View
5
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
ACADEMIA ROMÂNĂ
INSTITUTUL DE CHIMIE MACROMOLECULARĂ ”PETRU PONI”, IAŞI
NOI BIOMATERIALE RECEPTIVE LA STIMULI EXTERNI CONŢINÂND
PROTEINE
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
Conducători ştiinţifici: CS. I Dr. Cornelia VASILE
CS. I Dr. Maria CAZACU
Doctorand: Bioing. Daniela PAMFIL
< IAŞI, 2016 >
Mulţumiri
Datorez mulţumiri speciale Academiei Române şi conducerii Institutului
de Chimie Macromoleculară ”Petru Poni” pentru suportul financiar, sprijinul ştiinţific, încrederea şi înţelegerea acordată pe parcursul stagiului de pregătire a tezei de doctorat.
Această teză reprezintă rezultatul a 4 ani de cercetare şi s-a concretizat sub atenta îndrumare a domnişoarei Prof. Dr. CS. I Cornelia Vasile, căreia doresc să îi adresez pe această cale profunda mea recunoştinţă şi sincere mulţumiri pentru sugestiile sale indispensabile, sprijinul total şi constant, pentru răbdare şi pentru coordonarea ştiinţifică acordată pe toată perioada elaborării tezei de doctorat.
Un gând deosebit şi alese mulţumiri doamnei Dr. CS. I Maria Cazacu pentru sprijinul, sugestiile, timpul şi răbdarea acordate de-a lungul perioadei doctorale şi pentru oportunitatea oferită de a o avea ca îndrumător de doctorat.
Mulţumesc membrilor comisiei de doctotat, domnului Prof. Univ. Dr. Marcel Ionel Popa, doamnei Dr. CS. II Loredana Elena Niţă şi doamnei Prof. Univ. Dr. Liliana Vereştiuc pentru atenţia acordată analizei acestei lucrări şi pentru sugestiile formulate.
Îi rămân îndatorată doamnei Prof. Univ. Dr. Liliana Vereştiuc pentru încrederea necondiţionată şi ghidarea, încă din studenţie, a drumului spre o formare profesională cu baze solide.
Mulţumesc domnului Prof. Dr. Christoph Schick, specialist în analiza termică pentru disponibilitate şi pentru ajutorul acordat în realizarea studiilor de calorimetrie în cadrul Institutului de Fizică al Universităţii din Rostock, Germania şi doamnei Prof. Dr. Lidija Fras Zemljič pentru testele de titrare potenţiometrică ce au fost realizate în cadrul Laboratorului de Caracterizare şi Prelucrare a Polimerilor a Universităţii din Maribor, Slovenia.
Cele mai calde mulţumiri tuturor colegilor din cadrul Departamentului
Chimia Fizică a Polimerilor pentru, amiciţia unică, sfaturile preţioase, sprijinul şi încrederea lor neîncetată şi pentru că mi-au fost pur şi simplu alături când am avut nevoie de ajutor şi mi-au arătat ce înseamnă implicarea şi lucrul în echipă.
Adresez mulţumiri colegilor din cadrul Institutului de Chimie
Macromoleculară pentru generozitatea şi amabilitatea de a realiza diferite caracterizări ale sistemelor polimerice investigate în această teză.
În încheiere, le mulţumesc şi le datorez mai multă recunoştinţă decât aş fi în stare să exprim dragilor mei părinţi care au crezut în mine.
Cu deosebită stimă şi consideraţie, Bioing. Daniela Pamfil
CUPRINS
Pg.
teză/
rezumat
MOTIVAŢIA ŞI STRUCTURAREA TEZEI 1/1
PARTEA I. Stadiul actual privind obţinerea de biomateriale / hidrogeluri receptive la
stimuli externi cu aplicaţii în domeniul biomedical şi farmaceutic
Cap. I: BIOMATERIALE RECEPTIVE LA STIMULI EXTERNI
I.1. Introducere. Definiţii, clasificare, comportare generală 6
I.2. Polimeri sensibili la temperatură, un stimul extern uşor de aplicat 9
I.2.1. Polimeri termosensibili naturali 10
I.2.1.1. Proteine cu proprietăţi receptive la temperatură 11
I.2.1.1.1. Materiale termosensibile pe bază de colagen 11
I.2.1.1.2. Gelatina 12
I.2.1.2. Chitosanul 14
I.2.2. Polimeri termosensibili sintetici 17
I.2.3. Aplicaţii ale polimerilor cu caracter termosensibil 18
I.2.3.1. Eliberarea de principii active cu efecte terapeutice 18
I.2.3.2. Inginerie tisulară 19
I.3. Polimeri sensibili la pH 22
I.3.1. Clasificarea polimerilor sensibili la pH 23
I.3.2. Materiale sensibile la pH pe bază de colagen 25
I.3.3. Aplicaţii biomedicale ale polimerilor sensibili la pH 27
I.3.3.1. Sisteme de eliberare ale compuşilor activi 27
I.3.3.2. Transportori de gene 30
I.3.3.3. Biosenzori 32
I.4. Polimeri sensibili la stimuli biologici 33
I.4.1. Sensibilitatea la enzime 33
I.4.1.1. Aplicaţii biomedicale 33
I.4.1.2. Sensibilitatea colagenului la enzime cu aplicaţii în
ingineria tisulară
35
I.5. Materiale receptive la mai mulţi stimuli externi 37
Cap. II: COLAGENUL: CARACTERISTICI ŞI APLICAŢII ÎN DOMENIUL BIOMEDICAL
II.1. Introducere generală şi clasificare 38
II.2. Structura şi compoziţia chimică a colagenului 40
II.3. Proprietăţile colagenului 42
II.4. Implicarea colagenului în reacţii chimice şi fizice 46
II.4.1. Metode de modificare a colagenului 46
II.4.1.1. Modificarea chimică a colagenului 46
II.4.1.2. II.4.1.2.1. Modificarea colagenului prin intermediul
grupelor amino
47
II.4.1.2.2. Modificarea colagenului prin intermediul
grupelor carboxil
49
II.4.2. Reticularea colagenului 50
II.4.2.1. Reticularea chimică 51
II.4.2.2. Reticularea fizică 54
II.4.2.3. Reticularea enzimatică 55
II.5. Aplicaţii biomedicale ale colagenului 55
II.5.1. Pansamente pe bază de colagen pentru tratarea rănilor 55
II.5.1.1. Funcţia colagenului în refacerea rănilor 56
II.5.1.2. Pansamente pe bază de colagen ca potenţiale sisteme de
eliberare a agenţilor terapeutici
57
II.5.2. Utilizarea materialelor pe bază de colagen ca sisteme de eliberare a
principiilor active
59
Cap. III: BIOMATERIALE PE BAZĂ DE HIDROGELURI
III.1 Biocompatibilitatea polimerilor 62
III.2. Hidrogeluri ca biomateriale biocompatibile 64
III.3. Hidrogeluri obţinute prin combinarea polimerilor sintetici cu cei naturali 67
III.3.1. Compatibilitatea polimerilor 67
III.3.2. Metode de îmbunătăţire a compatibilităţii între polimeri 69
III.3.3. Hidrogeluri multicomponente 70
III.4. Aplicaţii biomedicale ale hidrogelurilor 70
III.4.1. Hidrogeluri pentru regenerarea pielii 71
III.4.2. Hidrogeluri injectabile pentru regenerarea şi refacerea ţesuturilor vii 72
III.4.3. Hidrogeluri utilizate ca sisteme de eliberare controlată 73
III.4.4. Hidrogeluri utilizate ca lentile de conctact 75
CONCLUZII PARTEA I 76
PARTEA A II-A. Contribuţii privind sinteza şi caracterizarea unor noi materiale
polimerice pe bază de proteine sensibile la stimuli externi
Cap. IV: MATERIALE ŞI METODOLOGIA DE INVESTIGARE
IV.1. Materiale 78
IV.2. Sinteza colagenului funcţionalizat cu anhidride ciclice 83
IV.3. Sinteza hidrogelurilor pe bază de colagen modificat şi 2-hidroxietil metacrilat–
CM/HEMA
84
IV.4. Sinteza hidrogelurilor pe bază de poli (alcool vinilic) şi chitosan – PVA/CHT 85
IV.5. Sinteza hidrogelurilor hibride pe bază de poli N-izopropil acrilamidă şi colagen 86
IV.6. Metode de investigare a materialelor de colagen nativ şi a celor modificate cu
anhidride
86
IV.6.1. Analiza prin spectroscopie FT-IR 86
IV.6.2. Analiza prin spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară 1H-
RMN
87
IV.6.3. Determinarea grupelor amino din structura colagenului înainte şi
după modificare prin reacţia cu TNBS
87
IV.6.4. Titrarea potenţiometrică 89
IV.6.5. Determinarea conţinutului de Carbon Organic Total şi Azot Total
(TOC/TN)
90
IV.6.6. Difuzia dinamică şi statică a luminii 90
IV.6.7. Măsurători vâscozimetrice 91
IV.6.8. Analiza termică prin TG/DTG/DTA/FT-IR/MS 93
IV.6.9. Teste de adeziune 93
IV.7. Metode de investigare a hidrogelurilor 95
IV.7.1. Spectroscopia în infraroşu cu transformată Fourier (FT-IR) 95
IV.7.2. Microscopia electronică de baleiaj (SEM) 95
IV.7.3. Randamentul reacţiei de sinteză 95
IV.7.4. Determinarea gradului de umflare 96
IV.7.5. Analiza prin calorimetrie diferenţială de baleiaj (DSC) 97
IV.7.6. Determinarea unghiului de contact cu apa 100
IV.7.7. Testarea in vitro a biodegradabilităţii enzimatice 101
IV.7.8. Teste in vitro de încărcare şi eliberare a principiilor active din
hidrogelurile CM/HEMA şi PVA/CHT
104
IV.7.9. Teste de toxicitate acută in vivo 107
IV.7.10. Teste de biocompatibilitate in vivo prin implantare intraperitoneală la
şobolani
108
Cap. V: MODIFICAREA COLAGENULUI CU ANHIDRIDE ŞI OPTIMIZAREA CONDIŢIILOR DE REACŢIE
V.1. Introducere 114
V.2. Stabilirea structurii chimice a colagenului modificat prin metodele
spectroscopice
114/5
V.2.1. Caracterizarea prin spectroscopie FT-IR 116
V.2.2. Caracterizarea prin spectroscopie 1H RMN 117/5
V.3. Determinarea gradului de substituţie utilizând reacţia cu TNBS 118/6
V.4. Rezultatele obţinute în urma titrării potenţiometrice şi a analizei TOC / TN 119/6
V.5. Rezultatele DLS/SLS 122/7
V.6. Efectul concentraţiei şi temperaturii asupra comportamentului reologic al
soluţiilor de colagen nemodificat şi al celor modificate cu anhidride
124/7
V.7. Rezultatele analizelor termice 128
V.7.1. Date termogravimetrice 128/8
V.7.1. Analiza compuşilor volatili în urma descompunerii termice 130
V.8. Rezultatele testelor de adeziune in vitro 137/9
V.9. Concluzii 139
Cap. VI: OBŢINEREA DE HIDROGELURI PE BAZĂ DE COLAGEN MODIFICAT ŞI 2-HIDROXIETIL METACRILAT VARIIND TIPUL DE COLAGEN MODIFICAT
VI.1. Introducere 140
VI.2. Sinteza hidrogelurilor pe bază de 2-hidroxietil metacrilat şi colagen modificat
cu anhidride (HEMA/CM)
141/9
VI.3. Analiza structurală a hidrogelurilor prin spectroscopie FT-IR 145
VI.4. Examinarea morfologică a hidrogelurilor prin microscopie electronică de baleiaj
(SEM)
149
VI.5. Comportamentul la umflare al hidrogelurilor 150/10
VI.6. Rezultate analizei calorimetrice DSC 152/11
VI.6.1. Analiza în stare uscată a materialelor de colagen modificate cu
anhidride şi a hidrogelurilor ce conţin aceste tipuri de colagen
152/11
VI.6.2. Analiza în stare hidratată a materialelor de colagen modificate cu
anhidride şi a hidrogelurilor ce conţin aceste tipuri de colagen
155/12
VI.7. Concluzii 160/56
Cap. VII: OBŢINEREA DE HIDROGELURI PE BAZĂ DE COLAGEN MODIFICAT ŞI 2-HIDROXIETIL METACRILAT VARIIND CONŢINUTUL DE COLAGEN MODIFICAT ŞI AL AGENTULUI DE INIŢIERE
VII.1. Introducere 162
VII.2. Sisteme investigate 163/13
VII.3. Analiza spectrală FT-IR 165/14
VII.4. Randamentul reacţiei de sinteză a hidrogelurilor 166/15
VII.5. Testele de solubilitate 167
VII.6. Analiza morfologică şi determinarea gradului de umflare în condiţii similare 168/15
mediului fiziologic
VII.7. Dependenţa de pH a comportamentului la umflare al hidrogelurilor 172/17
VII.8. Degradarea enzimatică in vitro a hidrogelurilor 176/17
VII.9. Studiul de eliberare a ciprofloxacinei în condiţii care simulează pe cele ale
mediului fiziologic
182/19
VII.10. Dependenţa de pH a eliberarii ciprofloxacinei din hidrogeluri 187/20
VII.11. Determinarea toxicităţii acute in vivo a hidrogelurilor CM/HEMA 191/20
VII.12. Rezultatele testelor de biocompatibilitate in vivo a hidrogelurilor CM/HEMA 192/21
VII.13. Studii de eliberare a bisoprolului fumarat (BF) din hidrogelurile pe bază de
colagen modificat şi HEMA
200
VII.14. Concluzii 201
Cap VIII: TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA PH A UNOR HIDROGELURI PE BAZĂ DE CHITOSAN ŞI POLI (ALCOOL VINILIC)
VIII.1. Introducere 203
VIII.2. Sensibilitatea la pH a comportării la umflare a hidrogelurilor PVA/CHT 205/21
VIII.3. Caracterizarea hidrogelurilor PVA/CHT încărcate cu CF prin spectroscopie FT-
IR
211
VIII.4. Studii de eliberare in vitro a ciprofloxacinei hidroclorurate monohidratate (CF)
din matricile hidrogelurilor pe bază de PVA şi PVA/CHT
215/22
VIII.5. Studii de eliberare in vitro a bisoprololului fumarat (BF) din matricile
hidrogelurilor pe bază de PVA şi PVA/CHT
221
VIII.6. Concluzii 224
Cap. IX: HIDROGELURI HIBRIDE SENSIBILE LA pH ŞI TEMPERATURĂ PE BAZĂ DE COLAGEN ŞI POLI N-IZOPROPIL ACRILAMIDĂ
IX.1. Introducere 226
IX.2. Materiale folosite 228
IX.3. Analiza de calorimetrie diferenţială de baleiaj (DSC) a hidrogelurilor în stare
hidratată
229/24
IX.4. Determinarea unghiului de contact 239/26
IX.5. Concluzii 241
Cap. X: CONCLUZII GENERALE ŞI PERSPECTIVE 242/26
BIBLIOGRAFIE 251/33
ACTIVITATEA ŞTIINŢIFICĂ ÎN CADRUL TEZEI DE DOCTORAT 285/34
1
MOTIVAŢIA TEZEI
Colagenul este principala proteină din matricea extracelulară. Mai mult de
90 % din proteinele extracelulare de la nivelul tendonului şi mai mult de 50 % din
cele de la nivelul pielii este reprezentat de colagen. Datorită biocompatibilităţii şi
biodegradabilităţii excelente, structurii bine definite, caracteristicilor biologice şi
modului în care interacţionează cu organismul, proteinele reprezintă unele dintre
cele mai utilizate biomateriale.
