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PAOLA BENEIT VILLENA
14/DIC/2010
Citogenética Convencional Estudio citogenético convencional de las
neoplasias hematológicas En SP y MO Citogenética: Estudio de los cromosomas
de las células hematopoyéticas en su fase de máxima concentración (metafase)
Cariotipo: Ordenación de los cromosomas en 22 parejas de cromosomas autosómicos y una pareja de cromosomas sexuales
Ventajas
En un solo experimento, analizamos todo el genoma celular, con información de todos los cromosomas
Bajo coste económico Disponibilidad Alteraciones cromosómicas numéricas y
estructurales Significación clínica establecida
Inconvenientes Requiere cultivo de tejido fresco Analiza células sólo en división Lenta en tumores sólidos (2 semanas),
aunque en neos hematológicas, se puede en 24-72h
Precisa personal experimentado Baja sensibilidad Poco poder de resolución en alteraciones
cromosómicas complejas, microdelecciones, …
Muestras
Médula Ósea extraída mediante punción esternal o de cresta ilíaca, en un tubo estéril de heparina sódica
Sangre Periférica extraída en un tubo de 10ml de heparina sódica
Biopsia ganglionar guardada en un tubo con medio de cultivo
¡INTENTAR MÁXIMAS CONDICIONES DE ASEPSIA!
Siembra En primer lugar, se realiza la siembra de
los cultivos en condiciones estériles en la cámara de flujo laminar
Se siembran 0.5 ml en dos Falcons de cultivo estéril (preparados con 10ml de caldo de cultivo a -20ºC)
Según dx de la muestra, se cultiva 24-72h, con o sin TPA
Orientación Diagnóstica
Tipo de Muestra
Tipo de Cultivo
Mitógenos [ ] y tiempo de Colcemid
SMD MÓ o SP 24/48h24h + MTX
____________ (0,1g/ml)30’
SMPC MÓ o SP 24/48h24h + MTX
____________ (0,1g/ml)30’
LAM MÓ o SP 24/48h24h + MTX
____________ (0,1g/ml)30’
LAL MÓ o SP Directo/24h ____________ (0,1g/ml)2 h
SLPC/LNH SP o MÓ 72h TPA (estimulación de línea B)PHA (estimulación de línea T)
(0,15g/ml) 2h
SLPC/LNH Ganglio/bazo/ exudado/masa tumoral
24h: Sin estimulación celular48/72h: Con mitógeno
TPA/PHA (0,1g/ml)20’ (sin estimular)(0,15g/ml) 2h (estimulado)
MM MÓ 48/72h: Sin estimulación120h: Con
IL-4 (0,1g/ml)20’
Sacrificio de los cultivos Añadir 0.1 ml del antimitótico Colcemid y se
deja en estufa de CO2 a 37ºC durante○ 30’ las mieloblásticas (LAM, LMC, SMD, SMPC)○ 2º las linfoblásticas (SLPC, LNH)
Pasamos el contenido a un tubo de centrífuga, y lo centrifugamos 10’ a 1200 rpm
Posteriormente, decantamos el sobrenadante, dejando el botón (pellet) y resuspendemos
Choque Osmótico: 8 ml de ClK 0.075M gota a gota, agitando, y lo dejamos 30’ al baño maría (37ºC)
Sacrificio de los cultivos Centrifugamos, decantamos, y se
añaden 5ml del fijador Carnoy (metanol:ácido acético 3:1) agitando. 10’ a temperatura ambiente
Repetimos el paso anterior, dejando 30’ en nevera
Centrifugamos, decantamos, y añadimos 1ml de Carnoy
Resuspendemos y pasamos a un tubo NUP
Portaobjetos Porta previamente guardado a 4ºC con metanol. Secamos, cubrimos con fijador (Carnoy) y mientras decantamos se tiran 1 ó 2 gotas de la
preparación. Se flamea y se deja secar Miramos en microscopio invertido para ver la
densidad celular y la extensión de los cromosomas
Se hacen 4 extensiones de cada cultivo 24h en estufa de desecación a 60ºC, para
envejecer
Portaobjetos
Para la tinción○ Solución de tripsina 12 segundos○ Lavamos con PBS 2 segundos○ Giemsa al 5% 5 minutos○ Lavar y mirar al microscopio
Se cubren Metafer® para seleccionar metafases
Leucemias agudas
Momento Cultivo Cariotipo FISH
LAM Dx 2x24h + ADN + ARN + Criopreserv.
