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IlIl metodometodo introdottointrodotto neinei primiprimi annianni ’’9090 daldal ProfProf.. JanuszJanuszPawliszynPawliszyn dell’Universitàdell’Università didi WaterlooWaterloo inin Ontario,Ontario, CanadaCanadarappresentarappresenta unauna evoluzioneevoluzione delladella tecnicatecnica SPESPE..
Microestrazione in Fase Solida Microestrazione in Fase Solida “Solid Phase Microextraction”“Solid Phase Microextraction” (SPME)(SPME)
E’ una tecnica d'estrazione/concentrazione di E’ una tecnica d'estrazione/concentrazione di contaminanti (presenti anche in tracce) in matrici contaminanti (presenti anche in tracce) in matrici solide,
liquide o gassose in soluzioni omogenee e/o in fase eterogenea, che che non richiede l'uso di solventinon richiede l'uso di solventi..
TECNICA “SOLVENT FREE”TECNICA “SOLVENT FREE”
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http://www.sigmaaldrich.com/europe/events/spme-usermeeting-italy.html
Il componente fondamentale è un piccolo segmento di Il componente fondamentale è un piccolo segmento di FIBRA DI SILICE FUSAFIBRA DI SILICE FUSA
rivestita da una pellicola (film di liquido non vol atile) simile rivestita da una pellicola (film di liquido non vol atile) simile alle fasi stazionarie usate in gascromatografiaalle fasi stazionarie usate in gascromatografia
Ripartizione dell’analita tra il campione (Ripartizione dell’analita tra il campione (soluzione, spazio soluzione, spazio
di testadi testa) ed il polimero che riveste la silice fusa ) ed il polimero che riveste la silice fusa
Questa tecnica abbastanza recente, ha acquisito Questa tecnica abbastanza recente, ha acquisito popolarità negli ultimi anni grazie a:popolarità negli ultimi anni grazie a:1. semplicità1. semplicità2. velocità2. velocità3. sensibilità3. sensibilità
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La fibra La fibra di diversa lunghezza di diversa lunghezza ((generalmente 1 cm)generalmente 1 cm)e diverso spessoree diverso spessore(generalmente diametro 100 µm(generalmente diametro 100 µm))è saldata alla parte terminale di è saldata alla parte terminale di un tubicino sottile di acciaio un tubicino sottile di acciaio all’interno di un sistema a all’interno di un sistema a “siringa” protetto da un “siringa” protetto da un rivestimento anch’esso in rivestimento anch’esso in acciaio. acciaio.
Opportuno dispositivo che comanda lo scorrimento della fibra
Il piccolo diametro e la simmetria cilindrica della fibrapermettono di incorporare la fibra stessa in un sistemache può essere utilizzato come una classica siringacromatografica
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Procedura di Estrazione Procedura di Estrazione (e preconcentrazione)(e preconcentrazione)
L’SPME prevede due processi L’SPME prevede due processi fondamentalifondamentali
Procedura di DesorbimentoProcedura di Desorbimento
1. Perforare il setto del portacampione con l’ago metallico.
2. Esporre la fibra alla soluzione (mediante spinta dello stantuffo) nella soluzione campione o nello spazio di testa per un tempo prefissato. La soluzione campione è posta sotto agitazione e, in alcuni casi riscaldata.
3. Ritrarre la fibra ed estrarre l’ago.
VIAL
Modalità di utilizzo di una fibra SPMEModalità di utilizzo di una fibra SPMEProcedura di EstrazioneProcedura di Estrazione
magnetino
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L’estrazione può essere effettuataL’estrazione può essere effettuata
esponendo la fibra nello esponendo la fibra nello spazio di testa del spazio di testa del
campione, cioè nella fase campione, cioè nella fase vapore sovrastante il vapore sovrastante il
campionecampione
Immergendo la fibra Immergendo la fibra direttamente nel direttamente nel campione liquidocampione liquido
DIRECTDIRECT––SPMESPME(sistema a due fasi)(sistema a due fasi)
HEAD SPACE HEAD SPACE --SPMESPME(Sistema a tre fasi)(Sistema a tre fasi)
Preferibile per campioni solidi o matrici liquide Preferibile per campioni solidi o matrici liquide complessecomplesse (es. acque di scarico contenenti grassi, oli, sostanze umiche, etc.) dove il maggior numero di composti interferenti potrebbero inibire i centri di adsorbimento della fibra.
