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C.I. MEDICINA DI LABORATORIO
MICROBIOLOGIA CLINICACL MEDICINA E CHIRURGIA – AA 2014-2015
Modulo 6: Diagnosi microbiologica delle
infezioni del sistema nervoso
Giovanni Di Bonaventura, PhD
Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara
Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel 0871 3554812)
Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel 0871 541519)
E-mail: gdibonaventura@unich.it
Sistema nervosoOrganizzazione
• Sistema Nervoso Centrale (SNC): encefalo e
midollo spinale
• Sistema Nervoso Periferico (SNP): nervi periferici
• Fisiologicamente sterile:
– assenza di flora “autoctona”
• Difese naturali del SN:
– cranio e vertebre
– cellule di microglia e macrofagi
– presenza di una Barriera Emato-Encefalica (BEE) e
della Barriera Emato-fluido cerebrospinale (BECS)
che impediscono l’accesso cerebrale/meningeo a:
• microrganismi
• farmaci (es. antibiotici)
• sistema immune
Sistema NervosoInfezioni
• Infezioni del SNC:
– Meningiti (acute o croniche)
– Encefaliti (acute o croniche)
– Ascessi cerebrali
• Infezioni del SNP:
– Tetano
– Sindrome Guillian-Barrè
– Botulismo
MeningiStruttura ed organizzazione
3 membrane connettivali (nell’insieme
costituiscono la barriera emato-encefalica) a
rivestimento del cervello e della colonna
vertebrale:
– Dura madre
• doppio strato: il primo a contatto con il
periostio; l’altro, a contatto con le meningi
(decorre attraverso il foramen magnum,
copre CN’s)
– Aracnoide
• tesa a ponte sopra i solchi cerebrali
• granulazioni aracnoidali che si proiettano nei
seni venosi, (dove il liquor diffonde verso il
torrente ematico)
• spazio subaracnoidale occupato dal liquor
cefalo-rachidiano
– Pia madre
• delicata, altamente vascolarizzata
• a contatto con il cervello e la colonna
vertebrale
Con il rachide, le meningi delimitano tre spazi:
vertebra < spazio EPIDURALE < dura madre
dura madre < spazio SUBDURALE < aracnoide
aracnoide < spazio SUBARACNOIDALE < pia madre (contiene il liquor; sede
specifica di esordio della meningite)
Ciascuno di questi spazi è sede di infezioni distinte
MeningiSpazi meningei
I villi estremamente vascolarizzati della pia
madre si proiettano in 4 ventricoli
all’interno dell’encefalo e sono rivestiti da
cellule epiteliali ependimali.
Queste proiezioni, note come plessi
coronoidei, sono i siti nei quali la
componente fluida del sangue è
modificata attraverso secrezione e
assorbimento di certi soluti e convogliata
all’interno dei ventricoli sotto forma di
liquido cefalorachidiano (LCR) o liquor
(adulti: 400-600 ml/die; volume totale: 40-
60 ml nei neonati e 100-160 ml negli
adulti).
Il liquor circola nei ventricoli e nello
spazio subaracnoidale, attorno
all’encefalo ed alla corda spinale e ritorna
al sistema circolatorio sanguigno
attraverso i villi subaracnoidali che
proiettano nel seno sagittale superiore
nella volta interna del cranio.
Meningite: definizione e tipologia
Definizione
La meningite è definita come l’infiammazione delle meningi: pachimeningite
(dura madre), leptomeningite (pia madre, aracnoide). Se severa, può evolvere in
encefalite, stato infiammatorio del cervello. Può essere causata da agenti infettivi,
metastasi, agenti chimici e/o farmaci.
Tipologia
FULMINANTE: evoluzione rapida (coma, shock), quasi sempre irreversibile.
ACUTA: esordio e sviluppo nel corso di ore o di pochi giorni.
SUBACUTA: decorso lento e insidioso, con segni meningei sfumati (solitamente
causata da bacillo tubercolare oppure da miceti).
RICORRENTE: ripetuti episodi anche a distanza che sono espressione
generalmente di un difetto dell'ospite, o dell'anatomia locale oppure delle difese
antibatteriche immunologiche (trauma cranico, pazienti HIV+, ecc).
DECAPITATA: forma il cui decorso è attenuato per il precoce intervento con
terapia antibiotica (N. meningitidis; alta frequenza di falsi negativi al colturale).
Meningitepatogenesi
I microrganismi debbono superare la barriera morfo-funzionale (emato-liquorale,
emato-encefalica, meningo-encefalica) posta a protezione di LCR e SNC:
– via ematogena (batteriemia, viremia): la più frequente
– per contiguità:
• da focolai infettivi parameningei (otiti, sinusiti, mastoiditi, ascessi cerebrali) attraverso la
lamina cribrosa etmoidea, la guaina olfattoria, plessi corioidei, i vasi ematici/linfatici;
• comunicazioni anomale post-chirurgiche e traumatiche fra gli spazi subaracnoidali e siti
colonizzati (naso e seni paranasali, secondaria a frattura della base cranica);
• drenaggio di LCR;
– per contagio diretto: rachicentesi, ferite penetranti, traumi cerebrali aperti, fratture,
interventi neurochirurgici
Site all’interfaccia tra circolo sistemico e parenchima cerebrale, le leptomeningi - ed in
particolare gli spazi di Virchow-Robin - rappresentano il principale sito di
ingresso dei microrganismi.