Una dintre cele mai importante funcţii ale colagenului este aceea de a
conferi rezistenţă şi integritate structurală a ţesuturilor. Totuşi, în urma procesului
de extracţie rezistenţa mecanică a acestuia scade. Viteza mare a biodegradării,
proprietăţile mecanice şi termice scăzute limitează utilizǎrile ulterioare ale
colagenului în domeniul biomedical. Pentru a îmbunătăţi toate aceste proprietăţi
într-un mod controlabil şi pentru a conferi noi poziţii active de legare la nivelul
catenei macromoleculare, colagenul a fost supus unei reacţii de funcţionalizare cu
anhidride şi s-au variat condiţiile de reacţie şi agentul de modificare pentru
optimizarea lor. Anhidrida citraconică şi 2,3-dimetil maleică folosite ca agenţi de
funcţionalizare sunt două anhidride cu reactivitate crescută. Materialele de colagen
modificate cu anhiride au fost ulterior caracterizate comparativ cu materialul nativ
şi s-au testat pentru potenţialele lor aplicaţii biomedicale.
Teza de doctorat are ca scop principal obţinerea de noi hidrogeluri
polimerice poroase, sensibile la modificări ale stimulilor externi, în particular pH,
pe bază de 2-hidroxietil metacrilat şi colagen modificat cu anhidride fără
implicarea agenţilor chimici de reticulare.
Testarea aplicabilităţii acestor materiale a început cu testarea toxicităţii,
biocompatibilităţii, biodegradabilităţii şi a capacităţii de a funcţiona ca transportori
pentru principii active şi eliberarea controlată a acestora. Rezultatele pozitive
obţinute au indicat potenţialele utilizării ale acestora în domeniile biomedical şi
farmaceutic, în particular ca pansamente în refacerea şi regenerarea ţesuturilor,
colagenul fiind deja cunoscut pentru calităţile lui în acest domeniu. Suplimentar, s-
a avut în vedere compararea sistemelor sintetizate pe bază de proteine sensibile la
pH cu alte sisteme deja cunoscute pentru sensibilitatea lor la stimuli externi,
acestea fiind hidrogelurile pe bază de poli (alcool vinilic) şi chitosan şi cele pe bază
de poli N-izopropil acrilamidă şi colagen.
2
STRUCTURAREA TEZEI
Teza abordează subiectul obţinerii, caracterizării şi utilizǎrii hidrogelurilor
sensibile la pH în domeniul interdisciplinar al ingineriei ţesuturilor, domeniu ce
aplicǎ principii ale ştiinţelor vieţii şi ale ingineriei pentru realizarea de sisteme care
refac, menţin sau îmbunǎtǎţesc funcţia ţesuturilor. Utilizarea biomaterialelor în
aceste scopuri dateazǎ încǎ din antichitate. În prezent, odatǎ cu dezvoltarea
procedurilor şi materialelor de refacere a organismului, a crescut şi riscul de
afectare a acestuia.
Introducerea de noi materiale în domeniile biomedical şi farmaceutic ca
cele elaborate în cadrul tezei, presupune respectatea unor condiţii esenţiale precum:
� sǎ fie biocompatibile şi sǎ satisfacǎ diferite nevoi nutriţionale şi biologice
specifice populaţiei de celule existente;
� să fie reproductibile în forme diverse tridimensionale;
� să aibă structurǎ poroasǎ ce permite o distribuţie adecvatǎ a celulelor
însǎmânţate şi difuzia elementelor nutritive necesare creşterii şi
dezvoltǎrii celulare;
� să ofere un potenţial de reglare a proprietǎţilor chimice, fizice şi
mecanice;
� sa aibă biodegradabilitate controlatǎ.
Lucrarea de doctorat este structurată pe două părţi şi nouă capitole.
În primele trei capitole, ce constituie prima parte a lucrării, se prezintă
noţiuni generale şi date de literatură recentă în domeniu privind obţinerea de
biomateriale/hidrogeluri receptive la stimuli externi cu aplicaţii în domeniile
biomedical şi farmaceutic.
Primul capitol cuprinde noţiuni de bază ce vizează stadiul actual al
biomaterialelor receptive la unul sau mai mulţi stimuli externi ca temperatura, pH-
ul, tăria ionică, enzimele, etc.. S-a urmărit clasificarea şi aplicabilitatea acestora.
În capitolul al II-lea, atenţia este îndreptatǎ, în mod special, asupra
colagenului, o bioproteină cu aplicaţii multiple în ingineria tisularǎ, atât datoritǎ
biocompatibilitǎţii lui, cât şi datoritǎ posibilitǎţilor relativ crescute de obţinere din
ţesuturi animale (piele, tendon, os, etc.). Pe baza multor date bibliografice recente,
acest capitol vine în întâmpinarea noilor metode de îmbunǎtǎţire a proprietǎţilor
colagenului.
Problema realizǎrii de noi biomateriale pe bază de colagen, poate fi
abordatǎ din douǎ puncte de vedere:
3
- realizarea de noi biomateriale cu performanţe superioare celor deja
cunoscute;
- realizarea de noi biomateriale cu proprietǎţi similare sau îmbunătățite
celor deja cunoscute, dar cu preţ de cost mai redus.
Capitolul III prezintă succint tipurile de hidrogeluri şi utilizările acestora.
Materialele polimerice, sintetice sau naturale, sunt din ce în ce mai mult utilizate în
domeniul cercetării medicale şi farmaceutice. Gama largă a materialelor polimerice
cât şi cunoştinţele extinse din domeniu permit realizarea de noi biomateriale ale
cǎror proprietăţi sǎ fie cât mai apropiate de cele optime pentru implanturi.
Biomaterialele polimerice sunt sisteme minim invazive care pot transporta la
organul ţintă diferite principii biologic active, fiind sisteme de eliberare controlată
a medicamentelor şi altor principii active în organism.
Următoarele 5 capitole, încadrate în partea a doua a tezei de doctorat, cuprind rezultate proprii, originale privind sinteza şi caracterizarea noilor materiale
de colagen modificat şi a hidrogelurilor polimerice sensibile la pH dar şi
compararea acestora cu alte sisteme receptive la modificări ale condiţiilor
fiziologice.
Capitolul IV oferă date referitoare la materialele utilizate şi la metodele de
investigaţie utilizate în teză pentru a obţine rezultate concludente pentru viitoarele
aplicaţii biomedicale. Folosirea sistemelor polimerice pentru obţinerea produşilor
de inginerie tisulară presupune o etapă de prelucrare, în urma căreia se fixează
forma şi structura finală. Aceasta din urmă este cea care influenţează proprietăţile
produsului final. În acest context, este explicabilă importanţa deosebită acordată
metodelor de caracterizare a structurii şi morfologiei sistemelor polimerice în
vederea elucidării relaţiei ce există între parametrii de prelucrare, structura şi
proprietăţile produselor finale obţinute.
Capitolul V prezintă sinteza şi caracterizarea materialelor de colagen ce au
fost modificate chimic cu anhidrida citraconică şi anhidrida 2,3-dimetil maleică
atât în scopul îmbunătăţirii proprietăţilor prin optimizarea condiţiilor reacţiei de
sinteză cât şi în scopul fixării pe biopolimer a unor noi situsuri de legare ce pot
participa ulterior la reacţii de copolimerizare cu un monomer sintetic, şi anume 2-
hidroxietil metacrilatul, pentru obţinerea de hidrogeluri tridimensionale.
Capitolul VI este orientat spre studiul noului sistem polimeric sintetizat
alcătuit din colagenul funcţionalizat şi poli (2-hidroxietil metacrilat). Hidrogelurile
au fost obţinute cu diferite de tipuri de colagen modificat (cu grade diferite de
substituţie) şi analizate din punct de vedere structural dar şi din prisma aspectului
4
morfologic, a capacității de umflare şi a stabilităţii termice în stare uscată sau
hidratată prin intermediul calorimetriei diferenţiale de baleiaj.
Capitolul VII prezintă rezultatele originale asupra hidrogelurilor pe bază
de 2-hidroxietil metacrilat şi colagen modificat cu anhidride în care s-a variat
raportul masic al acestora. Pentru sinteza hidrogelurilor s-au selectat materialele de
colagen modificat cu cele mai mari grade de substituţie. S-a urmărit, în principal,
evaluarea sensibilităţii la variaţii ale pH-ului prin studii de umflare şi de eliberare a
principiilor active. Principiile active selectate pentru studiile de încărcare şi de
eliberare au fost ciprofloxacina hidroclorurată şi bisoprololul fumarat. De
asemenea, în ideea utilizării în ingineria tisularǎ ca pansamente de refacere tisulară,
noile sisteme polimerice sintetizate au fost evaluate din punct de vedere al
biodegradabilităţii, toxicităţii şi biocompatibilităţii la contactul cu ţesuturiile vii.
Capitolele VIII şi IX descriu caracterizarea unor sisteme sensibile la
schimbări ale mediului exterior şi anume hidrogelurile pe bază de poli (alcool
vinil) şi chitosan şi cele pe bază de poli N-izopropil acrilamidă şi colagen. S-au
realizat astfel studii de umflare şi de eliberare pentru a evidenţia sensibilitatea la
pH dar şi studii asupra stabilităţii termice pentru evidenţierea sensibilităţii la
temperatură.
Teza se încheie cu prezentarea într-o manieră succintă a concluziilor
generale cu privire la cele mai importante rezultate experimentale obţinute în
cadrul acestei tezei (Capitolul X) şi cu lista bibliografiei consultate.
Lucrarea se extinde pe 289 pagini şi cuprinde 105 figuri, 15 ecuaţii, 50
tabele şi 488 referinţe bibliografice.
Rezumatul tezei cuprinde într-o formă concentrată rezultatele originale
obţinute. În rezumat se menţine numerotarea tabelelor, figurilor şi schemelor din
materialul tezei.
5
CAPITOLUL V. MODIFICAREA COLAGENULUI CU ANHIDRIDE SUBSTITUITE ŞI OPTIMIZAREA CONDIŢIILOR DE REACŢIE
V.2. Stabilirea structurii chimice a colagenului modificat prin metodele spectroscopice
Procesul chimic de modificare al colagenului prin intermediul grupelor
aminice este descris în Figura V.1. Legarea chimică dintre atomul de carbon
provenit de la gruparea carbonil (C=O) a anhidridei ciclice cu gruparea aminică
(-NH2) din macromolecula de colagen are loc printr-o reacţie de adiţie nucleofilă -
eliminare ce conduce la obţinerea de colagen modificat care prezintă în structura sa
chimică legături vinil (HC=CH) şi carboxil (COOH). Reacţia dintre colagen şi AC
poate conduce la două posibilităţi de legare la grupele funcţionale ale colagenului
în funcţie de poziţia grupei metil (CH3) faţă de grupa carbonil (Figura V.1.a).
Figura V.1. Reacţia dintre o moleculă de colagen şi
anhidrida AC (a) sau ADM (b)
V.2.2. Caracterizarea prin spectroscopie 1H RMN În spectrele
1H RMN (Figura V.3.a şi V.3.b) colagenului modificat cu AC
(colagen:AC, 1:3 g/g) există trei semnale noi ce nu sunt prezente în spectrul
colagenului nemodificat. La δ = 6 ppm apare un semnal atribuit protonilor din
dubla legătură a grupării vinil (-HC=CH-) iar la δ = 8,7 ppm apare un semnal
corespunzător protonului din gruparea amidă (C=O-NH-). Protonul din gruparea
metil (CH3) a fost evidenţiată prin cel puţin un semnal la δ = 2,1 ppm.
Figura V.3. Spectrele 1H-NMR colagenului nemodificat (a) şi a probelor de colagen modificate cu AC
(b) şi ADM (c)
6
În spectrul prezentat în Figura V.3c ce a fost înregistrat pe proba de
colagen modificat cu ADM (colagen:ADM, 1:3 g/g) s-au observat două semnale la
8,7 ppm şi 2,1 ppm asociate protonilor din gruparea amidă şi respectiv din cele
două grupări metil.
V.3. Determinarea gradului de substituţie utilizând reacţia cu TNBS În Tabelul V.1 sunt prezentate rezultatele referitoare la gradul de
substituţie ale probelor de colagen modificat.
Tabelul V.1. Dependenţa valorilor procentuale ale gradului de substituţie în funcţie de tipul
şi cantitatatea de anhidridă şi de condiţiile mediului de reacţie.
Modificare cu anhidrida 2,3-dimetilmaleică Modificare cu anhidrida citraconică
Material* pH Raport C/ADM
(g/g)
Gradul de substituţie (mol %)
Material* pH Raport C/AC (g/g)
Gradul de substituţie (mol %)
ADM10.6 8 1/3 10,6 AC8.4 8 1/3 8,4
ADM8.2 8 1/5 8,2 AC5.6 8 1/5 5,6
ADM7.2 9 1/5 7,2 AC 9.6 9 1/5 9,6
*simbolul probei indică tipul de anhidridă folosit la modificare şi gradul de substituţie
Comparativ cu agentul de funcţionalizare AC, ADM a manifestat o
reactivitate mai crescută pentru colagen obţinându-se un grad de substituţie de 10,6
%, datorită susceptibilităţii mai mari de a hidroliza a anhidridei AC faţă de ADM.
V.4. Rezultatele titrării potenţiometrice şi ale analizei TOC/TN Curbele de titrare obţinute prin creşterea şi scăderea treptată a pH-ului
aproape au coincis şi sunt reversibile dovedind faptul că probele de colagen sunt
stabile, fără apariţia precipitării. Valorile medii pentru pKa pentru grupele carboxil
şi amino din colagenul nemodificat au fost de 4,3 şi respectiv 10,1 (Tabelul V.2).
Tabelul V.2. Valorile pKa obţinute pentru grupele carboxil şi amino ale materialelor de
colagen obţinute.
Denumirea probei
Media pKa pentru COOH
(pK1)
Conţinutul de grupări –COOH protonate
(mmol/Kg)
Media pKa pentru NH2
(pK2)
Conţinutul de grupări –NH3
+ protonate (mmol/Kg)
Colagen 4,3 33 10,1 13
AC 8.4 4,7 53 10 9
AC 9.6 4,8 70 10 2
ADM 7.2 4,7 46 9,9 7
ADM 10.6 5,1 81 9,9 4
La valori de pH de 4,3, jumătate din grupările carboxil din colagen sunt
deprotonate şi toate grupele amino sunt protonate. De asemenea, poate fi menţionat
că în jurul valorilor de pH 10, jumătate din conţinutul de −NH3+ sunt încă
disociate. Prin urmare, în structura colagenului (la pH puternic alcalin) vor fi
7
prezente un număr semnificativ de grupări amino terminale deprotonate care sunt
foarte propice în reacţia cu anhidride.
Grupele funcţionale cu valori mai mari ale pKa-ului au scăzut (grupele
amino) după modificarea colagenului, iar cele cu un pKa cuprins între 4,5–5,1 care
aparţin grupelor carboxil au crescut, fapt ce dovedeşte succesul modificării
colagenului.
