View
4.051
Download
17
Category
Preview:
DESCRIPTION
laporan sementara Uji Cemaran Mikroba
Citation preview
ACARA VIII
UJI CEMARAN MIKROBA :
ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) DAN ANGKA KAPANG KHAMIR
(AKK)
A. TUJUAN
1. Menghitung jumlah mikroba aerob mesofil yang terdapat dalam
produk makanan.
2. Menguji bahwa produk makanan yang diuji tidak boleh
mengandung mikroba melebihi batas yang ditetapkan karena
berbahaya (toksik) bagi kesehatan.
B. DASAR TEORI
Pertumbuhan kuman merupakan peningkatan umlah sel kuman yang
terjadi akibat peningkatan biomassa kuman yang teratur, pertumbuhan
kuman memerlukan lingkungan nutrisi yang cocok sehingga dapat
mendukung proses perkembangbiakan kuman. Konsentrasi sel kuman
dapat diukur dengan “perhitungan jumlah sel hidup” dengan cara
pengenceran yang diikuti dengan penentuan unit pembentukan koloni pada
permukaan media agar (Arthur, 1993).
Kapang adalah kelompok mikroba yang tergolong dalam fungi.
Kapang adalah fungi yang mempunyai filamen (miselium). Sedangkan
khamir adalah juga termasuk fungi, tapi yang dibedakan dari kapang
karena bentuknya yang terutama uniseluler. Reproduksi vegetatif khamir
dengan pertunasan dan dapat tumbuh lebih cepat daripada kapang. Khamir
lebih efektif memecah komponen kimia dibandingkang kapang karena
mempunyai perbandingan luas permukaan dengan volume yang lebih
besar. Khamir tidak dapat melakukan proses fotosintesis. Sel khamir
mempunyai ukuran sel yang bervariasi yaitu dengan panjang 1-
5mikrometer dan lebar 1-10 mikrometer. Bentuk sel khamir yaitu bulat,
oval, silinder, bulat panjang dengan salah satu ujung runcing, segitiga
melengkung berbentuk botol, bentuk apikulat dan lemon dan sebagainya
(Srikandi, 1992).
Uji angka lempeng total bertujuan untuk menunjukkan jumlah
mikroorganisme dalam suatu sediaan dengan metode hitungan cawan. Jika
sel masih dapat ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikrobia
tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat
langsung dilihat dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Cara
perhitungan koloni yaitu dengan memilih cawan yang ditumbuhi koloni
dengan jumlahnya berkisar antara 25 koloni – 250 koloni. Bila tiap cawan
memiliki tingkat pengenceran yang berbeda, tetapi memiliki jumlah koloni
seperti kisaran di atas, maka pilih cawan koloni dengan koloni yang
banyak. Kemudia gunakan tally counter untuk menghitung jumlah koloni.
Beri tanda pada koloni yang telah dihitung untuk menghindari perhitungan
ulang. Bila ada koloni yang menyebar dihitung sebaga isatu koloni. Akan
tetapi bila lebih dari 25% koloni yang tumbuh pada cawan adalah koloni
yang menyebar, maka cawan tidak perlu dihitung. Perhitungannya (jumlah
koloni per ml sampel) adalah dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni
dari pengenceran yang dipilih dengan kebalikan dari faktor pengenceran.
Secara sistematis dapat dirumuskan sebagai berikut :
Faktor pengenceran = (pengenceran) x (jumlah yang ditumbuhkan)
Jumlah koloni = (jumlah koloni) x (1/faktor pengenceran) (Anonim,
2001).
Jumlah mikrobia pada suatu bahan dapat ditentukan dengan
bermacam-macam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikrobia yang
ditentukan. Jenis populasi mikrobia dlama tanah, air, bahan makanan, dll.
Berbeda-beda tergantung pada susunan bahan tersebut. Ada 2 cara
perhitungan jumlah mikrobia, yaitu perhitungan secara langsung (direct
method) dan secara tidak langsung (indirect method) (Jutono, 1980).
