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Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO MIOCÁRDICA, DA ACTIVAÇÃO NEUROHUMORAL E
DA REMODELAGEM NO VENTRÍCULO ESQUERDO DE RATOS COM
HIPERTENSÃO PULMONAR INDUZIDA PELA MONOCROTALINA
Orientador: Professor Doutor Adelino F. Leite-Moreira
André Pedro Leite Martins Lourenço
Porto, 2007
1
ÍNDICE
Página
I – Introdução 2
Sobrecarga mecânica e acção neurohumoral na progressão da insuficiência cardíaca 2
Hipertensão pulmonar 4
Sobrecarga selectiva ventricular direita e acção neurohumoral bi-ventricular 4
Disfunção ventricular esquerda em doentes com hipertensão pulmonar 5
Avanços recentes no conhecimento fisiopatológico, abordagem clínica e
terapêutica da hipertensão pulmonar 6
Modelo experimental de hipertensão pulmonar induzida pela monocrotalina 9
Função ventricular esquerda em modelos de hipertensão pulmonar 10
Activação neuro-endócrina no miocárdio ventricular esquerdo 11
Estudo da função ventricular esquerda em modelos de hipertensão pulmonar 13
Preparações in vitro de feixes miocárdicos ventriculares esquerdos isolados 13
Avaliação hemodinâmica in vivo dos efeitos da sobrecarga aguda sobre a função diastólica 15
II – Objectivos 19
III – Metodologia 20
Modelo experimental 20
Avaliação hemodinâmica 20
Estudos funcionais em feixes musculares miocárdicos 21
Avaliação histológica 21
Estudos de biologia molecular 21
IV - Activação neuroendócrina local e disfunção ventricular esquerda
sem remodelagem na hipertensão pulmonar (trabalho nº1) 23
V - Mecanismos subcelulares e progressão da disfunção ventricular esquerda
num modelo experimental de hipertensão pulmonar (trabalho nº 2) 32
VI – Conclusões 51
VII – Bibliografia 57
2
I - INTRODUÇÃO
Sobrecarga mecânica e acção neurohumoral na progressão da insuficiência cardíaca
Independentemente da etiologia, as alterações da carga ventricular têm sido destacadas entre
os factores clinicamente responsáveis pela progressão da insuficiência cardíaca. O paradigma mais
associado historicamente à fisiopatologia da insuficiência cardíaca assenta no desenvolvimento de
hipertrofia ventricular, redutora da tensão parietal ventricular e da tensão suportada pelos
miocardiócitos, por aumento da espessura da parede ventricular (lei de Laplace), como resposta à
sobrecarga de pressão ventricular (Drazner, 2005). A resposta de hipertrofia miocárdica é um
mecanismo compensatório, a sobrecarga miocitária leva a um crescimento compensatório dos
miócitos, que permite o desenvolvimento de maior força; contudo, este mecanismo acaba por ser
ultrapassado pela persistência da sobrecarga, o crescimento dos miócitos acaba por resultar na
disfunção mecânica e falência do miocárdio (Huang, 2004). Se, inicialmente, a resposta hipertrófica
pode compensar a função cardíaca, a hipertrofia prolongada tem consequências negativas, resultando
em falência miocárdica, o ventrículo entra, então, em falência, sofrendo dilatação e modificação da
forma ventricular, de elipsóide a esférica, dando lugar a um síndroma clínico dominado pelo
congestionamento vascular a jusante (Braunwald, 2001; Hurst, 2004). Embora esta sequência de
eventos nunca tivesse sido inequivocamente comprovada na doença humana (Drazner, 2005), em
modelos experimentais esta progressão está claramente documentada (Hasenfuss, 1998; Hunter,
1999). A maior parte dos casos de insuficiência cardíaca deve-se a uma perda de miocárdio normal,
tipicamente por enfarte, com sobrecarga subsequente do miocárdio viável remanescente (Huang,
2004; Sussman, 2002). Este paradigma mecânico foi, no entanto, posto à prova pela evolução dos
conhecimentos sobre a insuficiência cardíaca e pelas mais recentes inovações terapêuticas. Se é
verdade que a redução da pressão arterial, em doentes hipertensos, previne o desenvolvimento de
hipertrofia e de insuficiência cardíaca, não é menos verdade que a maior parte dos anti-hipertensores
actua por inibição de sistemas neuro-endócrinos, que são intensamente activados na progressão para a
3
insuficiência cardíaca. Mediadores autócrinos/parácrinos e neuroendócrinos que estão associados à
progressão da insuficiência cardíaca são produzidos, tanto pelo miocárdio como por outros tecidos, em
resposta a diversos estímulos, como a sobrecarga ou a isquemia (Baker, 1990; Ferrari, 1999; Katz,
2000). Efectivamente, excluíndo algumas abordagens terapêuticas, que são reservadas para os casos
de gravidade mais extrema, como a transplantação (Lim, 2005), a ressincronização cardíaca, com ou
sem cardio-desfibrilador implantado (Feldman, 2005), os dispositivos de suporte ventricular esquerdo
(Pagani, 1999) ou a oxigenação por membrana em circulação extracorporal (Zwischenberger, 1992),
apenas a interferência farmacológica nos sistemas neuro-endócrinos conseguiu alterar o prognóstico
da insuficiência cardíaca (the SOLVD investigators, 1991). Se é verdade que a sobrecarga de pressão
e as alterações hemodinâmicas são encaradas como factores imprescindíveis para a perturbação, não
só da função miocárdica (Katz, 2000; Leite-Moreira, 1999), como também da fisiologia celular e
molecular do cardiomiócito, nomeadamente no que concerne à homeostasia do cálcio e estrutura e
função dos miofilamentos (Dhalla, 1999; Katz, 2000; Sussman, 2002), facto a que não é alheia a
omnipresença da sobrecarga na maioria dos modelos experimentais de insuficiência cardíaca
(Hasenfuss, 1998), são também claras as evidências que demonstram o papel fundamental de neuro-
hormonas e mediadores locais na modulação da função miocárdica e na regulação da expressão génica
e molecular de proteínas envolvidas na fisiologia contráctil subcelular (Flesch, 1997; Rothermund,
2000). Os mediadores neurohumorais modulam as condições de carga do miocárdio, mas também são
precocemente activados na sequência de eventos que acompanha a sobrecarga mecânica e conduz à
resposta hipertrófica (Guerra, 2006; Roncon-Albuquerque, 2006). De facto, entre os vários
mecanismos moleculares subjacentes à hipertrofia miocárdica os neurohumorais têm sido
particularmente estudados e destacados. Os cardiomiócitos, quando sobrecarregados, libertam
angiotensina II que actua como factor de crescimento parácrino (Sadoshima, 1993), o mesmo
acontecendo para a endotelina-1 (Ito, 1993). Vários mediadores autócrinos/parácrinos, como a
angiotensina II, a endotelina-1 e os peptídeos natriuréticos, têm sido implicados na função cardíaca
(Brunner, 2006; Molkentin, 2003; Moravec, 1990), resposta hipertrófica (Baker, 1990) e remodelagem
4
miocárdica, desempenhando um importante papel fisiopatológico na insuficiência cardíaca, como
agentes promotores de disfunção, hipertrofia e remodelagem, caso do sistema renina-angiotensina-
aldosterona e da endotelina-1 (Flesch, 1997; Rothermund, 2000), ou como sistemas contra-
reguladores, caso dos peptídeos natriuréticos (Molkentin, 2003). Os papéis desempenhados e a
contribuição relativa da sobrecarga e da activação neuro-humoral para a génese da disfunção
miocárdica e da remodelagem subcelular, subjacentes à progressão da insuficiência cardíaca, não
estão, ainda hoje, bem definidos.
Hipertensão pulmonar
Sobrecarga selectiva ventricular direita e acção neurohumoral bi-ventricular
O maior obstáculo ao esclarecimento dos papéis da sobrecarga e da estimulação neuro-
humoral é colocado pela inexistência de modelos experimentais em que os efeitos de uma e outra
possam ser bem individualizados (Hasenfuss, 1998; Koide, 1999). Recentemente, esta questão tem
sido abordada recorrendo a modelos experimentais de hipertensão pulmonar (Kögler, 2003;
Leineweber, 2002; Schott, 2005; Seyfarth, 2000; Sharma, 2004). Efectivamente, tanto na hipertensão
pulmonar induzida experimentalmente como no contexto clínico de hipertensão pulmonar, ambos os
ventrículos são expostos a activação neuro-humoral, enquanto que apenas o ventrículo direito é sujeito
a sobrecarga biomecânica. A maioria destes estudos de ciência básica tem destacado o papel da
sobrecarga na progressão das alterações funcionais e moleculares que acompanham a evolução da
insuficiência cardíaca, uma vez que é o ventrículo direito que apresenta grande parte das alterações
funcionais e moleculares (Chen, 1998; Kögler, 2003; Leineweber, 2002; Schott, 2005; Sharma, 2004).
No entanto, também já foram descritas alterações miocárdicas intrínsecas no ventrículo esquerdo,
semelhantes às que acompanham a progressão da insuficiência cardíaca, em modelos experimentais de
hipertensão pulmonar, destacando-se a comutação das isoformas das cadeias pesadas de miosina, com
aumento das isoformas β (Ishikawa, 1991), e a alteração da expressão proteica de algumas enzimas do
metabolismo bioenergético (Schott, 2005). Não está descrita a alteração das proteínas reguladoras da
5
cinética do cálcio (Kögler, 2003; Sharma, 2004), embora se deva salvaguardar que em modelos
relacionados, de sobrecarga ventricular direita crónica, por constrição da artéria pulmonar tenha sido
observada igualmente alteração destas últimas, concretamente, redução da expressão da SERCA 2a
(ATPase de Ca2+ do retículo sarcoplasmático) e do fosfolambano (LekanneDeprez, 1998).
Disfunção ventricular esquerda em doentes com hipertensão pulmonar
Vários estudos clínicos envolvendo pacientes em estadios avançados de hipertensão pulmonar
reconhecem o desenvolvimento de disfunção ventricular esquerda (Mahmud, 2002; Menzel, 2000;
Schena, 1996; Tutar, 1998). A maior parte das evidências, e opiniões, aponta para a inexistência de
alterações intrínsecas do miocárdio ventricular esquerdo (Dong, 1995; Menzel, 2000; Schena, 1996),
sendo apontados como mecanismos fisiopatológicos a interdependência ventricular, a restricção do
preenchimento ventricular esquerdo (Menzel, 2000) e as alterações geométricas (Dong, 1995; Vonk
Noordegraaf, 1997). O ventrículo esquerdo sofre alterações da sua geometria na dependência da
sobrecarga crónica do ventrículo direito (Tutar, 1998), podendo mesmo ser estabelecida uma
correlação entre o nível de hipertensão pulmonar e a magnitude da disfunção diastólica do ventrículo
esquerdo, avaliada pela razão entre os contributos do preenchimento precoce e da contracção auricular
para o enchimento ventricular, a denominada razão E/A, determinada por ecocardiografia (Moustapha,
2001). Todavia, se a maioria dos trabalhos salienta o papel de factores puramente mecânicos na
fisiopatologia da disfunção ventricular esquerda que acompanha a hipertensão pulmonar grave,
também há várias evidências que sugerem a possibilidade de ocorrência de disfunção contráctil
intrínseca do miocárdio ventricular esquerdo. Vários aspectos da clínica dos doentes com hipertensão
pulmonar não são facilmente explicados se se atender meramente à hipótese mecânica de
interdependência e alterações da geometria e do preenchimento ventricular, sugerindo, por exemplo,
após transplante de pulmão único, em pacientes com hipertensão pulmonar grave e disfunção
ventricular esquerda, a perturbação do relaxamento ventricular esquerdo persiste durante um período
prolongado, após a normalização da geometria e da função ventricular direita (Xie, 1998); de facto,
6
nos casos, em que a hipertensão pulmonar é grave e se faz acompanhar de disfunção quer do
ventrículo direito quer do ventrículo esquerdo, é aconselhado o recurso a transplante conjunto de
coração e pulmão, porque a função ventricular esquerda pode não recuperar se apenas for efectuado
transplante pulmonar (Pielsticker, 2001).
