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11/PRPM
MÉTODO PARA LA EXTRACCIÓN DE
RNA BASADO EN EL USO
NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS
Dra. Capriotti Natalianataliacapriotti@conicet.gov.ar
Centro Regional de Estudios Genómicos
11/PRPM
Instituto de Física de La Plata
(IFLP)
Claudia Rodríguez Torres
(torres@fisica.unlp.edu.ar)
Fabiana Cabrera
Silvana Stewart
Pedro Mendoza Zeliz
Elisa De Sousa
Luciana Juncal
Odín Vázquez Robaina
Instituto de Investigaciones
Fisicoquímicas Teóricas y
Aplicadas (INIFTA)
Patricia Schilardi
Carolina Diaz
Diego E. Pissinis
Centro Regional de Estudios Genómicos
(CREG)
Sheila Ons
Lucila Traverso
Natalia Capriotti
Instituto De Biotecnología Y Biología
Molecular (IBBM)
Victor Romanowski
Matías Pidre
Leticia Ferrelli
Florencia López
Leslie Amorós
Laboratorio de Salud Pública
Instituto Biológico
Hospital Rossi
Convenio Agosto 2020 – PBA
- Ministerio de Producción,
Ciencia e Innovación
Tecnológica.
- Ministerio de Salud.
11/PRPM
Muestra
BiológicaExtracción de
RNA
Generación de
cDNA
Amplificación
por PCR
Detección
> cc. RNA < Ct
11/PRPM
Métodos de extracción de RNA
• Propensión a obstruirse
• Retención de ácidos nucleicos grandes como el ADNg
• Necesidad de equipamiento costoso (centrifugas)
• Difícil de automatizar
Solventes orgánicos Fase sólida (columnas Si02)
• Residuos
• Procesamiento laborioso y manual intensivo
• Difícil de automatizar
11/PRPM
El objetivo del trabajo es proporcionar un protocolo de extracción de RNA
basado en perlas magnéticas de sílice de bajo costo, independiente de
equipamiento sofisticado y de producción nacional.
11/PRPM
Antecedentes
11/PRPM
- Se obtuvieron nanopartículas de magnetita (NPM, Fe3O4) por el método de co-precipitación
(IFLP)
- Se recubrieron con sílice (SiO2) por hidrólisis detetraetilortosilicato (TEOS) obteniéndose así las
“perlas magnéticas” (PEM) (INIFTA)
Gentileza Y-TEC
11/PRPM
Desarrollo y optimización de un protocolo de extracción (CREG-IBBM)
Buffer de Lisis: GITC + Triton
LISIS DE
LA
MUESTRA
RNA LIGADO A LAS PEM LAVADOS ELUCIÓN
11/PRPM
Método de
extracción RNA
Dilución 1:2 Dilución 1:4 Dilución 1:8
Trizol Reagent 19,40 21,5 26,34
Protocolo PEM
+ centrifuga
17,80 20,01 21,22
Protocolo PEM 21,69 23,46 24,08
• Muestra biológica: tejido blando de Rhodnius prolixus (3 replicas)
• Síntesis de cDNA: protocolo MML-V (Promega)
• RT-qPCR: Sybr Green y gen de referencia Rhopr_Actina
(CREG)
11/PRPM
Resultados
• Muestra biológica: línea celular pulmón A549. Concentración 105
• Molde RNA - dilución 1/5
• RT-qPCR: Kit MGI
1 2 3
PEM 03720 15,03 15,97 16,28
PEM 23720 15,34 15,99 15,94
PEM 24720 14,95 16,2 16,44
Columnas GeneAid 14,72
1. 4M GITC, 2% TritónX100 y pH6,5
2. 4M GITC, 4% TritónX100 y pH6,5
3. 2M GITC, 4% TritónX100 y pH6,5
(IBBM-CREG)
11/PRPM
Resultados
• Muestra biológica: hisopado bucal del operador (X 2)
• Molde RNA
• RT-qPCR: Kit BGI
H 23 H 24
PEM 23720 21,96 -----
PEM 24720 ----- 21,65
Columnas GeneAid 21,53
Buffer 4M GITC, 2% TritónX100 y pH6,5
(CREG)
11/PRPMResultados
Laboratorio Salud Pública (Exactas-UNLP)
Número de muestras procesadas por ambos métodos: 46.
Número de muestras DETECTABLE según columnas: 15
Número de muestras DETECTABLE según PEM-UNLP: 13 (criterio Ct <35)
Coincidencia en muestras detectables: 86.7 %.
Coincidencia en muestras no detectables: 96.8 %.
Diferencia promedio de Ct para gen control (Ct PEM-UNLP - Ct columna)= 1,9
(+/-1.1 ).
Diferencia promedio de Ct para gen ORFab (Ct ORFab PEM-UNLP - Ct ORFab
columna)= 1.2 (+/-2.4 ).
• Muestra biológica: oro y naso faríngeo sospechados de COVID
• Molde RNA
• DETECTABLE una muestra si se detecta el gen ORFab
11/PRPM
Conclusiones
• Las PEM funcionalizadas con SiO2 son eficientes en la extracción de RNA. Se obtienen
resultados comparables con los obtenidos con los métodos comerciales disponibles.
• El protocolo resulta útil para la extracción de RNA en distintos tipos de muestras
biológicas.
• El protocolo depende en gran medida del buffer GITC/Tritón. Variaciones en las
concentraciones, pH podrían aumentar el rendimiento y eficiencia del método.
11/PRPM
Muchas gracias
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