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Microbiologia delle infezioni delle vie
respiratorie inferiori
Microbiologia delle Microbiologia delle infezioni delle vie infezioni delle vie
respiratorie inferiorirespiratorie inferiori
Dr.ssa Lo Cascio GiulianaDipartimento di Patologia e diagnostica, Sezione di Microbiologia, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di VeronaServizio di Microbiologia, Ospedale G. B. Rossi, Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata di Verona
Quale l’approccio microbiologico?
• Fase pre-analitica (raccolta e trasporto campione)
• Fase analitica-diagnostica: se e chi è il patogeno?
• Test di Sensibilità• Resistenze e problematiche correlate
PolmonitePolmonitePolmonite
Eziologia: Età Microrganismi più frequenti
Neonato (0-1 mese) E. coli, Streptococcus agalactiae
Infante (1–6 mesi) Chlamydia trachomatis, respiratorysyncytial virus
Bambino (6 mesi –5 anni) Respiratory syncytial virus, parainfluenza viruses
Bambino (5–15 anni) Mycoplasma pneumoniae, influenza virus type A
Giovane adulto (16-30 anni) Mycoplasma pneumoniae, Streptococcuspneumoniae
Adulto Streptococcus pneumoniae, Haemophilusinfluenzae
Tabella LRI-2. Agenti eziologici di polmonite: tipologia e correlazione con stato immunitario
Presentazione e Stato immunitario Cause più frequenti Cause meno frequenti
Community acquired typical pneumonia
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae
Staphylococcus, Moraxella catarrhalis, Neisseria meningitidis
Nosocomial pneumonia typical pneumonia
Gram-negative aerobic bacilli (Enterobacter, Klebsiella, Acinetobacter, Pseudomonas), Staphylococcus aureus, anaerobic bacteria, standard bacteria*
Legionella, Streptococcus pneumoniae
Community acquired primary interstitial pneumonia
Mycoplasma pneumoniae, respiratory viruses†, influenza virus, Chlamydophila pneumoniae, Legionella sp.
Adenovirus, Chlamydophila psittaci, Chlamydia trachomatis, primary tuberculosis, acute fungal pneumonias
Hematogenous pneumonia Staphylococcus, Streptococcus Gram-negative aerobic bacilli
Opportunistic pneumonia occurring in immunocompromised host
Standard bacteria*, Pneumocystis jirovecii, Cytomegalovirus, herpes simplex virus, Nocardia, opportunistic fungi (e.g., Candida, Phycomycetes mucor, Aspergillus)
Legionella, Listeria, Histoplasma, Coccidioides
Pneumonia acquired by environmental exposure
Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Chlamydophila psittaci, Mycobacterium tuberculosis
Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei Coxiella burnetii, Yersinia pestis, Pasteurella multocida, Paracoccidioides
Aspiration pneumonia
Prevotella melaninogenicus, Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus, Peptococcus, and other anaerobes, Staphylococcus, Gram-negative aerobic bacilli
* Standard bacteria:batteri che comunemente causano CAP. †Respiratory viruses include influenza, parainfluenza, and respiratory syncytial virus.