Avanços recentes no conhecimento fisiopatológico, abordagem clínica e terapêutica da hipertensão pulmonar
Os últimos anos têm sido particularmente férteis em investigação clínica e básica no campo da
hipertensão pulmonar, o que se traduz por um conjunto recente de revisões publicadas sobre o tema,
facto a que não são alheios, por um lado, o mau prognóstico, a dificuldade no diagnóstico precoce e a
ausência de armas terapêuticas adequadas (Cool, 2005; Newman, 2004; Provencher, 2005; Rubin,
2005; Rubin, 2006; Rubin, 2006b; Zaiman, 2005) e, por outro lado, o reconhecimento crescente da
importância, em termos de prevalência, das formas secundárias de hipertensão pulmonar
(Higenbottam, 2005; Wright, 2005). De forma resumida, a hipertensão pulmonar pode definir-se como
a elevação da pressão média na artéria pulmonar para valores superiores a 25mmHg em repouso e
superiores a 30mmHg durante o exercício, sendo caracterizada por uma elevação progressiva e
sustentada da resistência vascular pulmonar que, em última análise, conduz à falência cardíaca direita.
As causas clínicas são diversificadas, tendo a classificação diagnóstica da hipertensão pulmonar sido
alvo de revisão recente. Segundo a classificação, inicialmente avançada em Evian, em 1998, e mais
tarde modificada em Veneza, em 2003, algumas formas raras, que já receberam a designação de
hipertensão pulmonar primária, passaram a ser classificadas como hipertensão arterial pulmonar. A
hipertensão arterial pulmonar pode ser familiar, idiopática, ou, ainda, secundária a doenças como a
esclerodermia, doenças do conjuntivo, doença hepática (hipertensão portal, com ou sem cirrose),
infecção pelo vírus da imunodeficiência humana ou à ingestão de fármacos anorexiantes, como a
fentermina e a fenfluramina. No entanto, as formas mais comuns de hipertensão pulmonar não são
incorporadas neste grupo, são as formas resultantes de insuficiência ventricular esquerda
(provavelmente a mais frequente), valvulopatias, doença pulmonar crónica, apneia do sono,
7
cardiopatias congénitas, tromboembolismo pulmonar crónico e residência em elevadas altitudes
(Higenbottam, 2005; Hoeper, 2006; Roy , 2006; Said, 2006). O reconhecimento de que uma grande
parte dos pacientes com doença pulmonar obstrutiva crónica evolui inexoravelmente, com o avançar
dos anos, para formas de hipertensão pulmonar ligeiras a moderadas, e, num número mais restrito de
casos, graves (Wright, 2005), contribuiu, atendendo à grande prevalência destas formas de doença
pulmonar crónica, para uma maior focalização neste tópico,. Efectivamente, a doença pulmonar
obstrutiva crónica é a quarta causa de morte em adultos, e, pela sua incidência, prevê-se que virá a ser
a terceira em 2020 (Naeije, 2005; Szilasi, 2006).
A hipertensão pulmonar arterial é uma doença com consequências devastadoras que, dada a
inespecificidade dos sintomas de apresentação e a baixa prevalência, é diagnosticada usualmente
quando já está presente um estadio avançado de doença vascular, de reversibilidade limitada, sendo
fatal em cerca de 3 anos, caso não seja instituído qualquer tratamento (Provencher, 2005). Apesar dos
avanços terapêuticos das duas últimas décadas, que acrescentaram às estratégias clássicas de
tratamento de suporte (digitálicos, diuréticos, oxigenioterapia, hipocoagulação e bloqueadores dos
canais de cálcio) a terapia crónica com epoprostenol, endovenoso, a terapia com novas formulações de
prostaciclina, inaladas, endovenosas e orais, e a administração crónica de antagonistas dos receptores
da endotelina, o prognóstico continua a estar bem longe do desejável. As novas terapêuticas são
extremamente dispendiosas e conferem apenas ligeiros benefícios na sobrevida e capacidade funcional
(Newman, 2004), condicionando uma melhoria da condição física dos pacientes e o aumento da
sobrevida para cerca de 50% aos 5 anos (Badesch, 2004; Badesch, 2004b; Sitbon, 2005). Em última
análise, a HTP progride e a única alternativa terapêutica é o transplante pulmonar simples ou o
transplante pulmonar combinado de coração e pulmões (Pielsticker, 2001). Um tal facto deve-se, em
larga escala, ao desconhecimento de grande parte dos mecanismos fisiopatológicos subjacentes ao
desenvolvimento desta síndrome. É consensual que vários estímulos podem condicionar a
remodelagem dos vasos pulmonares, nomeadamente a hipóxia, toxinas, infecções víricas, o stress
8
mecânico e o desequilíbrio na produção de mediadores vasoactivos (Cool, 2005; Said, 2006).
Algumas formas terão por mecanimo patogénico alterações genéticas (Cool, 2005; Geraci, 2001). No
entanto, os mecanismos subcelulares e moleculares envolvidos são, na sua maioria, desconhecidos. Há
várias terapêuticas em investigação, incluíndo, inibidores das fosfodiestérases, estatinas, L-arginina,
anti-agregantes, moduladores da função de canais iónicos, inibidores da serotonina, terapia génica, etc
(Newman, 2004). A terapia de combinação também tem suscitado grandes expectativas, encontrando-
se em avaliação em vários ensaios clínicos (Ghofrani, 2003; Humbert, 2004; Itoh, 2004).
Um resultado claro, que emanou das estratégias terapêuticas combinadas, foi a conclusão de
que os benefícios de fármacos que apenas possuem propriedades vasodilatadoras são limitados, o foco
da terapêutica tem evoluído para o controlo da proliferação vascular da hipertensão arterial pulmonar
(Robbins, 2004). Por outro lado, também é reconhecido que a fisiopatologia da hipertensão pulmonar
se caracteriza pela elevação persistente das resistências vasculares pulmonares, com sobrecarga
progressiva do ventrículo direito, que acaba por conduzir, inevitavelmente, à falência do VD e à morte
(Hoeper, 2006; Newman, 2004; Provencher, 2005), sendo o principal determinante do prognóstico a
integridade da função miocárdica, e não o grau de lesão vascular da circulação pulmonar (Provencher,
2005). Contudo, o estudo da função miocárdica e a caracterização molecular do miocárdio estão
praticamente vedados à investigação clínica. A avaliação hemodinâmica invasiva, o estudo da função
contráctil, características moleculares e actividade endócrina do miocárdio e do leito vascular
pulmonar destes pacientes é impossível em termos técnicos e éticos. A investigação em modelos
experimentais de hipertensão pulmonar assume, então, particular relevância. Grande parte dos avanços
no estudo fisiopatológico e terapêutico da hipertensão pulmonar foi dada inicialmente em modelos
experimentais. Por exemplo, a importância da endotelina-1 na fisiopatologia da hipertensão pulmonar
foi inicialmente reconhecida em modelos experimentais (Miyauchi, 1993), tendo mais tarde sido
comprovada em pacientes, nos quais se verificou uma correlação entre os níveis circulantes desta
hormona e a gravidade clínica da hipertensão pulmonar (Nootens, 1995). De igual modo, a eficácia de
9
antagonistas da endotelina-1 na terapêutica da hipertensão pulonar foi, inicialmente, reconhecida em
modelos experimentais (Jasmin, 2001) e, mais tarde, em doentes com hipertensão pulmonar (Rubin,
2002), sendo hoje um pilar da terapêutica crónica de formas mais graves de hipertensão pulmonar. O
Bosentan é uma alternativa, por via oral, aos prostanóides endovenosos, nas formas de hipertensão
pulmonar grave, das classes III e IV, modificadas para a hipertensão pulmonar, da NYHA,
melhorando significativamente quer a capacidade funcional quer um conjunto global de resultados
finais, que inclui a sobrevida, a necessidade de internamento ou de transplante e a necessidade de
iniciar terapêutica endovenosa com prostanóides (Rubin, 2002; Rubin, 2005).
Modelo experimental de hipertensão pulmonar induzida pela monocrotalina
Existem diversos modelos experimentais que, apesar de várias limitações, muito têm
contribuído para o esclarecimento da fisiopatologia da hipertensão pulmonar e para os avanços
terapêuticos mais recentes (Robbins, 2004). O modelo de hipertensão pulmonar induzida pela
monocrotalina no rato, é um modelo experimental adequado ao estudo da sobrecarga crónica do
ventrículo direito e insuficiência cardíaca (Brunner, 1999; Werchan, 1989). Este modelo experimental
é o mais divulgado e mais frequentemente empregue no estudo da hipertensão pulmonar. A
monocrotalina é um alcalóide de acção tóxica, isolado a partir da Crotalaria spectabilis, que provoca
uma endarterite obliterativa das arteríolas pulmonares (Kay, 1967). As lesões histológicas provocadas
são semelhantes às lesões típicas da hipertensão pulmonar, resultante de diversas etiologia, sendo a
monocrotalina desprovida de acção tóxica directa no miocárdio (Chen, 1998; Kay, 1967). Embora
nenhum modelo experimental reproduza por completo as alterações histopatológicas da hipertensão
pulmonar humana (Robbins, 2004; Pietra, 1989), este é dos modelos em que a activação neuro-
humoral mais semelhanças apresenta com a insuficiência cardíaca humana (Brunner, 1999;
Leineweber, 2002), sendo de execução simples, não invasivo e de desenvolvimento gradual e
reprodutível. Este modelo experimental tem sido usado na avaliação de novos fármacos, no contexto
da hipertensão pulmonar (Jasmin, 2001), e no estudo da hipertrofia miocárdica (Buermans, 2005),
10
mas, recentemente, tem-se destacado a sua importância no estudo comparativo das alterações
funcionais e moleculares entre os dois ventrículos (Kögler, 2003; Leineweber, 2002; Schott, 2006;
Seyfarth, 2000). O ventrículo esquerdo dos animais tratados com monocrotalina encontra-se, à
semelhança do ventrículo direito, sob a influência de um ambiente neuro-humoral semelhante ao da
insuficiência cardíaca, as concentrações plasmáticas de noradrenalina (Leineweber, 2002),
angiotensina II e endotelina-1 (Brunner, 1999; Miyauchi, 1993) aumentam precocemente, mas,
contrariamente ao ventrículo direito, não está sujeito a sobrecarga. Então, o estudo funcional e
molecular do ventrículo esquerdo neste modelo experimental permitirá definir melhor os papéis
precisos da sobrecarga e da mediação humoral, assim como as acções efectivas dos mediadores
humorais in vivo, na ausência de sobrecarga.