1. Perhitungan Jumlah Mikrobia secara Langsung
Cara ini dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia keseluruhan
baik yang mati maupun yang hidup. Ada beberapa cara perhitungan
antara lain :
a. Menggunakan counting chamber
Perhitungan ini dapat memakan haemacytometer, Petroff-
Hausser Bacteria Counter atau alat-alat lain yang sejenis. Dasar
perhitungannya ialah dengan menempatkan 1 tetes suspensi bahan
atau biakan mikrobia pada alat terebut, ditutup dengan gelas
penutup kemudia diamat idengan mikroskop yang perbesarannya
tergantung pada besar kecilnya mikrobia. Dengan menentukan
jumlah sel rata-rata tiap petak (ruangan) yang telah diketahui
volumenya dari alat tersebut dapat ditentukan jumlah sel mikrobia
tiap cc (Jutono, 1980).
b. Menggunakan cara pengecatan dan pengamatan mikroskopik
Pada cara ini mula-mula dibuat preparat mikroskopik pada
gelas benda : suspensi bahan atau biakan mikrobia yang telah
diketahui volumenya diratakan di atas gelas benda pada suatu luas
tertentu. Setelah itu preparat dicat dan dihitung jumlah rata-rata sel
mikrobia tiap bidang pemandangan mikroskop. Luas bidang
pemandangan mikroskop dihitung dengan mengukur garis
tengahnya. Jadi jumlah mikrobia yang terdapat pada gelas benda
seluruhnya dapat dihitung. Dengan perhitungan dapat diperoleh
jumlah mikrobia tiap cc bahan/cairan yang diperiksa. Cara yang
hampir sama yang biasanya dipakai untuk menghitung jumlah
bakteri ialah dengan mencampurkan 1 cc biakan bakteri dengan 1
cc dara manusia; setelah tercampur homogen dibuat preparat
mikroskopik. Dari perbandingan jumlah rata-rata sel bakteri dan
jumlah sel darah merah dalam tiap bidang pemandangan, jumlah
bakteri tiap cc dapat dihitung, sebab darah manusia yang normal
rata-rata mengandung 5 juta sel darah merah tiap cc (Jutono, 1980).
c. Menggunakan filter membran ( milliporefilter )
Mula-mula disaring sejumlah volume tertentu suatu suspensi
bahan atau biakan mikroba kemudian disaring dengan filter
membran yang telah disterilkan. Dengan menghitung jumlah sel
rata-rata tiap kesatuan luas pada filter membran dapat dihitung
jumlah sel dari volume suspensi yang disaring. Kalau perhitungan
secara biasa sukar, perlu dilakukan pengecatan pada filter
membran, kemudia filter membran dijenuhi dengan minyak imersi
supaya dapat menjadi trasparan (Jutono, 1980).
2. Perhitungan Jumlah Mikrobia secara Tidak Langsung
a. Menggunakan sentrifuge
Caranya ialah 10 cc biakan cair mikrobia disentrifuge dengan
memakai sentrifuge yang biasa dipakai untuk menentukan jumlah
butir-butir darah. Supaya hasilnya dapat dipertanggungjawabkan,
maka kecepatan dan waktu sentrifugasi harus diperhatikan. Setelah
diketahui volume mikrobia keseluruhan makan dapat dipakai untuk
menentukan jumlah sel-sel mikrobia tiap cc, yaitu dengan membagi
volume mikrobia keseluruhan dengan volume rata-rata tiap sel
mikrobia (Jutono, 1980).
b. Berdasarkan kekeruhan
Dasar penentuan cara ini ialah jika seberkas sinar dilewatkan
pada suatu suspensi mikrobia makan makin pekat (keruh) suspensi
tersebut makin besar intensitas sinar yang diabsorpsi sehingga
intensitas sinar yang diteruskan makin kecil. Untuk keperluan ini
dipakai alat-alat seperti photoelectric turbidimeter :
electrophotometer; spectrophotometer; nephelometer dan alat lain
yang sejenis. Alat tersebut memakai sinar monokromatik dengan
panjang gelombang tertentu. Dengan membaca persentase sinar
yang diabsorpsi atau sinar yang diteruskan dan dibandingkan
dengan suspensi standar mikrobia sama yang telah diketahui
jumlahnya tiap cc. Alat yang paling sederhana untuk penentuan
tersebut ialah komparator blok, tapi penggunaan alat ini
kesalahannya sangat besar sebab cara pengamatannya hanya
memakai mata biasa (Jutono, 1980).