Modificata da: N. Chamberlain, 2010
Tabella 3. Cause di Polmoniti secondo Tempo di esordio, modalità di acquisizione e trasmissione
Esordio Tipologia di polmonite
Trasmissione Agenti causali
Acuta Community acquired
Persona-a-persona Streptococcus pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Haemophilus
influenzae, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Neisseria
meningitidis, Moraxella catarrhalis, influenza virus, Streptococcus pyogenes
Acuta Community acquired
Animali o esposizione ambientale
Legionella, Francisella tularensis, Coxiella burnetii, Chlamydophila
psittaci, Yersinia pestis (peste), Bacillus anthracis (antrace), Burkholderia
pseudomallei (melioidosi), Pasteurella multocida (pasteurellosi)
Acuta Community acquired
Persona a persona in infanti e bambini
piccoli
Chlamydia trachomatis (polmonite apiratica), respiratory syncytial virus e
altri virus respiratori, Streptococcus agalactiae (Group B), S aureus,
Cytomegalovirus, S pneumoniae, H influenza
Acuta Nosocomial pneumonia
Persona a persona Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacters, S aureus
Subacuta interstiziale
Community acquired
Persona a persona Mycoplasma pneumoniae, influenza virus
Subacuta Nosocomial or community
acquired
Aspirazione Mista: anaerobi e aerobi gram-negative, enterobatteri, usualmente
polimicrobiche Subacuta o cronica
Nosocomial or community
acquired
Persona a persona o aspiratione in immunocompromessi
Pneumocystis jiroveci, cytomegalovirus, atypical
mycobacterium (e.g., Mycobacterium kansasii), Nocardia, Aspergillus,
Phycomycetes mucor, Candida albicansCronica Community
acquired Persona a persona Mycobacterium tuberculosis,la più
frequente. Polmoniti MICOTICHEBlastomyces dermatitides,
Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, Cryptococcus
neoformans Modificata da: N. Chamberlain, 2010
Sethi S., NEJM 2008
Ricerca e isolamento di microrganismi responsabili di polmonite dipende da:
• Adeguatezza del campione delle basse vie respiratorie
• Assenza di contaminazione della flora del tratto
respiratorio superiore
• Utilizzo delle tecniche microscopiche e colturali
• Trattamenti antimicrobici in corso recenti
Tipologia di campioni• Emocolture
• Toracentesi
• Aspirazione Transtoracica
• Lavaggio Broncoalveolare;
• Aspirato bronchiale;
• Brushing bronchiale;
• Escreato spontaneo o indotto;
• Tampone faringeo/nasale, Aspirato nasofaringeo;
Tecniche INVASIVE: siti NON Sterili
Tecniche INVASIVE: siti Sterili
Tecniche NON INVASIVE: siti NON Sterili
Raccolta dei campioni
• Tempo ottimale di prelievo: – Emocolture: prima possibile e precedente a terapia
antibiotica (alta specificità ma positive solo nel 4-18% dei casi, 34% se eseguite nei primi 4 giorni dall’esordio sintomi )
– Escreato: preferibile campione della mattina
– Preferibile campione precedente alla terapia
antibiotica (Legionella può risultare positiva anche dopo inizio
terapia)
Raccolta dei campioniTipo di campione appropriato e metodo di prelievo
– Escreato profondo
– Se tosse secca, possibilmente fare fisioterapia o drenaggio posturale o
inalazione di aerosol
• Quantità adeguata e numero appropriato di campioni
» Per Emocolture: almeno 2 campioni
» Per BAL max volume
» Escreato: almeno 2 ml, possibilmente ripetere il
campione per 3 giorni consecutivi
Trasporto e conservazione del campione
• Tempo tra prelievo del campione e procedura analitica– Minimo possibile, l’escreato può essere refrigerato per
2-3 h, oltre possibile perdita di Haemophilus e Streptococcus pneumoniae, sovracrescita di bacilli Gramnegativi.
– In casi eccezionali il campione può essere seminato fino a 48h dopo il prelievo, ma l’interpretazione deve essere fatta con attenzione
• Accorgimenti speciali per ridurre il deterioramento– Refrigerazione è preferibile alla conservazione a T
Ambiente. Non tollerati ritardi superiori alle 48h.
PERCORSO DIAGNOSTICO POLMONITE
CAP HAP/HCAP/VAP
IMMUNOCOMPETENTE IMMUNOCOMPROMESSO IMMUNOCOMPETENTE IMMUNOCOMPROMESSO
EMOCOLTURA
COLTURALE (batt., miceti e legionella su ESCR/BASP/BAL
Pneumocistis su BAL
β-d glucano su sangue
Ag. CMV su sangue
Antigene Legionella su urine
Antigene Pneumococco su urine
COLTURALE su liquido pleurico (se presente)
Sierologia agenti pneumotropi su sangue
Se sospetto BK • Coltura ESCR/BAS/BAL • Quantiferon su sangue • Quantiferon su l.pleur.
EMOCOLTURA
Antigene Legionella su urine
β-d glucano su sangue
Ag. Aspergillo su sangue
Ag. Aspergillo su BAL
Ag. CMV su sangue
Virus respiratori su BAL
Virus respiratori sierologia su sangue
COLTURALE (batt., miceti e legionella su ESCR/BASP/BAL
COLTURALE su liquido pleurico (se presente)
Cosa attenderci?
Che risultati possiamo garantire al clinico?
Loens K., JCM 2009
Microscopia• Retaggio del passato?• Se buon campione, una diagnosi
“probabile” di S. pneumoniae o H.influenzae può essere fatta in 30-60 min.
