NTA: Anlama Ölçüm Yapılır - Atomika Teknik3. Ölçüm yapılır 4. Videolar proses edilir 5....

NTA:

Tekniği Anlama

Nasıl Ölçüm Yapılır?

NTA Eğitimi

2015

Genel Bakış• Part 1

• NTA Teknolojisi

• Görüntüleme

• Boyut Ölçümü

• Konsantrasyon

• Işık Yoğunluğu

• Eklenen Özellikler

• Floresan

• Zeta potansiyel

• Part 2

• Numune hazırlama

• Video çekimi

• Analiz

• Sonuşlar ve Raporlar

• Part 3

• Data analizi

NanoSight Teknolojisi

Lazer numune haznesinin şeması

NanoSight:

• Lazer diyot

• Metalize yüzeyli Cam

prizma (açılı) ve Üst

tabaka

• Likid (numune) tabakası

• Mikroskop objektifi

› Ekstrasellüler

vesiküller (Exosomes

ve microvesicles)

› İlaç taşınımı

› Protein Agregatları

› Virüs ve VLP

numuneleri

› Nanopartikül

Toksikolojisi

› Polimerler ve koloidler

› Ink jet mürekkepleri ve pigmentler

› Manyetik nanopartiküller

› Quantum dots (Qdots)

› Nanobubbles

› Seramik

› Yakıt katkı maddeleri

› Çok duvarlı karbon nanotüpler

› Kozmetik

› Gida maddesi

NTA geniş bir nanopartikül aralığı için uygulanabilir

Biy

oaplik

asyonla

r

Non

-biy

oaplik

asyonla

r

NanoSight Sistemi Çalışırken…

Thumbprint (parmak izi) –

Işının numuneye giriş noktası

Optimum gözlem bölgesi

(LM10)

Not: Şekil numunedeki

partikülleri göstermemektedir

Lazer ışınının numuneden geçişi; istenilen görüntüleme alanınayakınlaştırılması

NTA Görüntüleme ve Ölçüm Limitleri

Minimum Boyut limiti:• Materyal tipine (RI oranı)

• Lazer dalga boyu ve gücüne

• Kameranın hassasiyetine

10 - 40nm

Maximum Boyut limiti:• Brownian hareket

• Viskozite

1000-2000nm

Minimum konsantrasyon limiti:

• Yeterli sayıda partikül olmaması = istatistikiolarak zayıf data

yaklaşık 107/ml

Maximum konsantrasyon limiti:

• Komşu partikülleri ayırt edememe

• Partiküller çok yakın olduğundan haretmesafeleri kısalıyor

yaklaşık 109/ml

Boyut Konsantrasyon

Boyut Ölçümü: 3 Aşamalı Proses

Analizİz sürmeYakalama

1. Görüntüleme ve Yakalama: Software Brownian hareket halindeki partiküllerin bir

videosunu çeker

2. İz süreme: Çekilen videodan yararlanarak her bir partikülün izi sürülür ve hepsinin

teker teker MSD’leri (mean squared displacement) for each particle hesaplanır

3. Analiz: Stokes Einstein denkleminden yararlanarak bireysel partiküller için Rh elde

edilir

• Partiküllerin MSD’ları (mean square displacement) hesaplanır

• Ölçülen parametre partikülünhidrodinamik yarıçapıdır (sphere equivalent hydrodynamic diameter)

• Sıcaklık ölçülür ve uygun viskozitekullanılır

• Kütle, RI, material tipinden bağımsızdır

• Absolut metod – kalibrasyongerektirmez

Boyut Ölçümü: Stokes-Einstein

KB = Boltzmann ConstantT = temperature

ts = sampling time= viscosity

dh = hydrodynamic diameter

<x,y>2 = KBTts

3dh

2-D Stokes-Einstein equation

Konsantrasyon Ölçümü

• Hacim biliniyor

• Partikül sayısı biliniyor

• 106 to 109 partikül/mL aralığında ölçüm yapılabilir

80 µm~10 µm

100 µm

Numune içeriği hakkında bilgi verir!

