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MARKERDEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN
Einteilung nach Ausgangsmaterial1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau2. RNA – nach Umschreiben in cDNA
Einteilung nach der verwendeten Technik
1. Einsatz von Sonden2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR)
MARKER-Typen
1. PHÄNOTYP: meist unbekannte Art von
Unterschied
2. RFLP: restriction fragment length
polymorphism
3. AFLP: amplified fragment length
polymorphism
4. SSLP: simple sequence length polymorphism
5. SSR: simple sequence repeat (Mikrosatellit)
6. SNP: single nucleotide polymorphism
7. CAPS: cleaved amplified polymorphic
sequences
8. RAPD: random amplified polymorphic DNA
2. RFLP
Unterschied im Restriktionsmuster der Genome zweier Individuen
Gelanalyse
Diese unterschiedlichen Fragmente können wegen der Vielzahlder Restriktionsfragmente aber nicht „gesehen“ werden.
Zusätzliche Restriktionsschnittstelle
Mit einer Hybridisierungssonde kann man Mutationen nachweisen
Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
2. RFLP
2. RFLPSONDE
Sonde = DNA-Fragment aus einem Bereich des Genoms der den Polymorphismus überdeckt oder an diesen angrenzt
Autoradiogramm
2. RFLPERSTELLUNG
1. Klonierung eines beliebigen (genomischen) Fragments = Sonde
2. Restriktionsverdau genomischer DNA der beiden Individuen mit einem identischen Satz von Restriktionsenzymen
3. Gelelektrophorese und Blotten der verdauten DNAs
4. Hybridisierung des Blots mit der radioaktiv markierten Sonde
5. Autoradiographie und Identifizierung eines Restriktionsverdaus, der einen Poly-morphismus zeigt
3. AFLPamplified fragment length polymorphism
Grundsätzlich: Unterschied im Restriktionsmuster der
Genome zweier Individuen werden ausgenutzt
IM GEGENSATZ ZUM RFLP1. werden Restriktionsenzyme eingesetzt, die
neben 6 auch nur 4 bp erkennen, d.h. die durchschnittliche Fragmentlänge sinkt von ca. 4000 auf etwa 250 bp. Statt Agarosegelen werden Polyacrylamidgele Elektrophorese eingesetzt.
2. wird statt der „Sonden-Technik“ das „Display“-Prinzip verwendet, d.h. statt aller möglichen Restriktionsfragmente (16x mehr als beim RFLP) wird durch ein entsprechendes Verfahren nur eine Teilmenge der Fragmente erzeugt, deren Zahl sich bei der Gelelektrophorese gerade noch auftrennen lässt. Aus diesem Grund wird keine Sonde benötigt.
Display-Verfahren, auf DNA und RNA anwendbar
3. AFLP
3. AFLP „SPEZIFISCHE PCR“
PCR Primer 1 <——— AC GACGT GATT..
....TGTC TAA NNNNN.....NNNNN CTGCA CTAA.. ..ACAG ATT NNNNN.....NNNNN GACGT GATT..
TGTC TAA TC ———> PCR Primer 2
[MseI] [PstI]
3. AFLP „SPEZIFISCHE PCR“
Über- Anteil Genom Pflanzehang ampl. 106 bp
1 1/4 2 Bakterien 2 1/16 8 Bakterien 3 1/64 32 Hefe 4 1/256 128 Arabidopsis 5 1/1024 512 Reis 6 1/4096 2048 Zuckerrübe 7 1/16384 8192 Gerste 8 1/65536 32768 Weizen
4. SSLP simple sequence length polymorphism
- PCR-gestützte Markertechnik (display-Technik)
- Zu untersuchende Bereich wird mit sequenz-spezifischen primern
überdeckt und mittels PCR amplifiziert
- Die enstehenden Fragmente werden mit Agarose-Gel-Elektrophorese
in Gegenwart von Ethidiumbromid nach Größe aufgetrennt und
verglichen.
4. SSLP
Insertion
Autoradiogramm
Primer I
Primer I
Primer II
Primer II
(Analog Deletion)
5. SSRsimple sequence length polymorphism
Unterschiedliche Zahl von Wiederholungen einfacher Di- und Trinukeotidsequenzen
(TG)10
(TG)12
ENTSTEHUNG„Stottern“ der Polymerase bei der Replikation
VORTEILSchnelle Veränderung der Anzahl von Wiederholungen solcher Sequenzen in evolutionär kurzen Zeiträumen, d.h. auch Nutzpflanzenvarietäten zeigen noch Polymorphie
5. SSRIDENTIFIZIERUNG
1. Anlegen einer Bibliothek kurzer genomischer
Fragmente in E. coli Plasmiden
2. Übertragen der Kolonien auf
Nylonmembranen
3. Hybridisieren mit SSR-Oligonukleotiden,
wobei selbstkomplementäre Sequenzen
([CG]n und [AT]n) ausgeschlossen sind
4. Sequenzieren positiver Klone
5. Design und Synthese von PCR-Primern
6. Überprüfen, ob Polymorphie des
amplifizierten Fragmentes für die
interssierenden Varietäten vorliegt
6. SNPsingle nucleotide polymorphism
Unterschied in einem einzigen Basenpaar
A C
VORTEIL
SNPs sind häufig auch zwischen nahe verwandten
Individuen (im Humangenom ca. 0,1% aller
Basenpaare)
6. SNP
Fluorescence resonance energy trasfer (FRET)Temperaturabhängigkeit
6. SNP
Fluorescence resonance energy trasfer (FRET)Temperaturabhängigkeit
A B
C
7. CAPSCleaved amplified polymorphic sequences
AC
neue Schnittstelle
primerGenom 1Genom 2
1. PCR-Amplifizierung2. Restriktionsverdau3. Gelelektrophorese
Genom 2 Genom 1
Gelektrophorese
8. RAPDrandom amplified polymorphic DNA
Unterschiede bei der Bindung von Oligonukleotiden willkürlicher Sequenz und der daraus resultierenden unterschiedlichen Amplifizierbarkeit kurzer genomischer Fragmente
GenomIndividuum 1 GenomIndividuum 2
Gelanalyse
2. Diagnostik und Pflanzenschutz- Viroide
- Viren
- Bakterien
- Pilze
Molekulare Diagnostik und Pflanzenschutz1. Nachweis der Pathogenfreiheit für kommerzielle Zwecke
2. Absicherung der Pathogenfreiheit im Ausgangsmaterial
für Züchtungszwecke
3. Allgemeine phytosanitäre Überwachung
Ökonomische Aspekte der Methodenwahl1. Zeitaufwand, besonders Lohnkosten
2. Automatisierbarkeit
3. Materialkosten
1. Viroide
Ein Viroid ist ein infektiöses Molekül, das aus einer einzelsträngigen,
zirkulären (nur 150–400 Nukleotide) RNA besteht.
