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IDALINA INÊS FONSÊCA NOGUEIRA CAMBUIM
MICOSES SUPERFICIAIS EM HIV/AIDS E CARACTERIZAÇÃO DE
AGENTES ETIOLÓGICOS QUANTO A VIRULÊNCIA E
SUSCEPTIBILIDADE ANTIFÚNGICA
RECIFE
OUTUBRO/2009
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS
MICOSES SUPERFICIAIS EM HIV/AIDS E CARACTERIZAÇÃO DE
AGENTES ETIOLÓGICOS QUANTO A VIRULÊNCIA E
SUSCEPTIBILIDADE ANTIFÚNGICA
Idalina Inês Fonsêca Nogueira Cambuim
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos do Departamento de Micologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Biologia de Fungos.
Área de Concentração: Micologia aplicada Orientadora: Rejane Pereira Neves Co-orientadora: Ana Lucia F. Porto
RECIFE OUTUBRO/2009
Cambuim, Idalina Inês Fonsêca Nogueira Micoses superficiais em HIV/AIDS e caracterização de agentes etiológicos quanto a virulência e susceptibilidade antifúngica / Idalina Inês Fonseca Nogueira Cambuim. – Recife: O Autor, 2009. 102 folhas: il., graf., tab. Orientadores: Rejane Pereira Neves e Ana Lucia F. Porto. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro
de Ciências Biológicas. Departamento de Micologia. Pós-graduação em Biologia de Fungos, 2009.
Inclui bibliografia e anexo. 1. Dermatomicose 2. Dermatofitos – AIDS (Doença) - Pacientes
3. Antimicóticos I Título. 616.969 CDD(22.ed.) UFPE CCB – 2009- 243
“ Se as conquistas úteis à humanidade vos comovem; se ficais pasmados diante da telegrafia elétrica, da fotografia, da anestesia, e de tantas outras descobertas; se estais
orgulhosos e conscientes da parte que cabe ao vosso país na conquista dessas maravilhas, tomai interesse, eu vos conjuro, por esses recintos sagrados que chamamos de laboratórios. Façais o possível para que eles se multipliquem. Eles representam os
templos do futuro, da riqueza e do bem-estar social. É por intermédio deles que a humanidade melhora e cresce. É neles que o homem aprende a ler os segredos da natureza e da harmonia universal, enquanto as obras do homem são quase sempre
obras de barbárie, de fanatismo e de destruição...”
(Madame Curie, em seu discurso quando da inauguração do Instituto de Radium, em Paris, julho de 1914, início da 1ª Guerra Mundial).
MENSAGEM
A Deus, pelo dom da vida e por ser a base de tudo.
À Lusinete Acioli de Queiroz que desde meu mestrado, passando pelo doutorado, tornou-se
meu maior exemplo, por sua simplicidade, sabedoria e profissionalismo.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi o meio motivador de uma busca diária por aprendizado, especialização e superação de obstáculos.
Dessa forma, AGRADEÇO especialmente à Dra. Lusinete Acioli de Queiroz minha orientadora (in memoriam), por ter me ajudado de todas as maneiras que alguém pode ser ajudado, ensinando e aconselhando, conforme as cobranças que estes anos de convivência me impuseram me dando força e segurança e acima de tudo, acreditando no meu potencial.
À Dra. Miriam Silveira “diretora do Hospital Correia Picanço” e Dra Marília Delgado “Dermatologista do Hospital Correia Picanço” pela amizade e oportunidade oferecidas, pois sem isso este trabalho não teria sido concluído com tamanho êxito.
Aos pacientes portadores do HIV/AIDS, seres humanos indispensáveis para meu aprimoramento ficam aqui registrados meu respeito, gratidão e reconhecimento de que o progresso da ciência está interligado de forma relevante às vossas existências.
À Professora Dra Rejane Pereira Neves que se tornou minha orientadora, pela acolhida e ajuda na conclusão deste trabalho.
À Professora Dra. Ana Lucia Figueiredo Porto, pela amizade, pelos ensinamentos e ajuda na parte das própolis e lectinas inseridas neste trabalho e principalmente por sua ética profissional.
Agradeço de forma especial à Professora Dra Oliane Maria Correia de Magalhães, que tanto admiro, não somente como professora, mas principalmente pela pessoa que é, por sua ética e seriedade no trato das questões acadêmicas, por todo o carinho, apoio, amizade e experiência profissional transmitidas em cada gesto e palavras de apoio que foram de importância ímpar para conclusão deste trabalho.
Ao Professor Armando Marsden Lacerda Filho pela acolhida ao laboratório de micologia médica, amizade e apoio durante todos esses anos.
À Dra Viviana Giampaoli pelo profissionalismo e amizade bem como a grande ajuda na elaboração da estatística do trabalho.
Às Professoras Dra. Cristina de Sousa-Motta, Dra. Maria José Fernandes, Dra. Débora Maria Massa Lima pela amizade e ajuda na identificação dos fungos filamentosos.
Às Professoras Dra. Elvira Alencar e Dra. Rita de Cássia Carvalho Maia que sempre se mostraram dispostas a ajudar-me no crescimento profissional.
Aos professores das disciplinas cursadas durante o Doutorado em Biologia de Fungos pelos valiosos ensinamentos passados no decorrer de todo curso, quer em sala de aula ou em bancada.
À Dra. Ana Beatriz S. Siqueira e Dr. Bruno Severo Gomes (estes muito mais que desempenhar seus papéis de amigos e profissionais, dividiram comigo os seus conhecimentos).
À Danielle Cerqueira, André Ferraz, Gilmara Araújo, Suani Lemos, Filipe Duarte, Genilda Mendes pelo respeito, amizade e sempre dispostos a ajudar.
À Doutoranda Kedma de Magalhães Lima, pelo respeito, amizade e experiências trocadas.
Ao Dr. Benildo Cavada pelo fornecimento das lectinas e Sheila Abreu (Farma-Necta) pelo fornecimento das própolis que foram de grande importância para elaboração deste trabalho.
Aos órgãos financiadores CNPq, UFPE pelo suporte financeiro e estrutural.
Às Coordenadoras da Pós-Graduaçao Dra. Elaine Malosso e Dra. Leonor Costa Maia, que conduzem de maneira a primar pela excelência do programa.
A todos os funcionários do Departamento de Micologia.
Finalmente agradeço à minha família: meu esposo minha luz e sempre um ombro amigo e protetor, que muitas vezes distante, era presença constante na minha vida. Às minhas filhas Amanda e Danielle que compreenderam minha ausência e muitas vezes davam o máximo para me ajudar “graças a Deus que eu as tenho”. Aos meus queridos netos João Vitor e Mariana que Deus me presenteou e que foram o segredo para minha tranquilidade e paz nos momentos mais difíceis.
Aos meus irmãos Aldo pela correção da língua portuguesa (grande professor), Renato, Fausto e Cristina (guerreiros na vida).
Ao meu pai e minha mãe (in memoriam) por terem me ensinado o verdadeiro caminho da perseverança sempre acreditando que “tudo posso naquilo que creio”.
Às minhas cunhadas Floripes e Angelita pelo apoio em tudo que realizei.
Ao meu querido cunhado Fetimendes Cambuim pelo exemplo de luta e seriedade que sempre copiei.
A todos que me ajudaram direta ou indiretamente no desenvolvimento deste trabalho e principalmente a DEUS por mais essa etapa de VIDA, que com seus intercessores ou “anjos”, sempre me mostrou o melhor caminho a seguir, me guiando em uma trajetória de amadurecimento pessoal e espiritual. Agradeço o conforto, a força, a fé e a coragem em todos os episódios de minha vida, ESPECIALMENTE ESTE.
RESUMO
A incidência de lesões superficiais em HIV/AIDS é freqüente sendo
caracterizada por depressão celular facilitando o aumento da susceptibilidade por
fungos. A patogenicidade destes parece estar relacionada ao crescimento a 37ºC e
produção de enzimas. O insucesso terapêutico e complicações clínicas requerem testes
antifúngicos. Os objetivos deste estudo foram diagnosticar infecções fúngicas
superficiais em HIV/AIDS e caracterizar os agentes quanto à patogenicidade e
susceptibilidade antifúngica. As amostras foram clarificadas com KOH e inoculadas em
ágar Sabouraud com cloranfenicol, incubadas a 30ºC e 37ºC por 15 dias. As enzimas
foram testadas usando caseína do leite (protease), lecitina de soja (fosfolipase) como
substratos. O antifungigrama seguiu o CLSI, sendo testados 45 isolados de Candida
frente anfotericina B, fluconazol (controle), própolis e lectinas. Em 117 amostras
clínicas foram observadas estruturas fúngicas e isoladas Candida albicans, C.
parapsilosis, C. tropicalis, C. guilliermondii, C. famata, C. glabrata, Malassezia furfur,
M. sympodialis, Trichosporon asahii, Kodamae ohmeri, Brettanomyces anomalus,
Microsporum gypseum, Trichophyton menthagrophytes, T. rubrum, T. tonsurans,
Aspergillus niger, Cylindrocarpon destructans, Fusarium solani, Phialophora reptans,
Scytalidium hialinum, S. japonicum e Penicillium commune. As amostras cresceram a
37ºC e exibiram fosfolipase, entretanto protease foi detectada em 43 isolados. Os
intervalos de valores de MIC foram muito amplos e o efeito inibitório da própolis e
lectinas sobre o crescimento fúngico foram respectivamente 2-1024µg/mL e 8-
256µg/mL. Os resultados da anfotericina B e fluconazol foram 0,06-2 µg/mL e 0,25-64
µg/mL, respectivamente.
Palavras-chave: Paciente com HIV/AIDS, virulência, suscetibilidade antifúngica, própolis, lectinas.
ABSTRACT
The incidence of superficial lesions in HIV/AIDS is frequent, being characterized by an
important cellular depression facilitating the increased susceptibility to infection by
fungi. The pathogenicity of these organisms seems to be related to ability to grow at
37ºC and the production of enzymes. Therapeutic failure is related to clinical
complications justifying the antifungal tests. The purpose of this study was to diagnose
superficial fungal infections in HIV/AIDS and characterize the etiologic agents as to
pathogenicity and antifungal susceptibility. Clinical samples were clarified with KOH
and inoculated in Sabouraud agar with chloranphenicol, incubated at 30ºC and 37ºC for
15 days. The enzymes were tested using milk casein (protease) and soy lecitin
(phospholipase) as substrate. The susceptibility tests were conducted according to CLSI
using 45 isolates of Candida against amphotericin B, fluconazole (control), propolis and
lectins. In 117 clinical samples were observed fungal structures and isolated Candida
albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. guilliermondii, C. famata, C. glabrata,
Malassezia furfur, M. sympodialis, Trichosporon aahii, Kodamae ohmeri,
Brettanomyces anomalus, Mycrosporum gypseum, Trichophyton menthagrophytes, T.
rubrum, T. tonsurans, Aspergillus niger, Cylindrocarpon destructans, Fusarium solani,
Phialophora reptans, Scytalidium hialinum, S. japonicum and Penicillium commune.
All of the samples grew at 37ºC and exhibited phospholipase, hovewer proteinase
activity was observed in 43 isolated. The ranges of MIC values were so larges and
inhibitory effect of green propolis and lectins on the fungal growing were respectively
2-1024 µg/mL and 8-256 µg/mL. The results of amphotericin B, fluconazole were
respectively 0.06-2 µg/mL and 0.25-64 µg/mL.
Keywords: susceptibility testing, Propolis, lectins, Patient with HIV / AIDS, virulence.
LISTA DE FIGURAS
Pág
Figura 1. Esquema da estrutura dos três tipos de lectinas de plantas:
merolectina, hololectina, quimerolectina segundo Peumans e Van
Dame, 1995.
32
Figura 2. Aspectos epidemiológicos referente à situação do paciente com
lesão superficial no momento da coleta.
45
Figura 3. Número de amostras clínicas em regiões acometidas por lesões
superficiais em pacientes com HIV/AIDS.
46
Figura 4. Resultados referentes aos exames diretos (ED) e culturas de
amostras clínicas coletadas de lesões superficiais em pacientes
com HIV/AIDS.
47
Figura 5. (a) Leveduras isoladas e unibrotantes; (b) pseudomicélio; (c)
leveduras agrupadas em cacho e hifas curtas e tortuosas; (d)
micélio demáceo; (e) micélio verdadeiro hialino septado; (f)
artrosporados (400X).
47
Figura 6. Culturas obtidas de lesões superficiais em pacientes com
HIV/AIDS.
48
Figura 7. Associação de duas espécies de fungos na mesma lesão. 56
Figura 8. Crescimento à 37ºC em meio ágar Sabouraud para as leveduras
(a), Batata Dextrose Agar (b), ágar Czapec para fungos
filamentosos não dermatófitos (c) e Meio Teste para Dermatófito
(d).
58
Figura 9.
Protease em meio com caseína do leite (a) muito forte (b) muito
fraca.
59
Figura 10. Fosfolipase em meio com lecitina de soja (a) muito forte, (b)
forte.
61
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Fungos isolados de lesões superficiais em pacientes com HIV/AIDS
com total de amostras e percentual 49
Tabela 2. Regiões acometidas por lesões superficiais e espécies de
leveduras. 53
Tabela 3. Relação entre regiões acometidas por lesões superficiais e espécies
de fungos filamentosos. 54
Tabela 4. Presença da mesma espécie de fungo isolado de lesões superficiais
em diferentes regiões do corpo. 57
Tabela 5. Expressão de protease em caseína do leite entre amostras de
leveduras isoladas de lesões superficiais em pacientes HIV/AIDS. 59
Tabela 6. Expressão da protease em caseína do leite entre amostras de fungos
filamentosos isolados de lesões superficiais em pacientes com
HIV/AIDS.
60
Tabela 7. Expressão de fosfolipase em lecitina de soja entre amostras de
leveduras isoladas de lesões superficiais em pacientes HIV 61
Tabela 8. Expressão de fosfolipase em lecitina de soja entre amostras de
fungos filamentosos isolados de lesões superficiais de pacientes
HIV/AIDS.
62
Tabela 9. Concentração inibitória mínima e concentração fungicida mínima do
extrato aquoso da própolis verde, extratos alcoólicos das própolis verde e
vermelha e de lectinas ConBr e DViol em relação às espécies de Candida
isoladas de lesões superficiais de pacientes com HIV/AIDS do Hospital
Correia Picanço, usando como controle anfotericina B e fluconazol
65
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 13
2. REVISÃO DA LITERATURA 16
2.1 Caracterização fisiológica 21
2.2 Fármacos antifúngicos 23
2.3 Novas alternativas antifúngicas 25
2.3.1 Própolis 25
2.3.2 Lectinas 31
2.3.3 Teste de susceptibilidade antifúngica 34
3. MATERIAL E MÉTODOS 36
3.1 Pacientes 36
3.2 Amostras clínicas 36
3.3 Exame micológico direto 36
3.4 Cultura 36
3.5 Identificação de leveduras 37
3.5.1 Metodologia clássica 37
3.5.1.1 Auxonograma e Zimograma 37
3.5.1.2 Produção de urease 38
3.5.1.3 Produção de ácido 38
3.5.1.4 Indução de tubo germinativo 38
3.5.1.5 Produção de clamidosporos 38
3.5.1.6 Assimilação de Tween 39
3.5.1.7 Teste da Catalase 39
3.5.1.8 Teste da Esculina 39
3.5.2 API20C AUX (bioMérieux) 39
3.5.3 CHROMagar Candida® 40
3.6 Identificação de fungos filamentosos 40
3.7 Caracterização quanto à patogenicidade 41
3.7.1 Crescimento a 37°C 41
3.7.2 Expressão de protease 41
3.7.3 Expressão de fosfolipase 41
3.8 Teste de susceptibilidade in vitro 42
3.8.1 Meio de cultura 42
3.8.2 Fármacos antifúngicos 43
3.9 Novas alternativas antifúngicas 43
3.9.1 Própolis 43
3.9.2 Lectinas 43
3.9.3 Microdiluição em caldo 43
3.9.4 Preparo do Inóculo 44
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 45
4.1 Isolamento e identificação das espécies 45
4.2 Características de patogenicidade 58
4.3 Testes de Susceptibilidade 63
5. CONCLUSÕES 68
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 70
ANEXOS
13 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
1. INTRODUÇÃO
A infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) resulta numa deleção
dos linfócitos T CD4, de assintomático o portador torna-se suscetível ao acometimento de
uma variedade de manifestações clínicas, determinando a Síndrome da Imunodeficiência
Adquirida (AIDS). Neste estágio há o desenvolvimento de doenças oportunistas
comumente graves e potencialmente fatais (ABRAS et al., 2003; BRASIL MINISTÉRIO
DA SAÚDE, 2004; LEVINSON; JAWETZ, 2005).
Entre as doenças oportunistas, as micoses têm se destacado com acometimento de
superficial a profunda. A pele é o órgão mais afetado em portadores do HIV e
frequentemente, esse grupo de pacientes apresentam micoses superficiais com lesões
atípicas, severas e disseminadas (BURKHART et al., 2003; GOMIDES et al., 2002; YAMADA
et al., 2000). A resposta inflamatória pode ser intensa e os agentes etiológicos podem ser
leveduras, dermatófitos ou outros fungos filamentosos como causa de quadros clínicos
superficiais ou profundos (YAMADA et al., 2000).
Micoses superficiais de formas atípicas disseminadas ou lesões cutâneas resultante
de micoses sistêmicas podem indicar imunossupressão, incluindo a presença do HIV
(CONANT, 1994; JOHNSON, 2000).
O acometimento fúngico nos portadores do HIV pode conferir a estes, micoses
oportunistas e/ou de comportamento oportunista. O envolvimento apresenta-se bastante
variado quer por leveduras, sobretudo do gênero Candida, ou por fungos filamentosos
como os dermatófitos, podendo causar uma variedade de infecções em pacientes
imunossuprimidos. Para melhor compreensão sobre o prognóstico, epidemiologia e a
terapêutica é essencial que se identifiquem as diferentes espécies etiológicas (SILVA;
CANDIDO, 2005).
Dermatofitose em hospedeiros imunossuprimidos é atípica e muitas vezes mais
severa do que em hospedeiros imunocompetentes, o diagnóstico precoce e o tratamento são
importantes para pacientes com HIV, a fim de evitar infecção disseminada (BURKHART
et al., 2003).
A capacidade virulenta que os fungos possuem deve ser esclarecida para se
estabelecer os danos que estes possam causar e dessa forma, serem instituídas medidas
preventivas e terapêuticas eficazes. Características fenotípicas como a capacidade de
crescer a 37ºC, bem como de produzirem enzimas extracelulares como protease e
fosfolipase, estabelecem uma relação entre o agente e os danos causados à membrana
14 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
celular, sendo de grande importância para caracterização dos isolados fúngicos (ABDEL-
RAHMAN, 2000; CHAVES et al., 2003; LACAZ et al., 2002; SIDRIM; ROCHA, 2004;
SINGH, 1997; TRABULSI et al., 1999).
