM. En (A), representacióndirecta; en (B), representaciónde dobles--
inversasdondeel ajustea la curvaexponencialesy = 0,04. e’3- II ~ r = 0,85.
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Figura 56< Ligamiento de ácidoúsnico a la isoformaIII de arginasaa una concentración
1,42 jíM. En (A), representaciónde Scatcbard; en (B), representación
semilogarítmica.
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214
Figura 57.- Ligamiento de
1,50 jiM. En
dobles-inversas
r~ 0,98.
atranorinaa la isoforma IV de arginasaa una concentración
(A), representacióndirecta; en (B), representaciónde
dondeel ajustede la curva exponencialesy = 0,04e71’70X;
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Figura 58.- Ligamiento de atranorinaa la isoforma IV de arginasaa una concentración
1,50 iM. En (A), representaciónde Scatchard;en (B), representaciónsemi-
logarítmica.
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218
Figura 59.- Ligamiento de ácido evérnico a la isoforma IV de arginasa a una
concentración 3,50 jtM. En (A), representaciónde Scatchard; en (B),
representaciónsen-u-logarítmica.
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220
Figura 60.- Ligamiento de ácido evérnico a Ja isoforma IV de arginasa a una
concentración 1,50 1M. En (A), representaciónde Scatcbard; en (B),
representaciónsemi-Iogaritmica.
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222
Figura 6k- Ligamientode ácido ósnicoa la isoformaIV de arginasaa una concentración
1,50 pM. En (A), representacióndirecta; en (B), representaciónde dobles-
inversasdondeel ajustede la curvaexponencialesy = 0,03 e26-53OC; r = 0,95.
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224
Figura 62< Ligamiento de ácidoósnico a la isoformaIV de arginasaa una concentración
1,50 pM En (A), representaciónde Scatchard;en (8), representacionserni-
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226
111.7.-EFECTO DEL LIGAMIEI~TO DE ATRANORINA, ACIDO EVERNICO Y ÁCIDO
USNICO PRODUCIDO EN LAS ISOFORMAS DE ARGINASA
En estese presentanla Figura63 y la Tabla XVI
227
111.7.1.-Isoforma 1
El ligamiento de atranorina,ácido evérnico y ácido úsnico a la isoforma 1 de arginasa
producE:agregaciónde la proteínanativa, segúnpuedeobservarseen los resultadosexpuestosen
la Tabla XVI. ParaconfeccionarestaTabla, seeligió una de las concentracionesde efectorque
produciasaturaciónde los sitiosde unión enla proteína.
La atranorina108,0 pM (0,108 pmot en la subeámarade ligando, como se deducede la
Fig. 45 A) promuevela dimerización,ya que se detectaun agregadode aproximadamente39
kDa, el cual representaun 9,2%. De la forma nativa de la proteína,quedaun 68% despuésdel
ligamientoy apareceun terceragregadode aproximadamente30 kDa queno se sabea qué puede
corresponder.
El ligamiento de ácidoevérnico 5 1,0 pM (0,051 pmol en la subcámarade ligando, como
sededucede la Fig. 47 A) produceagregaciónde la isoforma1 a dímero,trimero, tetrámeroy un
polímero de aproximadarnentre9 unidades (Mr — J 60 kDa). La forma nativa, tras la
polimerización,representael 50% de la proteína.
El ácidoúsnico 87,0 pM (0,087pmo] en la subeámarade ligando, como se deducede la
Fig. 49 A) produceagregaciónen el 20% de la proteínanativa y aparecendímeros, trímerosy
hexámeros.
111.7.2.-Isoforma111
El ligamiento de atranorina,ácido evérnico y ácido úsnico a la isoforma III de arginasa
produceagregaciónde la proteínaen diferentesproporciones,segúnel ligando efector (Tabla
XV]).
La atranorina71,0 pM (0,071 gmol en la subeámaradel ligando, como se deducede la
Fig. 5 1 A) agregala proteínaa dímeroy trimero pero,en estecaso,tras el ligamientoapareceuna
forma de peso molecularaproximadamente19 ki)a, inferior al pesomolecular de la proteína
nativa (26 kDa).
228
El ácido evérnico45,0 ~M (0,045 pmol en la subcámaradel ligando, como sededucede
la Ng. 53 A) producelas mismasformasde agregadoquela atranorina.
El ácidoúsnico 77,0 1iM (0,077gmol en Jasubeámaradel ligando, como se deducede la
Fig. 55 A) ocasionaagregaciónde la isoforma111 de arginasaal dímeroexclusivamente(Mr 57
kDa). Se detectaun 61% de otra forma de pesomolecularinferior a la proteínanativa (Mr 18
kDa).
111.7.3.-IsoformaIV
SobreJaisoformaIV de arginasa,el ligamiento de atranorina198,0 pM (0,198 ~moíen la
subeámaradel ligando, como se deducede la Fig. 57 A) polimeriza la proteína a dimerosy
trimerosquedando,trasla unión, aproximadamenteun 90%de la formanativa.
El ácidoevérnico 23,0 ~tM(0,023 iLmol en la subcámaradel ligando, como sededucede
la Ng. 59 A> produce diferentes grados de agregación: dímeros, trímeros, hexámerosy
undecámeros.
EJ ácidoúsnico 87,0 ~tM(0,087iimol en la subeámaradel ligando, como sededucede la
PÁg. 61 A) agregala forma nativa al dímeros,trimeros, tetrámerosy un polímero de 13 unidades
(Mrt2óO kDa)querepresentaaproximadamenteel 3% de la proteínanativa.
La actividadarginasade los diferentesagregadosno ha sido anaiizada,dado el carácter
microanaliticodel métodode HPLC-exclusiónmolecularempleado.
En la Figura 63 A-C se muestrantres cromatogramasrepresentativosdel efecto de
agregaciónocasionadoen las isoformas1, III y IV nativasde arginasa,tras eJ ligamiento de los
distintosefectores.
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230
Figura 63< (?romatogramasobtenidosmedianteHPLC de exclusiónmolecular de los
distintos agregadosde arginasatras el ligamiento del efector. En (A>,
agregadosde la isoforma1 en presenciade 87 ninoies de ácido úsnico; en
(B), agregadosde la isoformaIII en presenciade 71 nmolesde atranorinay
en (C), agregadosde Ja isoforma IV en presenciade 23 nmolesde ácido
evérnico. Las flechasindican el pico identificado como monómero(forma
nativa).
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IV.- DISCUSION
233
Los últimos pasosde Ja vía de la sintesisy el catabolismode argininaen vegetalesson
similaresa los que seproducenen mamiferosy bacterias(De Ruitery Kollófel, 1982). Morae/al.
(1965)propusieronuna clasificaciónde los organismosen ureotélicoso uricotélicos,en ifinción
de la producciónde ureao ácidoúrico; clasificaciónque tambiénadoptaronparalas arginasasde
dichos organismos.Sin embargo,se ha descritoactividadarginasaen plantasde soja (Kang y
Cho, 1990), especieque carecedel ciclo del ácidoúrico. La importanciade dicha actividaden
estetipo de organismosradicaría,en última instancia,en la producciónde ornitina parala síntesis
de poliaminas,segúnproponenPohjanpeltoy Hóltta, 1983).
En el presentetrabajose handescritoy caracterizadocuatroisoformasde arginasa(1,11,111
y IV). si bien la isoforma 1 y la II son la misma, según se deducede su similitud en el punto
isoeléctrico (Figs. 5 y 6), en el pesomolecular(Fig. 14) y en la composiciónde aminoácidos
(Tabla y). Tambiénsehan descritoisoformasde arginasaen higadode ratón (1-lerfeid y Rapen
1976; Spolarisy Bond, 1988; Tarrabél al?, 1974) y en IV. crassa (Borkovichy Weis, 1987a)que
difieren en sus propiedadescatalíticas,molecularese inmunológicas.Las isoformas1 y IV de E.
prunastr¡ son induciblesporL-arginina, a] igual que las arginasasde E. cok (Crabeeleta!., 1975)
y Lac/obacillz¡sladis (Ananyan, 1981). La isoforma III es preexistentey posiblementeseactive
tras la liberación de arginina vacuolizada,segúndescribieronMartín-Falquinay Legaz (1984).
También sehan descritoarginasasconstitutivasen IV crassa (Weiss y Davis, 1973, 1977) y en
levaduras(Cybis y Davis, ¡975),
La isoforma IV de arginasaposee un resto glícosiladocompuestode 280 residuosde
glucosa,27 de fructosay 85 dc manosa(Planellesy Legaz, 1987). La proteínaessegregableal
igual quela arginasade ratón(Spolarisy Bond, 1988).