Função ventricular esquerda em modelos de hipertensão pulmonar
Nos estudos levados a cabo até ao presente, alguns autores não identificaram perturbação da
função no ventrículo esquerdo (Chen, 1998; Kögler, 2003), enquanto outros relatam perturbação da
contractilidade e do relaxamento (Henriques-Coelho, 2004; Jasmin, 2001). As discrepâncias podem
dever-se, muito simplesmente, a diferenças em determinantes fundamentais da gravidade da
hipertensão pulmonar e do desenvolvimento de insuficiência cardíaca neste modelo experimental,
nomeadamente, as idades e pesos dos animais na altura da injecção da monocrotalina, a via de
administração, a dosagem, e o tempo decorrido entre a administração e o estudo funcional e molecular
(Werchan, 1989). No aspecto funcional, a avaliação hemodinâmica invasiva por cateterização das
câmaras cardíacas revela, em modelos experimentais de hipertensão pulmonar, alterações quer na
função sistólica, quer na função diastólica do ventrículo esquerdo, com particular predomínio das
alterações diastólicas (Gomez, 1993; Gomez, 1994; Henriques-Coelho, 2004; Jasmin, 2001). Nos seus
trabalhos, levados a cabo em modelos experimentais de enfisema, Gomez e cols propuseram a
existência de disfunção intrínseca do miocárdio ventricular esquerdo, com base em índices de função
que são pouco influenciados pelas condições de carga, obtidos pela cateterização das câmaras
11
cardíacas, e com base na ausência de alterações significativas do volume da cavidade ventricular
esquerda, avaliado pela implantação de cristais ultrassónicos nos vários diâmetros da cavidade,
avançando como possível hipótese explicativa que o ventrículo direito, sobrecarregado, produzisse
uma substância que actuaria no ventrículo esquerdo induzindo disfunção (Gomez, 1993; Gomez,
1994). Jasmin e cols, por sua vez, verificaram que o tratamento crónico com antagonistas da
endotelina-1 melhorava a sobrevida e o fluxo pulmonar, atenuava a hipertensão pulmonar e melhorava
a função do ventriculo direito, mas, curiosamente, também melhorava os índices hemodinâmicos de
função ventricular esquerda (Jasmin, 2001). Este achado não foi analisado pormenorizadamente pelos
autores, subentendendo-se que a melhoria da função ventricular esquerda se poderia dever à redução
do grau de hipertensão pulmonar e da pressão e hipertrofia do ventrículo direito, e à melhoria do fluxo
pulmonar e, portanto, do preenchimento do ventrículo esquerdo.
Activação neuro-endócrina no miocárdio ventricular esquerdo
Do mesmo modo, não foi discutido ou interpretado o aumento da expressão génica de
endotelina-1 no miocárdio ventricular esquerdo em dois estudos anteriores, levados a cabo no modelo
experimental de hipertensão pulmonar induzida pela monocrotalina (Miyauchi, 1993; Park, 2001). O
papel dos sistemas locais, e teciduais, de mediadores endócrinos tem vindo a ser progressivamente
realçado na fisiopatologia da doença cardiovascular, ultrapassando em relevância a acção endócrina,
sistémica (Iwanaga, 1998; Mizuno, 2001; Takemoto, 1997). O reconhecimento da maior importância
dos sistemas locais abre novas perspectivas na interpretação dos resultados experimentais previamente
sumariados. A disfunção ventricular esquerda identificada no estudo hemodinâmico invasivo (Gomez,
1993; Gomez, 1994; Henriques-Coelho, 2004; Jasmin, 2001) em modelos de hipertensão pulmonar, e
a sua reversibilidade após tratamento com antagonistas da endotelina-1 (Jasmin, 2001), podem muito
bem resultar não só da interacção ventricular e da melhoria da hemodinâmica pulmonar com
atenuação do nível de hipertensão pulmonar e da hipertrofia e dilatação do ventrículo direito, mas
também da inibição da endotelina-1 produzida localmente, nos miócitos do ventrículo esquerdo. A
12
endotelina-1 produzida no miocárdio tem sido implicada em muitas das alterações que acompanham a
progessão da insuficiência cardíaca (Iwanaga, 1998), perturbando quer a contractilidade quer e o
relaxamento miocárdico, por disfunção da homeostasia do cálcio (Onishi, 1999; Rothermund, 2000) e
por alteração da composição dos miofilamentos, nomeadamente por comutação das isoformas da
cadeia pesada da miosina, favorecendo a forma β (Ichikawa, 1996). Esta forma de miosina é
responsável pela diminuição dos índices de contracção e relaxamento que dependem da velocidade
dos ciclos de pontes cruzadas do miocárdio, porque se associa a ciclos lentos de pontes cruzadas
(Dorn, 1994).
Relativamente à possibilidade de ocorrência de activação neuro-endócrina local ventricular
esquerda em modelos experimentais de hipertensão pulmonar, deve ser notado que os trabalhos em
que esta é descrita pela primeira vez (Miyauchi, 1993; Park, 2001) empregaram métodos de
quantificação de ARNm que não podem ser considerados, presentemente, gold standard e que as
metodologias empregues têm sido alvo de críticas em publicações mais recentes (Ding, 2004; Dvořák,
2003). A reprodutibilidade destes achados experimentais deve ser confirmada com métodos mais
modernos de quantificação de ARNm, como o RT-PCR em tempo real. Igualmente relevantes serão,
por um lado, a confirmação da produção de proteína no ventrículo esquerdo e, por outro lado, o estudo
histológico do ventrículo esquerdo e o estudo das alterações moleculares subcelulares do miocárdio,
particularmente as alterações que mais têm sido associadas à progressão da insuficiência cardíaca e à
activação miocárdica da produção de endotelina-1.
Outra questão pertinente que se levanta é o esclarecimento de posssíveis mecanismos que
podem estar na base desta activação neuroendócrina ventricular esquerda na hipertensão pulmonar. O
miocárdio ventricular esquerdo não está sujeito a sobrecarga, ou a unloading. O unloading, que se
pode definir como redução marcada da pré-carga, com atrofia e alterações moleculares características,
que incluem activação neuro-endócrina local (Lisy, 2000; McGowan, 2003), nunca foi descrito em
modelos de hipertensão pulmonar, ao contrário dos modelos de constricção crónica do tronco
13
pulmonar (LekanneDeprez, 1998). Então, outros mecanismos causais, não dependentes da
modificação das condições de carga, devem ser ponderados. A hipoxemia deve seguramente ser
considerada como um possível indutor da expressão génica ventricular esquerda neste modelo de
hipertensão pulmonar (Kakinuma, 2002; Yamashita, 2001). No entanto, a hipóxia que usualmente
acompanha o modelo de hipertensão pulmonar induzida pela monocrotalina é ligeira (Meyrick, 1980;
Yuyama, 2004). A hiperactividade do sistema nervoso simpático e a activação neuroendócrina
sistémica, descritas neste modelo (Brunner, 1999; Leineweber, 2002; Miyauchi, 1993), deverão ser
elementos decisivos na indução da actividade neuro-endócrina do ventrículo esquerdo. Quer as
catecolaminas (Kaddoura, 1996; Moser, 2002), quer a angiotensina II (Ito, 1993; Maki, 1998) são
indutores da expressão génica e síntese de endotelina-1. Outra hipótese conceptualmente atraente, que
não deve ser descurada, atendendo à elevada concentração e produção local destes mediadores,
comparativamente com os níveis circulantes (Dell’Italia, 1997), é que, como previamente sugerido
(Gomez, 1993), alguma substância, neste caso um mediador neuro-endócrino, fosse produzida no
ventrículo direito sobrecarregado, ou no pulmão, actuando preferencialmente e em elevada
concentração no ventrículo esquerdo.
Estudo da função ventricular esquerda em modelos de hipertensão pulmonar
Preparações in vitro de feixes miocárdicos ventriculares esquerdos isolados
Apesar de vários resultados experimentais prévios sugerirem a ocorrência de disfunção
intrínseca do ventrículo esquerdo na hipertensão pulmonar, e mesmo que estes tenham sido obtidos
por avaliação hemodinâmica invasiva, recorrendo a índices relativamente independentes da
modulação pelas condições de carga, como a constante de tempo do relaxamento isovolumétrico, τ
(tau) (Ludbrook, 1979; Weiss, 1976), em animais toracotomizados, nos quais é feita a remoção do
pericárdio (Slinker, 1986) o que, em grande parte, excluí factores de confundimento como a
interacção e a interdependência ventriculares, a única metodologia experimental que garante uma
avaliação da função miocárdica intríseca é o estudo da função contráctil de feixes miocárdicos in vitro
14
uma vez que as condições de carga e a frequência cardíaca são controladas, a influência de
mediadores neuro-humorais sistémicos e a modulação pelo sistema nervoso autónomo são anuladas,
tal como o é a interferência de factores mecânicos como os que medeiam a interdependência
ventricular. A avaliação funcional de feixes de miocárdio ventricular esquerdo em modelos
experimentais de hipertensão pulmonar já foi efectuada por alguns autores e não revelou perturbação
da função em estadios de hipertensão pulmonar ligeira (Brown, 1998; Kögler, 2003), não foi, no
entanto, levada a cabo nas fases de doença mais avançada. Um teste frequentemente empregue para
avaliar a reserva contráctil e o estado funcional do miocárdio é a estimulação miocárdica com
frequências crescentes, a designada relação força frequência. O aumento de contractilidade com a
estimulação em frequência crescente, no âmbito das frequências cardíacas fisiológicas, é um
importante mecanismo regulador intrínseco da contractilidade cardíaca, que, quando está presente
garante a existência de uma normal reserva contráctil. Quando, pelo contrário, o miocárdio perde esta
reserva, e a relação força frequência passa a ser negativa, então, este é um claro indicador de
disfuncão miocárdica. A obtenção de relações força frequência é um excelente meio para avaliar a
gravidade da disfunção contráctil e a capacidade de reserva cardíaca (Endoh, 2004). Adicionalmente,
o estudo da função muscular in vitro permite a modulação aguda por fármacos, possibilitando, por
exemplo, o bloqueio da actividade de sistemas neuro-endócrinos locais, como, por exemplo o da
endotelina-1 (Leite-Moreira, 2003; Leite-Moreira, 2004). Contudo, o estudo do miocárdio ventricular
esquerdo do rato em elevadas frequências de estimulação, levanta dificuldades técnicas particulares,
uma vez que, atendendo às necessidades metabólicas elevadas e à necessidade de nutrição por difusão,
a partir de uma solução perfusora, é necessária a constante renovação desta solução e a dissecção de
feixes ultra-finos de miocárdio, com diâmetros de secção transversa inferiores a 300µm. Para
espessuras superiores de miocárdio e e na ausência de renovação constante de solução as zonas mais
profundas, ou centrais, do miocárdio são colocadas sob stress metabólico e entram em disfunção,
particularmente quando sujeitas a elevadas frequências de estimulação ou maiores sobrecargas.