Il liquor è veicolo di diffusione dell’infezione che, se non contrastata, si estende al
parenchima cerebrale (meningo-encefaliti).
Le forme PRIMARIE, si sviluppano in assenza di infezioni extra-cerebrali.
Nelle forme SECONDARIE, l’infezione diffonde per contiguità dai foci infettivi
parameningei, o per metastasi da foci situati a distanza (tifo, polmonite,tubercolosi).
Photomicrograph (original magnification, x20; hematoxylin-eosin stain) of a
coronal section through the anterior perforated substance shows two arteries
(straight arrows) with surrounding VR spaces (curved arrows).
Epitelio mucosale
IgA seceretorie
Attività ciliare
Abs anti-capsulari
Complemento
Abs specifici
BEE
ridotti livelli di fagociti e IgG
ridotta attività opsonizzante
Fimbrie (pili)
Capsula
Proteasi vs IgA
(pneumococco)
Endocitosi (menigococco)
Rottura tight-junctions epitelio
colonnare (H. influenzae)
Recettori specifici (H.
influenzae, N. meningitidis)
Fimbrie (pili)
Associazione con
monociti
Capsula
Meningite batterica: patogenesi
Meningiteeziologia
• Le meningiti batteriche vengono indicate con il termine “meningiti
purulente” (a liquor purulento)
• Le meningiti non batteriche, ad esempio quelle virali, vengono
indicate come “meningiti asettiche” (a liquor trasparente)
– Il liquor risulta trasparente anche in caso di infezione da M. tuberculosis, Funghi,
Leptospira
• La causa più frequente di meningite è una infezione virale che
generalmente si risolve in assenza di trattamento.
• Le meningiti batteriche sono meno frequenti ed estremamente più
gravi (vs virali); possono causare exitus o danno cerebrale anche in
presenza di trattamento.
• Altri agenti eziologici: parassiti, Chlamydia spp, Mycoplasma spp,
Spirochete, Rickettsiae.
Meningite batterica epidemiologia Incidenza: 1 milione di casi/anno (mondo); 3-12 casi/100.000 persone/anno (Italia)
Mortalità: 5% negli adolescenti, 25% nei neonati e negli adulti
Fattori di rischio: età, gravidanza, ambienti comunitari, immunocompromissione
Trattamento disponibile: terapia antibiotica (“mirata” vs l’agente eziologico)
Reservoir: uomo
Eziologia: dipendente dall’età del paziente; tuttavia, le meningiti pneumococciche sono le più
comuni (6.000 casi/anno) ed associate al più alto tasso di mortalità (20-30%):
1. neonati (< 1 mese):
bacilli Gram-negativi (E. coli K1) (50-60%)
streptococchi gruppo B (Streptococcus agalactiae) (20-40%)
Listeria monocytogenes (2-10%)
2. bambini e ragazzi fino a 15 anni:
Neisseria meningitidis (25-40%; max incidenza nel 1° anno di vita)
Streptococcus pneumoniae (10-20%)
Haemophilus influenzae tipo b (25-40%; in declino, per vaccinazione)
3. adulti (anziani, immunocompromessi):
Streptococcus pneumoniae (30-50%)
Neisseria meningitidis (10-35%) (causa principale di fenomeni epidemici)
Staphylococcus aureus (5-15%)
bacilli Gram-negativi (anziani) (1-10%)
Meningite da anaerobi: associata a foci contigui di infezione (otite, sinusite, faringite, ascesso
cerebrale, tumori testa/collo, interventi chirurgici o ferite infette, post-trauma, post-operatorio
neurochirurgico).
A
B
C
D
E
F
Principali agenti eziologici di
meningite batterica:
A. Escherichia coli K1
B. Streptococcus agalactiae
C. Listeria monocytogenes
D. Neisseria meningitidis
E. Haemophilus influenzae
F. Streptococcus pneumoniae
Meningiti virali (“asettiche”)
• Decorso meno grave della meningite batterica: benigno a
risoluzione spontanea
• Sindrome caratterizzata da comparsa acuta di sintomi
meningei (febbre, cefalea, fotofobia) ma senza rigidità nucale
• La meningite asettica può avere varia eziologia, sebbene più
frequentemente causata da un agente virale:
– M. tuberculosis
– Funghi
– Leptospira
• Aspetto del liquor: trasparente, mai purulento
• Cellularità del liquor: pleiocitosi (inizialmente mista neutrofilo-
mononucleare, quindi linfomonocitica)
Meningite viraleepidemiologia
Incidenza: 1 milione di casi/anno (mondo); 5-35 casi/100.000 persone/anno (Italia)
Mortalità: decorso meno grave della meningite batterica: benigno a risoluzione
spontanea
Fattori di rischio: età, gravidanza, ambienti comunitari, immunocompromissione
Trasmissione: principalmente interpersonale, ma anche vettori animati (artropodi) per
Arbovirus.