En las isoformas1, III y IV de arginasapredominanlos aminoácidosácidos(Tablas V,
VIII y X). Las isoformas 1 y II presentan,sin embargo,ciertas diferenciasa nivel de los
234
aminoácidosbásicos y aquellos con radicalesno polares. Al copurificar las dos proteínas,las
diferenciasencontradaspodríandebersea la microheterogeneidadobtenidaal purificarías a partir
de una variadapoblaciónde individuos. La isoforma IV no presentadiferenciassignificativasen
su composiciónde aminoácidosrespectoa la isoforma1. Ya que la isoforma IV de It? primas/rl
sólo se segregaen condicionesde inducción nutricional, probablementese trate de la misma
proteínaquela isoforma1. Blancoe/ al (1984)y Pérez-Urnay Vicente (i989) tambiéndescriben
secreciónde ureasaen E. prunastri. La isoformaIII presentaclarasdiferenciasen la composición
aminoacídicafrentea las isoformas¡ y IV. Poseeuna menorproporciónde aminoácidosácidosy
de aquelloscon grupospolares; sin embargo,tiene abundanciade aminoácidoscon gruposno
polares(Tabla VIII), lo cual indica una menoracidezde la proteínay, probablemente,una alta
tendenciaa la hidrofobicidadde la cadenapolipeptidica.La composiciónde aminoácidosde las
isoformasde arginasade E. primas/rl no guardarelacióncon la de otros organismoscomo rata,
pollo o cerdo(lkemoto, ¡989).
El punto isoeléctríco.estimadomedianteelectroforesiscapilar, de la isoforma1, alrededor
de 4,9 (Fig. 10), eJ de la isoformaIII, alrededorde 5,3 (Fig. 18) y el de la isoformaIV, alrededor
de 4,8 (Fig. 23), corrobora que se trata de proteínasde carácterácido. Wright el al. (1981)
describieronuna arginasaácidade alcachofacon pl de 5,3, estimadomedianteelectroenfoqueen
columna. Dichosautoresobservarondiferencias,aunqueno significativas,en la determinacióndel
pl, yaque el valor estimadoporelectroforesisen gel de poliacnilamidaoscilabaentre5,0 y 5,9. El
pl de las isoformasde arginasade E. pnmavtri difiere segúnel método empleado.Así, el valor
para la isoforma1 es de 5,86, estimadopor electroenfoque(Fig. 5), el de la isoformaIII de 6,18
(Mg. 16> y el de la isofonna IV de 5,6 (Mg. 21), valores algo diferentesa los obtenidospor
electroforesis capilar. Ya que la eficiencia del sistema capilar es muy superior a la del
electroenfoqueen columna,en lo que serefiere a la separaciónde picos, el valor elegido de pl de
las isoformasde arginasaeseJ determinadomedianteelectroforesiscapilar. La heterogeneidadde
cargatambiénfue descritapor Spoiaricsy Bond (1988) en dos subunidadesde arginasa(una de
35 kDa y otra de 38 kDa) de hígadode ratón. Ambassubunidadesconteníanproteínasbásicas
(rango de pI 7,8-9,1) y proteínasácidas(rango de pl 5,8-6,4) cuya multiplicidad de carga
235
constituiaunavariantede la mismaproteína.
El significado de haberdetectadotres isoformasde arginasacon distinta carga podría
llevar a pensaren su distintainteraccióncon la membranacelularo con otrasenzimas,incluso con
la función de la enzimaen diferentesrutasmetabólicas.En 1< prunastrí, la enzimaproporciona
ornitína y urea.Estosintermediarios,a su vez,conducena rutas(biosíntesisde poliaminasy ciclo
de la urea,respectivamente)cuyasfuncionespuedenestarreguladasde forma independiente.
En otro ordende funciones,Stichery iones(1992)detectarondosgruposde isoformasde
a-amilasadiferenciablesen su punto isoeléctrico,en capasde aleuronade cebada:las isoformas
de alto pl (4,90 y 4,72) y las de bajo pí (4,64 y 4,56). Las cuatro isoformastenían diferente
localizaciónsubcelu¡ary, a su vez, las de pl 4,72 y 4,56 eran formas segregablesal medio de
incubación.En E prunas¡ri, la isoformaIV de arginasa,segregableal medio, tambiéntieneun pl
ligeramenteinferior (5,6 ó 4,8, segúnla técnicautilizada)que la isoforma1 (pfrS,866 49>.
Los espectrosde absorciónultravioletade las tres isoformaspresentanun máximo a 275-
278 nm (hg. 25), es decir, ligeramentedesplazadohacialongitudesde onda inferiores al máximo
de absorcióndel ‘i’rp libre (280nm) (Campbelly Dwek, 1984). Estoindicala existenciade Tyr en
la cadenapolipeptídica. El espectrode absorciónultravioleta de la arginasade S. cerev¡siae
presentaun máximoa 278 nm, lo cual indica el dominio del Trp en su cadenapolipeptídica(Green
el al., 1990), ademásJaabsorbanciadecaea partir de 300 nm. Sin embargo,en el espectrode las
arginasasde E. prunasíri se puedeobservaruna discreta absorbanciaa longitudes de onda
superioresa 310 nm. Estehecho reflejauna tendenciaa la agregaciónpor partede las enzimas,
fenómenodescrito para otras proteínas, como por ejemplo el alergeno principal del olivo
(Lauzurica¿aal?, 1988; Wheelerel al?,1987).
Los espectrosde emisiónde fluorescencia(Figs. 26, 27 y 28) seobtuvieronsobrela base
de la fluorescencianatural de los anillos aromáticosde algunosaminoácidos.Cuandose excita
con una longitud de onda de 295 nm (Fig. 27), es decir, analizando exclusivamentela
contribución del Trp, se detectaun máximo alrededorde 350-352 nm. Dicho máximo se
encuentramuy próximo al del Trp libre (350nm) (Campbell y Dwek, 1984), lo cual indicarlaque
el Trp sesitúa en un entornobastanteaccesible.Una situación similar se describeparalos dos
236
residuosde Trp presentesen la albúminabovina(Pico y Houssier,1989).Los cambiosproducidos
en la fluorescenciade estos ‘Lp son utilizados por los autorespara estudiarla unión de sales
biliaresa la albúmina; dichaunión setraduceen un ‘atrapamiento”de la fluorescencia.Oreenel
a/, (1991) observaronque la intensidadde fluorescenciade laarginasade S. cerev.rs¡ae,excitando
a 295 nm, incrementabael 100%yel máximosedesplazabade 337 a 352 nm cuandoquelabanel
Zn2±por diálisis, en comparacióncon la holoenzima.En E. prunavlri, no seha demostradoque
la arginasaposeaZn24 como ión asociado,pero llama la atenciónel hechode observarel pico de
máximaemisión de fluorescenciaa 352 nm en las tres isoformas,idénticalongitud de onda a la
queemitela arginasade levaduraen ausenciade Zn2+.
La excitacióny emisión simultáneas,espectrosincrónico,a diferenteslongitudesde onda
(Fig. 29), muestrados máximos de emisión. El principal, a 355 nm, pone de manifiesto la
contribuciónde los Trp, el segundomáximo, centradoentre305-307nm, indica la presenciade
Tyr. El máximo de fluorescenciadel aminoácidolibre es 303 nm (Carnpbell y Dwek, 1984). El
segundomáximo estáausenteen la isoforma Hl de arginasa,lo que indicaria que éstapresenta
unaaccesibilidaddiferentea los residuosde Tyr. Sin embargo,la isoformaIII poseeun máximo a
288 nm, correspondientea la fluorescenciade la Phe. El máximo de fluorescenciadel aminoácido
libre es 282 nm (Campbelly Dwek, 1984). En S. cerevisiaeel máximo de emisión a 377 nm y el
de excitacióna284 nm, seencuentranalejadosde los máximosdel Trp, esdecir, el aminoácidose
encuentraenun entornobastantehidrofóbico(Greenel al, 1990).
De los resultadosobtenidosa partir de los espectrosde absorcióny de emisión de
fluorescencia,sedesprendequelas tresisoformasde arginasapresentanunaalta homología.
La arginasaha sido descrita,generalmente,comouna enzimaoligomérica,compuestapor
un númerovariablede subunidades,entretres y ocho, en función del organismodel que seaísle.
Así, la arginasade hígadode ratasedescribiócomo un trimero o un tetrámero( Aguirre y Kashe,
1983; Gargantay Bond, 1986; Hirhs-Kolb y Greenberg,1968).La arginasade 5. cerevisiaeesun
trímero (Oreen el al., 1990) y la de soja un tetrámero(Kang y Cho, 1990). Sin embargo,la
arginasade A’. erasway la de Bach/as/¡chenf/brmispresentanun mayor númerode subunidades,
7 y 8, respectivamente(Borkovich y Weiss, 1987b). Por otra parte, la subunidadmonomérica
237
tieneun pesomolecular,determinadopor electroforesisen SDS, queoscilaentre33 kDa, la de 1?.
licheniform¡s, y 55 kDa, la de soja.
