MEDICINA DI LABORATORIO: MICROBIOLOGIA … DI...MEDICINA DI LABORATORIO: MICROBIOLOGIA CLINICA...

MEDICINA DI LABORATORIO:MICROBIOLOGIA CLINICA

Giovanni Di Bonaventura, PhD

Università “G. d’Annunzio” di Chieti -Pescara

Anno Accademico 2012-2013

Università “G. d’Annunzio” di Chieti -Pescara

Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livellotel 0871 355 4812

Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.)tel 0871 541509

e-mail: gdibonaventura@unich.it

FASE ANALITICA

Principi di diagnostica batteriologica

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

• DIAGNOSI DIRETTA = volta a stabilire la presenzadell’agente patogeno.

• DIAGNOSI INDIRETTA = tesa a rilevare la rispostaimmunitaria dell’ospite all’agente infettivo.

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

� DIAGNOSI DIRETTA = volta a stabilire la presenza dell’agentepatogeno mediante:

A. Esame microscopico (batterioscopico)B. Esame colturale (isolamento)C. Ricerca di antigeniC. Ricerca di antigeniD. Ricerca di sequenze geniche

Diagnosi DIRETTAA. Esame microscopico

• Fornisce informazioni utili per:– stabilire la idoneità del campione (espettorato: valutazione secondo Bartlett per

numero e % neutrofili)– porre diagnosi presuntiva , a seguito di positività per microrganismi

(caratteristiche tintoriali, morfologia, disposizione)

Nel caso in cui l’esame batterioscopico risulti NEGATIVO, è importante ricordare la scarsa sensibilità di questa metodica (circa 104 cellule/ml di materiale)

• Il campione può essere osservato “a fresco” oppure previa fissazione (calore/chimica)• La scelta del tipo di microscopia dipende dal patogeno eventualmente presente:

– microscopia in campo oscuro: il condensatore illumina obliquamente l’oggetto in modo che le strutture cellulari riflettano la luce verso l’occhio dell’operatore, a differenza dell’ambiente circostante (microrganismi circondati da alone luminoso)

• ricerca di spirochete (T. pallidum) nelle lesioni cutanee associate alla sifilide– microscopia in fluorescenza: antigene rilevato da molecola fluorescente

(cromoforo/fluoroforo) che, eccitato da una sorgente laser, assorbe luce ad una λper riemetterla ad una λ più lunga. Tale differenza viene rilevata da filtri.

• identificazione di virus, batteri e funghi• Spesso si utilizzano colorazioni “dedicate” , per la ricerca “mirata” di gruppi di

microrganismi o di specifici patogeni (Gram, Ziehl Nielsen)

Diagnosi DIRETTAA. Esame microscopico “a fresco”

Si esegue soprattutto per la ricerca di microrganismi difficilmentecolorabili (o coltivabili) con le tecniche disponibili, evidenziabiliinvece in campo oscuro:

– ricerca di Spirochete (Borrelia spp., Treponema spp.)– ricerca di Spirochete (Borrelia spp., Treponema spp.)

– ricerca di Leptospire

Osservazione in campo oscuro: Borrelia burgdorferi (sn), Treponema pallidum (dx)

Diagnosi DIRETTAA. Esame microscopico in fluorescenza

Fluorescenza : capacità di assorbire radiazionielettromagnetiche di una certa λ e di emettere una frazionedell’energia assorbita con radiazione elettromagnetiche a λsuperiore a quella assorbita.Microscopia a fluorescenza : usa la luce UV; ad una λ paria 200-400 nm le strutture sono analizzate in base allafluorescenza che emettono nello spettro visibile.Si esegue soprattutto per la ricerca di microrganismidifficilmente coltivabili con le tecniche disponibili:difficilmente coltivabili con le tecniche disponibili:– patogeni della alte vie respiratorie: virus influenzali (A e B)e parainfluenzali (1,2 e 3), Virus Respiratorio SincizialeRSV, Adenovirus e Coronavirus– Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi

Coronavirus Adenovirus

Diagnosi DIRETTAA. Esame microscopico previa colorazione• Campioni fissati (al calore o chimicamente)• Fornisce indicazioni riguardo :

– idoneità del campione (nell’espettorato: numero di cellule squamose,cellule colonnari ciliate, polimorfonucleati neutrofili, cellule mononucleate)– presenza/assenza di microrganismi (batteri, funghi, parassiti)

• Colorazione del campione con tecnica di Gram :• Colorazione del campione con tecnica di Gram :– morfologia (cocchi, bastoncelli, cocco-bacilli, lanceolata)– disposizione (catenelle, clusters, diplococchi)– quantità assoluta di batteri presenti– percentuale relativa di Gram+ e Gram-– localizzazione intra/extra-cellulare del microrganismo

• Specifiche colorazioni :– colorazione di Ziehl Nielsen (bacilli alcool-acido resistenti)– verde malachite (endospore batteriche in Bacillus spp. e Clostridium spp.)– colorazione di Albert (granuli metacromatici o volutina in Corynebacterium)– colorazione di Leifson (flagelli)

Diagnosi DIRETTAA. Esame microscopico previa colorazione

Colorazioni SEMPLICI: che prevedono l’impiego di un solocolorante:

– cristalvioletto– fucsina basica– blu di metilene– blu di metilene

Colorazioni DIFFERENZIALI : che prevedono l’impiego dipiù di un colorante:

– colorazione di Gram– colorazione di Ziehl-Neelsen

Le colorazioni in microbiologiaAllestimento di un preparato (fissazione) (1 di 2)

La fissazione garantisce che: i) il materiale venga disteso ed essiccato non venga rimosso dal vetrino nel corso dei successivi lavaggi; ii) le cellule vengano uccise per coagulazione (sicurezza biologica e maggiore penetrazione ai coloranti)

� Partendo da una sospensione batterica (brodocoltura) centro di un vetrino pulito

� Se si preleva il materiale (colonie) da terreno agarizzato, aggiungere una goccia di soluzione tampone (PBS) al campione

Le colorazioni in microbiologiaAllestimento di un preparato (fissazione) (2 di 2)

� Aiutandosi con un’ansa, stemperare il campione nel tampone/brodo e stenderlo fino a coprire circa la metà della superficie del vetrino superficie del vetrino (preparazione dello smear)

� Lasciare essiccare il preparato all’aria o forzatamente (bunsen).

� Fissare il preparato esponendo il vetrino (lato non contenente il campione) per 4-5 volte direttamente alla fiamma

Hans Christian Joachim Gram

� Nato a Copenhagen il 13 Settembre1853.

