Métodos de Coloração

Ziehl-Neelsen / Kinyoun

Auramina O (Fluorocromo)

Tinta da China (Tinta Nanquim)

Marcos AugustoInstituto Clemente Ferreira –SES-SPHospital do Servidor Público Municipal -SP

Métodos de Coloração em Microbiologia

BIOSSEGURANÇA

EPI

EPC

ESCARRO - 2 AMOSTRAS - 1º- Consulta / 2º- Manhã

Conservação: 24 horas em Temperatura ambiente. 7 dias em refrigeração (2 a 8 graus )

URINA- Todo volume da primeira micção (manhã) MÍNIMO 3 - MÁXIMO 6

Não aceitar urina 24 horas (contaminação)

LÍQUOR, PLEURAL, ASCÍTICO, etc (Frascos estéreis)

BIÓPSIA E MATERIAL DE RESSECÇÃO - NÃO ADICIONAR CONSERVANTES (FORMOL)

FEZES – não aceitar, frequente falso POSITIVO, diagnóstico se faz por biópsia.

LAVADO GÁSTRICO – Crianças (Proc. Hospitalar)

COLETA : Amostras Viáveis ou Não

ZIEHL-NEELSEN / KINYOUN Álcool Ácido Resistente

Robert Koch só conseguiu sua coloração primária após aproximadamente 270 tentativas

Desenvolvida pelo bacteriologista alemão, Franz Ziehl (1857-1926) e pelo patologista alemão Friedrich Karl Adolf Neelsen(1854-1894), em 1882.

Utilizado também na diferenciação de Bacilos Gram Positivos: álcool ácido resistente (+) ou (-)

Histórico da Coloração de Ziehl-Neelsen

Bactérias com paredes estruturalmente Gram-positivas

Modificação na parede: lipídeos em maiorquantidade (cerca de 60% do peso seco daparede), entre eles os ácidos micólicos.

A ligação de alguns desses lipídeos com aFucsina gera complexos responsáveis pela AlcoolÁcido Resistência.

Caráter hidrofóbico.

Fundamento da Coloração de Ziehl-Neelsen

PAREDE CELULAR

GRAM (-)

GRAM (+)

• Fucsina Fenicada a 0,3%

• Álcool-Ácido

Clorídrico 3%

• Azul de

Metileno a 0,1%

(5 minutos)

3 aquecimentosLavar com água destilada

COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN

(2 minutos)

(30 segundos)

Lavar com água destilada

Lavar com água destilada

• Fucsina Fenicada a 4%

• Álcool-Ácido

Clorídrico 3%

• Azul de

Metileno a 0,1%

(20 minutos)

Lavar com água destilada

COLORAÇÃO DE KINYOUN

(2 minutos)

(30 segundos)

Lavar com água destilada

Lavar com água destilada

NEGATIVO Não foram encontrados

BAAR em 100 campos

(+) Presença de menos de 1 BAAR por campo em 100 campos observados

(++) Presença de 1 a 10 BAAR por campo em 50 campos observados

(+++) Presença de mais de 10 BAAR por campo em 20 campos observados

OBS: Diagnóstico, 1 a 4 bacilos em 100 campos - ampliar para mais 100 campos. Resultado igual - negativo - cultura

RESULTADO - BAAR

Considerações sobre a Coloração para BK

Método de Ziehl-Neelsen:

Exame simples

Rápido

Econômico

O mais utilizado no diagnóstico da tuberculose pulmonar

Desvantagens:

Necessita pelo menos de 5.000 bacilos por mililitro de

amostra para ser positivo.

Identifica o microorganismo apenas como BAAR.

Existem outros BAAR sem ser o M. tuberculosis

Mycobacterium leprae

Agente etiológico: Mycobacterium leprae (bacilo de Hansen)Descoberto por Hansen em 1873Não é cultivado em vitro.O Brasil ocupa o segundo lugar em número de casos no mundo, apenas atrás da Índia.Os bacilos são vistos isoladamente ou em aglomerados chamados globias.

O Índice Baciloscópico (IB), proposto por Ridley em 1962

(0) – Ausência de bacilos em 100 campos.(1+) – Presença de 1 a 10 bacilos, em 100 campos.(2+) – Presença de 1 a 10 bacilos, em cada 10 campos.(3+) – Presença de 1 a 10 bacilos, em média, por campo.(4+) – Presença de 10 a 100 bacilos, em média, por campo.(5+) – Presença de 100 a 1.000 bacilos, em média, por campo.(6+) – Presença de mais de 1.000 bacilos, em média, por campo.

Os bacilos aglomerados e os contidos em globias não podem ser contados, porém,o seu número deve ser estimado.Globia Pequena - Apresenta em média 30 bacilos em seu corpo.Globia Média - Apresenta em média 60 bacilos em seu corpo.Globia Grande - Apresenta em média 100 bacilos em seu corpo.