Efectivamente, as relações força frequência do rato foram consideradas negativas durante longos anos,
15
até à demonstração do contrário em condições particularmente rigidas de solução de perfusão,
temperatura e dissecção fina dos feixes musculares; as baixas temperaturas, a ausência de recirculação
da solução perfusora e o estudo de feixes miocárdicos excessivamente espessos foram considerados os
factores de confundimento responsáveis pelos resultados anteriores que apontavam relações força-
frequências negativas no miocárdio do rato (Layland, 1999).
Avaliação hemodinâmica in vivo dos efeitos da sobrecarga aguda sobre a função diastólica
Outro teste de reserva contráctil pode ser levado a cabo, in vivo, no ventrículo esquerdo de
ratos com hipertensão pulmonar induzida pela monocrotalina. A elevação aguda da pós carga em
batimentos únicos é um teste de stress hemodinâmico que permite detectar disfunção diastólica
incipiente, mesmo que esta não seja evidente nos registos hemodinâmicos basais (Gillebert, 1997;
Leite-Moreira, 1999; Leite-Moreira, 2001; Leite-Moreira, 2006), um pouco à semelhança do que
sucede em alguns pacientes que desenvolvem hipertensão arterial durante o exercício (Warner, 1999)
ou nos pacientes idosos com hipertensão, em que a maior rigidez arterial e ventricular esquerda
durante a sístole se correlaciona com insuficiência cardíaca diastólica (Kawaguchi, 2003). Este teste
de sobrecarga hemodinâmica consiste na oclusão abrupta da aorta ascendente, com início na diástole,
para obter níveis de pós-carga variáveis, desde o valor de pressão máxima do batimento basal ao do
batimento isovolumétrico, em um único batimento teste, por forma a excluir variáveis como a
interdependência e interacção ventriculares e a resposta neurohumoral, que se fariam sentir no caso de
se efectuarem oclusões sustentadas. O efeito sobre a velocidade de relaxamento é avaliado através da
modificação da constante de tempo do relaxamento isovolumétrico, τ, e o efeito final na função
diastólica é avaliado pela análise da relação pressão-volume tele-diastólica. A constante de tempo τ,
cuja unidade é o milisegundo, é obtida após conversão matemática do traçado de pressões, registado
durante o relaxamento isovolumétrico, numa equação matemática que traduz a variação da pressão em
função do tempo. Esta equação é, classicamente, uma função exponencial em que τ é uma variável
que pode ser calculada, para cada traçado de queda de pressão, por exemplo, após conversão
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logarítmica (Weiss, 1976), traduzindo a velocidade da queda de pressões e, portanto, do relaxamento:
a valores elevados de τ corresponde relaxamento mais lento e a valores menores relaxamento mais
rápido. Vários métodos matemáticos alternativos têm sido avançados para reproduzir a queda de
pressões ventricular e calcular τ, destacando-se o modelo logístico (Matsubara, 1995). A definição
hemodinâmica de disfunção diastólica é, classicamente, o desvio positivo da relação pressão-volume
tele-diastólica, que corresponde a pressões mais elevadas para um mesmo volume tele-diastólico e a
uma menor distensibilidade miocárdica (Grossman, 1980; Leite-Moreira, 2006). Durante longos anos
admitiu-se que esta relação só poderia ser modulada cronicamente, por vários factores determinantes
das propriedades passivas do enchimento ventricular (Gilbert & Glantz, 1989; Grossman, 1991) e
nunca pelo comprometimento do relaxamento activo, mas trabalhos mais recentes revelaram que a
elevação aguda da pós-carga pode condicionar quer o prolongamento do relaxamento miocárdico
activo quer a disfunção diastólica (Gillebert, 1997; Leite-Moreira, 1999), independentemente de
variações de pré-carga, mesmo que este efeito seja exacerbado nas pré-cargas mais elevadas (Leite-
Moreira, 2001). Efectivamente, uma sobrecarga de pressão excessiva pode lentificar o relaxamento
activo e prolongar o relaxamento, aumentando a respectiva constante de tempo τ, não permitindo um
relaxamento completo no tempo disponível em diástole, contribuíndo para a elevação da relação
pressão-volume tele-diastólica, ou seja, para a disfunção diastólica. À disfunção diastólica assim
evocada foi atribuída a designação de disfunção diastólica induzida pela pós-carga (Leite-Moreira,
1999; Leite-Moreira, 2001). O efeito da elevação aguda da pós-carga no relaxamento miocárdico e
disfunção diastólica parece ser dependente da espécie animal, sendo mais evidente em coelhos,
oryctolagus cuniculus, do que em rato, Rattus norvegicus (Correia-Pinto, 2003), dependente da
modulação da cinética do cálcio, por exemplo, pela cafeína ou por diferente expressão e actividade de
transportadores envolvidos na homeostasia do cálcio (Correia-Pinto, 2006; Leite-Moreira, 1999b) e do
ventrículo que é sobrecarregado, sendo o ventrículo direito bastante mais sensível à perturbação do
relaxamento induzida pela pós-carga (Correia-Pinto, 2006). Mas mais importante poderá ser a relação
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com o estado funcional do miocárdio. Em corações saudáveis elevações pequenas a moderadas da
pós-carga aceleram a queda de pressões do relaxamento ventricular e só nas sobrecargas extremas é
que há uma lentificação do relaxamento, esta mudança no resultado dos efeitos da pós-carga ocorre
quando é ultrapassada a reserva contráctil, que neste caso se pode designar por reserva de pós-carga
(Gillebert, 1997), podendo quantificar-se reprodutivelmente o grau de pós-carga em que esta ocorre
recorrendo ao conceito de carga relativa. A carga relativa é o cociente entre a pressão sistólica
máxima desenvolvida num batimento pós-carregado e a pressão sistólica máxima do batimento
isovolumétrico, quando estes são obtidos em condições de pré-carga e contractilidade constantes,
podendo apresentar-se como percentagem. Nos corações com compromisso funcional elevações de
pós-carga menos marcadas, ou seja, cargas relativas inferiores, já desencadeiam uma lentificação do
relaxamento miocárdico e até disfunção diastólica, se a lentificação do relaxamento for de tal forma
pronunciada que não permita um relaxamento completo, no final da diástole, provocando uma
elevação da relação pressão-volume tele-diastólica (Gillebert, 1997; Gillebert, 2000; Leite-Moreira,
1994). As elevações agudas de pós-carga geram batimentos teste em que a contractilidade não se
altera, apesar da elevação da pressão sistólica máxima, e em que, portanto, a função sistólica é
insuficiente apesar da contractilidade ser normal, uma circunstância designada por afterload
mismatch, que pode estar presente no coração insuficiente mesmo em condições basais, com pressões
máximas ventriculares esquerdas relativamente normais para um coração saudável, o coração não
dispõem, então, de reserva contráctil de pós-carga, recorrendo à elevação das pressões tele-diastólicas
e à reserva da pré-carga, para manter uma função sistólica normal (Ross, 1976). A redução da pré- e
pós-carga por clampagem da veia cava inferior reverte a lentificação do relaxamento e a elevação da
relação pressão-volume tele-diastólica em modelos experimentais de insuficiência cardíaca (Ishizaka,
1995) e a redução da pré- e pós-carga melhoram a função diastólica em pacientes com edema agudo
do pulmão no contexto de hipertensão arterial e insuficiência cardíaca diastólica isolada (Gandhi,
2001). A identificação de alterações funcionais semelhantes no ventrículo esquerdo em modelos
experimentais de hipertensão pulmonar permitirá não só consubstanciar a existência de disfunção
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miocárdica intrínseca, como também identificar novos mecanismos de descompensação na hipetensão
pulmonar. Evidências emanadas quer de modelos experimentais (Kawaguchi, 1992) quer de estudos
clínicos em pacientes com hipertensão pulmonar (Sun, 2001) apontam para uma grande sensibilidade
ao stress hemodinâmico, sendo reconhecida igualmente a má-resposta à agressão anestésico-cirúrgica
(Kerbaul, 2005). De facto, o stress hemodinâmico pelo exercício tem vindo a ser empregue para
facilitar o diagnóstico precoce de doentes com factores de risco para hipertensão pulmonar
(Provencher, 2005).
19
II- OBJECTIVOS
O principal objectivo dos trabalhos levados a cabo é a demonstração inequívoca da ocorrência
de disfunção miocárdica ventricular esquerda intrínseca no modelo experimental de hipertensão
pulmonar induzida pela monocrotalina.
São objectivos adicionais: (i) estabelecer possíveis mecanimos causais prováveis para a
ocorrência de disfunção sem sobrecarga, nomeadamente, o envolvimento de mecanismos
neuroendócrinos locais; (ii) comparar os dois ventrículos relativamente à função, resposta hipertrófica
e remodelagem miocárdica, por forma a melhor definir quais os papéis relativos da sobrecarga e da
actividade neuro-endócrina na progressão da insuficiência cardíaca; (iii) esclarecer possíveis
mecanismos indutores da actividade neuro-endócrina local do miocárdio ventricular esquerdo; (iv)
esclarecer os mecanismos moleculares subjacentes à disfunção contráctil ventricular esquerda e a
respectiva sequência de activação temporal; e, finalmente, (v) caracterizar in vivo, do ponto de vista
hemodinâmico, a resposta ventricular esquerda a um teste de sobrecarga hemodinâmica por elevação
aguda de pós-carga.
20
III - METODOLOGIA
São tecidas considerações sumárias relativamente à metodologia empregue, sendo os métodos
apresentados com maior detalhe nos trabalhos que incorporam a tese.
Modelo experimental
O modelo experimental empregue é de execução simples, consistindo na administração, por
via subcutânea, em dose única, de 60mg/Kg do alcalóide pirrolizidínico, monocrotalina. Foram
empregues exclusivamente ratos Wistar macho com pesos corporais compreendidos entre 180-200g, e
cerca de 6-7 semanas de idade, estando descrita uma resposta mais ligeira em ratos fêmea (Tofovic,
2005) e respostas variáveis em função da idade (Werchan, 1989). As doses e vias de administração
utilizadas por diferentes grupos de investigadores são algo variáveis, sendo as empregues nos
trabalhos desta tese as mais frequentemente utilizadas. Num subgrupo de animais foi feito tratamento
crónico com o antagonista não-selectivo dos receptores ETA e ETB da endotelina-1, por administração
diária de uma dose de 250mg/Kg através de sonda orogástrica.
Avaliação hemodinâmica
A avaliação hemodinâmica foi levada a cabo em alguns animais, anestesiados com
pentobarbital, administrado por via intraperitoneal, numa dose de 60mg/Kg, ventilados
mecanicamente e sob fluidoterapia com soro fisiológico aquecido, após toracotomia e exérese do
pericárdio. A medição contínua das pressões ventriculares foi efectuada por micromanómetros de alta-
precisão com dimensões de 2F e 3F inseridos nas cavidades ventriculares direita e esquerda,
respectivamente, e os volumes foram registados recorrendo a cristais ultrassónicos implantados nas
paredes septal e lateral do ventrículo esquerdo, sendo a leitura dinâmica das distâncias entre os cristais
efectuada com um sonomicrómetro. Procedeu-se à colheita de registos hemodinâmicos basais e a
registos após oclusões transitórias da aorta ascendente, que elevaram a pós-carga do ventrículo
esquerdo, em ciclos isolados, para valores correspondentes a 60%, 70%, 80% e 90% dos valores de
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pressão máxima do ciclo isovolumétrico, bem como ao registos de ciclos isovolumétricos, sendo
comparados os valores de τ e da pressão telediastólica entre o ciclo basal e o ciclo pós-carregado para
cada nível de pós-carga.
