View
249
Download
15
Category
Preview:
Citation preview
METODE EVALUASI LEMAK DAN PROTEIN
Disusun oleh:
Kelas E
Diwyacitta Antya P. 105100100111003
Steffani Baretta P. M. 105100107111009
Jauhar Firdaus 105100101111022
JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2012
A. METODE EVALUASI NILAI BIOLOGIS LEMAK
Parameter yang digunakan untuk mengevaluasi nilai biologis lemak, antara
lain:
1. Bilangan peroksida
2. Bilangan TBA
3. Bilangan iod
4. Kadar asam lemak trans dan asam lemak esensial
5. Profil lipid darah (total kolesterol, trigliserida, HDL, LDL)
6. Kadar TBARS menunjukkan tingkat oksidasi lemak
7. Pengujian daya hipokolesterolemik in vitro
8. Pengujian kapasitas pengikatan asam empedu atau kolesterol in vitro
9. Kadar asam empedu sekum
Bilangan iod
Bilangan iod menggambarkan derjat ketidakjenuhan lemak/minyak. Asam-
asam lemak tidak jenuh pada minyak/lemak mempunyai kemampuan mengabsorpsi
sejumlah iod, terutama bila dibantu dengan suatu ’carrier’ seperti iodin klorida atau
iodin bromida, membentuk suatu senyawa yang jenuh. Jumlah iod yang diabsorpsi
menunjukkan ketidak-jenuhan lemak/minyak.
Kedalam sejumlah sampel minyak/lemak ditambahkan iod berlebih. Kelebihan
iod dititrasi dengan natrium tiosulfat sehingga iod yang diabsorpsi oleh minyak/lemak
dapat diketahui jumlahnya. Bilangan iod didefinisikan sebagai jumlah gram iod yang
diserap oleh 100 gram minyak/lemak.
Bilangan Peroksida
Penentuan bilangan peroksida biasanya didasarkan pada pengukuran sejumlah
iod yang dibebaskan dari kalium iodida melalui reaksi oksidasi oleh peroksida pada
suhu ruang di dalam medium asam asetat/kloroform
Bilangan TBA
Asam 2-tiobarbiturat (TBA) bereaksi dengan malonaldehid membentuk warna
merah. Malonaldehid adalah produk degradasi lipid teroksidasi
Kadar asam lemak trans dan asam lemak esensial
Pengukuran kadar keduanya dapat dilakukan dengan metode HPLC
Profil lipid darah
Lipid darah meliputi kadar trigliserida (TG), kadar total kolesterol (TK), kadar
HDL dan kadar LDL. Kadar TG, TK dan HDL pada plasma/serum dapat diukur
dengan menggunakan kit reagen komersial. Kit komersial berisi sejumlah enzim-
enzim spesifik yang mengubah substrat menjadi kromofor, sehingga kadarnya dapat
diukur dengan spektrofotometri.
1. Analisis Kadar Total Kolesterol (TK)
Kadar kolesterol total diukur dengan metode CHOD-PAP dan
menggunakan pereaksi kit. Kolesterol diukur setelah dihidrolisis dan
dioksidasi secara enzimatis.
Kolesterol ester + H2O kolesterol esterase kolesterol + asam lemak
Kolesterol + O2 kolesterol oksidase kolesten-3-one + H2O2
2 H2O2 + fenol+ 4-aminoantipyrine peroksidase quinoneimine + 4 H2O
Prosedur analisis yaitu sampel atau standar diambil sebanyak 100
mikroliter dan dicampurkan dengan 1000 µl pereaksi kit (mengandung
kolesterol esterase, kolesterol oksidase, fenol, 4-aminoantipyrine,
peroksidase dan bufer) kemudian dimasukkan ke dalam tabung lalu
dicampurkan sampai homogen. Campuran diinkubasi pada suhu 37°C
selama 5 menit, dan kemudian dibaca absorbansinya pada panjang
gelombang 500 nm. Perhitungan kadar kolesterol total dilakukan dengan
menggunakan rumus :
Kadar kolesterol (mg/dl):
2. Analisis Kadar HDL
Pengukuran HDL dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan
presipitasi terhadap lipoprotein densitas rendah (LDL dan VLDL) dan
kilomikron. Presipitasi dilakukan dengan penambahan asam fosfotungstat
dan kehadiran ion magnesium (MgCl2). Setelah sentrifugasi, HDL dalam
supernatan diukur menggunakan pereaksi kit yang sama dengan pengukuran
total kolesterol (CHOD-PAP).