V.5. Rezultatele DLS/SLS Masa moleculară medie (Mw) şi cel de-al doilea coeficient virial (A2) au
crescut după modificarea chimică, valori care au fost mai mari în cazul probelor cu
gradul de substituţie mai ridicat ceea ce semnifică faptul că, s-au format
interacţiuni puternice atât intramoleculare cât şi intermoleculare ce sunt în
concordanţă cu variaţia valorilor KA şi KB din datele vâscozimetrice.
Tabelul V.4. Valori ale Mw, A2, dimensiunea particulelor (media Z), PDI şi potenţialului
Zeta obţinute pentru colegenul modificat cu anhidride substituite.
Probă Mw (KDa) A2 104 (mL mol/g2)
Media Z (nm) PDI Potenţialul Zeta (mV)
Colagen 398 1,8 410 0,94 22,9 ADM7.2 876 10,44 1170 0,538 25,3
ADM8.2 1395 24,85 2100 0,165 28,0
ADM10.3 819 14,12 2700 0,407 24,1
AC5.6 558 22,45 2880 0,133 28,4
AC8.4 525 25,97 1840 0,559 26,3
AC9.6 598 17,56 2290 0,416 26,0
După reacţiile de modificare, indexul de polidispersitate (PDI) scade,
probele de colagen substituite devenind mult mai omogene în ceea ce priveşte
dimensiunea moleculelor. Dimensiunile particulelor au crescut după reacţia de
modificare cu anhidride de cel puţin 5 ori schimbându-se astfel şi distribuţia
acestora, efect pus pe seama modificării helixului triplu dar şi pe apariţia unor
aglomerări ale moleculelor de colagen.
V.6. Efectul concentraţiei şi temperaturii asupra comportamentului reologic al soluţiilor de colagen nemodificat şi al celor de colagen modificat cu anhidride
O diferenţă majoră este remarcată în vâscozitatea soluţiei de colagen
nemodificat comparativ cu vâscozităţile soluţiilor de colagen modificate cu AC şi ADM. Această diferenţă este cauzată de schimbarea formei şi dimensiunii
moleculelor de colagen în urma modificării cu anhidride. Astfel, prezenţa grupelor
acil în structura chimică a colagenului conduce la o creştere considerabilă a
dimensiunii moleculelor ce vor cauza ulterior creşterea vâscozităţii soluţilor.
Vâscozitatea intrinsecă şi cea inerentă au crescut semnificativ după
modificarea cu cele două anhidride demonstrând legarea chimică a acestora la
8
catenele din colagen provocând modificări conformaţionale ale moleculelor şi apariţia de interacţiuni puternice atât inter - macromoleculare cât şi cu moleculele
de solvent, fapt dovedit şi de valorile crescute ale mărimilor KA şi KB de până la de
20 sau 8 ori în cazul probelor de colagen modificate comparativ cu cel nemodificat.
Figura V.7 reprezintă graficul schimbării vâscozităţii relative la încălzire a
soluţiilor de colagen. După cum se poate vedea, toate soluţiile de colagen modificat
manifestă o descreştere bruscă a vâscozităţii relative (ηrel) în intervalul de
temperatură 28 - 38 oC urmând apoi o menţinere aproape constantă a acesteia la
temperaturi mai ridicate pâna la 46 oC. Probele de colagen modificate AC5.6 şi
ADM7.2, care au cel mai mic grad de substituţie, sunt mult mai stabile şi au o
temperatură de denaturare mai mare (32-33 oC) faţă de cele care au un grad de
substituţie mai mare şi care au arătat o Td mai scăzută (31 oC).
26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46
1
2
3
4
5
6
7
8
9
28 30 32 34 36 38 40 42 44 46
1.055
1.060
1.065
1.070
1.075
1.080
1.085
1.090
1.095
1.100
ηre
l
T, oC
ηre
l
Temperatura (o C)
Colagen
C-ADM7.2
C-ADM8.2
C-ADM10.6
C-AC5.6
C-AC8.4
C-AC9.6
Figura V.7. Reprezentarea
grafică a vâscozităţii relative
(ηrel) în funcţie de
temperatură a soluţiilor de
colagen modificate cu AC şi
ADM comparativ cu cea a
colagenului pur
V.7.1. Date termogravimetrice Curbele termogravimetrice (TG) pentru colagen şi materialele modificate
cu anhidride substituite au indicat prezenţa a două procese termice de pierdere a
masei. Primul etapă implică două procese suprapuse: denaturarea colagenului şi
eliminarea apei libere sau legate existente în material. Pe baza temperaturilor
iniţiale de descompunere prezentate în Tabelul V.7, se poate concluziona că
modificarea chimică a colagenului cu AC şi ADM a condus la creşterea stabilităţii
termice a materialelor în stare solidă.
Tabelul V.7. Caracteristici TG ale colagenului pur şi a celor modificate.
Probă Primul
proces Tmax (oC)
Al doilea proces Pierderea de masă (%)
(30 - 570 oC) Tonset
(oC)
Tmax
(oC)
Tendset
(oC)
Colagen 71 262 326 375 72
C-AC 9.6 82 273 318 373 69
C-ADM 10.6 77 270 326 371 72
Tonset = temperatura la care începe degradarea termică; Tmax = temperatura ce corespunde gradului maxim de degradare; Tendset = temperatura la care fiecare etapă de degradare ia sfârşit
9
Cel de al doilea proces de degradare termică, desfăşurat într-un interval
extins de temperatură, include reacţii de descompunere secvenţiale cu paşi multipli
de pierdere a masei. Făcând o comparaţie între temperaturile la care începe
degradarea termică (Tonset), au fost obţinute valori ridicate de 273 oC şi 270
oC
pentru produsele de colagen modificat comparativ cu Tonset a colagenului
nemodificat de 262 oC, fapt ce evidenţiază o rezistenţă termică mai ridicată.
V.8. Rezultatele testelor de adeziune in vitro S-au evidenţiat cele mai crescute valori ale lucrului mecanic în cazul
probelor C-ADM10.6 şi C-AC9.2 până la aproximativ 500 mm*mN comparativ cu
materialul de colagen nemodificat care a înregistrat un lucru mecanic de 234
mm*mN (Figura V.12). Prin urmare, proprietatea de adeziune a fost îmbunătăţită
pentru probele de colagen funcţionalizate cu anhidride cu cât gradul de substituţie a
fost mai crescut. Acest lucru este explicat de numărul mare grupări COOH nou
formate în urma procesului de modificare.
0
100
200
300
400
500
600
700
Colagen C-ADM7.2
C-ADM8.2
C-ADM10.6
C-AC5.6 C-AC8.4 C-AC9.2
Lu
cru
l m
ecan
ic d
e a
de
ziu
ne
(m
m*
mN
)
Figura V.12. Valorile medii ale lucrului mecanic necesar desprinderii materialelor
polimerice de colagen modificat de pe suprafaţa de analiză
CAPITOLUL VI. OBŢINEREA DE HIDROGELURI PE BAZĂ DE COLAGEN MODIFICAT ŞI 2-HIDROXIETIL METACRILAT VARIIND
TIPUL DE COLAGEN MODIFICAT
VI.2. Sinteza hidrogelurilor pe bază de 2-hidroxietil metacrilat şi colagen modificat cu anhidride (HEMA/CM)
Hidrogelurile au fost sintetizate prin utilizarea unui raport masic de 30 %
colagen modificat faţă de monomerul HEMA şi 2 % iniţiator APS (persulfat de
amoniu) faţă de TEMED (N, N, N’, N’ - tetrametiletilen diamina). De asemenea,
au fost utilizate 4 tipuri de colagen modificat cu anhidrida citraconică (AC) sau
anhidrida 2, 3 - dimetil maleică (ADM), obţinute şi caracterizate în capitolul
anterior: C-AC5.6, C-AC9.6, C-ADM7.2 şi C-ADM8.2. Hidrogelurile pe bază de
HEMA şi colagen modificat cu AC şi ADM au fost preparate prin reacţii de
polimerizare şi reticulare în prezenţa sistemului iniţiator redox APS/TEMED fără
implicarea agenţilor de reticulare chimici. Formarea hidrogelurilor a implicat mai
multe tipuri de reacţii chimice sau fizice între grupele funcţionale ale
componenţilor polimerici. Prin activarea macromoleculelor de colagen modificat
prin intermediul sistemului redox de iniţiatori, s-au produs reacţii de grefare ale
10
monomerilor de HEMA la catenele de colagen modificat (Figura VI.2.a).
Concomitent cu aceste reacţii au loc copolimerizarea şi reticularea
homopolimerului HEMA cu lanţurile funcţionalizate de colagen dezvoltându-se
astfel o reţea polimerică semi-interpenetrată (semi-IPN).
R1 =R2 =
(NH4)2S2O8 2SO4-
SO4-
+ H2O HSO4-+ OH
SO4-
NH
O
C C +
Colagen modificat
R1(R2)
C
CH3
COOH
(n+1) H2C C
CH3
C
HEMA
TEMED
APSOH +
O
O
OH
CH2 C
CH3
HC C
CH3
n
colagen modificat grefat cu pHEMA
C O
O
OH
C O
O
OH
NH C
O
C
OH
R1(R2)
C
COOH
CH3
H pentru AC
CH3 pentru ADM(a)
n = 1,2,.....
Figura VI.2. Reprezentarea schematică a reacţiilor posibile dintre macromolelculele de colagen modificat şi pHEMA induse de prezenţa sistemului inţiator redox APS/TEMED
Legăturile intermoleculare chimice şi fizice din reţeaua semi-
interpenetrată de hidrogel asigură integritate şi rezistenţă structurală crescută.
Materialele obţinute sunt insolubile în apă şi fluide biologice (Figura VI.3) şi au
caracter superabsorbant.
Figura VI.3. Aspectul hidrogelurilor menţinute
în apă bidistilată
VI.5. Comportamentul la umflare al hidrogelurilor Hidrogelurile studiate au o capacitate mare de umflare. La începutul
procesului de umflare, gradul de retenţie a crescut brusc înregistrându-se un grad
maxim de umflare dependent de compoziţia hidrogelului după aproximativ 20 de
minute, urmat apoi de atingerea echilibrului de umflare (Figura VI.6).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1440 28800
50
100
150
200
250
300
37 oC / pH 7.4
Gra
du
l de u
mfla
re (
%)
Timp (minute)
C-AC5.6/HEMA
C-AC9.6/HEMA
C-ADM7.2/HEMA
C-ADM8.2/HEMA
Figura VI.6. Profilul de umflare al hidrogelurilor
pe bază de colagen modificat şi HEMA
11
Diametrul mare al porilor conduce la scăderea gradului de umflare al
hidrogelurilor. S-a observat o capacitate mare de umflare în cazul probelor C-AC
5.6/HEMA şi C-ADM 8.2/HEMA, care au înregistrat un grad maxim de umflare de
240 % şi respectiv 205 %. Valorile exponentului de difuzie nsw au înregistrat valori
mai mici de 0,5 ceea ce sugerează faptul că viteza de penetrare a solventului este
mai mică decât viteza de relaxare a catenelor polimerice. Aceast comportament,
care este o subclasă a difuziei Fickiane, corespunde unei difuzii denumite ’less
Fickian’ [361].
VI. 6. Rezultate analizei calorimetrice DSC VI.6.1. Analiza în stare uscată a materialelor de colagen modificate cu anhidride şi a hidrogelurilor ce conţin aceste tipuri de colagen
Calorimetria diferenţială de baleiaj DSC permite măsurători asupra
stabilităţii structurii de triplu helix a moleculelor de colagen prin monitorizarea
schimbărilor în timpul tranziţiilor de fază [362, 363]. Din curbele DSC obţinute în
primul ciclu de încălzire a probelor (Figura VI.7.a) se evidenţiază un proces
endoterm care este atribuit tranziţiei de ordinul întâi specifică denaturării colagenului aflat în stare uscată. Această tranziţie apare la 186
oC în cazul
colagenului nemodificat şi la temperaturi mai ridicate (189 – 195 oC) în cazul
probelor de colagen modificat datorită formării de legături de hidrogen
intermoleculare cu participarea grupelor carboxil din structura colagenului
modificat cu anhidride. Această modificare a temperaturii de denaturare spre valori
mai ridicate sugerează o creştere a stabilităţii termice în urma funcţionalizării cu
anhidride.
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200-0,60
-0,55
-0,50
-0,45
-0,40
-0,35
-0,30
-0,25
-0,20
-0,15
-0,10
Flu
x d
e c
ãld
urã
/ M
asã
(m
W/m
g)
Temperaturã (oC)
Colagen
C-AC 5.6
C-AC 9.6
C-ADM 7.2
C-ADM 8.2
Endo
Exo
(a)
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
-0,60
-0,55
-0,50
-0,45
-0,40
-0,35
-0,30
-0,25
-0,20
-0,15
-0,10
Flu
x d
e c
ãldu
rã /
Masã
(m
W/m
g)
Temperaturã (oC)
Colagen C-AC 5.6 C-AC 9.6 C-ADM 7.2 C-ADM 8.2
Endo
Exo
(b)
Figura VI.7. Curbele DSC înregistrate între 20 şi 220 oC pe probele de
colagen nemodificat şi modificat în stare uscată: primul ciclu de încălzire
(a), al doilea ciclu de încălzire (b)
În Figura VI. 7.b sunt prezentate curbele DSC înregistrate în timpul celui
de-al doilea ciclu de încălzire la care au fost supuse materialele de colagen
nemodificat şi modificate. Se observă că denaturarea endotermă dispare indicând
faptul că structura ordonată specifică colagenului se pierde în mod ireversibil.
Singurul fenomen observat pe curbele DSC înregistrate la cel de-al doilea ciclu de
încălzire este procesul de tranziţie sticloasă specific gelatinei care apare la
temperaturi mai scăzute faţă de procesul de denaturare al colagenului. În acest
studiu, temperatura de tranziţie sticloasă a gelatinei (Tg) a înregistrat valori
cuprinse între 165 şi 190 oC.
12
Au fost observate câteva diferenţe majore între proprietăţile materialelor
de colagen modificat şi hidrogeluri. Prin copolimerizarea colagenului modificat cu
HEMA, temperatura de denaturare suferă o descreştere semnificativă care poate fi
cauzată de formarea homopolimerilor de pHEMA (Figura VI.8.a) [369].
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200-0,40
-0,35
-0,30
-0,25
-0,20
-0,15
-0,10
-0,05
Flu
x d
e cã
ldurã
/ M
asã
(m
W/m
g)
Temperaturã (oC)
C-AC 5.6/HEMA C-AC 9.6/HEMA C-ADM 7.2/HEMA C-ADM 8.2/HEMAEndo
Exo
(a)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
-0,40
-0,35
-0,30
-0,25
-0,20
-0,15
-0,10
-0,05
Flu
x d
e cãld
urã
/ M
asã
(m
W/m
g)
Temperaturã (oC)
C-AC 5.6/HEMA C-AC 9.6/HEMA C-ADM 7.2/HEMA C-ADM 8.2/HEMAEndo
Exo
(b)
Figura VI.8. Curbele DSC înregistrate pentru
hidrogeluri aflate în stare uscată, pe un interval de temperatură cuprins între 0 oC şi 220 oC: primul (a) şi al doilea ciclu de
încălzire (b)
VI.6.2. Analiza în stare hidratată a materialelor de colagen modificate cu anhidride şi a hidrogelurilor ce conţin aceste tipuri de colagen
Parametrii de denaturare, care au valori foarte diferite faţă de cele obţinute
pe probe uscate, în cazul colagenului pur au fost: Tdh = 65 oC şi ∆Hdh = 58,2 J/g
(Figura VI.9), valori ce sunt apropiate cu cele raportate în literatură (64 oC) [370].
