Állatkísérletek az orvostudományban- In vitroweb.szote.u-szeged.hu/expsur/allatkiserletek...Az...

ÁÁllatkllatkíísséérletek az rletek az orvostudomorvostudomáánybannyban-- In vitroIn vitro

modellek modellek ééllőő áállatok llatok helyetteshelyettesííttéésséérere

Tuboly EszterSebészeti Műtéttani Intézet

Az alternatAz alternatíívváák szk szüükskséégessgesséégege• Élő modellek kiváltása

– Társadalmi megítélés, az igény egyre nő– Szervezeti fellépések– Törvényi szabályozás– Költségek, ellenőrzés

•• 2013. 03.112013. 03.11--ééttőől l Európai Unió megtiltotta a kozmetikai ipar számára folytatott állatkísérletek végzését

– SEURAT-1 (50 millió €)

•• In vitro modellek elIn vitro modellek előőnyeinyei

– Csak a vizsgált mechanizmusra fókuszálnak– Egyszerűbb kezelni, kisebb a kockázat, felelősség– Sokszor szükségesek a publikáláshoz– Időmegtakarítás, elemszám

•• HHáátrtráányoknyok

– Nem feltétlenül költséghatékonyabb– Nem igazán életszerű– Sejttenyészet: fertőződés (mycoplasma)– Krónikus, szisztémás reakciók vizsgálatára nem

alkalmas

A 3A 3 R:R:

• Replacement • Reduction• Refinement

Russell and Burch

A helyettesA helyettesííttéés egyre hats egyre hatéékonyabbkonyabb

LehetLehetőősséégek gek ééllőő áállatmodellek helyettesllatmodellek helyettesííttéésséérere

• Csak kémiai komponensek• Szöveti homogenizátum,

izolált organellum • Ex vivo kísérletek• Sejt-és szövetkultúrák• Mesterségesen növesztett

szövetek, szervek• Invazív beavatkozás

helyett kezelés

• Biokémiai tesztek• Immunkémiai technikák (bakteriális

toxinok azonosítására)• Szerv, szövet vagy sejtkultúrák

(biokémiai kutatások céljára)• Mikroorganizmusok (karcinogén ill.

mutagén anyagok tesztelésére)• Magasabbrendű növények• Néhány metazoa parazita• Komputer szimulációs modellek

SejttenySejttenyéésztsztééss• 1907 óta létező technika• ’50-es évektől kezdve elterjedt eljárás

– Áttörések: antibiotikumok, médium, tripszin

• Társaságok, sejt-és szövetbankok• Izolált-és mai napig fenntartott

sejtvonalak (HeLa)• Tenyésztő eszközök rohamos fejlődése

(gyógyszergyártás)• Gén-és biotechnológia alappillére

(klónozás)• Rákkutatás (nanotechnológia)• Őssejt-és génterápia (etikai kérdések)• Szintetikus biológia (mesterséges

szervek, programozott sejtek)• Virológia (vakcinák készítése)

VizsgVizsgáálati lehetlati lehetőősséégekgek• Az adott sejt életfolyamatainak

nyomonkövetése (sejtanalízis)• sejt-sejt kölcsönhatások, a

sejtkommunikáció vizsgálata (neuronok)• a sejtek különböző kémiai anyagokra adott

válaszának analízise (gyógyszerfejlesztés)• különböző sejteredetű fehérje termékek

előállítására (biotechnológiai ipar) • “tissue engineering” céljára

• Sejttenyészetek eredete:• szöveti explantok ("explant kultúrák") • sejtszuszpenzió ("szuszpenziós kultúrák")

SejttenySejttenyéészetek tszetek tíípusaipusaiPrimer tenyészetek:

• embrionális ill. felnőtt szövetből• korlátozott ideig tarthatók fenn• élettartamuk véges (hetek,

néhány hónap)

• előnyük:– a sejtek nem tekinthetők módosított

ill transzformált sejteknek, mivel a tenyésztés kezdő lépéseként alkalmazott enzimatikus, vagy mechanikus disszociáción kívül a sejteket más hatás nem éri.

• hátrányuk: – a kultúrák korlátozott élettartama– minden egyes preparátum kicsit

eltér egymástól, teljesen homogén idegen sejtet nem tartalmazó tiszta tenyészetről nem beszélhetünk.