Prosedur presipitasi adalah sbb : sebanyak 200 µl serum darah
dicampurkan dengan 500 µl pereaksi presipitasi yang telah diencerkan
dengan akuabides (rasio 4+1), kemudian diinkubasi selama 10 menit pada
suhu kamar. Setelah sentrifugasi pada 1074g (4000 rpm) selama 10 menit,
dihasilkan supernatan yang siap untuk dianalisis sama seperti analisis total
kolesterol di atas.
Kadar HDL (mg/dl):
3. Analisis Kadar Trigliserida (TG)
Trigliserida ditentukan setelah hidrolisis enzimatis dengan lipase.
Trigliserida + H2O lipase gliserol + asam lemak
Gliserol + ATP gliserol kinase gliserol-3-fosfat + ADP
Gliserol-3-fosfat + O2 gliserol-3-fosfat oksidase dihidroksiaseton fosfat + H2O2
2H2O2 + 4-aminofenazon + 4 klorofenol peroksidase quinoneimine + HCl + 4
H2O
Sampel atau standar diambil sebanyak 10 mikroliter dan dicampurkan
dengan 1000 mikroliter pereaksi kit, kemudian dimasukkan ke dalam tabung
lalu dicampurkan sampai homogen. Campuran diinkubasi pada suhu 370C
selama 5 menit, dan kemudian dibaca absorbansinya pada panjang
gelombang 500 nm. Perhitungan kadar trigliserida dilakukan dengan
menggunakan rumus :
Kadar trigliserida (mg/dl):
4. Perhitungan Kadar LDL
Teknik yang paling banyak digunakan oleh lab klinik untuk mengukur
kadar LDL pasien yaitu dengan menggunakan formula Friedewald sebagai
berikut :
Kadar LDL = Total kolesterol – HDL – TG/5
Diasumsikan bahwa TG/5 merupakan kadar VLDL
5. Perhitungan Indeks Aterogenik (IA)
Indeks aterogenik mengindikasikan besarnya potensi terjadinya
aterosklerosis.
Rumus Indeks Aterogenik (IA ) =
Pengujian Daya Hipokolesterolemik Secara in vivo
Sebelum diperlakukan, hewan percobaan dibuat hiperkolesterolemia terlebih
dahulu dengan cara pemberian kolesterol dalam ransum dan dicekok PTU (Propil
Tiourasil) sebanyak 2 mg/kg BB/hari. Kondisi hiperkolesterolemia juga dapat dicapai
dengan pemberian asam kolat atau turunannya di dalam ransum bersamaan dengan
kolesterol (tanpa PTU). Pemantauan kadar kolesterol serum dilakukan dengan
mengambil sampel darah dari ujung ekor tikus. Setelah kondisi hiperkolesterolemia
tercapai, hewan percobaan dikelompokkan untuk diberi perlakuan.
Pemberian perlakuan (sampel uji) dilakukan hingga kadar kolesterol serum
salah satu kelompok mencapai nilai seperti semula atau normal yaitu sekitar 60-70
mg/dL. Sebagai kelompok kontrol positif adalah kelompok hiperkolesterolemia yang
tidak diberi sampel uji. Di akhir perlakuan, tikus dieutanasi untuk dianalisis profil
lipida darahnya menggunakan kit, yang meliputi kadar total kolesterol (TK), High
Density Lipoprotein (HDL), dan trigliserida (TG), serta penghitungan Low Density
Lipoprotein (LDL) dan indeks aterogenik (IA).