Nella headspace-SPME gli analiti però devono poter essere rilasciati facilmente dal campione nello spazio di testa, devono quindi avere una certa volatilità.
HEAD SPACE HEAD SPACE --SPMESPME
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Sistema di autocampionamento
1.1. Perforare il setto Perforare il setto dell’inettore del dell’inettore del cromatografo con cromatografo con l’ago metallico.l’ago metallico.
2. Esporre la fibra 2. Esporre la fibra riscaldata al gas di riscaldata al gas di trasporto (GC) o al trasporto (GC) o al flusso di solvente flusso di solvente (HPLC) per un tempo (HPLC) per un tempo prefissato per prefissato per ottenere il ottenere il desorbimento degli desorbimento degli analiti.analiti.
3. Ritrarre la fibra ed 3. Ritrarre la fibra ed estrarre l’ago.estrarre l’ago. INIETTORE GC o HPLCINIETTORE GC o HPLC
Modalità di utilizzo di una fibra SPMEModalità di utilizzo di una fibra SPMEProcedura di DesorbimentoProcedura di Desorbimento
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In GC i composti volatili e
semivolatili possono essere
desorbiti tra 150 e 250 °C in
poche frazioni di secondo.
Per composti ad alto peso
molecolare, invece, è
possibile che si verifichino
per la fibra SPME effetti di
carry-over (effetti memoria).
La fibra comunque non
può essere riscaldata oltre i
300 °C, poichè si avrebbero
perdite di fase adsorbente.
Fibre SPMEFibre SPME
FibreFibre inin silicesilice fusafusa::
-- lunghezzalunghezza 11 oo 22 cmcm
-- chimicamentechimicamente inerteinerte
-- stabilestabile adad altaalta temperaturatemperatura (<(< 300300 °°C)C)..
LeLe fibrefibre sonosono rivestiterivestite concon unauna fasefase polimericapolimerica similesimile aaquellequelle utilizzateutilizzate perper colonnecolonne gascromatografichegascromatografiche::
-- rivestimentirivestimenti didi variavaria polaritàpolarità-- spessorispessori variabilivariabili dada 77 aa 100100 mmmm..
IlIl differentedifferente spessorespessore permettepermette didi assorbireassorbire quantitàquantitàdiversediverse didi analitaanalita sullasulla superficiesuperficie polimericapolimerica..
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DISPONIBILITA’ DELLE FIBRE PER POLARITA’
Fibre Non polariFibre Non polari
Polydimethylsiloxane (PDMS): 100 µµµµm, 30 µµµµm, 7 µµµµ
(estraggono sostanze apolari come gli idrocarburi, i BTEX (benzene, toluene, etilbenzene e xileni isomeri) e gli IPA
Fibre polariFibre polari
Polyacrylate : 85 µµµµm
Carbovax®-divinylbenzene StableFlex TM (CW-DVB): 65 µµµµm (estraggono efficacemente composti polari: fenoli, acidi carbos silici, ecc.)
Fibre BiFibre Bi--PolariPolari
PDMS-DVB StableFlex: 65 µµµµm
Carboxen TM-PDMS StableFlex: 75 µµµµm
DVB-Carboxen-PDMS StableFlex: 55 -30 µµµµm
PDMS-DVB: 60 µµµµm
La Microestrazione in Fase Solida sfrutta la possibilità di poter disporre di fibre con diverso spessore e polarità per effettuare campionamenti selettivi in funzione dei pesi molecolari, delle volatilità e delle polarità degli analiti in esame.
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110 µm
25 µm
60 µm
Scegliendo in maniera opportuna l' adsorbente (e lo spessore) è possibile eliminare le
interferenze di matrice e lo stadio di clean-up del campione, spesso necessario
nella tecnica SPE
natura natura dell’analitadell’analita
natura della natura della matricematrice
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In genere, la polarità del rivestimento dovrebbe essere confrontabile con quella dei componenti del campion e.