É essencial o reconhecimento dos agentes causais de infecções fúngicas para que
seja instituída a terapêutica antifúngica adequada, evitando resistência à droga que pode
ocorrer devido ao uso empírico de terapia com azólicos sistêmicos, bem como recidivas e
insucesso no tratamento (BURKHART et al., 2003; GALHARDO et al., 2004; WARREN;
HAZEN, 1995).
Os produtos naturais derivados de plantas tem sido uma rica fonte da produção de
compostos antifúngicos e sabe-se que 30% a 40 % dos medicamentos utilizados na
medicina moderna, são direta ou indiretamente derivados da natureza, assim atenção
especial tem se voltado para tais produtos (AQUINO et al., 2007; GURGEL et al., 2005;
WOJTASZEK, 1997).
Nesse contexto, tem sido verificada ação inibidora do crescimento fúngico em
própolis, que é uma mistura de substâncias resinosa de consistência e coloração variada, de
composição química complexa, elaborado por abelhas a partir da coleta de exsudatos de
plantas (AFOLAYAN; MEYER, 1997; BANKOVA et al., 2002; BANKOVA, 2005a,
BANKOVA, 2005b; BURDOCK, 1998; CASTALDO; CAPASSO, 2002; FERNANDES
et al., 2007; FERNANDES JUNIOR et al., 2006; HEGAZI et al., 2000; KOC et al., 2005;
MOLINA et al., 2008; MURAD et al., 2002; OTA et al., 2001; PARK et al., 1998a;
SANTOS et al., 2005; SAWAYA et al., 2002; SOARES; CURY, 2001; ZHENG et al.,
1996).
As lectinas, outro produto natural que desperta interesse por sua propriedade
antimicrobiana, são proteínas que se ligam especificamente e reversivelmente a mono e
oligossacarídeos livres ou na forma de glicoconjugados como glicoproteína e glicolipídeo.
São encontradas em animais, plantas, bactérias, vírus e fungos (CAVADA, et al., 1998;
LIS; SHARON, 1998; NGAI; NG, 2004; PEUMANS; VAN DAMME, 1995); estando em
maior quantidade em grãos de leguminosas (ALENCAR et al., 2005a; CAVADA, et al.,
2000; YE, et al., 2001).
A ação de lectinas tem sido observada sobre o crescimento de fungos como C.
albicans, C. glabrata, Saccharomyces bayanus, S. uvarurn, Rhodotorula mucilaginosa,
Pichia pastoris, Kluyveromyces bulgaricus, K. lactis, Schizosacchamyces bulgaricus, S.
octosporus, Aspergilus flavus, A. niger, Fusarium moniliforme e F. solani
15 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
(CHUMKHUNTHOD et al., 2006; DAMICO et al., 2003; FAKHOURY; WOLOSHUK,
2001; TRINDADE et al., 2006; VIARD et al., 1993; YAN et al., 2005; YE et al., 2001). Os
objetivos deste trabalho foram determinar o agente etiológico das micoses de lesões
superficiais em pacientes com HIV/AIDS e caracterizar os agentes quanto à virulência e
sensibilidade à própolis e lectinas.
.
16 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
2. REVISÃO DA LITERATURA
O surgimento da AIDS causou significativo aumento da incidência de micoses
superficiais e sistêmicas, gerando profundas alterações na historia natural destas infecções,
apresentando-se de forma muito agressiva, com acometimento extenso do tegumento e
anexos refletindo em problema de saúde pública (HOSSAIN; GHANNOUM, 2000;
LACAZ; MACHADO, 2000).
As lesões de pele e mucosa, bem como as subcutâneas comumente ocorrem por
leveduras, destacando-se as espécies de Candida e merecem destaque por serem as mais
frequentes neste grupo de paciente (HOSSAIN; GHANNOUM, 2000; MACÊDO et al.,
2009; PAULA, 1998; SOMENZI et al., 2006).
O acometimento de infecções fúngicas localizadas nas camadas superficiais da pele
e seus anexos, bem como nas mucosas e zonas cutâneo-mucosas, estão associadas a
imunossupressão, umidade, calor, uso prolongado de antibióticos sistêmicos,
corticosteróides ou imunossupressores, que são condições favoráveis ao desenvolvimento
dos fungos (LACAZ et al., 2002; SOMENZI et al., 2006).
Certas manifestações cutâneas podem sinalizar a imunossupressão frequentemente
relacionada à pacientes infectados com HIV/AIDS, são caracterizadas pela diversidade dos
aspectos clínicos, rápida disseminação e resposta terapêutica insatisfatória, constituindo
um problema significativo para esse grupo de pacientes e são causadas principalmente por
C. albicans e Trichophyton rubrum (LOHOUÉ PETMY, et al., 2004; PANYA et al., 2009;
PORRO et al., 1997; PORRO; YOSHIOKA, 2000).
Segundo Johnson (2000), leveduras, dermatófitos e outros fungos filamentosos
podem colonizar a pele e anexos podendo causar dermatomicoses, contudo espécies de
Candida são agentes frequentes na infecção avançada pelo HIV, comprometendo a mucosa
da orofaringe e esôfago assim como a região inguinocrural. Candidíases cutâneas são
menos comuns, mas podem ocorrer como intertrigo ou paroníquia e pitiríase versicolor não
tem sido citada com maior incidência em pacientes com HIV.
Segundo Lacaz et al., 2002; Hube, 2004 candidíases são infecções causadas
principalmente por C. albicans, levedura que faz parte da microbiota endógena da pele,
mucosa oral e vaginal, bem como do trato gastrointestinal. Os autores afirmam ainda que,
quando causada por outras espécies é de fonte exógena encontrada na natureza em variados
substratos. Nas mucosas esta levedurose é influenciada por diversos fatores,
17 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
imunossupressão, em portadores de infecções graves, as hipo e avitaminoses, em geral se
manifestam quando a mucosa se encontra alterada.
A candidíase é descrita como a mais frequente infecção fúngica oportunista,
sobretudo por C. albicans. Contudo outras espécies têm sido causa de quadros clínicos
superficiais e sistêmicos. Estas diferentes espécies inicialmente determinam colonização,
progredindo às micoses oportunistas e de caráter oportunista (COLOMBO et al., 1999;
CROCCO et al., 2004; FOONGLADDA et al., 2002; GAUTRET et al., 2000; PFALLER
et al., 2001).
Espécies de leveduras de importância médica como C. albicans, C. parapsilosis, C.
tropicalis podem acometer imunocompetentes e imunossuprimidos (CALDERONE 2001;
COLEMAN et al., 1998; GROLL; WALSH, 2001; SINGH, 2001; SLAVIN, 2002).
A prevalência de C. albicans embora constatada comumente em lesões
mucocutânea graves em infectados pelo HIV/AIDS, não exclui mudança no perfil
epidemiológico no qual tem sido verificado o envolvimento de patógenos emergentes
como: C. guilliermondii, C. glabrata, C. krusei e C. lusitaniae (HAY, 1996; KREUTER et
al., 2003; MACÊDO et al., 2009; RICHARDSON; LASS-FLÖRL, 2008).
Segundo Crocco et al. (2004) espécies do gênero Candida podem danificar a unha
principalmente de indivíduos com AIDS, comportando-se como patógeno primário, quanto
aos acometimentos nos imunocompetentes, estas são frequentemente patógenos
secundários, invadindo a unha após trauma, hiper-hidratação ou irritação por contacto com
substâncias químicas.
Lima et al. (2008a) relataram lesão de unha distrófica parcial com paroníquia
crônica em portadora do HIV, em que foi detectado C. albicans e C. tropicalis como
agentes etiológicos, com resistência in vitro a fluconazol e itraconazol. Os autores
mencionam um tratamento prévio com fluconazol sistêmico para candidíase oral nesta
paciente. A onicomicose é uma infecção superficial de difícil tratamento e mesmo nos
casos em que a medicação é adequada, a cura nem sempre é obtida e recidivas são
freqüentes. Concluíram ainda que pacientes HIV-positivos com tratamento prévio com
fluconazol para candidíase oral podem desenvolver novas infecções por espécies de
Candida resistentes aos azólicos.
Candidose oral é uma manifestação comum em pacientes infectados com HIV e foi
reconhecida como um dos primeiros indicadores dessa doença (GIUDICE et al., 1997;
SAMARANAYAKE, 1992; TAYLOR et al., 2000).
18 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
Fungos patogênicos são causas de infecções com risco de vida, principalmente
entre indivíduos imunossuprimidos (PEREA; PATTERSON 2002). Novos dados indicam
que a proporção de infecções por espécies de Candida continua estabelecida como um dos
mais frequentes agentes de micoses (GONCALVES et al., 2006).
Infecções cutâneas por fungos filamentosos são também comuns em indivíduos
infetados com HIV e normalmente representam um aumento no crescimento de fungos que
colonizam a camada superficial da pele e anexos. A frequencia de dermatofitose em
pacientes com HIV pode não ser mais alta do que em grupos de pacientes não infectados
com o vírus, entretanto é aumentada a severidade e a variabilidade de apresentação desta
micose nesse grupo de pacientes (BURKHART et al., 2003; JOHNSON, 2000; YAMADA et
al., 2000). A lesão pode ser extensa e o diagnóstico clínico sugerir uma dermatose
inflamatória, e quando tratados com corticosteróide tópicos, pode resultar em infecção
fúngica generalizada (GIUDICE et al., 1997; JOHNSON, 2000).
A incidência de dermatofitose tem aumentado nos últimos anos, particularmente em
pacientes imunocomprometido, normalmente essa micose ocorre na camada superficial da
pele, mas também causa abscessos dependendo do estado imune do paciente (SUN; HO,
2006; WOON-LEUNG, 2006). Os dermatófitos mais comuns nos pacientes com HIV são
os mesmos dos indivíduos não infectados pelo vírus. T. rubrum coloniza os pés, com o
passar do tempo e o aumento da imunossupressão, a infecção pode se espalhar para toda
região plantar e posteriormente infectar as unhas. A infecção fúngica pode então
disseminar-se para as mãos (Tinea manum), virilha (Tinea cruris), tronco (Tinea corporis)
e para o rosto (Tinea facie) (JOHNSON, 2000).
Infecções dermatofíticas, comuns em pacientes imunocompetentes, podem ser mais
prevalentes em pacientes infectados pelo vírus HIV com deficiência de células T; regiões
inguinal, tronco, pés e mãos são muitas vezes mais envolvidos, enquanto que infecções de
face e couro cabeludo são menos comuns; o agente mais comum em todas as regiões
corpóreas é T. rubrum exceto em couro cabeludo (BERGER, 1993; BURKHART et al., 2003;
JOHNSON, 2000).
O aumento de infecções por dermatófitos, está relacionado a sobrevida de pessoas
com doenças imunossupressoras, como HIV/AIDS, câncer e transplantes (BERGOLD;
GEORGIADIS 2004; FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2003a; FERNÁNDEZ-TORRES et
al., 2002; GARCÍA et al., 2003; RIPPON, 1990; SQUEO et al., 1998).
Infecções por dermatófitos em indivíduos portadores do HIV variam de acordo com
a utilização terapêutica. Pessoas infectadas pelo vírus HIV sem tratamento anti-retroviral
19 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
(TARV) ou terapêutica para infecções fúngicas oportunistas ou dermatofíticas de pele,
unhas e pêlos, uma vez estabelecido a colonização, subsistem e progridem (PORRO et al,
1997); as infecções crônicas de onicomicose podem favorecer uma porta de entrada para
infecções mistas com Staphylococcus aureus ou Streptococcus e raramente, por outros
fungos como algumas espécies de Fusarium, podendo causar infecções fúngicas invasivas
originadas desta micose (JOHNSON, 2000).
O gênero Microsporum foi relatado como agente de tinha corporis, tinha pedis e
tinha unguium associado ou não com outro dermatófito ou levedura em pacientes com
AIDS; M. canis e M. gallinae são espécies zoofílicas cujo papel etiológico é documentado
na literatura médica (DEL PALÁCIO et al., 1992).
Hennequin et al. (1997) relatam infecção sistêmica causada por espécies de
Fusarium em paciente HIV - positivo com onicomicose, conduzindo o paciente a óbito,
diante disso, onicomicose causada por agentes emergentes deve ser considerada como
doença relevante em paciente HIV positivo.
M. gypseum foi isolado de lesões disseminadas em paciente com AIDS que
trabalhava com jardinagem, nas quais não foi observada associação com outros fungos
nem bactérias; M. gypseum foi isolado de uma única lesão na perna, depois de um ano de
evolução foi observada uma progressão para lesões de tinea corporis e tinea cruris. As
manifestações clínicas causadas por este agente são diversas, mas ocorrem frequentemente
em regiões do corpo como pernas, braços, mãos e face, concluindo que a aquisição de
dermatofitose em paciente imunocomprometido poderia ser consequência de repetidas
exposições ao agente etiológico (GIUDICE et al., 1997).
M. gypseum não é um agente comum de dermatofitose em humanos e não tem sido
descrita em pacientes portadores do HIV; entretanto foi relatada tinea corporis atípica
causada por esta espécie em dois pacientes com AIDS (FERNANDES et al., 1998;
PORRO et al, 1997).
Lima et al. (2008b) relataram dois casos de onicomicose causada por Scytalidium
hyalinum, S. dimidiatum em pacientes infectados com o HIV e Lacaz et al. (1999) relatam
dois casos de onicomicose na forma distrófica, uma delas envolvendo um paciente HIV
positivo, provocada por S. dimidiatum. O gênero Scytalidium causa infecção pelo contato
com solo, não ocorrendo transmissão inter-humana, a capacidade que S. hyalinum, S.
japonicum, Fusarium solani, Trichophyton rubrum e T. mentagrophytes possuem de
invadirem e degradarem a queratina da unha foi relatado por Oyeka; Gugnani (1998).
20 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
Cribier et al. (1998) estudando onicomicose em pacientes portadores do HIV, citam
que os dermatófitos são os principais agentes causadores dessa micose.
Em pesquisa realizada com 108 pacientes HIV positivos, em cinco pacientes foram
constatados dois ou mais rigiões com micose; além disso, em alguns casos, foi encontrado
associação de fungos na mesma lesão: dermatófito com levedura em três casos, levedura
com fungo filamentoso em um caso, dermatófito com outro fungo filamentoso em um
caso. Em relação à localização da lesão, pés, dedos, interdígitos e região crural foram as
predominantes (YAMADA et al., 2000).
Espécies de fungos com atividade queratinofílica, não classificados entre os
dermatófitos, podem provocar lesões cutâneas ou ungueais, simulando casos de tinea,
destacando-se, neste grupo, algumas espécies de Scytalidium hyalinum, S. dimidiatum e
seus teleomorfos Chrysosporium e Nattrassia mangiferae (LACAZ et al., 2002).
Rodriguez-Villalobos et al. (2003) citam um caso disseminado incomum causado
por Cylindrocarpon lichenicola de infecção proveniente de onicomicose na unha do pé de
uma paciente imunocomprometida, portadora de leucemia. O fungo foi isolado das unhas e
pele do dedo infectado. Segundo Welsh et al. (2003) estes agentes são resultados da
implantação traumática, por esta razão os pés são mais acometidos por essa infecção.
Segundo Souza et al. (2007) em um estudo retrospectivo na cidade de Maringá com
exames realizados em pacientes imunocompetentes, com suspeita de onicomicose,
concluíram que dos 1.295 casos, a confirmação micológica de onicomicose ocorreu em
761 (58,76%). As leveduras foram as mais isoladas (46,39%), seguidas pelos dermatófitos
(40,60%) e pelos fungos filamentosos não dermatófitos (13,01%). A alta frequência de
leveduras em onicomicoses indica aprimoramento nas técnicas diagnósticas de
confirmação laboratorial de fungos oportunistas, esses resultados associados à abordagem
clínica do paciente, possibilitam maior segurança no diagnóstico e tratamento.
Surjushe et al. (2007) trabalhando com pacientes HIV positivos com lesão de unha,
relatam maior incidência de Aspergillus niger, Cladosporium sp, Scytalidium hyalinum,
Penicillium sp. e Gymnoascus dankaliensis.
Lima et al. (2008b) trabalhando com pacientes infectados com o HIV relataram
quatro casos de onicomicose causados por Aspergillus niger, Fusarium solani, Scytalidium
hyalinum e S. dimidiatum, concluíram que é necessário um diagnóstico acurado, para
estabelecer medidas específicas e tratamento adequado, visando prevenir possível invasão
fúngica.
21 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
Graham et al. (2008) referem Trichophyton rubrum seguido por T. mentagrophytes,
T. tonsurans, Epidermophyton floccosum e Candida albicans como os agentes mais
comuns de onicomicose em pacientes infectados com HIV. Ginter et al. (1996) trabalhando
com onicomicose em pacientes imunocompetentes relataram também maior ocorrência de
dermatófitos seguido de leveduras e outros fungos filamentosos.
2.1 CARACTERIZAÇÃO FISIOLÓGICA
São vários os aspectos fisiológicos relacionados à infecção, entre estes a
temperatura de crescimento e expressão de enzimas extracelulares como protease e
fosfolipase por microrganismos, participando de forma significativa dos danos à membrana
celular, sendo de grande importância para caracterização dos isolados, estabelecendo uma
relação com a patogenicidade. Estas enzimas são secretadas para o meio de cultura
contendo substrato específico, durante o crescimento (ABDEL-RAHMAN, 2002;
CHAVES et al., 2003; LACAZ et al., 2002; PAPINI; MANCIANTI, 1995; SINGH, 1997;
SIDRIM; ROCHA, 2004; TRABULSI et al., 1999).
A habilidade que espécies fúngicas têm de crescerem à temperatura corpórea é
considerada a principal exigência para que estes sejam patógenos (KWON CHUNG;
BENNETT, 1992; RIPPON, 1990). Portanto, essa característica está diretamente associada
à patogenicidade desses microrganismos (CAMBUIM, 2005; LACAZ et al., 2002;
MACEDO et al., 2005).
Os fungos são organismos instáveis quanto à adaptação as condições de
crescimento. Todavia, o estudo da temperatura estabelece um importante parâmetro quanto
à patogenicidade destes microrganismos, especialmente se crescem a 37ºC (ALVES, 1998;
HANEL et al., 1995; JIMÉNEZ, 1993; LACAZ et al., 2002; NEDER, 1992).