El pesomolecularde las distintas isoformasde arginasade E. prunastr¡ fue calculado
medianteHPLC en columnasde exclusiónmolecular,técnicaque permite obteneruna eficacia
media por pico de 100.000 platosteóricos(Tabla VI). Las isoformas1 y II tienen un peso
molecularde 18 kDa y 16 kDa, respectivamente,la isoformaIII de 26 kDa y la isoformaIV de
arginasade 20 kDa (Figs. 14, 19 y 24), valoresinferioresa los descritosparaotrasarginasas.El
análisis en presenciade SDS (Fig. 13) demostróque se trata de formas monoméricas;no se
detectaronoligómeros en ningún caso. Los pesosmoleculares,calculadosmedianteexclusión
molceular en Sephadex6200, de estasmismasarginasasfueron 1 80 kDa para la isoforma 1
(Legazy Vicente, 1980); 330 kDa parala isoformaIII (Martín-Falquinay Legaz, 1984)y 245
kDa para la isoformaIV (Planellesy Legaz, 1987); esdecir, setrataría,al menos,de decámeros
segúnel valor de pesomoleculardel monómeroestimadopor HPLC.
Esta discrepanciaen los valores de peso molecular, calculadospor distintas técnicas,
podríaexplicarsesi existieraautoasociaciónde las moléculasde arginasaduranteel procesode
filtración en Sephadex,fenómenosemejanteal descritopor Ikemotoel al. (1990).Dichosautores
purificaron arginasa,de higadoy eritrocito humano,con un valor de pesomolecularaproximado
de 100 kDa; sin embargo,cuandoexpresabanla arginasade hígadohumanoen E. aili, el peso
molecularque obteníande laproteínapurificadaerade 35 kDa, esdecir, el monómero.Ikemoto
e/ al. (1990)concluyeronque la arginasanativa era un monómeroy el aparentepolimorfismo de
las moléculas de arginasapodría estar causadopor autoasociacióno incluso modificación
proteoliticaduranteel procesode purificación.EstefenómenotambiénÑeobservadopor Totani
(1973)al purificar la arginasade hígadode cerdo.
Las isoformas1 y IV de arginasano sólo poseenuna composiciónde aminoácidosmuy
semejantee igual valor de pI (4,9 y 4,8) sino tambiénun pesomolecularmuy semejante(18 kDa
la isoforma1 y 20 kDa la isoformaIV) (Figs. 14 y 24). La diferenciade 2 kfla de pesomolecular
se debeal restoglicosídico,el cual representael 10% del pesode la proteína.La composiciónde
esteresiduo, determinadapor Planelles y Legaz (1987), es de 280 restosde glucosa,27 de
238
fructosa y 85 de manosa.El resto glicosídicode las proteínassegregablesoscila entre el 5 y el
40% del peso de la glicoproteina,segúnproponenGoocheey Monica (1990), y puedetener
implicacionesen su actividadbiológica específica(actividadporgramo de glicoproteina). En it?
primas/rl, ambasisoformasson activas,pero la forma segregablees unas3 vecesmenosafin por
su sustratoquela isoforma1 de arginasa(Tabla MII). Estefenómenode pérdidade actividades
bien conocido en las hormonas glicoproteicascomo, por ejemplo, la tirotropina, donde la
completadesglicosilaciónsuponeuna pérdidade actividad (Baenzigery Green, 1988; Sairam,
1989).
La isoforma III de arginasaes de mayor tamañoque la 1 y la IV (26 kDa) y rica en
aminoácidos característicosde pre-proteinas.Existen varias explicaciones posibles a esta
heterogeneidad.En primer lugar, las diferenciasde pesomolecularentredosisoformaspuedenser
la consecuenciade unaproteolisispost-traduccional,hechoquevieneavaladoporlos altosniveles
de Met detectados(unasdos vecessuperioresen la isoforma111 respectoa la 1). Stichery Jones
(1992) también definieron modificaciones post-traduccionaiesque afectabana la carga de
diferentes isoformasde a-amilasa.Al igual que ocurre con la pérdida de actividad biológica
debidoa la desglicosilación,una diferenciade 8 kDa en el pesomolecularrepercutea nivel de la
Km, haciendo3 vecesmenosafin por la L-arginina a la isoforma III que a la 1. Estesignificado
reguladorde la arginasain vivo, consecuenciade las variacionesde tamaño,ha sido descritopor
Messenguyy Dubois(1983)en Las arginasasde levaduras,Aguirre y Kasche(1983)encontraron
diferenciasde 5 kDa entresubunidadesde arginasade hígadode rata; la proteolisisñu vñrode la
proteínademostróque estefragmentono era esencialparala actividad enzimática.Resultados
similares encontraronSpolaricksy Bond (1988) en Las arginasasde ratón y Cronin y Tipton
(1985) en la fosfofrutoquinasade Tripanosoma brucei brucel. Burkovich y Weiss (198%)
detectarondosformasde arginasa,de 36 y 4] kDa, respectivasmente,en IV. crassa.Los estudios
de transcripciónin vi/ro indicaron que ambasformas procedíande rnRNA5 diferentes. Dichos
autoresapuntabanla posibleexistenciade promotoresalternativospara la transcripción,de tal
maneraque el pooi de argininapermitierauna mayor expresiónde uno de los promotores.Este
fenómenotambiénocurreen la invertasade levaduras(Perimanel al., 1984) y en la glutamina
239
sintetasade E? coli (Reitzery Magasanik,1985).
Los valoresde Km y vmax resultanmuy útiles cuandose trata de comparardiferentes
isoformas. La determinación de estos parámetrosse puede realizar mediante diferentes
representacionesgráficas,sin olvidar quela interpretaciónde estosvaloresdebeser independiente
del método por el cual se calculendichos parámetros.La representacióndirecta de los datos
pareceserel mejor sistemaparacalcular Km y vmax (1-lenderson,1992). En estemismo grupo
entrala representaciónde Eisenthal-Cornish-Bowden,puesemplealos pares(y0 [So]).obtenidos
directamente.Asumiendosiempreque la medidade la concentraciónde sustratotiene un error
próximoo igual a ‘cero, los posibleserroresexperimentalesse introducenen la valoraciónde la
velocidad de reacción. La representaciónde Lineweaver-Burk, aún siendo la más utilizada,
produceerroresimportantesen la determinaciónde parámetroscinéticos,debidoprincipalmentea
la desviaciónde la linearidad,consecuenciade las transformacionesmatemáticasde los datos.En
la representaciónde Eadie-Hofsteetambiénse puedenencontrardesviacionesde la lineañdad
interpretadas,en muchoscasoserróneamente,como cooperatividadde la enzimapor su sustrato.
En el caso que nos ocupa, no se ha elegidoni la representaciónde Lineweaver-Burkni la de
Eadie-Hofsteepor las razonesexpuestasanteriormente,máxime cuando la isoforma Il[ de
arginasaexhibecooperatividaden la unión de L-arginina(Fig.40).
Las isoformas1 y IV de arginasason enzimasmicaelianas(Figs. 37 y 42). El valor de Km
de la isoforma 1 es 1.5 mM y el de la isoformaIV de 4,45 mM; ambosobtenidosa partir de la
representacióndirecta, Esto indica quela isoforma1 estres vecesmásafin por su sustratoque la
isoformaIV. Sin embargo,al compararlos valoresde Km obtenidosmediantela representación
de Eisenthal-Comnish-Bowden(Figs. 38 y 43), 4,9 mM para la isoforma ¡ y 4,0 m.M para la
isoformaIV, el razonamientoanteriorno seríaválido. En estecaso,el valor de 4,9 mM, calculado
parala isoforma1, esmuy alto debidoa quela enzimapresentaunaligera inhibición porexcesode
sustrato. Cuando esto sucede, la representaciónde Eisenthal-Comish-Bowdenno resulta
conveniente(Henderson,1992).
En el presentetrabajose optó por una tercerarepresentacióngráfica, la de Hanes,que
corroborala credibilidad de los valoresobtenidosa partir de la representacióndirecta, ya que
240
ambosejes son independientes.El valor de Km de la isoforma1 de arginasa,obtenidoa partir de
estarepresentaciónes de 1,25 mM (Mg. 39) y el de la isoformaIV de 3,0 mM (Fig. 44). Dichos
valoresconfirman lo propuestoanteriormente:la isoforma1 es aproximadamentetres vecesmás
afin por la arginínaque la isoformaIV. Arginasaspurificadasa partir de otros organismostienen
valoresde Km algosuperiores.Es el casode la proteínade S. cerevisiae(Km 1 5,7 mM) ( Kang
y Cho, 1990), la de alcachofa(Km entre 8,0 y 18 m.M) (Wright el al., 1981) y la arginasadc
hígadode rata(Km entre 1,7 y 18 mM) (Gargantay Bond, 1986).