� Batteriologo danese. Inventò la colorazione Inventò la colorazione omonima nel tentativo didifferenziare Klebsiella pneumoniae dagli pneumococchi

Colorazione di GramTecnica

1. Fissare gli strisci al calore2. Coprire con cristalvioletto per

1-2 min3. Lavare con acqua. Non

asciugare4. Coprire con la soluzione

iodio-iodurata di Lugol per 1-iodio-iodurata di Lugol per 1-2 min

5. Lavare con acqua. Non asciugare

6. Decolorare per 10 sec con alcool-acetone

7. Lavare con acqua. Non asciugare

8. Coprire con safranina (2.5% in alcool 95%) per 1-2 min

9. Lavare con acqua e lasciare asciugare

Colorazione di Gram: colorazione regressiva e differenziale

� Nei batteri Gram+ il cristalvioletto e lo iodio si combinano a formare un complesso (CV-I) di grosse dimensioni che precipita all’interno della cellula. Il decolorante condensa, per disidratazione, la struttura

Colorazione di GramPrincipio

disidratazione, la struttura peptidoglicanica. In questo modo, il complesso CV-I viene “catturato” dalla parete cellulare.

� Nei batteri Gram- il decolorante agisce come solvente lipidico, dissolvendo la membrana esterna della parete cellulare, permettendo così il rilascio del complesso CV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica.

� I batteri Gram+ (Staphylococcusspp, Streptococcus spp, etc) appaiono colorati in blu

Colorazione di GramOsservazione microscopica

(Staphylococcus epidermidis)

� I batteri Gram- (E. coli, P. aeruginosa, Neisseriaceae, etc.) appaiono colorati in rosso

(Escherichia coli)

� Trichomonas vaginalis (protozoo) è Gram+

� Candida albicans (lievito), Aspergillus fumigatus (muffa) sono

Colorazione di GramCasi particolari

Aspergillus fumigatus (muffa) sono Gram+

� Occasionalmente, anche Mycobacterium tuberculosis è Gram+ (oppure Gram-variabile)

� Idoneità del campione da sottoporre a coltura� Es. nell’espettorato: numero di cellule epiteliali ed infiammatorie

� Diagnosi eziologica presuntiva (suggestiva)� meningiti e polmoniti batteriche, batteriuria, gonorrea ed infezioni

piogene

Colorazione di GramUtilità clinica (1 di 2)

� Suggerire la necessità di attuare tecniche di coltivazione “non routinarie”� ricerca di anaerobi, funghi

� Ausilio nella interpretazione dell’esame colturale� angina di Vincent (spirochete - Borrelia vincentii, fusobatteri -

Fusobacterium fusiforme)� nel paziente antibiotizzato

� Informazioni sulla natura dell’infezione� infezioni poli/mono-microbiche

Quindi:La conoscenza del risultato di una colorazione

di Gram può salvare una vita !Tuttavia:

Colorazione di GramUtilità clinica (2 di 2)

Tuttavia:� La colorazione di Gram non deve essere effettuata su

campioni clinici (feci, escreato) in cui la flora patogena non può essere differenziata da quella commensale

� La colorazione di Gram non è utile per la rilevazione di:� Legionella spp. (immunofluorescenza)� bacilli acido-resistenti (micobatteri, Nocardia spp.) (Ziehl-

Neelsen)

Colorazione di GramL’eccezione

� La colorazione di Gram non è applicabile a tutti i batteri.

� Mycobacterium tuberculosis, M. leprae� incapacità di colorare la cellula per la natura � incapacità di colorare la cellula per la natura

“cerosa” dell’involucro esterno, altamente impermeabile ai coloranti

� colorazione di Ziehl-Nielsen

Mycobacterium spp.Parete cellulare

� Composizione:� Grosse quantità di glicolipidi:

� acido micolico (60%)� complessi lipidi-arabinogalattani� lipoarabinomannani

� Scarso petidoglicano� Funzioni:� Funzioni:

� Condiziona la forma e previene la lisi osmotica (peptidoglicano)

� Inibisce ingresso composti chimici� crescita lenta� maggiore resistenza agli agenti chimici� maggiore resistenza alla fagocitosi

� Mediante l’acido micolico, induce la sintesi di citochine (TNF-α)

� Colorazioni:� Ziehl-Neelsen, Kinyoun

Step 1:Step 1:� versare la fucsina fenicata (fucsina basica in acqua, alcool e fenolo)

Colorazione di Ziehl-NeelsenTecnica (1 di 2)

fenolo)

Step 2:Step 2:� fare evaporare il colorante

alla fiamma per 5 min� lavare con acqua

Step 3:Step 3:� Decolorare (2 min, circa) con

alcool-acido fino alla scomparsa del colorante

Colorazione di Ziehl-NeelsenTecnica (2 di 2)

del colorante� Lavare con acqua

Step 4:Step 4:� Contrastare con blu di metilene

per 1-2 min� Lavare con acqua

� Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono colorati in rosso

� Gli organismi non acido-resistenti risulteranno colorati in blu

Colorazione di Ziehl-NeelsenOsservazione microscopica

colorati in blu

Le colorazioni in MicrobiologiaColorazioni speciali

La colorazione negativa consiste nellacolorazione di sottofondo con un coloranteacido (nero nigrosina). Viene usata quandoun organismo od una sua struttura non vienecolorata facilmente (esempio, la capsula).

La colorazione delle spore richiede caloreLa colorazione delle spore richiede caloreper facilitare la penetrazione del colorante(verde di malachite, fucsina fenicata) attraverso gli involucri sporali.

La colorazione dei flagelli impiega un mordenzante (precipitazione dei salidell’acido tannico) per evidenziare la strutturaflagellare altrimenti invisibile (d: 12-30 nm)

Le colorazioni in MicrobiologiaColorazione di flagelli

Colorazione di Leifson. Cellule politriche di Helicobacter pylori (da: Di Bonaventura et al., J. Clin. Microbiol., 1997)

Diagnosi DIRETTAA. Esame microscopico: significato diagnostico

Le informazioni desunte dall’esame microscopico possonoconsentire una diagnosi presuntiva e, comunque, risultanoimportanti per orientare l’iter diagnostico (es. scelta dei terrenicolturali per l’isolamento).

TUTTAVIA:TUTTAVIA:L’esame microscopico può fornire precise indicazioni diagnostiche

qualora si esamini:– un materiale normalmente sterile o comunque proveniente

da zone non comunicanti con l’esterno (liquido cefalo-rachidiano, essudato pleurico o peritoneale, materialepurulento proveniente da raccolte chiuse);

– un materiale nella cui popolazione batterica “normale” nonsiano compresi batteri con i caratteri morfologici e/otintoriali del batterio osservato.

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

� DIAGNOSI DIRETTA = volta a stabilire la presenza dell’agentepatogeno mediante:

A. Esame microscopico (batterioscopico)B. Esame colturale (isolamento)C. Ricerca di antigeniC. Ricerca di antigeniD. Ricerca di sequenze geniche

Diagnosi DIRETTAB. Esame colturale (isolamento): terreni

L’isolamento colturale prevede l’impiego di adeguati mezzi (terreni) di coltura.Essi si distinguono in base allo stato fisico :

LIQUIDI (brodi), utilizzati soprattutto nei casi di campioni per i quali si prevede una bassa carica microbica (liquidi biologici, aspirati, etc.)