-40 -20 0 20 40 60 80 100
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
Flu
x d
e cã
ldurã
/ M
asã
(mW
/mg
)
Temperaturã (oC)
Colagen pur (primul ciclu de încãlzire)
Colagen pur (al doilea ciclu încãlzire)
Endo
Exo
Figura VI.9. Curba DSC a colagenului
nemodificat înregistrată între -50 oC şi 100 oC
Vârful larg ,endoterm care apare
la un interval de temperatură cuprins
între -20 oC şi 10
oC este atribuit apei
libere, care îngheaţă. Valorile
temperaturilor Tdh în cazul probelor în
stare hidratată sunt mai mici
comparativ cu cele ale aceloraşi
materiale dar care se află în stare
complet uscată. Acest fenomen este
pus pe seama efectului de plastifiere
al apei [371].
Creşterea valorilor în cazul temperaturilor de denaturare ale materialelor
de colagen modificate se explică prin reticularea parţială care se produce în timpul
procesului de modificare datorită prezenţei grupelor vinilice. Reticularea şi copolimerizarea colagenului modificat cu HEMA au condus la descreşterea
temperaturii de denaturare deoarece lanţurile reticulate formate sunt mai lungi şi
mai flexibile decât cele formate prin participarea grupelor vinilice. Prin urmare,
catenele din compoziţia hidrogelurilor aflate în stare umedă se pot reordona mult
mai uşor.
Valorile scăzute ale entalpiilor (∆Hdh) înregistrate pentru materialele de
colagen modificat cu AC (55,21 şi 52,17 J/g) şi cu ADM (50,07 şi 48,72 J/g)
sugerează o stabilitate mai scăzută comparativ cu colagenul pur în stare hidratată
13
(58,2 J/g), de asemenea hidrogelurile sunt mai puţin stabile (∆Hdh = 1,75–4,43 J/g)
la acest nivel de hidratare (60–65 %) comparativ cu celelalte forme hidratate ale
materialelor pe bază de colagen. Însă, la un nivel de hidratare maxim, atât
colagenul nemodificat cât şi probele de colagen modificate devin solubile în apă
sau soluţii acide, în timp ce hidrogelurile se menţin stabile (Figura VI.3). Prin
urmare, hidrogelurile investigate sunt forme stabile ce pot fi utilizate în scop
medical. La reîncălzire, denaturarea hidrogelurilor este ireversibilă datorită dispariţiei complete a vârfului corespunzător temperaturii de tranziţie.
S-a înregistrat un procent foarte ridicat de apă legată la primul ciclu de
încălzire în cazul materialelor de colagen modificat de aproximativ 50 % (adică
0,5–0,54 g/g) indicând prezenţa unei cantităţi mai mari de grupe polare ce dau
caracter puternic hidrofil al biopolimerilor modificaţi. O creştere şi mai însemnată a conţinutului de apă legată s-a observat la cel de-al doilea ciclu de încălzire (0,52–
0,66 g/g), ceea ce înseamnă că prin încălziri succesive apa liberă devine legată.
Valorile entalpiei de fuziune a gheţii din cel de-al doilea ciclu de încalzire sunt mai
mici decât cele din primul ciclu de încălzire pentru toate materialele investigate.
Comparativ cu matricea de colagen, reţelele semi-interpenetrate au prezentat o
descreştere a conţinutului de apă legată de la 0,5–0,64 la 0,32–0,36 g/g şi o creştere
a conţinutului de apă liberă probabil datorită angajării grupelor hidrofile în
formarea de noduri în reţeaua polimerică.
Toate caracteristicile termice ale procesului de topire a gheţii, şi anume
entalpia de topire ∆HW, şi temperaturile TonsetW şi TmaxW, pentru materialele de
colagen modificat sunt apropiate de cele ale colagenului pur. Însă, în cazul
hidrogelurilor s-a observat o creştere semnificativă a acestor parametri sugerând o
interacţiune puternică a apei cu moleculele polimerice din reţeaua de hidrogel.
Această observaţie este susţinută şi de valorile ridicate obţinute asupra
conţinuturilor de apă legată care se păstrează şi în urma celui de-al doilea ciclu de
încălzire comparativ cu cele ale probelor de colagen modificat care au scăzut în
urma ciclului secund de încălzire.
CAPITOLUL VII. OBŢINEREA DE HIDROGELURI PE BAZĂ DE COLAGEN MODIFICAT ŞI 2-HIDROXIETIL METACRILAT VARIIND
CONŢINUTUL DE COLAGEN MODIFICAT ŞI AL AGENTULUI DE INIŢIERE
VII.2. Sisteme investigate Hidrogelurile de diferite compoziţii pe bază de 2-hidroxietil metacrilat
(HEMA) şi colagen modificat cu anhidridă (C-AC sau C-ADM) au rezultat în urma
reacţiilor de copolimerizare radicalică şi reticulare parţială ce s-au produs în
prezenţa sistemului de iniţiere redox format din persulfat de amoniu şi N,N,N’,N’–
tetrametiletilendiamină (APS/TEMED) (Figura VII.1).
14
Figura VII.1. Reprezentarea schematică a reţelei polimerice semi-interpenetrate pe bază de
colagen modificat şi HEMA
Pentru reacţia de copolimerizare a monomerilor de HEMA cu
macromoleculele de colagen modificat se are în vedere utilizarea unui conţinut
minim de CM (colagen modificat) care poate oferi sistemului proprietăţi
îmbunătăţite şi receptivitate la pH fără costuri ridicate. Rapoartele masice ale
acestor componenţi sunt prezentate în Tabelul VII.1.
Tabelul VII.1. Hidrogelurile copolimerice sintetizate.
Simbol HEMA (%) CM (C-AC sau C-ADM) (%) APS (%)
4C-CM/1.6APS 94,4 4 1,6
6C-CM/1.3APS 92,7 6 1,3
6.7C-CM/1.5APS 91,8 6,7 1,5
7C-CM/1APS 92 7 1
7C-CM/1.6APS 91,4 7 1,6
7C-CM/2APS 91 7 2
HEMA – 2 hidroxietil metacrilat, CM – colagen modificat, C-AC – colagen modificat cu AC, C-ADM – colagen modificat cu ADM, APS – persulfat de amoniu
VII.3. Analiza spectrală FT-IR În spectrele hidrogelurilor pe bază de colagen modificat (Figura VII.2) se
evidenţiază câteva modificări prin interferarea benzilor corespunzătoare
colagenului cu cele ale homopolimerului de pHEMA. Banda de absorbţie mult mai
largă şi mai intensă din regiunea 3655 – 3178 cm-1
este rezultatul suprapunerii
benzilor de absorbţie a grupărilor –OH ale pHEMA cu cele corespunzătoare
grupărilor –NH3+ ale colagenului de la amida A. De asemenea, vibraţia de alungire
a grupării esterice C=O (νC=O) (amida I) din colagenul modificat ce apare la 1656
cm-1
interferă cu banda de la 1650 cm-1
atribuită vibraţiei C=C din pHEMA
cauzând apariţia unui umăr la o lungime de undă de 1666 cm-1
în spectrele
hidrogelurilor.
15
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Tra
nsm
itan
tã (
u.a
.)
N um ãr de undã (cm-1
)
C -AC; pHEMA; C -AC/HEM A; C -ADM/HEMA
Figura VII.2. Spectrele FT-IR ale colagenului modificat (C-AC), homopolimerului de poli (2 -
hidroxietil metacrilat) (pHEMA) şi a hidrogelurilor pe bază HEMA şi colagen modificat cu anhidrida citraconică (C-AC/HEMA) şi anhidrida 2,3 – dimetil maleică (C-AMD/HEMA)
Valorile procentelor randamentului de reacţie au fost relativ crescute de
75- 89 % indicând faptul că hidrogelurile au prezentat o capacitate bună de
conservare a masei în urma reacţiei de sinteză, demonstrând în acelaşi timp şi
faptul că reacţiile de copolimerizare şi reticulare au avut loc cu succes. S-a
observat că o creştere a concentraţiei de iniţiator în reacţia de preparare a condus la
o creştere a eficienţei reacţiei de copolimerizare/reticulare.
VII.6. Analiza morfologică şi determinarea gradului de umflare în condiţii similare mediului fiziologic
Morfologia poroasă a hidrogelurilor observată în Figura VII.3 a fost
creată prin stabilizarea reţelei polimerice tridimensionale după procesul de
copolimerizare radicalică şi prin liofilizarea hidrogelurilor aflate în stare umflată.
Morfologia hidrogelurilor este caracterizată prin pori interconectaţi de dimensiuni
diferite care depind în principal de cantitatea de iniţiator utilizată la preparare.
(a) (b)
Figura VII.3. Imaginile SEM (400 µm) pentru hidrogelurile C-AC/HEMA (a) şi C-ADM/HEMA (b) realizate în secţiune şi la suprafaţă
S-au realizat studii asupra capacităţii de umflare a hidrogelurilor în soluţie
tampon de pH 7,4 la temperatura de 37 oC, care simulează condiţiile fiziologice.
Conform comportamentului la umflare (Figura VII.4) şi a imaginilor SEM (Figura
VII.3), sistemele polimerice obţinute pot fi clasificate ca hidrogeluri super-poroase
16
cu porozitate crescută şi pori interconectabili. Primul impact al hidrogelurilor cu
soluţia tampon a produs o umflare extrem de rapidă până la un minut datorită
capilarelor care au o putere de absorbţie mult mai mare decât simpla absorbţie prin
difuzie. Gradul de umflare (GU) al hidrogelurilor a atins un maxim după 2–3 ore,
apoi menţinându-se o stare de echilibru.
0 20 40 60 80 2800 2840 2880
0
50
100
150
200
250
37 oC / pH 7.4
Gra
dul d
e u
mflare
(%
)
Timp (minute)
4C-AC/1.6APS
6C-AC/1.3APS
6.7C-AC/1.5APS
7C-AC/1APS
7C-AC/1.6APS
7C-AC/2APS
(a)
0 20 40 60 80 2800 2840 2880
0
50
100
150
200
250
300
37 oC / pH 7.4
Gra
dul de
um
flare
(%
)
Timp (minute)
4C-ADM/1.6APS
7C-ADM/2APS
6.7C-ADM/1.5APS
7C-ADM/1.6APS
(b)
7C-ADM/1APS
6C-ADM/1.3APS
Figura VII.4. Profilele de umflare ale hidrogelurilor pe
bază de colagen modificat şi HEMA:
C-AC/HEMA (a) şi C-ADM/HEMA (b)
S-a observat o densitate mare asociată cu o flexibilitate şi elasticitate
scăzută în cazurile hidrogelurilor cu un conţinut mic de colagen modificat (4C-
AC/1.6APS cu GU = 104 % şi 4C-ADM/1.6APS cu GU = 136 %). Aceste aspecte
morfologice coincid cu o capacitate scăzută de expandare şi un grad de umflare
mic. Celelalte hidrogeluri copolimerice au arătat valori ale gradului de umflare mai
ridicate datorită prezenţei unei cantităţi mai mari de grupări funcţionale hidrofile
provenite de la componenta de colagen modificat [386].
Prezenţa unui conţinut crescut de iniţiator în matricea polimerică (de până
la 2 %) a indus descreşterea dimensiunilor porilor de la 11,8 µm până la 7,5 µm
cauzând ulterior descreşterea caracterului absorbant al hidrogelurilor de la 189 %
la 119 % datorită intensificării interacţiunilor interpolimerice care au ca efect
densificarea reţelei polimerice şi blocarea penetrării solventului în interiorul
matricei.
Valorile exponentului de umflare nsw sunt mai mici decât 0,5 şi indică un
mecanism de transport “less-Fickian”. Probele de hidrogel 4C-AC/1.6APS şi 7C-
AC/2APS au înregistrat cele mai mici valori ale exponentului nsw de 0,073 şi
respectiv 0,064, însemnând faptul că relaxarea lanţurilor polimerice este dominată
mai mult de o structură rigidă a matricei polimerice datorită prezenţei unui conţinut
mai scăzut de colagen modificat (4 % C-AC) sau mai crescut de iniţiator (2 %
APS). Valorile constantei de viteză ksw corespunzătoare probelor 4C-AC/1.6APS şi
4C-ADM/1.6APS au fost cele mai mici sugerând cele mai mici viteze de umflare,
fenomen observat de asemenea şi în Figura VII.4. Faptul că hidrogelurile au
manifestat un proces de umflare rapid cu un grad de umflare crescut, confirmă
posibilitatea acestora de a fi utilizate ca biomateriale flexibile şi cu grad crescut de
hidratare în aplicaţiile ingineriei tisulare.
17
VII.7. Dependenţa de pH a comportamentului la umflare al hidrogelurilor Proteina de colagen modificată cu anhidridă citraconică (C-AC),
cunoscută ca fiind o macromoleculă zwitterionică, a fost selectată pentru obţinerea
de hidrogeluri pe bază de HEMA sensibile la pH. Pentru a investiga dependenţa de
pH a comportamentului la umflare, hidrogelurile 4C-AC/1.6APS şi 6.7C-
AC/1.5APS, de compoziţii diferite, au fost imersate în soluţii tampon cu pH diferit
ce a variat între 3,0 şi 12,0.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
100
120
140
160
180
200
GU
(%
)
pH
4C-AC/1.6APS
6.7C-AC/1.5APS
Figura VII.6. Reprezentarea valorilor
gradului de umflare la echilibru (GU) în funcţie de pH mediului de umflare
Din Figura VII.6 se observă o
dependenţă a gradelor maxime de umflare
în funcţie de pH, curba rezultată având
forma literei ”U”. Prin urmare,
hidrogelurile au avut o capacitate mai mare
de umflare în condiţii de pH mai mici decât
4,7 şi mai mari decât 10,0, iar odată cu
apropierea pH-ului spre valori neutre
capacitatea de absorbţie a solventului a
scăzut.
Creşterea gradului de umflare al hidrogelurilor la pH<4,7 este cauzată de
ionizarea tuturor grupelor amino, iar la pH>10,0 creşterea GU este datorată
ionizării tuturor grupelor carboxil care au ca efect creşterea repulsiei electrostatice
dintre grupele carboxilat încărcate negativ [390]. Mai mult, la valori de pH=3,0
gradul de umflare a fost mult mai crescut decât în condiţii de pH = 12,0 probabil
datorită prezenţei unui conţinut mai scăzut de grupe carboxil libere în urma sintezei
hidrogelurilor, acestea reacţionând cu monomerii de HEMA în timpul reacţiei de
copolimerizare şi reticulare. Cel mai mic grad de umflare a fost înregistrat la
imersarea probelor în soluţii tampon de pH=7,2, pH ce este apropiat de valoarea
punctului izoelectric al colagenului modificat (P.I.=7,3) unde apare un echilibru
între absorbţia şi eliberarea de protoni.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130,04
0,08
0,12
Exp
on
en
tul
de
um
flare
n
pH
4C-AC/1.6APS
6.7C-AC/1.5APS
(a)
Figura VII.7. Variaţia valorilor nsw în funcţie de pH
Din datele cinetice de umflare
s-a remarcat, de asemenea, că la
valori extreme de pH, şi anume la pH
3,0 şi respectiv 10,0, exponentul de
umflare nsw a înregistrat cele mai
mari valori ce corespund unui proces
de umflare controlat mai mult de
difuzie (Figura VII.7.a).