Incubazione: Variabile: 3-6 gg (Enterovirus), 2-15 giorni (Arbovirus)
Trattamento disponibile: generalmente ad autorisoluzione.
Reservoir: uomo (Enterovirus, Adenovirus, Morbillivirus, Herpes Simplex, Varicella) o
naturale (uccelli per Arbovirus)
Eziologia: le meningiti da Enterovirus sono le più comuni (85%):
Enterovirus (Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus)
Herpesvirus (HSV 1/2, Varicella-zoster, Epstein Barr, ytomegalovirus).
Togavirus (Eastern equine, Western equine, Venezuelan equine; St. Louis,
Powasson, California, West Nile)
Mixo/paramyxovirus (Influenza/parainfluenza, Parotite, Morbillo)
Miscellaneous (Adenovirus, LCM, Rabbia, HIV)
Gli Enterovirus rappresentano la forma più frequente di
meningite asettica stagionale
Meningite viraleepidemiologia
Meningite virale: patogenesi
Colonizzazione
mucosa nasale
Sede
intracellulareviremia nervi
olfattivi
BEE
Sopravvivenza
nel SNC
• Fattori virali:
– Dimensione inoculo
– Virulenza del
microrganismo
– Neurotropismo
(rabbia, HSV tipo I)
Infezioni del SNCMeningite: diagnosi clinica
Insieme di segni/sintomi presenti indipendentemente dalla
natura eziologica dell’infezione:
Infezioni del SNCMeningite: diagnosi di laboratorio
• Il sistema nervoso attua strategie atte a limitare l’infiammazione, perché i suoi
effetti potrebbero essere più deleteri dell’agente patogeno che l’ha innescata.
• Le infezioni del SNC, la meningite in particolar modo, rappresentano una vera
emergenza medica. Debbono quindi essere:
– riconosciute tempestivamente
– correlate, possibilmente, con l’agente patogeno
– trattate immediatamente sulla base della eziologia
• Il maggior contributo alla diagnosi eziologica è sicuramente dato dallo
studio microbiologico del LCR. L’esame microbiologico si basa sulla ricerca
diretta dell’agente infettivo (esame microscopico, ricerca di antigeni
batterici/fungini, amplificazione genica), sugli esami colturali del liquor che
vanno di norma associati alla contemporanea esecuzione dell’emocoltura ed
alla ricerca della risposta anticorpale antimicrobica.
• Il sospetto di meningite richiede quindi il prelievo di LCR mediante esecuzione
della puntura lombare, anche in presenza di sintomatologia sfumata.
• L’analisi di base del LCR si effettua in urgenza ed il laboratorio svolge
un ruolo fondamentale.
Analisi del liquor cefalorachidianoPercorsi pre-analitici
• LCR è un materiale biologico molto prezioso: il prelievo, l’utilizzo e la
sua conservazione debbono essere previamente ed accuratamente
concordati tra il Clinico ed il Laboratorio per fare in modo che le procedure
analitiche abbiano inizio immediatamente dopo il prelievo del campione.
• La raccolta andrebbe effettuata, quando possibile, prima dell’inizio della
terapia antibiotica poiché essa:
– modifica il significato diagnostico di varie tecniche
– interferisce con l’isolamento colturale: false negatività
In caso contrario, bisogna avvertire il Laboratorio affinchè si possano
mettere in atto procedimenti in grado di minimizzare gli effetti inibitori sui
microrganismi (resine che rimuovono gli antibiotici, aumento dei volumi
colturali e di liquor per diluire l’effetto inibente)
• E’ necessario segnalare la sede di prelievo (lombare, ventricolare,
cistico), poiché i valori di riferimento sono, di norma, attribuiti al liquor
lombare.
Prelievo di LCRpuntura lombare (rachicentesi)
• Operare in asepsi: accurata disinfezione della cute
nella regione di prelievo
• Il paziente viene invitato a sdraiarsi su un fianco
incurvandosi in avanti per separare i processi spinosi
delle vertebre lombari
• Inserimento ago nel canale spinale generalmente tra
L3-L4, ma anche L4-L5 o L5-S1
• Il liquor può anche essere ottenuto dal ventricolo,
cisterna o fontanelle, o dal drenaggio di riserva
• Prelievo LCR (pressione > 600 mm Hg: fuoriuscita
“spontanea”)
Fase pre-analiticaRaccolta del LCR
E’ consigliabile prelevare 3 campioni, numerati sequenzialmente: #1 per chimica-
fisica, #2 per coltura e molecolare, #3 per microscopia e ricerca Ag.
