la tecnologia del DNA ricombinante

La tecnologia del DNA ricombinante

Finalità: capire che cos'è la ricerca scientifica nell'ambito della biologia molecolare.Capire il metodo di lavoro del ricercatore, ed i suoi risultati.Applicare il criterio della scientificità all'analisi dell'informazione fornita dai mass media e giornali.Migliorare la propria cultura scientifica per operare scelte consapevoli sul proprio futuro.

requisiti

Sapere che cos'è il DNA e a che cosa serve.

Il DNA è comune denominatore della vita.

Obiettivi specifici

Struttura e funzione dei plasmidiFunzione degli enzimi di restrizioneVettori di clonaggioClonazione del DNACostruzione di una libreria genomicaTecnica della PCR

Iniziamo dalle immagini

Per capire le cose troppo grandi o troppo piccole i ricercatori usano i modelli.

Che cos'è per te un modello scientifico?

È un oggetto a sfere e bastoncini?

Che cos'è per te un modello scientifico?

È un disegna 3D?

Che cos'è per te un modello scientifico?

È un disegno 3D con didascalie?

Che cos'è per te un modello scientifico?

È un'immagine al microscopio?

Che cos'è per te un modello scientifico?

È una sequenza di codice genetico?

Che cos'è per te un modello scientifico?

È un'immagine al microscopio di cromosomi?

Che cos'è per te un modello scientifico?

È il pattern di una elettroforesi?

Che cos'è un modello scientifico?

È l'immagine di molecole di DNA al microscopio?

Che cos'è un modello scientifico?

È una tecnica per colorare i cromosomi?

Che cos'è un modello scientifico?

È la rappresentazione dei legami idrogeno tra le coppie di basi?

Che cos'è un modello scientifico?

È una provetta contenente una soluzione di DNA?

Chi di Voi ha mai visto una provetta Heppendorf?

Che cos'è un modello scientifico?

Il modello nasce in laboratorio

I laboratori di biologia molecolare sono molto complicati!

Che cos'è un modello scientifico?

Il microscopio elettronico permette l'osservazione 3D dei cromosomi.

I cromosomi esistono...!!!

Che cos'è un modello scientifico?

La ricerca è anche creatività!!

I cromosomi hanno delle bande...perchè?

Prepariamo una libreria.

Preparazione di librerie Per preparare una library genomica occorre: a) Isolare il DNA genomico b) Digerirlo “parzialmente” con gli enzimi di

restrizione c) Ligare i frammenti di restrizione in un vettore

adatto d)Trasformare delle cellule ospiti con i prodotti di ligazione

Ripercorriamo ancora il metodo...

Aprire il PDF LA LIBRERIA GENOMICA

MOSTRARE IL MODELLO PAG.13,14COSTRUZIONE DI UNA LIBRARY.

È il momento del plasmide...

Il plasmide è un anellino di DNA, che posseggono alcuni batteri, come l'Escherichia coli.

La trasformazione è fatta su Escherichia coli mediante un plasmide modificato

Il plasmide modificato contiene il gene per la Green Fluorescent Protein (GFP), preso da una medusa, e che conferisce al batterio Escherichia coli la fluorescenza, solo però in presenza di arabinosio (induttore).

Nel plasmide c'è anche il gene che dà la resistenza all'ampicillina (è un antibiotico ); cioè i batteri trasformati saranno fluorescenti, in presenza di arabinosio,e saranno anche resistenti all'ampicillina.

I batteri non trasformati moriranno in presenza di ampicillina.

Il batterio è una creatura vivente e quindi si oppone all'inserimento di qualcosa di estraneo nel suo organismo.

Entrando in contatto con il CaCl2 però, il plasmide viene attratto dalla membrana dell'Escherichia.

Questo perché la polarità della membrana viene modificata dal CaCl2 e il plasmide è attratto da una forza elettrostatica verso il batterio.

Questo però non basta per l'introduzione del plasmide all'interno dell'Escherichia Coli.

Si effettuerà così uno " shock termico" che indebolirà la membrana dell'Escherichia coli, formando come delle " crepe ", permettendo al plasmide di entrare.

Questo "shock termico" si effettuerà con lo spostamento del batterio da un ambiente freddo (0°C ghiaccio in fusione) a un ambiente più caldo 42°C non più caldo, poiché una temperatura troppo elevata ucciderebbe il batterio).

Tratto da: life learning Center

A questo punto il batterio è pronto a ricevere il plasmide.

Dopo di che è necessario che il batterio possa " riprendersi" da questo shock e quindi va messo in un ambiente della sua temperatura ideale: 37°C, la temperatura interna del nostro corpo.Infatti il batterio di Escherichia coli fa parte della nostra flora intestinale.

Ancora un modello di plasmide

Il plasmide viene tagliato...si dice che viene linearizzato

Il DNA bersaglio si salda con il plasmide

Questo è un plasmide ricombinante.

Il modello è sempre lo stesso.

Il plasmide si lega al DNA bersaglio.

Dunque com'è fatto un plasmide?

Origine di duplicazione Marcatore A per la resisitenza ad

antibiotico Marcatore B per lo screening delle

colonie ricombinanti polylinker

Altri vettori di clonaggio

Aprire file pdf Clonazione del DNA Andare a pag. 1 Slide 4

Il concetto di enzima di restrizione

La conquista che ha reso possibile la tecnologia del DNA ricombinante, è stata la scoperta degli enzimi di restrizione.

Sono enzimi prodotti da batteri per difendersi dalle infezioni virali, che tagliano le molecole di DNA a livello dei siti di restrizione.

Questi enzimi generano frequentemente frammenti di DNA con terminazioni a singolo filamento complementari dette sticky_ends.

Le estremità sticky sono vantaggiose poiché sono coesive.

Modello 3D di EcoRI

Che cos'è un'enzima di restrizione?

È una proteina che taglia il DNA.

La PCR: alta tecnologia per la Scienza

Nel 1989, è stato messo appnto un procedimento semplice per produrre in numero illimitato copie di segmenti di D.N.A. , se si conosce almeno una parte di sequenza di D.N.A. da clonare, il clonaggio può risultare più facile amplificando i segmenti di D.N.A. con un processo chiamato reazione polimerasica a catena.

Il campione di D.N.A. del quale si vogliono ottenere copie può essere puro o far parte di un miscuglio di materiali biologici.

In laboratorio vengono sintetizzati degli oligonucleotidi primer, ciascuno complementare a una sequenza di una delle due catene del segmento di D.N.A. da clonare, che hanno la funzione di iniziatori della replicazione. Il campione di D.N.A. viene posto in una soluzione contenente D.N.A. polimerasi, nucleotidi in abbondanza e primer.

La soluzione viene fatta scaldare per breve tempo in modo che i legami ad idrogeno si possano spezzare e filamenti di D.N.A. separare. Quando poi la soluzione si raffredda gli oligo-nucleotidi si attaccano alle loro sequenze complementari e la molecola di D.N.A. polimerasi continua la sintesi del nuovo filamento. Dal momento che i due filamenti vengono copiati contemporaneamente alla fine del ciclo si avranno due copie del segmento compreso tra i due primer.

L’operazione si ripete un numero di volte desiderato considerando che ad ogni ciclo il numero delle copie aumenta esponenzialmente.

Schema della PCR

Andare al file PDF: diventare un biotecnologo Pag.17 Slide tratta da: “ dai geni ai Genomi”