Aún siendomenorel valor de Km de la isoforma1 que el de la IV, la velocidadmáximade
éstaúltima esmayor (TablaXHI).
La isoformaIII de arginasa,a diferenciade la 1 y la IV, exhibeuna cinética sigmoidal,
típicade enzimasalostéricas(Fig. 40), lo cual implica la existenciade cooperatividadpositiva en
la unión de su sustrato.Este resultadose confirma al compararel valor del coeficientede Hill
(h) — 4 (Mg. 41 y TablaXIV).
La arginasade hígado de rata muestradiferentescinéticasen función no sólo de la
concentraciónde sustrato (arginina), sino de cofactor (Mn2±).A concentracionesde arginína
alrededorde 1 mM, tanto en presenciacomo en ausenciade Mn2±30 uM, la enzima exhibe
cinética micaeliana,pero su Km varia de 0,94 mM (en presenciade Mn2+) a 1,58 mM (en
ausenciade Mn2±).Sin embargo,en el rangode concentraciónentre5 y 35 uM de arginina, la
argininapasade sermicaeliana,convalor de Km 14,4 pM (en ausenciade Mn2±).a alostérica,
con ~ 6,5 ~iMy un coeficientede Hill = 2, lo que demuestrasu cooperatividaden la unión
del sustrato(Maggini ci al., 1992). Es posibleque la isoformaIII de arginasaexhibieradiferente
cinéticavariandola concentraciónde Mn2+, aunqueestaconductano ha sido comprobada,ya
quela concentraciónde cofactorutilizadaha sido la mismaen todoslos casos.
Carvajal e/ al. (1982) refirieron cambios de cinéticas hiperbólicas a sigmoidales
producidaspor diferentesgradosde asociaciónde las subunidadesde arginasade hígadohumano
en función del pH. La arginasaconstitutiva de E. prunastri, aislada y purificada por Martín-
Falquinay Legaz(1984)no mostrabacooperatividaden la unión sustrato,posiblementedebidoa
un grado de asociaciónde las subunidadesdistinto al encontradoen el presentetrabajo, como
241
podríasospecharsede su elevadopesomolecular,estimadoen 330 kDa. Tambiénesposibleque
se trate de una “falsa cooperatividad.Tipton (1992) define como ‘falsa cooperatividad” la
reflejada como consecuenciade la lenta asociación-disociaciónde vanas subunidadesde una
enzima. Estefenómenotambiénha sido observadoen la GTPciclohidrolasa1 de higadode rata
(Hatakeyama¿aal. 1989).Porotra parte,la riquezaen aminoácidosno polaresde la isoformaIII
de arginasa<Tabla VIII), permitiría la formación de un núcleo hidrofóbico, base para dicha
asociación, El valor de ~ (concentraciónde sustratoque produceel 50% de la velocidad
máxima)es4,5 mM (TablaXIII), lo queindicaríaque la enzima escuatro vecesmenosafin por
L-arginina que la isoforma1. En estecaso,además,el valor de vmax = 2,12 ~molesde amonio.
miw1 es el menorobtenidoen comparaciónconlas otrasisoformas.
Una conclusióngeneralizadasobre cinéticassigmoidales,asumeque el alosterismose
produceen enzimasoligoméricas(Pricey Stevens,1986),pero esteno es el caso.Tambiénpuede
ocurnr en proteínascon varios sitios de unión parael sustrato(Merkler y Schramm,1990). Se
han descritocinéticasalostéricasdebidasa interaccionesproteína-proteínaque conllevancambios
en la estructuraterciaria y cuaternaria;esel casodescrito parala asociacióndel inhibidor de la
subtilisina a la subtilisinao de la arginina a la ornitina carbamil transferasa(Janin y Chothia,
1990), Esta última posibilidad queda descartadaal tratarse de isoformas purificadas como
monómeros.
Otra diferenciasignificativaentrelas tresisoformasde arginasaesla regulaciónquesobre
ellas ejercen los fenoles atranorina,ácido evérnico y ácido úsnico. Antes de comentarestos
efectossedebenmatizarunaseriede detalles.
En primer lugar, comentarque la determinaciónde los fenoles,en general, no resulta
problemática,siemprey cuandotenganuna alta solubilidaden agua.Es el casodel resorcinolo el
catecol.Risnery Cash<1990) extrajeroncompuestosfenólicos,a partir de muestrasde humode
cigarrillo, utilizando disolucionesacuosasde ácido acéticoal 1% (y/y). Guissey Bertru (1987)
propusieronun sistemade extracciónque consisteen ácido acéticoy óxido de éter, lo que
suponíauna ventajasobreel anterior. En amboscasosseempleabauna columnade fasereversa
en I-IPLC, detectandolos compuestosa280 nm ó 254 nm. Ambosmétodosson másrápidos y la
242
sensibilidadobtenidamayor que en los descritospor Coutis ci al. (1979)y Nanní el al? (1988),
utilizandocromatografiade gases.
Los fenolesde E. pi-unas/rl tienen muy bajasolubilidad en agua,por lo que el empleo de
fasesacuosasen su extracciónno resultaadecuado.El métodode extracciónque se describeen el
presentetrabajo tiene grandesventajassobreotros utilizadoshastael momento.En primer lugar,
se proponeuna mezcla de fases orgánicasextractivas que tiene en cuenta la naturalezay
propiedadesquímicas de las funciones presentesen los fenoles liquénicos. La mezcla de
cloroformo/ acetonitrilo/ éter dietilico¡ acetatode etilo, recuperahastael 99% de los fenoles
contenidosen muestrasacuosas(Fig. 2). En segundolugar, la elución isocráticade la fasemóvil
es menoscompleja y más rápida en comparacióncon las elucionesen gradientecomo, por
ejemplo, la sugeridapor Murphy y Brad-Stutte(¡983) en el análisis de los ácidosbenzoicoy
cinámico.En tercerlugar, deberesaltarsela ventajaquesuponela detecciónde cadasustanciaa la
longitud de ondade su máximaabsorción.En la detecciónde los fenolesde E. prunastrí se ha
empleadoun cambio de longitud de onda temporal en función del tiempo de retenciónde los
compuestos.La detecciónde atranorina,ácidoevérnicoy ácidoúsnico a 254 nm de longitud de
ondafija fija (Legazy Vicente, 1983),puedellevar a resultadosequivocados,debidoa la menor
absorbanciaque presentanestoscompuestosrespectoa otras longitudesde onda. Stracket al.
(1979)tambiéndetectaronfenolesde diferentenaturalezaa 254 nm,
La sensibilidaddel métodode detecciónpropuestopermitecuantificarfenolesen el rango
de nmoles,resultadoésteque sólo seobteníautilizando complejosprotocolosde derivatizacióny
posteriordetecciónfluorimétrica(Ogany Katz, 1981),
El fraccionamientodel talo que sepropone,permiteobservarla localizaciónmayoritaria
de cadauno de los fenoles.Los talos incubadosen argininaretienenprincipalmenteatranorinay
ácido úsnico, siendo el ácido evérnico el que se segregaal medio en mayor proporción. Una
primera aproximación seria suponerque la atranorinay el ácido úsnico fueran los fenoles
responsablesde la regulaciónde la actividadde la isoforma1, mientrasqueel ácidoevérnicoseria
el responsablede la regulaciónde la isoformaIV. Sin embargo,la cantidadde fenol solubilizado
en el extracto libre de células y el medio de incubación difiere de la detectadaen talo, esta
243
cantidadesdel ordende un millón de vecesinferior. Por tanto, la ideaanteriorde regulaciónde la
actividadde las isoformasde arginasaen función de la cantidadde fenol detectadaen talo o en
medio no esválida, debiéndoseestudiarel efecto reguladoren fUnción de la cantidadde efector
accesiblea la enzima. La mayor cantidadde fenoles solubilizados se detectaen el medio de
incubación,por lo que seriala isoformaIV de arginasala regulablepormayoresconcentraciones
de efector (Tabla XII), No hay contradicciónentreesteresultadoy la baja solubilidad de los
fenolesen agua,ya quevaloresalcalinosde pH incrementansu solubilidad,asícomo la formación
de quelatos(Rundel, 1978).
La baja cantidadde fenoles encontradaen los extractoslibres de células se debe a que
éstoscristalizanen los espaciosintercelularessobrelas paredesdel alga (Ahmadjian y Jacobs,
1985;Avalosy Vicente, 1987; Honegger,1986; Legazy Vicente, 1989). Estosfenoles,junto con
los depositadosen el córtex (Fig. 35 A-U) no tendríanefecto reguladorsignificativo sobrelas
isoformasde arginasa,ya queno estánsolubilizados.