• Standardizzare il volume da prelevare:
– media: 9-12 ml (3-4 ml/provetta; minimo 2 ml); max vol prelevabile (adulto): 15-20 ml
– raccolta in provette sterili, fondo conico, con tappo a vite (siliconate, per evitare
l’adesione dei monociti alle pareti), numerando i campioni in maniera sequenziale
– possibilità di confrontare diversi prelievi (intra- inter-paziente)
– volumi maggiori o campioni ripetuti per ricerca di M. tuberculosis o funghi
• Evitare contaminazione ematica e/o cutanea (principale causa di errore pre-analitico):
– contaminazione ematica: generalmente secondaria al trauma da puntura lombare
(diminuzione tracce ematiche dal 1o al 3o campione); non processare il campione in
presenza di massiccia contaminazione (inibitori di crescita batterica e/o PCR)
– il 3° campione è destinato al colturale (meno soggetto a contaminazioni cutanee)
• Seminare, al momento stesso del prelievo, parte del liquor in 2 flaconi (aerobi e
anaerobi) per emocoltura
Fase pre-analiticaRaccolta di altri campioni
• Prelevare contestualmente anche campioni di sangue per:
– indagini biochimiche e sierologiche (emocromo per leucocitosi neutrofila)
– emocoltura per ricerca di funghi/batteri indicanti una sottostante infezione sistemica
– diagnostica sieroimmunologica
• Tamponi: i tamponi (nasale, faringeo e vescicolare) devono essere trasportati tramite
apposito terreno per la ricerca dei virus e batteri.
• Feci: le feci, per l’eventuale ricerca di enterovirus, devono essere raccolte in contenitori
sterili.
Fase pre-analiticaTrasporto del campione
• Inserire i campioni in un contenitore rigido di plastica a chiusura ermetica
(trasporto in “sicurezza biologica”)
• Inviare i campioni in laboratorio entro 15-30 min (max 2 h) dal prelievo:
– ipotonicità del liquor causa la lisi dei neutrofili
– diminuzione della vitalità batterica: 32% dopo 1 h, 50% dopo 24 h
• Trasportare a temperatura ambiente, evitando la refrigerazione:
– N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae sono organismi “esigenti” che non
potrebbero sopravvivere a lunghi tempi di trasporto od a variazioni di temperatura
(microrganismi termosensibili)
– è consigliabile congelare il campione, residuo dalla esecuzione dell’esame colturale
e microscopico, per indagini successive (ricerca virus, mediante PCR)
– trasporto in contenitori privi di ossigeno per la ricerca/coltura di anaerobi (utilizzo
del flacone emocolturale per “anaerobi”)
Diagnosi di meningiteFase analitica
Il campione di LCR viene quindi sottoposto alle seguenti indagini:
Esame MACROSCOPICO (colore, aspetto, surnatante)
Esame MICROSCOPICO (colorazioni per microrganismi; citometria)
Esame CHIMICO-FISICO (protidorrachia, glicorrachia, pressione, etc.)
Se eziologia BATTERICA:
1. Ricerca di ANTIGENI BATTERICI
2. Isolamento COLTURALE ed ANTIBIOGRAMMA
Fase analitica Caratteristiche macroscopiche del LCR
ASPETTO:
Grado di torbidità: limpido (“acqua di roccia”), opalescente, torbido
Sulla base dell’aspetto del liquor, le meningiti sono classificate in:
meningiti a liquor limpido (opalescente, ma mai purulento,
smerigliato per pleiocitosi). Eziologia prevalentemente virale, ma
anche batterica (tubercolare, Brucella, Salmonella, Leptospira,
Listeria) o protozoaria (Toxoplasma, Trypanosoma).
meningiti a liquor torbido (purulento, fuoriesce ad alta
pressione). Indicativo di eziologia batterica, fungina (Candida,
Mucor), protozoaria (Naegleria, Acanthamoeba).
PRESENZA DI SANGUE O COAGULO:
La presenza di globuli rossi nel LCR può essere conseguente a:
emorragia intra-cerebrale o sub-aracnoidea (presenza uniforme
dei globuli rossi in tutti i campioni sequenziali da 1 a 3);
traumatismo da rachicentesi con contaminazione di sangue
periferico (riduzione dei conteggi sequenziali)
presenza di coagulo (coagulo “a ragnatela” nella meningite
tubercolare)
Fase analiticaCaratteristiche macroscopiche del LCR
COLORE:
incolore
xantocromico: giallo-arancio (ricco di proteine, bilirubina)
eritrocromico: contaminazione ematica (lesione subaracnoidea)
ASPETTO SOPRANATANTE (a seguito di centrifugazione):
xantocromico, colorazione giallognola nel sopranatante del
centrifugato (indica emorragia subaracnoidea)
trasparente e privo di colorazione (indica rachicentesi
traumatica)
LCR eritrocromico
LCR xantocromico
Fase analiticaEsame microscopico
Conteggio cellulare, sul campione non centrifugato, preferibilmente sull’ultimo
prelevato, utilizzando una camera di conteggio. I conteggi non devono essere
eseguiti su campioni con coagulo:
conta dei leucociti totali
conta differenziale dei leucociti: polimorfonucleati (PMN) vs mononucleati (LINF),
eseguita su conteggio totale > di 5x106 leucociti/litro.
conta eritrociti eseguita su due campioni, in caso di sospetta emorragia
Una pleiocitosi polinucleata indica una eziologia batterica, mentre una pleiocitosi
mononucleata indica una eziologia virale.