50nm Gold + 100nm Latex 100nm + 200nm Latex

**Partikül kompozisyonunun belirlenmesini sağlar

Floresan Ölçümler

405nm 488nm 532nm 642nm

• Lazer diyotu floroforları ve quantum dot’ları uyarabilir

• Synchronization cable to pulse the laser in time with the camera

shutter and high background

• Uzun geçiren ve ya Bant geçiren filtre seçenekleriyle spesifik

nanopartiküllerin iz sürümünü gerçekleştirebilir

Zeta Potansiyel Ölçümü

• Numuneye voltaj uygulanır

• Electroforez ve electroozmoz gözlenir

• Kararlılık göstergesidir – partiküller yeterince

yüklü iseler birbirlerini itme eğilimi gösterirler

• Sadece NS500 ile ölçülebilir

Part 2

NTA Software – Ölçüm nasıl alınır?

Numune Hazırlama

• Numune likid süspansiyon içinde hazırlanmalıdır

• Sonikasyon, filtrasyon vs. gibi gereklilikler numuneye özgü ve

müşteriye bağlıdır

• Numune gözle görülür biçimde konsantire olmamalıdır

1. Numune* numune haznesine doldurulur

2. Görüntü optimize edilir

o Konsantrasyon

o Lazer ışını pozisyonu belirlenir

o Fokus ayarlanır

o Kamera ayarı yapılır

3. Ölçüm yapılır

4. Videolar proses edilir

5. Sonuçlar ve raporlar alınır

Ölçüm Alınması

* İlk yüklenen numunenin “size standart bead”leri olması tavsiye edilir

NTA software’I üzerinde

gerçekleştirilir

Görüntünün Optimize Edilmesi

Kamera seviyesi (Camera Level), Numune konsantrasyonu

(Sample Concentration), Lazer ışını pozisyonu (Beam Position),

ve Focus arasında iterative bir prosestir

Camera Level ve Focus → auto-setting opsiyonu var

Camera Control panel

Script Panel

Temperature display

Live display from camera

Status InformationAnalysis tab

Hardware tab

SOP tab

Camera Start

İlk canlı görüntünün elde edilmesi (1)

İlk canlı görüntünün elde edilmesi (2)

Başta yüksek kamera

seviyesi seçin ve bireysel

patiküller seçilebilir hale

gelene kadar seviyeyi

azaltın

Likely to be line Optimal viewing Too far

Işın Pozisyonu: LM10 - ‘Thumbprint’

Thumbprint

Işın Pozisyonu: NS300 ve NS500

SOL fare tuşunu

kullanarak ekran hereket

ettirilir

Işıma yapan partiküller

görüntüleme alanını

doldurmalıdır

Fokus

Partiküller sürekli hareket halinde

olduğundan eş dğılmış, küresel fukus

elde etmek zor olabilir

İdeal görüntü (b) deki gibi olmalıdır.

Bulanık partiküller (a) yanlış sonuçlar

verecektir

Ulaşılabilen en iyi görüntü (c) ise o da

kabul edilebilir – küçük ve geride görünen

partikülleri görünür kılmak önemlidir

a) b) c)

LM10: Manuel focus dümenini

kullanılır

NS300: Cihazın yanındaki

düğmeden başlangıç fokusu

seçilir, software üzerinden

ayarlanır

NS500: Software üzerinden

ayarlanır

Kamera Ayarı

Kamera seviyesi ayarı, partiküller açıkça

görünene kadar ayarlarlanır. (20%’den fazla

renkli pixel görmemek kaydı ile)

Good Polydisperse Sample ImagePoor Polydisperse Sample Image

Good Monodisperse Sample Image Poor Monodisperse Sample Image

En hızlı hareket eden ve en mat

(en küçük) olan partiküllerin

görünür olduğundan emin olunuz

Konsantrasyon

Çok yüksek konsantrasyonlar

doğru iz sürmeyi engeller

Düşük konsantrasyonlar daha

uzun süreli görüntü yakalama ve

analiz zamanı gerektirir

*Düşük konsantrasyonlar için

NanoSight şırınga popasını

kullanmak örneklemeyi

artırdığından daha doğru sonuç

alınmasına yardımcı olur.