Sejtvonalak:

• abnormális, gyakran transzformált sejtek

• homogén sejtpopuláció• élettartamuk korlátlan• Leggyakrabban rákkutatási

célok• Könnyebb velük dolgozni, már

nem kell izolálni

Ami nAmi néélklküül nem megyl nem megy……• Laminaris fülke• HEPA filter - steril levegő-áramot biztosít • Horizontális

– A levegő horizontálisan, a tenyésztő irányába áramlik– veszélyes anyagokkal való munkára nem alkalmas

• Vertikális– A levegő felülről lefelé áramlik– veszélyes anyagokkal való munkára ez a típus a

legalkalmasabb• CO2 Inkubátorok (5-10 %, 100%-os páratartalom)• Fáziskontraszttal ellátott invert mikroszkóp

• Speciális tápfolyadék (médium)

• Ionikus homeosztázis

• Vitaminok, kofaktorok, fémek

• Fehérjék, lipidek• Energia• Szérum• Bakteriocid-fungicid

koktél

• Ablaktalan, fertőtlenített helység (meszelés)

• Steril öltözet• UV-védelem• Speciális

tenyésztőedények• Saját eszközök• Vízfürdő,

hűtőszekrény• 70%-os alkohol• Dezinficiens

• A tenyésztőedények felületének kezelésére használjuk:

• Kollagen (kötőszöveti fehérje)• Fibronectinek (sejtfelszíni és plazma fehérjék)• Laminin (heteromer glycoprotein)• Poly L-lysine (erősen pozitív töltésű polikationos

polimer)• Poly-L-Ornithin (polikationos poliaminosav) • A tenyésztést segítő, a sejttenyésztő oldatokhoz

adott szuplementumok:• Foetal bovine vagy calf serum• Növekedési faktorok • Insulin

Alkalmas sejttAlkalmas sejttíípusokpusok• Általában bármilyen sejt, a legmacerásabbak az

izom-és idegsejtek• Vérsejtek: a keringési rsz.-be kerülve már nem

osztódnak, rövid élettartam• Fibroblaszt (kötőszövet): jól szaporodnak,

generációs idejük rövid,gyorsan nőnek• Epithel (hám): egyszerű dolgozni velük,

gyorsan nőnek• Embrionális sejtek: jól szaporodnak,

kényesebbek• Sejtvonalak: már régóta fenntartott sejtek,

rengeteg információ, már izolált sejtek (HeLa, HEK, CHO)

SejtkultSejtkultúúra megvra megváálasztlasztáásasa• Izolálás: szerv kiválasztása sejtciklus,

sejtorganellum, sejtkapcsolatok, mozgás alapján, esetleg anyagi és metodikai korlát miatt

• Konkrét állatmodell mellé in vitro bizonyítékok• neonatalis v. adult sejtek,embrionális sejtek, esetleg

hibridómák, transzformált sejtek• Kezdeti sejtszám, életképesség ideje, növekedés

üteme különböző• A felnőtt sejtek csak adherens módon képesek

növekedni: laminin, vagy kollagén plate, coated-plate (akár recept alapján)

• Szövetek szétválasztása sejtekké: emésztőenzimekkel vagy mechanikusan (hőfok, időtartam!), nyírőerő minimalizálása (potter)

• Mosás, szűrés• Sejtek médiumba ágyazása, kezelése • Sejtnövesztés inkubátorban• Sejtszámolás időről-időre (ePetri)• Minden típus esetén szükséges a rendszer ki-

titrálása• Kevert kultúrák esetén figyelem a fibroblasztokra• Passzálás • Viabilitási-tesztek• Proteomika, fagyasztás-felengedés (DMSO!)

A sejttenyA sejttenyéésztsztőő rréémmáálmalma……Befertőződés

• Kémiai anyagok által (lejárt médium)• Biológiai ágensek: baktériumok, gomba

(mycoplasma-tesztek, alkohol, szájmaszk)• Médiumban indikátor: fenolvörös: metabolikus

aktivitást jelez a pH változása• Fertőzésgyanúnál ki kell dobni a rendszert és

mikrobiológiai vizsgálatot kérni• Újra kell fertőtleníteni a helyiséget és az eszközöket• Autokláv, inkubátor vízcseréje, alkohol• Félévente speciális takarítás ajánlott

ŐŐssejtek tulajdonsssejtek tulajdonsáágaigai

• képesek folyamatosan osztódni differenciálódás nélkül• stabil, diploid kromoszómakészletük van• külső hatásokra differenciálódhatnak és képesek

transzdifferenciálódni is, ez azt jelenti, hogy például a vérképző őssejtek képesek más ekto vagy endodermális sejttípussá alakulni, vagyis akár pluripotens is lehet

• telomeráz enzim megakadályozza a rövidülést – képes megnyújtani a kromoszómák végét: ennek az enzimnek az aktivitás az őssejtekben az idővel csökken, és az osztódással is

• majdnem halhatatlanok – az oxidatív folyamatok, genomiális DNS halmozódó mutációi, helyreállítómechanizmusok károsodása miatt ők is „öregszenek”

Honnan kaphatunk Honnan kaphatunk őőssejteket?ssejteket?