La meningite virale o tubercolare, associate generalmente a linfocitosi del LCR,
presentano nelle fasi precoci dell’infezione una predominanza liquorale neutrofila.
Bisogna inoltre ricordare che: i pazienti neutropenici non sono in grado di produrre efficienti o caratteristici polimorfonucleati od una
risposta di tipo neutrofilo nel LCR
in pazienti con shock settico e complicanze sistemiche si hanno basse conte cellulari
Fase analiticaEsame microscopico
LCR, pleiocitosi neutrofila LCR, pleiocitosi mista neutrofila/linfocitaria
LCR, pleiocitosi linfocitaria
Fase analiticaEsame microscopico
Ricerca di microrganismi mediante osservazione microscopica, eseguita sul
pellet ottenuto dopo centrifugazione del liquor si basa sulle seguenti colorazioni:
Gram:
diplococchi Gram- (N. meningitidis), diplococchi Gram+ (S. pneumoniae), coccobacilli
Gram- (H. influenzae)
sensibilità: 60-80% in assenza di terapia antibiotica; 40-60% nei pazienti in
trattamento. Sensibilità ridotta (23-36%) in caso di L. monocytogenes per scarsa
carica batterica.47
specificità per N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae: 97-98.5%.
può essere l’unica evidenza laboratoristica per meningite: 4% di 875 pazienti in uno
studio danese.35
blu di metilene (morfologia cellulare)
inchiostro di china (capsula di C. neoformans)
Ziehl-Nielsen e auramina-rodamina (micobatteri)
arancio di acridina (batteri e miceti):
fluorocromo che si intercala nella struttura dell’acido nucleico
alta sensibilità ma non differenzia Gram+ vs Gram-
Fase analiticaEsame microscopico
LCR, colorazione Gram. A) Streptococcus pneumoniae; B) Neisseria
meningitidis; C) Haemophilus influenzae; D) Escherichia coli.
A B
C D
Fase analiticaEsame microscopico
LCR. A) Colorazione inchiostro India: capsula di Cryptococcus neoformans; B) Colorazione
auramina-rodamina: Mycobacterium tuberculosis; C) Colorazione arancio di acridina:
Staphylococcus aureus; D) Colorazione blue di metilene: Neisseria meningitidis.
A B
C D
Fase analiticaEsame chimico-fisico
L’esame chimico-fisico viene effettuato previa centrifugazione e rimozione del
surnatante, poiché le cellule - lisandosi con il tempo - libererebbero il loro
contenuto proteico in sospensione:
[glucosio]: (ipoglicorrachia), (iperglicorrachia)
Ipoglicorrachia (infezioni batteriche, fungine, tubercolari). L. monocytogenes:
ipoglicorrachia soltanto nel 20% dei casi.
[glucosio]liquor / [glucosio]sangue < 0.25 (infezioni batteriche).
Normoglicorrachia (infezioni virali)
[proteine]: (ipoprotidorrachia), (iperprotidorrachia)
Forte iperprotidorrachia, proteina C-reattiva (infezioni batteriche)
Moderata iperprotidorrachia (infezioni virali)
Aumentata iperprotidorrachia (infezioni fungine, tubercolari)
[LDH]liquor, LDH (infezioni batteriche)
Esame del sedimento: previa colorazione con May-Grunwald-Giemsa per lo
studio delle caratteristiche morfologiche e strutturali.
LCR: caratteri chimico-fisici e cellulari
Eziologia
Parametro
(valore fisiologico adulto)Batterica Virale
Fungina, Tubercolare,
Leptospira
Pressione
(35-45, seduto/15-20 cm H2O,
dec. laterale)
> 300 mm 200 mm 300 mm
GB
(0-5 x 106/L)200-20.000 100-1.000 < 500
%PMN
(0)> 80% 1-50% 1-50%
Glucosio
(45-85 mg/dL)< 45 ↓ 45-85 < 45 ↓↓
Proteine
(15-45 mg/dL)> 100 < 100 > 100
Lattato
(mg/dl)> 30 0 0
Gram + - -
Citologia - - +
Aspetto
(limpido, incolore)purulento limpido limpido/smerigliato
Fase analiticaRicerca di antigeni batterici Costosi e di controversa affidabilità, tali tests dovrebbero essere utilizzati su LCR
SOLO in caso di conteggi anomali di cellule (immunodeficienza con deficit GB), di
esame negativo al Gram e quando LCR e le emocolture permangono negative
per oltre 48 ore (pregressa antibiotico-terapia).
