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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANAacute
PEDRO VICENTE MICHELOTTO JUacuteNIOR
EFEITOS DO DESAFIO AMBIENTAL E DO EXERCIacuteCIO NA FUNCIONALIDADE
DOS MACROacuteFAGOS DO LAVADO BRONCOALVEOLAR DE CAVALOS PURO
SANGUE INGLEcircS DE CORRIDA
CURITIBA
2010
PEDRO VICENTE MICHELOTTO JUacuteNIOR
EFEITOS DO DESAFIO AMBIENTAL E DO EXERCIacuteCIO NA FUNCIONALIDADE
DOS MACROacuteFAGOS DO LAVADO BRONCOALVEOLAR DE CAVALOS PURO
SANGUE INGLEcircS DE CORRIDA
Tese apresentada ao Curso de Poacutes-
Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular
aacuterea de concentraccedilatildeo Fisiologia Setor de
Ciecircncias Bioloacutegicas Universidade Federal do
Paranaacute como requisito parcial agrave obtenccedilatildeo do
tiacutetulo de Doutor em Fisiologia
Orientadora Profa Dra Anita Nishiyama
CURITIBA
2010
A mente que se abre a uma nova ideacuteia
jamais voltaraacute ao seu tamanho
original
Albert Einstein
Obrigado Senhor por na dificuldade
carregar-me no colo pela Sua
presenccedila constante mesmo nos
momentos mais tranquumlilos e por
conceder-me mais esta benccedilatildeo
DEDICATOacuteRIA
Este trabalho eacute dedicado agrave minha esposa Ana
Luacutecia e aos meus filhos Joatildeo Pedro e
Bernardo com todo o meu amor
Aos cavalos por me ensinarem tanto
AGRADECIMENTOS
A Deus por permitir-me concluir mais esta etapa em minha vida
A minha esposa Ana Luacutecia e meus filhos Joatildeo Pedro e Bernardo que estiveram ao
meu lado desde o iniacutecio desta jornada souberam me dar tranquumlilidade e muito amor aleacutem de levarem pizza no laboratoacuterio nos dias de experimento
Aos meus pais Pedro Maria Luis e Zelma pelos exemplos que vocecircs satildeo e por todo o amor e apoio em todos os momentos
Aos meus irmatildeos Marcus e Andreacute cunhados Cristine Dani e Luiz Gustavo sobrinhas Mariana e Juacutelia pela amizade e torcida
A minha orientadora Profa Dra Anita Nishiyama sobretudo pela amizade e incentivo sendo orientadora nos momentos certos sempre com muita competecircncia
Aos meus colegas meacutedicos veterinaacuterios e amigos Alessandro Mercadante Daniel Mendes Campos Fernando Perche e Luis Henrique Costa pelo apoio prestado na execuccedilatildeo deste trabalho permitindo a avaliaccedilatildeo de potros sob sua
responsabilidade
Aos estabelecimentos que me apoiaram e suas equipes de funcionaacuterios sempre
prestativos Haras Belmont Haras Cifra Haras Santa Rita da Serra Haras dos Girassoacuteis Haras Palmerini Haras Santareacuten
Aos treinadores que me apoiaram permitindo a avaliaccedilatildeo dos potros sob sua responsabilidade extensivo agraves suas respectivas equipes de funcionaacuterios Fernando Azevecircdo Beto Feltran Gladston Santos J Ceacutesar A A Farias Marcus Lanza
Agrave incansaacutevel equipe de colheitas de lavado broncoalveolar que em momento algum deixou de madrugar nos 22 experimentos conduzidos Lorena Andrade da Cruz
Renata Schaefer Liacutevia Medalha Arauacutejo Amine do Vale Meira Fabiana Tieme da Silva Mariana Muumlller da Silva Aline Bonfaacute Richard
A maravilhosa equipe da qual tive a felicidade de conhecer e trabalhar Luis Alexandre Muehlmann MS Fernanda Ceccon Grando MS Ana Luacutecia Zanatta Carolina Farias Gabriela Rubbo Eloyse Bieberbach Ana Claacuteudia e Victor Vocecircs
me deram a amizade e o prazer de trabalhar com vocecircs me ensinaram muito e valorizaram o verdadeiro sentido de equipe com simplicidade determinaccedilatildeo e muita competecircncia
Aos amigos do Laboratoacuterio de Metabolismo Celular da UFPR companheiros de poacutes-graduaccedilatildeo de duacutevidas de buscas pelas respostas de risadas e de conquistas
muito obrigado pela amizade ajuda e muita paciecircncia Fabiacuteola Eacuteverson Ricardo Carine Loli Sandro Gleisson Marcelo Jaison Isabela Diogo Paulo Dalton Gina Daniele Pequito
Ao Prof Dr Luiz Claacuteudio Fernandes pela inestimaacutevel oportunidade de poder
trabalhar no seu laboratoacuterio disponibilizando material necessaacuterio e seu tempo quando o solicitei
A minha amiga e soacutecia meacutedica veterinaacuteria MS Cassiana Maria Garcez Ramos
Aos meus amigos da Direccedilatildeo do Curso de Medicina Veterinaacuteria da PUCPR Profa
Dra Claacuteudia Turra Pimpatildeo e Prof Rodrigo Taacutevora Mira por todo o apoio incentivo e amizade incondicionais
Aos amigos professores da PUCPR Rita M Rocha Denise Kozemjakin Antonia Maria Marconi Farias pelo apoio
Ao Decano do Centro de Ciecircncias Agraacuterias e Ambientais da PUCPR Prof Dr Sylvio Peacutellico Neto pelo apoio e incentivo
Ao Professor Metry Bacila por tantos exemplos demonstrados e por nunca haver se omitido em ajudar e entusiasmar
As bibliotecaacuterias da UFPR pela ajuda e tambeacutem da PUCPR Lucieli e Teresinha e equipe
A amiga Monica Echeverria pela amizade e apoio no inglecircs nesta e em muitas outras oportunidades Thank you
Ao Laboratoacuterio Fort Dodge pelo apoio me fornecendo os sedativos e pela dedicaccedilatildeo dos competentes profissionais Alessandra Carol e Leonardo que sempre estiveram dispostos a ajudar
Ao amigo Nilton Reis companheiro de trabalho na Unidade Hospitalar para Equinos da PUCPR pelo apoio
Aos amigos do Regimento de Poliacutecia Montada Coronel Dulciacutedio pela amizade e apoio durante esta etapa Coronel Heraldo Reacutegis Boacuterio da Silva Major Lorival da
Cunha Sobrinho Major Maacutercio Luis Fonseca Capitatildeo Adilar Marcelo de Lima e agrave equipe do Centro Veterinaacuterio da PMPR Sargento Faacutetima Sd Manasseacutes e demais amigos
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS IX
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES XI
LISTA DE TABELAS XV
RESUMO XVI
ABSTRACT XVII
1 INTRODUCcedilAtildeO 18
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 18
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA) 18
13 PAF E VIAS AEacuteREAS 23
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 27
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO 29
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE) 34
2 OBJETIVOS 40
21 OBJETIVOS GERAIS 40
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS 41
31 REAGENTES E SEDATIVOS 41
32 ANIMAIS 41
33 ASPECTOS EacuteTICOS43
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA 43
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS 43
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) 45
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA46
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957) 47
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS 48
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE CA++
EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE ET AL 2001) 48
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)51
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR E MARLETTA 1985) 51
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA
(NOUROOZ-ZADEH ET AL 1994)52
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984) 53
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA ET AL 1998) 54
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA ET AL 1998) 54
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK E MIZEL 1981) 55
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN E GORDON 1987) 56
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 57
4 RESULTADOS 59
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO 59
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica59
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas 60
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT) 61
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA) 62
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem Diferencial de Ceacutelulas do LBA 62
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF 63
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF 65
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 67
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 68
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 69
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 70
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA 71
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 72
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar 73
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 74
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO 75
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA 75
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 76
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 77
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 78
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 79
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 80
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-) 80
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 81
5 DISCUSSAtildeO 83
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 96
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 97
LISTA DE ABREVIATURAS
ACVIM American College of Veterinary Internal Medicine
AT Aspirado traqueal
CN Grupo Condiccedilotildees Naturais
DA Grupo Desafio Ambiental
DIVA Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas
DIVAI Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
DPOC Doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica
EX Grupo Exerciacutecio
HAIE Hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio
HPIE Hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
HRPO Horse radish peroxidase
IFN-γ Interferon gama
IL-1 Interleucina-1
IL-4 Interleucina-4
IL-8 Interleucina-8
IL-9 Interleucina-9
IL-17 Interleucina-17
LBA Lavado broncoalveolar
L-NAME N-nitro-L-arginina metil ester
LTB4 Leucotrieno B4
LTE8 Leucotrieno E8
MLCP Myosin light chain phophatase
NO Oacutexido niacutetrico
NOS Oacutexido niacutetrico sintase
NTCN Nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas
ORVA Obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas
PAF Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PAF-AH Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria acetilhidrolase
PAF-R Receptor de fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PBS Soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada
PMA Phorbol myristate acetate
PMN Polimorfonuclear
PRS Phenol red solution
PSI Puro sangue inglecircs
RNS Espeacutecie reativa do nitrogecircnio
ROS Espeacutecie reativa do oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Th2 Linfoacutecitos T helper 2
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE 20
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO SN-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL 24
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM
RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS 25
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E
SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE 30
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA
ASMA 31
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS 32
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO
A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR
(BAC) 36
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO
DERSKEN et al (2009) 38
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA
FARINGE 44
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS
ARITENOacuteIDES DE I A IV 44
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME
ENDOSCOacutePICO 45
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO
DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO
REGISTRADA A 510 nm 50
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA
ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 57
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA
AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 63
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS
DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 64
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO
ANTAGONISTA DE PAF BN52021 64
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO
ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 65
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 66
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR
PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 66
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++
EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 67
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO
EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA
ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 68
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A
PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 69
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO
SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 70
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX
(n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA 71
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) 72
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) 73
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) 74
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) 75
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) HPIE NEG (n=5) e EX NORMAL (n=4) 76
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE
POS (n=13) HPIE NEG (n=12) E EX NORMAL (n=8) 77
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) HPIE NEG (n=10) E EX NORMAL (n=7) 79
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) HPIE NEG (n=8) E EX NORMAL (n=5) 80
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS
POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) HPIE NEG (n=5) E EX NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE
POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 81
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE
PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) HPIE NEG (n=6) E EX
NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2
ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 82
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS
TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE
INGLEcircS DE CORRIDA 59
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGIANOS
OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS
DE I A IV 60
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS
CARTILAGENS ARITENOacuteIDES 60
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA
ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO
SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE
AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 61
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS
CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN
(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS
DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN
(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM
PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO
LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX E DOS
SUBGRUPOS HPIE POS HPIE NEG E EX NORMAL 76
RESUMO
A doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas (DIVA) e a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) satildeo comuns em cavalos de corrida resultando em interrupccedilatildeo no treinamento A hipoacutetese do presente estudo foi de que o ambiente e o exerciacutecio
causam estresse oxidativo produccedilatildeo do fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF) e inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas de potros PSI de corrida e que haacute uma relaccedilatildeo entre a DIVA e a HPIE Estudou-se potros PSI em ambiente natural (NC n=45) estabulados
por 30 dias (DA n=40) e treinados (EX n=34) Apoacutes os potros do grupo EX foram divididos em trecircs subgrupos HPIE pos (presenccedila de hemossideroacutefagos no lavado broncoalveolar - LBA) HPIE neg (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA) e EX
normal (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA e menos de 5 de neutroacutefilos e menos de 1 de eosinoacutefilos no LBA) Avaliou-se perfil citoloacutegico e paracircmetros do LBA relacionados a estresse oxidativo bioatividade de PAF atividade da catalase e
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar (MA) Os percentuais de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no LBA do grupo EX foram maiores (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 e 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectivamente) que os limites superiores para cavalos normais
(5 para neutroacutefilos e 1 para eosinoacutefilos) juntamente com um maior nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 ceacutelulasmicroL de LBA P=0017) evidenciaram a ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo pulmonar A bioatividade de PAF e a
concentraccedilatildeo de proteiacutenas no LBA foram maiores no grupo EX (relaccedilatildeo 340380 nm 0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg de proteiacutenasmL de LBA Plt0001) A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos no LBA foi maior
no grupo DA (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg de proteiacutenas Plt0001) e a atividade da catalase foi maior no grupo EX (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg de proteiacutenas P=0002) A fagocitose de MA (P=0006) bem como a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido (Plt0001) e peroacutexido de hidrogecircnio (P=0006) foram
significativamente menores no grupo EX Vinte e trecircs (622) potros do grupo EX foram HPIE pos e o LBA desse subgrupo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutenas (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) bioatividade de
PAF (relaccedilatildeo 340380 nm 0180 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 P=0042) e concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) significativamente maiores que o subgrupo HPIE neg A concentraccedilatildeo de nitritos
(008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) e a atividade de MA foi menor em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg O ambiente e o exerciacutecio modificaram o fluido broncoalveolar confirmando a hipoacutetese do presente estudo
Houve aumento da resposta de MA induzida pelo ambiente enquanto o exerciacutecio fiacutesico resultou em HPIE inflamaccedilatildeo pulmonar e diminuiccedilatildeo na resposta imune inata relacionada aos macroacutefagos alveolares nos potros PSI jovens durante o treinamento
para corrida e o PAF esteve presente nesse processo Sugere-se a conduccedilatildeo de novas investigaccedilotildees para elucidar os mecanismos inflamatoacuterios da HPIE bem como o papel do PAF neste processo como um potencial alvo terapecircutico
Palavras-chave cavalo fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria hemorragia pulmonar inflamaccedilatildeo pulmonar fluido broncoalveolar
ABSTRACT
Inflammatory airway disease (IAD) and exercise-induced pulmonary hemorrhage (EIPH) are common in racehorses during training being important ailments interrupting training of thoroughbred racehorses The present study hypothesis was
that stabling and exercise cause oxidative stress release of platelet-activating factor (PAF) and inflammation in airways of Thoroughbred colts and that there is an association between IAD and EIPH The subjects were colts in breeding farms (NC
n=45) stabled for 30 days (EC n=40) and race trained (EX n=34) Colts of the EX group were subdivided into three subgroups EIPH pos (presence of hemosiderophages in BALF) EIPH neg (absence of hemosiderophages in BALF)
and Normal EX (absence of hemosiderophages and less than 5 neutrophils and 1 eosinophils in BALF) Cytological profile and parameters of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) related to oxidative stress bioactivity of the pro-inflammatory
mediator PAF catalase activity and alveolar macrophage (AM) activity were studied Percentages of neutrophils and eosinophils in the BALF of the EX group were higher (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 and 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectively)
than the upper limits for normal horses (5 of neutrophils and 1 of eosinophils) that associated with a significantly higher total nucleated cell count (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 cellsmicroL of BALF P=0017) displayed pulmonary inflammation PAF
bioactivity and the total protein concentration in the BALF were higher in the EX group (0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 340380nm ratio P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg of proteinsmL of BALF Plt0001) Concentration of BALF hydroperoxides
