M/z: Nozioni di Spettrometria di Massa e di Proteomica...

M/z: Nozioni di Spettrometria di Massa e di

Proteomica Applicata alla Biomedicina Marco Gaspari

Laboratorio Proteomica

Argomenti

•  Nozioni di analisi proteomica

•  Gel elettroforesi bidimensionale

•  Elementi costitutivi dello spettrometro di massa

•  Ionizzazione MALDI

•  Ionizzazione ESI

•  Analizzatore a tempo di volo

•  Spettrometria di massa in tandem

•  Identificazione di proteine tramite PMF o MS/MS

Analisi proteomica

Analisi proteomica

Gel elettroforesi 2D: prima dimensione

4 5 6 7

Gradiente di pH

pI = 4.2 pI = 5.2 pI = 6.8

Caricamento del campione

Applicazione voltaggio

Isoelettrofocalizzazione (separazione in funzione

del punto isoelettrico)

+ -

+ -

Gel elettroforesi 2D: seconda dimensione

Aggiunta SDS

Gel elettroforesi 2D: seconda dimensione

+

- C

ampo

ele

ttric

o

SDS PAGE (separazione in funzione delle

massa)

Analisi proteomica

Analisi proteomica

Lista di proteine differenzialmente presenti nel tessuto tumorale

•  Determinare il peso molecolare di una grande varieta’ di molecole e biomolecole (peptidi, proteine)

•  Fornire informazioni strutturali sulle proteine, e sulle loro modificazioni post-traduzionali.

•  Effettuare analisi quantitativa sia di piccole molecole che di biomolecole, fornendo alta sensibilita’ ed elevata specificita’

La spettrometria di massa e’ una sofisticata tecnica analitica in grado di:

Spettrometria di massa

Per effettuare un’analisi mediante spettrometria di massa bisogna impartire una carica elettrica alla molecola di interesse, cioe’ l’analita, e successivamente misurare come le traiettorie dello ione risultante rispondono nel vuoto a varie combinazioni di campi elettrici e magnetici.

John Fenn, Premio Nobel per la Chimica 2002

Le traiettorie degli ioni dipendono dal loro

rapporto massa/carica m/z

Spettro di massa

4999 32000 59001 86002 113003 140004

m/z 0

100

% In

tens

ity

1D PAGE

M1+

M2+

Componenti di uno spettrometro di massa

Camera di ionizzazione

Analizzatore

Rivelatore

MALDI, ESI

Analizzatore a tempo di volo, quadrupolo

Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore

Componenti di uno spettrometro di massa

Camera di ionizzazione

Analizzatore

Rivelatore

Analizzatore a tempo di volo, quadrupolo

Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore

MALDI, ESI

Ionizzazione

Condizione necessaria all’analisi spettrometrica e’ la generazione di specie cariche in fase gassosa. Tale processo e’ detto ionizzazione.

Il processo richiede energia

1900 1925 1950 1975 2000

1984 1966 1985

1981

1907

Costruito il primo spettrometro di massa

EI

ESI FAB MALDI CI

Tipi di ionizzazione (1)

Protonazione

Deprotonazione

M + H+ à MH+

M - H+ à [M-H+]-

-

O

O

+ NH3

Espulsione di elettroni

Addizione cationica

M à M+.

M + Na+ à MNa+

- e-

Tipi di ionizzazione (2)

CH3

+.

OH

OH Na+

Principali tecniche di ionizzazione

Ionizzazione “hard”

•  EI (electron impact)

Ionizzazioni “soft”

•  MALDI (matrix-assisted laser desorption ionisation)

•  ESI (electrospray ionisation)

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation

•  La tecnica e’ basata su un’analisi in fase solida, anche se il

campione di partenza e’ in genere in soluzione.

•  L’energia necessaria alla ionizzazione del campione e’

fornita sotto forma di radiazione elettromagnetica.