Pengujian daya hipokolesterolemik juga dapat dilakukan tanpa membuat
kondisi hiperkolesterolemia terlebih dahulu. Model pengujian seperti ini digunakan
untuk mengeavaluasi kemampuan hipokolesterolemik melalui kemampuan menahan
penyerapan kolesterol. Dalam model ini, sampel uji diberikan bersamaan dengan
pemberian kolesterol, kemudian dilakukan pengukuran kadar lipid darah selama
perlakuan.
Pengujian Kapasitas Pengikatan Asam Empedu atau Kolesterol Secara in vitro
Untuk melihat adanya kapasitas pengikatan asam empedu atau kolesterol,
maka sampel uji diinkubasi bersamaan dengan sejumlah asam empedu atau kolesterol.
Selama inkubasi dilakukan penambahan enzim-enzim pencernaan (pepsin, tripsin,
pankreatin danlipase) sehingga menyerupai kondisi pencernaan. Di akhir proses
inkubasi, dilakukan sentrifugasi dan selanjutnya pengukuran kadar asam empedu atau
kolesterol pada bagian supernatan. Rendahnya kadar asam empedu atau kolesterol
pada supernatan menunjukkan kemampuan sampel uji mengikat asam empedu atau
kolesterol. Kadar asam empedu atau kolesterol dapat diukur dengan menggunakan kit
pereaksi. Sebagai kontrol untuk dapat digunakan kolestiramin (pengikat asam
empedu) dan serat oat (pengikat kolesterol).
Analisis Kadar Kolesterol dengan metode Liebermann-Buchards
Ke dalam tabung sentrifus 15 ml diisikan 12 ml campuran alkohol-eter,
kemudian dimasukkan 0.01 g sampel padat, diaduk perlahan sampai homogen.
Tabung ditutup rapat dan dikocok kuat selama 1 menit dengan vortex. Tabung
disentrifugasi selama 3 menit dan supernatannya dipindahkan ke dalam gelas piala
ukuran 50 ml lalu diuapkan di atas penangas mendidih hingga kering.
Residu kering ditambahkan kloroform 2-2,5 ml dan dikocok perlahan agar
larut. Ekstrak dipindahkan secara kuantitatif dan ditepatkan menjadi 5 ml dengan
kloroform. Kemudian ditambahkan 2 ml asetat anhidrida dan 0.1 ml asam sulfat
pekat, dan dikocok. Tabung disimpan di ruang gelap selama 15 menit dan diukur
absorbansinya pada 420 nm.
Analisis Kadar Asam Empedu Sekum (Bagian Awal Kolon)
Sebelum pengukuran, dilakukan preparasi sampel sebagai berikut. Sebanyak
0,2 g isi sekum dihomogenisasi dengan 2 ml KOH-etanol (0,5 mol/L) dan disonikasi
60-70ºC selama 90 menit. Homogenat disentrifugasi pada 1074g (4000 rpm) selama
10 menit sehingga diperoleh supernatan jernih. Kadar asam empedu supernatan diukur
dengan menggunakan pereaksi kit Bile Acids.
Prinsip pengukuran :
3--hydroxy bile acids + NAD+ 3-α-HSDH 3-keto-hydroxy bile acids + NADH + H+
NADH + H+ + NBT diaphorase NAD+ + formazan
Kit terdiri dari 2 pereaksi yaitu pereaksi untuk sampel yang berisi 3-α-
hydroxysteroid dehidrogenase (3-α-HSDH), diaphorase, NAD+ dan NBT (nitroblue
tetrazolium) dan pereaksi untuk blanko yang berisi diaphorase, NAD+ dan NBT
(nitroblue tetrazolium). Kit juga dilengkapi dengan larutan standar dengan 3
konsentrasi (5.0, 25 dan 100 µmol/L) untuk digunakan dalam kurva standar.