O uso de meio de cultura sólido contendo substrato específico permite detecção da
expresssão enzimática e tem sido utilizado por vários autores (AOKI et al., 1994;
CORDEIRO NETO, 1997; DOS SANTOS et al., 2001; FRIEDRICH et al. 1999; LACAZ
et al., 2002; MUHSIN et al., 1997; PRICE; CAWSON, 1977; PRICE et al., 1982;
WAWRZKIEWICK et al., 1991); embora em trabalho realizado por Chaves et al., 2003,
com amostras de C. albicans estocadas e recém isoladas de secreção da orofaringe de
pacientes com AIDS, não expressaram atividade proteásica em meio sólido contendo
caseína como substrato.
22 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
Protease e fosfolipase são enzimas importantes na patogenicidade de fungos e são
citadas por Banerjee et al. (1991) em leveduras do gênero Candida.
As leveduras como microrganismos oportunistas podem expressar vários fatores de
virulência incluindo a expressão de enzimas extracelulares como proteases e fosfolipases,
as quais contribuem para a patogênese da infecção e estas leveduroses são observadas em
várias regiões do corpo (CANDIDO et al., 2000; CALDERONE; FONZI, 2001; HUBE,
2004).
Proteases estão envolvidas em infecções por dermatófitos que são capazes de
quebrar moléculas maiores existentes na pele e anexos em moléculas menores para sua
utilização (ABDEL-RAHMAN 2002; MAIA et al, 2001; MUHSIN; SALIH, 2000;
PAPINI; MANCIANTI, 1995; SKOREPOVÁ; HAUCK, 1987; TAKASUKA, 2000).
Abdel-Rahman (2000) relatou que a expressão de protease extracelular de
Trichophyton tonsurans é importante para a infecção, sendo verificado também que quanto
maior é a atividade enzimática, mais severa é a micose.
Alguns autores citam o importante papel da atividade proteásica sintetizada por
dermatófitos no processo de invasão do tecido do hospedeiro desenvolvendo infecção
(ABDEL-RAHMAN 2002; MAIA et al., 2001; SAMDANI et al., 1995; SIMPANYA;
BAXTER, 1996). Além da invasão do micélio no tecido do hospedeiro, a habilidade de
colonizar e posteriormente se disseminar no estrato córneo são governados em parte, por
enzimas proteolíticas que contribuem de forma imprescindível (ABDEL-RAHMAN, 2000;
MAIA et al., 2001; SAMDANI et al., 1995).
Variações da atividade proteolítica entre T. mentagrophytes e T. rubrum isolados de
escamas de pele e unha causando tinea pedis e tinea unguium, foram observadas por
Samdani et al. (1995), as quais constataram maior atividade com amostras de T.
mentagrophytes. Variações enzimáticas foram também observadas entre amostras de M.
canis por Maia et al. (2001) e de T. rubrum por Dos Santos et al. (2001). As diferentes
expressões enzimáticas podem estar relacionadas com os aspectos ecológicos antropofílico,
zoofílico e geofílico uma vez que a adaptação do dermatófito geofílico para o homem e
outros animais, envolve também adequada nutrição (MUHSIN; SALIH, 2000; PHILPOT,
1977).
A determinação da atividade fosfolipásica em meio sólido, utilizando lecitina de
soja ou gema de ovo como substrato, tem sido utilizada por vários autores com grande
quantidade de fungos, os quais secretam enzimas para o meio de cultura (CAMBUIM,
2005; CHAVES et al., 2003; CORDEIRO NETO et al., 1997; DOS SANTOS et al., 2001;
23 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
FRIEDRICH et al.,1999; KANTARCIOGLU; YUCEL, 2002; LACAZ et al., 2002;
MACEDO et al., 2005; MUHSIN et al., 1997; PRICE; CAWSON, 1977; PRICE et al.,
1982; RÖRIG et al., 2009).
Fosfolipases são enzimas que degradam os fosfolipídeos, frequentemente fazendo
parte da membrana celular de animais, plantas e microrganismos, auxiliando a invasão de
células hospedeiras por dermatófitos (DAS; BANERJEE, 1977). A expressão da
fosfolipase por C. albicans está relacionada com a patogenicidade, podendo causar danos à
membrana da célula do hospedeiro pela degradação de fosfolipídeos e lisofosfolipídeos
(HANEL et al., 1995; IBRAHIM et al., 1995); a elevada produção está relacionada com
maior capacidade de aderência, desenvolvimento da doença e elevada taxa de mortalidade
em estudos com animais (MAYSER et al., 1996). Chaves et al. (2003) constataram
atividade fosfolipásica em 13 amostras de C. albicans preservadas sob óleo mineral e em
quatro recém isoladas de pacientes com AIDS.
Em trabalho de revisão, foi confirmado o envolvimento de enzimas nas infecções
por espécies de fungos de interesse médico, em especial por dermatófitos (WEITZMAN;
SUMMERBELL, 1995); as enzimas podem atuar como fator de patogenicidade, devido ao
envolvimento com a propagação do fungo no hospedeiro, causando invasão através da
degradação de proteínas da pele e anexos (KWON-CHUNG; BENNETT, 1992).
Braz et al. (2009) não observaram atividade fosfolipásica em nenhuma cultura
preservada de Acremonium usando como substrato lecitina de soja; bem como Macêdo et
al. (2005) de 15 isolados de Epidermophyton floccosum preservadas e recém isoladas.
2.2 FÁRMACOS ANTIFÚNGICOS
Muitos agentes antifúngicos estão disponíveis em várias formulações farmacêuticas
para o tratamento tópico ou sistêmico de infecções por fungos. Os principais agentes
pertencem aos polienos, como anfotericina B e nistatina ou os azólicos, como fluconazol e
itraconazol. Porém, devido à necessidade para tratamento prolongado, o custo alto,
toxicidade e ação limitada dos fármacos convencionais, novos e efetivos produtos são
pesquisados para infecções por fungos (GAZIM, et al., 2008; PORTER; WILKINS, 1999;
SRIDHAR et al., 2003).
Segundo Feedberg et al. (2003) o tratamento via oral é realizado em caso
disseminado ou de lesões extensas, utilizando principalmente os derivados azólicos como
fluconazol, itraconazol, cetoconazol e alilaminas como a terbinafina. Entretanto, a escolha
24 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
da forma ideal depende da localização e extensão da lesão como também da espécie
envolvida (FERNANDEZ-TORRES et al., 2001; FERNANDEZ-TORRES et al., 2002).
O uso de fluconazol associado com inibidores da protease em paciente com HIV
pode ter efeitos clinicamente importantes; usar associado com indinavir pode resultar em
uma diminuição na concentração sérica de indinavir; quando utilizado com ritonavir pode
resultar em um aumento na concentração sérica do mesmo. Fluconazol pode interferir com
zidovudina e aumentar as concentrações séricas deste inibidor da transcriptase reversa
(LIMA, 2003).
Pacientes portadores do HIV, frequentemente apresentam micose superficial em
diferentes fases da doença, com lesões atípicas severas e disseminadas (BURKHART, 2003;
GOMIDES et al., 2002; YAMADA et al., 2000). Entretanto o uso de alguns antifúngicos é
dificultado pela falta de eficácia, surgimento de resistências, toxicidade e a necessidade de
administração intravenosa (VAZQUEZ et al., 2006). O tratamento prolongado com
medicações sistêmicas pode gerar efeitos tóxicos como vômitos, erupções cutâneas,
sonolência, efeitos como diminuição do libido, ginecomastia e hepatotoxicidade, esta
última ocorre entre 1 a 5% dos casos com raros casos fatais (FREEDBERG et al., 2003;
GIORDANI et al., 2001), o que torna importante o desenvolvimento de novas estratégias
terapêuticas (FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2006; FOSTEL; LARTEY, 2000; GARCÍA
et al., 2003; TATSUMI et al., 2002).
Silva et al. (1998) trabalhando com 86 amostras clínicas de mucosa oral de
pacientes com AIDS, isolaram 59 (68,60%) amostras de Candida, sendo 52(88,13%) de C.
albicans, quatro (6,77%) de C. tropicalis e três (5,08%) de C. krusei. Dessas amostras
apenas 8,47% e 5,08% foram resistentes a anfotericina B e flucitosina, respectivamente.
Entretanto foi observada uma maior resistência aos derivados azólicos, sendo 25,42% ao
itraconazol, 45,76% ao cetoconazol e 66,10% ao fluconazol.
Magliorati et al. (2004) isolaram vinte e cinco diferentes amostras de Candida da
cavidade oral de pacientes HIV positivos; destes 68% foram de C. albicans, C. famata
(16%), C. glabrata (4%), C. tropicalis (4%); verificaram que 52,2% eram resistentes ao
cetoconazol, 30,4% ao fluconazol e 26% ao itraconazol.
A busca para novas gerações de compostos antifúngicos é devido a algumas
limitações do uso, como efeito colateral, toxicidade e emergência de amostras resistentes
(TERRELL, 1999). Embora a susceptibilidade das leveduras do gênero Candida aos
antifúngicos disponíveis seja variável, nem sempre uma amostra isolada segue o padrão
geral. Essa é uma das razões da crescente importância dos testes de susceptibilidade (REX
25 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
et al., 2000), tradicionalmente, extratos de plantas medicinais têm sido uma fonte valiosa
de novos antifúngicos (WEBSTER et al., 2008).
2.3 NOVAS ALTERNATIVAS ANTIFÚNGICAS
2.3.1 Própolis
Um dos produtos naturais que tem sido bastante estudado pelas suas propriedades
biológicas é a própolis, que é uma mistura de substâncias resinosas de consistência e
coloração variada, de composição química complexa, produzida pelas abelhas Apis
mellifera de várias partes das plantas, usada pelas abelhas para selar buracos e proteger a
colméia (GHISALBERTI, 1979; GREENAWAY et al., 1990; KUSUMOTO et al., 2001),
preparar e manter asséptico o ambiente interno da colméia, para a postura da abelha rainha
e embalsamar invasores (BANKOVA et al., 2000; BURDOCK, 1998; FUNARI; FERRO,
2006; KOC et al., 2005; KUJUMGIEV et al., 1999; SALATINO et al., 2005; SAWAYA et
al., 2002) e tem sido usada como medicamento para tratar infecções e promover a
cicatrização de feridas durante séculos (ALENCAR et al., 2007). As abelhas transportam
estas substâncias até a colméia e as modificam por meio da adição de cera, pólen e
produtos do seu metabolismo, como a enzima salivar ß-glicosidase, aumentando sua ação
farmacológica (PARK et al., 1998b; PINTO et al., 2001; PARK et al., 2002a;
STRADIOTTI et al., 2004).
No Japão, o uso da própolis foi impulsionado em 1985 após a realização do XXX
Congresso Internacional de Apicultura, sendo hoje, o principal comprador da própolis
brasileira, pois consomem 90% da própolis exportada pelo Brasil, principalmente por
causa das propriedades biológicas (AGUIAR et al., 2003; MARCUCCI et al., 2007;
NASCIMENTO et al., 2007; SALATINO et al., 2005). A própolis foi utilizada na Europa
como tratamento para candidíase oral, antibacteriano, antieczematoso, antiacne, no
tratamento de abscessos gengivais hemorrágicos e halitose (NOTHENBERG, 1997). A
própolis também tem demonstrado excelentes atividades fungistática e fungicida, em testes
in vitro frente a leveduras identificadas como agentes de onicomicoses (LONGHINI et al.,
2007; OLIVEIRA et al., 2006).
A principal fonte de própolis é o botão do álamo (Populus sp.), que pode ser
encontrado ao longo dos rios ou em regiões pantanosas de clima temperado como Europa,
América do Norte, oeste da Ásia e norte da África (MARKHAM et al., 1996; PARK et al.,
26 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
2000). Em regiões de clima tropical o álamo não é nativo, mas existe uma grande
diversidade vegetal para retirada da resina, o que dificulta a correlação com a composição
química da própolis; entretanto, o melhor indicador da origem botânica da própolis é a
análise da sua composição química comparada com a provável fonte vegetal (PARK et al.,
2002b). No Brasil, existem várias espécies vegetais para a extração de resina, até agora
poucas foram identificadas, no entanto, o alecrim (Rosmarinus Officinalis), assa-peixe,
aroeira (Schinus molle L) e eucalipto (Eucalyptus robusta) são alguns exemplos de onde as
abelhas buscam a matéria-prima para a produção da própolis (PARK et al., 2000).
A própolis brasileira foi classificada por PARK et al. (2002a) a partir de
características físico-químicas e fontes botânicas de cinco estados do sul do Brasil, um do
sudeste e seis do nordeste, concluindo que as própolis dessas regiões têm como fonte
botânica a resina extraída do álamo, de Baccharis dracunculifolia e de Hyptis divaricata,
respectivamente, com aspectos físicos e colorações diferentes.
A coloração da própolis depende da procedência e pode variar entre marrom claro e
escuro, marrom avermelhado, esverdeado, amarelado e avermelhado (BURDOCK, 1998;
DAUGSCH et al., 2007; SALATINO et al., 2005), sua composição química depende da
localização geográfica, como resultado, sua atividade biológica está relacionado à
vegetação nativa (CHRISTOV et al., 1998; PARK et al., 2002b). Possui odor característico
de resina aromática podendo variar de uma amostra para outra e o ponto de fusão é entre
60 e 70 ºC podendo chegar a 100 ºC em alguns casos (MARCUCCI, 1995). É uma
substância rígida, mas quebradiça quando fria e que se torna dúctil e maleável quando
aquecida (BURDOCK, 1998; SALATINO et al., 2005).
A principal fonte botânica da própolis verde brasileira é extraída de Baccharis
dracunculifolia, família Asteraceae por abelhas A. mellifera, é rica em derivados
prenilados do ácido cinâmico, (ALENCAR et al., 2005a; BANKOVA et al., 2000;
KUMAZWA et al., 2003; PARK et al., 2000; PARK et al., 2002a), conhecida como
alecrim-do-campo ou vassourinha; é nativa da região central do Brasil, mas pode ser
encontrada em qualquer outra região do país (KUMAZWA et al., 2003; PARK et al., 2004;
SALATINO et al., 2005). Ao oeste de Uberlândia (Minas Gerais, Brasil), foram
encontradas Brachiarea decumbens e Eucalyptus urophilla como fontes botânicas da
própolis dessa região (NASCIMENTO; BENZZAN, 2001).
Foi verificada atividade in vitro da própolis em relação a bactérias Gram positivas
(SANTOS NETO et al., 2009) e Gram negativas in vivo com redução de 95% de casos de
gengivites (AMARAL et al., 2006) e inibição de candidíase oral (SANTOS et al., 2005).
27 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
Fernandes Júnior et al. (2006); Havsteen, (2002) e Quiroga et al. (2006) também
correlacionam a composição química da própolis com atividade antifúngica.
Segundo Trusheva et al. (2006) as própolis brasileiras, têm mostrado diferenças
significantes nas suas composições químicas em relação à própolis da zona temperada,
tornando-se objeto de grande interesse por parte dos cientistas. O extrato da própolis verde
brasileira, produzida em São Paulo e Minas Gerais são constituídos principalmente de
derivados prenilados do ácido p-cumárico e possui grande quantidade de flavonóides,
muitos dos quais não estão presentes em própolis da Europa, América do Norte e Ásia
(SIMÕES et al., 2004).
Não são conhecidos os fatores que direcionam a preferência das abelhas coletoras
de resina por uma determinada fonte vegetal, mas sabe-se que estas são seletivas
(SALATINO et al., 2005). Possivelmente, esta escolha esteja relacionada com a atividade
antimicrobiana da resina, uma vez que as abelhas utilizam a própolis como um anti-séptico
(SAHINLER; KAFTANOGLU, 2005). Harish et al. (1997) também descreveram atividade
inibitória da própolis sobre a replicação do vírus HIV-1 em culturas celulares de linfócitos
CD4. Alguns trabalhos têm indicado que a própolis apresenta baixa toxidade, descrevendo
inclusive suas doses toleráveis (CASTRO; HIGASHI, 1995; PARK et al., 1998). Burdock,
(1998) conclui ainda que a própolis não é tóxica, a um nível de 1.400 mg / kg de peso
corporal / dia.
De modo geral, a própolis, contêm 50-60% de resinas e bálsamos, 30-40% de ceras,
5-10% de óleos essenciais, 5% de grão de pólen, além de microelementos como alumínio,
cálcio, estrôncio, ferro, cobre, manganês e pequenas quantidades de vitaminas B1, B2, B6,
C, E (BURDOCK, 1998; FUNARI; FERRO, 2006; MENEZES, 2005; PARK et al.,
2002b).
Os principais compostos químicos isolados da própolis até o momento podem ser
organizados em alguns grupos principais como: ácidos e ésteres alifáticos, ácidos e ésteres
aromáticos, açúcares, alcoóis, aldeídos, ácidos graxo, aminoácidos, esteróides, cetonas,
charconas e di-hidrocharconas, flavonóides (flavonas, flavonóis e flavononas), terpenóides,
proteínas, vitaminas B1, B2, B6, C, E, bem como diversos minerais. Detalhes sobre a
composição da própolis podem ser encontrados em BANKOVA et al. (2000), BURDOCK
(1998), MARCUCCI (1995), SAHINLER; KAFTANOGLU (2005). De todos esses grupos
de compostos, certamente o que mais vem chamando a atenção dos pesquisadores é o dos
flavonóides (HAVSTEEN, 2002).
28 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
Os flavonóides são compostos fenólicos que compreendem um amplo grupo de
substâncias naturais não sintetizadas pelos animais (MANACH et al., 2004). Cerca de
4.000 substâncias diferentes foram listadas como flavonóides, entre estas apigenina,
quercetina, hesperetina, rutina, luteolina, genisteina, daidzeina, antocianidina, kanferol etc.
A presença e a concentração destes compostos são utilizados como índice de qualificação
de amostras de própolis (LU et al., 2004). Nas amostras brasileiras de própolis os
compostos fenólicos, como o artepillin C e o ácido hidroxicinâmico, são as principais
substâncias (PEREIRA et al., 2003).
A ingestão de flavonóides interfere em diversos processos fisiológicos, auxiliando
na absorção e na ação de vitaminas, atuando nos processos de cicatrização como
antioxidantes, além de apresentarem atividade antimicrobiana e moduladora do sistema
imune (WILLIAMS et al., 2004). Embora os flavonóides sejam os componentes da
própolis mais extensivamente estudados, estes não são os únicos responsáveis pelas suas
propriedades farmacológicas; diversos outros compostos têm sido relacionados com as
propriedades medicinais da própolis (AWALE et al., 2005).