POLARITA’ DEI SOLUTI
Il principio su cui si basa l' SPME
è la RIPARTIZIONE
In SPME gli equilibri che si instaurano sono quelli:
ASPETTI TEORICI DELLA SPMEASPETTI TEORICI DELLA SPME
tratra l’analita nel l’analita nel campione e il campione e il rivestimento rivestimento
polimerico che polimerico che ricopre la fibra di ricopre la fibra di
silice (Directsilice (Direct--SPME)SPME)
tratra l’analita nel l’analita nel campione, la fase vapore campione, la fase vapore
sopra il campione e il sopra il campione e il polimero che ricopre la polimero che ricopre la
fibra di silice (HSfibra di silice (HS--SPME) SPME)
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Considerando un rivestimento polimerico liquido, laquantità di analita n (µg), adsorbita dal polimero èdirettamente proporzionale alla concentrazione di analitainiziale nel campione (C0) e alla costante didistribuzione (K fs) dell' analita secondo la seguenterelazione:
dove:n = massa di analita adsorbito (estratto) dal polimero in µgVf = volume del film di rivestimento sulla fibraVs = volume della soluzione sottoposta ad estrazione C0 = concentrazione iniziale (µg/mL) dell’ analita nella medesima soluzioneKfs= coefficiente di ripartizione per l’analita tra il film di rivestimento e la soluzione
n = K fs Vf C0
Se si estrae un grande volume di soluzione (VSe si estrae un grande volume di soluzione (V ss) , cosicchè ) , cosicchè Vs >> KVs >> K fsfs VVff, allora l’equazione precedente:, allora l’equazione precedente:
La quantità di analita estratto n è quindi proporzionale:-- allaalla concentrazioneconcentrazione didi analitaanalita inzialeinziale CC oo inin soluzionesoluzione
indipendenteindipendente daldal volumevolume deldel campionecampione stessostesso V s (questorende la tecnica SPME utilizzabile per misure in situ)
-- al volume di adsorbente Val volume di adsorbente V ff-- al valore del coefficiente di ripartizione Kal valore del coefficiente di ripartizione K fsfs
Vssi riduce a:si riduce a:
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Per valori elevati di KPer valori elevati di K fsfsNei casi in cui i valori di Nei casi in cui i valori di KK fsfs non risultino elevati, gli non risultino elevati, gli analiti hanno scarsa analiti hanno scarsa affinità per la fibra e non affinità per la fibra e non sono quantitativamente sono quantitativamente estratti dalla matrice.estratti dalla matrice.
All’All’ aumentareaumentare deldel volumevolume deldelfilmfilm didi rivestimentorivestimento sullasulla fibrafibra(V(Vff)) attraversoattraverso::-- aumento dello spessore del aumento dello spessore del film di rivestimentofilm di rivestimento-- aumento della lunghezzaaumento della lunghezzadella fibradella fibra..
L'L' SPMESPME haha quindiquindi delledelle limitazionilimitazioni termodinamichetermodinamiche (è(è ununmetodometodo all’equilibrio)all’equilibrio):: inin altrealtre paroleparole sese ilil coefficientecoefficiente didiripartizioneripartizione KK fSfS èè troppotroppo piccolo,piccolo, ilil metodometodo sisi rivelarivela pocopocoefficaceefficace .
Migliorare il valore di KMigliorare il valore di K fsfs attraverso attraverso
derivatizzazione degli analiti
modificazione della modificazione della matricematrice
Reazioni di derivatizzazione possono essere usate per ridurre ad esempio la polarità di composti, aumentare il valore del K fs.
La derivatizzazione può avvenire sia in soluzione, sia " drogando " la fibra con un opportuno agente derivatizzante.
Mediante l' addizione di sali Mediante l' addizione di sali (NaCI, Na(NaCI, Na22SOSO44) si può ) si può modificare la forza ionica del modificare la forza ionica del mezzo e di conseguenza mezzo e di conseguenza variare il valore di Kvariare il valore di K fsfs . .