was higher in the EC group (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg of proteins Plt0001) and catalase activity was higher in the EX group (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg of proteins P=0002) AM phagocytosis (P=0006) as well as production of superoxide anion (Plt0001) and hydrogen peroxide (P=0006) were
significantly lower in EX group Twenty three (622) colts of the EX group were EIPH pos and the BALF of this subgroup presented a significantly higher protein concentration (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg of proteinsmL of BALF P=0031) PAF
bioactivity (018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 340380 nm ratio P=0042) and lipid hydroperoxide concentration (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg of proteins P=0009) as well as lower nitrite concentration (008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007
absorbance 550 nm P=0049) and AM activity than EIPH neg subgroup Environment and exercise modified the bronchoalveolar fluid confirming the hypothesis of the present study Environment increased AM response as exercise resulted in EIPH
pulmonary inflammation and decreased innate immune response of alveolar macrophages in young Thoroughbred horses during race training and PAF participated in this event Further studies should be conducted to better understand
the inflammatory mechanisms of EIPH and the role of PAF in this process as a potential therapeutic target
Keywords horse platelet-activating factor pulmonary hemorrhage pulmonary
inflammation bronchoalveolar fluid
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
As doenccedilas respiratoacuterias satildeo comuns nos cavalos e as condiccedilotildees a que
estatildeo sujeitos fazem com que a inflamaccedilatildeo seja uma manifestaccedilatildeo frequumlente dessas
afecccedilotildees O epiteacutelio das vias aeacutereas superiores e dos pulmotildees estatildeo expostos a
patoacutegenos invasores e fatores ambientais Portanto o conhecimento dos
mecanismos da resposta inflamatoacuteria nas vias aeacutereas se faz importante a fim de se
estabelecer estrateacutegias para reduzir o impacto e os danos causados (THACKER
2006)
A inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apresenta um agravante o papel dos pulmotildees
na troca gasosa Assim as quatro principais consequumlecircncias de um processo
inflamatoacuterio desencadeado nas vias aeacutereas incluem vasodilataccedilatildeo e a reduccedilatildeo no
fluxo sanguiacuteneo resultando em capilares ingurgitados o aumento da permeabilidade
capilar permitindo a passagem de fluiacutedo e ceacutelulas para os tecidos o influxo e
acuacutemulo de fagoacutecitos e ceacutelulas ativadas no local e a bronconstricccedilatildeo (LUNN et al
2007)
O estudo das doenccedilas respiratoacuterias em cavalos eacute relevante particularmente
nos cavalos jovens de corrida onde a taxa de inflamaccedilatildeo detectada nas vias aeacutereas
eacute significativa (CHRISTLEY e RUSH 2007)
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA)
Os termos ldquodoenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereasrdquo (DIVA) e ldquodoenccedila
inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferioresrdquo (DIVAI) tecircm sido usados para descrever uma
siacutendrome inflamatoacuteria do trato respiratoacuterio de cavalos de corrida (CHRISTLEY e
RUSH 2007)
Tem-se relatado que a DIVA ocorre em 11 a 50 dos cavalos de corrida em
treinamento chegando a afetar ateacute 80 dos cavalos de corrida de dois anos de
idade (CHRISTLEY e RUSH 2007) MALIKIDES (2003) estudou a prevalecircncia da
DIVA em cavalos de corrida na Austraacutelia evidenciando que 41 deles apresentaram
inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apoacutes duas semanas de iniciarem treinamento
19
A DIVA eacute considerada a segunda afecccedilatildeo mais comum a interromper o
treinamento para corridas (WILSHER et al 2006) podendo resultar em prejuiacutezos a
troca gasosa e diminuiccedilatildeo da capacidade atleacutetica (COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005)
Cavalos com DIVA ou com hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) apresentaram uma maior hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE)
(CHRISTLEY et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
(FIGURA 1)
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE EIPH HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO IAD DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS UAO OBSTRUCcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS SUPERIORES FONTE SAacuteNCHEZ et al (2005)
Cavalos trotadores de corrida diagnosticados com DIVA tiveram a mecacircnica
pulmonar (volume corrente frequumlecircncia respiratoacuteria ventilaccedilatildeo pulmonar duraccedilatildeo da
inspiraccedilatildeo e da expiraccedilatildeo complacecircncia dinacircmica) alterada apresentaram um
significativo aumento da carga ventilatoacuteria e da energia requerida para a respiraccedilatildeo
sofrendo restriccedilotildees em seu rendimento atleacutetico (PIRRONE et al 2007)
Contudo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas dos cavalos atletas natildeo eacute entendida
por completo especialmente pela falta de consistecircncia e precisatildeo na definiccedilatildeo
dessa siacutendrome (CHRISTLEY e RUSH 2007)
Recentemente um painel de discussatildeo promovido pelo American College of
Veterinary Internal Medicine (ACVIM) definiu que a DIVA pode ocorrer em cavalos
de qualquer idade e eacute caracterizada pelo seguinte fenoacutetipo (COUEumlTIL et al 2007)
20
- Baixo rendimento desportivo intoleracircncia ao exerciacutecio
- Tosse com ou sem quantidade excessiva de muco traqueal
- Inflamaccedilatildeo natildeo seacuteptica detectada pela avaliaccedilatildeo citoloacutegica do fluido do LBA
ou disfunccedilatildeo pulmonar baseada em evidecircncia de obstruccedilatildeo de vias aeacutereas
inferiores hiperresponsividade das vias aeacutereas ou prejuiacutezo a troca gasosa durante o
repouso ou exerciacutecio
Este painel formado por experts e pesquisadores da aacuterea propocircs tambeacutem
alguns fatores de exclusatildeo para a DIVA
- Evidecircncia de sinais sistecircmicos de infecccedilatildeo (febre alteraccedilotildees hematoloacutegicas
compatiacuteveis com infecccedilatildeo)
- Aumento do esforccedilo respiratoacuterio durante o repouso
A etiopatogenia da DIVA eacute pouco definida Acredita-se que uma variedade de
fatores de risco estejam envolvidos variando nas diferentes populaccedilotildees de cavalos
baseado na alimentaccedilatildeo manejo praacuteticas preventivas distribuiccedilatildeo de agentes
infecciosos e influecircncias geneacuteticas (COUEumlTIL et al 2007)
Alguns autores encontraram uma reduccedilatildeo da incidecircncia desta afecccedilatildeo em
cavalos mais velhos (BURRELL et al 1996 CHAPMAN et al 2000 CHRISTLEY et