•  La radiazione e’ inviata in pacchetti ad alta intensita’ tramite

un impulso laser

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation

Matrice

Campione (proteina,peptide, acido nucleico, zucchero)

Laser ad azoto, emissione a 337 nm (UV)

OH

HO

COOH

H CN

COOH

DHB CHCA

MALDI- preparazione del campione

Piastra metallica per la deposizione del campione e l’analisi

Soluzione di matrice Soluzione campione

Miscelare (la matrice e’ in forte eccesso)

Depositare sulla piastra metallica (1 µL)

Lasciare cristallizzare

Piastra metallica

Piastra metallica

+

+

+

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation

+

+

+

+

+

+ +

+

+

Proteina

Matrice

Impulso laser + 20 kV

All’analizzatore Piastra m

etallica

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation

10700 20000 24000 m/z

0

100

% In

tens

ity

20900

10451

•  Genera per lo piu’ specie monocarica

•  Buona tolleranza a contaminanti e Sali

•  Capace di ionizzare proteine (> 300 kDa)

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation

10700 20000 24000 m/z

0

100

% In

tens

ity

20900

10451

[M+H]+

[M+2H]2+

•  Genera per lo piu’ specie monocariche

•  Buona tolleranza a contaminanti e Sali

•  Capace di ionizzare proteine (> 300 kDa)

Elettrospray - ESI

•  La tecnica e’ basata sulla nebulizzazione di una soluzione contenente il campione da analizzare.

•  L’energia di ionizzazione e’ fornita da un campo elettrico generato tra l’ago di introduzione del campione e lo spettrometro di massa.

-

+

+

+

+

+ + + + + +

MS inlet +

+ + +

+

+ +

+ + + +

+

+

+

+ +

+ + + +

+ + + +

+ + + + - +

+ +

+ + +

+ + + -

- - - - + + -

+ +

+ +

+ + -

- +

- + + + +

+ + - -

+ - - +

Alimentatore

Elettrospray - ESI

Polo positivo Polo negativo

Campo elettrico sufficiente Ionizzazione

+ - + 1000-5000 V + 50 V

+ -

L’elettrospray genera ioni multicarica

+

+

+

+

+

+

+ +

+

+

+

+ +

+ + +

+ +

+

+

+

+

+ +

+ + +

+

La ionizzazione mediante elettrospray di una soluzione contenente una singola proteina generera’ un segnale multiplo allo spettrometro di massa, dovuto al fenomeno della formazione di ioni multicarica.

Goccia generata da elettrospray

La goccia evapora lungo il tragitto che porta allo spettrometro

La proteina ionizzata entra nello spettrometro di massa

MALDI & ESI: interleuchina 6

600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 m/z

0

100

% in

tens

ity

996.48 909.86 872.01 1046.40 951.19

805.03

775.27 1101.28 1162.39

1230.61 747.63 1307.49

1394.65

10700 20000 24000 m/z 0 0

100

% In

tens

ity

20900

10451

MALDI

ESI

Mw=20904

Mw=20899

Componenti di uno spettrometro di massa

Camera di ionizzazione

Analizzatore

Rivelatore

MALDI, ESI

L’analizzatore svolge il compito di separare gli ioni secondo il loro rapporto m/z prima che essi arrivino al rivelatore

Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore

Analizzatore a tempo di volo P

ushe

r, 10

-20

kV

Rivelatore

+

+ +

Ionizzazione

Campo elettrico

Campione

Assenza di campo elettrico

Ek= ½ mv2

Analizzatore a tempo di volo

•  In un analizzatore a tempo di volo (TOF), gli ioni vengono separati all’interno di uno spazio di 1-2 metri compreso tra la sorgente di ionizzazione ed il rivelatore, detto tubo di volo.

•  Ioni aventi una massa elevata viaggiano nel tubo di volo con velocita’ ridotta, arrivando con ritardo al rivelatore rispetto a ioni piu’ piccoli.

Componenti di uno spettrometro di massa

Camera di ionizzazione

Analizzatore

Rivelatore

Analizzatore a tempo di volo, quadrupolo

Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore

MALDI, ESI

Esempio di rivelatore: moltiplicatore di elettroni

Uno ione dall’analizzatore 106 elettroni

Serie di dinodi

L’urto di un singolo ione proveniente dall’analizzatore causa una cascata di elettroni. L’impulso elettrico viene successivamente digitalizzato

Ionizzazione MALDI TOF

Piastra metallica

Laser

Tempo (m/z)

Inte

nsita’

