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Métodos Analíticos em Biotecnologia
Métodos envolvendo Ácidos Nucleicos:
•Extração e quantificação;•Enzimas de modificação;•Marcação;•Hibridizações Moleculares; •Desenho de iniciadores;•PCR de várias modalidades;•Clonagem gênica;•Sequenciamento gênico;•Genômica e bioinformática;
Precisamos de um novo olhar para o básico conhecido na estrutura dos ácidos nucleicos para compreender os métodos com mais facilidade
Pirimidinas
Purinas
5-Metildicetopirimidina Dicetopirimidina
BASES NITROGENADAS
Base-Pareamento nos ácidos nucleicos
Bases nitrogenadas e ABSORÇÃO DE LUZ
U.V.
DOSAGEM DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR ABSORÇÃO DE LUZ U.V.
D.O 260nm = 1,0 corresponde a
• 50g/mL de DNA dupla fita
•40 g/mL de DNA ou RNA simples fita
•20 g/mL de oligonucleotídeos.
D.O 260nm/ D.O 280nm : fornece a pureza de uma preparação de ácidos nucleicos (1,8 e 2,0 para DNA e RNA respectivamente). Valores inferiores indicam contaminação com fenol e proteínas.
Purificação de DNA por gradiente de Cloreto de Césio e visualização por luz U.V.
O CsCl tem sua solução aquosa com uma gravidade específica próxima a do DNA . Quando esta solução é centrifugada por um longo período de tempo e em alta velocidade, atinge-se um equilíbrio com a formação de um gradiente de densidade contínuo, com a porção mais concentrada de CsCl no fundo do tubo e a porção menos concentrada no topo.
Tratamento ácido: depurinação
MARCAÇÃO NÃO RADIOATIVA DO DNA VIA BASES NITROGENADAS
•DIGOXIGENINADIGOXIGENINA: : O DNA é marcado com o glicosídeo digoxigenina-11-UTP
•BIOTINABIOTINA: : O DNA é marcado com biotina
•COMPOSTOS FLUORESCENTESCOMPOSTOS FLUORESCENTES: : O DNA é marcado com compostos fluorescentes como Texas Red.
dUTP- Biotina
dUTP-Digoxigenina
AÇÚCARES DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Ligação P-O sensível a alkali e enzimas
Grupamentos Fosfatos nos ácidos nucleicos
dATP
β α
As sondas genéticas podem ser produzidas pelo emprego de nucleotídeos marcados com radiosótopos no fosfato α, por exemplo α 32P .
Ligações FosfodiésterLigações fosfodiéster constituem o núcleo principal da vida já que são parte da constituição básica de todos os ácidos nucleicos.
A hidrólise das ligações fosfodiester são catalisadas pelas fosfodiesterases (quebra do DNA)
•Etanol e isopropanol: A natureza higroscópica do DNA forma precipitados quando colocado em presença de etanol ou isopropanol e pequenas concentrações de
cátions monovalentes.
Química de formação : Rosalind Franklin (1920-1958): Novembro de 1951- Cadeia de fosfato-desoxiribose no exterior com bases no interior havendo entre 2 e 4 hélices co-axiais.
A: desidratada B: Helicoidal alongada
Laboratório de Biofísica do Kings College
Maurice Wilkins 15/12/1916- 05/10/2004
Uma estrutura de ferro e madeira, imitando uma hélice dupla, foi a forma que os biólogos James Watson e Francis Crick encontraram para demonstrar como é a forma da molécula de DNA.
25 de abril de 1953 - Prêmio Nobel em 1962 junto com Maurice Wilkins)
Grupos fosfatos das ligações fosfodiester são carregados negativamente
Por quê o mesmo tamanho
molecular pode migrar
diferentemente no gel de
eletroforese?
Estrutura e propriedades dos RNAs80% do material genético das células: rRNA15%: tRNA5%: mRNA2%: sn RNA e scRNA
•Regiões dupla fita (Pontes de H) são rompidas por altas temperaturas e calor (como no DNA!)
•Ligações fosfodiester são rompidas por alkalis (NÃO OCORRE NO DNA!!!!)
mRNA
RNA polimerase II: Transcreve os genes do mRNA (e também o snRNA).
Ribosomos são compostos por moléculas de RNA e proteínas formando grandes complexos que compreendem a maior parte da massa de uma célula. O ribossomo tem um coeficiente de sedimentação de 70S, e pode ser dividido em duas subunidades: 50S e 30S. Estas subunidades são compostas por unidades separadas: a subunidade 50S possui 2 moléculas de RNA, uma de 23S e outra de 5S bem como 34 proteínas diferentes. A subunidade 30S tem como subunidades a molécula de rRNA de 16S e 21 proteínas diferentes.
rRNA
RNA polymerase I (Pol I): Transcreve os genes do rRNA dos precursores 23S e 16SRNA polymerase III (Pol III): Transcreve os genes para o rRNA 5S
tRNA RNA polymerase III (Pol III): Transcreve os genes para os tRNAs.
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