Il Clinico deve essere informato che sebbene una positività al lattice possa indicare la
presenza di un agente infettivo, un risultato negativo non può essere considerato
come “finale”.
Tests al lattice: consentono la diagnosi eziologia in quanto i batteri che comunemente
causano meningite presentano sulla loro superficie antigeni di natura polisaccaridica
che possono essere rilevati dal latex test. Vengono ricercati gli antigeni solubili
polisaccaridici specifici di:
– Streptococcus pneumoniae
– Haemophilus Influenzae di tipo b
– Neisseria meningitidis (gruppi A, B, C, Y/W135)
– Esherichia coli (gruppo K1)
– Streptococcus agalactiae (streptococco beta-emolitico di gruppo B)
– Cryptococcus neoformans
Test immunocromatografico: elevata sensibilità per la ricerca dell’antigene solubile di
S. pneumoniae nel liquor o nelle urine.
Fase analiticaEsame colturale
Rappresenta il gold standard per la diagnosi della meningite batterica.
Si effettua sul centrifugato di LCR, per la ricerca di:
– aerobi: N. meningitidis, H. influenzae,S. pneumoniae, stafilococchi
– la ricerca di anaerobi è importante nelle meningiti post-neurochirurgiche o shunt
cerebrali-related
– ricerche particolari: miceti (C. neoformans), M. tuberculosis, amebe
Sensibilità: 67-85%, in assenza di terapia antibiotica:35,50
La sensibilità viene ridotta in presenza di trattamento all’atto della rachicentesi:
– da 66 a 62% 35
– da 88 a 70% oppure 59% se in terapia da più di 1 giorno 235
– da 19 a 11% nella meninigite meingococcica 260
35. Bohr, V., et al. 1983. 875 cases of bacterial meningitis: diagnostic procedures and the impact of preadmission antibiotic therapy. Part III of a three-part series. J. Infect. 7:193–202.
50. Bryan, J. P., et al. 1990. Etiology and mortality of bacterial meningitis in northeastern Brazil. Rev. Infect. Dis. 12:128–135.
235. Nigrovic, L. E., et al. 2008. Effect of antibiotic pretreatment on cerebrospinal fluid profiles of children with bacterial meningitis. Pediatrics 122:726–730.
260. Ragunathan, L., et al 2000. Clinical features, laboratory findings and management of meningococcal meningitis in England and Wales: report of a 1997 survey. Meningococcal meningitis:
1997 survey report. J. Infect.40:74–79.
Meningite battericadiagnosi microbiologica Amplificazione genica (PCR) su sangue e liquor: utilizzata per la ricerca diretta di batteri
(Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Listeria
monocytogenes ) e virus.
• I saggi di PCR sono disponibili come possibilità diagnostica per alcuni microrganismi quali:
Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae e particolarmente
utili quando l’esame colturale risulta negativo (ad esempio quanto il LCR risulti torbido e sia stata
somministrata chemioterapia). Allo stato attuale delle conoscenze tutte le metodiche molecolarI
basate su amplificazione genica per la messa in evidenza di target batterici in campioni di LCR
devono essere considerate di impiego esclusivamente epidemiologico, mancandone l’adeguata
validazione clinica.
• I test di amplificazione genica (PCR) sul liquor sono soprattutto utilizzati nella diagnosi di
meningite-encefalite virali. L’interpretazione del test deve tener conto di terapie virali precoci in
grado di determinare risultati falsamente negativi.
• Nei casi di probabile meningite/encefalite virale (Tabella 5) è raccomandata la ricerca nel liquor
del genoma di: enterovirus, HSV-1, HSV-2 e VZV.
• Nel caso in cui la ricerca del genoma di HSV risulti negativa in presenza di sospetto clinico e
risonanza magnetica positivi per encefalite erpetica è consigliata la ripetizione del LCR dopo 3-7
giorni per un’ulteriore valutazione molecolare. In presenza di vescicole cutanee o mucose
effettuare ricerche colturali o molecolari per HSV e VZV su tampone cutaneo/mucoso. Un risultato
positivo non indica necessariamente che il microrganismo isolato sia l’agente eziologico
dell’encefalite/meningite, così come un risultato negativo non lo esclude.
• Nel sospetto clinico di infezione da Enterovirus ricercare il virus nel tampone faringeo o nelle feci
mediante isolamento in coltura e metodiche molecolari. L’eventuale positività deve essere
interpretata con cautela: nei bambini piccoli la positività nelle feci può essere dovuta a ceppi
vaccinici.
Meningitediagnosi di laboratorio: ricerca diretta
PCR assay. Amplificazione gene
proteina b (419bp) di M. tuberculosis
su gel agarosio 1.5%.