ESCREATO: Campioni non idonei
> 10 cell squamose/campo, <25 PMN/campo
ESCREATO: Campioni idonei
Circa il 30-50% dei campioni di pz con CAP!!
Morfotipi predominanti
Coltura• Fondamentale discriminare fra colonizzazione e infezione;( In CAP
che richiedono ospedalizzazione la coltura dovrebbe essere supportata dalla
microscopia: convincente solo se il microrganismo isolato è compatibile con la
morfologia del batterio evidenziabile nel >90% dei PMN al GRAM)
• Valutazione quantitativa:
– BAL: cutoff: 103 CFU/ml
– Brush: cutoff: 104 CFU/ml
– Escreato: cutoff: 106 CFU/ml
Necessarie informazioni cliniche!!
• Interpretazione di colture dovrebbe sempre essere coadiuvata dal “sospetto clinico”;
• Comunitaria (CAP)? Nosocomiale (HAP)? Associata a ventilatore (VAP)?
Eziologia varia in funzione:
• Tempo di ospedalizzazione• Trattamento antibiotico• Ventilazione meccanica è maggiore fattore di rischio
Si modifica la flora colonizzante
Aumento dei bacilli Gramnegativi aerobi
Tot HAP VAP VE-VAP
MSSA 16.3 10 18 20.3
MRSA 16 21.4 14.6 12.7
PSE 23.1 25.7 22.8 20.3
Acineto 19.1 21.4 20.2 10.1
Enterobat 43.8 50 43 36.7
Coronamento dell’esame colturale….
Antibiogramma
Inciso diagnostico: nuove strategie diagnostiche rapide
• Per contenere inappropriato uso di antibiotici• Per tempestiva terapia mirata, riduzione mortalità;
• Tecniche basate prevalentemente su Metodi di Amplificazione Molecolare (Real-time Multiplex, Microarray, PCR/ESI-MS spettrofotometria di massa dell’aerosol amplificato)
Inciso diagnostico: nuove strategie diagnostiche rapide
• Utili se:– Disponibili 24h/day, 7 g/wk, risultati disponibili
in poche ore;– Semplici da eseguire, point-of care– Prezzi ragionevoli;– Possibilità di evidenziare batteri resistenti– Capacità di quantificare per distinguere
colonizzazioni da infezioni;
Torniamo all’antibiogramma….
CHE COS’ E’ L’ANTIBIOGRAMMA?
L’antibiogramma è un test che permette la valutazione del profilo di sensibilitàbatterica in vitro a vari antibiotici
COME SI MISURA LA SENSIBILITA’ DEI BATTERI AGLI ANTIBIOTICI?
Determinando la minima concentrazione inibente (MIC), intesa come la più bassa concentrazione del farmaco in grado di inibire la crescita in vitro del microrganismo saggiato
Come?• Microdiluizione
• E-test
• Agar-diffusione(MIC estrapolata)
La MIC di per sé non è utile, ma deve essere comparata per esempio alla concentrazione che il farmaco può raggiungere nel sito di infezione, parametro considerato anche nella definizione dei breakpoints.
Metodi automatizzati• Noi usiamo Vitek
• Ma ci sono anche altri
MIC non precisa ma a cavallo dei breakpoint
I breakpoint servono per interpretare i saggi di sensibilità
I breakpointbreakpoint servono per interpretare i saggi saggi di sensibilitdi sensibilitàà
Saggi di sensibilità : MICSaggi di sensibilitSaggi di sensibilitàà : : MICMIC
La MIC è alla base della determinazione dei breakpoint
La MICMIC è alla base della determinazione dei breakpointbreakpoint
Il cardine di tutti i saggi di sensibilità (ovviamente dei metodi fenotipici, ma indirettamente anche degli altri) è la MIC
Il cardine di tutti i saggi di saggi di sensibilitsensibilitàà (ovviamente dei metodi fenotipici, ma indirettamente anche degli altri) è la MICMIC
MICMICMIC
Seregno, 20 dicembre 2010
Breakpoint:• Interpretazione qualitativa della MIC,
classificando il ceppo batterico come Sensibile, Intermedio o Resistente al farmaco saggiato
• Deriva dall’armonizzazione di piùinformazioni: – Distribuzione MIC dei principali microrganismi– Dati di PK/PD e modelli di simulazione– Dati di esito clinico
COME SI INTERPRETA L’ANTIBIOGRAMMA?