c. Menggunakan penghitung elektronik ( electronic counter )
Alat ini dapat menentukan beribu-ribu sel tiap detik secara
tepat. Prinsip kerjanya ialah adanya gangguan-gangguan pada
aliran ion-ion (listrik) yang bergerak di antara kedua elektrode.
Penyumbatan sementara oleh sel mikrobia pada pori sekat yang
terdapat di antara kedua elektrode itu menyebabkan terputusnya
aliran listrik. Jumlah pemutusan aliran tiap satuan waktu
dihubungkan dengan kecepatan aliran cairan yang mengandung
mikrobia merupakan ukuran jumlah mikrobia dalam cairan tersebut
(Jutono, 1980).
d. Berdasarkan analisa kimia
Cara ini didasarkan atas hasil analisa kimia sel-sel mikrobia.
Makin banyak sel-sel mikrobia, makin besar hasil analisa kimianya
secara kuantitatif. Yang dipakai sebagai dasar penentuan
umummnya ialah kandungan protein : asam-asam nukleat (DNA
dan RNA) atau fosfor dari asam-asam nukleat, dan sebagainya
(Jutono, 1980).
e. Berdasarkan berat kering
Cara ini terutama digunakan untuk penentuan jumlah jamur
benang misalnya dalam industri mikrobiologi. Kenaikan berat
kering suatu mikrobia berarti juga kenaikan sintesa dan volume sel-
sel yang dapat dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia (Jutono,
1980).
f. Menggunakan cara pengenceran
Cara pengenceran ini dipakai untuk menentukan jumlah
mikrobia yang hidup saja. Dasar perhitungannya ialah
mengencerkan sejumlah volume tertentu suatu suspensi bahan atau
biakan mikroba secara bertingkat. Seletah diinokulasikan ke dalam
medium dan diinkubasikan dilihat adanya pertumbuhan mikrobia.
Misalnya suatu seri pengenceran dengan kelipatan 10 pada
pengenceran 1 : 1000 ada pertumbuhan tetapi pada pengenceran 1 :
10000 tidak ada pertumbuhan, berarti secara teoretis jumlah
mikrobia pada suspensi bahan atau biakan mikrobia antara 1000
dan 10000 tiap cc (Jutono, 1980).
g. Menggunakan cara Most Probable Number (MPN)
Cara di atas kurang tepat mengingat tidak semua mikrobia
dapat tumbuh dalam suatu medium pada keadaan tertentu. Untuk
mengatasinya makan tiap pengenceran dibuat beberapa ulangan,
hasilnya secara matematik dapat untuk menentukan kemungkinana
besar jumlah mikrobia yang terdapat dalam suspensi bahan
tersebut. Cara ini dikenal sebagai Most Probable Number (jumlah
mikrobia yang paling mungkin). Untuk penentuan jumlah mikrobia
yang paling mungkin digunakan daftar Most Probable Number
misalnya daftar HOSKINS atau daftar MC.CRADY (Jutono, 1980).
h. Berdasarkan jumlah koloni ( plate count )
Cara ini yang paling umum dipakai untuk perhitungan jumlah
mikrobia. Dasarnya ialah membuat suatu seri pengenceran bahan
dengan keliapatan 10; dari masing-masing pengenceran diambil 1
cc dan dibuat taburan dalam petridish (pour plate) dengan medium
agar yang macam dan caranya tergantung pada jenis mikrobia.