Anche il pH del campione Anche il pH del campione gioca un ruolo importante nel gioca un ruolo importante nel processo di estrazione, processo di estrazione, soprattutto per composti polari soprattutto per composti polari dove è importante la dove è importante la ionizzazione della molecolaionizzazione della molecola..
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MatriciMatrici solidesolide (suoli(suoli oo sedimenti)sedimenti) presentanopresentano particolariparticolari
problemiproblemi poichèpoichè ii composticomposti didi interesseinteresse nonnon possonopossono
essereessere estrattiestratti direttamentedirettamente mama devonodevono essereessere primaprima
rilasciatirilasciati oo inin fasefase acquosaacquosa oo nellonello spaziospazio didi testatesta perper
essereessere poipoi preconcentratipreconcentrati sullasulla fibrafibra..
Questo processo coinvolge il desorbimento degli analiti da materiaparticellata eventualmente presente nel campione, il tras portoconvettivo in una matrice liquida o gassosa e la diffusione d egli analitiverso la fibra.
Per composti ad alto PM e con analiti che interagiscono forte mente con lamatrice, la cinetica di rilascio è lenta e il tempo di estrazi one può essere piùlungo.
Il tempo di equilibrio dipende, anche dallo spessore dello s trato disoluzione adiacente alla fibra. Una rapida estrazione si ot tiene confibre in cui lo strato adsorbente ha uno spessore di 10-100 µm .
L'equilibrio di ripartizione è di solito veloce e viene ragg iunto in menodi 1 minuto.
è controllata dal trasporto di massa dal campione alla fibraè controllata dal trasporto di massa dal campione alla fibra
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Tecnica solvent freeTecnica solvent free
SemplicitàSemplicità - La semplicità fa di questa tecnica un’efficace alt ernativa ai metodi di estrazione tradizionali.
RapiditàRapidità – L’equilibrio può essere raggiunto in soli 2-30 min uti (dipende dall’analita). Riduzione dei tempi di preparazione dei campioni fino al 70%
SensibilitàSensibilità – Si possono determinare concentrazioni dell’ordine dei ppt.
EconomicitàEconomicità – Le fibre sono riutilizzabili (il tempo di vita delle fibre dipende dalle condizioni d’uso. Comunque è stato ve rificato che in condizioni non troppo drastiche, possono essere riutilizzate p er più di 100 estrazioni) e non ci sono costi per solventi.
VersatilitàVersatilità – Le siringhe possono essere utilizzate in combinazi one con qualunque GC o GC-MS con iniettori split/splitlesso on-column e con HPLC con la possibilità di ricorrere a sistemi di introd uzione della fibra completamente automatizzati.
PRINCIPALI VANTAGGI DELL’SPME
• Campione “pulito”; non si ha contaminazione Campione “pulito”; non si ha contaminazione della fibra con la matrice.della fibra con la matrice.
• Intorno alla fibra non ci sono solventi o acqua.• Intorno alla fibra non ci sono solventi o acqua.
• L’estrazione degli analiti per assorbimento sul • L’estrazione degli analiti per assorbimento sul rivestimento della fibra è rapido.rivestimento della fibra è rapido.
Vantaggi dell’applicazione delle fibre SPME per sistemi a Spazio di Testa
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ApplicazioniAnalisi ambientali e degli alimenti, analisi di droghe,analisi cliniche etc..
� Per quanto riguarda le analisi sull' aria, la tecnica è
stata utilizzata con successo per differenziare inquinanti
presenti in fase gassosa da quelli adsorbiti su
particolato.
� L'SPME diretta con una fibra di poli(dimetil)silossano
ha trovato notevoli applicazioni nella determinazione dei
VOCs, anche a livello di tracce, in acque potabili.
��DiverseDiverse applicazioniapplicazioni riguardanoriguardano l'l' analisianalisi deidei pesticidipesticidi ee
deglidegli erbicidierbicidi.