Estudos funcionais em feixes musculares miocárdicos
Noutro grupo de animais foi feita excisão do coração, sob anestesia, sendo este mantido e
dissecado em finos feixes de miocárdio (<300µm) colhidos do ventrículo esquerdo, sob visualização
microscópica, em solução de Krebs-Ringer modificada, a temperatura constante de 35ºC e pH
constante de 7,4, por intermédio de uma mistura de CO2 a 5% em O2. Os feixes miocárdicos foram
então ligados a transdutores de pressão e estimulados a uma frequência de 0,5 Hz até que a preparação
se tornou estável. Em alguns músculos procedeu-se, então, à estimulação com frequências crescentes
até 5 Hz, enquanto que noutros se administraram antagonistas selectivos dos receptores ETA.
No final das experiências realizadas foram pesados os animais, o coração, o ventrículo direito
e o conjunto constituído pelo septo e pela parede livre do ventrículo direito. Algumas amostras foram
processadas para avaliação histológica, enquanto outras foram conservadas para estudos de biologia
molecular.
Avaliação histológica
A avaliação histológica sumária consistiu na determinação dos diâmetros dos cardiomiócitos
da parede livre do ventrículo direito, do septo e da parede livre do ventrículo esquerdo e na coloração
com tricrómio de Masson para análise semi-quantitativa de fibrose miocárdica.
Estudos de biologia molecular
Os estudos de biologia molecular consistiram na quantificação relativa de ARNm por
transcrição reversa e reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) em tempo real de genes envolvidos
na síntese de mediadores neuro-endócrinos locais como a endotelina-1, a enzima de conversão da
22
angiotensina, a síntase da aldosterona, o angiotensinogénio e o peptídeo auricular natriurético do tipo
B, e de genes de proteínas reguladoras da cinética do cálcio, como a ATPase de cálcio do retículo
sarcoplasmático e o fosfolambano. A quantificação da expressão génica como método de avaliação da
actividade neuro-endócrina local é um método aceite, em função da grande dependência da produção
dos mediadores e enzimas envolvidos relativamente à transcrição génica (Iwanaga, 1998; Takemoto,
1997; Roncon-Albuquerque, 2006), contudo no caso da endotelina-1 procedeu-se igualmente à
detecção imunohistoquímica em secções de miocardio, como método de confirmação. Já no caso da
expressão dos genes de proteínas reguladoras da cinética do cálcio, as especulações sobre qualquer
repercussão funcional são mais limitadas, uma vez que a sua actividade é substancialmente modulada,
por exemplo, por mecanismos de fosforilação e desfosforilação (Bers, 2006;Mattiazzi, 2005), o que
não invalida que estejam descritas alterações na expressão génica típicas do miocárdio insuficiente
(Bers, 2006; Hasenfuss, 1998; Katz, 2000). Finalmente, procedeu-se à quantificação relativa das
isoformas proteicas das cadeias pesadas de miosina, α e β, por electroforese em gel de poliacrilamida.
23
IV
ACTIVAÇÃO NEUROENDÓCRINA LOCAL E DISFUNÇÃO VENTRICULAR
ESQUERDA SEM REMODELAGEM NA HIPERTENSÃO PULMONAR
24
V
MECANISMOS SUBCELULARES E PROGRESSÃO DA DISFUNÇÃO
VENTRICULAR ESQUERDA NUM MODELO EXPERIMENTAL DE
HIPERTENSÃO PULMONAR
25
Time Course and Mechanisms of Left Ventricular Systolic and Diastolic
Dysfunction in Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension
(Currently under revision – American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology)
Jorge Correia-Pinto; Tiago Henriques-Coelho; Roberto Roncon-Albuquerque, Jr; André P. Lourenço;
Gustavo Melo-Rocha; Thierry C. Gillebert; Adelino F. Leite-Moreira
From the Department of Physiology, Faculty of Medicine, University of Porto, Porto, Portugal
Running title: LV Dysfunction in Pulmonary Hypertension
Current affiliations:
JC-P, GM-R: Health Sciences School, University of Minho, Braga, Portugal; TH-C, RR-A Jr, APL,
AFL-M: Department of Physiology, Faculty of Medicine, University of Porto, Porto, Portugal. TCG:
Department of Cardiology, University of Ghent, Ghent, Belgium.
Correspondence address:
Professor Adelino F. Leite-Moreira
Department of Physiology, Faculty of Medicine
Alameda Professor Hernâni Monteiro
4200-319 Porto, PORTUGAL
Tel: +351 225513644; Fax: +351 225513646
E.mail: amoreira@med.up.pt
26
ABSTRACT
Although pulmonary hypertension (PH) selectively overloads the right ventricle (RV), autocrine/paracrine
activation and intrinsic myocardial dysfunction have been recently described in the left ventricle (LV). In order to
establish the timing of LV dysfunction development in PH and to further clarify the underlying molecular changes,
Wistar rats were studied 4 and 6 weeks after subcutaneous injection of monocrotaline (MCT), 60 mg/Kg (MCT-4,
n=6; MCT-6, n=6), or vehicle (Ctrl-4, n=6; Ctrl-6, n=6). Acute single-beat stepwise increases of systolic pressure
were performed by constricting the ascending aorta from baseline to isovolumetric (LVPiso). This hemodynamic
stress was used to detect early changes in LV performance. Angiotensin-converting enzyme (ACE), Endothelin-1
(ET-1), Ca2+-ATPase of the sarcoplasmic/endoplasmic reticulum (SERCA2a), and phospholamban (PLB) mRNA
levels, and myosin heavy chain (MHC) protein isoforms were quantified in LV free wall. MCT treatment increased
RV pressures and RV/LV weight ratio, without changing LV end-diastolic pressures or dimensions. ET-1
overexpression and baseline LV dysfunction were present only in MCT-6 rats: dP/dtmax (Ctrl-4=4953±550;
MCT-4=5263±393; Ctrl-6=5197±567; MCT-6=2205±272 mmHg/s; p<0.001); LVPiso (Ctrl-4=194±7;
MCT-4=208±4; Ctrl-6=202±7; MCT-6=132±7 mmHg; p<0.001); dP/dtmin (Ctrl-4=-3144±259; MCT-4=-
3889±143; Ctrl-6=-2674±271; MCT-6=-1434±140 mmHg; p<0.001); time-constant-τ (Ctrl-4=22±2;
MCT-4=19±2; Ctrl-6=20±2; MCT-6=27±2 ms; p=0.003). Afterload elevations prolonged the time-constant-τ and
upward-shifted the end-diastolic pressure-dimension relation in MCT-4 and even more in MCT-6, but not in Ctrl
rats. MHC-isoform switch and ACE upregulation were present in both MCT groups while SERCA2a and PLB
expression were unaltered. In conclusion, rats with severe longstanding PH develop LV dysfunction associated
with ET-1 overexpression. At an earlier stage, however, LV diastolic dysfunction can be detected in response to a
hemodynamic stress, when only LV molecular changes, such as MHC isoform switch and ACE upregulation, are
present.
KEY WORDS: diastole; overload; heart; pulmonary hypertension; neuroendocrine.
27
INTRODUCTION
Although chronic pulmonary hypertension (PH) selectively overloads the right ventricle (RV), left
ventricular (LV) dysfunction also manifests in the course of primary PH (23), chronic thromboembolism (25) and
cor pulmonale (30). Echocardiography-based studies carried out in PH patients suggested that one of the
mechanisms contributing to LV dysfunction is ventricular interdependence and impaired LV filling (25). Other
studies, however, provide evidences that intrinsic LV myocardial abnormalities also contribute to LV dysfunction
in severe PH (5; 6; 24). In fact, the LV of rats with severe longstanding PH induced by monocrotaline (MCT)
presents local autocrine/paracrine system activation and muscle strips dissected from the LV myocardium show, in
vitro, negative force-frequency relationships (FFR) (24). Intrinsic LV myocardial abnormalities might help to
explain late recovery of LV filling after single-lung transplantation in patients with PH, even if LV geometry and
RV function are immediately restored (36). They might explain as well, why combined heart-lung transplantation is
favored for PH patients when severe impairment of LV function is present, since LV function may not sufficiently
recover after transplantation of the lungs alone (28).
The timing of development and the underlying mechanisms of intrinsic LV myocardial dysfunction were
incompletely investigated so far. In the present study, we analyzed biventricular hemodynamics and LV myocardial
expression of angiotensin converting enzyme (ACE), endothelin-1, sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-
ATPase, and phospholamban, and myosin heavy chain (MHC) protein isoforms, 4 weeks and 6 weeks after MCT
injection in the rat. Hemodynamics were studied at baseline and in response to single-beat afterload elevations,
which allow the detection of diastolic dysfunction that may not be evident during evaluation at rest, but is revealed
during exercise or hemodynamic stress (4; 34; 13; 21).
METHODS
Animal protocol
Animal experiments were performed according to the Portuguese law on animal welfare and conform to
the APS guiding principles in the care and use of animals and the Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals published by the US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revised 1996). Seven-
28
weeks-old male Wistar rats (n=48; CHARLES-RIVER, Barcelona, Spain) were housed in groups of 3 per cage in a
controlled environment under a 12:12h light/dark cycle at a room temperature of 22ºC. Rats randomly received, a
subcutaneous injection of monocrotaline (MCT, 60 mg/Kg; SIGMA CHEMICAL, St. Louis, MO; n=36) or an
equal volume of vehicle (Ctrl, n=12; 1 mL/Kg). Animals had free supply of food and water. Hemodynamic studies
and collection of samples for molecular studies were carried out, for control and MCT-treated rats, at days 22, 24 or
26 (4th week), Ctrl-4 (n=6) and MCT-4 (n=6), respectively, and at days 36, 38 or 40 (6th week) after injection, Ctrl-
6 (n=6) and MCT-6 (n=6), respectively.
Hemodynamic studies
Experimental preparation: Animals were anesthetized with an intraperitoneal injection of 60mg/Kg
pentobarbital sodium and additional boluses of 20 mg/Kg when needed, placed over a heating pad, and
mechanically ventilated (HARVARD RODENT VENTILATOR model 683) through a tracheostomy. The right
jugular vein was cannulated and a pre-warmed 0.9% NaCl solution was administrated to compensate for
perioperative fluid losses. The heart was exposed through a median sternotomy and the pericardium widely
opened. The ascending aorta was dissected and surrounded by a silk thread in order to transiently occlude it
during the experimental protocol. RV pressure was measured with a 2F high-fidelity micromanometer (SPR-
324, MILLAR INSTRUMENTS, Houston, Texas) inserted through the RV free wall into the RV cavity and LV
pressure with a 3F high-fidelity micromanometer (SPR-407, MILLAR INSTRUMENTS, Houston, Texas)
inserted through an apical puncture into the LV cavity. LV septal to free wall diameter was recorded with
ultrasonic crystals using a sonomicrometer amplifier (TRITON TECHNOLOGY, San Diego, CA). One crystal
was placed into the left border of the interventricular septum and the other on the epicardial surface of the LV
free wall, as previously described (1; 2). A limb ECG (II) was recorded throughout. After the instrumentation
period (typically 60 minutes), the animal was allowed to stabilize for 15 minutes before the beginning of the
experimental protocol. Recordings were made with ventilation suspended at end-expiration. Parameters were
converted on line to digital data with a sampling frequency of 1000 Hz.