VII.8. Degradarea enzimatică in vitro a hidrogelurilor Degradarea hidrogelurilor pe bază de colagen modificat cu anhidride au
fost expuse la colagenaza provenită din Clostridium histolyticum. Degradarea
18
hidrogelurilor a fost evidenţiată prin analiza spectrelor FT-IR în care s-a observat
dispariţia benzii de absorbţie corespunzătoare amidă II din structura colagenului
modificat.
În Figura VII.9 sunt ilustrate imaginile SEM ale hidrogelurilor C-
AC/HEMA nedegradate şi degradate.
4C-AC/1.6APS 7C-AC/1APS 7C-AC/1.6APS 7C-AC/2APS
Hidrogeluri nedegradate
Hidrogeluri degradate
Figura VII.9. Imaginile SEM realizate în secţiune ale unor hidrogeluri liofilizate de C-AC/HEMA aflate în stare nedegradată (sus) şi degradată (jos); scala imaginilor este de 100 µm
Dezintegrarea enzimatică a generat formarea de pori cu dimensiuni mici
în interiorul matricei de colagen ce înconjoară porii foarte mari.
În urma procesului de degradare porii au devenit mult mai mari
nemaifiind interconectaţi ci bine definiţi datorită distrugerii componentei proteice
de către enzimă. Dacă în cazul hidrogelurilor nedegradate media dimensiunii
porilor a fost de 7,5–11,8 µm, după degradarea enzimatică aceasta a crescut la
10,2–23,4 µm.
Hidrogelurile nu s-au degradat în totalitate ci doar componenta de colagen
din matrice a fost “digerată” de colagenază. În consecinţă, deşi viteza de degradare
este considerată a fi destul de rapidă (câteva zile), semi-biodegradabilitatea lor
dobândită prin prezenţa lanţurilor de pHEMA (care sunt rezistente la degradarea
enzimatică) le dă posibilitatea de a fi utilizate în aria biomedicală ca pansamente
parţiale pentru tratarea rănilor superficiale sau moderate.
19
VII.9. Studiul de eliberare a ciprofloxacinei în condiţii care simulează mediul fiziologic
În vederea evaluării funcţiei de suport/transportor pentru înglobare şi
eliberare de principii active a hidrogelurilor pe bază de HEMA şi colagen
modificat cu AC sau ADM, s-a utilizat monohidratul ciprofloxacinei hidroclorurate
(CF), un antibiotic foarte cunoscut în tratarea infecţiilor.
Spectrele FT-IR şi imaginile SEM (Figura VII.13) au confirmat prezenţa
medicamentului în matricea polimerică a hidrogelurilor.
(a) (b)
Figura VII.13. Imaginile SEM ale hidrogelurilor 4C-
AC/1.6APS (a) şi 4C-ADM/1.6APS (b) încărcate cu CF
În imaginile SEM ale hidrogelurilor încărcate cu medicament se pot
observa diferite forme de microcristale ale pudrei de ciprofloxacină ce se regăsesc
fie sub formă de aglomerări, fie individuale. Se observă prezenţa cristalelor
înglobate în interiorul matricei polimerice dar şi în spaţiile porilor.
Modul de eliberare a CF din matricile polimerice este reprezentat în
Figura VII.14 şi a fost studiat la o temperatură constantă de 37 oC în soluţie tampon
fosfat pH 7,4 similar cu valoarea de pH a sângelui sau a unei răni infectate.
În prim stadiu, viteza de eliberare a CF a fost rapidă (câteva minute) fiind
asociată cu efectul ”burst” care este cauzat de capacitatea de umflare rapidă a
hidrogelurilor sau de difuzia mai rapidă a medicamentului situat pe sau în
apropierea suprafeţei polimerice [400]. Ulterior, s-a remarcat un proces de
eliberare gradual ce s-a extins pe o perioadă de câteva ore (până la 50 de ore)
datorită unei difuzii lente a antibioticului din matricea polimerică spre mediul
exterior.
0 1000 2000 3000 4000 5000 60000
2
4
6
8
10
12
14
16 37 oC / pH 7.4
Gra
dul d
e d
eg
rad
are
(%
)
Timp (minute)
7C-AC/1 APS
7C-AC/1.6 APS
7C-AC/2 APS
(a)
Figura VII.11. Efectul colagenazei asupra
degradării hidrogelurilor
Creşterea conţinutului
agentului de iniţiere (APS) a
permis crearea unei reţele cu o
densitate crescută care la rândul
ei a cauzat o scădere a capacităţii
de umflare şi a restricţionat
degradarea enzimatică a
hidrogelurilor (Figura VII.11).
20
0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 30000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
37 oC / pH 7.4
Gra
du
l d
e e
lib
era
re (
%)
Timp (minute)
4C-AC/1.6APS-CF
7C-AC/1APS-CF
7C-AC/1.6APS-CF
7C-AC/2APS-CF
(a)
Figura VII.14. Profilele de eliberare ale ciprofloxacinei
din hidrogelurile C-AC/HEMA-CF în condiţii
care simulează mediul fiziologic
Atât timpul necesar eliberării totale de CF (tmax) cât şi timpul necesar
scăderii la jumătate a concentraţiei de CF din cantitatea totală încorporată (t1/2) au
crescut odată cu creşterea conţinutului de CM şi APS datorită legăturilor de
hidrogen formate între medicament şi grupele polare ale componenţilor polimerici
din hidrogeluri. Viteza de eliberare a depins de difuzia medicamentului prin porii
hidrogelurilor. Astfel, o viteză de eliberare mai mare a fost evidenţiată în cazul
hidrogelurilor cu pori de dimensiuni mai mici şi cu o cantitate mai mică de colagen
modificat.
VII.10. Dependenţa de pH a eliberării ciprofloxacinei din hidrogeluri Dependenţa procesului de eliberare a CF în funcţie de pH-ul mediului de
eliberare a fost evaluată la următoarele valori de pH: 3,0; 4,3; 5,5; 7,4; 10,1 şi 12,0.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
0
500
1000
1500
2000
2500
t max (
min
ute
)
pH
4C-AC/1.6APS-CF
7C-AC/1APS-CF
7C-AC/2APS-CF
Figura VII.16. Influenţa timpului necesar
eliberării totale de CF (tmax) în funcţie de pH-ul mediului de eliberare
Se poate constata o viteză mai lentă de
eliberare a ciprofloxacinei hidroclorurate
în cazul ambelor hidrogeluri investigate la
utilizarea unui mediu tampon de pH 7,4
sau 10,1 (Figura VII.16). În condiţii de pH
7,4 acest efect este cauzat atât de
capacitatea de umflare scăzută a
hidrogelurilor la pH neutru încetinind
astfel difuzia medicamentului din
matricea polimerică spre exterior, cât şi de
solubilitatea scăzută a CF la acest pH.
Timpul necesar atingerii platoului la o cantitate maximă eliberată (tmax) a
crescut semnificativ pâna la 1080–2220 minute când probele au fost imersate în
soluţii de pH 7–10. La efectuarea testelor de eliberare în medii de pH foarte acid
(pH = 3,0) sau foarte bazic (pH=12,0), starea de echilibru a fost atinsă într-un
interval foarte scurt de timp de doar 170–345 minute şi respectiv 255 – 390 minute.
VII.11. Determinarea toxicităţii acute in vivo a hidrogelurilor CM/HEMA În urma evaluării in vivo din punct de vedere toxicologic, se poate aprecia
că DL50 (doza letală care produce moartea a 50 % din animale) pentru materialele
21
polimerice investigate este mai mare de 4000 mg/kg corp la 24 de ore, la 48 de ore,
72 de ore, 7 zile şi 14 zile de la administrarea intraperitoneală a suspensiei. Acestă
valoare a DL50 încadrează hidrogelurile în grupul celor cu grad redus de toxicitate.
VII.12. Rezultatele testelor de biocompatibilitate in vivo a hidrogelurilor CM/HEMA
Studiul de biocompatibilitate in vivo a evidenţiat apariţia unei reacţii
inflamatorii, prin creşterea uşoară a granulomului apărut la locul implantului de
hidrogeluri, însă valorile obţinute s-au încadrat în limite normale neexistând
diferenţe semnificative faţă de lotul control sănătos. Implantarea de pelete cu
hidrogeluri încărcate cu CF a cauzat o scădere a mediei modificărilor greutăţii animalelor şi a granulomului uscat comparativ cu lotul care a primit pelete cu
hidrogeluri neâncărcate cu CF indicând un efect intens de inhibare a procesului de
proliferare a celulelor macrofage.
Faţă de hidrogelurile fără medicament, materialele polimerice încărcate cu
CF au inhibat semnificativ reacţiile inflamatorii subcutanate, fapt argumentat de
scăderea capacităţii fagocitare a leucocitelor polimorfonucleare neutrofile din
sângele periferic şi a procentelor de limfocite serice.
De asemenea, buna biocompatibilitate a hidrogelurilor implantate sub
formă de pelete a fost atestată de lipsa variaţiei activităţii transaminazelor hepatice,
ceea ce nu denotă o influenţă negativă a fenomenului inflamator asupra funcţiei
hepatice. Parametrii imuni determinaţi pe loturile ce au primit pelete pe bază de
hidrogeluri sau hidrogeluri înglobate cu ciprofloxacină nu au prezentat schimbări faţă de lotul martor.
CAPITOLUL VIII. TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA PH A UNOR HIDROGELURI PE BAZĂ DE CHITOSAN ŞI POLI (ALCOOL VINILIC)
VIII.2. Sensibilitatea la pH a comportării la umflare a hidrogelurilor PVA/CHT
Influenţa pH-ului asupra gradului maxim de umflare a membranelor de
PVA respectiv PVA/CHT a fost evaluată prin imersarea în soluţii tampon de pH
1,2; 4,0; 5,5; 6,5; 7,4; 8,5 şi 9,5 la temperatura constantă de 37 oC.
Deoarece chitosanul folosit în acest studiu are o masă moleculară medie
mică difuzia moleculelor de solvent printre lanţurile polimerice are loc mult mai
rapid [430] astfel încât adaosul unei cantităţi mai însemnate de chitosan în etapa de
sinteză a hidrogelurilor va conduce la o creştere a capacităţii lor de umflare (Figura
VIII.2.a). De asemenea, prin scăderea conţinutului de chitosan, s-a observat o
descreştere a sensibilităţii la pH în ordinea următoare: PVA/CHT60/40 >
PVA/CHT80/20 > PVA/CHT90/10.
Pentru toate sistemele polimerice investigate, cel mai mare grad de
umflare a fost înregistrat la pH 1,2, iar odată cu creşterea pH-ului proprietăţile de
umflare ale acestora au scăzut şi cel mai mic grad de umflare înregistrându-se la
22
imersarea în soluţie tampon de pH 9,5. Aceste rezultate sunt datorate prezenţei de
grupări cu sensibilitate la pH cum sunt grupările amino libere (-NH2) de la
carbonul C-2 al chitosanului care în soluţii acide se ionizează (–NH2+H+↔–NH3
+).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
180
210
240
270
300
330
360
390
420
GU
(%
)
CHT (%)
pH 1.2 pH 6.5
pH 4.0 pH 7.4
pH 5.5 pH 8.5
(a)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
200
250
300
350
400
450
GU
(%
)pH
PVA
PVA/CHT 90/10
PVA/CHT 80/20
PVA/CHT 60/40
(b)
Figura VIII.2. Reprezentarea grafică a gradului de umflare la echilibru (GU) în funcţie de conţinutul de chitosan (a) şi de pH-ul mediului de imersare (b) la 37 oC pentru hidrogelurile de PVA şi PVA/CHT
Membrana de PVA nu prezinta o variaţie a gradului de umflare cu pH-ul -
Figura VIII.2b. Gradul de umflare al hidrogelurilor de PVA/CHT având conţinuturi
diferite de chitosan a scăzut odată cu creşterea pH-ului. O variaţie bruscă a
gradului de umflare a fost observată la pH = 6,68 pentru proba PVA/CHT 90/10,
pH = 6,65 pentru proba PVA/CHT 80/20 şi pH = 6,37 pentru proba PVA/CHT
60/40, evidenţiind sensibilitatea la pH a membranelor investigate.
Exponentul de umflare nsw a scăzut odată cu creşterea pH-ului şi a variat
în intervalul 0,099–0,33 indicând un mecanism de transport ”pseudo-Fickian” în
care relaxarea lanţurilor polimerice a fost neglijabilă în timpul sorbţiei. Acest
comportament al difuziei poate fi atribuit structurii dense a reţelei care limitează
capacitatea hidrogelului de a încorpora o cantitate mare de solvent [434].
1 2 3 4 5 6 7 8 9 100,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
k (
min
-n)
pH
PVA
PVA/CHT 90/10
PVA/CHT 80/20
PVA/CHT 60/40
Figura VIII.3. Reprezentarea grafică a variaţiei constantei de
viteză ksw în funcţie de pH-ul soluţiei de imersare
O creştere a valorilor constantei ksw odată cu
creşterea pH-ului spre alcalin însoţită de o variaţie
bruscă în jurul valorii de pH = 6,5 care este
asociată pKa–ului chitosanului a fost observată în
FiguraVIII.3 demonstrând-se caracterul de
receptivitate al hidrogelurilor la varierea
stimulului de pH. În cazul probei de PVA, fără
chitosan, acest parametru cinetic nu a manifestat
schimbări semnificative la modificarea valorilor
de pH sugerând lipsa de interacţiuni specifice între
reţeaua polimerică şi moleculele de solvent.
VIII.4. Studii de eliberare in vitro a ciprofloxacinei hidroclorurate monohidratate (CF) din matricile hidrogelurilor pe bază de PVA şi PVA/CHT
Profilul cinetic de eliberare al ciprofloxacinei din matricile hidrogelurilor
de PVA şi PVA/CHT pe durata a 24 de ore este prezentat în Figura VIII.6.
Rezultatele experimentale au evidenţiat o eliberare controlată dependentă
de compoziţia hidrogelurilor polimerice şi de mediul în care acestea au fost
imersate. Iniţial, în primele 5 - 7 minute de eliberare are loc o difuzie mult mai
23
rapidă a antibioticului spre exteriorul matricei polimerice, care este asociată cu
efectul ”burst” şi care este datorată solubilităţii foarte crescute al antibioticului.
Efectul ”burst” este mult mai pronunţat în cazul hidrogelurilor cu un conţinut de
chitosan mai mare şi în condiţii de pH acid. Ulterior, are loc o încetinire a vitezei
de eliberare urmată de atingerea unui echilibru.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
37 oC / pH 4.5
Gra
du
l de
elib
era
re (
%)
Timp (minute)
PVA_CF
PVA/CHT 90/10_CF
PVA/CHT 80/20_CF
PVA/CHT 60/40_CF
(a)
0 200 400 600 800 1000 1200
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
37 oC / pH 7.4G
radul de e
libera
re (
%)
Timp (minute)
PVA_CF
PVA/CHT 90/10_CF
PVA/CHT 80/20_CF
PVA/CHT 60/40_CF
(b)
Figura VIII.6. Evidenţierea dependenţei profilului de eliberare al medicamentului (CF) din hidrogeluri în funcţie de conţinutul de CHT la pH 4,5 (a) şi la pH 7,4 (b)
În ceea ce priveşte dependenţa de conţinutul de CHT (Figurile VIII.6.a şi
VIII.6.b), se observă o scădere a timpului necesar eliberării totale a
medicamentului în mediul de imersare (tmax) odată cu creşterea conţinutului de
chitosan datorită creşterii gradului de umflare care cauzează difuzia mult mai
rapidă a medicamentului din matricea polimerică în mediul tampon. Astfel,
matricea de PVA a înregistrat cel mai lent proces de eliberare al ciprofloxacinei iar
matricea PVA/CHT 60/40 a eliberat medicamentul în cel mai scurt timp.