Lane 1: 100bp DNA marker
Lane 2: CTRL +
Lanes 3,4,5: CSF positivi
Lane 5: CTRL -(Sharma et al, Neurol India 2010)
Colonie di N. meningitidis su
agar cioccolato
Ricerca rapida di antigeni. Tests
di agglutinazione.
Costi e tempi di esecuzione
Test Tempo Costo (euro)
Glucosio <1 h 4
Proteine <1 h 2
Conta GB <1 h 27
Gram 2 h 8
Coltura 5 gg 20
Latex test <1 h 130
La puntura lombare non è esente da rischi: la complicanza più temuta è
‘l’incuneamento’, che si verifica quando le tonsille cerebellari erniano attraverso il
foramen magnum del cranio, comprimendo le strutture cerebrali vitali del peduncolo. Ciò
accade più facilmente in presenza di lesioni cerebrali espanse o di pressione
intracranica aumentata.
Pertanto, i pazienti con sospetto clinico di aumentata pressione intracranica non
dovrebbero essere sottoposti a puntura lombare, mentre quelli con segni neurologici di
lesioni localizzate dovrebbero essere sottoposti a TC prima di altre procedure volte ad
escludere una lesione.
Talvolta il paziente è in condizioni troppo instabili o presenta diatesi emorragica come
risultato di una sindrome settica ed anche in queste condizioni non può essere
sottoposto a puntura lombare.
Nei pazienti con controindicazione alla puntura lombare, si deve conseguire il massimo
impegno per definire la diagnosi microbiologica con ogni altra modalità:
Urine (antigeni batterici)
Markers infiammatori sierici: aumentati livelli di procalcitonina (>=0.5 ng/ml) e
proteina C-reattiva (>=20 mg/l) depongono a favore di una eziologia batterica.
Biopsia cutanea e tampone naso-faringeo: in caso di meningite meningococcica.
Diagnosi di meningite... in assenza di LCR
Markers infiammatori sierici:
Indicano la eziologia dell’infezione (batterica vs virale).84
PCT (0.5 ng/ml), proteina C-reattiva (20 mg/l): eziologia batterica.93
Elevate concentrazioni sono suggestive sebbene non sufficienti per porre diagnosi
di meningite batterica.
Biopsia cutanea:
Campione prelevato mediante biopsia, scraping o aspirazione
colorazione Gram: sensibilità 0.5%192-36%12
isolamento colturale
La accuratezza dell’esame delle lesioni cutanee non è inficiata dalla
presenza di una terapia antibiotica in atto. 12,325
Diagnosi di meningite... in assenza di LCR
12. Arend, S. M., et al. 2006. Prospective controlled study of the diagnostic value of skin biopsy in patients with presumed meningococcal disease. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 25:643–649.
84. De Cauwer, H. G., et al. 2007. Differential diagnosis between viral and bacterial meningitis in children. Eur. J. Emerg. Med. 14:343–347.
93. Dubos, F., et al. 2008. Serum procalcitonin level and other biological markers to distinguish between bacterial and aseptic meningitis in children: a European multicenter case cohort study.
Arch. Pediatr. Adolesc. Med. 162:1157–1163.
192. Levy, C., et al. 2008. Characteristics of meningococcal meningitis in children in France. Arch. Pediatr. 15(Suppl. 3):S105–S110.
325. van Deuren, M., et al. 1993. Rapid diagnosis of acute meningococcal infections by needle aspiration or biopsy of skin lesions. BMJ 306:1229–1232.
Meningite meningococcica.
Rash petecchiale
• ASPETTO: aspetto del LCR ed (eventuale) presenza di coaguli
• MICROSCOPIA
• Conteggio cellulare
– numero di GR (x106 per litro) e
– numero di PMN e linfociti (x 106 per litro), oppure
– numero di PMN e linfociti (% conteggio totale dei GB, riferito a x 106)
– in alcuni casi può essere opportuno fare riferimento al citocentrifugato per la
differenziazione delle cellule mononucleate e delle altre cellule
• Colorazione Gram
– descrizione del(dei) microrganismo(i) osservato(i)
– descrizione dei funghi dotati o meno di capsula (colorazione con inchiostro
d’India o nigrosina
– microscopia per specie Mycobacterium e parassiti
• COLTURALE
– descrizione microrganismi isolati, oppure
– indicazione di assenza di crescita
– risultati delle prove supplementari per ID
Esame LCRrefertazione
Meningiti fungine
Rare e di difficile diagnosi
Cryptococcus neoformans (causa più frequente), Coccidioides immitis
(Messico, America meridionale)
Invade il sangue e raggiunge il cervello soprattutto nell’ospite con immunità
cellulo-mediata compromessa (AIDS; immunosoppressi)
Quadro liquorale: pleiocitosi linfocitaria, aumento quoziente albumina
Identificazione mediante colorazione della capsula (India ink): solo per C.
neoformans
Isolamento colturale
E’ raccomandabile l’utilizzo di volumi maggiori di liquor (almeno 4 ml) per
l’allestimento del vetrino e per la coltura
Ricerca di antigeni + ricerca anticorpale nel LCR per monitorare l’efficacia
della terapia:
aumentati livelli di Abs specifici + ridotta presenza di antigeni = terapia efficace
Ricerca di materiale genico: PCR, non ancora standardizzata
C. neoformans su agar sangue: colonie
didimensioni piccole/medie, con aspetto
mucoide dovuto alla produzione di una
capsula polisaccaridica.