Setelah diinkubasikan, dihitung jumlah koloni tiap petridish dari
masing-masing pengenceran. Dari jumlah koloni dengan kebalikan
pengencerannya, misalnya untuk pengenceran 1 : 10000 terdapat
45 koloni bakteri maka tiap cc atau gram bahan mengandung
450000 bakteri. Untuk membantu menghitung jumlah koloni dalam
petridish dapat digunakan colony counter yang biasanya dilengkapi
dengan electronic register. Pada perhitungan dengan cara ini ada
beberapa syarat yang harus dipenuhi, antara lain :
Jumlah koloni tiap petridish antara 30-300 koloni, jika
memang tidak ada yang memenuhi syarat dipilih yang
jumlahnya mendekati 300.
Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas
petridish, koloni tersebut dikenal sebagai spreader.
Perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran yang
berturut-turut antara pengenceran yang lebih besar dengan
pengenceran sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari dua
hasilnya maka di rata-rata; tapi jika lebih besar dari dua yang
dipakai jumlah mikrobia dari hasil pengenceran sebelumnya.
Jika dengan ulangan setelah memenuhi syarat hasilnya di rata-
rata (Jutono, 1980).
C. PROSEDUR KERJA
1. UJI ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT)
Alat dan Bahan
a. Media Plate Count Agar (PCA)
b. Buffered Pepton Water (BPW)
c. Sampel uji makanan (jajan pasar dan makanan dalam
kemasan pabrik)
d. Pipet volume
e. Colony Counter (alat hitung koloni)
f. Cawan mortir steril
g. Gelas arloji steril
h. Sendok steril
Cara Kerja
a. Persiapan dan Homogenisasi Makanan
Membersihkan wadah/kemasan sediaan makanan dengan
alkohol 70%
Melewatkan bagian yang dibuka dengan api bunsen agar
tercipta suasana aseptis
Sampel di-homogenisasi-kan sesuai dengan bentuk
makanan ujinya (cairan, serbuk, kental, padat, beku,
dikalengkan), dapat dilihat di lampiran pada buku panduan
b. Pembuatan media PCA sesuai dengan yang tertera
pada kemasan
c. Pengujian sampel
Sampel uji berupa makanan dalam kemasan maupun yang
tidak dalam kemasan yang bisa dihancurkan dengan
menggunakan mortir steril. Timbang @ 5 gram
menggunakan gelas arloji steril secara aseptis
Penanganan wadah/kemasan : Wadah/kemasan makanan
dibersihkan, dicuci/dilap dengan alkohol 70 %, bagian
tutup/bagian yang dibuka dilewatkan di atas api dan
kemudian dibuka secara aseptis
d. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel
Dengan cara aseptik timbang 5 gram atau 10 gram masing-
masing sampel makanan yang telah dihaluskan dengan
mortir, larutkan ke dalam 45 ml BPW atau 90 ml BPW,
kocok dengan baik dan homogen. Didapat suspensi dengan
pengenceran 10-1. (Berat sampel/bahan bisa disesuaikan
dengan kebutuhan).
Siapkan 3 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 9 ml
BPW.
Pipet 1 ml bahan yang telah dihomogenkan dalam tabung I,
kocok sampai homogen.
Pipet 1 ml cairan dalam tabung I ke dalam tabung II, kocok
sampai homogen
Pipet 1 ml cairan dari tabung II dan masukkan ke dalam
tabung III, kocok sampai homogen. Dengan demikian
pengenceran yang diperoleh adalah 10 -2, 10 -3, 10 -4.
e. Uji ALT
Dari masing-masing hasil pengenceran bahan tersebut,
pipet 1 ml dan tuangkan ke dalam 15 ml PCA yang telah
dicairkan (suhu 45-55 oC).
Tuangkan ke dalam cawan petri steril, goyang sampai
homogen dengan cara memutar petri sedemikian rupa
hingga suspensi tersebar merata (metode pour plate).
Percobaan dibuat duplo.
Untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer dibuat uji
kontrol. Uji sterilitas media dilakukan dengan pembuatan
kontrol kontaminasi media. Caranya : ke dalam satu cawan
petri dituangkan media dan biarkan memadat. Uji kontrol
pengencer dilakukan menginokulasikan larutan BPW ke
dalam media PCA, biarkan memadat.