Segnale amplificato

Spettrometro MALDI-TOF

Rivelatore

Spettro MALDI-TOF di una Fosfoproteina

m/z

Rel

. Int

ensi

ty

23010

22930 23090

m/z

Rel

. Int

ensi

ty

No phosphorylation 2 phosphorylations

1 phosphorylation

Delta mass = 80 Da

MALDI-TOF MS diagnostic patterns

Using a highly optimized peptide extraction and matrix-assisted laser desorption/ ionization–time-of-flight (MALDI-TOF) MS–based approach, we now show that a limited subset of serum peptides (a signature) provides accurate class discrimination between patients with 3 types of solid tumors and controls without cancer. Targeted sequence identification of 61 signature peptides revealed that they fall into several tight clusters and that most are generated by exopeptidase activities that confer cancer type–specific di fferences superimposed on the proteolytic events of the ex vivo coagulation and complement degradation pathways.

MALDI-TOF MS in microbiology

MALDI-TOF MS in microbiology

Spettrometro ESI-TOF

La ionizzazione MALDI e’ pulsata (con la frequenza del laser), percio’ si presta bene per essere collegata ad un analizzatore TOF.

ESI e’ una sorgente continua di ioni.

L’accoppiamento ESI-TOF richiede una speciale geometria che unisca la sorgente continua di ioni con un’analisi TOF di tipo pulsato (geometria ortogonale).

ESI-QqTOF analizzatore ibrido

pusher rivelatore ESI

m/z

Intensita’

0

100

1000

Quadrupolo Quadrupolo

Filmato

Spettrometria di massa in tandem (MS/MS)

•  ESI e MALDI generano ioni causando minima frammentazione nelle molecole.

•  Questo implica che l’unica informazione ottenibile dall’analisi e’ una misura piu’ o meno accurata del peso molecolare dell’analita.

•  Cio’ non e’ sufficiente per una dettagliata caratterizzazione strutturale di peptidi e proteine (struttura primaria, modifiche post-traduzionali).

E’ necessario usare la spettrometria di massa in tandem

Spettrometria di massa in tandem (MS/MS)

La spettrometria di massa in tandem consiste nell’effettuare una doppia analisi di massa su un determinato campione. Per fare cio’, e’ possibile utilizzare due analizzatori in serie, o utilizzare lo stesso analizzatore a tempi diversi.

m/z

Inte

nsita’

0

100

1000 m/z 0

100

1000

MS2: MS/MS su m/z 850.1

Inte

nsita’

MS1: spettro MS da 0 a 1000 m/z

650.4

850.1

401.3 80.4

198.6 678.8

466.7

850.1

Selezione del picco

Qq-TOF : analisi MS/MS pusher Rivelatore

Da ESI

m/z

Relative intensity (%)

0

100

1000

Full scan MS

m/z

Relative intensity (%)

0

100

1000

MS/MS su

Q0: selezione

Q1: Camera di collisione

Newborn Screening workflow

Take supernatant

Flow injection MS

MS spectrum

Free carnitine PKU

CV MSUD

CV

CV

CV

Homocystinuria

CV Citrullinemia

CV GA-I

CV CPT-I/II

CV VLCAD

CV SCAD

CV ASA

CV PMA/MMA

CV

CV CV

CV CV CV CV

CV

CV

CV CV

CV

CV

CV

Identificazione di proteine mediante spettrometria di massa

•  La determinazione del peso molecolare della proteina intatta non e’ un’informazione sufficiente.

•  Nonostante nuove tecniche basate sulla frammentazione di proteine intatte siano in rapida evoluzione, generalmente l’approccio standard per l ’ identif icazione di una proteina e’ l ’analisi spettrometrica del digerito triptico della proteina stessa.

Identificazione di proteine mediante spettrometria di massa

Digestione triptica

Analisi spettrometrica del digerito

Ricerca in banca dati

Approccio 1: peptide mass fingerprinting (PMF)

•  Il peso molecolare dei peptidi ottenuti mediante digestione triptica e’ analizzato tramite spettrometria di massa.

•  La lista dei pesi molecolari di un buon numero di peptidi triptici ( > 5) e’ spesso un’informazione sufficiente per identificare una proteina (o, piu’ specificatamente, il gene da cui essa proviene).