Data analysis: Peak rates of LV and RV pressure rise (dP/dtmax) and fall (dP/dtmin) were determined.
RV and LV pressures were measured at end-diastole (EDRVP and EDLVP, respectively) and at peak-systole
(RVPmax and LVPmax). Relaxation rate was estimated with the time constant τ, by fitting isovolumetric LV
29
pressure fall to a monoexponential function. From baseline to isovolumetric, multiple graded LV pressure
elevations were randomly performed by abruptly clamping the ascending aortic root starting in the diastole
separating two heartbeats, as previously described (18; 19; 1; 2). Beats preceding aortic obstruction were
designated as baseline heartbeats and those immediately following it as test beats. Along with the baseline
hemodynamics, four afterloaded test-beats with a peak systolic pressure of approximately 60%, 70%, 80%, and
90% of the isovolumetric pressures, and the isovolumetric test-beat were selected for analysis. LV septum to
free wall diameter was measured at end-diastole. Afterload-induced shifts of the end-diastolic pressure-
dimension relation (EDPDR) were assessed by measuring diastolic pressures at matched dimensions, close to
end-diastole, as previously described (18; 19; 1; 2).
At the end of the hemodynamic study animals were euthanized with anesthetic overdose, the position
of crystals and manometers was verified, the RV was carefully dissected from the interventricular septum and
LV free wall, and transmural samples of LV free wall (excluding the septum) were collected for molecular
studies. Two MCT-6 rats died during hemodynamic instrumentation, having been excluded from analysis.
Molecular studies
Relative quantification of mRNA
Two-step Real-time RT-PCR was performed as previously described (24; 9; 8; 29). Briefly, after total
mRNA extraction (no. 74124, QIAGEN), standard curves were obtained using graded dilutions of a rat cardiac
tissue sample. The starting mRNA quantities were correlated (R≥ 0.98) with the respective threshold cycles, for
each gene. Threshold cycles were automatically calculated by software (LightCycler, ROCHE) using the
second derivative maximum method. An equal amount of mRNA from every sample underwent two separate
two-step real time RT-PCR experiments for each gene, using SYBR green as marker (no. 204143, QIAGEN).
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as internal control since its mRNA levels
were similar in the studied groups. Results are normalized for GAPDH and presented in arbitrary units. The
arbitrary unit was set as the mean obtained for the Ctrl-4 group. Specific PCR primer pairs for the studied genes
were: endothelin-1, fw 5’ - CCA TGC AGA AAG GCG TAA AAG - 3’, rev 5’ - CGG GGC TCT GTA GTC
AAT GTG - 3’; angiotensin-converting enzyme, fw 5’ - GCA GGC CAG CAG GGT CCA CTA CAC - 3’, rev
5’ - GAC CTC GCC ATT CCG CTG ATT CT - 3’; sarcoendoplasmic reticulum calcium-ATPase isoform 2a
30
(SERCA2a) fw 5’ - CGA GTT GAA CCT TCC CAC AA - 3’, rev 5’ - GGA GGA GAT GAG GTA GCG GAT
GGA - 3’; phospholamban fw 5’ - GGC ATC ATG GAA AAA GTC CA -3’, rev 5’ - GGT GGA GGG CCA
GGT TGT AA - 3’; and GADPH, fw 5’ - TGG CCT TCC GTG TTC CTA CCC - 3’, rev 5’ - CCG CCT GCT
TCA CCA CCT TCT - 3’.
Relative Quantification of myosin heavy-chain isoforms
Total protein (15 µg) was separated by SDS-PAGE (3.0 % stacking and 5.0 % running polyacrylamide
gels). Electrophoresis was carried out at constant voltage (60 volt) for ~270 min (no. 165-3301, BIO-RAD),
allowing the separation of myosin heavy-chain isoforms α and β isoforms in two distinct bands visible at ~200
KDa. Gels were silver-stained following the manufacturer’s instructions (no. 161-0449, BIO-RAD) and the relative
amount of the myosin heavy-chain isoforms in each sample was quantified by densitometry (Multilmage Light
Cabinet; ALPHA INNOTECH CORPORATION).
Statistical Analysis
Values were expressed as mean±SEM. Differences in baseline hemodynamic parameters, morphology, and
molecular studies were evaluated by two-way ANOVA. Three-way ANOVA was employed to compare data from
graded afterload elevations. Holm-Sidak’s method was used for multiple comparisons when significant differences
were detected. Statistical significance was assumed at a two-tailed value of P<0.05.
RESULTS
All MCT-6 animals presented clinical signs of congestive heart failure such as lethargic behavior, ruffled
fur, cachexia, tachypnea and severe breathing effort, pleural effusion, and ascites. MCT-4 animals behaved
similarly to control animals. Mortality was null in Ctrl-4 and Ctrl-6, 33% in MCT-4 and 70% in MCT-6. No
significant differences were observed between Ctrl-4 and Ctrl-6 for morphometric, hemodynamic and molecular
parameters.
31
Baseline hemodynamics and morphometry
MCT treatment resulted in progressively increasing RV peak-systolic pressures (P<0.001; Figure 1A).
Increased RV pressures were accompanied by selective RV hypertrophy (Table 1), as denoted by the progressive
increase of the RV to LV plus interventricular septum weight ratio (P<0.001; Figure 1B). RV end-diastolic
pressures were significantly increased in MCT-6 (3.9±0.7 vs 1.9±0.5, 0.5±0.3, and 1.1±0.6 mmHg, in MCT-4, Ctrl-
4, and Ctrl-6, respectively; P=0.005). Compared with the other groups, MCT-6 also presented lower body weight
(table 1) and heart rate (200±17 vs 287±7, 265±20, and 270±20 beats/min, in MCT-4, Ctrl-4, and Ctrl-6,
respectively; P=0.025).
Figure 1
Figure 1. Development of pulmonary hypertension and selective RV hypertrophy in response to monocrotaline
(MCT) injection. A: Peak systolic right ventricular pressures (RVPmax). B: Right ventricular (RV) weight/left ventricular
plus interventricular septum (LV+S) weight ratio. RVPmax progressively increased in MCT-4 (*P=0.006 vs Ctrl-4) and
MCT-6 (*P<0.001 vs Ctrl-6; †P=0.016 vs MCT-4); RV weight to LV weight ratio also increased in MCT-4 (*P=0.006 vs
Ctrl-4) and MCT-6 (*P<0.001 vs Ctrl-6; †P<0.001 vs MCT-4); n=6 in each group.
Table 1 – Morphological parameters.
Ctrl-4 MCT-4 Ctrl-6 MCT-6
BW, g 239 ± 25 270 ± 13 258 ± 38 185 ± 14*†
HW/BW, mg/g 3.3 ± 0.1 3.5 ± 0.1 3.1 ± 0.1 4.9 ± 0.2*†
RVW/HW, g/g 0.13 ± 0.01 0.21 ± 0.02* 0.14 ± 0.03 0.25 ± 0.01*†
Data are presented as mean±SE, n=6 in each group. BW, body weight; HW, heart weight; RVW, right
ventricular weight. P<0.05: * vs control at the same week; † vs MCT-4.
Both systolic (Figure 2) and diastolic parameters (Figures 3) were preserved at baseline in the LV of MCT-
4. MCT-6 animals, however, presented low peak LV systolic pressure (P<0.001) and disturbed indexes of both LV
contractility (Figure 2), such as reduced peak isovolumetric pressures (P<0.001) and dP/dtmax (P<0.001), and LV
32
relaxation (Figure 3), such as reduced dP/dtmin (P<0.001) and prolonged time constant τ (P=0.003). Despite these
hemodynamic disturbances neither the EDLVP nor the EDLVD were changed (Figure 3).
Figure 2
Figure 2. Left ventricular (LV) systolic hemodynamic parameters. A: Peak systolic LV pressure (LVPmax). B:
Peak isovolumetric LV pressure (LVPiso). C: Peak rate of LV pressure rise (dP/dtmax). *P<0.001 vs Ctrl-6, †P<0.001 vs
MCT-4, n=6 in each group.
Figure 3
Figure 3. Left ventricular (LV) diastolic hemodynamic parameters. A: End diastolic left ventricular (LV) pressure
(EDLVP). B: End diastolic LV dimensions (EDLVD). C: Peak rate of LV pressure fall (dP/dtmin). D: LV time constant τ.
Significant differences were found for dP/dtmin (*P=0.03 for MCT-4 and <0.001 for MCT-6 vs respective Ctrl group,
†P<0.001 vs MCT-4) and τ (*P=0.003 vs Ctrl-6, †P=0.036 vs MCT-4) whereas no differences were observed for EDLVP
and EDLVD; n=6 in each group.
Response of diastolic function to afterload elevations
Both MCT-4 and MCT-6 revealed an impaired response of diastolic function to afterload elevations
(Figure 4). This figure displays changes in the time constant τ (left panel) and shifts of the EDPDR (right panel)
with increasing afterloads. Effects on τ are expressed by the ratio of test to baseline beats values. Time constant τ
was differently affected by afterload in control and in MCT-treated rats. Control animals responded to afterload
elevations with shortening of τ (acceleration of pressure fall) for almost the entire range of systolic LV pressures,
apart from isovolumetric beats that showed a non-significant change in τ. On the contrary, MCT-treated animals
responded to afterload elevations with a prolongation of τ (slowing of pressure fall). This slowing was observed
33
only with the two highest afterload levels in MCT-4, while in MCT-6 such slowing was more pronounced and
present over the entire range of systolic LV pressures. With regard to the EDPDR, in response to afterload
elevations, it remained unaffected in control animals, but was upward shifted in both MCT-4 and MCT-6 groups.
This upward shift was of similar magnitude in MCT-4 and MCT-6, but occurred at much lower systolic LV
pressures in the later, so that MCT-6 curve in the right panel of Figure 4 is shifted to the left.
Figure 4
Figure 4. Effects of acute left ventricular (LV) afterload elevations on LV diastolic function. A: Fractional changes in
time constant τ (τtest/τbaseline). B: Upward shift in the end-diastolic pressure-dimension relation (EDPDR). Six beats with
progressively higher peak systolic LV pressure (LVPmax) are represented: baseline, test-beats with a peak systolic LV pressure
corresponding to 60%, 70%, 80%, and 90% of the isovolumetric beat, and the isovolumetric test-beat (LVPiso); n=6 in each
group. MCT-treated rats, distinctly from controls (*P<0.001), presented a prolongation of the time constant τ in test beats
compared with baseline beat (†P<0.001), while controls presented an overall acceleration of relaxation and shortening of τ,
with the exception of the isovolumetric test beats. In MCT-6 the changes in τ were more striking and observed for lower
afterload levels than in MCT-4 (‡P=0.007). The upward shift of EDPDR in test-beats compared with baseline beat (†P<0.01)
was more pronounced and observed for lower afterload levels in MCT-treated rats compared with controls (*P=0.008).