I valori delle MIC vengono poi rapportati a valori sogliavalori soglia ( MIC breakpointbreakpoint ) fissati da Istituzioni Scientifiche Internazionali per le diverse combinazioni microrganismo-antibiotico.
Attraverso il confronto con i breakpoint, i risultati ottenuti possono essere tradotti nelle cosiddette categorie di interpretazione:– S (sensibile)– I (intermedio)– R (resistente)
Isolati da tutti i materiali: Medicine AOUI
2010
2011
Rianimazione AOUI: isolati da RESPIRATORI (% isolati)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
2008 2009 2010
Gram- fastidiosi
Funghi f ilamentosi
Gram+
Gram- ferment
Gram- non ferment
Medicine AOUI: isolati da Respiratori
0%
20%
40%
60%
80%
100%
2010 2011
Gram- fastidiosi
Funghi filamentosi
Gram+
Gram- ferment
Gram- non ferment
Pneumococco• Problematica principale è la
resistenza a Penicillina, dovuta a modifiche del bersaglio: le PBP hanno ridotta affinità.
EARSS Report 2008
Streptococcus pneumoniae:non sensibilità alla penicillina
Streptococcus pneumoniae: isolati 2010-2011
Differenze fra CLSI ed EUCAST?
Streptococcus pneumoniae (totale isolati 42/44): sensibilità (%).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
PENICILLINA
ERITROMICINA
CLINDAMICINA
LEVOFLOXACINA
TEICOPLANINA
VANCOMICINA
LINEZOLID
trimestre 2010
trimestre 2011
POLMONITE PNEUMOCOCCICA: Breakpoint per PENICILLINA in base alla dose usata in terapia
PENICILLINA - Polmonite pneumococcica
S ≤ 0,5 mg/L R > 2,0 mg/LSe si usa dose 1.3 g x 4
POLMONITE PNEUMOCOCCICA: Breakpoint per PENICILLINA in base alla
dose usata in terapia
PENICILLINA - Polmonite pneumococcica
S ≤ 1 mg/L R > 2,0 mg/L Se si usa dose 2.4 g x 4 o 1.3 g x 6
POLMONITE PNEUMOCOCCICA: Breakpointper PENICILLINA in base alla dose usata in
terapia
PENICILLINA - Polmonite pneumococcica
S ≤ 2 mg/L R > 2,0 mg/L Se si usa dose 2.4 g x 6
AMPICILLINA - Streptococcuspneumoniae
Isolati Sensibiliad Ampicillina(MIC ≤0.5 mg/L) possonoessere riportatisensibili ad Ampicillina, Amoxicillina e Piperacillina(con o senzainibitori di Beta-lattamasi)
ECOFF ≤ 0,064 mg/L
R > 2,0 mg/LS ≤ 0,5 mg/L
CEFALOSPORINE - Streptococcuspneumoniae
Cefotaxime, Ceftriaxone, Cefepime: finoranon sono maistati riportaticeppi con MIC superiori aibreakpoint disensibilità. Se siriscontrasseroceppi con MIC superiori al Breakpoint diSensibilità ocorrefar controllare I risultati ma anchesconsigliare l’usodel farmaco.
S ≤ 0,5 mg/L R > 2 mg/L
Per questi BP può essere necessario aumentare dosaggio
MEROPENEM - Streptococcuspneumoniae
Meropenem è ilsolo farmacocarbapenemicoutilizzabile in casodi meningite. I Breakpoint in questo caso sonoS ≤0.25 mg/L e R >1 mg/L.
R > 1 mg/L S ≤ 0,25 mg/L
MEROPENEM - Meningite pneumococcica
MEROPENEM - Infezioni diverse da Meningite
S ≤ 2 mg/L R > 2 mg/L
CARBAPENEMI - Streptococcuspneumoniae
Carbapenemi: finora non sonomai stati riportaticeppi con MIC superiori aibreakpoint disensibilità. Se siriscontrasseroceppi con MIC superiori al Breakpoint diSensibilità ocorrefar controllare I risultati ma anchesconsigliare l’usodel farmaco.