Setelah tercampur dengan baik kemudian diinkubasi selama 20 menit pada
25°C atau 15 menit pada 37°C. Reaksi dihentikan dengan menambahkan stop buffer
masing-masing 500 µl. Setelah dicampur, absorbansi diukur pada 540 nm. Kurva
standar dibuat dengan memplotkan nilai selisih nilai absorbansi standar (A standar –
A blanko standar) terhadap konsentrasi standar. Konsentrasi asam empedu sampel
dihitung setelah memplotkan selisih nilai absorbansi sampel (A sampel – A blanko
sampel) terhadap kurva standar.
B. METODE EVALUASI NILAI BIOLOGIS PROTEIN
Metode evaluasi kualitas protein pangan dapat dilakukan dengan 2 metode,
yaitu metode in vitro dan metode in vivo.
1. Metode in vitro, yaitu metode penentuan kulaitas protein secara khemis
berdasarkan pada pemecahan protein oleh enzim proteolitik seperti pepsin,
tripsin, khimotripsin, dan aminopeptidase. Analisis ini memberikan gambaran
berlangsungnya proses pencernaan protein di lambung dan usus.
a. Skor Kimia
Pada metode skor kimia, kualitas protein ditentukan oleh asam
amino esensial yang paling kekurangan (defisiensi asam amino yang
paling banyak) dibandingkan dengan asam amino yang terkandung
dalam bahan makanan standar. Standar yang digunakan pada metode
ini adalah protein yang terkandung pada telur. Kandungan setiap asam
amino esensial dalam bahan makanan yang diuji dibandingkan dengan
asam amino yang sama dalam protein telur. Asam amino yang
mempunyai proporsi paling kecil digunakan sebagai skor.
Kualitas protein pada dasarnya ditentukan oleh komposisi asam
amino dan ketersediaan biologisnya. Biasanya penentuan pola EAA
protein diperkirakan dari kebutuhan EAA makanan, spesies, dan nilai
skor kimia hasil uji biologis. Skor kimia 100 menunjukan suatu tingkat
asam amino essensial dalam protein suatu bahan pakan sama dengan
tingkat kebutuhan EAA untuk ternak (dinyatakan dalam persen dari
total EAA serta cystine dan tyrosine). Skor kimia protein diambil dari
persentase EAA suatu bahan makanan dibandingkan dengan pola
kebutuhan. Metode penilaian kualitas protein ini didasarkan pada
konsep bahwa nilai protein tergantung kepada jumlah EAA dalam
protein, yang dibandingkan terhadap referensi protein.
b. Daya Cerna
Salah satu parameter nilai gizi protein adalah daya cernanya
yang didefinisikan sebagai efektivitas absorbsi protein oleh tubuh.
Protein yang mudah dicerna menunjukkan tingginya jumlah asam-
asam amino yang dapat diserap oleh tubuh dan begitu juga sebaliknya.
Penganalisisan daya cerna dilakukan dengan menggunakan
pereaksi atau menirukan sama seperti yang terjadi di dalam pencernaan
manusia. Untuk melakukan evaluasi protein dengan daya cerna
digunakan enzim yang memang terdapat dalam saluran pencernaan
untuk mencerna protein menjadi asam-asam amino, misalnya tripsin,
kimotripsin dan pankreatin. Pankreatin merupakan cairan pankreas
yang terdiri dari enzim amino peptidase dan karbopeptidase. Analisis
dilakukan terhadap kasein sebagai kontrol.
Metode daya cerna dipengaruhi oleh ukuran dan sifat
permukaan partikel protein, perbedaan biologis di indiviu, pengaruh
konformasi protein, interaksi dengan ion logam, lipid, asam nukleat
dan selulosa, faktor antinutrisi, perlakuan panas, kondisi fisik dan
kimia bahan. Makin keras bahan, maka akan menurunkan daya
cernanya dalam tubuh karena adanya ikatan kompleks yang terdapat di
dalam bahan yang sifatnya semakin kuat. Ikatan ini dapat berupa ikatan
antar molekul protein, ikatan protein- fitat, dan sebaginya. Sedangkan
kondisi kimia yaitu adanya senyawa anti gizi seperti tripsin inhibitor
dan fitat.