Dem Viroid fehlt vor allem die Proteinhülle eines normalen Virus. Viroide
kommen in der Natur als Krankheitserreger von Pflanzen vor
(Pflanzenpathogen).
Im Gegensatz zu Viren tragen Viroide keine Gene. Sie codieren also keine
Proteine, weshalb Viroide bei ihrer Replikation und ihrem Transport
ausschließlich auf Enzyme der Wirtspflanzen angewiesen sind. Der
Infektionsmechanismus der Viroide ist bisher unklar. Allerdings wurden
Nukleotidsequenzen in der Wirtspflanzen-DNA gefunden, die komplementär
zu den Sequenzen der Viroide sind. Hierbei wäre also denkbar, dass das
Viroid selbst als primärer Pathogenitäts-Effektor wirkt. Alternativ wird
diskutiert, dass Viroide ihre Pathogenität durch "RNA silencing" erlangen.
1. ViroideDie meisten Viroide tauchen in Kulturpflanzungen auf bzw. sind dort am
meisten verbreitet. Ein gutes Beispiel ist das
Kartoffelspindelknollen-Viroid (Abk. PSTVd),
welches Kartoffeln, Tomaten und viele andere Pflanzenarten befällt und großen wirtschaftlichen Schaden anrichtet.
1. Viroide
Molekulare Nachweismöglichkeit:
- Bereits 1981 wurde Viroid-RNA (als cDNA) in einem Vektor kloniert
und nach radioaktiver Markierung als Hybridisierungssonde verwendet.
- Ursprünglich hat die Notwendigkeit der radioaktiven Markierung
die Anwendung in breitem Massstab verhindert.
- Heute ist nicht-radiokative Markierung kein Problem mehr, der finan-
zielle Aufwand hat solche und ähnliche Methoden bisher jedoch
nicht zum Einsatz kommen lassen.
1. Viroide
Praktische Nachweismöglichkeit: bidirektionale Elektrophorese
nativ denat.
Largely internally base-paired viroid RNA
1. Viroide
Bidirektionale Gelektrophorese mit nachfolgender Silberfärbung
hat dieselbe Empfindlichkeit wie Hybridisierungstechniken
(5 ng/ g Frischgewicht),
ist jedoch wesentlich billiger.
Außerdem braucht man nicht jedesmal eine neue Sonde, wenn
Ein anderes Viroid zu bestimmen ist.
2. Viren
Hybridisierungstechniken sind möglich, auch PCR-gestützte
Methoden sind beschrieben und werden in der Forschung
verwendet. In den Großtests jedoch sind diese Methoden zu teuer.
Ein Testverfahren, dass von den Hüllproteinen der Viren Gebrauch
macht, wird hingegen wegen der geringen Kosten im Routinetest
eingesetzt.
2. Viren
Enthalten Hüllproteine, gegen die Antikörper erzeugt werdenkönnen.
2. Viren
Trübungsmessung,automatisierbar
Polyklonale Antikörper
3. BakterienSaprophytische Bakterien überdecken meist pathogene Bakterien.
Im Routinetest kann man nicht axenisch arbeiten.
3. Bakterien
Bindung der Bakterienmittels Antikörper anMagnetpartikel.
3. Bakterien
Entfernung derTargets mit einemMagneten.
Kultivierung derisolierten Bakterien.
Klassischer Nachweis.
3. Bakterien
4. Pilze
Anwendungsbeispiel:Schwarzfusskrankheit bei Cruciferen (Kreuzblütengewächse)z. B. Raps und KohlInfektion durch den Pilz Leptospaeria MaculansUnterscheidung aggressiv/ nichtaggressiv
Resitent Empfänglich
4. Pilze
Besonders erfolgreich in letzter Zeit hat sich der Einsatz von
Antikörpern gegen Komponenten der Zellwand aus Mycel und
Sporen entwickelt.
Je nach Spezifität kann man auf diese Weise gattungs- oder
artspezifische Nachweise führen.
Zunehmend gewinnen aber PCR-gestützte Methoden zum
Pilznachweis an Bedeutung.
4. Pilze
RAPD
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