Numerosas propriedades biológicas têm sido citadas incluindo antimicrobianos,
antifúngicos, antinflamatórios, antineoplásicos e atividade antioxidante (ALENCAR et al.,
2005; KUJUMGIEV et al., 1999; MARCUCCI et al., 2001; PARK et al., 1998; RUFER;
KULLING, 2006; SIMÕES et al., 2004; WANG et al., 2000); citotoxidade (MATSUNO et
al., 1997), anti-herpes (VYNOGRAD et al., 2000), inibe o crescimento de câncer
prostático (KANAZAWA et al., 2003), antitumoral (PARK et al., 1998; SANTOS NETO
et al., 2009), anti-HIV (ITO et al., 2001), efeitos supressivos da toxicidade da dioxina
(PARK et al., 2005); e o efeito de ativação imune em ratos pela ação da própolis foi
verificado por Takagi et al. (2005), contra Toxoplasma gondii, Trichomonas spp., Giardia
lamblia (DANTAS et al., 2006), Trypanosoma cruzi (DANTAS et al., 2006; PRYTZYK et
al., 2003) Leishmania amazonensis (AYRES et al., 2007).
A inibição do crescimento de fungos pela ação de própolis já foi verificada em
leveduras do gênero Candida (KUJUMGIEV et al., 1999; OLIVEIRA et al., 2006; OTA et
al., 2001; SANTOS et al., 2005; SAWAYA et al., 2002; SEVERO GOMES, 2009),
Paracoccidioides brasiliensis (MURAD et al., 2002) Cryptococcus neoformans
(FERNANDES et al., 2007) e dermatófitos (SIQUEIRA et al., 2008).
Marcucci et al. (2007) verificaram quando a fonte vegetal predominante da região
diminui, começam a aparecer novas fontes de resinas o que justifica a presença do álamo
29 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
na região sul do Brasil e o surgimento de própolis com composição química proveniente de
várias fontes botânicas.
A maioria dos produtos comercializados no Brasil à base de própolis possui
registro no Ministério da Agricultura, que preconiza os limites para fixação de identidade e
qualidade da própolis na Instrução Normativa nº 3, de 19 de janeiro de 2001 (BRASIL,
2001). Os produtos que contêm própolis e que apresentem indicações terapêuticas podem
ser registrados como medicamentos específicos segundo a Resolução-RDC nº 132, de 29
de maio de 2003, D.O.U. de 02/10/2003, sendo classificados como opoterápicos
(medicamentos de origem animal) (BRASIL, 2003). A comprovação de segurança e
eficácia segue a nota técnica da Câmara Técnica de Medicamentos Fitoterápicos (CATEF,
2005).
Segundo Alencar et al. (2005a) os estados de Minas Gerais e São Paulo possuem
simplesmente um tipo majoritário de própolis, indicando que são poucas as espécies
vegetais fornecedoras de resinas para elaboração de própolis e pelo grande número de
compostos identificados e confirmados pelas técnicas de cromatografia líquida de alta
eficiência e cromatografia gasosa com espectrometria de massa, chegaram a conclusão que
a resina da espécie vegetal de B. dracunculifolia é a principal fonte de resina para a
elaboração das própolis produzidas nesses estados.
Segundo Sousa et al. (2007) o extrato etanólico da própolis verde brasileira é rico
em ácidos fenólicos e flavonóides, havendo predomínio de ácidos fenólicos do qual o ácido
cinâmico é o mais abundante, principalmente os que contem o grupo prenil, como por
exemplo, o artepelin C. Além desses, também são citados terpenos, ácidos aromáticos e
flavonóides tais como canferide, pinobanskina, pinocembrina, crisina, galangina, canferol e
isosakuranetina (MARCUCCI et al., 2007).
Mello et al. (2006) verificaram que o extrato etanólico da própolis verde brasileira
industrializada pela Pharma Néctar inibiu a formação do tubo germinativo de C. albicans
ATCC18804.
A atividade antimicrobiana da própolis contra bactérias periodonto patogênicas foi
investigada através de testes in vitro. C. albicans também foi testada para sua
susceptibilidade ao extrato etanólico de própolis a qual foi determinada na concentração de
12 µg/mL. A concentração inibitória mínima (CIM) para Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli e Staphylococcus aureus (tipo selvagem) foi de 14 µg/mL. Todos os
patógenos periodontais testados foram sensíveis ao extrato etanólico de própolis
(GEBARA et al., 2002).
30 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
Molina et al. (2008) trabalhando com extrato glicólico de própolis concluíram que o
mesmo foi o mais efetivo, apresentando atividade antifúngica para todas as amostras de C.
albicans. É importante ressaltar que no presente estudo foi utilizado o extrato glicólico de
própolis e não o extrato alcoólico como na maioria dos estudos. Embora a ação
antimicrobiana do álcool nessas soluções possa ser nula devido a sua baixa concentração, o
uso prolongado de soluções contendo álcool tem sido questionado, pois o álcool se
utilizado em longo prazo tem potencial carcinogênico (CARRETERO-PELAÉZ et al.,
2004).
O extrato alcoólico da própolis verde brasileira de Minas Gerais demonstrou
atividade antimicrobiana em relação à Staphylococcus sp. (PARK et al., 1998a; SANTOS
NETO et al., 2009), entretanto essa atividade não ocorreu quando foi usado o extrato
aquoso (PARK et al., 1998a).
Amostras de própolis produzidas por abelhas A. mellifera, coletada do estado de
Alagoas, em março de 2005, foi classificada como um novo tipo de própolis brasileira,
denominada de própolis vermelha. Sua intensa cor vermelha e composição química fazem
desta própolis brasileira diferente dos 12 tipos classificadas anteriormente por Park et al.,
2002 (ALENCAR et al., 2007).
Dalbergia ecastophyllum é a principal fonte botânica da própolis vermelha do
Brasil conhecida como rabo-de-bugio, localizada nos estados da região nordeste do país,
como Alagoas, Bahia, Paraíba, Pernambuco e Sergipe. Apresentaram atividade
antimicrobiana para Staphylococcus aureus ATCC25923, na concentração próxima a
2,5µg/mL, que variaram a depender da prevalência de D. ecastophyllum nas regiões
(DAUGSCH et al., 2007).
Alencar et al. (2007) em seu trabalho analisando atividade biológica e composição
química da própolis vermelha, concluíram que o extrato etanólico da própolis vermelha
tem combinações biologicamente ativas que nunca tinham sido informadas para outros
tipos de própolis brasileira.
A composição química do extrato etanólico da própolis vermelha é variável
dependendo da biodiversidade da fonte botânica, mas é notável a predominância de
isoflavonóides (SILVA et al., 2007). As isoflavonas são compostos típicos de espécie da
família leguminosa (Dalbergia ecastophyllum) e, portanto, estes compostos podem ser
úteis como marcadores químicos deste novo tipo de própolis brasileira (ALENCAR et al.,
2007).
31 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
2.3.2 Lectinas
As lectinas, outra substância de origem natural despertam interesse científico
devido ao grande potencial, quando utilizadas de forma purificada em pesquisas biológicas
para fins de diagnóstico clínico, investigação de estrutura de proteína e carboidratos em
células; quanto aos efeitos tóxicos das lectinas, estes podem ser inativados ou inibidos
quando são utilizados tratamentos térmicos adequados (SILVA; SILVA, 2000).
Lectinas são proteínas com propriedade particular de interagir específica e
reversivelmente com carboidratos e glicoconjugados como glicoproteína e glicolipídeo,
combinam-se com estruturas biológicas e moléculas que contém esses açúcares sem alterar
a estrutura covalente das ligações glicosídicas nos sítios de ligação (CAVADA et al., 1998;
CHEN et al., 2005; CHUMKHUNTHOD et al., 2006; DAMICO et al., 2003; LIS;
SHARON, 1998; MOREIRA et al., 1996; MOREIRA et al., 1997; WONG et al., 2006).
São encontradas amplamente em plantas, animais, fungos, bactérias e vírus (CAVADA et
al., 1998; CHUMKHUNTHOD et al., 2006; LIS; SHARON, 1998; NGAI; NG 2004;
WANG et al., 1996; XIA; NG, 2005), entretanto sementes de leguminosas como de feijão
e ervilha são fontes ricas em lectinas as quais têm sido amplamente caracterizadas em
relação as propriedades biológicas, químicas, fisicoquímicas e estrutural (CAVADA et al.,
1996; GOZIA et al., 1993; GRANGEIRO et al., 1997; MOREIRA et al., 1993; MOREIRA
et al., 1996; NAPIMOGA et al., 2007). Além disso, tem a capacidade de se manter estável
em condições desfavoráveis como elevada temperatura, ampla faixa de pH e na presença
de proteases de animais e insetos; isso leva a acreditar na função de defesa dessa classe de
proteína (PEUMANS; VAN DAMME, 1995, YE et al., 2001).
Com exceção de quitinases, glucanases e glicosidades, as lectinas são as únicas
proteínas capazes de reconhecer e ligar-se a glicoconjugados presentes na superfície de
fungos e bactérias ou expostos no trato intestinal de insetos e mamíferos (PEUMANS;
VAN DAMME, 1995, YE et al., 2001).
A parede celular dos fungos contém entre 80 e 90% de polissacarídeos, sendo
também constituída de proteínas e lipídeos, a qual é continuamente expandida e
remodelada durante o desenvolvimento. Os monossacarídeos mais encontrados na parede
celular dos fungos são: D-glicose, N-acetil-D-glicosamina, D-manose, D-galactose, D-
galactosamina, L-fucose, D-glicosamina, xilose e ácido D-glicurônico e ocasionalmente
32 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
ramnose, ribose e arabinose. Entretanto glicose, N-acetil-D-glicosamina e manose são
encontrados na maioria dos fungos (ADAMS, 2004; KITAJMA, 2000).
As lectinas podem ser agrupadas quanto à especificidade de ligação aos
carboidratos: D-manose/D-glicose, D-manose, N-acetilglicosamina, N-acetilgalactosamina,
galactose e ácido siálico (MOREIRA et al., 1996; NGAI; NG, 2004; WONG; NG, 2005;
WONG et al., 2006) e quanto às características estruturais, são denominadas merolectinas,
hololectinas e quimerolectinas (Figura 1).
As merolectinas são proteínas de caráter monovalente que tem um único domínio
de ligação a carboidrato, são incapazes de precipitar glicoconjugados ou aglutinar células
(PEUMANS; VAN DAMME, 1995); como exemplo tem as haveínas, proteína do látex de
seringueira (Hevea brasiliensis), que se liga à quitina (VAN PARIJS et al., 1992).
Hololectinas são constituídas exclusivamente de domínios de carboidratos ligantes, mas
com dois ou mais sítios de ligação, podendo ser idênticos ou semelhantes; podem aglutinar
células e/ou precipitar glicoconjugados, comportando-se como aglutininas por serem di ou
multivalente; compreende a maioria das lectinas de plantas, pois se comportam como
hemaglutininas. Quimerolectinas são compostas com um ou mais domínios de carboidratos
ligantes e um domínio não relacionado com uma atividade catalítica bem definida que age
independente dos domínios de carboidratos ligantes. As quimerolectinas podem comportar-
se como merolectinas ou hololectinas, dependendo do número de sítios de ligação aos
carboidratos; como exemplo deste grupo são as proteínas inativadoras de ribossomos,
como a ricina (toxina da mamona), que possui dois domínios de ligação para carboidratos
Figura 1. Esquema da estrutura dos três tipos de lectinas de plantas: merolectina,
hololectina, quimerolectina segundo Peumans e Van Dame, 1995.
MEROLECTINA HOLOLECTINA QUIMEROLECTINA
quitinase – classe I
RIP – tipo II
domínio de ligação ao carboidrato
domínio catalítico
domínio de inativação ribossômica
33 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
comportando-se como hololectina e um domínio para a inativação do ribossomo
(PEUMANS; VAN DAMME, 1995).
Essa classificação foi ampliada com o conceito de superlectinas, as quais possuem
dois ou mais domínios ligantes a carboidratos, domínios esses com especificidade para
diferentes açúcares. Posteriormente foi elaborado o termo multilectinas, que são aquelas
que possuem dois ou mais domínios ligantes a carboidratos, idênticos, mas que podem se
ligar a açúcares diferentes (MONTEIRO-MOREIRA, 2002). Foram observadas
propriedades antifúngicas de lectinas de sementes de leguminosa como Phaseolus vulgaris
(feijão) (YE et al., 2001); de frutas como Talisia esculenta (pitomba) (FREIRE et al.,
2002), Artocarpus intergrifolia (jaca), A. incisa (fruta-pão) (TRINDADE et al., 2006) e
Annona muricata (graviola) (DAMICO et al., 2003); de fungos como Kluyveromyces
bulgaricus (VIARD et al., 1993) e Schizophyllum commune (CHUMKHUNTHOD et al.,
2006); de Urtica dioica (urtiga) (BROCKAERT et al., 1989), de batata (GOZIA et al.,
1993), de germe de trigo (CIOPRAGA et al., 1999) e de Astragalus mongholicus (erva
chinesa) (YAN et al., 2005).
Vários autores citam a participação das lectinas em atividades biológicas como
antifúngica (CIOPRAGA et al., 1999; DAMICO et al., 2003; SEVERO GOMES, 2009;
SIQUEIRA et al., 2008; TRINDADE et al., 2006; YE et al., 2001), antibacteriana
(AYOUBA et al., 1994; SEQUEIRA; GRAHAM, 1977; TEIXEIRA et al., 2006;
TEIXEIRA et al., 2007), antiinflamatória (NUNES et al., 2009) anti-HIV (BARRIENTOS;
GRONENBORN, 2005; OOI et al., 2000; PEUMANS; VAN DAMME, 1995; WANG;
NG, 2001; WONG; NG, 2003; WONG; NG, 2005; YE et al., 2001), antiproliferativa
(WANG et al., 1995; WONG; NG, 2003), antitumoral (ABDULLAEV; MEJIA, 1997;
NGAI; NG, 2004; SANTOS NETO et al., 2009; SANTOS, 2009; WANG et al., 1996;
WANG et al., 2000), imunomodulatória (RUBINSTEIN et al., 2004; SHE et al., 1998;
WANG et al., 1996; WANG et al., 2002), estimulação de macrófagos, (RODRIGUEZ et
al., 1992), indução da produção de interferon δ por linfócitos humanos (BARRAL-NETTO
et al., 1992), liberação de histamina (GOMES et al., 1994), efeitos edematogênicos e
migração celular (BENTO et al., 1993).
A ação antifúngica de lectinas foi observada em Aspergillus niger
(CHUMKHUNTHOD et al., 2006), Candida albicans (SEVERO GOMES, 2009), C.
glabrata, Kluyveromyces bulgaricus, K. lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula mucilaginosa,
Sacchromyces cerevisiae, S. bayanus, S. uvarurn, Schizosacchamyces bulgaricus, S.
octosporus (VIARD et al., 1993;), Sacchromyces cerevisiae (FREIRE et al., 2002;
34 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
TRINDADE et al., 2006), Fusarium oxysporum (CIOPRAGA et al., 1999; DAMICO et al.,
2003; FREIRE et al., 2002; YAN et al., 2005; YE et al., 2001), F. graminearum
(CIOPRAGA et al., 1999), F. solani (DAMICO et al., 2003), F. moniliforme (TRINDADE
et al., 2006), Colletorichum sp. (YAN et al., 2005), C. lindemuthianum (FREIRE et al.,
2002), C. musae (DAMICO et al., 2003), Phoma betae, Phycomyces blakesleeanus,
Phytophthora erythroseptica, Septoria nodorum (BROCKAERT et al., 1989), Botrytis
cinerea, Drechslera turcia (YAN et al., 2005), Coprinus comatus, Rhizoctonia solani (YE
et al., 2001).
De acordo com Aguilar-Uscanga e François (2003) a parede celular de leveduras
apresenta como componentes polímeros de manose (constituindo manoproteínas), glicanas
(principalmente betaglucanas, mas galactanas também podem ser encontradas) e polímeros
de N-acetilglucosamina (formando quitina).
ConBr e DVioL são lectinas extraídas das leguminosas Canavalia brasiliensis,
Dioclea violacea respectivamente (BARBOSA et al., 2001; CAVADA et al., 1996), que
têm afinidade por glicose e manose (CAVADA et al. 1993, CAVADA et al., 1996). Foi
evidenciado efeito protetor in vivo contra infecção por Leishmania amazonensis em
camundongos BALB/c (BARRAL-NETTO et al., 1996), estimulação linfocitária em
humanos (BARRAL-NETTO et al., 1992), estimulação da produção de macrófagos e
linfócitos em camundongos C3H/HeJ (RODRIGUEZ et al., 1992), antitumoral (MAIA,
2009; SANTOS NETO et al., 2009).
A faixa de concentração de lectinas com atividade antifúngica foi relatada para
diferentes espécies de fungos podendo variar de 100µg/mL a 1058 µg/mL, dependendo da
espécie (FREIRE et al., 2002; TRINDADE et al., 2006; YAN et al., 2005; YE et al., 2001).
Foi observada a estimulação de crescimento de Candida albicans e C. tropicalis,
havendo rápida formação do tubo germinativo como também indução da formação de
micélio em presença da lectina de Kluyveromyces bulgaricus entre as concentrações 0,04 e
0,08µg/mL (VIARD et al. 1993); foi observada também estimulação de crescimento de
dermatófitos por Siqueira et al. (2008).
2.3.3 Teste de Susceptibilidade Antifúngica
O “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI), aprovou em 2002 a norma
M27-A2 que descreve a metodologia de testes padronizados de agentes antimicrobianos
35 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
das leveduras que causam infecções fúngicas, incluindo Cryptococcus neoformans e
diferentes espécies de Candida.
É fator primordial na decisão de utilizar um antifúngico in vivo é determinar uma
concentração inibitória mínima (CIM) do fármaco in vitro, o que sugere que as espécies
fúngicas alvo são susceptíveis a essa droga (CUENCA-ESTRELLA; RODRIGUEZ-
TUDELA, 2001).
A determinação do valor do CIM para espécies de Candida continua sendo um
importante método de identificação dos organismos que são sucestíveis de apresentarem
resistência aos tratamentos antifúngicos (CUENCA-ESTRELLA; RODRIGUEZ-
TUDELA, 2001; ESPINEL-INGROFF et al., 2002; LOZANO-CHIU et al, 1999; PEREA,
2001;).
A concentração inibitória mínima (CIM) é a menor concentração da droga que inibe
o crescimento de microrganismo e a concentração fungicida mínima (CFM) a menor
concentração da droga capaz de matar o microrganismo (LEYDEN, 1998).
Diante disso existe uma necessidade urgente de novos compostos antifúngicos com
um amplo espectro de ação fungicida e com menos efeitos colaterais (MAERTENS;
BOOGAERTS, 2005).