4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5
72
76
80
84
88
92
96
100
Gra
dul de e
libera
re (
%)
pH
PVA_CF
PVA/CS 90/10_CF
PVA/CS 80/20_CF
PVA/CS 60/40_CF
Figura VIII.7. Variaţia cantităţii maxime de medicament eliberată la echilibru cu
pH-ul mediului de eliberare şi cu compoziţia de chitosan din hidrogeluri
Odată cu creşterea conţinutului de chitosan
s-a înregistrat o creştere a cantităţii maxime
eliberate, fenomen asociat cu creşterea
gradului de umflare la creşterea conţinutului
de chitosan. În comparaţie cu hidrogelurile
ce conţin chitosan, matricea de PVA a
înregistrat cel mai scăzut grad de eliberare.
De asemenea, se poate remarca o scădere
bruscă a cantităţii maxim eliberate în jurul
valorii de pH 6,56 care reprezintă punctul
critic al hidrogelurilor (Figura VIII.7).
4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
Tim
pu
l n
ec
es
ar
eli
be
rãri
i
tota
le d
e C
F (
min
)
pH-ul mediului de eliberare
PVA_CF
PVA/CHT 90/10_CF
PVA/CHT 80/20_CF
PVA/CHT 60/40_CF
Figura VIII.8. Reprezentarea grafică a
timpului necesar eliberării totale de CF din
hidrogelurile investigate în funcţie de pH
24
S-a înregistrat profilul de eliberare cel mai susţinut (până la 16 ore) în
cazul imersării sistemelor polimerice în soluţie tampon de pH 7,4 atât datorită
gradului de umflare al matricilor polimerice care este cel mai scăzut la acest pH cât
şi datorită solubilităţii scăzute a medicamentului în mediu bazic (Figura VIII.8).
Scăderea gradul de umflare în mediu bazic este cauzată de deprotonarea grupărilor
amino din chitosan. Contrar, la pH scăzut grupele aminice sunt protonate conferind
chitosanului un comportament policationic.
CAPITOLUL IX. HIDROGELURI HIBRIDE SENSIBILE LA pH ŞI TEMPERATURĂ PE BAZĂ DE COLAGEN ŞI POLI N-IZOPROPIL
ACRILAMIDĂ
IX.3. Analiza de calorimetrie diferenţială de baleiaj (DSC) a hidrogelurilor în stare hidratată
Starea apei şi procesul de denaturare al colagenului, hidrogelului pe bază
de colagen şi PNIPAAm (ND) şi hidrogelurilor hibride ce conţin nanoparticule au
fost studiate prin calorimetria DSC.
Curbele DSC realizate pe bureţii de colagen în stare hidratată au
înregistrat pentru primul ciclu de încălzire trei procese endoterme (Figura IX.1).
Procesul de topire a gheţii de la -8 oC cu generarea unei entalpii de ∆H = 39,5 J/g a
fost urmat de un proces de relaxare a fibrelor de colagen care apare la temperatura
de 18 oC cu o absorbţie de căldură de ∆H = 1,3 J/g şi de un proces de denaturare
care se produce la 74 oC cu entalpie de ∆H = 48 J/g. Pe curba DSC înregistrată în
urma celui de-al doilea ciclu termic apare un proces endoterm intens la temperatura
de -6 oC cu o entalpie de ∆H = 52,9 J/g. De asemenea, se observă dispariţia
procesului endoterm înregistrat la 74 oC în primul ciclu termic, subliniindu-se
caracterul ireversibil de denaturare al colagenului.
-40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
Flu
x d
e c
ald
ura
/ M
asa
(m
W/m
g)
Temperatura (oC)
Endo
Exo
Colagen (primul ciclu de încalzire)
Colagen (al doilea ciclu de încalzire)
ND (primul ciclu de încalzire)
ND (al doilea ciclu de încalzire)
Figura IX.1. Curbele calorimetrice pentru buretele de colagen şi hidrogelul ND (fără
nanoparticule) aflaţi în stare hidratată
Denaturarea lanţurilor din reţeaua
ND a avut loc la valori ale temperaturii de
53 oC cu un consum de energie de ∆H =
6,1 J/g. Un alt proces endoterm mai mic se
observă la temperatura de 49 oC. Topirea
apei îngheţate în cazul hidrogelului ND
apare la temperaturi mult mai ridicate (0,6 oC) comparativ cu cea a colagenului pur (-
8 oC). Această diferenţă de temperatură
este cauzată de formarea reţelei
polimerice şi de abilitatea acesteia de a
reţine moleculele de apă în interior prin
intermediul interacţiunilor cu grupele
funcţionale ale lanţurilor polimerice.
25
Procesele endoterme din primul ciclu termic şi din cel de-al doilea în
cazul hidrogelurilor hibride aflate în stare hidratată sunt atribuite procesului de
topire a apei libere şi parţial legate, caracteristice pentru materiale hidrofile
(Fiugura IX.2). Datorită interacţiunii diferite a apei cu componentele hidrogelului
hibrid valorile TonsetW şi TmaxW variază pentru fiecare probă în parte.
-40 -20 0 20 40 60 80
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
40 45 50 55 60 65 70
-0,70
-0,65
-0,60
-0,55
-0,50
-0,45
-0,40
-0,35
-0,30
Temperature (oC)
Heat Flo
w / M
ass
(m
W/m
g)
Temperatura (oC)
Flu
x d
e c
ald
ura
/ M
asa
(m
W/m
g)
C
ND
2 HPS
2 G
2 G 20 HA
2 G 80 HAEndo
Exo
(a)
-40 -20 0 20 40 60 80
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
40 45 50 55 60 65 70
-0,70
-0,65
-0,60
-0,55
-0,50
-0,45
-0,40
-0,35
-0,30
Temperature (oC)
Heat F
low
/ M
ass (
mW
/mg)
Temperatura (oC)
Flu
x d
e c
ald
ura
/ M
asa
(m
W/m
g)
C
ND
2 HPS
2 G
2 G 20 HA
2 G 80 HA
Endo
Exo
(b)
Figura IX.2. Curbele DSC înregistrate între -50 oC şi 100 oC la primul ciclu de
încălzire (a) şi al doilea ciclu de încălzire (b) pentru nanocompozitele de
hidrogeluri hibride aflate în stare hidratată
Se pot obţine informaţii despre starea apei din probe prin examinarea
aspectului procesului de topire care apare pe curbele DSC. Hidrogelurile hibride au
prezentat cantităţi considerabile de molecule de apă liberă comparativ cu proba de
colagen pur şi cu hidrogelul ND. Procentul de apă legată a scăzut în urma celui de-
al doilea proces termic, iar cel cel de apă liberă a crescut.
Curbele pentru probele G şi G / 20% HA au prezentat câte două procese
endoterme la topirea gheţii evidenţiind diferenţele care există între cele două tipuri
de apă. Cu cât capacitatea de umflare a fost mai mare cu atât cele două procese
endoterme au fost mai proeminente. Acest fenomen nu a fost întâlnit în cazul
probelor G/80%HA datorită capacităţii scăzute de umflare.
Se presupune că la începutul procesului de umflare, moleculele de apă mai
întâi distrug legăturile de hidrogen intermoleculare ale matricei polimerice care
sunt mai slabe şi apoi se leagă de capătul hidrofil rămas liber. Aceste molecule de
apă sunt izolate şi uniform distribuite în masa polimerică asigurând o mobilitate
limitată, astfel temperatura la care gheaţa se topeşte este mai mare în cazul
hidrogelurilor hibride comparativ cu materialul colagenic pur.
Temperatura situată între 34 şi 39 oC pe curbele DSC, corespunde
colapsării lanţurilor de PNIPAAm. În cel de-al doilea ciclu de încălzire această
tranziţie devine mai mică, însă rămâne apropiată de valoarea temperaturii din
primul ciclu. Acest fapt se explică prin existenţa unei structuri mai puţin ordonate a
catenelor de colagen după primul ciclu de încălzire. Prezenţa ei pe curbele
înregistrate la cel de-al doilea ciclu de încălzire poate fi explicată de reversibilitatea
colapsării lanţurilor de PNIPAAm la reîncălzire [482]. O altă explicaţie pentru care
s-au obţinut valori ale acestei temperaturi de tranziţie mai mici în cel de-al doilea
ciclu de încălzire este schimbarea interacţiunilor colagen/PNIPAAm cu cele de
gelatină/PNIPAAm ca urmare a denaturării colagenului în timpul primului ciclu de
încălzire. De aici se poate deduce sensibilitatea la temperatură a PNIPAAm-ului.
26
Cel de-al doilea proces endoterm de pe curba DSC înregistrată la primul
ciclu termic corespunde denaturării colagenului. Temperatura de denaturare a
hidrogelurilor hibride variază între 58 şi 64 oC şi este ireversibilă, nefiind observată
la cea de-a doua încălzire.
Temperaturile de denaturare ale hidrogelurilor hibride aflate în condiţii de
umiditate de RH = 23 % au prezentat valori mai ridicate decât cea a colagenului
nativ. Aceste rezultate se află în concordanţă cu cele raportate de alţi autori. Tronci
şi colab. au demonstrat că materialele reticulate au o temperatură de denaturare
într-un intervalul de valori 68 - 88 oC mai mare decât temperatura de denaturare a
colagenului (Td ~ 67 oC) [483].
IX.4. Determinarea unghiului de contact Efectul nanoparticulelor anorganice este, de asemenea, evidenţiat prin
variaţia valorilor unghiului de contact care depind foarte mult de tipul de
nanoparticule folosite (Figura IX.3).
ND
1 HPS
2 HPS
3 HPS
1 G
2 G
3 G C
0
20
40
60
80
100
Un
gh
iul d
e c
on
tact,
gra
de a)
ND
1G 20H
A
1G 8
0HA
2G 2
0HA
2G 80H
A
3G 20 HA
3G 8
0HA
0
20
40
60
80
100
Un
gh
iul d
e c
on
tact,
gra
de b)
Figura IX.3. Unghiul de contact dintre picătura
de apă şi suprafaţa hidrogelurilor ce conţin nanoparticule de argilă (a) şi a celor care conţin nanoparticule de argilă
şi HA (b)
Prin urmare, în cazul hidrogelurilor ce conţin Dellite® HPS şi Cloisite
®
93A, valoarea unghiului de contact a scăzut comparativ cu valoarea obţinută în
cazul hidrogelului fără nanoparticule (ND), în timp ce prin încorporarea cu
nanoparticule Dellite® 67G hidrogelurile au înregistrat valori ale unghiului de
contact mai mari. Această variaţie depinde de hidrofilia nanoparticulelor de argilă.
În cazul setului de hidrogeluri pe bază de HA (hidroxiapatită), s-a observat că prin
creşterea cantităţii de nanoparticule de hidroxiapatită încorporate, unghiul de
contact scade.
CAPITOLUL X. CONCLUZII GENERALE
CAPITOLUL V: MATERIALE DE COLAGEN MODIFICAT CU DIFERITE GRADE DE SUBSTITUŢIE
� Colagenul solubil investigat în această teză a fost modificat utilizând ca
agenţi de funcţionalizare 2 anhidride şi anume, anhidrida citraconică (AC) şi
anhidrida 2,3 –dimetil maleică (ADM). Reacţia de modifcare chimică a
presuspus implicarea grupelor funcţionale amino ale proteinei. S-au sintetizat
6 probe de colagen modificat, trei funcţionalizate cu AC şi trei cu ADM.
27
� În urma analizei structurale prin spectroscopie FT-IR şi 1H RMN, s-a
demonstrat că reacţia de modificare a avut loc prin remarcarea unor
modificări apărute în spectrele de colagen modificat.
� Gradul de substituţie al colagenului a fost determinat folosind metoda cu
acidul 2, 4, 6 – trinitrobenzen sulfonic (TNBS). Reacția a fost dependentă de
tipul şi cantitatea de anhidridă folosită şi de condiţiile de reacţie în special de
valoare pH-ului de reacţie. Folosirea anhidridei 2,3-dimetil maleică şi a unui
raport masic între colagen şi anhidridă de 1/3 a condus la obţinerea celui mai
mare grad de substituţie de 10,6 %.
� Modificarea colagenului a fost demonstrată şi prin metoda titrării
potenţiometrice şi a conţinutului total de carbon şi azot (TOC/TN). Curbele
de titrare au dovedit stabilitatea probelor de colagen modificat în timpul
creşterii şi scăderii pH-ului, fără apariţia precipitării dar şi sensibilitatea la pH
a acestora. Au fost calculate valorile pKa ale grupelor carboxil şi amino.
Media pKa pentru grupările carboxilice a crescut de la 4,3 la 5,1 dovedind
succesul modificării colagenului. Conţinutul total de carbon organic (TOC)
calculat pentru probele modificate a crescut fiind de 40,66 mmol/g faţă de
colagenul pur care a prezentat doar un conţinut de 33,21 mmol/g.
� În urma analizei DLS/SLS, masa moleculară medie (Mw) şi cel de-al doilea
coeficient virial (A2) au crescut după modificarea chimică, valori care au fost
mai mari în cazul probelor cu gradul de substituţie mai ridicat. După reacţiile
de modificare, PDI scade, probele de colagen substituite devenind mult mai
omogene în ceea ce priveşte dimensiunea moleculelor.
� S-a evaluat comportamentul reologic al soluţiilor de colagen modificat în
funcţie de concentraţie şi de temperatură prin studii de vâscozimetrie. După
modificare, vâscozitatea soluţiilor de colagen a crescut semnificativ datorită
schimbării formei şi dimensiunii moleculelor de colagen în urma modificării
prin legarea chimică a anhidridelor la catenele de colagen. La creşterea
temperaturii, soluţiile de colagen modificat au manifestat o descreştere bruscă
în intervalul 28 - 38 oC a vâscozităţii relative relevând transformarea
colagenului în gelatină prin dezintegrarea structurii de triplu helix.
Temperatura de denaturare a probelor de colagen modificat în soluţie acidă a
scăzut odată cu creșterea gradului de substituție.
� Stabilitatea termică mai ridicată a fost evidenţiată în cazul materialelor de
colagen modificat prin evaluarea comportamentului termic în stare uscată prin
termogravimetrie. Analiza produşilor volatili obţinuţi din probele de colagen
modificat a indicat o întârziere a evoluţiei diferiţilor produşi datorită
stabilităţii termice crescute.
� Adeziunea la suprafaţa unei membrane celulozice de dializă a fost
îmbunătăţită pentru probele de colagen funcţionalizate cu anhidride cu cât
gradul de substituţie a fost mai crescut datorită prezenţei unui număr mai
mare de grupări COOH în urma procesului de modificare.