Terreno liquido “classico“ (brodo normale o nutriti vo)� peptone (derivato dalla digestione parziale di proteine animali) 0,5%� estratto di carne 0,3%� estratto di carne 0,3%� NaCl (per rendere isotonico il terreno)� tampone fosfato (PBS; pH 7,0)� H2O

SOLIDI (agarizzati) in cui il brodo normale viene solidificato con agar (1.5-2%),polisaccaride acido estratto da alghe rosse tropicali del genere Gelidium.Vantaggi :� l’agar non viene metabolizzato dalla maggior parte dei batteri� liquidi a temperature > 80°C, gelificano a temperatura compresa tra 42-47°C� consentono un esame qualitativo (aspetti coloniali macroscopici) e quantitativo

(stima della carica batterica) dell’isolamento

Diagnosi DIRETTAB. Esame colturale (isolamento): terreni

L’isolamento colturale prevede l’impiego di adeguati mezzi (terreni) di coltura.Essi si distinguono in base allo stato chimico :

A composizione chimicamente definita: molto costosi, utilizzati esclusivamente perl’identificazione di batteri con particolari esigenze nutrizionali.A composizione indefinita: contenenti sostanze naturali (peptone, siero, liquidoascitico, sangue, estratto di lievito etc.).Terreni minimi: utilizzati di rado, contengono carbonio, azoto, zolfo e fosforo sotto Terreni minimi: utilizzati di rado, contengono carbonio, azoto, zolfo e fosforo sotto forma di sali inorganici, aggiunti a concentrazione nota.Terreni di arricchimento: più frequentemente utilizzati, contengono sangue, siero, estratto di lievito, infuso di cuore e cervello, carboidrati e amminoacidi per facilitare la crescita di microrganismi patogeni particolarmente “esigenti ” dal punto di vista nutritivo.

Diagnosi DIRETTAB. Esame colturale (isolamento): terreni

L’isolamento colturale prevede l’impiego di adeguati mezzi (terreni) di coltura.Essi si distinguono in base alla tipologia di informazioni che forniscono :

Terreni NON SELETTIVI

Terreni SELETTIVI

Terreni DIFFERENZIALITerreni DIFFERENZIALI

Privi di inibitori, consentono la crescita della maggior parte delle specie microbiche:� Agar sangue: contiene il 5% sangue montone/cavallo, per evidenziare attività

emolitica:– α-emolisi = emolisi parziale, dà luogo alla formazione di un alone verdeintorno alla colonia per degradazione della bilirubina a biliverdina– β-emolisi = emolisi completa, dà luogo alla formazione di un alone trasparenteintorno alla colonia– γ-emolisi = mancanza di emolisi

Diagnosi DIRETTAB. Esame colturale (isolamento): terreni non selettivi

� Agar cioccolato: contiene emoglobina (emina o fattore X), NAD (fattore V) evitamine, per l’isolamento di germi “esigenti” dal punto di vista nutritivo(Haemophilus spp, Neisseria spp., S. pneumoniae). Il caratteristico colorcioccolato deriva dal trattamento termico del sangue che ne causa la emolisi e,quindi, il rilascio dei fattori di crescita.

Agar sangue Agar cioccolatoAgar sangue: α-, β-, γ-emolisi

A differenza dei terreni non selettivi, questi terreni contengono agenti selettivi:� coloranti : cristalvioletto, verde brillante, fucsina basica� antibiotici: con attività batteriostatica/battericida vs “contaminanti”

Vengono utilizzati per l’isolamento di microrganismi patogeni presenti in campioniprelevati da siti caratterizzati (“contaminati”) da una da flora microbicaresidente (cute, faringe, naso, intestino, vagina).

� Thayer-Martin agar (agar cioccolato addizionato di vancomicina, colistina,

Diagnosi DIRETTAB. Esame colturale (isolamento): terreni selettivi

� Thayer-Martin agar (agar cioccolato addizionato di vancomicina, colistina,trimethoprim lattato e nistatina), selettivo per Neisseriaceae patogene

� MacConkey agar (sali biliari, cristalvioletto, lattosio, rosso neutro), selettivo perEnterobacteriaceae

� Mannitol Salt Agar (7.5% NaCl, mannitolo, rosso fenolo), selettivo perstafilococchi

� SS agar (sodio citrato, sali biliari, verde brillante) selettivo per Salmonella spp. eShigella spp.

Contengono ingredienti in grado di differenziare particolari specie microbiche sullabase di caratteristiche generalmente biochimiche:• carboidrati (zuccheri) ed indicatori di pH (rosso fenolo, rosso neutro, blu dibromofenolo), che consentono di distinguere tra microrganismi in grado difermentare specifici carboidrati . La fermentazione del carboidrato causa ilrilascio di prodotti acidi della via fermentativa causando una acidificazione delterreno, prontamente indicata dal viraggio dell’indicatore di pH (e della colorazionedelle colonie) (agar sale-mannite, MacConkey agar, etc.)• sangue (5% di montone oppure cavallo) per evidenziare la capacità di emolisi dei

Diagnosi DIRETTAB. Esame colturale (isolamento): terreni differenziali

• sangue (5% di montone oppure cavallo) per evidenziare la capacità di emolisi deibatteri: α-emolisi, β-emolisi, γ-emolisi

Agar sale-mannite (Chapman agar):terreno selettivo/differenziale. 1) S. aureus(mannite-fermentante), 2) Staphylococcusspp coagulasi-negativi, non fermentanti, 3)terreno non seminato.

Agar MacConkey : terrenoselettivo/differenziale perEnterobacteriaceae lattosio-fermentanti(E. coli) e non- (Salmonella spp., Shigellaspp., Proteus spp.)

Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica R. Cevenini, V.Sambri Piccin

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA

TEMPERATURA

• Psicrofili -10°C a +20°C ( L. monocytogenes, 5-8°C)

• Mesofili +10 a +50°C (la quasi totalità dei batteri patogeni)• Mesofili +10 a +50°C (la quasi totalità dei batteri patogeni)

• Termofili +40 a +70°C

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA

OSSIGENO

Aerobi obbligati : crescono solo in presenza di O2 atmosferico (Micrococcus spp.)

Aerobiobbligati

Aerobi facoltativi

Anaerobiobbligati

Anaerobi facoltativi

Microaerofili

2

Aerobi facoltativi : crescono meglio in condizioni aerobie che anaerobie(Staphylococcus spp., Bacillus spp., Escherichia coli, Enterococcus spp.)Anaerobi obbligati : crescono solo in assenza di O2 atmosferico (Clostridiumtetani, Clostridium botulinum, Fusobacterium spp., Bacteroides spp.)Anaerobi facoltativi : crescono meglio in condizioni anaerobie che aerobie(Corynebacterium spp., Streptococcus spp.)Microaerofili : crescono in ambienti con ridotta pressione parziale di O2; cresconobene in atmosfera addizionata di CO2 (H. pylori, Neisseria spp.)

CRESCITA IN ANAEROBIOSI

I batteri anaerobi tendono a rendere torbido il terreno di coltura liquido,depositandosi sul fondo come sedimento.

Vanno fatti crescere in terreni riducenti ed in incubatori speciali.

Terreni riducenti : sono terreni che contengono dei composti chimici(tioglicolato di sodio) che si combinano chimicamente con l’ossigenoatmosferico fino ad esaurirlo.