36 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Pacientes
Foram selecionados 100 pacientes atendidos no Hospital Correia Picanço, Recife-
PE, portadores do HIV/Aids que apresentaram lesões superficiais com hipótese diagnóstica
de micose, os mesmos foram avaliados por uma médica dermatologista no período de julho
de 2006 a julho de 2007.
O projeto de pesquisa foi encaminhado ao Comitê de Ética em Pesquisa
envolvendo seres humanos do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de
Pernambuco CEP/CCS/UFPE e aprovada de acordo com a resolução n° 196/96 do
conselho Nacional de Saúde, tendo registro no SISNEP FR n° 84657 e pela Comissão de
Ética Médica do Hospital Correia Picanço, Recife/PE; bem como foi assinado o termo de
consentimento livre e esclarecido por todos os pacientes que aceitaram participar da
pesquisa (anexo).
3.2 Amostras Clínicas
As amostras foram coletadas após assepsia local com álcool a 70%. Escamas
epidérmicas e ungueais foram obtidas através de escarificação com bisturís e as secreções
com “swabs” esterilizados e processadas para o exame micológico.
3.3 Exame micológico direto
Amostras de secreções foram analisadas à fresco sem clarificante ou corante, e
escamas epidérmicas e ungueais clarificadas com solução aquosa de hidróxido de potássio
(KOH) a 20% (LACAZ et al., 2002).
3.4 Cultura
As amostras clínicas foram semeadas em duplicata em meio ágar Sabouraud
adicionado de 0,5g/L de extrato de levedura (YE) e 50mg/L de cloranfenicol e quando
necessário acrescido de 2% de azeite, contidos em placas de Petri, mantidas à temperatura
37 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
de 30°C para obtenção da cultura e posterior purificação e identificação dos agentes
etiológicos. Os meios foram preparados segundo Lacaz et al. (2002).
3.5 Identificação de leveduras
Para identificação das leveduras foram utilizadas: a metodologia clássica, o painel
API20C AUX (bioMerieux) e o meio seletivo CHROMagar Candida® (Probac do Brasil,
São Paulo).
3.5.1 Metodologia clássica
A identificação seguiu a metodologia clássica através da observação dos aspectos
macroscópicos, micromorfológicos e fisiológicos incluindo assimilação de fontes de
carbono e nitrogênio (auxonograma), fermentação de fontes de carbono (zimograma), bem
como produção de urease, ácido, indução de tubo germinativo em albumina a 37°C,
clamidosporos em água bile de boi a 20%, assimilação de tween 20 e 80, prova da catalase
e produção de β-glicosidase e temperatura de crescimento a 45°C (BARNETT et al., 2000;
GUILLOT; BOND, 1999; KREGER VAN-RIJ, 1984; KURTZMAN e FELL, 1998;
LODDER, 1970; DUARTE, 1999).
3.5.1.1 Auxonograma e Zimograma (Barnett et al., 2000)
Foram preparadas suspensões em 10 mL de água destilada esterilizada contendo
YE, sendo padronizada com o tubo 0,5 da escala McFarland, dois mL dessa solução foi
incorporado à 15mL do meio C (isento de fontes de carbono) e meio N (isento de fonte de
nitrogênio). Após solidificação, foram adicionadas diferentes fontes de carbono e
nitrogenio em pontos eqüidistantes. As leituras foram realizadas a cada 24 horas durante
três dias. Da mesma suspensão, foram retirados 100 µL e colocados em tubos de hemólise
contendo em seu interior tubos de Duhan invertidos com água peptonada adicionada de
diferentes fontes de carbono.
38 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
3.5.1.2 Produção de urease (Barnett et al., 2000)
Fragmentos de culturas com 72 horas de crescimento em meio ágar Sabouraud,
foram semeados na superfície do meio de Christensen e observada a capacidade do fungo
em produzir urease. A interpretação do teste ocorreu pela verificação da mudança de cor
do meio do amarelo para o rosa intenso devido a liberação de amônia e alcalinização do
meio
3.5.1.3 Produção de ácido (Barnett et al., 2000)
Fragmentos de culturas com 72 horas de crescimento em meio ágar Sabouraud
foram inoculados na superfície do meio Ágar carbonato de cálcio (CaCO3) e observado se
ocorreu a degradação do substrato através de halo transparente ao redor da colônia
(tamanho do halo igual ao dobro do diâmetro da colônia).
3.5.1.4 Indução de tubo germinativo (Reynolds; Braude, 1956)
Fragmentos de culturas com 72 horas de crescimento em meio ágar Sabouraud,
foram inoculados em clara de ovo contida em tubos de ensaio e incubados a 37°C por três
horas, em seguida alíquotas foram depositadas entre lâmina e lamínulas, para observação
microscópica da capacidade de formação de tubo germinativo.
3.5.1.5 Produção de clamidosporos (Barnett et al., 2000)
De culturas com 72 horas de crescimento em meio ágar Sabouraud, foram retirados
fragmentos e inoculados em meio água bile de boi contido em tubos de ensaio, sendo
mantidos a temperatura ambiente (30°C). Após 72 horas, alíquotas das suspensões foram
depositadas entre lâmina e lamínula e observada ao microscópio, para observação da
capacidade de produção de clamidosporo.
39 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
3.5.1.6 Assimilação de Tween (Duarte, 1999; Guillot; Bond, 1999)
Foram preparadas suspensões em 2 mL de água destilada esterilizada sendo
padronizada com o tubo 0,5 da escala McFarland à qual foi adicionado a 18mL do meio
ágar Sabouraud contido em Erlemeyer com temperatura aproximada de 45ºC,
posteriormente homogeneizada e vertida em placa de Petri previamente esterilizada. Após
solidificação, foram realizados dois orifícios de Oxford e colocados em cada um 5 µL de
Tween nas concentrações 20, 40, 60 e 80, as placas foram mantidas à 30° C, durante sete
dias para observação da assimilação do Tween.
3.5.1.7 Teste da catalase
Para o teste da catalase foram preparadas laminas à partir de fragmentos das
colônias aos dez dias de crescimento em meio ágar Sabouraud adicionado de óleo de oliva,
sobre estes, depositado 40µl de peróxido de hidrogênio (Volume 10) para observação de
formação de bolhas de gás.
3.5.1.8 Teste da esculina
O teste da esculina para detecção de β-glicosidase foi realizado a partir de
suspensões preparadas com fragmentos da cultura em caldo da esculina, mantidas a 30ºC
durante seis semanas. A interpretação do teste foi realizada através do escurecimento da
suspensão pelo indicador citrato férrico.
3.5.2 API20C AUX (bioMérieux)
Leveduras com 48 horas de crescimento a 30°C em ágar Sabouraud acrescido de
5% de YE, foram transferidas assepticamente para tubos contendo 2mL de solução
fisiológica 0,9%, ajustando a uma opacidade equivalente à escala 2 de McFarland; 100µl
desta suspensão foi colocado na ampola de API C Médium, homogeneizado e
posteriormente colocado 0,6µl em cada poço. O painel foi mantido a 30°C em câmara
úmida e as leituras realizadas com 48 e 72 horas. A interpretação do teste foi realizada
40 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
através da verificação da opacidade observada mediante a assimilação de carboidratos nos
diferentes poços comparando-as com a cúpula zero correspondendo ao controle negativo
(sem opacidade). A identificação foi obtida a partir de um perfil numérico, cuja
interpretação foi realizada a partir do programa de identificação apiwebTM.
3.5.3 CHROMagar Candida®
Todas as amostras foram cultivadas em ágar Sabouraud acrescido de 5% de YE por
72 horas e mantidas a 30°C e subcultivadas no meio cromogênico CHROMagar Candida®
(Probac do Brasil, São Paulo), o qual foi preparado de acordo com as instruções do
fabricante. Após 48 horas a 30°C, a interpretação dos resultados foi realizada pela
observação da pigmentação das colônias (GARCÍA-MARTOS, et al., 1998; LACAZ et al.,
2002).
3.6 Identificação de fungos filamentosos
As culturas mantidas em ágar Sabouraud a 30°C foram inoculados em meios
específicos para indução de esporulação de acordo com o grupo de fungo. Os dermatófitos
foram cultivados em Dermatófito Teste Meio (DTM), espécies de Fusarium, Scytalidium e
Phialophora em meio Batata Dextrose Ágar (BDA), Aspergillus e Penicillium em meio
ágar Czapeck (Cz) segundo Lacaz et al. (2002).
Para os fungos filamentosos foram observadas as características macroscópicas e
microscópicas e quando necessário foi utilizado o método de cultura em lâmina segundo
Riddell (1950).
Para identificação utilizou-se entre outros as seguintes bibliografias: Booth (1971);
De Hoog et al. (2000); Domsch et al. (1980); Ellis (1971 e 1976); Pitt (1988); Raper e
Fennell (1977); Rebell; Taplin (1979).
41 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
3.7 Caracterização quanto a patogenicidade 3.7.1 Crescimento a 37°C
Fragmento da colônia com três dias de crescimento para leveduras e entre quatro e
dez dias para os fungos filamentosos foram inoculados em duplicata na superfície dos
meios, a depender do fungo, Ágar Sabouraud, Batata Dextrose Ágar, Ágar Czapec e Meio
Teste para Dermatófito, contidos em placas de Petri, mantidas a 30°C e 37°C.
3.7.2 Expressão de protease
Para verificação da expressão da protease foi utilizado o método de Hastings, 1904
(Lacaz et al., 2002), utilizando caseína do leite como substrato.
Fragmento da colônia com três dias de crescimento para leveduras e entre quatro e
dez dias para os fungos filamentosos foram inoculados na superficie do meio contendo
caseína do leite como substrato, contido em placas de Petri, as quais foram mantidas à
temperatura ambiente (30ºC) e observadas até 15º dia. A expressão de protease foi
evidenciada através da formação de um halo transparente ao redor da colônia e quando
positivo foi adicionado solução acidificada de cloreto de mercúrio para distinguir se o halo
ocorreu pela ação de produtos metabólicos ácidos ou alcalinos contidos no leite ou se
houve proteólise, indicando que a caseína foi realmente degradada, quando observado a
permanência do halo transparente.
3.7.3 Expressão de fosfolipase
Para verificar a atividade fosfolipásica, foi adotado o método de Price e Cawson
(1977), com lecitina de soja como substrato.
Fragmento da colônia com três dias de crescimento para leveduras e entre quatro e
dez dias para os fungos filamentosos foram inoculados na superficie do meio com lecitina
de soja como substrato contido em placas de Petri, as quais foram mantidas à temperatura
ambiente (30ºC) e observadas até 15º dia. A expressão da fosfolipase foi evidenciada
através da formação de um halo opaco ao redor da colônia.
42 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
O diâmetro do halo ao redor das colônias em caseína do leite e lecitina de soja foi
mensurado para determinar a zona de atividade (ZA), onde o diâmetro da colônia é
dividido pela soma do diâmetro da colônia com a zona de precipitação de acordo com a
seguinte fórmula:
ZA: zona de atividade
∅ : diâmetro da colônia
Zona de precipitação: halo formado
Interpretação: O diâmetro do halo ao redor das colônias em caseína do leite para protease e
lecitina de soja para fosfolipase, foram medidos para determinar a zona de atividade (ZA)
os quais foram considerados: ZA entre 0,9 e 1 (+) muito fraca, 0,89-0,80 (++) fraca, 0,79-
0,70 (+++) forte e ZA < que 0,69 (++++) muito forte segundo Serda; Yucel (2002) que
adaptaram a interpretação do método de Price et al. (1982).
As provas de detecção enzimática foram realizadas em duplicata à 30°C.
3.8 Teste de susceptibilidade in vitro Os testes de susceptibilidade foram realizados com os isolados de leveduras em
caldo de acordo com a padronização publicada no documento M27-A2 pelo Clinical
Laboratory Standard Institute (CLSI, 2002). Anfotericina B e fluconazol, bem como os
isolados de Candida parapsilosis ATCC22019 e C. krusey ATCC6258 foram utilizados
como controle.
3.8.1 Meio de cultura
O meio de cultura utilizado foi RPMI 1640 (com glutamina e vermelho fenol, sem
bicarbonato - Sigma-Aldrich, USA), tamponado com MOPS (ácido 3-[N-morfolino]
propanosulfônico - Sigma-Aldrich, USA) a 0,165 mol/L, ajustado para pH 7,0 usando
hidróxido de sódio 1 mol/l. A esterilização do meio foi realizada por filtração com
membrana de porosidade 0,22µm (TPP, Suíça).
ZA = ∅∅∅∅ da colônia ∅∅∅∅ da colônia + Zona de precipitação
43 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
3.8.2 Fármacos antifúngicos Anfotericina B (Bristol-Myers Squibb) e fluconazol (Pfizer) foram solubilizadas em
dimetilsufóxido (DMSO) e água nas concentrações que variaram de 0,12-64µg\mL e 0,03-
16µg\mL, respectivamente.
3.9 Novas alternativas antifúngicas 3.9.1 Própolis
Extrato aquoso e alcoólico da própolis verde (Minas Gerais) e extrato alcoólico da
própolis vermelha (Paraíba) fornecidos pela Pharma Néctar®, Belo Horizonte, Brasil.
Foram utilizadas soluções solubilizadas em água e álcool etílico (70%) nas concentrações
de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 e 1024µg /mL (SAWAYA et al., 2002).
3.9.2 Lectinas
Foram analisadas duas lectinas purificadas obtidas de sementes de leguminosas:
Conavalia brasiliensis (Conbr) (Ceará-Brasil) e Dioclea violacea (Dviol) (Rio Grande do
Sul - Brasil), estas lectinas foram cedidas gentilmente pelo professor Dr. Benildo Cavada
da Universidade Federal do Ceará. Após solubilização em água, foram preparadas soluções
nas concentrações de 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 e 256µg mL (SIQUEIRA et al. 2008).
3.9.3 Microdiluição em caldo
A microdiluição foi preparada em placas de fundo chato (TPP, Suíça) com oito
séries identificadas de A a H, cada qual com 12 poços (96 poços). A partir da solução-
estoque de cada fármaco, foram preparadas soluções testes com dez vezes a concentração
final, para anfotericina B de 0,3 a 160µg/mL, fluconazol de 1,25 a 640 µg/mL, própolis de
2 a 1,024µg/mL e as lectinas de 0,5 a 256µg/mL. As drogas foram diluídas a 1:5 em
RPMI-1640 e alíquotas de 100µL de cada concentração foram dispensadas em sequencia
nas placas de microtitulação e conservadas a -20ºC. No dia do teste, cada poço da placa de
microdiluição foi inoculado com 100µL da correspondente suspensão do inoculo de
44 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
levedura. Os poços controle de crescimento (fileira 11) continham 100µL de meio estéril
com 100µL das suspensões dos inóculos do isolado controle (ATCC). A fileira 12 da placa
foi usada para efetuar o controle da esterilidade (apenas meio isento de drogas).
3.9.4 Preparo do Inóculo
O inóculo foi preparado com cinco colônias de Candida com diâmetro de
aproximadamente 1 mm, com 24 horas de crescimento em placas de Petri contendo ágar
Sabouraud a temperatura (30ºC). Em seguida as colônias foram suspensas em 5mL de
solução salina esterilizada e ajustada para obter a turbidez equivalente de uma solução-
padrão da escala de McFarland 0,5. Ao final esse procedimento forneceu uma suspensão-
padrão de levedura contendo 1 x 106 a 5 x 106 células por mL. A suspensão foi produzida
fazendo-se uma diluição 1:100 seguida de uma diluição de 1:20 da suspensão-padrão com
meio líquido RPMI 1640, obtendo uma concentração final de 5,0 x 102 a 2,5 x 103 células
por mL2.
No momento da leitura, o crescimento do fungo no poço controle (poço 11) foi
comparado visualmente ao crescimento verificado nos poços referentes a diferentes
concentrações testadas (1 a 10). A menor concentração capaz de inibir o crescimento
fúngico em relação ao poço controle foi identificada como a Concentração Inibitória
Mínima (CIM) da droga segundo o Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI, 2002).
Para a Concentração Fungicida Mínima (CFM), o poço que apresentou visualmente 100%
de inibição, foi retirado 100µL e semeado na superfície do meio ágar Sabouraud. A CFM
foi a que não permitiu o crescimento do fungo no meio (FAVRE et al., 2003; PFALLER et
al., 2004). Foram determinadas também as médias geométricas para a concentração
inibitória mínima (CIMMG) e concentração fungicida mínima (CFMMG) e a determinação
da concentração capaz de inibir o crescimento de metade e de todas as amostras analisadas
CIM50 e CIM100, respectivamente.
45 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Isolamento e identificação das espécies
Foram atendidos no ambulatório de dermatologia do Hospital Correia Picanço
(HCP), 100 pacientes com lesões superficiais com hipótese diagnóstica de micose, destes
48 portadores assintomáticos do HIV e 52 haviam desenvolvido AIDS; entre estes 64
pertenciam ao sexo masculino com idade entre 21 a 67 anos e 36 do sexo feminino com
idade entre 19 a 59 anos. Entre os pacientes, havia 35 homossexuais e 65 heterossexuais;
No momento da coleta da amostra clínica, 40 pacientes faziam uso de antifúngicos, entre
estes, dois faziam uso de mais de um tipo de antifúngico (Figura 2).
Figuras 2. Aspectos epidemiológicos referente à situação do paciente com lesão
superficial no momento da coleta.
De 100 pacientes com HIV/AIDS, foram coletadas 159 amostras clínicas de
diferentes regiões do corpo, sendo da região inguinal (28), unhas das mãos (19), unhas dos
pés (18), interdígitos (12), membros inferiores (12), membros superiores (11), região
inguinocrural (10), abdômen (nove), dorso dos pés (sete), face (seis), nádegas (cinco),
axilas (cinco), comissura labial (três), bolsa escrotal (três), glande (três), cavidade oral
(dois), pescoço e colo (dois), abdômen e costa (um), couro cabeludo (um), face e dorso das
orelhas (um) e mama (um) (Figura 3). Somenzi et al. (2006) citam que existem várias
formas de manifestações clínicas das micoses superficiais, dependendo da região afetada e
46 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
também da espécie do fungo causador da micose e segundo Yamada et al. (2000)
frequentemente pacientes portador do HIV têm micoses superficiais em qualquer estágio
da doença. Os resultados apresentados neste trabalho mostram a diversidade de regiões
afetadas por lesões superficiais, comprometendo o estado geral dos pacientes nos quais a
incidência de micoses chegou a 142 (89,3%) casos.
Figura 3. Número de amostras clínicas em regiões acometidas por lesões superficiais em
pacientes com HIV/AIDS.
De 100 pacientes foram coletadas 159 amostras clínicas, destas, em 142 havia
estruturas fúngicas ao exame direto. Contudo, o isolamento de fungo ocorreu em 117
amostras (Figura 4).
Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e
Figura 4. Resultados referentes aos
coletadas de lesões superficiais em pacientes com HIV/AIDS.
Entre as 142 amostras clínicas foram observadas células de leveduras isoladas,
agrupadas, unibrotantes, pseudomicélio, bem como micélio verdadeiro hialino septa
artrosporados e micélio demáceo (Figura 5).
Figura 5. (a) Leveduras isoladas e unibrotantes; (b) pseudomicélio; (c)
agrupadas em cacho e hifas curtas e tortuosas;
hialino septado; (f) artrosporados (400X).
O rápido crescimento bacteriano, o uso de medicamentos específicos para micose,
adaptação do fungo in vitro e estruturas fúngicas
para inibição do crescimento de fungos
a
d
Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
referentes aos exames diretos (ED) e culturas de amostras clínicas
coletadas de lesões superficiais em pacientes com HIV/AIDS.
Entre as 142 amostras clínicas foram observadas células de leveduras isoladas,
unibrotantes, pseudomicélio, bem como micélio verdadeiro hialino septa
artrosporados e micélio demáceo (Figura 5).
(a) Leveduras isoladas e unibrotantes; (b) pseudomicélio; (c)
e hifas curtas e tortuosas; (d) micélio demáceo; (e) micélio verdadeiro
hialino septado; (f) artrosporados (400X).
O rápido crescimento bacteriano, o uso de medicamentos específicos para micose,
e estruturas fúngicas inviáveis, provavelmente contribuíram
de fungos, embora fossem observadas estruturas fúngicas
b c
e f
47
amostras clínicas
Entre as 142 amostras clínicas foram observadas células de leveduras isoladas,
unibrotantes, pseudomicélio, bem como micélio verdadeiro hialino septado,
(a) Leveduras isoladas e unibrotantes; (b) pseudomicélio; (c) leveduras
(d) micélio demáceo; (e) micélio verdadeiro
O rápido crescimento bacteriano, o uso de medicamentos específicos para micose,
viáveis, provavelmente contribuíram
, embora fossem observadas estruturas fúngicas ao
48 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
exame direto. Esses dados reforçam a importância do exame direto em amostras clínicas, a
fim de monitorar a terapia adequada (LACAZ et al. 2002; MARQUES, 1998).
Entre as 117 culturas obtidas, 66 revelaram de leveduras e 51 fungos filamentosos
(Figura 6). Segundo Johnson (2000) leveduras, dermatófitos e outros fungos filamentosos
podem colonizar a pele e anexos e causar dermatomicoses. Este dado corrobora com
nossos resultados, pois além de leveduras e dermatófitos foram isoladas nove espécies de
fungos filamentosos não dermatófitos.
Figura 6. Culturas obtidas de lesões superficiais em pacientes com HIV/AIDS.
Foram isoladas e identificadas 22 espécies de fungos, entre estas 22 amostras
(13,41%) de Candida albicans, 18 (10,97%) C. parapsilosis, quatro (2,44%) C. tropicalis,
três (1,83%) C. guilliermondii, duas (1,22%) C. famata, uma (0,61%) C. glabrata, oito
(4,88%) Malassezia furfur, duas (1,22%) M. sympodialis, três (1,83%) Trichosporon
asahii, duas (1,22%) Kodamaea ohmeri, uma (0,61%) Brettanomyces anomalus, três (1,83
%) Microsporum gypseum, cinco (3,05%) T. mentagrophytes, 23 (14,02%) T. rubrum, 11
(6,70%) T. tonsurans, um (0,61%) Aspergillus niger, um (0,61%) Cylindrocarpon
destructans, dois (1,22%) Fusarium solani, dois (1,22%) Phialophora reptans, um (0,61%)
Scytalidium hialinum, um (0,61%) S. japonicum e um (0,61%) Penicillium comunne
(Tabela 1).
49 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
Tabela 1. Fungos isolados de lesões superficiais em pacientes com HIV/AIDS com total de
amostras e percentual.
Espécies Total %
Aspergillus-niger 1 0,61 Brettanomyces anomalus 1 0,61 Candida albicans 22 13,41 C. famata 2 1,22 C. glabrata 1 0,61 C. guilliermondii 3 1,83 C. parapsilosis 18 10,97 C. tropicalis 4 2,44 Cylindrocarpon destructans 1 0,61 Fusarium solani 2 1,22 Kodamaea ohmeri 2 1,22 Malassezia furfur 8 4,88 M. sympodialis 2 1,22 Microsporum gypseum 3 1,83 Penicilium commune 1 0,61 Phialophora reptans 2 1,22 Scytalidium hialinum 1 0,61 S. japonicum 1 0,61 Trichophyton mentagrophytes 5 3,05 T. rubrum 23 14,02 T. tonsurans 11 6,70 Trichosporon asahii 3 1,83 Total 117 100
As 22 amostras identificadas como C. albicans pela metodologia clássica e pelo
sistema comercial API20C AUX, apresentaram colônias verde-claras própria desta espécie
no meio cromogênico. Estes resultados mostraram, portanto, uma concordância entre as
metodologias para esta espécie. O meio cromogênico foi útil na detecção de leveduras em
cultura mista de Candida. Segundo Fotedar, AL-Hedaithy (2002) essa característica de
crescimento em ágar Sabouraud dextrose não permite esta diferenciação, como ocorreu em
duas culturas, nas quais houve associação de C. albibans e C. tropicalis nas mesmas
amostras analisadas.
O sistema comercial API20C AUX teve as seguintes percentagens de identificação
para as espécies de Candida albicans 99,2%, C. famata 98,2%, C. glabrata 99,3%, C.
guilliermondii 84,3%, C. parapsilosis 99,9%, C. tropicalis 60,8%, Kodamaea ohmeri
99,4% e Trichosporon asahii 99,9%.
O CHROMagar® caracterizou 44% das amostras como Candida albicans; 8%, C.
tropicalis. O meio CHROMagar® Candida, fornece resultados rápidos, de fácil
50 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
reprodutibilidade, possibilitando a introdução precoce de tratamento específico, resultando
em uso racional de terapia antifúngica (MIMICA et al., 2009).
Foi fundamental a utilização de metodologias diagnósticas, que determinassem em
menor tempo as espécies de Candida envolvidas em processos infecciosos superficiais,
bem como na detecção de leveduras em cultura mista de Candida, visto que, os resultados
eram anexados aos prontuários dos pacientes para que fosse indicado o tratamento
adequado.
Candida albicans foi a segunda espécie mais frequênte, seguida de C. parapsilosis,
C. tropicalis, C. guilliermondii, C. famata, C. glabrata, Malassezia furfur, M.
sympodialis, Trichosporon asahii, Kodamaea ohmeri, Brettanomyces anomalus. Embora
C. albicans seja a levedura que mais predomina em várias amostras clínicas, outras
espécies de Candida têm sido relatadas como importantes patógenos oportunistas
(BAUMGARTNER et al., 1996; FOONGLADDA et al., 2002; MACÊDO et al., 2009).
Nas infecções superficiais ou invasivas, destacam-se como agentes as leveduras C.
albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata e C. krusei, em alguns casos,
associada à alta taxa de mortalidade. Estas micoses são raramente relatadas por espécies
de Trichosporon (BAYRAMOGLU et al., 2008; COLOMBO et al., 2003; DA MATTA
et al., 2007; GODOY et al., 2003).
O primeiro caso de infecção disseminada por Trichosporon asahii, foi descrito em
2001 na China por Yang et al. (2003), também por Bayramoglu et al. (2008) em uma
paciente imunocomprometida com 47 anos portadora de leucemia mielóide aguda. Os
resultados obtidos neste trabalho revelaram a presença de T. asahii em amostras clínicas
coletadas das regiões inguinocrural, interdígitos e nádegas, nesta última associado a
Trichophyton rubrum. Essas espécies são patógenos importantes em causar diferentes
manifestações clínicas, que vão desde envolvimento superficial a doença sistêmica severa
em pacientes imunossuprimidos.
As leveduras Bretanomyces anomallus e Kodamaea ohmeri consideradas neste
trabalho como leveduras oportunistas emergentes de lesões superficiais em pacientes
portador do HIV, foram identificadas pela metodologia clássica e pelo sistema comercial
API20C AUX respectivamente; a dificuldade de se realizar uma identificação de uma
espécie emergente baseia-se na similaridade entre algumas espécies. Espécies de
Brettanomyces foram descritas desde o início do século 20, estando associadas diretamente
na biotecnologia atraindo atenção na produção de vinho (LOUREIRO; MALFEITO-
FERREIRA, 2003; VAN DER WALT; VAN DER KERKEN 1958; VAN DER WALT;
51 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
VAN DER KERKEN 1961). Até o momento não foi encontrado relato dessa espécie
causando infecções em humanos, sendo esta a primeira citação dessa espécie isolada de
lesão superficial em paciente HIV positivo.
Kodamaea ohmeri é teleomorfo de Candida guilliermondii var. membranaefaciens,
é comumente utilizada na indústria alimentícia para a fermentação de picles, crostas e
frutas; no entanto, também é um fungo patogênico emergente, particularmente em
pacientes imunossuprimido (HAN et al., 2004; OTAG et al., 2005).
Neste estudo, Candida glabrata foi isolada de secreção oral de paciente com AIDS
tratado anteriormente com fluconazol e cetoconazol. Segundo Macedo et al. (2008), esta
espécie é raramente citada e tem sido subestimada por falta de identificação adequada.
Em infecções fúngicas causadas por Candida, sobretudo, em imunossuprimidos torna-se
indispensável a identificação em nível de espécie uma vez que a patogenicidade e o perfil
de sensibilidade a um determinado antifúngico são variáveis como ocorre com C.
glabrata que possue resistência intrínseca a fluconazol (COLOMBO et al., 2003; DA
MATTA et al., 2007; GODOY et al., 2003).
Segundo Souza et al. (2007) algumas leveduras são componentes da microbiota
normal de mucosas, pele e anexos, e até há pouco tempo eram consideradas agentes
contaminantes. A alta frequência de leveduras isoladas de onicomicoses relatada neste
trabalho indica aprimoramento nas técnicas diagnósticas e confirmação laboratorial de
fungos oportunistas e de comportamento oportunista.
Pitiríase versicolor (PV) foi diagnosticada em sete pacientes, cuja faixa etária variou
de 30 a 46 anos. Este resultado está apoiado com o de Roza et al. (2003), os quais
trabalharam com pacientes HIV/AIDS, detectando PV em sete amostras clínicas. Segundo
Zaitz et al. (2000), o gênero Malassezia é considerado parte da microbiota normal da pele e
a maior frequência dos casos acontece a partir da puberdade, quando ocorrem alterações
nos lipídios da pele em consequência de alteração hormonal. Schlottfeldt et al. (2002)
afirmam que para o desenvolvimento e evolução de quadros patológicos associados às
espécies de Malassezia é necessário que existam fatores predisponentes no hospedeiro.
Schlottfeldt et al. (2002) afirmam que desde a descoberta da Malassezia, esse
gênero passou por várias mudanças taxonômicas, tornando possível a diferenciação entre as
espécies representadas por M. furfur, M. pachydermatis, M. sympodialis, M. globosa,
M.obtusa, M. restricta e M. slooffiae. A importância na identificação das espécies consiste
na possibilidade de detecção de características ainda não determinadas, visto que, são
52 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
descritas variações quanto ao envolvimento nas lesões e na intensidade ou dano causado
por cada espécie.
Entre as espécies isoladas T. rubrum foi a mais frequente com 23 (14,02%)
amostras, sendo da região inguinal (sete), unhas (quatro), membros superiores (três),
membros inferiores (dois), abdomen (dois), região das nádegas (dois), região inguinocrural
(um), dorso do pé (um) e face (um). Nas amostras clínicas de três pacientes, houve
associação de T. rubrum com leveduras na mesma lesão, coletada de região das nádegas de
dois pacientes e unha do pé (hálux) de um paciente.
A variabilidade das regiões acometidas por T. rubrum neste trabalho e a associação
a outras espécies na mesma lesão, divergem dos resultados obtidos por Berger (1993) e
Johnson (2000) quando citam que esta espécie é o agente mais comum em todas as regiões
destacando-se regiões da virilha, tronco, pés e mãos e raramente face e couro cabeludo.
Entretanto, os autores não relatam associação deste agente a outras espécies. Graham et al.
(2008) confirmam esta espécie como agente mais frequente de onicomicose em pacientes
infectados com HIV. O diagnóstico precoce e tratamento das dermatofitoses são
importantes para evitar infecção disseminada, pois, segundo Burkhart et al. (2003), a
frequência de dermatofitose em pacientes portadores do HIV pode não ser mais alta do que
em grupos de pacientes sem o vírus, contudo é aumentada a severidade e a variabilidade de
apresentação desta micose nesse grupo de pacientes.
Segundo Giudice et al. (1997), as dermatofitoses causadas por M. gypseum
ocorrem frequentemente em pernas, braços, mãos e face; tem sido pouco relatada em
pacientes com AIDS (FERNANDES et al., 1998; PORRO et al., 1997). Neste trabalho foi
isolada de lesão na bolsa escrotal, nos membros superiores e na região da virilha, nesta
última associado à Candida famata.
Os resultados referentes às espécies de leveduras e de fungos filamentosos bem
como das regiões acometidas, estão inseridos nas Tabelas 2 e 3.
53
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55 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
A onicomicose foi a forma clínica mais prevalente e corresponde ao maior desafio
quanto à terapêutica de micoses superficiais. Nossos resultados apontam as leveduras como
a principal causa, seguida pelos fungos filamentosos não dermatófitos e por último os
dermatófitos, discordando dos achados de Surjushe et al. (2007) os quais trabalharam com
onicomicose em pacientes portadores do HIV relatando os dermatófitos como os principais
agentes causadores dessa micose. Contudo Souza et al. (2007) em um estudo com
pacientes imunocompetente concluíram que as leveduras foram as mais isoladas, seguidas
pelos dermatófitos e pelos fungos filamentosos não dermatófitos.
Segundo Guilhermetti et al. (2004) a prevalência de onicomicose é alta e o
isolamento e identificação de leveduras e fungos filamentosos como agentes de
onicomicose, são importantes entre os portadores do HIV. Dahdah; Scher (2006) citam que
a onicomicose está presente em mais de 30% dos pacientes com HIV. O isolamento e a
identificação de leveduras e de fungos filamentosos como agentes de onicomicoses, são
importantes para estes pacientes, visto que, o caráter crônico das lesões e a dificuldade de
absorção dos fármacos disponíveis, aliados ao elevado custo dos antifúngicos clássicos,
são condições limitantes para o insucesso terapêutico das onicomicoses o que justifica a
busca por novas drogras antifúngicas para uso tópico e sistêmico.
A associação de duas espécies na mesma lesão ocorreu em sete amostras clínicas.
Em escamas ungueais houve associação de Candida albicans com C. tropicalis (dois
casos), C. parapsilosis com Trichophuton rubrum (um caso); nas escamas epidérmicas de
lesão nas nádegas houve associação de Trichosporon asahi com Trichophyton rubrum
(um caso) e T. rubrum com C. parapsilosis (um caso); em escamas epidérmicas de lesão
entre os artelhos a associação foi evidenciada com C. parapsilosis e Trichophyton
mentagrophytes (um caso); nas escamas de lesão na região inguinal a associação ocorreu
com C. famata e Microsporum gypseum (um caso) (Figura 7).
56 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
Figura 7. Associação de duas espécies de fungos na mesma lesão.
Rugeles et al. (2001) também observaram associação de levedura com fungos
filamentosos, sem no entanto, verificarem essa associação entre diferentes espécies de
levedura. Yamada et al. (2000) detectaram diversos fungos na mesma lesão, nestas
ocorreram três casos de dermatófito com levedura, um de levedura com fungo
filamentoso não dermatófitos, e um dermatófito com outro fungo filamentoso não
dermatófito. Nossos resultados revelaram associação de fungos em lesão nas nádegas e
inguinal, salientando que esses resultados não têm sido citados na literatura em pacientes
com HIV/AIDS.
Em 16 pacientes foi observada a presença do mesmo agente etiológico em dois ou
mais sítios corpóreos, destacando a dermatofitose por Trichophyton rubrum como a
espécie mais isolada (13); as regiões que mais se destacaram foram membros inferiores (5),
membros superiores (5) e abdomem (5), seguida por unha da mão (4), unha do pé (3),
inguinal (3), inguinocrural (3), face (3), dorso do pé (2), entre os artelhos (2), pescoço/colo,
axila, couro cabeludo, comissura labial, nádegas, glande, bolsa escrotal (1) em cada
(Tabela 4).
57 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
Tabela 4. Presença da mesma espécie de fungo isolado de lesões superficiais de diferentes
regiões do corpo.
№ de pacientes Regiões Espécies isoladas 01 Inguinal Trichophyton mentagrophytes
Entre os artelhos T. mentagrophytes
02 Inguinocrural T. rubrum
Abdomen T. rubrum
Membros inferiores T. rubrum
03 Face Malassezia furfur C. cabeludo M. furfur 04 Membros superiores M. furfur Pescoço / colo M. furfur 05 Unha da mão Candida albicans Áxila C. albicans Inguinocrural C. albicans Comissura labial C. albicans 06 Inguinocrural T. tonsurans Membros inferiores T. tonsurans
Dorso do pé T. tonsurans
07 Unha do pé (hálux) C. parapsilosis Dorso do pé C. parapsilosis 08 Nádegas C. parapsilosis Entre os artelhos C. parapsilosis 09 Membros inferiores T. rubrum
Inguinal T. rubrum
Membros superiores T. rubrum
10 Abdomen T. tonsurans
Membros inferiores T. tonsurans
11 Abdomen T. tonsurans
Membros superiores T. tonsurans
12 Face T. rubrum
Abdomen T. rubrum
Inguinal T. rubrum
Membros superiores T. rubrum
Membros inferiores T. rubrum
Unha da mão T. rubrum
Unha do pé (hálux) T. rubrum
13 Abdomen Phialophora reptans Unha da mão P. reptans 14 Unha da mão C. parapsilosis Unha do pé (hálux) C. parapsilosis 15 Glande C. parapsilosis Bolsa escrotal C. parapsilosis 16 Membros superiores M. furfur Face M. furfur
Segundo Johnson (2000) T. rubrum coloniza a região dos pés, evoluindo à infecção
pelo aumento da imunossupressão, podendo disseminar-se para toda região plantar e
58 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
posteriormente infectar as unhas dos pés e mãos (Tinea manum), inguinal (Tinea cruris),
tronco (Tinea corporis) e face (Tinea facie).
A elevada ocorrência de infecções superficiais verificada nesta casuística deve
estimular uma maior atenção às micoses nos pacientes com HIV/AIDS, para que seja
estabelecido tratamento adequado e direcionado para o agente isolado.