LV myofilaments and neuroendocrine and calcium-handling gene expression
The expression of genes involved in autocrine/paracrine systems was upregulated in the LV myocardium
of MCT-treated rats compared with controls (Figure 5). Angiotensin-converting enzyme mRNA levels were
progressively increased in MCT-4 and MCT-6 (P<0.05), whereas endothelin-1 expression was only elevated in
MCT-6 (P<0.05). While the expression of calcium-handling genes such as the Ca2+-ATPase of the
sarcoplasmic/endoplasmic reticulum and phospholamban was unchanged in both MCT-4 and MCT-6 groups
(Figure 6), a significant elevation of myosin heavy-chain β-isoform was observed in the myofilament composition
of both MCT-4 (P=0.003) and MCT-6 (P=0.005) LV myocardium compared with Ctrl-4 and Ctrl-6, respectively
(Figure 7).
Figure 5
34
Figure 5. Left ventricular (LV) mRNA levels
of angiotensin-converting enzyme (ACE; panel A) and
endothelin-1 (ET-1; panel B) in rats with monocrotaline
(MTC)-induced pulmonary hypertension (MCT-4, n=6;
MCT-6, n=6) and controls (Ctrl-4, n=6; Ctrl-6, n=6), 4
and 6 weeks after injection, respectively. Results are
expressed as arbitrary units after normalization for
GAPDH. The arbitrary unit was set as the average value
of the Ctrl-4 group. ACE mRNA levels progressively
increased in MCT-4 (*P=0.002 vs Ctrl-4) and MCT-6
(*P=0.033 vs Ctrl-6, †P=0.032 vs MCT-4), whereas ET-
1 mRNA levels were only increased 6 weeks after MCT
injection (*P=0.033 vs Ctrl-6, †P=0.002 vs MCT-4).
Figure 6
Figure 6. Left ventricular (LV) mRNA levels
of saroendoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA2a;
panel A) and phospholamban (PLB; panel B) in rats with
monocrotaline-induced pulmonary hypertension (MCT)
and controls (Ctrl) 4 and 6 weeks after injection. Results
are expressed as arbitrary units after normalization for
GAPDH. The arbitrary unit was set as the average value
of the Ctrl-4 group. No significant differences were
observed, n=6 in each group.
35
Figure 7
Figure 7. Myosin heavy chain (MHC) isoform switch in monocrotaline-induced pulmonary hypertension, manifested
as a significant increase of the β-MHC isoform that was similar in the MCT-4 and MCT-6 groups. *P<0.01 vs control, at the
same week; n=6 in each group.
DISCUSSION
The present study was undertaken to investigate the onset and progression of LV dysfunction in the course of
PH, as well as, the underlying changes in myofilaments and local neurohumoral activation. A hemodynamic stress test
with single-beat afterload elevations was used to detect early, load dependent, changes in LV diastolic function in
animals with MCT induced PH.
MCT-treated rats progressively developed PH, as evaluated by RVPmax, selective RV myocardial hypertrophy,
and increased EDRVP. As previously reported (24), MCT-6 rats showed clinical signs of congestive heart failure,
disturbed indexes of LV contractility and relaxation, and increased expression of ACE and ET-1 in the LV
myocardium. A more detailed discussion on the possible causes of neuroendocrine activation in the non-overloaded LV
is provided elsewhere (24). MCT-6 animals also presented reductions in body weight and LVPmax, previously
interpreted as consequence of continuous severe sickness (26), as well as, diminished heart rate, suggesting an
attenuation of the sympathetic nervous system response (16; 24). In contrast, MCT-4 rats showed no baseline LV
hemodynamic changes. Nonetheless, single afterloaded test-beats revealed diastolic function impairment in MCT-4.
Systolic performance, as assessed by the contractility indexes LVPiso and dP/dtmax, was unchanged, but diastolic
36
dysfunction was elicited in response to increased afterload (afterload-induced diastolic dysfunction; 18; 19). Diastole
was evaluated with the time constant of isovolumetric relaxation τ and the end-diastolic pressure-volume relation
(EDPVR), the former evaluates relaxation rate while the latter allows a wider scope on diastolic function. The dynamic
process of myocardial relaxation goes on from the ejection phase to the early filling period. The main hemodynamic
manifestation of myocardial relaxation, however, is LV pressure fall and its analysis, through the time constant τ,
allows a description of the course of myocardial relaxation (21). Changes in afterload modify τ and the rate of LV
pressure fall. While in healthy hearts small afterload elevations accelerate LV pressure fall and only marked afterload
increases slow it, in failing hearts even slight increases in afterload may induce slower relaxation. At a similar systolic
LV pressure, in failing hearts the relative load, defined as the ratio of systolic LV pressure to isovolumetric LV
pressure, is higher, the afterload reserve is surpassed and afterload mismatch yields a pronounced slowing of LV
pressure fall, compared with healthy hearts (4; 17).
Diastolic dysfunction is commonly defined, in hemodynamic terms, by an upward displacement of the EDPVR
(21), which reflects a decrease in diastolic distensibility (7). Classically, it was held that only chronic conditions that
altered the compliance and distensibility of the LV could change the filling conditions to the point of modifying the
EDPVR. However, more recent work demonstrated that the EDPVR could be acutely shifted by load (18; 19) and
neurohumoral stimulation (20; 22; 27). Afterload mismatch induces incomplete myocardial relaxation that can be large
enough to increase LV pressure at end-diastole and cause diastolic dysfunction. Compared with control rats, MCT-
treated rats developed prolongation of time constant τ and a larger upward shift of the EDPDR indicating that afterload
mismatch occurred at lower relative loads. Curiously, although MCT-6, unlike MCT-4, presented prolongation of τ at
baseline that was aggravated with every step up in relative load, there were no differences between the two groups
regarding the upward shift of the EDPDR induced by afterload. One possible reason is the difference in heart rates.
Inappropriate increases in heart rate are known to upwardly displace the EDPVR even if relaxation rate is normal (35),
conversely, the reduction in the heart rate of MCT-6 may have partly reverted afterload-dependent diastolic dysfunction
by increasing the time available for relaxation and the extent of relaxation. Animals and patients with PH are known to
respond badly to hemodynamic stress (12; 33). The present results suggest that increased systemic blood pressures may
induce, or contribute to, hemodynamic deterioration in PH by leading to, or worsening of, LV diastolic dysfunction.
One of the most likely subcellular candidates for myocardial dysfunction is the altered myofilament
composition. MCT-treated rats presented myosin heavy-chain isoform switch in the LV myocardium. The slower β-
37
isoform was increased in the LV of both MCT-4 and MCT-6, as previously reported for MCT (10) and hypoxia-
induced PH (32). Changes in the expression of enzymes involved in bioenergetics and cell metabolism such as
pyruvate dehydrogenase kinase-4, acetyl-CoA dehydrogenase and mitochondrial ATP synthase have also been
described in the LV of PH rats (31; 32). Contrastingly, calcium kinetics regulator proteins such as the Ca2+-ATPase of
the sarcoendoplasmic reticulum and phospholamban were consistently reported to be unaltered in the non-overloaded
LV (14; 31; 32). The present study extends the later findings to a stage of severe disease, when LV dysfunction has
already developed, but we must point out that changes in phospholamban phosphorylation have recently been identified
in the LV of mice with hypoxia-induced pulmonary hypertension (15). Regarding local autocrine/paracrine related gene
expression, MCT-4 rats showed increased ACE mRNA levels in the LV myocardium. However, only MCT-6 rats
presented markedly increased expression of ET-1, and ACE was further upregulated compared with MCT-4. The
activation of autocrine/paracrine systems, particularly for ET-1, was concomitant with the development of LV systolic
and diastolic dysfunction in the baseline hemodynamic evaluation. It has been suggested that cardiac ET-1 may play a
critical role in the functional deterioration of LV during the transition to congestive heart failure (11), indeed, chronic
administration of ET-1, for 5 days, to engineered heart tissues, derived from cells of neonatal rat hearts, decreased the
contractile response to calcium and isoprenaline and changed myosin heavy.chain isoform and sarcoendoplasmic
reticulum Ca2+-ATPase expression in a signaling pathway that involved protein kinase-C and the Na+/H+ exchanger
(37). Lower heart rate, LVPmax and LV dysfunction under the stress of anesthesia and surgical manipulation could well
be partly the consequence of refractoriness to adrenergic stimulation mentioned above. Although we also found
modifications in myosin heavy-chain isoform we did not observe changes in sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPase
expression, but the experimental settings are not comparable. Further supporting the possibility that endothelin-1 might
have an important role modulating LV function in PH we have previously demonstrated that chronic ET-1 blockade
prevents functional deterioration of the LV myocardium in PH rats, restoring normal contractile response to increasing
frequencies of stimulation (24).
In conclusion, selectively RV overloaded MCT-treated rats develop, on hemodynamic assessment, LV
dysfunction that is accompanied by myosin heavy-chain isoform switch and local LV autocrine/paracrine system
activation. Despite the changes in myocardial molecular phenotype, such as MHC isoform switch and ACE
upregulation, in the LV, four weeks after MCT injection, diastolic dysfunction can only be detected in MCT-4 by
increasing afterload. Two weeks later, however, the LV myocardium of MCT-6 overexpresses ET-1 and presents
38
baseline systolic and diastolic dysfunction. ET-1 may participate in the transition to LV dysfunction and congestive
heart failure in PH. Afterload-dependent diastolic disturbances of the LV may herald, or contribute to, hemodynamic
deterioration in PH.
ACKNOWLEDGEMENTS
Supported by Portuguese grants from FCT (PRAXIS/SAU/11301/98; partially funded by FEDER) and Calouste
Gulbenkian Foundation, through Unidade I&D Cardiovascular (51/94-FCT). There are no conflicts of interest to
disclose.
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43
VI - CONCLUSÕES
Quer a avaliação hemodinâmica invasiva, basal e com elevação de pós-carga, quer a avaliação
in vitro da contractilidade miocárdica ventricular esquerda nos estadios mais avançados de hipertensão
pulmonar, com sinais clínicos de insuficiência cardíaca, denotam disfunção miocárdica intrínseca,
sendo particularmente relevante o achado de relações força–frequência negativas. Estudos anteriores,
levados a cabo neste modelo experimental, em fases mais precoces, com hipertensão pulmonar menos
grave, reveleram relações força-frequência positivas, embora fosse clara uma tendência para
diferenças em relação aos controlos (Kögler, 2003). Embora este modelo seja um modelo
experimental animal, que não tem uma correspondência directa com qualquer patologia humana (Kay,
1967; Pietra, 1989; Robbins, 2004), e, portanto, não se possa fazer uma extrapolação directa dos
resultados para a fisiopatologia da hipertensão pulmonar, estes enquadram-se bem com alguns
achados clínicos dos doentes com HTP grave e disfunção ventricular esquerda, nos quais se opta
frequentemente por transplantação combinada de pulmão e coração, uma vez que a disfunção
ventricular não é, na maior parte dos casos, reversível com o transplante pulmonar isolado
(Pielsticker, 2001). Quando estes pacientes são submetidos a transplante pulmonar de pulmão único,
só um ano após transplantação recuperam o preenchimento VE normal, mesmo que o
restabelecimento da função VD e da geometria do VE ocorra bem mais precocemente (Xie, 1998).