al 2001 WOOD et al 2005) sendo que a idade natildeo provocou diferenccedila no estudo
de McKANE et al (1993)
O ambiente da cocheira representa um risco adicional para a DIVA nos
cavalos (BURRELL et al 1996 HOLCOMBE et al2001 CLEMENTS e PIRIE
2007 BERNDT et al 2008) bem como para a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas das
pessoas envolvidas no trabalho com os cavalos (ELFMAN et al 2009)
HOLCOMBE et al (2001) associaram o manejo de estabulaccedilatildeo com a
ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas inferiores Estudaram 14 potros aacuterabes
que foram transferidos da pastagem para cocheiras com cama de palha Apoacutes 90
dias de estabulados houve um aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no
lavado broncoalveolar (LBA) Cavalos estabulados em cama de palha tambeacutem
apresentaram maior chance de apresentar DIVA em outros estudos (BURRELL et
al 1996 WOODS et al 1993)
No entanto em cavalos de montaria no estado norte-americano de Michigan
foi a permanecircncia em piquetes durante o inverno que esteve associado com
aumento do acuacutemulo de muco traqueal com maior nuacutemero de neutroacutefilos Neste
21
estudo a alimentaccedilatildeo com feno tambeacutem representou risco para a ocorrecircncia de
inflamaccedilatildeo (ROBINSON et al 2006)
Contudo o ambiente de cocheiras em modelos convencionais de manejo aos
quais os cavalos em treinamento estatildeo submetidos reconhecidamente apresenta
riscos para as vias aeacutereas Nestes haacute aumento nas concentraccedilotildees de partiacuteculas
inalaacuteveis contendo partiacuteculas orgacircnicas e inorgacircnicas incluindo endotoxinas β-D-
glucan partiacuteculas ultra finas (lt100 nm de diacircmetro) microorganismos esporos de
fungos material vegetal poeira inorgacircnica e gases toacutexicos (COUEumlTIL et al 2007)
Recentemente no estudo de BERNDT et al (2008) se demonstrou que o ambiente
de cocheira apresenta uma concentraccedilatildeo de endotoxinas 8 vezes maior que nos
piquetes
Aleacutem disso haacute muito jaacute foi descrita a presenccedila de actinomicetos termofiacutelicos
como a Micropolyspora faeni nos fenos fornecidos aos cavalos capazes de serem
inalados atingindo as vias aeacutereas inferiores (McPHERSON e THOMSON 1983)
Assim a praacutetica de encharcar o feno antes da administraccedilatildeo para diminuir a
quantidade de poeira disponiacutevel resultou em benefiacutecio agraves vias aeacutereas dos cavalos
(CLEMENTS e PIRIE 2007)
Por outro lado a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA ainda
natildeo estaacute bem esclarecida Cavalos com sinais cliacutenicos de inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas apresentaram maior frequecircncia de isolados bacterianos nos estudos de
CHRISTLEY et al (2001) e WOOD et al (2005) apesar de o painel do ACVIM
entender que a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA precisa ser
melhor estudada (COUEumlTIL et al 2007)
O exerciacutecio tambeacutem tem sido associado agrave inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas
inferiores dos cavalos atletas (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) A prevalecircncia da DIVA eacute maior em cavalos em treinamento
que em cavalos do mesmo grupo mas sem treinamento talvez pela inalaccedilatildeo de
maiores quantidades de partiacuteculas pela exposiccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores ao ar
frio ou pela ocorrecircncia da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (DAVIS et
al 2006 CHRISTLEY e RUSH 2007)
O diagnoacutestico da DIVA inclui a histoacuteria e o exame fiacutesico detalhados para a
identificaccedilatildeo de potenciais fatores etioloacutegicos A tosse durante o exerciacutecio ou
durante a alimentaccedilatildeo constitui a queixa mais comum (CHRISTLEY e RUSH 2007)
esteve associada agrave presenccedila de quantidades aumentadas de secreccedilatildeo traqueal bem
22
como a um maior percentual de neutroacutefilos tanto na secreccedilatildeo traqueal (CHRISTLEY
et al 2001) como no LBA (BENEDICE et al 2008) mas sua ausecircncia natildeo descarta
o diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
A presenccedila de descarga nasal mucopurulenta eacute achado comum em cavalos
de corrida de dois anos de idade sendo menos comum em cavalos mais velhos
Sua relaccedilatildeo com a DIVA todavia natildeo eacute sabida (COUEumlTIL et al 2007)
A auscultaccedilatildeo toraacutecica durante o repouso raramente evidencia alteraccedilotildees em
cavalos atletas com inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores (MAZAN e HOFFMAN
2003 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007) sendo necessaacuteria a
utilizaccedilatildeo de uma sacola para o cavalo respirar no seu interior ampliando o esforccedilo
respiratoacuterio (bdquorebreathing bagrsquo) podendo tornar audiacuteveis alguns sons anormais em
certos casos (MAZAN e HOFFMAN 2003 COUEumlTIL et al 2007)
MAZAN e HOFFMAN (2003) relataram que os testes de funccedilatildeo pulmonar
como o pneumotacoacutegrafo e o teste de broncoprovocaccedilatildeo com histamina podem
auxiliar tornando o diagnoacutestico da DIVA definitivo Contudo o diagnoacutestico precoce
da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores deve enfatizar a avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA
e natildeo os testes de funccedilatildeo pulmonar (COUEumlTIL et al 2007)
A avaliaccedilatildeo citoloacutegica do AT tambeacutem tem contribuido ao diagnoacutestico dos
processos inflamatoacuterios das vias aeacutereas contudo natildeo eacute considerado suficiente para
o diagnoacutestico da DIVA Isto se deve a falta de concordacircncia entre os achados
citoloacutegicos do AT e do LBA e da falta de estudos associando os achados no AT e o
rendimento atleacutetico (HODGSON e HODGSON 2003 HUGHES et al 2003
COUEumlTIL et al 2007) Ainda um cuidado a ser levado em conta quando da
realizaccedilatildeo de AT eacute o tempo da colheita jaacute que a realizaccedilatildeo de exerciacutecio
esteneuante pode aumentar o percentual de neutroacutefilos na amostra obtida
(MALIKIDES et al 2007)
O LBA por sua vez eacute o meacutetodo para a obtenccedilatildeo de amostras de ceacutelulas
presentes nas vias aeacutereas mais distais e espaccedilo alveolar (HOFFMAN 1999
FERNANDES et al 2000 LESSA et al 2005) considerado como uma bioacutepsia
liacutequida (MAZAN e HOFFMAN 2003) sendo a teacutecnica de avaliaccedilatildeo citoloacutegica
preferida para o diangoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
Um aumento no percentual de ceacutelulas inflamatoacuterias no fluido do LBA eacute um dos
principais criteacuterios diagnoacutesticos para a DIVA Usualmente ocorre uma predominacircncia
de neutroacutefilos mas tambeacutem pode ocorrer aumento nos nuacutemeros percentuais de
23
eosinoacutefilos linfoacutecitos e mastoacutecitos normalmente associados com diminuiccedilatildeo no