4.2 Características de Patogenicidade
Com relação aos aspectos fisiológicos relacionados à patogenicidade, todas as 117
amostras de fungos foram capazes de crescerem a temperatura de 37ºC. As leveduras em
meio ágar Sabouraud, fungos filamentosos em Batata Dextrose Ágar (BDA) ou Czapec
(Cz) e dermatófitos no Meio Teste para Dermatófito (DTM) (Figura 8).
Figura 8. Crescimento à 37ºC em meio ágar Sabouraud para as leveduras (a), Batata
Dextrose Agar (b), ágar Czapec para fungos filamentosos não dermatófitos (c) e Meio
Teste para Dermatófito (d).
A habilidade que os fungos têm de crescerem à temperatura corpórea, é
considerado por vários autores como a principal exigência para que sejam considerados
patógenos (KWON CHUNG; BENNETT, 1992; RIPPON, 1990).
Entre as 66 amostras de leveduras avaliadas quanto à protease, em oito foram
verificadas a expressão muito forte (< 0,69), apenas uma amostra foi verificada fraca
expressão (0,89-0,80) e duas muito fracas (0,9-1) (Figura 9; Tabela 5).
a b c d
59 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
Figura 9. Protease em meio com caseína do leite (a) muito forte (b) muito fraca.
Tabela 5. Expressão da protease em caseína do leite entre amostras de leveduras isoladas
de lesões superficiais em pacientes o Vírus da Imunodeficiencia Humana/Síndrome da
Imunodeficiencia Adquirida.
Espécies
ZONA DE ATIVIDADE PROTEASE Total < que 0,69 (muito forte)
0,79-0,70
(forte)
0,89-0,80 (fraca)
0,9-1 (muito fraca)
Candida albicans (22) 0 0 0 0 0
C. famata (2) 0 0 0 0 0
C. glabrata (1) 0 0 0 0 0
C. guilliermondii (3) 01 0 0 0 01
C. parapsilosis (18) 0 0 0 01 01
C. tropicalis (4) 0 0 0 0 0
Malassezia furfur (8) 03 0 01 0 04
M. sympodialis (2) 02 0 0 0 02
Trichosporon asahii (3) 0 0 0 01 01
Kodamaea ohmeri (2) 01 0 0 0 01
Brettanomyces anomallus (1) 01 0 0 0 01
Total 8 0 1 2 11
As amostras de Malassezia testadas se destacaram quanto à expressão desta enzima.
Os resultados revelaram a importância destes organismos de caráter oportunistas nesse
grupo de paciente, os quais apresentaram lesões extensas e atípicas. Segundo Serda; Yucel
a b
60 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
(2002) protease tem um papel importante na patogenicidade dos fungos, os quais causam
danos às células hospedeiras.
Entre as 51 amostras de fungos filamentosos, avaliadas quanto à protease, em duas
amostras foi verificada expressão forte (0,79-0,70), em 16 fraca (0,89-0,80) e 13 muito
fraca expressão (0,9-1) (Tabela 6).
Tabela 6. Expressão da protease em caseína do leite entre amostras de fungos filamentosos
isolados de lesões superficiais em pacientes com o Vírus da Imunodeficiencia
Humana/Síndrome da Imunodeficiencia Adquirida.
Espécies
ZONA DE ATIVIDADE PROTEASE Total < que 0,69 (muito forte)
0,79- 0,70 (forte)
0,89- 0,80 (fraca)
0,9-1 (muito fraca)
Microsporum gypseum (3) 0 0 0 01 01
Trichophyton mentagrophytes (5) 0 0 01 04 05
T. rubrum (23) 0 02 08 04 14
T. tonsurans (11) 0 0 06 04 10
Aspergillus niger (1) 0 0 0 0 0
Cylindrocarpon destructans (1) 0 0 0 0 0
Fusarium solani (2) 0 0 0 0 0
Phialophora reptans (2) 0 0 0 0 0
Scytalidium hialinum (1) 0 0 0 0 0
S. japonicum (1) 0 0 0 0 0
Penicillium comunne (1) 0 0 01 0 01
Total 0 2 16 13 31
Segundo Puente; López-Otín (2004) as proteases desempenham papel importante
em vários processos biológicos e patológicos. Melo et al. (2006) e Zepelin et al. (1999);
citam que podem ocorrer ausência ou diferenças na expressão da protease por fungos
isolados de pacientes HIV-positivos, como consequência do uso de inibidores de proteases
por este grupo de pacientes. Como ação, os inibidores da protease ligam-se às proteases
impedindo a sua função, a partir do momento em que assumem a sua posição, estes
permanecem nas células, tornando a protease inativa (ROCHE, 2009).
Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e
Entre as 66 amostras de leveduras avaliadas quanto à expressão de fosfolipase, em
30 foi verificada expressão muito forte (
fraca expressão (0,89-0,80) e em 15, muito fraca atividade (0,9
Figura 10. Fosfolipase em meio com lecitina de soja (a)
Tabela 7. Expressão de fosfolipase em lecitina de soja
lesões superficiais em pacientes
Imunodeficiencia Adquirida.
Espécies
Candida albicans (22)
C. famata (2)
C. glabrata (1)
C. guilliermondii (3)
C. parapsilosis (18)
C. tropicalis (4)
Malassezia furfur (8)
M. sympodialis (2)
Trichosporon asahii (3)
Kodamaea ohmeri (2)
Brettanomyces anomallus (1) Total
Das 51 amostras de fungos filamentosos avaliados quanto à fosfolipase,
amostras foi verificada expressão muito
Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
Entre as 66 amostras de leveduras avaliadas quanto à expressão de fosfolipase, em
verificada expressão muito forte (< 0,69), em 12 forte expressão (0,79
) e em 15, muito fraca atividade (0,9-1) (Figura 10; Tabela 7).
em meio com lecitina de soja (a) muito forte, (b) forte.
Expressão de fosfolipase em lecitina de soja entre amostras de leveduras isoladas de
pacientes com o Vírus da Imunodeficiencia Humana/Síndrome da
ZONA DE ATIVIDADE FOSFOLIPASE Total
< que 0,69 (muito forte)
0,79-0,70 (forte)
0,89-0,80 (fraca)
0,9-1 (muito fraca)
12 04 02 04
02 0 0 0
01 0 0 0
01 0 0 02
07 07 02 02
01 01 01 01
03 0 0 05
02 0 0 0
0 0 02 01
0 0 02 0
01 0 0 0 30 12 9 15
Das 51 amostras de fungos filamentosos avaliados quanto à fosfolipase,
amostras foi verificada expressão muito forte (< 0,69), em quatro amostras foi verificada
a b
61
Entre as 66 amostras de leveduras avaliadas quanto à expressão de fosfolipase, em
9-0,70), nove,
Figura 10; Tabela 7).
muito forte, (b) forte.
entre amostras de leveduras isoladas de
com o Vírus da Imunodeficiencia Humana/Síndrome da
ZONA DE ATIVIDADE FOSFOLIPASE Total
(muito fraca)
4 22
02
01
02 03
02 18
01 04
05 08
02
1 03
02
01 15 66
Das 51 amostras de fungos filamentosos avaliados quanto à fosfolipase, em sete
), em quatro amostras foi verificada
b
62 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
expressão forte (0,79-0,70) e fraca expressão (0,89-0,80), respectivamente e em 36
apresentaram expressão muito fraca (0,9-1) (Tabela 8).
Tabela 8. Expressão de fosfolipase em lecitina de soja entre amostras de fungos filamentosos
isolados de lesões superficiais de pacientes com o Vírus da Imunodeficiencia Humana/ Síndrome
da Imunodeficiencia Adquirida.
Espécies ZONA DE ATIVIDADE FOSFOLIPASE Total
< que 0,69 (muito forte)
0,79-0,70
(forte)
0,89-0,80
fraca)
0,9-1 (muito fraca)
Microsporum gypseum (3) 0 0 0 03 03
Trichophyton mentagrophytes (5) 0 0 01 04 05
T. rubrum (23) 05 02 02 14 23
T. tonsurans (11) 02 02 01 06 11
Aspergillus niger (1) 0 0 0 01 01
Cylindrocarpon destructans (1) 0 0 0 01 01
Fusarium solani (2) 0 0 0 02 02
Phialophora reptans (2) 0 0 0 02 02
Scytalidium hialinum (1) 0 0 0 01 01
S. japonicum (1) 0 0 0 01 01
Penicillium comunne (1) 0 0 0 01 1
Total 7 4 4 36 51
Os resultados relacionados à expressão da fosfolipase por espécies de dermatófitos
apresentados neste trabalho, diferem dos achados de Dos Santos et al. (2001), que não
detectaram fosfolipase em nenhuma das amostras analisadas.
Considerando o crescimento a 37°C, a expressão da protease e da fosfolipase, os
isolados de Malassezia e o isolado de Bretanomyces anomalus, se destacaram, pois,
cresceram a temperatura de 37°C e expressaram protease e fosfolipase em meio sólido,
confirmando seu poder virulento, causando dano à célula do hospedeiro e expressando seu
potencial patogênico.
63 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
4.3 Testes de Susceptibilidade
Os resultados referentes à atividade antifúngica dos extratos aquoso e alcoólico da
própolis verde e extratos alcoólicos da própolis vermelha do Brasil bem como das lectinas
ConBr e DViol em relação às espécies de Candida isoladas de amostras clínicas de lesões
superficiais em pacientes com HIV/AIDS estão inseridos na Tabela 9.
A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) dos antifúngicos e dos
extratos das própolis e lectinas foram realizadas por observação visual de cada poço que
apresentasse redução de crescimento fúngico. Considerando o crescimento total (100%) do
fungo no poço controle, foi atribuído o percentual de redução de crescimento aos demais
poços, os quais foram confirmados através da leitura das placas de microtitulação pelo
programa Microplate Manager, modelo BenchMark Plus (Bio-Rad Laboratories Inc.) em
530nm.
A resistência ao extrato aquoso da própolis verde foi observada em Candida
tropicalis e C. glabrata; ao extrato alcoólico da própolis verde em C. guilliermondii e C.
famata, a lectina DViol em C. glabrata.
As concentrações inibitórias mínimas das própolis verde aquosa e alcoólica foram
variáveis entre os isolados de leveduras (16µg/mL a 1024µg/mL). Para o extrato alcoólico
da própolis vermelha a CIM ocorreu entre 2µg/mL a 1024µg/mL. Com relação às lectinas
ConBr e DViol as CIMs foram de 8µg/mL a 256µg/mL. As menores concentrações dos
fármacos convencionais foram obtidas em anfotericina B (0,06µg/mL a 2µg/mL) seguida
por fluconazol (0,25µg/mL a 64µg/mL). Contudo, vale ressaltar que estes fármacos
tradicionais apresentam altos níveis de toxicidade, o que não ocorre com os produtos
testados neste trabalho. Neste contexto, embora tenham sido mais elevadas às
concentrações inibitórias da própolis e das lectinas, estas podem ser administradas sem, no
entanto, causarem danos indesejáveis aos pacientes, sobretudo, se for de uso tópico nos
casos de lesões superficiais (Tabela 9).
A concentração fungicida mínima (CFM) correspondeu a menor concentração que
não permitiu o crescimento do fungo em meio Ágar Sabouraud (FAVRE et al., 2003;
PFALLER et al., 2004).
No extrato aquoso e alcoólico da própolis verde não foi observada CFM em
nenhuma das amostras de Candida, sendo constatada no extrato alcoólico da própolis
vermelha em C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis. Em lectina ConBr ocorreu em C.
64 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
albicans e C. parapsilosis bem como em lectina Dviol em C. tropicalis, C. guilliermondii e
C. famata (Tabela 9).
65 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
Espécie № amostras testadas
Antifúngico Inibição de crescimento
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL) Candida albicans (19) Anfotericina B 0,06-1 0,25 - 4 Fluconazol 0.25-64 4 - 64 Própolis verde aquosa 1.024 ND Própolis verde alcoólica 1.024 ND Própolis vermelha 16-512 1.024 Lectina ConBr 8 256 Lectina DViol 64 R C. famata (2) Anfotericina B 0,125-2 0,5 -8 Fluconazol 4 32 Própolis verde aquosa 512-1.024 ND Própolis verde alcoólica R R Própolis vermelha 8 ND Lectina ConBr 128 ND Lectina DViol 8 16 C. glabrata Anfotericina B 0,25 2 Fluconazol 4 8 Própolis verde aquosa R ND Própolis verde alcoólica 256 ND Própolis vermelha 64 512 Lectina ConBr 256 ND Lectina DViol R R C. guilliermondii (3) Anfotericina B 0.125-1 0,5-4 Fluconazol 4-64 32 Própolis verde aquosa 512-1.024 ND Própolis verde alcoólica R R Própolis vermelha 2-1.024 ND Lectina ConBr 256 ND Lectina DViol 8 16 C.parapsilosis (16) Anfotericina B 0.25-2 1-4 Fluconazol 1-8 4-32 Própolis verde aquosa 512 R Própolis verde alcoólica 16-1.024 ND Própolis vermelha 8-1.024 1.024 Lectina ConBr 8 256 Lectina DViol 64 R C. tropicalis (4) Anfotericina B 0.125-1 0.5-4 Fluconazol 2-16 16 Própolis verde aquosa R R Própolis verde alcoólica 512 ND Própolis vermelha 16 -1.024 R Lectina ConBr 64 ND Lectina DViol 128-256 128-256
s s
Tabela 9. Concentração inibitória mínima e concentração fungicida mínima do extrato aquoso
da própolis verde, extratos alcoólicos das própolis verde e vermelha e de lectinas ConBr e
DViol em relação às espécies de Candida isoladas de lesões superficiais de pacientes com
HIV/AIDS do Hospital Correia Picanço, usando como controle anfotericina B e fluconazol.
CIM: concentrações inibitórias mínimas. ND: não determinado. R: resistência.
66 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
A própolis é conhecida por sua atividade contra os microrganismos e apesar das
substâncias presentes na própolis brasileira, sua atividade antimicrobiana frente a isolados
de Candida não havia sido reconhecida anteriormente com amostras de leveduras obtidas
de lesões superficiais desse grupo de paciente, demonstrando a importância de sua
padronização e análises microbiológicas, bem como obtenção do perfil geográfico sobre
regiões produtoras. Os flavonóides, juntamente com ácidos fenólicos, aldeídos fenólicos e
cetonas são considerados os mais importantes compostos antimicrobianos da própolis
(CASTALDO; CAPASSO, 2002; PIETTA et al., 2002).
A própolis é uma importante alternativa terapêutica para tratar doenças respiratórias
bem como do ponto de vista econômico e de eficácia farmacológica por ser de fácil
obtenção (SOARES et al., 2006; TAVARES et al., 2006).
O extrato alcoólico da própolis vermelha conseguiu inibir o crescimento de 24
amostras de Candida em diferentes concentrações 8-1024 µg/mL. A ação antifúngica do
extrato da própolis está relatada na literatura frente a vários agentes etiológicos incluindo
espécies de Candida (De CASTRO, 2001, SEVERO GOMES, 2009; OLIVEIRA et al.,
2006; SILICI et al 2005), dermatófitos (SIQUEIRA et al. 2008) e bactérias Gram positivas
como Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus e Gram negativas Escherichia coli
(BURDOCK, 1998; KUJUMGIEV, 1999; PACKER; LUZ, 2007; MOLINA et al. 2008;
NIEVA et al., 1999; SANTOS NETO et al., 2009).
As lectinas ConBr e DViol inibiram seis amostras de Candida cada uma. A ação de
lectinas com atividade antifúngica foi citada para diferentes espécies de Candida,
Colletotrichum, Fusarium, Kluyveromyces, Saccharomyces, Pichia, Rhodotorula e
Schizosaccharomyces (DAMICO et al 2003; SEVERO GOMES, 2009; TRINDADE et al
2006). Entretanto não tem sido relatada a ação antifúngica de própolis brasileira e de
lectinas, frente a amostras de Candida, isoladas de lesões superficiais de paciente com
HIV/AIDS.
A CIM da anfotericina B, variou de 0,06 a 2 µg/mL entre as 45 amostras de
Candida testadas, dos quais três (6,7%) amostras apresentaram a CIM >1 µg/mL, sendo
duas de C. parapsilosis e uma de C. famata. Estes resultados corroboram com os de
Colombo et al. (2006) os quais avaliaram 712 isolados de Candida através do protocolo
M27-A2 frente à anfotericina B, não consideraram nenhum achado de resistência, embora
cinco isolados de C. pelliculosa apresentaram a faixa de suscetibilidade de 0,125 µg/mL a 2
µg/mL. Os testes descritos na Norma M27-A2, indicam que as CIM da anfotericina B, para
espécies de Candida, estão agrupadas entre 0,25 e 1,0 µg/mL e que um valor de CIM >1
67 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
µg/mL para uma amostra de Candida, indica que esta seja resistente à anfotericina B
(CLSI, 2002). No Rio Grande do Sul, Antunes et al. (2004) avaliaram a suscetibilidade de
120 isolados de Candida utilizando testes padronizados pelo CLSI (M27-A2), todos os
isolados evidenciaram CIM < 1 µg ml-1 para anfotericina B.
A variação das CIM para o fluconazol ocorreu entre 0,25 - 64 µg/mL, sendo que em
32 amostras as CIM foram ≤ 8 µg/mL; sete apresentaram CIM entre 16 - 32 µg ml-1 sendo
colocado segundo a norma M27-A2 na categoria de Sensibilidade Dose-Dependente (S-
DD). Os testes descritos na Norma M27-A2 indicam que os pontos de corte de fluconazol
para as espécies de Candida para ser suscetível deve ser ≤8 µg/mL e resistente para valores
≥ 64 µg/mL, essa resistência só foi observada em duas amostras de C. albicans e uma de C.
guilliermondii, a variação das CIM de anfotericina B e fluconazol citadas neste trabalho,
estão de acordo com resultados de outros autores (BARRY et al., 2000).
A utilização generalizada de fluconazol para o tratamento e prevenção da
candidiase, principalmente em pacientes com HIV/AIDS, na maioria das vezes contribui
para o desenvolvimento da resistência microbiana tornando-se um problema grave para
esses pacientes. Magliorati et al. (2004) isolaram diferentes amostras de C. albicans da
cavidade oral de pacientes HIV-positivos e concluíram que alguns isolados foram
altamente resistentes aos antifúngicos estudados: 52,2% a cetoconazol, 30,4% a fluconazol
e 26% a itraconazol.
68 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
5. CONCLUSÕES
Considerando os resultados obtidos neste trabalho, pode-se concluir que:
1. O exame direto de amostras clínicas provenientes de lesões superficiais de
pacientes com HIV/AIDS foi conclusivo para o diagnóstico de micoses em 89,3%
das amostras.