2. Metode in vivo. Evaluasi kualitas protein dilakukan dengan cara PER dan
PCAAS, NPU, NPR, BV dan NPU hitung
a. PER dan PDCAAS
PER adalah singkatan dari Protein Efficiency Ratio. PER
merupakan perbandingan antara kenaikan berat pada subjek yang
melakukan tes (dalam gram) dengan jumlah protein yang dikonsumsi
(dalam gram) selama periode tes. PER merupakan metode tradisional
untuk evaluasi kualitas protein.
PDCAAS adalah singkatan dari Protein Digestibility Corrected
Amino Acid Score. Faktor yang digunakan dalam perhitungan
PDCAAS adalah kandungan AAE dalam protein pangan, kemampuan
cerna, dan kemampuan dalam menyediakan AAE dalam jumlah yang
cukup sesuai kebutuhan manusia. Skor paling tinggi pada PDCAAS
adalah 1.0. Perhitungan dilakukan dengan cara analisis kandungan
nitrogen, lalu proteinnya dihitung, kemudian asam amino essensialnya
dihitung AAE, kemudian skor asam amino dihitung dengan cara
membagi IAA dari 1 gram protein dalam milligram dengan IAA dari 1
gram asam amino dalam milligram. Kemudian daya cerna sejati dapat
ditentukan lalu PDCAAS dihitung dengan rumus rasio IAA terendah
dikalikan dengan daya cerna protein sejati.
b. NPR
NPR adalah singkatan dari Net Protein Ratio. alam penentuan
NPR, baik ransum maupun persyaratan tikus yang digunakan sama
dengan yang terdapat pada penentuan PER. Bedanya adalah pada NPR
ditambahkan 1 grup tikus yang diberi ransum non protein dan
percobaan hanya dilakukan selama 10 hari. NPR dihitung untuk tiap –
tiap ekor tikus dan nilai rata – ratanya dihitung untuk tiap grup.
Selanjutnya nilai NPR rata – rata tersebut dinyatakan sebagai
persentase dari nilai NPR kasein sebagai grup kontrol.
c. BV
BV adalah Biological Value yang merupakan pengukuran dari
protein yang terabsorpsi dari makanan yang akan bergabung dengan
protein yang ada di dalam tubuh. Hal tersebut menunjukkan kesiapan
dari protein yang telah dipecahuntuk digunakan dalam sintesa protein
yang terjadi di dalam sel tubuh. Metode ini mengasumsikan bahwa
protein adalah satu-satunya sumber nitrogen dan mengukur nitrogen
yang terabsorbsi oleh tubuh. Rasio dari nitrogen yang bergabung
dengan tubuh dengan nitrogen yang terabsorbsi menunjukkan protein
yang dapat digunakan.
d. NPU
NPU adalah Net Protein Utilization yang merupakan rasio dari asam
amino yang dikonversikan menjadi protein denganasam amino yang
tersedia. Rumus dari NPU adalah
NPU={[0,16 x (protein yang dikonsumsi selama 24 jam dalam gram) –
[(urin dengan urea nitrogen selama 24 jam dalam gram) + 2] – [0,1 x
berat badan ideal dalam gram]]}. Jangkauan NPU adalah dari nilai 1
sampai 0. nilai 1 sebagai indikasi dari 100% utilisasi nitrogen dietary
sebagai protein dan nilai biologis 0 sebagai indikasi bahwa tidak ada
nitrogen yang tersedia terkonversi menjadi protein.
DAFTAR PUSTAKA
Abun. 2006. Protein dan Asam Amino. Jatinangor: UNPAD.
Palupi. 2007. Metode Evaluasi Nilai Gizi protein. Bogor: IPB.
Prangdimurti dkk. 2007. Metode Evaluasi Nilai Biologis Karbohidrat dan Lemak. Bogor: IPB.
Wirastuti dkk. 2006. Pengaruh Pengolahan Terhadap Kecernaan atau Digestibilitas Protein. Yogyakarta: UGM.
Recommended