rendimento desportivo e hiperresponsividade das vias aeacutereas (McKANE et al 1993
HARE e VIEL 1998 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007)
O perfil citoloacutegico de LBA mais comumente encontrado em cavalos com DIVA
eacute caracterizado por aumento no nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (NTCN) com
discreta neutrofilia (gt5) linfocitose e monocitose Tambeacutem pode ser encontrado
um aumento do nuacutemero percentual de eosinoacutefilos (gt01) e mastoacutecitos (gt2)
(HOFFMAN 1999 COUEumlTIL et al 2007)
O painel de estudo da DIVA promovido pelo ACVIM apontou direccedilotildees para as
pesquisas nesta aacuterea e dentre elas o estudo das citocinas e mediadores
inflamatoacuterios envolvidos no processo (COUEumlTIL et al 2007)
Sabe-se que ocorre um incremento da imunidade inata nas vias aeacutereas dos
cavalos estabulados com o envolvimento de IL-6 (RIIHIMAumlKI et al 2008a) Em
cavalos trotadores de corrida em treinamento ocorre uma eosinofilia transitoacuteria no
fluido broncoalveolar e um aumento da expressatildeo de IL-4 e IL-5 contudo natildeo foi
encontrada correlaccedilatildeo entre estes eventos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Dentre os mediadores quiacutemicos participantes do processo inflamatoacuter io nas
vias aeacutereas o PAF (platelet-activating factor) estaacute especialmente implicado na asma
sepse e injuacuteria pulmonar aguda (THACKER 2006) presente tambeacutem na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas em cavalos mais velhos
(FAIRBAIRN et al 1996) Contudo a participaccedilatildeo do PAF no processo inflamatoacuterio
nas vias aeacutereas de cavalos atletas ainda natildeo eacute conhecida
13 PAF E VIAS AEacuteREAS
O fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocoline)
eacute um potente mediador proacute inflamatoacuterio envolvido na angiogecircnese aterosclerose
anafilaxia cicatrizaccedilatildeo inflamaccedilatildeo apoptose e endotoxemia (MARATHE et al
2001 STAFFORINI et al 2003 OWEN et al 2005) O PAF eacute produzido por
eosinoacutefilos macroacutefagos alveolares neutroacutefilos plaquetas e ceacutelulas endoteliais
(BAKER et al 2002 STAFFORINI et al 2003 GAUDREAULT et al 2005 SUMITA
et al 2005) a partir de uma subclasse especiacutefica de fosfatidilcolina que conteacutem um
eacuteter ao inveacutes de um eacutester ligado a posiccedilatildeo sn-1 do esqueleto de glicerol (FIGURA
24
2) A fosfatidilcolina eacute o mais abundante fosfolipiacutedio presente nas membranas
bioloacutegicas (MARATHE et al 2001 OWEN et al 2005)
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO sn-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL FONTE MARATHE et al (2001)
O PAF tambeacutem estaacute envolvido numa variedade de funccedilotildees pulmonares como
por exemplo no tocircnus vascular e das vias aeacutereas na frequumlecircncia de movimentaccedilatildeo
dos ciacutelios e na permeabilidade endotelial causando um aumento da secreccedilatildeo de
fluido traqueal broncoconstricccedilatildeo edema e hiperresponsividade das vias aeacutereas
resultando em prejuiacutezos a troca gasosa (CLAVIJO et al 2001 GABRIJELCIC et al
2003 ISHII et al 2004 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008)
Os efeitos do PAF sobre a circulaccedilatildeo pulmonar foram descritos por diversos
autores CHEN et al (1992) demonstraram um aumento das pressotildees arterial e
microvascular pulmonares e edema apoacutes a injeccedilatildeo de PAF SHIBAMOTO et al
(1993) estudaram os efeitos do PAF na circulaccedilatildeo venosa em pulmatildeo de catildeo onde
o PAF causou venoconstricccedilatildeo e aumento da pressatildeo capilar sem aumento da
permeabilidade vascular OHAR et al (1994) tambeacutem demonstraram
venoconstricccedilatildeo em estudo com pulmatildeo de coelhos mas demostraram que a
reduccedilatildeo da complacecircncia e aumento da resistecircncia vascular deveu-se a alteraccedilatildeo
estrutural vascular por perda de colaacutegeno intersticial induzida por PAF
Contudo o papel do PAF como causador de aumento da permeabilidade
vascular e edema pulmonar estaacute bem estudado devido a sua participaccedilatildeo na
fisiopatologia da anafilaxia da endotoxemia e da asma (EVANS et al 1987
25
CLAVIJO et al 2001 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008
MUEHLMANN et al 2009)
Em estudo preacutevio o extravasamento microvascular ocorrido apoacutes a infusatildeo de
PAF natildeo foi acompanhado de aumento da pressatildeo arterial pulmonar assim os
autores concluiacuteram que o edema pulmonar mediado por PAF resulta de aumento da
permeabilidade microvascular pulmonar (CLAVIJO et al 2001)
De fato demonstrou-se que o aumento da permeabilidade capilar induzida
por PAF ocorre pela formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular devido a
desorganizaccedilatildeo das proteiacutenas juncionais VE-caderina e ocludina (ZHANG et al
2003 JIANG et al 2008) mediada por receptores especiacuteficos (EVANS et al 1987)
e atraveacutes da ativaccedilatildeo da via do insositol trisphosphato e influxo de caacutelcio (GOumlGGEL
e UHLIG 2005) (FIGURA 3)
PLC phopholipase C IP3 inositol 145-trisphosphato IP3R receptor de IP3
MLCK myosin light chain kinase ML-7 5-iodonaphthalene-1sulphonyl-
homopiperazine L108 edelfosina Inibiccedilatildeo ativaccedilatildeo
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS NO LADO ESQUERDO OBSERVA-SE O EFEITO DO PAF EM CEacuteLULAS ENDOTELIAIS NO LADO DIREITO OBSERVA-SE OS EFEITOS DO PAF EM CEacuteLULAS DA MUSCULATURA LISA VASCULAR E DAS VIAS AEacuteREAS A QUAL Eacute ALTAMENTE MEDIADA POR TROMBOXANO NESTE A VIA PRINCIPAL Eacute ATRAVEacuteS DA ATIVACcedilAtildeO DE RHO E PROTEIacuteNAS KINASES ASSOCIADAS Agrave RHO QUE ATENUAM A ATIVIDADE DA MLCP (MYOSIN LIGHT CHAIN PHOPHATASE) COM CONSEQUumlENTE AUMENTO DA FOSFORILACcedilAtildeO DA CADEIA LEVE DA MIOSINA E PORTANTO A CONTRACcedilAtildeO FONTE GOumlGGEL e UHLIG (2005)
26
Adicionalmente os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) (BELLAN et al 1992) O
aumento da produccedilatildeo de NO induzida por PAF via ativaccedilatildeo de receptor de PAF foi
demonstrado em ceacutelulas do endoteacutelio vascular humano considerado como um efeito
cardioprotetor (KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Contudo particularmente
na microcirculaccedilatildeo o NO contra-ataca muitos dos efeitos bioloacutegicos do PAF inibindo
a vasoconstricccedilatildeo arteriolar e o aumento da permeabilidade vascular aleacutem de inibir
a adesatildeo de plaquetas e de leucoacutecitos ao endoteacutelio (BRKOVIC e SIROIS 2007
KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Mas os mecanismos pelos quais o NO
modula a permeabilidade microvascular ainda natildeo satildeo bem entendidos podendo ser
confusos e dependentes do estado das ceacutelulas endoteliais (RAMIREZ et al 2006)