PMF: esempio

Digestione triptica

Spettro MALDI-TOF

m/z

Inte

nsita’ (%

)

0

100

2000

650.4

748.6

1378.8

1606.7

1885.2

Pesi molecolari rilevati sperimentalmente

1885.2 1606.7 1378.8 748.6 650.4

Lys, Arg

PMF: esempio

Digeriti triptici in silico: peso molecolare previsto per i peptidi triptici appartenenti a tre proteine “modello”

Citocromo C Mioglobina Lattalbumina

1495.70 1470.69 1168.62 1018.44 964.53 779.45

678.38 634.39 604.35 547.27

1885.02 1853.96 1815.90 1606.85 1502.67 1378.84

1271.66 748.43 708.32 662.33 650.31 631.34

4654.15 1889.77 1642.73 1200.65 1034.49 653.31

650.32 618.34 549.28

La lista di peptidi acquisita sperimentalmente viene confrontata con i digeriti teorici presenti nella banca dati.

1885.2 1606.7 1378.8 748.6 650.4

Dato sperimentale

? ??

MS/MS di peptidi Nello spettrometro di massa, durante esperimenti MS/MS, i peptidi tendono a frammentare in corrispondenza del legame ammidico.

M+ b + y+

b+ + y M+

MS/MS di un peptide

K S A T K S A

S A T

K S

A T

S A

K T

500 m/z

Inte

nsita’

0

100

405

Spettro MS

MS/MS

Spettro MS/MS

m/z

Inte

nsita’

0

100

500

405

353

301

201

170

156

248

Thr-Ala-Ser-Lys

MS/MS di peptidi

H2N

HN

OH

O O

O O

NH

HN

R2

R3

R4

b1 b2 b3

y3 y2 y1

b1 = Mres + H+

b2 = b1 + Mres

bn-1 = MH+ - 18 - Mres

R1

y1 = Mres + 18 + H+

y2 = y1 + Mres

yn-1 = MH+ - Mres

- H2O nel caso di D, E, S, T

- NH3 nel caso di N, Q, K, R

Inoltre: Per un peptide composto da n ammino acidi:

MS/MS di peptidi Per interpretare uno spettro MS/MS di un peptide, si parte in genere da un estremo, superiore o inferiore, dello spettro, cercando di individuare potenziali serie di ioni b o y. Le differenze tra i vari ioni b (o y) nella serie, corrispondono alle masse residue degli amminoacidi componenti la sequenza del peptide.

Attenzione: la frammentazione e’ piu’ o meno favorita in diversi punti della sequenza del peptide; l’intensita’ dei frammenti risultanti sara’ dunque variabile ( e spesso il frammento potrebbe essere assente, interrompendo la serie).

427

314

y4

y2

Intensita’

m/z

y3

200 484 y5

G

L

N

…..GLN…

MS/MS di peptidi b1 = Mres + H+

b2 = b1 + Mres

bn-1 = MH+ - 18 - Mres

y1 = Mres + 18 + H+

y2 = y1 + Mres

yn-1 = MH+ - Mres Ala 71

Pro 97

Leu 113

Asn 114

Thr 101

Val 99

Lys 128

Phe 147

Masse residue di alcuni ammino acidi

592

427 521

574

407

314

279 166

186 M + H+

H2N

HN

OH

O O

O O

NH

HN

R2

R3

R4

b1 b2 b3

y3 y2 y1

R1

Intensita’

m/z

MS/MS di peptidi b1 = Mres + H+

b2 = b1 + Mres

bn-1 = MH+ - 18 - Mres

y1 = Mres + 18 + H+

y2 = y1 + Mres

yn-1 = MH+ - Mres

Ala 71

Pro 97

Leu 113

Asn 114

Thr 101

Val 99

Lys 128

Phe 147

Masse residue di alcuni ammino acidi

592

427 521

574

407

314

279 166

186

Ala – Asn – Lys – Leu - Phe

b2 b3

b4

M + H+

y4

MH+ - H2O

y3

y2 y1

Intensita’

m/z

Identificazione di proteine approccio 2: MS/MS ion search

Digestione triptica

Spettro MS

m/z

Inte

nsita’ (%

)

0

100

2000

650.4

748.6

1378.8

1606.7

1885.2

PMF (1)

MS/MS ion search (2)

Identificazione di proteine tramite MS/MS

m/z

Inte

nsita’ (%

)

0

100

2000

650.4

748.6

1378.8

1606.7

1885.2

m/z

Inte

nsita’ (%

)

0

100

2000

1885.2

m/z

Inte

nsita’ (%

)

0

100

2000

1606.7

1378.8

m/z

Inte

nsita’ (%

)