L' SPME, come si e detto, non utilizza solventi organ ici L' SPME, come si e detto, non utilizza solventi organ ici non solo nella fase di estrazione, ma anche in quell a non solo nella fase di estrazione, ma anche in quell a dell'iniezione cromatografica, per cui si presta ben e in dell'iniezione cromatografica, per cui si presta ben e in campo ambientale per campo ambientale per analisi in situ e onanalisi in situ e on--lineline , vista , vista anche la possibilità di utilizzo di gascromatografi anche la possibilità di utilizzo di gascromatografi portatili. portatili.
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ESEMPI APPLICAZIONI SPME
VEDERE anche LIBRETTO REACH
Condizioni per l’analisi delle NitrosammineCondizioni per l’analisi delle Nitrosammine
Sample: analytes in (water + 25% KCl, pH = 10 )
SPME Fiber: 65 µµµµm polydimethylsiloxane/divinylbenzene
Extraction: immersion, 15 min (rapid stirring)
Desorption:270 °C, 1 min
Column: PTA TM-5 (amine deactivated 5% phenyl Polydimethylsiloxane),
30 m x 0.32 mm ID, 0.5 µµµµm film
Oven: 50 °C (1 min) to 250 °C at 10°C/min, hold 2 min
Carrier: helium, 30 cm/sec
Det: GC/MS (quadrupole, selected ion mo de)
Inj.: splitless, 250 °C (0.75 mm ID lin er)
ESEMPI APPLICAZIONI SPME
10 ppb Nitrosammine in Acqua:
SPME-GC/MS
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1. Nitrosodimethylamine (NDMA)
2. Nitrosodiethylamine (NDEA)
3. Nitrosomethylethylamine (NMEA)
4. Nitrosodipropylamine (NDPA)
5. Nitrosopiperidina (N-PIP)
6. Nitrosodibutylamine (NDBA)
7. Nitrosodiphenylamine (NDPhA)
Dal punto di vista chimico le nitrosammine sono deicomposti organici caratterizzati dalla presenza del gruppoN=O legato all’atomo di azoto di un’ammina secondaria e siottengono generalmente per reazione dei nitriti con leammine secondarie .
Struttura generale di una nitrosammina (R1 e R1 sono i due gruppi sostituenti)
In ambito tossicologico è molto importante il problema delle nitrosammine poiché molte di esse sono cancerogene e la loro presenza è dovuta sia ai componenti naturali degli alimenti sia all’uso di nitriti aggiunti come additivi a insaccati, prosciutti, wurstel, carni in scatola ed altri prodotti a base di carne, pesci marinati, prodotti caseari, …
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US EPA Method 524.2 VOCs: SPME/GC
1. Dichlorodifluoromethane
2. Chloromethane
3. Vinylchloride
4. Bromomethane
5. Chloroethane
6. Trichlorofluoromethane
7. 1,1-Dichloroethylene
8. Methylene chloride
9. Trans-1,2-Dichlorothylene
10. 1,1-Dichloroethane
11. 2,2-Dichloropropane
12. Cis-1,2-Dichloroethylene
13. Chloroform
14. Bromochloromethane
15. 1,1,1-trichloroethane
16. 1,1-Dichloropropene
17. Carbon tetrachloride
18. 1,2-Dichloroethane
19. Benzene
20. Trichloroethylene
21. 1,2-dichloropropane
22. Bromodichloromethane
23. Dibromomethane
24. cis-1,3-Dichloropropene
25. Toluene
26. trans-1,3-Dichloropropene
27. 1,1,2-Trichloroethane
28. 1,3-Dichloropropane
29. Tetrachloroethylene
30. Chlorodibromomethane
31. 1,2-Dibromoethane
32. Chlorobenzene
33. 1,1,1,2-Tetrachloroethane
34. Ethylbenzene
35. M-Xylene
36. p-Xylene
37. o-Xylene
38. Styrene
39. Isopropylbenzene
40. Bromoform
41. 1,1,2,2-Tetrachloroethane
42. 1,2,3-Trichloropropane
43. n-Propylbenzene
44. Bromobenzene
45. 1,3,5-Trimethylbenzene
46. Chlorotoluene
47. 4-Chlorotoluene
48. tert-Butylbenzene
49. 1,2,4-Trimethylbenzene
50. sec-Butylbenzene
51. p-Isopropyltoluene