A inibiccedilatildeo da NO sintase (NOS) em ceacutelulas endoteliais atenuou o aumento da
permeabilidade microvascular induzida por PAF no estudo de ZHU et al (2004) Por
outro lado estudando a participaccedilatildeo de NO e PAF em lesotildees de intestino delgado
de ratos KWASNIEWSKI et al (2008) evidenciaram que a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de
NO endoacutegeno aumentou bastante as lesotildees hemorraacutegicas e a taxa de mortalidade
demonstrando o papel proacute inflamatoacuterio do PAF e o efeito protetor do NO na
microcirculaccedilatildeo Tal relaccedilatildeo tambeacutem foi descrita por BRKOVIC e SIROIS (2007)
estudando o papel do PAF e do NO nos efeitos proacute inflamatoacuterios resultantes da
participaccedilatildeo de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e concluindo que eacute
o PAF que diretamente aumenta a permeabilidade vascular sendo o NO um cofator
A atuaccedilatildeo do PAF como mediador inflamatoacuterio eacute bastante importante na
asma onde aleacutem de provocar aumento da permeabilidade vascular tambeacutem induz
uma neutropenia transitoacuteria seguida de neutrofilia resultando no recrutamento de
neutroacutefilos para o pulmatildeo evidenciado atraveacutes de estudo citoloacutegico do lavado
broncoalveolar (LEE et al 2002 GABRIJELCIC et al 2003)
No estudo de AU et al (2001) a ativaccedilatildeo de neutroacutefilos resultou em ativaccedilatildeo
dos receptores de PAF aumento da fagocitose de neutroacutefilos e subsequumlente
liberaccedilatildeo de interleucina-8 (IL-8) causando mais quimiotaxia de neutroacutefilos
Adicionalmente demonstrou-se que haacute envolvimento de receptor 1 de leucotrieno B4
(LTB4) nas atividades de neutroacutefilos humanos mediadas por PAF (GAUDREAULT et
al 2005)
Em indiviacuteduos asmaacuteticos e com doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC)
o influxo de neutroacutefilos mediado por PAF nas vias aeacutereas foi modulado pelo aumento
27
de LTB4 provavelmente pelo estiacutemulo de PAF para a liberaccedilatildeo de LTB4 dos
macroacutefagos alveolares (SHINDO et al 1998 GABRIJELCIC et al 2003 FINNEY-
HAYWARD et al 2009)
Nas vias aeacutereas dos cavalos se demonstrou a participaccedilatildeo do PAF na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas (ORVA) levando a um
aumento do recrutamento de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo resultando em
prejuiacutezos agrave funccedilatildeo pulmonar (FAIRBAIRN et al 1996)
O PAF tendo como uma de suas origens o macroacutefago alveolar eacute capaz de
modificar o comportamento de neutroacutefilos sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da
adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a
ORVA (MARR et al 2002)
A participaccedilatildeo do PAF na asma humana e em outras espeacutecies foi evidenciada
pela sua capacidade em reproduzir mecanismos fisiopatoloacutegicos tais como a
broncoconstricccedilatildeo hiperresponsividade das vias aeacutereas aumento da
permeabilidade na microcirculaccedilatildeo pulmonar e aumento na secreccedilatildeo de muco (LOU
et al 1998 ISHII et al 2004 MUEHLMANN et al 2009)
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
Os desafios indutores de alteraccedilotildees na funcionalidade dos macroacutefagos
alveolares resultando em quimiotaxia de neutroacutefilos para as vias aeacutereas levam a um
quadro inflamatoacuterio pulmonar acompanhado de hipersecreccedilatildeo de muco Por sua vez
o muco presente nas vias aeacutereas possui uma seacuterie de funccedilotildees essenciais que
coletivamente levam a proteccedilatildeo das vias aeacutereas Juntamente com as ceacutelulas
epiteliais forma o sistema mucociliar que associado agrave tosse eacute essencial para
manter as vias aeacutereas desobstruiacutedas (ADLER 2005)
Por outro lado a produccedilatildeo excessiva de muco representa um fator importante
de morbidade e mortalidade nas doenccedilas das vias aeacutereas (THORNTON e
SHEEHAN 2004) Assim a resposta imunoloacutegica do epiteacutelio das vias aeacutereas frente
a infecccedilotildees virais e bacterianas e endotoxinas inaladas eacute caracterizada pela
liberaccedilatildeo de citocinas e pela produccedilatildeo de mucinas para prover proteccedilatildeo adicional
(HODGSON et al 2003 GERBER et al 2004 LORA et al 2005) Entretanto nos
quadros inflamatoacuterios os danos teciduais substanciais podem levar a produccedilatildeo
28
excessiva de muco e comprometimento da funccedilatildeo respiratoacuteria (LORA et al 2005
ROBINSON 2005)
O muco eacute uma mistura de aacutegua (~95) eletroacutelitos (~1) lipiacutedios (~1)
proteiacutenas (2-3) enzimas proteiacutenas seacutericas e mucinas (GERBER 2001) As
mucinas glicoproteiacutenas oligomeacutericas representam um constituinte importante do
muco sendo o gene responsaacutevel pela produccedilatildeo de mucinas o MUC5 (THORNTON
e SHEEHAN 2004)
Nas vias aeacutereas a produccedilatildeo de mucinas ocorre predominantemente pelas
ceacutelulas caliciformes do epiteacutelio e em menor parte nas glacircndulas da submucosa
(GERBER et al 2004 THORNTON e SHEEHAN 2004) A produccedilatildeo de
quantidades excessivas de muco pode representar a causa direta de obstruccedilatildeo
bronquial podendo amplificar o efeito de estreitamento luminal da broncoconstricccedilatildeo
e estar associada ao comprometimento da funccedilatildeo pulmonar tosse e capacidade
reduzida para a corrida em atletas humanos (HALLSTRAND et al 2007) e em
cavalos de corrida (CHRISTLEY et al 2001 HOLCOMBE et al 2006)
Assim a quantidade de muco secretado apresenta uma correlaccedilatildeo estreita
com a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas (GERBER et al 2004 ROBINSON et al 2003
HOLCOMBE et al 2006 ROBINSON 2005) De fato haacute uma evidente associaccedilatildeo
entre a hipersecreccedilatildeo de muco e presenccedila de quantidades aumentadas de
neutroacutefilos nas secreccedilotildees respiratoacuterias em seres humanos e em cavalos
(HODGSON et al 2003 ROBINSON et al 2003 ADLER 2005) Contagens de
neutroacutefilos no LBA menores que 30 ceacutelulasμL correspondem a pequenas
quantidades de muco nas vias aeacutereas e os acuacutemulos de secreccedilatildeo aumentam
quando as quantidades de neutroacutefilos estatildeo entre 30 e 100 ceacutelulasμL Entre 100 e
1000 ceacutelulasμL ocorre obstruccedilatildeo mensuraacutevel das vias aeacutereas Possivelmente esse
mecanismo pode estar relacionado com a secreccedilatildeo de proteiacutenas pelos neutroacutefilos
(ROBINSON et al 2003) De fato jaacute foi demonstrado que o neutroacutefilo secreta
elastase a qual estaacute associada com um aumento nas secreccedilotildees relacionadas com a
expressatildeo do gene MUC5 (SHAO e NADEL 2005) e metaplasia de ceacutelulas
caliciformes (VOYNOW et al 2004)
A expressatildeo anormal de neutroacutefilos e de moleacuteculas de adesatildeo em indiviacuteduos