0

100

2000

748.6

m/z

Inte

nsita’ (%

)

0 2000

650.4

m/z

Inte

nsita’ (%

)

0

100

2000 100

Spettro MS/MS di un peptide acetilato

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

m/z 0

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

1460.5

1250.4 733.2 945.1

1103.4 534.2

846.3 662.2 954.2

781.6 1016.4 1391.4

447.1 1373.4 1174.4 1561.4 348.1

276.9 1355.3 429.0 1665.4

1779.4

y12

y7

y3

y6

y5

y4 y10

y9

y8 y13 y14

b4o b7

b2

822.1

[M+2H-2H2O]+2

[M+2H-H2O]+2

b10o b12

o

b12

b14 b13 b15

Y L S T P I F S K(Ac)L A Q W S N K

y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y12 y13 y14

b2 b4o b7 b10

o b12 b13 b14 b15

HPLC-ESI-MS

Miscele complesse di peptidi non possono essere analizzate direttamente mediante spettrometria di massa. Tali miscele sono analizzate in maniera piu’ efficace tramite cromatografia liquida HPLC accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS).

Un normale spettrometro di massa e’ capace di analizzare simultaneamente circa 50-100 peptidi. Utilizzando LC-MS, le miscele peptidiche possono arrivare a contenere migliaia di componenti diversi.

HPLC-ESI-MS

Colonna HPLC

Campione

ESI

Fase mobile

Spettrometro

di

massa

Analisi proteomica

Lo studio qualitativo e quantitativo delle proteine contenute in un dato tessuto, coltura cellulare o fluido biologico. Tale studio puo’ riguardare rapporti quantitativi tra le proteine stesse, modificazioni post-traduzionali, interazioni tra proteine.

Analisi Proteomica Mediante nanoLC-ESI-MS/MS

DIgestione triptica

Miscela di Proteine Miscela di peptidi

nanoLC-ESI-MS/MS analysis

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 0

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

Migliaia di spettri MS/MS

RIcerca in banca dati Identificazione di centinaia/

migliaia di sequenze peptidiche, riconducibili a

centinaia di proteine diverse

Quantitative Phosphoproteomics Reveals a Cluster of Tyrosine Kinases That Mediates Src Invasive Activity in

Advanced Colon Carcinoma Cells

The nonreceptor tyrosine kinase Src is frequently overexpressed and/or activated in human colorectal carcinoma (CRC), and its increased activity has been associated with a poor clinical outcome. Src has been implicated in growth and invasion of these cancer cells by still not well-known mechanisms. Here, we addressed Src oncogenic signaling using quantitative phosphoproteomics. Src overexpression increased growth and invasiveness of metastatic SW620 CRC cells. Proteomic analysis revealed that Src phosphorylates a cluster of tyrosine kinases which were required for its invasive activity. Targeting these tyrosine kinases may be of significant therapeutic value in this cancer.

Cancer Research, 2009 Cellule tumorali

Estrazione proteine

Isolamento fosfoproteine

Identificazione e quantificazione

m/z 0

A G H I pS K P L R

Identification of cardiac myosin binding protein C as a candidate biomarker of myocardial infarction by proteomic analysis.

Molecular & Cellular Proteomics, 2009

Acute myocardial infarction (AMI) is a common cause of death for which effective treatments are available providing diagnosis is rapid. Isolated mouse hearts were perfused with oxygenated protein-free buffer and coronary effluent collected after ischemia or during matched normoxic perfusion. 2D Gel of ischemic and control coronary effluent identified more than 200 asymmetric spots. Perfusing hearts with protein-free buffers provides a platform of graded ischaemic injury that allows detailed analysis of protein release and identification of candidate cardiac biomarkers like myosin binding protein C.

The identification of proteins that are preferentially expressed on the membrane of metastatic tumor cells is of fundamental importance in cancer research. A dramatic increase in abundance at the cell membrane was observed for a broad variety of proteins which were mainly thought to reside in intracellular compartments. F u r t h e r m o r e , w e s h o w e d b y microautoradiographic analysis that certain target proteins can readily be reached by intravenously administered radiolabeled antibodies.

Comparative Analysis of the Membrane Proteome of Closely Related Metastatic and Nonmetastatic Tumor Cells

Metastatic potential

Cancer Research, 2009