Biarkan sampai memadat dan inkubasikan pada suhu kamar
selama 24 jam.
Amati hasil dan hitung jumlah koloni kuman yang tumbuh.
dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang
menunjukkan jumlah koloni antara 25-250 koloni. Jumlah
koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan
dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai
Angka Lempeng Total (ALT) dalam tiap gram contoh
bahan (jumlah bakteri per ml sampel : CFU/ml sampel).
Cara menghitung dan menyatakan hasil ALT terlampir
dalam lampiran 2.
Bandingkan hasil angka ALT yang diperoleh dengan
literatur tentang persyaratan ALT pada makanan yang
ditetapkan berdasarkan SNI.
2. UJI ANGKA KAPANG KHAMIR (AKK)
Alat dan Bahan
a. Media Malt Extract Agar (MEA)
b. Buffered Pepton Water (BPW)
c. Sampel uji makanan (jajan pasar dan makanan dalam
kemasan pabrik)
d. Kloramfenikol 100 mg/liter media
Pembuatan larutan kloramfenikol : 1 gram kloramfenikol
dalam 100 ml air suling steril
e. Pipet volume
f. Colony Counter (alat hitung koloni)
g. Cawan mortir steril
h. Gelas arloji steril
i. Sendok steril
Cara Kerja
a. Persiapan dan Homogenisasi Makanan
Membersihkan wadah/kemasan sediaan makanan dengan
alkohol 70%
Melewatkan bagian yang dibuka dengan api bunsen agar
tercipta suasana aseptis
Sampel di-homogenisasi-kan sesuai dengan bentuk
makanan ujinya (cairan, serbuk, kental, padat, beku,
dikalengkan), dapat dilihat di lampiran pada buku panduan
b. Pembuatan media MEA (Malt Extract Agar) sesuai
dengan yang tertera pada kemasan
c. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel
Perhitungan Angka Kapang Khamir (AKK) bertujuan untuk
menghitung jumlah koloni kapang dan khamir yang
terdapat dalam bahan. Pada prinsipnya pengujian ini
menggunakan metode yang sama dengan penentuan Angka
Lempeng Total (ALT).
Media pertumbuhan yang digunakan adalah MEA (Malt
Extract Agar)
d. Uji AKK
Sebelum dicampur dengan sampel makanan, MEA
ditambah dengan antibiotik kloramfenikol (MEA 100 ml
ditambah 0,5 ml larutan antibiotik kloramfenikol (1 gram
antibiotik dalam 100 ml air suling steril).
Metode pour plate : ambil 15 ml MEA suhu 45-50 oC
dalam tabung reaksi (yang telah diinokulasi kloramfenikol)
dan tambahkan 1 ml dari masing-masing hasil pengenceran
sampel makanan. Tuangkan ke dalam cawan petri steril,
goyang sampai homogen dengan cara memutar petri
sedemikian rupa hingga suspensi tersebar merata (metode
pour plate).
Percobaan dibuat duplo. Seluruh cawan petri diinkubasi
pada suhu 20-25oC dan diinkubasi 24-48 jam.
Saat pengamatan, catat jumlah koloni jamur yang tumbuh.
Koloni khamir dibedakan dari kapang karena bentuknya
bulat kecil-kecil putih hampir menyerupai bakteri. Koloni
kapang biasanya buram dan berbulu, koloni khamir
berwarna putih dan licin (berbau asam). Lempeng agar
yang diamati adalah lempeng di mana terdapat 10-150
koloni kapang/khamir. Jumlah total koloni dari kedua
cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor
pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Kapang
Khamir (AKK) dalam tiap gram atau ml contoh bahan
Cara menghitung dan menyatakan hasil AKK terlampir
dalam lampiran 2.
Bandingkan hasil angka AKK yang diperoleh dengan
literatur tentang persyaratan AKK pada makanan yang
ditetapkan berdasarkan SNI.
Recommended