28
CAPITOLUL VI: HIDROGELURI PE BAZĂ DE HEMA ŞI COLAGEN MODIFICAT VARIIND TIPUL DE COLAGEN MODIFICAT
� S-au obţinut hidrogeluri poroase pornind de la colagenul modificat cu
anhidride, prin grefarea, copolimerizarea, şi reticularea cu monomerul sintetic
HEMA, în prezenţa unui sistem de iniţiere redox APS/TEMED, fără
implicarea agenţilor de reticulare chimici. Pentru obţinerea hidrogelurilor în
acest capitol s-a menţinut constant raportul masic dintre biopolimer şi monomer sintetic dar şi conţinutul de iniţiator, variind doar tipul de colagen
modificat. S-au sintetizat astfel patru tipuri de hidrogeluri: C-AC 5.6/HEMA,
C-AC 9.6/HEMA, C-ADM 7.2/HEMA şi C-ADM 8.2/HEMA. Legăturile
intermoleculare chimice şi fizice din reţeaua semi-interpenetrată de hidrogel
au asigurat integritate şi rezistenţă structurală crescută. � Noile materiale obţinute sunt insolubile în apă şi au caracter superabsorbant.
� Spectrele FT-IR au evidenţiat interacţiunea chimică şi fizică între
componenţii naturali şi sintetici implicaţi în sinteza hidrogelurilor. În urma
analizei morfologice prin intermediul imaginilor SEM, s-a observat o reţea
poroasă cu pori interconectaţi de diferite dimensiuni cuprinse între 30 şi 300
µm comparativ cu proba de colagen pur care a prezentat o microstructură neomogenă lipsită de pori. Hidrogelurile pe bază de colagen modificat cu
ADM au prezentat pori de dimensiuni mai mari probabil datorită prezenţei
celor două grupări metil în molecula de ADM.
� Hidrogelurile au prezentat o capacitate mare de absorbţie a solventului de
până la 240 % ce a depins de tipul de colagen modificat. Un grad de umflare
mai însemnat a fost evidenţiat în cazul hidrogelurilor compuse din colagen
modificat cu un grad de substituţie mai mare.
� Integritatea colagenului a fost analizată prin măsurători DSC pentru materiale
în stare hidratată şi uscată. Prin modificarea chimică a colagenului cu
anhidride, temperatura de denaturare (Td) a crescut, efect ce este asociat cu
îmbunătăţirea stabilităţii termice cauzată de prezenţa grupelor carboxil ce a
condus la formarea de noi legături de hidrogen intermoleculare. Absenţa apei
în reţeaua materialelor de colagen a condus la creşterea temperaturii de
denaturare a acestora comparativ cu cele aflate în stare hidratată, apa având
rol de plastifiere.
� Curbele DSC ale reţelelor aflate în stare hidratată au înregistrat un proces
endoterm intens care a fost asociat entalpiei de denaturare. Ireversibilitatea
denaturării probelor a fost dovedită prin dispariţia la reîncălzire a procesului
endoterm atribuit temperaturii de denaturare. S-a demonstrat că formarea de
reţele polimerice a condus la o descreştere a capacităţii de retenţiei a apei
legate şi la o creştere a conţinutului de apă liberă datorită implicării grupelor
hidrofile în formarea hidrogelurilor.
� În urma analizei conţinutului tipurilor de apă prezente în structura
materialelor de colagen hidratate s-a evidenţiat caracterul puternic hidrofil al
29
acestora sugerând posibilitatea lor de a fi utilizate ca biomateriale în diferite
aplicaţii biomedicale şi farmaceutice.
� S-a evaluat capacitatea de încărcare şi eliberare a bisoprololului fumarat din
matricea hidrogelurilor în condiţii care simulează pe cele fiziologice. Cinetica
de eliberare a fost controlată de difuzia soluţiei tampon în matricea poroasă şi
de conţinutul hidrogelurilor.
CAPITOLUL VII: HIDROGELURI PE BAZĂ DE HEMA ŞI COLAGEN MODIFICAT VARIIND RAPORTUL MASIC AL COMPONENŢILOR
� S-au sintetizat şase hidrogeluri pe bază de HEMA şi colagen modificat cu
anhidrida citraconică şi anhidrida 2,3-dimetil maleică, care au înregistrat cele
mai mari grade de substituţie, variind raportul masic între componenți astfel:
4C-CM/1.6APS, 6C-CM/1.3APS, 6.7C-CM/1.5APS, 7C-CM/1APS, 7C-
CM/1.6APS şi 7C-CM/2APS. Randamentul de reacţie a fost mare de până la
89 % indicând capacitatea mare de conservare a masei în urma reacţiei de
sinteză şi în acelaşi timp succesul reacţiei de polimerizare şi reticulare.
� Imaginile SEM ale hidrogelurilor au evidenţiat o structură super-poroasă cu
pori intercomunicabili care au ca avantaj capacitatea de retenţie mare şi rapidă a fluidelor. Dimensiunile porilor au depins în principal de cantitatea de
iniţiator utilizată la prepararea hidrogelurilor. O densitate mare asociată cu o
flexibilitate şi elasticitate scăzută a fost observată la folosirea unui conţinut
mai mic de colagen modificat şi un conţinut mai mare de iniţiator. Aceste
modificări observate în aspectele morfologice ale hidrogelurilor au avut o
influenţă asupra gradului de umflare. În urma studiului amănunţit al cineticii
de umflare în condiţii care simulează pe cele fiziologice s-a constatat că
hidrogelurile manifestă un mecanism de umflare special de difuzie Fickiană
denumit ”less-Fickian” în care viteza de umflare este dependentă de
conţinutul de iniţiator.
� Sensibilitatea la pH a hidrogelurilor a fost demonstrată prin evaluarea
comportamentului la umflare al acestora în medii cu diferite pH-uri.
Hidrogelurile au avut o capacitate mai mare de umflare în condiţii de pH mai
mic decât 4,7 şi mai mare decât 10,0, valori ce sunt caracteristice pKa-urilor
grupărilor carboxil şi amino din colagenul modificat, iar odată cu apropierea
pH-ului spre valoarea punctului izoelectric capacitatea de absorbţie a
solventului a scăzut. Mai mult, la valori de pH = 3,0 gradul de umflare a fost
mult mai crescut decât în condiţii de pH = 12,0 datorită prezenţei unui
conţinut mai scăzut de grupe carboxil libere în urma sintezei hidrogelurilor,
acestea reacţionând cu monomerii de HEMA în timpul reacţiei de
copolimerizare şi reticulare. Prin analiza cineticii de umflare a fost
reconfirmată sensibilitatea hidrogelurilor la variaţia pH-ului.
� Gradul de degradare al hidrogelurilor în prezenţa colagenazei a fost
semnificativ redus, iar procesul de digestie enzimatică a fost influenţat de
30
raportul masic biopolimer modificat/HEMA. Creşterea conţinutului de
iniţiator şi scăderea conţinutului de colagen modificat a permis restricţionarea
degradării enzimatice. Hidrogelurile şi-au păstrat integritatea structurală pe
tot parcursul procesului de degradare, însă aspectul morfologic şi structural a
suferit modificări aşa cum s-a observat în urma testelor FT-IR şi SEM
datorită degradării părţii proteice.
� Din punct de vedere al potenţialelor aplicaţii în domeniul farmaceutic,
hidrogelurile au capacitatea de a încorpora şi elibera controlat şi susţinut un
principiu activ în condiţii fiziologice simulate. Eliberarea ciprofloxacinei
hidroclorurate monohidratate (CF) din hidrogeluri a fost descrisă de o viteză
rapidă în primele minute urmând apoi un proces de eliberare gradual ce s-a
extins până la 50 de ore. Viteza de eliberare a fost influenţată de compoziţia
hidrogelurilor, de comportamentul diferit la umflare al acestora dar şi de
solubilitatea antibioticului.
� Caracteristicile de sensibilitate la pH ale hidrogelurilor au fost demonstrate şi
prin studii de eliberare a ciprofloxacinei hidroclorurate monohidratate în
medii tampon fosfat de pH diferite. Hidrogelurile au manifestat un
comportament de eliberare ce s-a caracterizat printr-o variaţie a tipului de
mecanism de transport la variaţia pH-ului.
� Studiul de biocompatibilitate in vivo a arătat că hidrogelurile prin implantarea
intraperitoneală la şobolani au cauzat apariţia unei reacţii inflamatorii, prin
creşterea uşoară a granulomului apărut la locul implantului de hidrogeluri,
însă valorile obţinute s-au încadrat în limite normale neexistând diferenţe
semnificative faţă de lotul control sănătos. Implantarea de pelete cu
hidrogeluri încărcate cu CF a cauzat o scădere a mediei modificărilor greutăţii
animalelor şi a granulomului uscat comparativ cu lotul care a primit pelete cu
hidrogeluri neâncărcate cu CF indicând un efect intens de inhibare a
procesului de proliferare a celulelor macrofage.
� Faţă de hidrogelurile fără medicament, materialele polimerice încărcate cu CF
au inhibat semnificativ reacţiile inflamatorii subcutanate, fapt argumentat de
scăderea capacităţii fagocitare a polimorfonuclearelor neutrofile din sângele
periferic şi a procentelor de limfocite serice. În cazul hidrogelurilor,
parametrii sanguini nu au variat faţă de lotul martor.
� De asemenea, buna biocompatibilitate a hidrogelurilor implantate sub formă
de pelete a fost atestată de lipsa variaţiei activităţii transaminazelor hepatice,
ceea ce nu denotă o influenţă negativă a fenomenului inflamator asupra
funcţiei hepatice. Parametrii imuni determinaţi pe loturile ce au primit pelete
pe bază de hidrogeluri sau hidrogeluri înglobate cu CF nu au prezentat
schimbări faţă de lotul martor.
� Hidrogelurile descrise în acest studiu prezintă caracteristicile unui biomaterial
ce poate fi utilizat în diferitele aplicaţii medicale asigurând biocompatibilitate
31
şi biodegradabilitate, în special în obţinerea de pansamente pentru vindecarea
rănilor.
CAPITOLUL VIII: HIDROGELURI PE BAZĂ DE CHITOSAN ŞI POLI (ALCOOL VINILIC)
� S-au investigat hidrogeluri în care raportul masic dintre componenta naturală
(chitosan-CHT) şi cea sintetică (poli (alcool vinilic) -PVA) a variat
(PVA/CHT 90/10, PVA/CHT 80/20 şi PVA/CHT 60/40) şi un hidrogel ce a
conţinut doar polimer sintetic de poli (alcool vinilic). � Gradul de umflare al hidrogelurilor în condiţii fiziologice a scăzut odată cu
creşterea concentraţiei de chitosan. � Hidrogelurile au demonstrat sensibilitate la schimbări ale pH-ului prin
producerea unor modificări asupra comportamentului la umflare şi prin
variaţia valorilor parametrilor cinetici de umflare. Sensibilitatea la pH al
hidrogelurilor a scăzut odată cu scăderea conţinutului de chitosan în
următoarea ordine: PVA/CHT 60/40 > PVA/CHT 80/20 > PVA/CHT 90/10.
În urma analizei cineticii de umflare s-a evidenţiat un mecanism de difuzie
pseudo-Fickian fără implicarea proceselor de relaxare ale lanţurilor
polimerice din reţeaua de hidrogeluri.
� Atât încărcarea cât şi profilele de eliberare a principiului activ din hidrogeluri
au fost controlate de compoziţia polimerică (raportul masic). Capacitatea de
încărcare a hidrogelurilor a fost mai eficientă în cazul hidrogelurilor cu un
conţinut mai mare de chitosan. Procesul de eliberare al ciprofloxacinei
hidroclorurate monohidratate din hidrogeluri a fost dependent de pH atât
datorită proprietăţilor de umflare ale matricilor polimerice cât şi datorită
solubilităţii medicamentului, ambele suferind modificări la variaţia stimului
pH. Astfel, s-a observat o creştere a gradului de eliberare al medicamentului
odată cu creşterea conţinutului de chitosan din hidrogeluri şi cu scăderea pH-
ului.
� Cantitatea maximă de medicament eliberată şi parametrii cinetici de eliberare
au arătat o variaţie bruscă în jurul pH-ului critic al chitosanului şi al
medicamentului. Ca efect al sensibilităţii la pH al hidrogelurilor, s-a
înregistrat o modificare a tipului de mecamism de transport odata cu
modificarea pH-ului.
� Hidrogelurile de PVA/CHT sensibile la pH şi încărcate cu ciprofloxacina
hidroclorurata monohidratată pot fi utilizate ca potenţiale sisteme de eliberare
controlată a principiilor active în diversele patologii întâlnite în practica
medicală, în special în tratarea rănilor unde ciprofloxacina are acţiune
puternică asupra infecţiilor.
CAPITOLUL IX: HIDROGELURI PE BAZĂ DE COLAGEN ŞI POLI N-IZOPROPIL ACRILAMIDĂ
32
� Au fost studiate şi comparate 15 probe, dintre care una a fost buretele de
colagen pur, una a fost un hidrogel pe bază de colagen şi poli N-izopropil
acrilamidă (ND) şi restul au fost hidrogeluri, cu rapoarte masice diferite între
colagen şi N-izopropil acrilamidă, ce au conţinut o concentraţie de 1 %
nanoparticule de argilă (Dellite® HPS, Dellite
® G67, Cloisite
® 93A). În
sinteza hidrogelurilor hibride cu două tipuri de nanoparticule (Dellite® G67 şi
hidroxiapatită) s-a folosit un raport de 20 % sau 80 % de hidroxiapatită faţă de conţinutul de colagen.
� Hidrogelurile pe bază de colagen şi poli N-izopropil acrilamidă au fost studiate
în principal pentru sensibilitatea la variaţia temperaturii şi a comportării
termice în starea hidratată faţă de comportarea în stare uscată.
� Studiul şi înţelegerea comportamentului termic şi a temperaturii de denaturare
a colagenului în special în mediu fluid este foarte utilă având în considerare
folosirea intensă a terapiilor ce presupun procese termice ca de exemplu în
cardiologie, dermatologie, ginecologie, neurochirurgie, oncologie,
oftalmologie, ortopedie şi inginerie tisulară.
� Studiile de calorimetrie diferenţială au demonstrat că denaturarea colagenului
este un proces cinetic ireversibil care este guvernat de istoria termică a probei,
tipul de nanoparticule încorporate în reţeaua hidrogelurilor hibride, gradul de
hidratare şi de conţinutul agentului de reticulare.
� În cazul hidrogelurilor, ce au avut un grad de hidratare cunoscut, temperatura
maximă corespunzătoare denaturătii a scăzut la 53 oC comparativ cu matricea
de colagen pur care s-a denaturat la 74 oC. Tranziţia ce apare în intervalul de
temperatură 34 - 39 oC a fost observată la reîncălzire şi explică reversibilitatea
colapsării lanţurilor de PNIPAAm. Prin urmare, hidrogelurile hibride îşi
păstrează receptivitatea la temperatură chiar şi după cicluri termice repetate.
� În condiţii de umiditate cu RH de 23 % (mediu ambiant), hidrogelurile
hibride au prezentat valori ale temperaturii de denaturare mai ridicate decât în
stare hidratată. Hidrogelurile reticulate au înregistrat o temperatură de
denaturare într-un intervalul de valori 77 - 98 oC mai mare decât temperatura
de denaturare a colagenului (Td ~ 75 oC).