Mycobacterium leprae

Nocardia spBactérias gram positivas do gênero Nocardia causadora da Nocardiose. Podem causar infecção localizada ou disseminada, mais freqüentemente pulmão, pele e sistema nervoso central . Doença oportunista, acometendo pacientes portadores de imunossupressão sistêmica, particularmente,da imunidade celular.Vive habitualmente na matéria em decomposição que se encontra na terra. São transportadas através do ar contaminado com partículas de pó e penetram nos pulmões ao respirar

Bacillus subtilis Rhodococcus spBactéria gram-positiva. Saprófita,comum do solo e da água.Esporulado, não patogênico, graças àsua termofilia é utilizado nomonitoramento e validação de ciclosde esterilização

Causador da rodococose, é um cocobacilo pleomórfico, gram-positivo e aeróbio, que infecta humanos por via inalatória ou transcutânea e se manifesta como abscesso pulmonar. Poucas espécies do gênero são

patológicas.

Isospora BelliProtozoário (Coccídeo) causador da isosporíaseOocisto elipsóide, medindo em média 20 a 30μm de comprimento e 10 a 19μm de largura, com as extremidades afuniladas (regiões polares), apresentando uma dupla parede lisa e hialinaO Oocisto constitui a forma infectante da isosporíase, pois é eliminado nas fezes e possibilita a infecção por via fecal-oralAs infecções humanas são geralmente assintomáticas. No entanto, nos demais casos, há febre, diarréia e cólicas abdominais, sendo que em pacientes aidéticos essas manifestações tornam-se crônicas.

Cryptosporidium parvumProtozoário (Coccideo) causador da criptosporidiose. Oocisto com estrutura geralmente esférica de 3 a 6μm de diâmetro, com membrana externa fina e citoplasma finamente granulado.Descrito como parasito de animais inferiores em 1907.A infecção em seres humanos foi reconhecido em 1976, de ocorrência rara. Em 1983 (AIDS) aumento no número de casos.Transmissão pela água ou alimentos contaminados com oocistos eliminados nas fezes de seres humanos ou animais infectados.

Partículas de alimentos

Corantes precipitados

Aquecimento excessivo

Fibras (alimentares, vegetais, gaze)

Riscos na lâmina

Utilização da Fucsina sem filtrar

Lente de imersão ou frasco conta-gotas do óleo com resíduos de esfregaços positivos.

PRINCIPAIS CAUSAS PARA QUE UMAAMOSTRA RESULTE FALSAMENTE POSITIVA

Coleta inadequada

Conservação inadequada da amostra

Preparação incorreta do esfregaço (aquecimento excessivo ou insuficiente na fixação)

Coloração inadequada (menor tempo de aquecimento da fuscina; descoloração excessiva; corantes impróprios)

Erro de leitura (sobreposição e diminuição do número de camposlidos)

Microscópio sem condições adequadas de uso/manutenção

Presença de fungos nas lentes (embaçamento)

PRINCIPAIS CAUSAS PARA QUE UMAAMOSTRA RESULTE FALSAMENTE NEGATIVA

MÉTODOS DE COLORAÇÃO

AURAMINA O

• Álcool-Ácido

Clorídrico

Lavar com água destilada

COLORAÇÃO DE AURAMINA O

(2 minutos)

Lavar com água destilada

Lavar com água destilada

•Sol. de Auramina

Fenicada a 0,3%(15 minutos)

•Permanganato

de pótassio

(2 minutos)

Considerações sobre a Coloração para BK

Método da AURAMINA O

Desempenho discutível em termos de sensibilidade e exatidão. Tempo de leitura menor.

Recomendável só para laboratórios que fazem mais de 100 baciloscopiaspor dia.

Exige pessoal treinado e todas as lâminas positivas precisam ser confirmadas por Ziehl Neelsen.

O equipamento é mais caro, portanto não está recomendado pelas II Diretrizes Brasileiras para a Tuberculose.

MÉTODOS DE COLORAÇÃOTINTA DA CHINA

Cryptococcus neoformans

Causador da CriptococoseLevedura capsuladaInfecção Primária no Homem via Pulmonar : inalação de propágulos de levedura Apresenta-se como infecção pulmonar, sistêmica ou do SNCAté anos 50 e 60 ocorrências esporádicas. Aumentaram com terapias imunossupressoras e na década de 80 com a AIDS.É isolado frequentemente de fezes dessecadas de POMBOS; eventualmente em outras aves ou solo contaminado.

Os organismos são visualizados por contraste negativo, a cápsula rejeita as partículas deste corante, permitindo a observação das células descoradas sobre fundo negro.

Cápsula possui composição Polissacarídica

Controle Negativo: Salina + Tinta da China

Material capsular é hidrossolúvel

Aquecimento induz a contração celular criando uma zona ao redor do microrganismo (artefato)

Atenção para artefatos como: Bolhas de ar , contaminantes (microrganismos ou partículas).

COLORAÇÃO – TINTA DA CHINA

Tinta Nanquim

Preta

+

Lamínula

Material Biológico (1 gota)

(1 gota)

Observar no aumento de 40 X

COLORAÇÃO – TINTA DA CHINA

COLORAÇÃO – TINTA DA CHINA

Característica: Células Globosas ou em forma ovalada com cápsula polissacarídica. Paredes espessas

com conteúdo citoplasmático globoso disperso no citoplasma,

formados por substâncias refringentes à luz.

Isospora belli Mycobacterium leprae

Cryptosporidium parvum Cryptococcus neoformans

MÉTODOS DE COLORAÇÃO - Slides

MÉTODOS DE COLORAÇÃO - Slides

Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis – FATOR CORDACryptosporidium parvum

Muito Obrigado !

Marcos AugustoBiólogo – Espec. Análises Clínicas

markosaugusto@yahoo.com.br