Incubatori speciali : a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche(bicarbonato di sodio e sodio boroidruro) che, quando vengonoumidificate, producono CO2 e H2 e successivamente H2O con scomparsadell’ossigeno.

Crescita in anaerobiosi

Cappa (camera) per anaerobiosi

Giara per anaerobiosi

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA

pH– Acidofili :

• crescono al di sotto di pH 6 (pH 2 – 6, generalmente)• crescono al di sotto di pH 6 (pH 2 – 6, generalmente)• funghi e lieviti (pH 5 - 6)

– Neutrofili :• crescono tra pH 6 – 8• maggior parte dei batteri

– Alcalofili :• crescono a pH > 8 (pH 8 – 9.5, generalmente)

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA

PRESSIONE OSMOTICA

In generale, i microrganismi replicano meglio in un terreno conconcentrazione osmotica più bassa della propria, in quantoquesta condizione permette la penetrazione dell’acqua all’internodella cellula.della cellula.

La pressione osmotica del terreno può essere modificata in basealla concentrazione di cloruro di sodio o di glucosio

Alofili: crescono ad elevate [saline] (generalmente ≥ 1 M), tollerando elevate pressioni osmotiche (es. stafilococchi)

TEMPO DI INCUBAZIONE

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA

Gran parte dei batteri patogeni ha un tempo di duplicazione nell’ordine dei 40-60 min. In particolare:

• Escherichia coli (in vitro) 20-30 min • Escherichia coli (in vivo) 12 h• Mycobacterium tuberculosis (in vitro) 18 h• Treponema pallidum (in vitro) 33 h

ISOLAMENTO BATTERICO

Una volta che dal campione biologico si sia verificata, su terreni solidiopportuni, la crescita di colonie batteriche, si procede all’isolamentodei morfotipi coloniali di interesse

E’ necessario tenere conto del sito di provenienza del campione. Inparticolar modo:� pus� liquido cefalo rachidiano� liquido cefalo rachidiano� sangue

ossia materiali fisiologicamente sterili, generalmente contengono un solotipo di microrganismo;

• materiale fecale• tamponi oro-faringei• altri materiali biologici

ossia materiali fisiologicamente contaminati da flora commensale,generalmente contengono microrganismi contaminanti, oltre al patogenoo ai patogeni responsabili dell’infezione.

ISOLAMENTO COLTURALE: TECNICA DI DISSEMINAZIONE IN SUPERFICIE

• Utilizzare terreni solidi (agarizzati) preparati in piastre di Petri

• Deporre una piccola quantità di materiale patologico da esaminareal margine della piastra (se il materiale è molto denso stemperarlocon soluzione fisiologica o brodo sterile)con soluzione fisiologica o brodo sterile)

• Mediante l’utilizzo di una spatola o di un’ansa, distribuire ilmateriale sulla superficie del terreno in modo da avere laformazione di colonie ravvicinate nel primo tratto di semina ecolonie isolate nell’ultimo tratto

• Successivamente, prelevare sterilmente i batteri di una coloniaisolata (formata cioè da una sola cellula batterica iniziale) edallestire una coltura pura

Tecnica di semina per isolamento

Tecnica di semina per isolamento

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

� DIAGNOSI DIRETTA: IDENTIFICAZIONE

Una volta che dal campione biologico si sia verificata, su terrenisolidi opportuni, la crescita di colonie batteriche isolate siprocede alla identificazione:

• ID PRESUNTIVA– caratteri microscopici

» colorazioni (forma, organizzazione)

– caratteri macroscopici» aspetto coloniale

• ID FINALE (DEFINITIVA)– biochimica– immunologica– molecolare

ID “presuntiva” dei microrganismi Aspetto macroscopico delle colonie (1 di 2)

Forma Rilievo

sottile, allungatoeffusopuntiforme d < 1 mm

piatto

sopraelevato

convesso

umbonato

circolare

filamentosa

rizoide

irregolare

irregolare, a filo intrecciato

irregolare, ramificata

ID “presuntiva” dei microrganismiAspetto macroscopico delle colonie (2 di 2)

Superficie Margine

interoliscia

ondulato

eroso

filamentoso

arricciato

radiata

rugosa

concentrica

rilevata ondulata

anelli concentrici

raggrinzita

Aspetto macroscopico coloniale:variabilità fenotipica

DIAGNOSI DIRETTAIdentificazione dei microrganismi

1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)� Colorazione di Gram� Colorazione di Ziehl-Neelsen

2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) � tipo (aspetto) coloniale� tipo (aspetto) coloniale� emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.� crescita su terreni selettivi

3. Caratteristiche biochimiche4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)5. Identificazione molecolare

IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA

La determinazione di “specie” si basa sulla capacità delmicrorganismo in esame di:

– metabolizzare zuccheri per via ossidativa (via aerobica) o per viafermentativa (via anaerobica)

– produrre specifici enzimi

– produrre specifici prodotti metabolici

Utilizzo di metodi “manuali” od “automatizzati”.Identificazione possibile in tempi rapidi (sistemi automatizzati: 4 - 6 h)

oppure previa incubazione o/night (sistemi “manuali”, 16-20 h).

ID BIOCHIMICAMetodo manuale: API (BioMérieux) Identification System

Anaerobes (Rapid ID 32 A)Enterobacteriaceae (ID 32 E)Gram Negative Rods (ID32 GN) Staphylococci (ID32 STAPH )Streptococci (Rapid ID32 STREP)Yeasts (ID32 C)

La fermentazione degli zuccheri e/o l’utilizzazione di altri substrati (ureasi, indolo, gelatina, citocromo, etc.) viene rivelata dal viraggio di un indicatore di pH

Identificazione batterica:Flow charts generate sulla base delle caratteristiche tintoriali (Gram) e biochimiche

ID BIOCHIMICAMetodo automatizzato: VITEK (BioMérieux)

Gram-positives (GP)Gram-negatives (GN)Yeasts (YST) Bacillus spp. (BCL)Anaerobes, Corynebacterium (ANC)Neisseria, Haemophilus (NH)

� Due tipologie di card: una per la identificazione (30 pozzetti/card contenenti dei substrati biochimici in forma disidratata), l’altra per l’antibiogramma.� Non sono richiesti reagenti addizionali, riducendo così il rischio di omissione o di errore. � Il database del VITEK copre oltre 300 specie sia di origine clinica che industriale. � Possibilità di generare reports epidemiologici (es. frequenza di antibiotico-resistenze)

Identificazione dei microrganismi

1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)� Colorazione di Gram� Colorazione di Ziehl-Neelsen

2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) � tipo (aspetto) coloniale� tipo (aspetto) coloniale� emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.� crescita su terreni selettivi

3. Caratteristiche biochimiche4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)5. Identificazione molecolare

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA

Ha come obiettivo finale la ricerca di ANTIGENI specie-specifici,direttamente nel campione biologico esaminato.

Le tecniche di identificazione sierologica che prevedono l’impiego dianticorpi comprendono:anticorpi comprendono:

A. Reazione di agglutinazioneB. Reazione di immunofluorescenzaC. Tecniche immunoenzimatiche (ELISA)D. Western blot

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICAA. REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE

Agglutinazione su vetrinoPrevede l’impiego di anticorpi, ottenuti in un animale immunizzato,messi a contatto con il batterio o con suoi antigeni solubili.