El patrónde distribución de los fenolesen talosincubadosen cicloheximida(Fig. 36 A-U)
es muy diferente al anterior. Los fenolesque se detectanen mayor cantidadson los ácidos
evérnico y úsnico,siendoéstos,a su vez, los que se solubilizan en mayor medidaen el extracto
libre de células(TablaXII>.
Los fenolesestándescritoscomo potentesreguladoresde variasactividadesenzimáticas.
Aunque habitualmentesedescribencomo inhibidores (Planaset al., 1981; Ravisee/ al., 1980),
algunasveces se comportancomo activadores.Estefenómenose ha descritopara la actividad
lacasa de Agar/cus bisporus y Pleoro/usostrea/us (Giovannozi-Sernanniy Luna, 1981). La
activación o inactivación,en general, dependede la concentraciónde efector utilizada. Así, la
arginasa inducible purificada por Legaz y Vicente (1982) es activada por atranorina a
concentracionescomprendidas entre 1 y 8 pM, pero resulta completamenteinhibida a
concentracionessuperioresa 12 aM. El ácido evérnico inactiva totalmente a la enzima a
concentracionessuperioresa 16 pM (Legazy Vicente, 1983).
La isoforma1 de arginasa,asimilable a la enzimainducible de Legaz y Vicente (1982),es
activadapor atranorina33,3 nM, fenol que secomportacomo un activadorno competitivo, es
244
decir,no compitecon el sustratopor el centroactivo de la proteína.El ácidoevérnico 130 nM es
un activadormixto de La isoforma1, mientrasque el ácidoúsnico ¡73,3 nm se comportacomo un
inhibidor competitivo,Puedeentoncesafirmarseque,en general,bajasconcentracionesde fenoles
producenactivación,mientrasquelas altasconcentracionesocasionanel efecto contrario.
La isoformaIII de arginasaes inhibida por los tres fenolesa concentracionesque oscilan
entre0,10 y 0,47 aM (Fig. 40). La arginasapre-existente,descritapor Martín-Falguinay Legaz
(1984),asimilablea la isoformaIII, resultabaactivadapor mezclasde fenolesa concentraciones
superioresa6 1.0v! de atranorina,19 jM de ácidoevérnicoy 200 1.iM de ácidoúsnico.
Los ácido evérnico (1,15 mM) y úsnico (1,27 mM) se comportancomo inhibidores no
competitivos de la isoformaIV de arginasa,mientrasque la atranorina1,69 mM es un activador
mixto. La argínasasegregable,descritapor Planellesy Legaz(1987),asimilablea la isoformaIV,
era activadapor ácidoúsnico en el rangode concentracionescomprendidasentre20 y 120 jM,
diez vecesinferioresa las ensayadasen el presenteestudio.
No obstante,la concentraciónde fenol solubilizadaen el extracto libre de célulasy por
tanto accesible,en principio, a la enzima,va a dependerdel pH del medio en cadamomento
(Legazel al., 1 993b), por lo que siempreesconvenientecuantificarel fenol, previo al ensayode
efección¡u vitro, Otragranvariaciónquepuedeobservarseen la cantidadde fenolesesla debida
a las condicionesambientales(Legazel al., 1986),las cualesa su vezvariandependiendono sólo
de la estación del alio sino de otros muchísimosfactorescomo pluviosidad, densidadde flujo
fotónico,temperatura,etc..
Los estudios de ligamiento contribuyen en gran medida al conocimiento de las
interaccionesentre una proteína y sus efectores. Los resultados obtenidos se presentan
habitualmentecomo cinéticasde Scatchard(1949),a partir de las cualesseestableceel númerode
sitios de unión para el efectory sus características.Sin embargo,es muy dificil obtenerestas
conclusionesa partir de una sola representacióngráfica (Pedersenel al., 1986; Klotz, 1989;
Munson y Rodbard, 1980). Por ello, en el estudio que se presenta,se han elegido otras tres
representacionesgráficas la directade ligamiento, la de dobles-inversasy la semi-logaritmica
(TablaIII>.
245
Las representacionesdirectasde los datosdel ligamiento de atranorina,ácido evérnico y
ácido úsnicoa cadaunade las isoformasde arginasamuestran,aún siendocinéticashiperbólicas,
una cierta tendenciaa la sigmoicidad (Figs. 45, 47, 51. 53, 57, 59 y 61), a excepcióndel
ligamiento del ácido úsnico a las isoformas1 y III (Figs. 49 y 55, respectivamente)claramente
hiperbólicas. Price y Dwek 0982) proponen la existenciade cooperatividadpositiva como
explicacióna estosperfiles de la gráficade saturacion.
Tambiénpuedeobservarseque el nivel de saturaciónde sitios en la proteínaesdiferente
segúnla isoforma de la que se trate. Asi, las isoformas 1 y IV necesitanmayor cantidad de
atranorina(aproximadamenteel doble) que la isoforma111 paralograr la saturación(Figs. 45 A,
Sí A y 57 A), E] comportamientode las proteínasfrente al ácido evérnicoesmuy diferente. La
isoformaIV saturasus sitios de unión parael efectora menorcantidadde ligando (entre 3 y 5
vecesmenos)quelas isoformas¡ y III (Figs. 47 A, 53 A y 59 A). Por el contrario, la saturación
del númerode sitios para el ácidoúsnico (Figs. 49 A, 55 A y 61 A) seproducea cantidadesde
ligando casi dos veces superioresen la isoforma 111 que en las isoformas1 y IV. La principal
diferenciaentrelas isoformas1 y IV respectoa la III estribaen que las primerasnecesitanmayor
cantidadde atranorinaque de otrosefectoresparasaturarsus sitios, mientrasque la isoformaIII
requieremayorcantidadde úsnicoquede otrosefectoresparaalcanzarla saturación.
Los datos del ligamientoutilizadosen la representaciónde dobles-inversasse ajustan,en
todoslos casos,a unacurva exponencial(Figs. 45 B, 47 B, 49 E, 51 B, 53 E, 55 E, 57 E, 59 E y
61 B), hechoque indica la existenciade un claro patrónde cooperatividadpositivaparala unión
de los tres fenolesa las tres isoformasde arginasa,segúnproponeNeet (1980). Este tipo de
representaciónpermiterealizar una primeraaproximaciónal númerode sitios de ligamiento (n)
parael efectorpor moléculade proteína,comodefinieronKlotz y Hunston(1971).
246
ISOFORMADEARGINASA
NUMERO DE SITIOS DE UNION PARA EL EFECTORPOR MOLECULA DEPROTEíNA
EFECTORATRANORINA AC. EVERNICO AC. USNICO
1 4 4 10*IIIIV
26 8 2623 5 32
*Valoressupcrwrcsa 10 indican inespccificidadencl ligamiento (KIeV 1989)
La isoforma1 es la que liga los efectorescon unamayor especificidad,sólo posee4 sitios
de unión para la atranorinay otros 4 para el ácido evérnico por molécula de proteína. La
semejanzaentrela isoforma1 y la IV radicaen su especificidadparaligar ácidoevérnico,pero la
diferencia entre ambasproteínasestribaen que la isoforma IV pierde La especificidaden el
ligamiento de atranorinay ácido úsnico. La isoforma III presentauna mayor semejanzacon la
isoforma IV que con la 1, ya que III Y IV ligan ácido evérnico de forma específica,pero
atranorinay ácidoúsnicode manerainespecifica.
No obstante,Klotz (1989)apuntala posibilidad de obtenerconclusioneserróneasa partir
de la representaciónde dobles-inversasde los datosde ligamiento,debidoa la fuertecompresión
que sufrenéstosen las proximidadesdel eje de ordenadas,El proponedeterminarel númerode
sitios de unión a partir de la representaciónsemi-logaritmica.Nosotrosestamosde acuerdocon
Klotz (1989),ya que en estetipo de representaciónse obtienendosclarasventajas.En primer
lugar, existe un espaciadouniforme de los datosy , en segundolugar, se puedeobservaruna
plataformade saturacióninequívocaa partir de la cual sepuedecalcularel númerode sitios de
ligamiento.
Los valoresque seobtienenmedianteestarepresentación(Figs. 46 B, 48 E, 50 13, 52 2,
54 13, 56 2, 58 B, 60 13 y 62 2) son prácticamenteiguales a los obtenidos mediantela
representaciónde dobles-inversas.La única variaciónen el númerode sitios es la obtenidaen el
ligamiento de atranorinaa las isoformasIII y IV (Figs. 52 y 58). Dondeantesaparecian26 y 23
sitios, respectivamente,ahorason aproximadamente13 y 15 los sitios de unión parael ligando.