S ≤ 2 mg/L R > 2 mg/L
Streptococcus pneumoniae e fluorochinoloni
Nota 2:i ceppi wild-type non sono considerati sensibili alla ciprofloxacina e sono pertanto classificati come “intermedio” (breakpoint di sensibilità per la ciprofloxacina inferiore/uguale a 0.12 mg/L)
Streptococcus pneumoniae e fluorochinoloni
Se R a Ciprofloxacina [mutazione singola]riportare un warning per i fluorochinoloni
Se R a Levofloxacina [mutazioni multiple]refertare R a tutti i fluorochinoloni
Klebsiella pneumoniae: isolati 2010-2011
Medicine Rianimazione
Klebsiella pneumoniae(totale ceppi 223/229): sensibilità (%)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
AMIKACINA
AMOX / AC-CLAV
CEFEPIME
CEFOTAXIME
CEFTAZIDIME
LEVOFLOXACINA
COLISTINA
GENTAMICINA
ERTAPENEM
IMIPENEM
MEROPENEM
PIPER+TAZOBACTAM
TIGECICLINA
TRIM.+SULFAMET
trimestre 2010
trimestre 2011
Klebsiella pneumoniae produttrice di carbapenemasiKPC: isolati da materiali Respiratori in Rianimazione
ESBL in rianimazione
ESBL in Medicina
Primi isolamenti KPC
KPC ormai quotidiana!!!
89 Klebsiella spp. 59 Enterobacter spp. (isolati non sensibili ai carbapenemi)Woodford et al., JAC 2007; 50:582
ESBL oproduzione di AmpC
+perdita di porine
Produzione di carbapenemasi a
serina(KPC, SME, IMI)
Klebsiella pneumoniaeresistente ai carbapenemi
Resistenza emergente ai carbapenemi nelle Enterobacteriaceae
Produzione dimetallo-β-lattamasi
(VIM, IMP)
EARSS 2008
Negli enterobatteri KPC-positivi,la MIC per i carbapenemi variada 0.25 mg/L a valori superiori a 32 mg/L
MBL E-Test• Striscia con due metà
– Imipenem– Impinem + EDTA
• Positivo con una riduzione di MIC in presenza del chelante– Rapporto ≥ 8– Riduzione di 3 diluizioni
Altri casi di positività del MBL E-test
KPC• K Klebsiella pneumoniae• P producing• C carbapenemase (cahos)
• Carbapenemase di classe A– Non inibita dall’EDTA
Test di Hodge modificatoDiluizione inoculo
1/10
Opzioni terapeutiche?
Pseudomonas aeruginosa isolati da materiali respiratori: % Resistenza (2010-2011)
Medicina Rianimazione
Pseudomonas aeruginosa (totale isolati 207/156): sensibilità (%)
0 20 40 60 80 100
AMIKACINA
AZTREONAM
PIPER+TAZOBACTAM
CEFEPIME
CEFTAZIDIME
CIPROFLOXACINA
COLISTINA
GENTAMICINA
IMIPENEM
MEROPENEM
POLIMIXINA B
TICAR/AC-CLAV
TOBRAMICINA
trimestre 2010trimestre 2011
Eucast
CLSI
CLSI
EUCAST
S. aureus isolato da materiali respiratori: % Resistenza (2010-2011)
Medicine Rianimazione
MRSA isolati da emocolture- AOI Verona- tutti i reparti
33,6
22,4 22,7
0
510
1520
25
3035
40
2008 2009 2010
resistenza oxacillinaMRSA isolati da emocolture ICU- AOI Verona-
48,5
29,4
37,5
0
10
20
30
40
50
60
2008 2009 2010
resistenza oxacillina
MRSA isolati da BASP-BAL- AOI Verona-
43,935,5
41,348,5
5457,7
0
10
20
30
40
50
60
70
2008 2009 2010
BASPBAL
Staphylococcus aureus (totale isolati 794/834): sensibilità (%)
0 20 40 60 80 100
OXACILLINA
LEVOFLOXACINA
CLINDAMICINA
GENTAMICINA
LEVOFLOXACINA
COTRIMOXAZOLO
ERITROMICINA
RIFAMPICINA
TEICOPLANINA
LINEZOLID
VANCOMICINA
trimestre 2010trimestre 2011
Distribuzione MIC S.aureusBP: S <=1
R: 256
Quindi in conclusione…
Quale l’approccio microbiologico?
• Fase pre-analitica (raccolta e trasporto campione)
• Fase analitica-diagnostica: se e chi è il patogeno?
• Test di Sensibilità• Epidemiologia, Resistenze e problematiche
correlate
Con la speranza di riuscire ad essere sempre più veloci!!!
Grazie per l’attenzione!
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