NanoSight ~107-109 particles/ml* aralığında ölçüm alabilir.

Bu görüntü alanında 20-100 tane partiküle denk gelir.

Concentration too low

1 particles identifiedConcentration too high

208 particles identified

Ideal concentration

44 particles identified

Oto-ayarlar (Auto-settings)

› NTA3.1 ve üzeri

› Auto-camera seviyesi Tüm cihazlarda mevcut

› Auto-focus Sadece NS300 ve NS500’de mevcut

› Numune oto-ayara uygun değilse system

kullanıcıyı uyaracaktır

Auto-Setup NS300 ve NS500

1. Sets an initial camera level

2. Focuses image 3. Sets capturecamera level

› Polidisperse olmayan numuneler için optimize

edilmiştir

Auto-camera seviyesi (-only) opsiyonu

› Tüm cihazlarda mevcuttur

› Polidisperse olmayan numuneler için optimize

edilmiştir

› Numune ful auto-setup’a uygun olmadığında

kullanılır

Görüntüyü finalize etmek

› Bunun bir iteratif proses olduğunu hatırlayın

› Optimum görüntüyü yakalamak için birden fazla

seçilmiş ayarı değiştirmek gerekebilir

Ölçüm yapmak (1)

‘Scripts’ are sets of

instructions that control

the software for each

measurement.

Raporda görmek istiyorsanız

seyreltme faktörü girilebilir

Su kullanılmadığı zaman viskozite

girilmelidir

Okumalar arasında ısı

birikimini önlemek için bu

kutuları işaretleyin

Ölçüm yapmaya

hazırsınız

Videoların sayı ve uzunluğunu seçin

Dosya adı ve yerini seçin (default -

folder of the date/Capture)

Ölçüm yapmak (2)

Sistem kullanıcıyı uyarır:

• Image/camera level ile

ilgili son kontrol

• Numune detaylarının

video ve çıktı

dosyalarında yer

almasını sağlayabilirsiniz

Yakala ve Başla…

Videoları Proses Etmek

› Video çekimi

tamamlandığında

“Process” alanine geçilir

› Bu ekran canlı imaj

yerine çekilen videoyu

gösterir. (Bu ekran daha

parlak görünecektir)

› Prosese başlanmadan

önce “Detection

Threshold”

ayarlanmalıdır. (OK’e

sonar basınız)

Detection Threshold (1)

› Slider veya + / – düğmelerini kullanarak

ayarlanır

› Gözle görülür şekilde, her frame’de her

bir partikül merkezinde kırmızı çarpı

olacak şekilde ayarlanır

› Mavi çarpılar olası yanlış patikülleri

(Noise) ifade eder ve minimumda

tutulmalıdır

› Slider’ı kullanarak farklı frame’lerdeki

görüntülerin doğruluğundan emin olun

Düşük sayıda yanlış merkez ve küçük

detection threshold, yüksek threshold ve

kaçırılan partiküllerden daha iyidir.

Detection Threshold (2)

Yüksek Detection Threshold

Düşük Detection ThresholdAlt soldaki görüntüdeki kırmızı çarpılarınsayısının 10 ile 100 arasında olması gerekir.

Videoların Prosesi

› Doğru Detection

Threshold seçildiğinde

OK’e basarak prosesi

başlatabilirsiniz

Proses

Software videoları proses ettikçe

görüntüde, Brownian Motion’dan

kaynaklı kırmızı “track”ler oluşur

Boyut (nm) vs Konsantrasyon

(particles/ml) ölçümleri mavi grafikte

gösterilir (default),

Aynı zamanda ölçümler; scatter plot

(Size (nm) vs Intensity (a.u.)), ve 3D

plot (Size (nm) vs Concentration

(particles / ml) vs Intensity (a.u.))

şeklinde de verilir

Örnek data – n=5 ölçüm

Export – Rapor Aktarımı

Proses tamamlandığında

Export Settings

opsiyonları penceri

otomatik olarak açılır

Default’lar PDF grafikleri ve

toplu özetleridir.

CSV dosyaları, ham datayı

içerir. Ve istenildiğinde

tekrar proses edilebilir.