En cualquiercaso,un valor superiora lO sitios lo único que indica esunaalta inespecificidadde
247
ligamiento proteina-efector.No obstante,estadiferencia de valores podría debersea que la
enzima se está saturandoen realidad a niveles inferiores de ligando a los que indica la
representacióndirecta, según propone Pedersenel al? (1986). Honoré y Brodersen (1983)
determinaron II sitios de unión para el diflunisal (fármaco antiinflamatorio) a la albúmina,no
lograndosaturarla proteínaa los niveles de fármaco utilizados, por lo que el númerode sitios
propuestoresultó sererróneo. En nuestro caso estono sucede,ya que siemprese obtieneuna
curvade saturaciónprevia.
La literaturamuestrala representaciónde Scatchardcomo la habitual en el estudio del
ligamiento, Cuando la representaciónproporcionauna línea recta, esto se interpretacomo la
unión de un ligando homogéneoa sitios idénticose independientes.Sin embargo,existencinéticas
de ligamiento donde los datos se alejan de la linearidad. En las tres isoformasde arginasase
observaestecomportamientoparael ligamiento de cualquierefector(Figs. 46 A, 48 A, 52 A, 54
A, 56 A, 58 A, 60 A y 62 A), donde los datossepuedenajustara curvas cóncavo-convexas,
excepto la que muestrala unión del ácidoúsnico a la isoforma1 (Fig. 50). Estetipo de curvasse
consideraindicativo de cooperatividadpositiva en la unión del ligando a la proteína(Price y
Stevens,1986). Es decir, se puedeconcluirque existeninteraccionesentrelos diferentessitios de
tal manera que la afinidad de cada sitio cambia con la ocupaciónde los otros y en estas
condicionesse podríadeterminarmásde una constantede ligamientoparacadauno de los sitios
(Klotz y Hunston,1977)
La cooperatividadpositivase puedemimetizarpor variosartefactos,comoporejemploes
la heterogeneidaddel ligando. Mendel et al. (1985) observaronesteefecto en el ligamiento de
receptoresde superficiecelulara lipoproteinas.El efectosedebíaaquelas lipoproteinasse aislan
generalmentecomo mezclasheterogéneasde partículasde varios tamañosy características.De
acuerdocon los mismosautoresse debeentendercomo ligando heterogéneoa una mezclade
ligandosque tienendistinta afinidad por el receptor(proteína)o bienun ligando con impurezas
químicas. En el caso que nos ocupa, la existenciade cooperatividadpositiva definida en el
ligamiento de atranorina y ácidos evérnico y úsnico a las isoformas de arginasano esta
mimetizada por el empleo de ligandos heterogéneos.Se han utilizado fenoles (ligandos)
248
comercialesde pureza— 99,8%,comprobadamedianteanálisisen 1-IPLC utilizando columnasde
fasereversa.Otro artefactoque puedemimetizar la cooperatividadpositivaes la autoasociación
del ligando (Ishidael al., 1 988). Estaposibilidad puedeserdescartadasi el tiempo requeridopor
los fenolesparaalcanzarel equilibrio de diálisis en presenciao ausenciade la proteínano difiere
en másde 2 h (Pedersene/al.,1986), lo cual se satisfaceen nuestrocaso.
Otra posibleexplicaciónde los resultadosobtenidosen las representacionesde Scatchard
estaríarelacionadacon los cambiosen el pesomolecularde las isoformas,debidosa la reacción
asociación-disociaciónde las proteínasen presenciadel fenol. Diversosautores(Ainslie e/ al,
1972; OFagain el al, 1982) hablan de una ‘cinética transitoria lenta’ para apoyar la
cooperatividadmostradaen el ligamiento de efectores a enzimasmonoméricas,caso de las
isoformas1, III y IV de arginasa.Estacinéticaconsistiríaen una reacciónde isomerizacióno bien
en una asociación-disociaciónde la proteína.Un mecanismode estetipo fUe descritopara la
glutamatodeshidrogenasa(Friedeny Colman, 1967). En un principio,estosautoresestablecieron
unacorrelaciónentrelos cambiosde pesomolecularde la enzimay la activación o inhibición por
nucleótidosde purina(GTPy GDP), de tal maneraqueel polímero eraactivo y el monómeroera
relativamenteinactivo. Sin embargo,los resultadoscinéticosy de ligamiento, les permitieron
concluirque el GTPy el GDP seuníanmenosa la formapoliméricaque a la monomérica.Existía
una fUerte cooperatividadpositiva a valoresaltosde concentraciónde proteína,pero esteefecto
era menor a concentracionesde proteínainferiores a 0,01 mg’mk1. Esto se debíaa que en el
primer caso la concentraciónde proteína era mayor que la constantede disociación para el
efector. La representaciónde Scatchardde los datosde ligamientode atranorinaala isoformaHl
de arginasa(Fig 52 A) resultaespecialmentediscutible. Si bien los puntosse puedenaproximara
una curva cóncavo-convexa,señalábamosen el punto 111.6.2.1. de Resultadosque otra
posibilidad seriaajustarlosa un ‘ciclo de histéresis.Dicho de otro modo, la isoformaIII muestra
una muy lenta respuestade asociación-disociacióna los cambiosde concentraciónde atranorina.
Estehechovieneavaladoporel perfil de la curva semi-logaritmica(Fig. 52 B), dondese observa
un descensode la cantidadde atranorinaligada a partir de concentracionesde efector libre
superioresa 1,8 gíM. Convienetambiénresaltarla consecuenciaque el ligamientode atranorina
249
produceen la isoformaIII en comparacióncon los otros efectoresen las distintasisoformas..Es
el único caso en que sólo se observaun 2% de formaspoliméricasrespectoa la proteínanativa
(Fig. 63). Podríamos,entonces,definir el comportamientode la isoformaIII de arginasacomo
histeréticoen su unión a la atranorina,segúnla definición propuestapor Neet y Ainslie (1980)
paraestetipo de respuestas.Un comportamientosimilar ocurreen el ligamiento de ácidoevémico
a la isoformaIV (Fig. 60 A) aunque,en estecaso,sehacemenospatenteel ciclo de histéresis.La
glucosidasade calia de azúcartambiénsecomportacomohisteréticaen su interaccióncon Mn2±
(Legazel al., 1991).
Las isoformas1 y IV de E? pi-unas/rl no muestrancooperatividaden la unión del sustrato,
como se desprendede sus cinéticasmicaelianas(Figs. 37 y 42) y del coeficientede Hill (h) (Tabla
XIV). Es sólo en presenciade efectorescuandoseobservala cooperatividadpositiva. Teng-Leary
y Kohlhaw (1973) describieron una situación similar en la a-isopropilmalato sintasa de
Sa/montillatyphimurium. La enzima exhibia cooperatividadpositiva para el ligamiento de Leu
(retroinhibidor)pero no parael ligamiento del sustrato,lo que permitíadeducirque estabasujeta
a un equilibrio de asociación-disociacióndeterminadopor el efector.
La isoformaHl de arginasamuestrauna clara cooperatividadparala unión del sustrato
como sepuedededucirde su cinéticasigmoidal (Fig. 40) y del valor del coeficientede Hill (Tabla
XIV). De los datos del ligamiento también se desprendeque la isoforma III presenta
cooperaiividadpositivaen el ligamientode atranorinay ácidosevérnicoy úsnico.
La única excepciónde ligamiento con cooperatividadpositiva la presentael ácido úsnico
en su unión a la isoforma1 de arginasa(Fig. 50 A). La representaciónde dobles-inversas(Fig. 50
13) y la semi-logaritmica(Ng. 51 B) confinnanuna unión inespecificaal estimaren 10 el número
de sitios de ligamiento;sin embargo,la cinéticade Scatchardno da una curvacóncavo-convexa
(Fig. Sí A). Hay dos posiblesexplicaciones,una seria que en la isoforma 1 no se produjera
reacciónde asociación-disociaciónen presenciade ácido úsnico o que todas las formas de
proteina mostraranla misma afinidad por el efector. También convienedestacarque la única
inhibición competitivade cualquierisoformaesla producidaporácidoúsnicosobreLa isofroma1
(Tabla XIII)
250
Se han propuestovarios modelosparaexplicar las cinéticascooperativasde las enzimas.
En general, todos ellos se centran en las interacciones entre subunidadesde enzimas
oligoméricas.Sinembargo,cuandose trata de enzimasmonoméricas,como es el caso que nos
ocupa, todosapuntana la existenciade asociaciones-disociacionesde la enzima(Ainslie el al,
1972; Meunierel al., 1974), hecho que se confirma por las cinéticascóncavo-convexasde la
representaciónde Scatchard.
Ricard el al. (1974) proponenun nuevo concepto,el de “transición con memoria,para
explicar el alejamiento del comportamientomicaeliano en algunasenzimas monomerícas.El
conceptose basaen la existenciade dos formas conformacionalesdistintas de la enzima en
equilibrio y no a un mecanismode transiciónlentacorno el descritoporOFagainel al, (1982). La
explicaciónde Ricardel al? (1974),no obstante,no esválida parala isoformaIII de arginasa,ya
que su teoríaimplica cooperatividada nivel cinético,pero queno se manifiestaen los estudiosde
ligamiento.La isoformaIII muestracooperatividadtantoa nivel cinéticocomoen el ligamientode
efectores.