52. 1,3-Dichlorobenzene
53. 1,4-Dichlorobenzene
54. n-Butylbenzene
55. 1,2-Dichlorobenzene
56. 1,2-Dibromo-3-chloropropane
57. 1,2,4-Trichlorobenzene
58. Hexachlorobutadiene
59. Naphthalene
60. 1,2,3-Trichlorobenzene
Condizioni Analitiche per i VOCs
Extraction ConditionsExtraction ConditionsSample: VOCs in water + 25% NaCl
SPEME Fiber: Carboxen TM/PDMS
Extraction: headspace, 40 °C (20 min) with stirring
Desorption: 5 min, 310 °C
Chromatographic ConditionsColumn: VOCOL TM, 30 m x 0.25 mm ID, 1.5 µµµµm film
Oven: 40 °C (2 min) to 210 °C at 8 °C/min
Carrier: helium, 35 cm/sec
Injection: splitless/split (closed 2 min), 0.75 mm ID liner
Detector: ion trap, GC/MS, m/z = 45 – 260 (0.6 sec/s can)
Per composti organici volatili (VOCs) la headspace-SPME si è rivelata più efficiente
della direct-SPME.
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Determinazione di benzene, toluene, xileni piridina, Determinazione di benzene, toluene, xileni piridina, limonene, naftalene, fenolo e nicotina nelle dieci marche, limonene, naftalene, fenolo e nicotina nelle dieci marche,
di sigarette più vendute in Italiadi sigarette più vendute in Italia
Parametri Analitici
Fibra SPME: PDMS/DVB
Temperatura del campione: 40°C
Tempo di esposizione: 1 min
Metodo: SPMEMetodo: SPME--GC/MS in diluizione GC/MS in diluizione isotopicaisotopica
Campionamento: un tiro di 35 mL in 2 sec
Analisi GC/MS dopo estrazione per 1 min
con SPME
Aggiunta Std marcati con
deuterio
Campionamento fumo diretto
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Curva di Calibrazione o-Xylene
Curva di Calibrazione Naphtalene
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•La fibra aveva un rivestimento di copolimero dimetilsilossano/divinilbenzene spesso 65 µm.
• Gli analiti sono stati desorbiti dalla fibra per 2 min a 250 °C
• La Temperatura della colonna era di 30°C durante il desorbimento ed è stata poi aumentata di 10 °C min.
• La colonna era di 0.32 mm x 30 m, con uno strato di 1 µm di fenilmetilpolisilossano.
• Il rivelatore per azoto-fosforo aveva un limite di rivelabilità di 0.05 ppb.
Gascromatogramma di agenti nervini, campionati medi ante microestrazione in fase solida per 30 minuti da acqua di mare.
ANALISI DI AMFETAMINE IN URINA TRAMITE GAS CROMATOG RAFIA
Introduzione dl campione tramite desorbimento di SPME
Introduzione di campione gassoso prelevato tramite una siringa
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MiglioramentoMiglioramento nella costruzione delle fibre nella costruzione delle fibre
per aumentarne le prestazioni.per aumentarne le prestazioni.
MiglioramentoMiglioramento nella copertura delle fibre SPME per nella copertura delle fibre SPME per
migliorarne le variabili attraverso:migliorarne le variabili attraverso:
-- controllo della porositàcontrollo della porosità
-- ottimizzazione del processo di condizionamentoottimizzazione del processo di condizionamento
SviluppoSviluppo di nuove fasi per la copertura delle fibre (la messa a di nuove fasi per la copertura delle fibre (la mes sa a
punto di fibre con fase a scambio ionico potrà punto di fibre con fase a scambio ionico potrà
costituire un valido strumento per l'estrazione dicostituire un valido strumento per l'estrazione di
specie anche metalliche).specie anche metalliche).
http://www.sigmaaldrich.com/europe/events/spme-usermeeting-italy.html
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