Agglutinazione al lattice (AL)Utilizzato per evidenziare gli antigeni polisaccaridici della capsulabatterica, costituiti da sequenze ripetitive di zuccheri in grado di legaregli anticorpi in più punti (antigeni polivalenti). Per il test si utilizzanoanticorpi legati (adsorbiti) a particelle di lattice (adsorbimento in fasesolida).Tecniche immunologiche rapide vengono frequentemente utilizzate perla ricerca di antigeni batterici (S. pneumoniae, H. influenzae, E. coli, N.meningitidis, C. neoformans) nel liquor (o nel suo centrifugato).

Ricerca di Haemophilus influenzae in un campione di liquor. Il campione viene mescolato conuna sospensione di particelle di lattice ricoperte di Abs specifici, diretti contro la capsula di H.influenzae. L’interazione tra Ag e Abs causa un’immediata agglutinazione di particelle(epifenomeno) visibile ad occhio nudo.

negativo positivo

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA B. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA

Il fluorocromo (es. Alexa Fluor) viene eccitato da una luce aduna certa lunghezza d’onda (UV), quindi ri-emette una luce aduna lunghezza d’onda maggiore (nel visibile).I fluorocromi possono essere legati ad anticorpi modificando la

loro capacità di legarsi ad uno specifico antigene:• Anticorpi monoclonali (MAb)• Anticorpi monoclonali (MAb)

– prodotti da cellule di ibridoma– riconoscono un singolo epitopo

• Due tipi di immunofluorescenza: diretta vs indiretta

Tale tecnica è caratterizzata da:� moderata sensibilità� costi non moderati (attrezzatura)� richiedere personale ad elevata qualifica� rapidità di esecuzione� elevata specificità (se si utilizzano Abs monoclonali)

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA B. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA

IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA

Si utilizza un anticorpo coniugato con fluoresceina isotiocianato, chesia specifico per l’antigene in esame.sia specifico per l’antigene in esame.

IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA

Si utilizza un anticorpo specifico per l’antigene in esame ma nonconiugato, che viene riconosciuto da un secondo anticorpo coniugatoe diretto contro regioni costanti delle immunoglobuline della speciein cui è stato prodotto il primo anticorpo.

Test con anticorpi fluorescenti per la ricerca e l’identificazione di antigeni microbici (o tessutali) o di anticorpidiretti contro entrambi. Nel test diretto , l’anticorpo marcato con colorante fluorescente è applicato su unasezione di tessuto contenente l’antigene, quindi l’anticorpo in eccesso viene lavato e l’anticorpo rimastolegato viene visualizzato attraverso microscopio a fluorescenza. Nel test indiretto , l’antigene è rilevatomediante aggiunta di un anticorpo non marcato e successivamente con un anti-anticorpo marcato con unasostanza fluorescente, che amplifica il segnale (se il primo anticorpo è umano, il secondo anticorpo sarà unanticorpo contro le immunoglobuline umane, prodotto in una specie diversa da quella umana).

Diagnosi di sifilide: IF diretta

IMMUNOFLUORESCENZA

A B D

A) Treponema pallidum; B) Chlamydia trachomatis; C) Helicobacter pylori; D) Bordetella pertussis; E) Neisseria gonhorroeae

C E

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA C. TEST IMMUNOENZIMATICO (ELISA: enzyme-linked immunodsorbent assay)

La presenza di un antigene viene rivelata dall’utilizzo di un anticorpo legato ad unenzima in grado di catalizzare una reazione cromogenica.

Si ricopre la superficie plastica di un pozzetto (micropiastra) con anticorpi specificicontro l’antigene (immobilizzazione degli antigeni su fase solida).

Si aggiunge l’antigene (presente nel campione). Esso viene legato dapprima da Abimmobilizzato, quindi – a seguito di lavaggio – da un secondo anticorpo, direttoanch’esso contro l’antigene ricercato, legato covalentemente ad un enzima(perossidasi, fosfatasi alcalina, β-galattosidasi) (sandwich ELISA)

La quantificazione avviene mediante tecniche spettrofotometriche, attraverso lavalutazione dell’intensità del colore prodotto in risposta alla conversioneenzimatica del relativo substrato cromogeno: [antigene] = k [intensità viraggio].

La reale concentrazione dell’antigene viene determinata per confronto condiluizioni standard dell’antigene stesso.

ELISA-test: diretto (sandwich) vs indiretto

IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA D. WESTERN BLOT

1. Separazione degli antigeni su gel di poliacrilammide in base al peso molecolare (elettroforesi)

2. Trasferimento degli antigeni (bande elettroforetiche) su membrana di

Tra i tests sierologici più specifici, il WB prevede la separazione delle molecole antigeniche del microrganismo, la loro fissazione su supporto solido, ed incubazione con anticorpi marcati.

elettroforetiche) su membrana di nitrocellulosa

3. Incubazione degli antigeni con l’anticorpo specifico

4. Esposizione ad un anticorpo secondario (anti-anticorpo primario) marcato con un enzima (perossidasi)

5. La formazione di immunocomplessi (e quindi la presenza dell’antigene ricercato) viene evidenziata dall’aggiunta di un substrato sul quale agisce l’enzima, che provoca la precipitazione di colorante

Identificazione dei microrganismi

1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)� colorazione di Gram� colorazione di Ziehl-Neelsen

2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) � tipo (aspetto) coloniale� tipo (aspetto) coloniale� emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.� crescita su terreni selettivi

3. Caratteristiche biochimiche4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)5. Identificazione molecolare

IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE

• Le biotecnologie hanno fornito strumenti diagnostici molto potenti, in quanto ci consentono:

– la ricerca e la identificazione rapida di patogeni umani– l’indagine diagnostica su campioni negativi all’esame colturale:– l’indagine diagnostica su campioni negativi all’esame colturale:

• ricerca di microrganismi a lenta crescita oppure non coltivabili

– la tipizzazione dei microrganismi a fini epidemiologici– la determinazione dell’antibiotico-sensibilità

IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE:POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

� Si basa sulla capacità della DNA-polimerasi di copiare un singolo filamento di DNA previo appaiamento dei primers, sequenze oligonucleotidiche fiancheggianti la sequenza bersaglio.� Ciascun ciclo consiste delle seguenti fasi:

� denaturazione a caldo: separazione � denaturazione a caldo: separazione delle due eliche di DNA� annealing: DNA dei primers si appaia al filamento complementare� estensione: DNA-pol copia il DNA bersaglio compreso tra i due primers

� Alla fine di ciascun ciclo, il numero delle sequenze di DNA bersaglio è raddoppiato. 25-40 cicli sono sufficienti per ottenere una quantità di DNA bersaglio evidenziabile a mezzo di migrazione elettroforetica.

IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE:PCR-BASED ASSAYS

� Multiplex-PCR : presenza di diverse coppie di primers per la ricerca simultanea di più patogeni nello stesso campione� Nested-PCR : permette di aumentare la specificità (e/o sensibilità) della reazione. Una specificità (e/o sensibilità) della reazione. Una aliquota della reazione originale è utilizzata come stampo per una seconda reazione (nested) utilizzando una coppia di primers complementari a regioni presenti all’interno del primo prodotto amplificato.� Ligase Chain Reaction (LCR) : amplificazione della sonda utilizzata per rivelare la sequenza genica di interesse.

IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE:PCR-BASED ASSAYS

� Strand Displacement Amplification (SDA) : amplificazione isotermica (52.5°C), in cui al taglio (per restrizione) del DNA se gue la sintesi del filamento da parte di DNA-pol, rimuovendo lungo il percorso il filamento che viene trascritto, mentre il filamento restante serve successivamente da stampo per nuove amplificazioni. Le fasi di taglio e di polimerizzazione/rimozione si ripetono ciclicamente producendo copie complementari a singolo filamento del DNA target. Infine, la ibridizzazione del probe specifico con il prodotto di amplificazione ne modifica la conformazione sterica consentendo l’emissione amplificazione ne modifica la conformazione sterica consentendo l’emissione di un segnale fluorescente.

Tecnica impiegata per la identificazione di:� Micobatteri, appartenenti ai complessi “tubercolare” e “avium-intracellulare”� Legionella pneumoniae� Mycoplasma pneumoniae� Neisseria gonorrhoeae� Chlamydiaceae

IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE:SONDE MOLECOLARI

� Sonda molecolare: sequenza di acido nucleico a singolo filamento [RNA (rRNA)/DNA] complementare rispetto ad una sequenza caratteristica di uno specifico patogeno (reazione di ibridazione).� La sonda può essere marcata con enzimi, molecole chemiluminescenti, radioisotopi, consentendo in tal modo la rivelazione dell’ibrido da parte di sistemi automatizzati.� Tre tipologie di ibridazione:

� In fase solida : sonda adsorbita su substrato (dot-blot, northern-blot, southern-blot)� In fase solida : sonda adsorbita su substrato (dot-blot, northern-blot, southern-blot)� In fase liquida : sonda in soluzione (molto rapida vs fase solida)� In situ: utilizzo di sonde marcate con fluocromo

� Elevata specificità� Buona sensibilità (sebbene minore vs tecniche di amplificazione): consente di rivelare la presenza di 104-106 copie (a seconda della tipologia di campione) della sequenza in esame.� La reazione di ibridazione può essere applicata su diverse tipologie di campioni: colonie batteriche, preparazioni di DNA purificato, campioni clinici.� L’impiego di sonde molecolare è piuttosto diffuso per la ricerca di patogeni difficilmente coltivabili e/o identificabili con altre tecniche: Micobatteri, Chlamydia, Legionella, Mycoplasma; genotipizzazione di HPV (DNA-Hybrid Capture).

<

Restriction fragment length polymorphism(RFLP): la digestione del DNA per mezzo di enzimidi restrizione, seguita da ibridazione con differentisonde geniche genera patterns specie-specifici(ossia caratteristici di una specie microbica).

Principali tecniche di ibridazione degli acidi nucleici

Il DNA target denaturato (singolo filamento) viene direttamente immobilizzato su unsupporto solido (es. membrana di nitrocellulosa) ed ibridato con una specifica sonda aDNA a singolo filamento marcata, per facilitarne la successiva rivelazione (dot blot ).In alternativa, differenti frammenti di DNA con diverso peso possono essere separatiattraverso elettroforesi su gel di agarosio, denaturati e poi trasferiti su membrane perl’ibridazione con sonda e rilevazione (Southern blot ). Se si utilizzano molecole diRNA separate mediante elettroforesi, si parla di Northern blot .

IBRIDAZIONE IN FASE SOLIDADot blot

IBRIDAZIONE IN FASE SOLIDASouthern blot

IBRIDAZIONE IN FASE SOLIDANorthern blot

IBRIDAZIONE IN SITU

• DNA denaturato senza alterare la morfologia cellulare o tessutale

• Frequentemente utilizzate in sezioni incluse in formalina/paraffina

• Sensibilità influenzata dalla capacità • Sensibilità influenzata dalla capacità della sonda di penetrare nella cellula (meglio se di piccole dimensioni, < 500 basi)

• Partciolare e frequente applicazione: Fluorescent In Situ Hybridization –FISH)

IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE:LIMITI TECNICI

• Facile contaminazione dei campioni negativi con DNA stampo, controllo o proveniente da altri campioni (cross-contaminazione)

• Amplificazione di DNA di batteri morti a seguito di terapia antibiotica

• Possibile cross-reattività con altri microrganismi (scarsa • Possibile cross-reattività con altri microrganismi (scarsa specificità)

• False negatività, per la presenza nel campione di inibitori degli enzimi utilizzati nella reazione

• Necessità di utilizzare una coppia di primers specifica per ogni specie microbica

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

� DIAGNOSI DIRETTA: ANTIBIOGRAMMA

Una volta eseguita l’identificazione del microrganismo in esame, siprocede alla determinazione della sensibilità/resistenzadell’isolato agli antibiotici (antibiogramma ).

Tests di antibiotico-sensibilitàObiettivo

Obiettivo dei tests per la determinazione della antibiotico-S è di predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica.

I tests vengono effettuati in vitro e misurano la risposta (crescita) di un microrganismo isolato verso un particolare antibiotico/antibiotici.

I tests sono eseguiti in condizioni standardizzate per garantire la I tests sono eseguiti in condizioni standardizzate per garantire la riproducibilità dei risultati.

I risultati di questi tests debbono essere adeguatamente interpretati per guidare la scelta dell’antibiotico da adottare. A tal fine contribuiscono anche le informazioni cliniche e l’esperienza professionale.

• MIC (Concentrazione Minima Inibente) è una misura quantitativa dell’attività di un antibiotico verso un determinato batterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile.

Tests di antibiotico-sensibilità

Definizioni

• CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute), già NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) pubblica i criteri per la interpretazione dei risultati dei tests di sensibilità (categorie interpretative).

• Categorie Interpretative (Sensibilità, S Intermedia, Resistenza) individuate da valori di MIC detti breakpoints (soglia, limite)

• Breakpoints : valori di concentrazione stabiliti sulla base di:– Livelli raggiunti in vivo (sangue, tessuti) dall’antibiotico

– Correlazione tra risultati in vitro (MIC) ed in vivo (risoluzione del caso clinico)

Categorie terapeutiche: definizione

Per un dato antibiotico, in accordo con le linee guida CLSI, un ceppo battericoviene definito sensibile, intermedio o resistente se:

Sensibile

Il ceppo viene inibito nella crescita da concentrazioni di antibiotico raggiungibili in vivo (sierici,

tessutali). Un’infezione sostenuta da un ceppo batterico isolato può essere trattata

appropriatamente (elevata probabilità di successo) con il dosaggio usuale dell’antibiotico testato e

raccomandato per il tipo di infezione clinica.