Sí CYTOCELL
Evolución 2x24h Sí Consultar
Pre/Post Tx 2x24h Sí Consultar
LAM INFANTIL Dx 2x24h Sí 7, 8, MLL
LAM (día sig.) Dx 24h + 48h Sí CYTOCELL
LAP Dx 1x24h + 1x48h Sí PML/RARα
Recaída 1x24h + 1x48h Sí PML/RARα
Evolución 1x24h + 1x48h Consultar Consultar
LAL Dx - Adultos 2x24h Sí BCR/ABL + MLL
Dx - Niños 2x24h Sí BCR/ABL + MLL + TEL/AML1 + E2A
Evolución 2x24h Sí Consultar
Pre/Post Tx 2x24h Consultar Consultar
Del(5q)
PML/RARα
Delección p53
AML1/ETO
MLL
Del(7q)
MYH11/CBFβ
Del(20q)
SMD y SMPC Momento Cultivo Cariotipo FISH
SMD * Dx 2x24h Sí 5q-
Evolución 2x24h Sí Consultar
Pre/Post Tx 2x24h Sí Consultar
SMPC Dx 2x24h Sí BCR-ABL (SP)
Evolución 2x24h Sí Consultar
LMC Dx 2x24h Sí BCR-ABL (SP)
Evolución 2x24h Sí BCR-ABL (SP)
LMMC Dx 2x24h + ADN + ARN
Sí PDGFR α y β* + BCR-ABL
Evolución 2x24h Sí No
SLPC Momento Cultivo Cariotipo FISH
SLPC-B Dx 2x72h + TPA No FISH LLC + IgH
LLC Dx 2x72h + TPA No FISH LLC + IgH
SLPC-T Dx 2x72h + PHA No FISH LLC + IgH
LINFOMAS Momento Cultivo Cariotipo FISH
Manto Dx 2x72h + TPA No BCL-1
Folicular Dx 2x72h + TPA No BCL-2
No definido Dx 2x72h + PHA No IgH
Hodking No No No
OTROSMoment
oCultivo Cariotipo FISH
Anemia Aplásica Dx 2x24h Sí 7q-
Fragilidad Cromósomica
Dx 2x72h + PHA2x72h + DPB2x72h + 10 MTC2x72h + 40 MTC
Sí No
FISH Complemento de la técnica de
citogenética Hibridación in situ: Marcar o identificar
una secuencia de ADN con una sonda específica que reconoce dicha secuencia
Sonda: Secuencia de ADN marcadas con un fluorocromo, específicas, que reconocen una determinada secuencia del genoma
FISH Alteraciones cromosómicas numéricas y
estructurales tanto en células que no entran en división (interfase) como en células en división (metafase)
La mayoría de los dx hematológicos se asocian a una alteración citogenética determinada
Confirmación de dx clínicos, caracterizar grupos pronósticos y realizar monitorización de EMR
Valoración del quimerismo hematopoyético tras el trasplante de médula ósea alogénico cuando existe discrepancia de sexo entre donante y receptor
FISH Menor S que otras técnicas moleculares Identificación de anomalías cromosómicas
crípticas o difíciles de detectar para la citogenética convencional
Por el hecho de permitir identificar mutaciones en interfase, simplifica el procesamiento de la muestra al no requerirse cultivo
○ Técnica sencilla y rápida○ En determinados casos, en 4-5h se puede tener
un dx
FISH Puede aplicarse en células depositadas en
un portaobjetos de microscopia (frotis convencional, impronta de tejido, citocentrifugación…) hasta cortes de tejido incluidos en parafina
Se ha usado esta técnica para muestras en parafina almacenadas durante años (hasta 12) a tª ambiente
Técnica de elección (por delante de la PCR) para búsqueda de translocaciones que involucran a genes “promiscuos”, y para delecciones en MM, LLC…
Variantes
Variantes tecnológicas○ Hibridación genómica comparada (CGH)○ Cariotipo espectral (SKY-FISH)○ Multiplex FISH (M-FISH)
Aplicaciones crecientes
Variantes (M-FISH y SKY-FISH) Consisten en marcar el ADN de cada
cromosoma con un fluorocromo con espectro de emisión único y diferenciable de lo demás
“Se pinta a cada cromosoma de un color” Los cromosomas anómalos aparecerán no
uniformes Útil en neos hematológicas Caracteriza correctamente translocaciones
complejas y crípticas
Ventajas (M-FISH y SKY-FISH) Permiten analizar todo el genoma Enorme poder de resolución Identificación de segmentos
cromosómicos no identificados (gran avance en el conocimiento de los genes implicados en ≠ patologías)
Inconvenientes (M-FISH y SKY-FISH) Requieren cultivo de tejido fresco Analizan sólo células en división Personal experimentado tanto en la
realización como en la interpretación Sensibilidad similar al cariotipo, aunque la
información sea más concluyente No detectan delecciones, inversiones o
duplicaciones dentro de un cromosoma Elevado coste económico Equipo informático sofisticado
Muestras
Preparaciones de citogenética convencional tras cultivo de médula ósea, sangre periférica, ganglio u otros tejidos
La muestra obtenida de estos cultivos se conserva en solución Carnoy
También es aplicable a extensiones en fresco de muestras biológicas
Preparación – Día 1 Extensiones: Eppendorf (donde se ha
guardado el material de citogenética convencional) del congelador a -20ºC, se centrifuga, se decanta, y se resuspende con fijador nuevo
Una gota en un porta previamente tratado con metanol y secar a la llama o con plancha a 40-50ºC
Observar extensiones en microscopio invertido a x10 aumentos para ver la distribución de núcleos y el secado
Guardar a Tª ambiente 24h○ Si la muestra es urgente, se puede hibridar en el
mismo día, dejando al menos 1h en temperatura ambiente
Hibridación - Día 2 En oscuridad 7 µl de tampón 1 µl de sonda 2 µl de agua destilada
Se colocan en el porta, tapar con un cubre y colocar en el Hybrite e incubar según cada sonda (24h
normalmente)
Tª ambienteEppendorf estéril
Lavado y contratinción - Día 3 En oscuridad Lavado post-hibridación
○ Retiramos cubre, lavamos 2’ en un baño a 74ºC con una solución de lavado
○ Posteriomente, lavamos 1’ en una solución de lavado a distinta concentración y a temperatura ambiente
Contratinción○ Poner 10 µl de DAPI II y cubrir○ Poner a -20ºC en una caja oscura, envueltas
en papel de aluminio, como mínimo 30’-1º
Microscopio de Fluorescencia Sondas centroméricas: Mínimo de 200
núcleos, con los núcleos con 1, 2, 3 ó 4 señales de hibridación
○ Trisomía: Si >5% de células con 3 señales○ Monosomía: Si >15% con 1 señal
Sondas de locus específicos: Valorar mínimo de 100 núcleos o de 20 metafases
○ Valorable si >5% de células alteradas
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