WMV video dosyaları da aktarılabilir

.PDF ve.CSF dosya örnekleri

The size distribution profile

data are shown over-plotted

Mean ± SEM data are shown, with

the size of the key peaks annotated.

Part 3

Datayı Anlamak

Genel

› Karşılaştırma yapılabilmesi için aynı tipteki numuneler, aynı

parametrelerle ölçülmelidir

› Polidisperse numuneler güvenilir data elde etmek için daha

uzun süre yakalanmalıdır

› Düşük partikül/ml’ye sahip olan numuneler güvenilir data elde

etmek için daha uzun süre yakalanmalıdır

› Yanlış sonuçlara karşı, kullanıcılar PDF ve CSV dosyalarındaki

uyarıları dikkate almalıdır

Tipik Numune Profilleri

Elde edilen profil ölçülen numuneye bağlıdır

Örneğin pürifiye sükroz

gradyanlı extracellular

vesiküller ölçüldüğünde

ana bir peak ve bir ya da

daha fazla küçük peak’in

olması beklenir

Boyutu kontollü bir

numune ölçüldüğünde

e.g. boyut standartları,

extruded liposomes vs.,

tek peak’li dar bir dağılım

profili elde edilmelidir, bu

mono disperse numune

anlanına gelir

Polidisperse numunelerde

(e.g. aggregated protein)

bir çok peak’den oluşan bir

boyut dağılımı beklenir.

Tipik olarak partikül boyutu

arttıkça peak’ler genişler ve

kısalır

Kabul Edilebilir Data

Aynı numunenin biden fazla ölçümü üst üste yerleştirildiğinde polidispersite profillerinin

benzerliği, numuneleme hatasının olmadığını ve ölçümün yeterince uzun yapıldığını gösterir

i.e. Datanın Kabul edilebilir olması için monodisperse nnumune profillerinin birbirine oldukça

benzemesi gerekirken polisperse numune profillerinde daha az tekrarlanabilirlik Kabul

edilebilir.

Monodisperse sample

Polydisperse sample

Dikkat (1)

Proses öncesi

<5 merkez saptaması – zayıf istatistiki data

Olası sebep:

• Orijinal numunenin konsantrasyonu düşük

• Yüksek detection threshold (yeterli partikül saptanamıyor)

• Kamera ayarları en bulanık partikülleri görmek için fazla düşük

>200 merkez saptaması – partikülleri verimli şekilde izlemek için fazla

Olası sebep:

• Orijinal numunenin konsantrasyonu yüksek

• yüksek gürültü (detection threshold çok düşük ayarlanmış olabilir)

Dikkat (2)

Proses esnasında

Yüksek gürültü uyarısı

Olası sebep:

• Düşük detection threshold – gürültü topluyor

• Yüksek konsantrasyon – partiküllerin scatter ettiği ışınlar karışıyor

Partiküllerin izi sürülmüyor

Olası sebep:

• Yüksek detection threshold

• Düşük detection threshold

• Particles flickering (Partiküller titreşiyor)

Proses sonrası

<100/<200 partikül uyarısı – analizde düşük düşük sayıda partikül

izlemesi – zayıf istatistiki data

Olası sebep:

• Düşük konsantrasyon

• Kısa video uzunluğu

• Uygun beirlenmeyen ayarlar – camera level, detection threshold

Vibrasyon uyarısı – boyutun sistematik olarak dikkate alınmaması

• Sarı üçgen <10% hata

• Kırmızı üçgen >10% hata

Dikkat (3)

Özet

• Numune likid süspansiyon içinde olmalıdır ve optimum konsantrasyona ulaşmak

için seyreltmek gerekebilir – Doğru konsantrasyon çok önemlidir

• Doğru görüntüleme pozisyonunu bulun, uygun yakalma seviyesini seçin ve

fokusu ayarlayın ki tüm partiküller gözlenebilsin

• Tüm partikülleri izleyebilmek ve hatalı merkezlerin sayısını limitlemek için uygun

detection threshold’u seçin

• .PDF ve .CSV dosyaları (tüm track’lerin ve intensity datasının özeti) analizden

sonar otomatik olarak aktarılabilir