Intermedio (a sensibilità intermedia)Intermedio (a sensibilità intermedia)

Il ceppo mostra una MIC borderline vs livelli raggiungibili in vivo (sierici e tessutali) di antibiotico la cui

efficacia potrebbe dunque essere minore di quella registrata per gli isolati sensibili (effetto

terapeutico incerto). Questa categoria suggerisce l’efficacia clinica nei siti corporei dove gli antibiotici

sono fisiologicamente concentrati (chinolonici e β-lattamici nelle urine) o quando l’antibiotico può

essere utilizzato a concentrazioni più alte di quelle normali in assenza di significativi effetti collaterali

(β-lattamici). Rappresenta una “buffer zone” che dovrebbe evitare/ridurre errori interpretativi di

natura tecnica, soprattutto nel caso di molecole con un ristretto margine di farmacotossicità.

Resistente

Il ceppo non viene inibito nella crescita dalle normali concentrazioni sistemiche raggiunte in vivo

(sieriche e tessutali) dall’antibiotico in seguito a somministrazione di dosi normali. Questa categoria

predice una elevata probabilità di fallimento terapeutico.

Tecniche per la determinazione in vitro dell’antibiotico-sensibilita’

• Brodo diluizione (micro- e macrometodo)• Diffusione in agar (Kirby-Bauer)• Diffusione in agar (Kirby-Bauer)• Agar diluizione• Sistemi Automatizzati

ANTIBIOGRAMMAMetodo della brodo diluizione

• Preparare una soluzione madre di antibiotico

• Allestire diluizioni seriali 2-fold dell’antibiotico in brodo Mueller-Hinton

• Preparare un inoculo a DO uguale a 0.125 (0.5 McFarland)• Preparare un inoculo a DO uguale a 0.125 (0.5 McFarland)

• Seminare ogni diluizione di antibiotico con l’inoculostandardizzato

• Incubare a 37°C per 16-18 ore

• Seminare un pozzetto “controllo” (senza antibiotico)

MC-FARLANDSTANDARDS

• La scala degli standards di Mc-Farland è rappresentata da una seriedi fiale contenenti BaSO4, di opacità differenti, che permettono lavalutazione della densità delle sospensioni batteriche

• La densità di una sospensione batterica è valutata per confronto conuna sospensione di opacità nota contenuta in una fiala dello stessodiametro

MC-FARLANDSTANDARD

Standard Concentrazione

batterica 1

x 106

Densità ottica teorica 2

a 550 nm

0.51

150300

0.1250.25

1 La concentrazione batterica varia secondo le dimensioni deimicrorganismi

2 I valori corrispondono alle densità ottiche delle sospensioni batterichee non a quelle delle particelle di BaSO4

12345

300600900

12001500

0.250.500.751.001.25

Minima Concentrazione Inibente (MIC)

Minima Concentrazione Battericida (MBC).

Brodo diluizioneNCCLS-breakpoints

Piperacillina ≤16 32-64 ≥128 Cefazolina ≤8 16 ≥32

ANTIBIOTICO S I R

Cefotaxime ≤8 16-32 ≥64 Cefpodoxime ≤2 4 ≥8 Imipenem ≤4 8 ≥16 Vancomicina ≤4 8-16 ≥32 Gentamicina ≤4 8 ≥16

S = Sensibilità, I = Sensibilità Intermedia, R = Resistenza

Tecniche per la determinazione in vitro dell’antibiotico-sensibilita’

• Brodo diluizione (micro- e macrometodo)• Diffusione in agar (Kirby -Bauer)• Diffusione in agar (Kirby -Bauer)• Agar diluizione• Sistemi Automatizzati

ANTIBIOGRAMMATecnica di Kirby-Bauer

• Sospendere 4-5 colonie in 4 ml di brodo

• Incubare a 37°C per 18 ore

• Immergere un tampone nella brodocoltura e scaricarlo contro la paretedella provetta

• Strisciare il tampone sulla piastra in modo uniforme ruotando la piastradi 60°

• Applicare i dischi a distanza maggiore di 25 mm dal bordo della piastrae ad distanza tra i centri dei dischi non inferiore a 24 mm

• Capovolgere la piastra ed incubarla a 37°C per 16-18 ore

• Misurare gli aloni di inibizione

Diffusione in agar (Kirby-Bauer)

1. Allestimento brodocoltura da coltura pura

2. Semina brodocoltura

1

2

2. Semina brodocoltura

3. Apposizione dischetti antibiotizzati

4. Incubazione (37°C, 18-24h)

5. Misurazione diametro alone di inibizione

3

4

5

Diffusione in agar Risultati

Attività battericida di un antibioticoE’ necessario considerare la attività battericida di un antibiotico,

SOPRATTUTTO in questi casi particolari:• Infezioni gravi: osteomieliti, endocarditi• Focolaio di infezione situato in distretti anatomici difficilmente

accessibili all’antibiotico

• Concentrazione Minima Battericida (MBC): La più bassaconcentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita battericaconcentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita battericadi almeno il 99.9% (1 germe su 1.000 elude l’azione antibiotica) della popolazione iniziale.

MIC/MBC test(Brodo diluizione)

MBC/MIC – killing quotient

� Tasso di uccisione = MBC / MIC

1-4 per antibiotici battericidi1-4 per antibiotici battericidi(beta-lattamici, aminoglicosidi, chinolonici, glicopeptidi, cotrimossazolo, etc.)

>4 per antibiotici batteriostatici(macrolidi, sulfamidici, trimethoprim, tetracicline, cloramfenicolo, etc.)

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA

� DIAGNOSI INDIRETTA = volta a rilevare una risposta immuneumorale specifica dell’ospite all’agente infettivo:

A. Reazione di fissazione del ComplementoB. Reazione di agglutinazioneC. Test immunoenzimatico (ELISA)C. Test immunoenzimatico (ELISA)D. Saggio in immunofluorescenzaE. Saggio radioimmunologico

Diagnosi INDIRETTA• La diagnosi INDIRETTA di una infezione batterica mira a rivelare una

risposta immunitaria umorale specifica dell’ospite all’agente eziologico• E’ più tardiva di quella DIRETTA in quanto si può ricorrere ad essa

soltanto quando si sia sviluppata la reattività immunitaria dell’ospite:– IgM, normalmente transitorie ed indicative di una infezione primaria e recente .

In alcuni casi possono persistere a lungo.– IgG, compaiono più tardivamente, raggiungendo un picco dopo 4-6 settimane

dall’infezione. Per questo è buona norma ricercarle in campioni successivi (primo: entro 5-10 giorni dall’infezione; secondo: 3-4 settimane dopo). Spesso persistono per tempi prolungati. Sono indicative di una infezione pregressa od persistono per tempi prolungati. Sono indicative di una infezione pregressa od attiva (se titolo anticorpale è aumentato di almeno 4 vv nei due campioni successivi)

• Non è sempre possibile porre diagnosi indiretta (es. in pazienti anergici ).• Pertanto, le indagini sierologiche diventano di ausilio diagnostico soltanto

quando l’isolamento del microrganismo sia difficoltoso, fallito, o non possibile .

• L’accertamento indiretto, non comportando l’isolamento del germe, preclude la possibilità di saggiare la sensibilità dell’agente etiologico verso i farmaci antimicrobici .