In vitro megtermékenyítés után fel nem használt embriók – akár totipotens

Elvetélt magzatokból – ivarmirigyekből

Szövetekből – korlátozott differenciálódási képességűek • vérképző őssejtek - csontvelőben találhatóak, felszíni markereik

alapján megtalálhatóak és izolálhatóak• mezenchima őssejtek-köldökzsinór

– Egyházi engedély• idegi őssejtek - az agykamrákat bélelő hámrétegben található• izom őssejteket - valószínűleg az izomrostokhoz szorosan kötődő

ún. kísérő (szatellita) sejtek között• Alig jelölődnek meg Hoechst 33342-es nevű fluoreszcens festékkel• Áramlási citométer segítségével izolálhatóak

SzSzöövettenyvettenyéésztsztééss• Sejtek szövetekként történő növesztése egy

speciális vázon (scaffold)• Célja: pótolni a többé már nem funkcióképes

szöveteket, javítani az adott szerv funkcióját• Regeneratív medicína-szintetikus biológia-őssejt

terápia • Fontos az immunrendszer válaszának

minimalizálása (graft vs. host) így a legjobbak az autológ sejtek

• Alkalmaznak allogén sejteket is (immunszupresszió, MHC mutációk)

• Xenogén sejtek (sertés, anti-inflammációs gének KI- a jövő útja?)

ScaffoldScaffold• Hálózatos polymer, különböző anyagokból

készülhet (protein, poliszacharid, polipeptid)

• Lehetővé teszi a sejtek számára a növekedést, átjárható a tápanyagok számára, ECM képes rajta létrejönni

• Meg kell tartania a szövet eredeti 3D-s struktúráját

• Biztosítania kell a sejtek számára megfelelő mikrokörnyezetet

• Megengedi a sejtek migrációját

Egy ideEgy ideáális scaffoldlis scaffold……• 3D• Keresztkötéseket tartalmaz• Pórusokat tartalmaz• Biológiailag lebontható• Megfelelő kémiai körülmények uralkodnak a

felszínén• Bírja a mechanikai terhelést• Biokompatibilis• Elősegíti a természetes gyógyulási folyamatokat• Hozzáférhető• Nagyüzemben gyártható

Leggyakoribb tLeggyakoribb tíípusokpusok

• Polymerek– Kollagén– Laminin– Fibrin– Decellularized matrix (szív)

• Kristályos anyagok– Hydroxyapatite– Kálcium-foszfát– Bioglass

Elkopott porcok helyettesElkopott porcok helyettesííttéésese

– Porcsejtek– Kollagén váz– Nem igényel kiterjedt

érhálózatot

CsontnCsontnöövesztvesztééss

• Őssejtek csontsejtekkétörténődifferenciálódásával– A parancs növekedési

faktor függő• Nem szabad túl

nagynak lennie a váznak, különben a sejtek nem kapnak elég oxigént

3D Calcium- scaffold

BBőőrnrnöövesztvesztééss• Kollagén-kitozán,

vagy hialuronsav scaffold

• Egyszerre egyféle sejt, 3 sejtréteg

• Égési sérülteknél siker

Cukorbetegek Cukorbetegek ßß--sejtjeinek psejtjeinek póótltláásasaIn vivo Islet of Langerhans in pancreas

MestersMestersééges ges vvééredredéényeknyek

• By-pass műtéteknél használatos http://popularmechanics.com/popmec

h/sci/tech/9805TUMDOM.html

SzSzíív regenerv regeneráácicióójaja

• Szívizomsejt, véredények

• Felnőtt szívizomsejtek tenyésztése nehézkes

• Természetes scaffold (decellularized matrix)

• Sokféle sejttípus, bonyolult terület

LehetLehetőősséégek mgek máájbetegeknekjbetegeknek

BioprintingBioprinting• Feltaláló: Forgách Gábor (Missouri Egyetem)• Hidro-gél alapú vázra élő sejtek felvitele• Tintasugaras nyomtatófej juttatja rá a sejteket,

több rétegben, körben is (3D)• 2 nyomtatófejet használ: sejtek

nyomtatása+gélszerű, tápanyagokban gazdag médium adagolása

• Kalibráció: lézerrel történik, szoftver irányít• Véredények by-pass műtétekhez• Távolabbi célok : teljes szervek nyomtatása,

bőrpótlás, mint rutin kezelés

SkingunSkingun

In vitro In vitro meatmeat

KKööszszöönnööm szm széépen!!!pen!!!