Round
capsulated
fungal organisms
Lymphocytic
infiltrate around
Meningite criptococcica:
sedimento liquorale colorato
con inchiostro di China
Meningite da protozoi
• Le amebe (Naegleria, Acantameba) possono moltiplicarsi in acque
stagnanti nei Paesi tropicali (scarichi fognari).
• Se inalate, raggiungono le meningi attraverso il nervo olfattivo e la
lamina cribrosa etmoidea
• Diagnosi: osservazione microscopica per evidenziare la
caratteristica motilità ameboide
Meningite amebica: sedimento liquorale
con trofozoiti di Naegleria fowleri
Meningite viraleRhabdovirus: diagnosi di laboratorio
• Campioni clinici: strisci corneali, biopsie
cerebrali, biopsie cutanee
• Ricerca di antigeni virali in IF o tramite
PCR
• Rilievo microscopico di cellule neuronali
cerebrali contenenti i corpi del Negri
(inclusioni intracitoplasmatiche)
Cervello rabbico: colorazione IF (in
alto); campione negativo (in basso)Cervello rabbico: colorazione
ematossilina-eosina. Indicati,
i Corpi del Negri.
Diagnosi microbiologica di meningiteEsami microbiologici effettuabili
Sospetto clinico Esame effetuabile Campione biologico Note
Meningite batterica Esame diretto e colturale per
batteri
Liquor (almeno 1 ml)
Trasportare immediatamente
Mantenimento: RT < 2 h
Inviare anche emocoltura (1
flacone x aerobi + 1 flacone x
anaerobi)
Ricerca antigeni batterici mediante
test di agglutinazione
Liquor (0.5-1 ml)
Trasportare immediatamente
Mantenimento: 4°C < 12 h
Lo stesso test può essere
eseguito anche su sangue od
urine
Ricerca antigene S. pneumoniae
(immunocromatografia)
Liquor (0.5 ml)
Mantenimento: RT <24 h, oppure
4°C < 1 settimana
Lo stesso test è eseguibile anche
in caso di sospetta polmonite
pneumococcica
Ricerca di DNA batterico mediante
PCR
Liquor (almeno 1 ml)
Mantenimento: RT < 2 h oppure 4°C
<24 h
Meningite fungina Esame diretto e colturale per miceti
(lieviti e muffe)
Liquor (almeno 3-4 ml)
Trasportare immediatamente
Mantenimento: RT < 2 h
Inviare anche emocoltura (1
flacone x aerobi + 1 flacone x
anaerobi)
Maggiore quantità di liquor per
eseguire esame diretto e colturale
per miceti
Ricerca antigeni C. neoformans
(test al lattice)
Liquor (almeno 0.5 ml)
Mantenimento: 4°C < 12 h
Meningite tubercolare Esame diretto e colturale per M.
tuberculosis
Liquor (almeno 3 ml)
Mantenimento: RT <2 h, oppure 4°C
< 1 settimana
Maggiore quantità di liquor per
esame colturale
Ricerca di M. tuberculosis
mediante amplificazione
Liquor (almeno 2 ml)
Mantenimento: RT <2 h, oppure 4°C
< 1 settimana
2 ml sono sufficienti per ricerca
DNA
Diagnosi microbiologica di meningiteEsami microbiologici effettuabili
Sospetto clinico Esame effettuabile Campione biologico Note
Meningite virale Ricerca DNA virus erpetici (CMV,
ENV, VZV, HSV1, HSV2)
mediante PCR
Liquor (almeno 1 ml)
Mantenimento: <2h a RT, oppure
<24h a +4°C
1 ml di liquor è sufficiente per la
ricerca molecolare di virus
erpetici e poliomavirus
Ricerca DNA poliomavirus (JCV,
BKV) mediante PCR
Liquor (almeno 1 ml)
Mantenimento: <2h a RT, oppure
<24h a +4°C
1 ml di liquor è sufficiente per la
ricerca molecolare di virus
erpetici e poliomavirus
Ricerca anticorpi anti-virus
neurotropi (Morbillo, Varicella,
Parotite, CMV, EBV, HSV1, HSV2)
Liquor (almeno 1 ml)
Mantenimento: <2h a RT, oppure
<24h a +4°C
Inviare anche un campione di
siero
Esame colturale per HSV1, HSV2,
CMV
Liquor (almeno 1 ml)
Mantenimento: <24h a +4°C
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