A activação neuro-endócrina miocárdica no modelo experimental de hipertensão pulmonar
induzida pela monocrotalina ocorre não só no ventrículo direito sobrecarregado, mas também no
ventrículo esquerdo. Os trabalhos experimentais desta tese são os primeiros que se centram neste tema
e fazem prova inequívoca desta hipótese. No entanto, a activação ventricular esquerda parece ser
selectiva. Não se verifica para o peptídeo natriurético do tipo B e no caso da enzima de conversão da
angiotensina é mais significativa no ventrículo direito do que no ventrículo esquerdo. A endotelina-1,
contudo, aumenta de forma indiferenciada em ambos os ventrículos, apresentando, até, uma tendência
para uma maior elevação no ventrículo esquerdo, que foi confirmada a nível da proteína, uma vez que
44
a maior marcação imunohistoquímica foi idêntica num e noutro ventrículo. Os factores subjacentes à
activação neuro-endócrina ventricular esquerda não ficam completamente definidos nos trabalhos
experimentais desta tese, embora esta seja a primeira a focar o tema. Não parece ser explicada por
alterações das condições de carga, uma vez que não se registou alteração nas pressões ou volumes
tele-diastólicos do ventrículo esquerdo. Não deve ser interpretada assumindo que o miocárdio
ventricular esquerdo está em continuidade directa com o ventrículo direito, pois houve diferenças
claras no perfil de activação da expressão génica entre os dois ventrículos. A expressão do peptídeo
natriurético do tipo B não foi activada no ventrículo esquerdo, à semelhança do que já havia sido
descrito por outros autores para o peptídeo natriurético do tipo A (Partovian, 1998). Pode também
excluir-se a toxicidade da monocrotalina, uma vez que esta é desprovida de efeitos directos na
estrutura miocárdica (Kay, 1967), e, como as amostras de miocárdio foram colhidas da parede livre, e
não do septo, a sobrecarga do septo pela hipertensão pulmonar também não pode explicar os
resultados. Embora não se possa excluir definitivamente o papel da hipoxemia, o facto de não se terem
encontrado diferenças na expressão génica do factor de transcrição indutível pela hipóxia-1α, factor
que está muito associado aos mecanismos subcelulares da indução da expressão génica da endotelina-
1 pela hipóxia (Kakinuma, 2001), não apoia esta possibilidade. Resta, finalmente, a hipótese, muito
provável, de que sejam mediadores neuro-endócrinos a induzir a activação neuroendócrina ventricular
esquerda. Tanto o sistema nervoso simpático (Kaddoura, 1996; Moser, 2002), como a angiotensina II
(Ito, 1993; Maki, 1998), são indutores da expressão génica da endotelina-1, e os níveis séricos de
ambos os mediadores estão aumentados (Brunner, 1999; Leineweber, 2002). Os trabalhos levados a
cabo permitem, no entanto, especular quanto a possíveis acções parácrinas ou endócrinas específicas.
De facto, demonstrou-se, particularmente, grande activação da produção tecidual local, destes
mediadores, não apenas no ventrículo esquerdo, caso da endotelina-1, mas também no ventrículo
direito, caso da enzima de conversão da angiotensina, sendo segura a maior produção local de
angiotensina II, à semelhança do que acontece no ventrículo esquerdo, quando sobrecarregado
(Schunkert, 1990). É reconhecida a maior importância fisiopatológica e quantitativa do sistema
45
renina-angiotensina local, relativamente ao sistémico (Dell’Italia, 1997; Kyriakidis, 1998; Takemoto,
1997), e também o seu papel como indutor da expressão da endotelina-1 (Clavell, 1996; Fujisaki,
1995; Ito, 1993). Atendendo à proximidade dos ventrículos e à comunicação através da circulação
pulmonar, não seria surpreendente que a maior produção ventricular direita de factores parácrinos e
endócrinos como a angiotensina II fosse responsável pela indução da expressão génica ventricular
esquerda, particularmente no caso da endotelina-1. De facto, apesar destas não constituírem
argumento de causalidade, pudemos estabelecer correlações fortes entre a expressão de ARNm da
enzima de conversão da angiotensina ventricular direita com a de endotelina-1 ventricular esquerda,
ao passo que a correlação entre a expressão de endotelina-1 no ventrículo direito e a de enzima
conversora da angiotensina no ventrículo esquerdo não foi significativa (dados não publicados). Estes
resultados apoiam a hipótese previamente avançada de que uma substância produzida no ventrículo
direito sobrecarregado pudesse actuar no ventrículo esquerdo induzindo alterações funcionais
(Gomez, 1993; Gomez, 1994).
Apesar da activação neuro-endócrina de sistemas classicamente associados a hipertrofia e
fibrose miocárdica, sem activação concomitante de um importante sistema contra-regulador, como o
dos peptídeos natriuréticos, foi no ventrículo direito que se identificou hipertrofia cardiomiocitária e
fibrose, e não no ventrículo esquerdo, o que reforça quer a concepção que os peptídeos natriuréticos
desempenham um papel modesto, como contrareguladores, sendo os seus efeitos largamente
ultrapassados pela acção dos sistemas promotores de hipertrofia e fibrose miocárdica, na progressão
da resposta hipertrófica e remodelagem miocárdica (Molkentin, 2003), quer o papel essencial da
sobrecarga nestas alterações (Koide, 1999). Contudo, deve ser realçado que a activação neuro-
endócrina se faz sentir tardiamente, enquanto que a sobrecarga ventricular direita está presente
praticamente desde o início do modelo experimental, o que obviamente deve ser tido em conta na
interpretação dos resultados.
46
O tratamento crónico, dos animais com hipertensão pulmonar, com um antagonista não-
selectivo da endotelina-1 não só atenuou a hipertrofia ventricular direita, indicando um efeito benéfico
na hipertensão pulmonar, por provável acção na vasculatura pulmonar, já descrito (Hill, 1997), como
também restaurou a positividade das relações força frequência, que apresentaram valores similares aos
dos controlos, sustentando a hipótese de que parte das acções benéficas dos antagonistas da
endotelina-1 se devam a efeitos miocárdicos. Outras evidências experimentais recolhidas apoiam esta
hipótese: a activação e hiperprodução local da endotelina-1, com alteração do efeito contráctil no
bloqueio agudo dos receptores ETA in vitro em feixes musculares ventriculares esquerdos sugere não
só hiperactividade deste sistema no miocárdio ventricular esquerdo, como também uma perturbação
da resposta funcional usual, à semelhança do que acontece na hiperactividade do sistema nervoso
simpático (Leineweber, 2002; Seyfarth, 2000). Apesar das reservas quanto à extrapolação para a
fisiopatologia da doença humana, deve referir-se que estes resultados também se enquadram bem com
aspectos clínicos de descrição recente. Num relato do caso clínico de um paciente com hipertensão
pulmonar, e disfunção ventricular esquerda severa concomitante, o transplante pulmonar isolado foi
bem tolerado, com recuperação completa da função cardíaca, após um período de terapia, durante
alguns meses, com Bosentan. Os autores atribuíram este resultado essencialmente à redução da
interacção ventricular, tendo, contudo, especulado sobre possíveis acções miocárdicas directas do
Bosentan (Brauchlin, 2005). As acções miocárdicas directas do Bosentan poderão explicar em parte o
grande sucesso na terapêutica da hipertensão pulmonar, comparativamente com outros fármacos que
têm vindo a ser testados, particularmente na recuperação da capacidade funcional e de exercício
(Rubin, 2005). Os resultados podem assumir igualmente relevância fisiopatológica e clínica se se
admitir que a função ventricular esquerda poderá ser um alvo terapêutico na hipertensão pulmonar,
um estudo mais recente, que segue esta linha de pensamento, identificou melhoria da sobrevida, no
mesmo modelo experimental, após terapêutica crónica com Valsartan (antagonista AT1 selectivo),
tendo correlacionado esta melhoria com alterações no ventrículo esquerdo, e não no ventrículo direito
(Usui, 2006).
47
Os mecanismos moleculares subcelulares que explicam a disfunção intrínseca do ventrículo
esquerdo não ficam completamente esclarecidos neste trabalho. Quanto à comutação das isoformas
das cadeias pesadas de miosina, com maior predomínio das formas β, apesar da demonstração prévia
de alterações semelhantes em ambos os ventrículos neste modelo experimental (Ishikawa, 1991), estes
resultados foram postos em causa num trabalho recente, que empregou metodologia experimental
mais moderna (Kögler, 2003). Contudo, este trabalho foi levado a cabo em animais com formas
menos graves de doença. Recorrendo à mesma metodologia experimental, de electroforese em gel de
poliacrilamida, identificamos comutação das isoformas das cadeias pesadas de miosina também no
ventrículo esquerdo. Estas alterações moleculares têm sido associadas à acção da endotelina-1 e, de
facto, os antagonistas da endotelina-1 inibem esta comutação no ventrículo direito no mesmo modelo
experimental (Ichikawa, 1996). Deve salientar-se, no entanto, que apesar de a comutação para as
isoformas β ser responsável pela diminuição dos índices de contracção e relaxamento que dependem
da velocidade dos ciclos de pontes cruzadas do miocárdio, estas alterações são muito mais relevantes
no miocárdio do rato do que no miocárdio humano (Dorn, 1994). Quanto à expressão de proteínas
reguladoras da cinética do cálcio, não foram identificadas alterações, ao contrário do que ocorre no
ventrículo direito (Kögler, 2003). Estes resultados não são concordantes com a acção neuro-endócrina
crónica, com as acções da endotelina-1 ou com o que é usual encontrar-se no miocárdio disfuncional,
contudo, eles devem ser interpretados considerando que a activação neuro-endócrina só é marcada nas
fases mais avançadas da doença e que, portanto, podem existir alterações funcionais nestas proteínas
sem que tenha havido tempo para a modulação da expressão génica. Efectivamente, no modelo de
hipertensão pulmonar induzida pela hipóxia foi recentemente descrita, no ventrículo esquerdo, a
alteração do estado de fosforilação do fosfolambano (Larsen, 2006).
A identificação, por um lado, de disfunção diastólica ventricular esquerda induzida pela pós-
carga em estadios menos graves de hipertensão pulmonar, em que esta não era evidente para a função
basal, e, por outro, de exacerbação da disfunção diastólica nos estadios mais avançados, em que já é
48
notória a disfunção basal tem, para além de relevância experimental, particular relevância clínica. No
primeiro caso, porque aponta, tal como as relações força-frequência negativas, levadas a cabo in vitro,
para disfunção miocárdica intrínseca, com a vantagem de ser um teste levado a cabo in vivo,
confirmando a capacidade deste teste hemodinâmico de sobrecarga para distinguir entre miocárdio
com reserva contráctil, e normal função, e miocárdio disfuncional. No segundo caso, porque poderá
constituir um alerta clínico a todos os que tratam doentes com hipertensão pulmonar, em consulta, em
cuidados intensivos ou no bloco operatório (Kerbaul, 2004; Sun, 2001;). A hipertensão sistémica
poderá ser mais um factor de descompensação ou agravamento clínico a evitar, mesmo que a causa de
hipertensão pulmonar não seja a falência ventricular esquerda ou a valvulopatia mitral.
49
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