2. Aspegillus niger, Brethanomyces anomalus, Candida albicans, C. famata, C.
glabrata, C. guilliermondii, C. parapsilosis, C. tropicalis, Cylindrocarpon
destructans, Fusarium solani, Kodamaea ohmeri, Malassezia furfur, M.
sympodialis, Microsporum gypseum, Penicilium commune, Phialophora reptans,
Scytalidium hialinum, S. japonicum, Trichophyton mentagroplytes T. rubrum, T.
tonsurans, Trichosporon asahii são isoladas de lesões superficiais em pacientes
com HIV/AIDS.
3. A diversidade de gêneros e espécies de fungos relacionados a onicomicose e
micose inguinal dos pacientes do estudo, sugere que deve-se ter especial atenção a
essas micoses, uma vez que as mesmas podem evoluir para quadros mais graves em
consequência do comprometimento imunológico.
4. Associação de fungos na mesma amostra clínica proveniente de lesão superficial é
um risco aumentado para os pacientes com HIV/AIDS.
5. Trichophyton rubrum e Candida albicans são as espécies mais isoladas de lesões
superficiais em pacientes com HIV/AIDS avaliados nesse estudo.
6. Bretanomyces anomalus está sendo citado pela primeira vez como agente de
micose inguinal em paciente com AIDS.
7. Cylindrocarpon destructans, Penicillium comunne, Phialophora reptans e
Scytalidium japonicum estão sendo citados como agentes emergentes de
onicomicose em paciente com HIV/AIDS.
8. O crescimento a 37°C e expressão de protease e fosfolipase influenciam o potencial
patogênico entre isolados clínicos de lesões superficiais em paciente com
HIV/AIDS.
9. Os gêneros Malassezia e Brethanomyces apresentam boa expressão proteásica e
fosfolipásica.
69 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
10. Os extratos alcoólicos da própolis vermelha do Brasil, bem como das lectinas
ConBr e DViol tem atividade fungicida em relação as espécies de Candida isoladas
de lesões superficiais em paciente com HIV/AIDS apesar da ampla variação das
CIM.
11. O extrato aquoso e alcoólico da própolis verde não apresentou atividade para
inibição de Candida isolada de lesões superficiais em pacientes com HIV/AIDS.
12. Própolis vermelha e lectinas podem ser futuras alternativas terapêuticas para
candidíase superficial em pacientes com HIV/AIDS.
70 Cambuim, I.I.F.N. Micoses Superficiais em HIV/AIDS e...
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Titulo da Pesquisa: “Micoses superficiais em HIV/AIDS e caracterização de agentes
etiológicos quanto a virulência e susceptibilidade antifúngica”.
Nome do pesquisador responsável: Idalina Inês Fonseca Nogueira Cambuim
Endereço: Rua Professor José Vicente nº 517 – IPSEP, Recife - PE.
Esta pesquisa tem como objetivo detectar fungos de lesões cutâneo-mucosas de
pacientes portador do Vírus da Imunodeficiência Humana – HIV e caracterizar os
fungos isolados quanto à morfologia, fisiologia e sensibilidade à lectinas. As amostras
serão coletadas com material esterilizado, não oferecendo riscos ao paciente. As
amostras clínicas serão processadas para exame micológico.
O paciente que participar da pesquisa se beneficiará com diagnóstico e
tratamento imediato com drogas fornecidas pelo Hospital Correia Picanço, conforme
disponibilidade das mesmas, uma vez que os pacientes pertencem a este serviço.
OBS 1: Os pacientes serão mantidos em anonimato, uma vez que não será feita
referência aos dados pessoais. Mesmo após aprovação do termo de consentimento, os
pacientes, poderão retirar-se a qualquer momento da pesquisa, sem nenhum prejuízo
para os mesmos.
____________________________ _____________________________ Nome do pesquisador responsável Assinatura
Desta forma, eu ____________________________________________ R.G.
nº___________________ Expedido por ______________, atesto que li e entendi o
conteúdo deste consentimento e aceito de livre e espontânea vontade participar
deste estudo clínico.
__________________________________ ______________________________
Nome do paciente Assinatura
Recife, ____ de __________ de _____
____________________________ _____________________________
Testemunha Assinatura
40
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 44(1):40-42, jan-fev, 2011
Artigo/Article
1. Departamento de Micologia, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE. 2. Ambulatório de Dermatologia, Hospital Correia Picanço, Recife, PE. 3. Serviço de Micologia, NKB-Medicina Diagnóstica, Recife, PE. †In mem,orianEndereço para correspondência: Dra Rejane Pereira Neves. Deptº de Micologia/UFPE. Av. Prof. Nelson Chaves s/n, Cidade Universitária, 50670-420 Recife, PE.Tel: 55 81 2126-8481; Fax: 55 81 2126-8480e-mail: rejadel@yahoo.com.brRecebido para publicação em01/06/2010Aceito em 16/09/2010
INTRODUÇÃO
Avaliação clínica e micológica de onicomicose em pacientes brasileiros com HIV/AIDS
Clinical and mycological evaluation of onychomycosis among Brazilian HIV/AIDS patients
Idalina Inês Fonsêca Nogueira Cambuim1, Danielle Patrícia Cerqueira Macêdo1, Marília Delgado2, Kedma de Magalhães Lima1,3, Genilda Pereira Mendes1, Cristina Maria de Souza-Motta1, Débora Maria Massa Lima1, Maria José Fernandes1, Oliane Maria Correia Magalhães1, Lusinete Acioli de Queiroz1† e Rejane Pereira Neves1
RESUMOIntrodução: Onicomicoses são comuns em pacientes imunocomprometidos embora espécies emergentes tenham sido verificadas, modificado o perfil epidemiológico desta micose. Assim, o objetivo desta pesquisa é avaliar o perfil clínico e micológico da onicomicose em pacientes com infecção pelo HIV/AIDS. Métodos: Amostras clínicas foram coletadas, processados para exame direto e a cultura mantida a temperatura de 30°C e 37ºC durante 15 dias. Resultados: Dos 100 pacientes, 32 apresentavam onicomicose. Os agentes isolados foram Candida albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. guilliermondii, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Fusarium solani, Scytalidium hialinum, S. japonicum, Aspergillus niger, Cylindrocarpon destructans e Phialophora reptans. Conclusões: Onicomicoses em HIV/AIDS apresentam variadas manifestações clínicas e podem ser causadas por fungos emergentes. As peculiaridades apresentadas pelos diferentes agentes de origem fúngica justificam a necessidade de identificação ao nível da espécie, com a finalidade de orientar uma melhor abordagem terapêutica e minimizar a exposição desses pacientes a condições de risco de uma infecção disseminada.Palavras-chaves: Onicomicose. HIV/AIDS. Leveduras. Fungos filamentosos.
ABSTRACTIntroduction: Onychomycosis is common in immunocompromised patients, but emerging species have been verified, thereby modifying the epidemiological profile of this mycosis. Thus, the aim of this study was to evaluate clinical and mycological profile of onychomycosis among HIV/AIDS patients. Methods: Clinical samples were collected and processed for direct examination, and cultures were maintained at a temperature of 30°C and 37°C for 15 days. Results: Out of 100 patients, 32 had onychomycosis. The etiological agents isolated were Candida albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. guilliermondii, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Fusarium solani, Scytalidium hialinum, S. japonicum, Aspergillus niger, Cylindrocarpon destructans and Phialophora reptans. Conclusions: Onychomycosis in HIV/AIDS patients presents various clinical manifestations and may be caused by emerging fungi. The peculiarities presented by different fungal agents justify the need for identification to species level, with the purpose of guiding better therapeutic approaches and minimizing these patients’ exposure to conditions presenting a risk of disseminated infection. Keywords: Onychomycosis. HIV/AIDS. Yeasts. Filamentous fungi.
Onicomicoses são infecções nas unhas causadas por fungos como leveduras, dermatófitos ou outros fungos filamentosos, os quais constituem infecção superficial frequente na população imunocompetente ou imunossuprimida1.
Em população com imunossupressão, lesões de onicomicoses expressam características mais intensas e o agente infectante vir a causar doença disseminada ou fatal2. Em pacientes portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV), essa micose pode ocorrer em mais de 30% dos pacientes, principalmente quando a contagem de linfócitos T CD4 estiver abaixo de 400 células/mm2,3. Outros fatores epidemiológicos relacionados são profissões que envolvem contato frequente das unhas com água e solo podendo contribuir para o estabelecimento da infecção fúngica4.
As apresentações clínicas das onicomicoses são classificadas de acordo com a localização, extensão e coloração das lesões. A mais comum é a onicomicose subungueal distal e lateral (OSDL) na qual predominam os dermatófitos com envolvimento ocasional por outro fungo filamentoso. A onicomicose superficial branca (OSB) é causada principalmente por T. mentagrophytes e, algumas vezes, por espécies de Acremonium ocorrendo comumente em pacientes com AIDS. A forma clínica distrófica total (ODT) é causada principalmente por dermatófitos e a onicomicose subungueal proximal (OSP) predomina nas unhas das mãos e é causada por espécies de Candida. Entretanto, em paciente portadores de AIDS essa forma clínica pode estar associada à dermatófitos5,6.
Pacientes HIV/AIDS são alvo constante das onicomicoses, fato frequentemente observado na prática médica7, contudo há escassez de trabalhos sobre o assunto. Dessa forma este trabalho tem como objetivo principal quantificar a ocorrência de onicomicoses em amostras de pacientes e identificar os agentes mais prevalentes.
41
Cambuim IIFN cols - Onicomicose em brasileiros portadores do HIV/AIDS
MÉTODOS
RESULTADOS
DIScUSSÃO
PacientesForam avaliados 100 pacientes HIV/AIDS atendidos no Hospital
Correia Picanço, referência em doenças infecto-contagiosas em Recife, Estado de Pernambuco, com sintomatologia e/ou lesões sugestivas de onicomicose.
A coleta das amostras clínicas foi realizada por raspado de lâmina ungueal ou leito subungueal após consentimento aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa envolvendo seres humanos do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco CEP/CCS/UFPE e pela Comissão de Ética Médica do Hospital Correia Picanço.
As amostras foram processadas para realização do exame direto, onde as escamas ungueais foram clarificadas com solução aquosa a 20% de hidróxido de potássio. Posteriormente, os espécimes clínicos foram semeados em duplicata no meio ágar Sabouraud (Difco) adicionado de 50mg/L de cloranfenicol contido em placas de Petri, sendo mantidas às temperaturas de 30 e 37°C durante 15 dias para identificação dos agentes etiológicos8.
Isolados A identificação das leveduras foi realizada segundo9 observação
das características macroscópicas (aspecto, coloração e bordos das colônias), microscópicas (presença de pseudomicélio, micélio verdadeiro e produção de clamidosporos) e fisiológicas (assimilação de fontes de nitrogênio e carbono, fermentação de fontes de carbono e produção de urease). As leveduras também foram avaliadas através de meio CHROMagartm Candida, o qual foi preparado de acordo com as instruções do fabricante e as placas foram mantidas a 4°C no escuro. Cada isolado foi subcultivado neste meio e incubado a 30°C por 48h. A leitura das placas e a interpretação dos resultados foram realizadas pela observação da morfologia e da pigmentação das colônias10.
Para identificação dos fungos filamentosos foram utilizados os critérios adotados por De Hoog cols11, Lacaz cols8 e Domisch cols12 através da observação das características macroscópicas e microscópicas dos isolados.
Considerações éticasEste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
envolvendo seres humanos do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco CEP/CCS/UFPE e pela Comissão de Ética Médica do Hospital Correia Picanço
Dos pacientes com HIV/AIDS avaliados, 32 apresentaram distrofia ungueal com apresentações clínicas variadas. Dentre estes, 16 eram do sexo feminino com acometimento nas unhas de mãos em sete casos, pés em seis, e mãos/pés em três casos. Os 16 pacientes do sexo masculino apresentaram onicomicoses nas mãos em sete casos, pés em sete e nas unhas de mãos e pés em dois casos. A faixa etária variou de 27 a 59 anos no sexo feminino e de 22 a 57 anos, no masculino.
Dentre os 32 pacientes com manifestações clínicas de onicomicose, foram reconhecidas as apresentações clínicas típicas. Às formas clínicas clássicas foram associadas com hiperpigmentação e/ou hiperqueratose subungueal, com destaque nos casos de hiperqueratose no sexo feminino.
Das onicomicoses causadas por leveduras foram definidas taxonomicamente, através de todas as características compatíveis, os agentes etiológicos Candida albicans, C. guilliermondii, C. parapsilosis, C. tropicalis, Trichophyton rubrum, T. mentagroplytes. Aspegillus niger, Cylindrocarpon destructans, Fusarium solani, Scytalidium hialinum, S. japonicum e Phialophora reptans.
As colônias de leveduras que exibiram coloração verde-clara foram consideradas C. albicans e as azuis, C. tropicalis, de acordo com o método CHROMagar utilizado.
Houve associação de dois fungos na mesma lesão, como dois isolados de leveduras (C. albicans e C. tropicalis) nas unhas das mãos e um de levedura com fungo filamentoso (C. parapsilosis e T. rubrum), nas unhas dos pés. Foram também isoladas C. parapsilosis das unhas das mãos, C. destructans das unhas dos pés e T. rubrum das unhas de mãos e pés.
Ocorreu onicomicose por A. niger na unha das mãos de um paciente do sexo masculino e F. solani foi isolado de escamas ungueais dos pés de um paciente do sexo masculino e um paciente do sexo feminino. S. hyalinum e S. japonicum foram isolados de escamas ungueais dos pés de dois pacientes do sexo feminino, Phialophora reptans das unhas das mãos de um paciente do sexo masculino agricultor e C. destructans de escamas ungueais do pé de uma paciente com atividade do lar e jardinagem.
Nesta pesquisa, as lesões nas unhas das mãos foram mais frequentes em pacientes do sexo feminino que desempenhavam atividades do lar. Este fato pôde ser justificado, possivelmente, devido ao contato frequente com água e produtos químicos, concorrendo à instalação dos fungos4. Contudo, os resultados descritos no trabalho de Yamada13 acerca das micoses superficiais em pacientes HIV-positivos, a maior incidência de onicomicose ocorreu no sexo masculino, com maior acometimento das unhas dos pés.
Dos três pacientes do sexo masculino agricultores, dois eram portadores de onicomicose nas mãos e um em mãos e pés. Segundo Araújo14 o tipo de ocupação e o contato com possíveis focos, favorecem o desenvolvimento das onicomicoses.
A apresentação clínica OSDL citada neste trabalho, foi também referida por Gupta cols2 ao trabalharem com pacientes com o HIV, ocorrendo de forma isolada ou associada à SB. Cribier cols15 verificaram em 155 pacientes infectados com HIV leuconíquia e melanoníquia longitudinal como apresentações clínicas mais freqüentes de onicomicose neste grupo de pacientes. Entretanto, Baran cols16 ao avaliarem imunocompetentes, observaram como apresentações clínicas a onicomicose subungueal distal e lateral, superficial, subungueal proximal, endonix e onicomicose distrófica total, e ressaltaram a possibilidade de associações entre estas formas.
A diversidade de fungos relacionados à etiologia de diferentes formas clínicas de onicomicose sugere que deve ser declinada uma atenção a esta micose uma vez que a mesma pode evoluir para quadros mais graves em imunossuprimidos17. Segundo Johnson18 infecções crônicas podem favorecer uma porta de entrada para infecções mistas e subsequentes infecções fúngicas invasivas originadas de onicomicose. Neste sentido, Hennequin cols19 descrevem um caso fatal de infecção sistêmica secundária por Fusarium com provável origem de infecção ungueal grave. Estes autores consideram onicomicose causada por agentes emergentes como doença potencialmente grave em paciente com HIV.
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Rev Soc Bras Med Trop 44(1):40-42, jan-fev, 2011
Surjushe cols20 em trabalho com onicomicose em pacientes com HIV, indicaram como de maior incidência A. niger, Cladosporium sp, S. hyalinum, Penicillium sp e Gymnoascus dankaliensis. No entanto, Cribier cols15 destacam dermatófitos como os principais agentes causadores de onicomicose em pacientes com HIV, assim como Graham cols21 que referem T. rubrum seguido por T. mentagrophytes, T. tonsurans, Epidermophyton floccosum, e C. albicans como os agentes mais comuns de onicomicose em infectados com HIV.
Candida albicans destacou-se neste trabalho como a espécie mais frequente das onicomicoses, seguida de dermatófitos e de outros fungos filamentosos considerados emergentes nos pacientes HIV/aids. Também Ginter cols22, ressaltam a predominância de onicomicose por dermatófitos, seguidos de leveduras e outros fungos filamentosos, entretanto, em imunocompetentes.
As associações entre agentes etiológicos nas onicomicoses são raramente citadas. Contudo, Rugeles cols17 observaram associação de levedura e fungos filamentosos, além de Yamada cols13 que citam três casos de dermatófito associado com levedura, um de fungo filamentoso com levedura e um dermatófito com outro fungo filamentoso. Estes mesmos autores, com relação à localização da lesão, destacaram as lesões nas unhas dos pés.
Os casos dos quais foram isolados Aspergillus como agente etiológico das lesões ungueais não corroboram com a freqüência de onicomicose podal citada por Tosti cols23.
Assim como verificado neste trabalho, outros fungos filamentosos foram causa de onicomicoses em HIV/AIDS tais como espécies de Scytalidium, Fusarium, Phialophora e Cylindrocarpon, os quais são mencionados por diversos autores como capazes de invadir e degradar a queratina da unha24-26.
Do material ungueal de um paciente, não foi obtida cultura de fungo, embora o exame direto tenha revelado filamentos micelianos septados, artrosporados e células de leveduras. Os procedimentos laboratoriais de exame direto e cultura devem ser realizados para o diagnóstico de onicomicose, uma vez que existem casos que o exame direto define a ocorrência dessa micose. O rápido crescimento bacteriano, o uso de medicamentos específicos, as exigências do fungo in vitro e o inóculo pobre em estruturas fúngicas viáveis, podem ter sido causas da não obtenção de cultura.
As manifestações clínicas ungueais apenas poderão ser indicadas como onicomicose após o diagnóstico laboratorial micológico e, desta forma, ser iniciado o tratamento específico para o agente causal27.
AGRADEcIMENTOS
Lembramos, de forma especial, a Prof ª Drª Luzinete Aciole de Queiroz in memorian.
cONFLITO DE INTERESSE
Os autores declaram não haver nenhum tipo de conflito de interesse no desenvolvimento do estudo.
SUpORTE FINANcEIRO
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e pelo Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos (PPGBF) da Universidade Federal de Pernambuco.
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