Sieroconversione

� Presenza di anticorpi specifici IgM o IgG (con un test precedente negativo!)� Presenza di IgM specifiche nelle infezioni acute o nella fase acuta di infezioni

persistenti� Aumento di IgG in assenza o lieve aumento di IgM nelle reinfezioni� Presenza di IgA sieriche specifiche nelle infezioni subacute o croniche

• Positività IgM: deve essere associata a sintomi cli nici compatibili e/o a un test positivo per IgG specifiche a bassa avidità.

• Aumento delle IgG: un aumento del titolo di IgG di a lmeno 4 volte rispetto al titolo del campione precedente:

– primo campione : prelevato entro 7-10 giorni dalla presunta data di esposizione (contatto con un soggetto infetto) o dalla comparsa della sintomatologia dell’infezione acuta (esantema) (fase acuta).

– secondo campione : prelevato dopo circa 2 settimane (fase convalescente)

– i due campioni devono essere esaminati nel corso della stessa seduta analitica per dimostrare l’aumento del titolo anticorpale.

Diagnosi INDIRETTAA. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO

� PRINCIPIO: capacità del Complemento di legarsi agli immunocomplessi� METODICA:

- il siero del paziente viene “scomplementato ” (privato del Complemento) (30 min, 56°C)- diluizioni del siero inattivato vengono cimentate con l’antigene , in presenza di Complemento “fresco” (di coniglio) aggiunto in quantità nota- se nel siero del paziente sono presenti anticorpi specifici questi si legano all’antigene ed il Complemento si lega all’immunocomplesso- si aggiunge un sistema rivelatore (eritrociti di montone + anticorpi anti-- si aggiunge un sistema rivelatore (eritrociti di montone + anticorpi anti-eritrociti di montone):

• se il siero del paziente è positivo (cioè contiene anticorpi control’antigene) gli eritrociti rimangono integri, in quanto il Complemento siè legato al primo immunocomplesso

• se il siero del paziente è negativo (cioè non contiene anticorpi control’antigene) gli eritrociti vengono lisati, in quanto il Complemento si legaall’immunocomplesso eritrocita+anticorpo anti-eritrocita. La reazione sievidenzia con liberazione di emoglobina.

Un classico esempio applicativo della FC è la reazione di Wassermann , per la diagnosi di sifilide (antigene lipidico o cardiolipina)

Diagnosi INDIRETTAA. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO

Diagnosi INDIRETTAA. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO

Titolo anticorpale = reciproco della più altadiluizione positiva alla fissazione

Nella reazione FC la lisi del globulo rosso indica una reazione negativa , mentre l’assenza di lisi è indice di positività per la presenza di anticorpi. In figura è riportata una reazione FC per evidenziare anticorpi verso Coxiella burnetii (agente eziologico della polmonite atipica). Nella linea superiore usando diluizioni di un siero in fase acuta, il Complemento e’ stato fissato solo nei primi 5 pozzetti (il titolo dell’anticorpo e’ 1/32), mentre con il siero convalescente nella seconda linea non c’e’ lisi dei globuli rossi per tutte le diluizioni di siero e quindi il titolo dell’anticorpo e’ maggiore di 1/512. Questo dimostra che un aumento di 4 volte nel titolo del siero tra la fase acuta e di convalescenza e’ indicativo dell’infezione da Coxiella burnetii.

Diagnosi INDIRETTAB. TEST DI AGGLUTINAZIONE

Titolo anticorpale = reciproco della più altadiluizione positiva all’agglutinazione

• L’antigene corpuscolato consiste di una sospensione di microrganismi, cellule (emazie) o particelle uniformi (lattice) sulle quali sono adsorbiti gli antigeni

• Diluzioni scalari (2-fold) del siero vengono cimentate con una quantità fissa di antigene

• In presenza di siero positivo, ossia contenente gli anticorpi specifici, la contenente gli anticorpi specifici, la formazione di immunocomplessi si appalesa con la formazione di aggregati (agglutinazione)

Classici esempi applicativi del test di agglutinazione sono le reazioni di Widal (diagnosi di salmonellosi ) e di Wright (diagnosi di brucellosi )

Diagnosi INDIRETTA C. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA

IF DIRETTA: Sul vetrino viene fissato l’antigene noto marcato con unfluorocromo (isotiocianato di fluorescina) ed il siero, opportunamentediluito, viene messo ad incubare con l’antigene.

IF INDIRETTA: Sul vetrino viene fissato l’antigene noto ed il siero,opportunamente diluito, viene messo ad incubare con l’antigene.Successivamente si aggiungono anticorpi anti-immunoglobuline umane,prodotti in animali e coniugati con isotiocianato di fluoresceina.

Se il campione è positivo, all’osservazione al microscopia a fluorescenzaesso risulterà fluorescente grazie alla formazione dell’immunocomplessomarcato (fluorocromo associato all’antigene).

Indirect fluorescent antibody (IFA) test. The fluorescence indicates that the patient serumbeing tested contains antibodies that are reacting with the antigen preparation (here, Plasmodium falciparum parasites).

Today, the indirect fluorescent antibody test (IFA) provides the only means by which an infection by Elrichiosis can be confirmed. The IFA is useful because it identifies the presence of host antibodies directed against the invading pathogen. However, false negatives may arise due to a prolonged delay of a host's immune response.

Diagnosi INDIRETTA D. Test immunoenzimatico (ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay)

� Si impiega l’antigene fissato su una superficie di plastica (piastra) per catturare e separare l’anticorpo specifico dagli altri anticorpi presenti nel siero del paziente. � L’anticorpo fissato viene quindi evidenziato da un anticorpo anti-IgGumano legato covalentemente ad un enzima (perossidasi, fosfatasi alcalina, β-galattosidasi).alcalina, β-galattosidasi).� La quantificazione avviene con tecniche spettrofotometriche, attraverso la valutazione dell’intensità del colore prodotto in risposta alla conversione enzimatica del relativo substrato cromogeno.

� La reale concentrazione dell’anticorpo viene determinata per confronto con diluizioni standard dell’anticorpo stesso.

Diagnosi INDIRETTA E. SAGGIO RADIOIMMUNOLOGICO (Radioimmunoassay, RIA)

• Marcatura dell’antigene (anticorpo) mediante radioisotopi• Rivelazione del corrispondente anticorpo (antigene)• Competizione tra molecole marcate e non-

– un anticorpo purificato marcato con un radioisotopo compete con un anticorpo standard non marcato per il legame con l’antigeneun anticorpo standard non marcato per il legame con l’antigene

• Misurazione della quantità di radioattività associata all’anticorpo• Il rischio associato all’utilizzo di radioisotopi ne ha limitato la

diffusione a vantaggio dei saggi ELISA

Bibliografia

• Principi di Microbiologia Medica. Antonelli G, Clementi M, Pozzi G, Rossolini GM. 2012 (II edizione). CEA ed.

• Microbiologia clinica. Cevenini. 2010. PICCIN ed.• Microbiologia clinica. Cevenini. 2010. PICCIN ed.