La reacciónde asociación-disociaciónes muy importanteen la regulaciónde la actividad
enzimática,ya que cadauna de las formas presentadiferenteafinidad por el efector. También
resultanecesarioconocerqué proporciónde cadauna de las formas enzimáticasexisteparauna
concentracióndada de efector Frieden y Colman (1967) estudiaronlos cambios de peso
molecularocurridos en la a-isopropilmalatosintasapromovidospor el ligamiento de Leu y
concluyeronque existía un claro predominio de especiesdiméricas frente a monómerosy
tetrámeros,aunqueno llegarona determinarla proporciónde monómeroy polímerosexistentea
cadaconcentraciónde efector.En nuestrocaso,se ha podido calcular la proporciónde formas
monoméricay poliméricas,estimandolos pesosmolecularesde cadaisoformade arginasatras el
ligamiento del efector a diferentesconcentraciones(Tabla XVI). En todos los casos, puede
observarseun claro predominiode la forma nativa sobrelas poliméricas,tras el ligamiento. Los
tipos de agregadosque sucedencon mayor frecuenciason los dímerosy los trímeros, si bien el
tipo de agregaciónes fUnción de tres variables: isoformade arginasa,naturalezadel efector y
concentracióndel mismo(Tabla XVI y Fig. 63).
251
En términos generaies,la unión de ácido evérnico a las isoformas 1 y 11] de arginasa
proporcionalos mayoresnivelesde polimerización,encontrandoúnicamenteun 49,97y 19,24%
de las formasnativas,respectivamente.Parala isoformaIV el menor porcentajede forma nativa
aparececuandose liga acido úsnicoa la proteína.En todos los casos,la atranorinaproducelos
menoresnivelesde polimerización,así comolos oligómerosde menornúmerode subunidades.
El agregadode mayor tamañoencontradoparala isoforma1 correspondea un nonámero,
obtenido tras el ligamiento de ácido evérnico a esta isoforma; el oligómero representasólo un
0,11%de la proteínatotal. Porotra parte,sedetectaun tridecámerotrasla unión de ácidoúsnico
a la isoformaIV, el cual representaun 3, ] 7% de la proteínatotal.
La isoforma III no presenta,en ningún caso, agregadosmayores que trímeros; sin
embargo,no sólo se detectanpolímeros, sino que también picos correspondientesa un peso
molecularinferior ( y 19 kDa) al de la forma nativa de la isoforma Hl. La proporciónde estos
picos oscila entreel 7 y el 67% de la proteínatotal eluida del sistemade HPLC. Además,este
pesomoleculares similar al estimado para la isoforma 1 de arginasa.Este hecho implica que,
posiblemente,el auténticomonómerode arginasaen it? pi-unas/rl poseaun pesomolecularde 18
kDa. La aparición de estaforma tras el ligamiento de atranorina,ácidoevémicoo ácido úsnicoa
la isoforma III estaría induciendo un cambio en la estructuracuaternariade la proteína,
permitiendosu disociaciónen unaformade menortamaño,
La proyecciónfisiológica que puedantenerla existenciay producciónde las diferentes
isoformas,previamentedescritas,esde dificil evaluación.Parasituar estepunto de la discusión,
habríaque hacerlas siguientesprecisiones:
a) En It? prunastri, los sistemasde carboxilaciónque utilizan dióxido de carbono
atmosférico producen primariamentehidratos de carbono, mientras que el producido por
descarboxilacionesinternas,singularmentepor hidrólisis de urea, va a ser empleadoen la síntesis
de fenoles(Blancoe/ al., 1984),principalmenteácidoevérnico.Sobreestabase,la modulaciónde
la actividasdarginasase relacionacon el nivel de ácidoevémicoa través de la activaciónde sus
enzimassubsidiarias~ureasay ornitina descarboxilasa.Hay que hacernotar que, sobrela basedel
número de sitios de unión del ácido evérnico, como ligando, a las diferentes isoformas de
252
arginasa,estefenolesel únicoque muestraespecificidadde ligamiento,siendoactivadormixto de
la isoforma e inhibidor de las isoformasIII y IV. Por tanto, en una secuencia,posiblemente
fungica(Vicentey Legaz, ¡992),descritacomo
- Acetil CoA carboxilasa
Arginina C02 —> - orselinatosíntasa —> Acido cvérnico—> Ornitina...t>
- Orsclinatodépsidohidrolasa1 Argiinsu
2 Orniúnadescaxboxilas&i
el fenol reguladasu nivel como activadorde la isoforma 1 o retroinhibidorde la isoformaIII,
primandounarelaciónu otrasegúnla necesidadfisiológica.
El CO2 producidoporhidrólisis de la ureaes,preferentementealgal, lo cual no invalida la
hipótesisde retroinhibicióndado que cantidadesdiscretasde ácidoevémicopuedenencontrarse
en el citoplasmadel ficobionte.
b) El papel de una isoforma segregablede arginasaes dudoso. Aunque puede
esperarseque un liquen epifito encuentrearginina exógenaen su sustrato, es dificilmente
imaginableque los fenolespuedanactuarcomo efectoresextratalinosde arginasa.Seriamás fácil
consideraresta isoforma como una señal fúngica de tipo parasitario (Molina ej al,, 1993),
segregadaa los espaciosintercelularescomounafunciónexclusivadel estadode rehidratacióndel
talo (Legaz y Vicente, 1991a; Vicente, 1990). En los espaciosintercelulares,los principales
efectoresserianaquellosfenolesque son retenidospor las paredescelulares,principalmenteácido
úsnico(Ahmadjiany Jacobs,1985; Honegger,1986),queactúacomo inhibidor de la enzima.
c) Tantosobrela basede unaarginasacomo efectorde parasitismofiángico, como
sobrela posiblemultiplicidad de formasde una solaenzimaen funciónde su sitio de producción,
la apariciónde isoformasde arginasay el cambio en sus propiedades,podría serun mero reflejo
de estadosdiferentesde desarrollo,Algo semejantefije, ya hace20 años, sugeridopor Martin
(1973) al demostrarque la invertasaexocelularde Parmelia caperata era fundamentalmente
distinta, tanto en su peso molecularcomo en sus propiedadescinéticas, de la sistetizadapor
micobiontey ficobionte aislados.
1<- CONCLUSIONES
254
It Se han purificado cuatro isoformas de arginasade talos de L’vernia prunastrí. Las
denominadasisoformas1 y II sonintratalinas,induciblespor arginina,y han sido purificadas148 y
359 veces,con recuperacionesdel 4,5% y 1,8%, respectivamente.La isoforma III, también
intratalina,constitutiva,ha sido purificada259 vecescon unarecuperacióndel 2,0%.La isoforma
IV, glicosilada,inducible y segregableha sido purificada616 vecescon un rendimientodel 5,6%.
2”. Se han determinadolos pl de las cuatro isoformas, purificadas a homogeneidadpor
electroenfoqueen columnay por electroforesiscapilar. Los valoresde pl obtenidospor el primer
procedimiento,fueron 5,86, 5,83, 6,18 y 5,60 paralas isoformas1, 11, III y IV, respectivamente.
La separaciónpor electroforesiscapilarfue desarrolladaa dos valoresdistintosde pH, 7, 1 y 9,0,
tomándosecomo valor de pl la media de los dos valoresobtenidos.Estasmediasfueron 4,90,
5,00, 5,38 y 4,80 paralasisoformas1, II, III y IV, respectivamente.
3” El análisisde aminoácidosde las cuatroisoformas indica quelas isoformas1, II y IV son
ricas en Asx, Glx, Sery Gly, conteniendode uno a tres residuosTrp por molécula.En cambio, la
isoforma111 esrica en aminoácidosno polares,como Ala, Val y Leu, conteniendonueveresiduos
Trp pormolécula.
4k’. El peso molecular de las diferentes isoformas de arginasa fue estimado por
HPLC-exclusiónmolecular,usandodosconfiguracionesde columna: una columna15K 65000
PWXL o dos columnasZorbax-diol en serie,GF450-GF250.Los valoresobtenidosfueron de lO
kDa parala isoforma1,16 kDaparala 11, 26 k.Da parala 111 y 20 kDaparala IV, siendotodas
ellasmonomé~cas.
5” Sobrelos datosprecedentes,puedeconcluirseque las isoformas1 y U son muy similares,
asi como la IV, salvo que, en esteúltimo caso, la proteínainducible ha sido segregada.Según
Planelles y Legaz (1987) la isoforma IV está glicosilada. La isoforma III, constitutiva, es
fundamentalmentediferentede las inducibles.