� Entalpia de topire a apei a crescut semnificativ în cazul hidrogelurilor hibride
comparativ cu materialul colagenic pur şi al probei de hidrogel fără
nanoparticule, subliniindu-se efectul nanoparticulelor anorganice asupra
procesului termic.
� Interacţiunea apei cu materialele hibride pe bază de colagen şi starea apei în
structura lor a depins de compoziţia hidrogelului şi de istoria termica al
probei. După primul ciclu de încălzire, raportul dintre apa liberă şi cea legată
a fost schimbat. Valorile cantităţilor de apă legată au prezentat o uşoară
descreştere în cel de-al doilea ciclu termic, în timp ce valorile cantităţilor de
apă liberă au crescut.
33
� Din măsurătorile unghiului de contact şi a gradului de umflare s-a observat o
corelare între balanţa hidrofob/hidrofil, starea apei din reţelele polimerice
investigate şi valorile temperaturilor de denaturare.
� Pentru hidrogelurile ce conţin Dellite® HPS şi Cloisite
® 93A, valoarea
unghiului de contact a scăzut comparativ cu valoarea obţinută în cazul
hidrogelului fără nanoparticule, iar această variaţie depinde de hidrofilia
nanoparticulelor de argilă. Nanoparticulele Dellite® 67G sunt puternic
hidrofobe iar Dellite® HPS şi Cloisite
® 93A sunt hidrofile şi au capacitatea de
a descreşte unghiul de contact. În cazul setului de hidrogeluri pe bază de
hidroxiapatită, s-a observat că prin creşterea cantităţii de nanoparticule de
hidroxiapatită încorporate, unghiul de contact a scăzut.
Bibliografie selectată: [361] J. Ostrowska-Czubenko, M. Gierszewska-Druzẏńska, Mechanism of water diffusion into noncrosslinked and ionically crosslinked chitosan membranes. Progress on Chemistry and Application of Chitin and its Derivatives; Polish Chitin Society: Lodz, Vol. 17, pp 59−66, 2012. [362] A. Sionkowska, A. Kaminska, Thermal helix-coil transition in UV irradiated collagen from rat tail tendon, Int. J. Biol. Macromol., 24 (4), 337−340, 1999. [363] P. Gill, T. T. Moghadam, B. Ranjbar, Differential Scanning Calorimetry Techniques: Applications in Biology and Nanoscience, J. Biomol. Technol., 21 (4), 167−193, 2010. [369] T. Nezu, N. Nishiyama, K. Nemoto, Y. Terada, The effect of hydrophilic adhesive monomers on the stability of type I collagen, Biomaterials, 26 (18), 3801−3808, 2005. [370] S. Vyazovkin, L. Vincent, N. Sbirrazzuoli, Thermal denaturation of collagen analyzed by isoconversional method. Macromol. Biosci., 7 (11), 1181−1186, 2007. [371] Y. L. Guan, L. Shao, K. D. Yaoz, A study on correlation between water state and swelling kinetics of chitosan-based hydrogels, J. Appl. Polym. Sci., 61 (13), 2325−2335, 1996. [386] M. Sahiner, D. Alpaslan, B. O. Bitlisli, Collagen-based hydrogel films as drug-delivery devices with antimicrobial properties, Polym. Bull., 71, 3017–3033, 2014. [390] H. Saito, T. Taguchi, H. Aoki, S. Murabayashi, Y. Mitamura, J. Tanaka, T. Tateishi, pH-responsive swelling behavior of collagen gels prepared by novel crosslinkers based on naturally derived di- or tricarboxylic acids, Acta Biomater., 3, 89–94, 2007. [400] S. A. Elkheshen, D. H. Mobarak, S. Salah, T. Essam, Formulation of ciprofloxacin hydrochloride loaded biodegradable nanoparticles: optimization of the formulation variables, J. Pharm. Res. Opinion 3, 11, 72 – 81, 2013. [430] H. Mahdavi, H. Mirzadeh, M. Jalal Zohuriaan-Mehr, F. Talebnezhad, Poly(vinyl alcohol)/chitosan/clay nano-composite films, J. Amer. Sci., 9 (8), 203-214, 2013. [434] F. Song, L.-M. Zhang, C. Yang, L. Yan, Genipin-crosslinked casein hydrogels for controlled drug delivery, Intern. J. Pharm., 373, 41–47, 2009. [482] J. Wu, B. Zhou, Z. Hu, Phase Behavior of Thermally Responsive Microgel Colloids, Phys. Rev. Lett., 90, 048304-1-4, 2003. [483] G. Tronci, A. Doyle, S. J. Russell, D.J. Wood, Structure–property–function rela-tionships in triple-helical collagen hydrogels, MRS Proc., 1498, 145–150, 2013.
34
ACTIVITATEA ŞTIINŢIFICĂ ÎN CADRUL TEZEI DE DOCTORAT
Articole publicate/în curs de publicare în reviste ştiinţifice internaţionale sau naţionale cotate ISI: 1. D. Pamfil, M. T. Nistor, L. Zemljic, L. Verestiuc, M. Cazacu, C. Vasile, Preparation and
characterization of methyl substituted maleic anhydride - modified collagens destined to
medical applications, Ind. Eng. Chem. Res., DOI: 10.1021/ie403563r, vol. 53 (10), pp 3865–
3879, 26 February 2014. FI = 2.587.
2. D. Pamfil, C. Schick, C. Vasile, New Hydrogels Based on Substituted Anhydride
Modified Collagen and 2-Hydroxyethyl Methacrylate. Synthesis and Characterization, Ind.
Eng. Chem. Res., DOI: 10.1021/ie5016848, vol. 53 (28), pp. 11239–11248, 30 June 2014.
FI = 2.587.
3. M. T. Nistor, D. Pamfil, C. Schick, C. Vasile, Study of the heat - induced denaturation
and water state of hybrid hydrogels based on collagen and poly (N – isopropylacrylamide) in
hydrated conditions, Thermochimica Acta, DOI:10.1016/j.tca.2014.05.020, vol. 589, pp.
114–122, 10 August 2014. FI = 2.184.
4. R. P. Dumitriu, D. Pamfil, M. T. Nistor, C. Vasile, Stimuli responsive matrices for
medical applications, 17 - 20 September 2014. Key Engineering Materials, vol. 638 (2015),
pp. 249-254, Trans Tech Publications, Switzerland,
doi:10.4028/www.scientific.net/KEM.638.249. FI = 0.19.
5. I. E. Raschip, A. D. Panainte, D. Pamfil, L. Profire, C. Vasile, In vitro testing of
xanthan/lignin hydrogels as carriers for controlled delivery of bisoprolol fumarate, Rev.
Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iasi, 119 (4), 1189 - 1194, Oct - Dec 2015. BDI= B+.
6. C. Vasile, R. N. Darie, C. N. Cheaburu-Yilmaz, G.-M. Pricope, M. Bračič, D. Pamfil, G.
E. Hitruc, D. Duraccio, Low density polyethylene - chitosan composites, Composites: Part
B, vol. 55, pp. 314–323, 2013. FI = 2.983.
7. D. Pamfil, E. Butnaru, C. Vasile, Poly (vinyl alcohol)/chitosan cryogels as ph responsive
ciprofloxacin carriers, Journal of Polymer Research (trimis spre publicare).
8. D. Pamfil, C. Vasile, L. Tarţău, L. Vereştiuc, Hydrogels based HEMA /citraconic
anhydride modified collagen as pH-responsive drug carriers (trimis spre publicare).
Carte publicată: 1. D. Pamfil, C. Vasile, Aplicaţiile medicale şi farmaceutice ale unor biomateriale şi biocompozite sensibile la stimuli externi, Tehnopress, ISBN 978-606-687-149-5, 2014, Iaşi, Romania.
Capitol de carte: 1. D. Pamfil, M. T. Nistor, C. Vasile, Chapter 13: Collagen-based materials for
pharmaceutical applications, in "Handbook of Polymers for Pharmaceutical Technologies",
editors: Vijay Kumar Thakur, Manju Kumari Thakur, Volume 3, Scrivener Publishing,
ISBN: 978-1-119-04142-9, DOI: 10.1002/9781119041450.ch13, 2015, pg. 439-482.
Comunicări în cadrul unor conferinţe naţionale şi internaţionale: 1. D. Pamfil, L. Verestiuc, A. G. Rusu, E. Pintilie, “Hydrogels based on collagen and poly
(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) with applications in restoration burns”, The XII-rd
Symposium of Biomedical Engineering, May 2010, Iaşi, Romania.
35
2. D. Pamfil, C. Vasile, L. Verestiuc, M. Nistor, “Anhydride-modified collagen”, 2ème
Colloque Franco-Roumain de Chimie Médicinale, CoFRROCM, 3 - 5 October 2012, Iaşi, Romania.
3. R. N. Darie, A. Sdrobis, G. Pricope, A: Baklavaridis, C. Panayiotou, I. Zuburtikudis, L.
Fras, D. Pamfil, C. Vasile, “Polyethylene / chitosan-Na+-MMT nanocomposites”, 10th
International Conference on Nanoscience & Nanotechnologies (NN13), 9 - 12 July
2013,Thessaloniki, Greece.
4. D. Pamfil, C. Vasile, Ch. Schick, “Caracterizarea termica a retelelor semi-interpenetrante
pe baza de colagen si 2-hidroxietil metacrilat”, A XXIV-a Sesiune de Comunicari Stiintifice
A Institutului de Chimie Macromoleculara “Petru Poni”, Z.A.I., 3 - 5 October 2013, Iasi,
Romania.
5. D. Pamfil, C. Schick, C. Vasile, “Thermal characterization of hydrogels based on
anhydride modified collagen and 2 - hydroxyethyl methacrylate”, International Conference
“Eco-sustainable Food Packaging Based on Polymer Nanomaterials”, 26 - 28 February
2014, Rome, Italy.
6. D. Pamfil, E. Părpăriţă, C. N. Yilmaz, O. Yilmaz, C. Vasile, “In vitro testing of polyvinyl
alcohol/chitosan hydrogels as systems for controlled delivery of bisoprolol fumarate”,
Faculty of Chemistry Conference, “Alexandru Ioan Cuza” University Days & 3ème
Colloque Franco-Roumain de Chimie Médicinale, 31 October - 1 November 2014, Iaşi, Romania.
7. I. E. Răschip, D. Pamfil, C. Vasile, “The in vitro testing of xantan/lignin hydrogels as
carriers for controlled delivery of bisoprolol fumarate”, Faculty of Chemistry Conference,
“Alexandru Ioan Cuza” University Days & 3ème Colloque Franco-Roumain de Chimie
Médicinale, 31 October - 1 November 2014, Iaşi, Romania.
8. D. Pamfil, L. Vereştiuc, C. Vasile, ”Biomaterials based on substituted anhydride
modified Collagen / HEMA hydrogels”, Apollonia University Days & The XXV-rd
International Congress “Preparing the Future by Promoting Excellence”, 26 February – 1
March 2015, Iaşi, Romania.
9. E. Părpăriţă, D. Pamfil, C. Vasile, ”Poly (vinyl alcohol) / chitosan hydrogels as carriers
for drug”, Apollonia University Days & The XXV-rd International Congress “Preparing the
Future by Promoting Excellence”, 26 February – 1 March 2015, Iaşi, Romania.
Postere prezentate în cadrul unor conferinţe naţionale şi internaţionale: 10. C. Vasile, M. T. Nistor, D. Pamfil, C. Schick, “Study of thermal properties and heat-
induced denaturation of hybrid hydrogels based collagen”, International Conference “Eco-
sustainable Food Packaging Based on Polymer Nanomaterials”, 26 - 28 February 2014,
Rome, Italy.
11. D. Pamfil, R. P. Dumitriu, M. T. Nistor, C. Vasile, “Stimuli responsive matrices for
medical applications”, 6th International Conference “Biomaterials, Tissue Engineering &
Medical Devices”, 17 - 20 September 2014, Constanţa, Romania.
12. A. D. Panainte, D. Pamfil, I. E. Răschip, E. Părpăriţă, C. Vasile “In vitro evaluation of
novel controlled release system of bisoprolol fumarate”, The XV-rd National Congress of
Pharmacy from Romania, 24 - 27 September 2014, Iaşi, Romania.
13. A. D. Panainte, G. Ţânţaru, N. Bibire, M. Apostu, M. Vieriu, D. Pamfil, V. Dorneanu,
“Development and validation of a PP-HPLC method with UV Detection for the estimation
36
of bisoprolol fumarate in tablets”, The XV-rd National Congress of Pharmacy from
Romania, 24 - 27 September 2014, Iaşi, Romania.
14. D. Pamfil, C. Vasile, “New biomaterials responsive to external stimuli containing
proteins“, The 7th Edition of EUROINVENT European Exhibition of Creativity and
Innovation, 14 - 16 May 2015, Iaşi, Romania.
15. D. Pamfil, L. Tarţău, L. Vereştiuc, L. Niţă, A. Chiriac, C. Vasile, ”Biocompatibility,
biodegradability and drug carrier ability of some substituted-anhydride modified collagen
based hydrogels”, Seventh Cristofor I. Simionescu Symposium, Frontiers in
Macromolecular and Supramolecular Science, 4-6 June 2015, Iaşi, Romania.
16. E. Stoleru, D. Pamfil, A. Irimia, M. Brebu, C. Vasile, ”Evaluarea Compozitiei si
Activitătii Antioxidante a Unor Uleiuri Vegetale”, Zilele Academice Ieşene, A XXV-a
Sesiune de Comunicări ştiinţifice “Progrese în Ştiinţa Compuşilor Organici şi Macromoleculari”, 25 - 26 Septembrie 2015, Iaşi, Romania.
Stagii în străinătate: 1. Participant la programul Erasmus – Socrates între 1 Ianuarie 2011 şi 30 Iunie 2011
(5 luni) la Universitatea din Portsmouth, United Kingdom.
2. Universitatea din Maribor, Slovenia; mobilitatea s-a efectuat în cadrul proiectului
„Functionalization of synthetic polymers for development of new antimicrobial
packaging”, Programul: Capacităţi; FPSNewPack nr: 525/2012, în perioada 19
Noiembrie 2012 – 1 Decembrie 2012.
3. Participant la programul Short Term Scientific Mission în cadrul proiectului
ştiinţific COST Action FA0904, în perioada 14 Ianuarie 2013 – 28 Februarie
2013, în Rostock, Germania.
4. Participare la cursurile intensive din cadrul proiectului Erasmus + TL-IRMP 2014-
1-PL01-KA203-003611 “Joint innovative training and teaching/learning program
in enhancing development and transfer knowledge of application of ionizing
radiation in materials processing” care a constat în 2 stagii în: Polonia, Varsovia,
perioada 5 - 19 Septembrie 2015 şi în Italia, Palermo, perioada 27 Septembrie – 4
Octombrie 2015.
Membru în echipe de cercetare pentru proiecte naţionale/internaţionale: 1. Denumire proiect Improving Food Safety through the Development and Implementation
of Active and Biodegradable Food Packaging Systems. Proiect international Romania-
Norvegia EEA Grants ACTIBIOSAFE 1SEE/30.06.2014/Cornelia Vasile, Durata: 2014-
2018.
2. Denumire proiect Bionanocompozite antimicrobiene pentru aplicatii medicale
(BIONANOMED). Program PN II – Partneriate; Contract nr. 164/2012 UEFISCDI., Durata:
2012-2015.
Recommended