255
6< ‘[‘odas las isoformaspresentanun máximode absorciónen el ultravioletade 275-278nm,
queindica la presenciade Tyr
En el espectrosimultáneode excitación-emisiónde fluorescencia,todas las isoformas
presentanun máximo de emisión a 355 nni. La isoformaIV presentaun máximo adicionala 305
nm. Utilizando luces monocromáticasde excitaciónde 257 nm, 275 nm ó 295 nm, se obtienen
maximosde emisión entre345 y 349 nm, 342-346nm y 351 nm, respectivamente.Al excitar la
isoformaHl con luz de 275 nm, apareceotro máximo secundariode emisión a 288 nm, indicativo
de Phe
8”. Los tres fenolesmayoritariosde It? pi-unas/rl hansido eficientementeseparadosporHPLC
de fase reversa,usandouna columna Nucleosil 5C8 y como fasemóvil acetonitrilo:agua:acético,
isocrático.La detecciónfue llevadaa cabousandoun detectorde longitud de ondavariable,a 280
nm para atranorínay ácido úsnico y a 270 nm para el ácido evérnico, coincidentescon sus
máximosespectrosde absorcion.
9”. Medianteprotocolosde extraccióndiferencia]y análisisporHPLC, sehandeterminadolas
concentracionesaproximadasde los tres fenoles que pueden tener accesoa las diferentes
isoformasde arginasa,paraprocederal estudiode supapelcomoefectoresenzimáticos.
10”. Lasisoformas1 y II de arginasason enzimasmicaelianas,convaloresde Km paraarginina
de 1,25 mM y 3,0 mM, respectivamente,determinadospor el procedimientográfico de Hanes,
aunquetambién se calculó de la representacióndirecta [5] frente a V0, y de acuerdocon el
procedimientode Eisenthal-Cornish-Bowden.La isoformaHl muestrauna cinéticasigmoidal de
saturaciónporsustrato,indicativade alosterismo,con un valor ~o,s paraargininade 4,5 mM.
256
Los diferentesfenolesmuestranejerceraccionesdistintassobrelas diferentesisoformasa
las concentracionesde efector ensayadas,La isoforma 1 sufre activación no competitiva por
atranorina,activación mixta por ácido evérnico e inhibición competitivapor ácido úsnico. La
isoforma III es inhibida por los tres fenoles.Atranorinase comportacomo activadormixto y los
ácidosevérnicoy úsnicocomoinhibidoresno competitivosde la isoformaIV.
12” La unión del sustrato.arginina,a las isoformas1 y IV serealizasin cooperatividad,dada
su naturalezamicaelianaque proporcionaun valor de coeficientede Hill cercanoa la unidad. La
unión de los diferentesefectoresno alteró sensiblementeestaconducta, salvo la unión de la
atranorinaa la isoformaIV, que aumentael valor de h a 2. La unión de la argininaa la isoforma
III se lleva, sin embargo,a cabocon un gradode cooperatividad(h) de 4,4, siendosensiblemente
incrementadopor atranorinay ácidoúsnicoy débilmenterebajadoporácidoevérnico.
l3~’ La estimacióndel númerode sitios de unión pormoléculade proteina(n) de cadauno de
los ligandos(efectores)a las distintasisoformasde arginasaindica que sólo el ácidoevérnicoes
capazde unirse a sitios especificosen las tres isoformas,sobrela basedel bajo númerode sitios
de unión, que han sido estimadosen 4, 8 y 5 paralas isoformas1, III y IV, respectivamente.El
ligamiento de la atranorina a la isoforma 1 también se lleva a cabo por 4 sitios de unión
específicos.Sin embargo,estamismaatranorinase liga inespecíficamentea las isoformasIII y IV,
por 26 y 23 sitios de unión, respectivamente.El ácido úsnico actúa como ligando inespecífico
paralas tres isoformas,con 10 sitios de unión parala isoforma1, 26 parala III y 32 parala IV.
14” Se ha calculadola proporciónde formasmonoméricasy poliméricastrasel ligamiento de
los efectores.En todos los casos,predominala forma nativa sobrelas poliméricas.Los tipos de
agregadosqueaparecencon mayorfrecuenciason dímerosy trímeros.
257
Paraun mayor seguimientode las conclusiones,seadjuntala Tabla XVII, resumende los
datosnuméricosque lasjustifican.
1.- PURIFICACION DE LAS ISOFORMAS DE ARGINASA
ISOFORMA
1
II
III
IV
VECES
148
359
259
616
RENDIMIENTO (%)
4,5
1,8
2
5,6
2.- PUNTO ISOELECTRICO DE LAS ISOFORMAS DE ARGINASA
ISOFORMA pl porelectroenfoque
en columna
5,86
5,83
6,18
5,60
3.- COMPOSICION DE AMINOÁCIDOS DE LAS ISOFORMAS DE ARGINASA
ISOFORMA AMINOACIDOS(n0 de residuos)
Ricasen Asx, Cix, Sery Gly
3
Rica en no pohresAla, Val y Leu 9
1-2
pI porE.C.
pH7
5,33
pH9
II
III
IV
4,50 4,9
5,70
4,80
5,07
4,80
5,38
4,80
Trp
II
III
IV Ricaen Asx, Glx, Sery Gly
258
4.- PESO MOLECULAR ESTIMADO EN HPLC POR EXCLUSION
MOLECULAR DE LOS ISOFORMAS DE ARGINASA
1 SOFORMA COLUMNA COLUMNAS
TSK 65000PWXL ZORBAX-DIOL GF4SO-GF250
l8
11
III
IV
18
16
26,5
20
ib
26
20
Todasson monómeros
5.- ABSORCION UV DE LAS ISOFORMAS DE ARGINASA
ISOFORMA
1.11
IV
MAX. ABSORBANCIA
275-278
275-278
275-278
6.- EMISION DE FLUORESCENCIA DE LAS ISOFORMAS DE ARGiNASA
1 SOFORMA MAX. EMISION ESPECTROSIMULTANEOFLUORESCENCIA
(EXCITACION 275) (EXCITA ION 295) (EXCITACION 257)
346. 305
345, 305, 288III
351, hombro 416
331, 351, 397-401
349, 302
349
355
355IV 337, 306 331, 351, 401 345, 290 355, 305
259
>7.- ABSORCION LV DE FENOLES
FENOL
ATRA.NORINA
ACIDO EVERNICO
ACIDO USNICO
MAXIMO ABSORBANCIA
280
270
280
HPLC fasereversa;columnaNucleosil5C8, isocrático 1 ml>min1 y fasemóvil agua ácido
acético(99:1, v/v)/acetonitrilo(30:70, y/y).
9.- CONSTANTES CINETICAS DE LAS ISOFORMAS DE ARGINASA
Vmax
(pmol amoniomin’)
1 sofornia
Directo
Km
(nál)
1,5 2,49
1 Eisenthal-Cornish-Bowden
Hanes
III Directo
Directo
IV Eisenthal-Cornish-Bowden
8.- SEPARACION DE FENOLES
4,9
1,25
5,25
2,79
2,12
3,0
4,7
4,45
4,0Hanes 3,0 4,2
260
10.- VARIACION DE LAS CONSTANTES CINETICAS EN PRESENCIA DE
FENOLES (Km (ap) Vmax(ap))
Atranorina
“lo
activador
no competitivo
4,90
inhibidor
0,96
activador
mixto
Ac. evémico
0,68
activador
mixto
4,40
inhibidor
3,16
inhibidor
no competitivo
vmpx
Ac. úsnico Atranorin
a
6,643.40
inhibidor
competitivo
4,50
inhibidor
3,05
inhibidor
no competitivo
0,12
3,95
(apjfitmol_amoníomiiv1)
Ac. evémico Ac, úsnico
2,75
0,06
3,69
3,32
0,25
3,39
II.- COEFICIENTE DE HILL (b)
Isoforma En ausenciade efector
III
lv
1,42
4,40
1,24
ALranorina
1,55
5,15
1,94
En presenciade efector
Ácido evérnico
1,65
3,75
1,25
Aedo Osnico
0,93
5,74
1,20
Isoforma
III
IV
261
12.- NUMERO DE SITIOS DE UNION DE LOS DISTINTOS LIGANDOS A LAS
ISOFORMAS DE ARGINASA
Númerositios (n)*
Atranorina Acido evérnico Acido úsnico
4
26
23
4
8
5
1.0
26
32
* Estimadode la representaciónde dobles-inversasde los datosde ligamiento
13.- EFECTO DEL LIGAMIENTO DE LOS FENOLES A LAS ISOFORMAS DE
ARGINASA
Polimerizaciones a dimeros y trimeros principalmente,
Isoforma
III
IV
Vi- BIBLIOGRZ4FLI
263
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