com asma e doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC) foi demonstrada por
GABRIJELCIC et al (2003) Aleacutem do aumento no nuacutemero de neutroacutefilos tambeacutem
foram observados diferentes padrotildees de ativaccedilatildeo e niacuteveis aumentados de elastase
29
neutrofiacutelica e IL-8 Estes uacuteltimos bem como a expressatildeo do gene MUC5 estatildeo
associados a um aumento no estresse oxidativo pulmonar (DROST et al 2005
SHAO e NADEL 2005)
A associaccedilatildeo entre a severidade da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas e o estresse
oxidativo em cavalos com ORVA foi relatada por KIRSCHVINK et al (2008) os
quais relacionaram a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas ao aumento da glutationa oxidada
do aacutecido uacuterico e de isoprostano (8-iso-PGF2α) no LBA
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO
Estresse oxidativo eacute o termo utilizado para descrever os danos causados
quando as espeacutecies reativas do oxigecircnio (ROS) superam a capacidade de defesa
antioxidante do indiviacuteduo (WOOD et al 2003)
Entretanto tanto as ROS como as espeacutecies reativas do nitrogecircnio (RNS)
ocorrendo em concentraccedilotildees pequenas a moderadas apresentam importante papel
na fisiologia celular incluindo a defesa contra invasores e atuando em diversas vias
de sinalizaccedilatildeo celular e na induccedilatildeo da resposta mitogecircnica O estresse oxidativo
propriamente dito ocorre quando o sistema redox sofre desequiliacutebrio pela produccedilatildeo
aumentada de ROS eou RNS ou produccedilatildeo reduzida de antioxidantes (VALKO et al
2007)
Os pulmotildees encontram-se sujeitos ao estresse oxidativo pois estatildeo
diretamente expostos a quantidades muito elevadas de oxigecircnio o que torna
imperativo que este oacutergatildeo possua um arsenal para a defesa contra possiacuteveis
ataques oxidativos Portanto os pulmotildees satildeo providos de um desenvolvido sistema
de defesa endoacutegeno constituiacutedo de agentes chamados antioxidantes Os
antioxidantes ajudam os pulmotildees a se livrarem dos efeitos de uma variedade de
oxidantes provenientes do oxigecircnio (ROS) como o acircnion superoacutexido radical
hidroxila peroacutexido de hidrogecircnio e do nitrogecircnio (RNS) como o oacutexido niacutetrico (NO)
peroxinitrito e nitritos endoacutegenos e do ambiente Os principais sistemas
antioxidantes natildeo enzimaacuteticos dos pulmotildees satildeo a glutationa a vitamina C a
vitamina E o beta-caroteno e o aacutecido uacuterico enquanto os antioxidantes enzimaacuteticos
satildeo as superoacutexido dismutases a catalase e as peroxidases (RAHMAN et al 2006)
(FIGURA 4)
30
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE O2- AcircNION SUPEROacuteXIDO NO OacuteXIDO NIacuteTRICO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO ONOO- PEROXINITRITO FE2+ IacuteON FERROSO GPX GLUTATIONA PEROXIDASE FONTE RAHMAN et al (2006)
O estresse oxidativo pode resultar em muitos prejuiacutezos agraves funccedilotildees das vias
aeacutereas incluindo a contraccedilatildeo da musculatura lisa das vias aeacutereas a induccedilatildeo de
hiperresponsividade das vias aeacutereas a hipersecreccedilatildeo de muco danos ao epiteacutelio
respiratoacuterio e aumento da permeabilidade capilar (WOOD et al 2003)
A fisiopatologia da asma e da DPOC caracteriza-se por inflamaccedilatildeo crocircnica
localizada e estresse oxidativo O estresse oxidativo ocorre pelo aumento de
agentes oxidantes que satildeo inalados bem como por grandes quantidades de ROS
liberadas das ceacutelulas inflamatoacuterias Niacuteveis aumentados de ROS aumentam a
resposta inflamatoacuteria diretamente ou via formaccedilatildeo de produtos da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica levando a um aumento na severidade da doenccedila (KIRKHAM e RAHMAN
2006)
A peroxidaccedilatildeo dos lipiacutedios da membrana celular leva a geraccedilatildeo de
isoprostanos (FIGURA 5) um composto bioativo semelhante agraves prostaglandinas Os
isoprostanos satildeo produzidos independentemente das enzimas ciclooxigenases via
peroxidaccedilatildeo do aacutecido aracdocircnico catalizada por ROS apresentando potente efeito
31
constritor na musculatura lisa respiratoacuteria hiperresponsividade e exsudaccedilatildeo de
plasma nas vias aeacutereas (WOOD et al 2003)
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA ASMA IL INTERLEUCINA TH2 CEacuteLULAS T-HELPER TIPO 2 ROS ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO O2
- AcircNION SUPEROacuteXIDO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO NADPH NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO REDUZIDA NADP NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO SOD SUPEROacuteXIDO DISMUTASE EPO PEROXIDASE EOSINOFIacuteLICA MPO MIELOPEROXIDASE NF FATOR DE TRANSCRICcedilAtildeO NUCLEAR FONTE WOOD et al (2003)
O oacutexido niacutetrico (NO) sintetizado enzimaticamente pela oxidaccedilatildeo do
aminoaacutecido L-arginina para L-citrulina apresenta diversas funccedilotildees fisioloacutegicas nas
vias aeacutereas como o relaxamento da musculatura lisa a regulaccedilatildeo da responsividade
e da permeabilidade das vias aeacutereas e na defesa contra invasores Contudo em
altas concentraccedilotildees o NO apresenta diversos efeitos proacute inflamatoacuterios participando
da infiltraccedilatildeo de ceacutelulas inflamatoacuterias e apresentando efeitos citotoacutexicos sobre
32
diversas ceacutelulas tal como a ceacutelula do epiteacutelio respiratoacuterio especialmente por
interagir com o acircnion superoacutexido formando o peroxinitrito (REDINGTON 2006)
As ceacutelulas inflamatoacuterias recrutadas agraves vias aeacutereas do indiviacuteduo asmaacutetico
apresentam excepcional capacidade de produccedilatildeo de oxidantes Eosinoacutefilos
neutroacutefilos e macroacutefagos bem como ceacutelulas do epiteacutelio respiratoacuterio podem gerar
oxidantes Inicialmente ocorre a formaccedilatildeo de acircnion superoacutexido no complexo
dependente de NADPH oxidase na membrana celular no sistema xantina oxidase
citosoacutelico e na cadeia respiratoacuteria mitocondrial (FIGURA 6) (CARAMORI e PAPI
2004) A seguir a interaccedilatildeo do acircnion superoacutexido com outros oxidantes e o ataque
oxidativo ao tecido pulmonar leva agrave peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e danos ao tecido pulmonar
(MILLS e HIGGINS 1997 KIRKHAM e RAHMAN 2006)
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS FONTE CARAMORI E PAPI (2004)
O estudo do estresse oxidativo na asma se utiliza de modelos que podem
envolver os murinos (MUEHLMANN et al 2009) ou mesmo os cavalos jaacute que estes
naturalmente desenvolvem a ORVA doenccedila respiratoacuteria com diversas similaridades
com a asma humana (DEATON 2006)
33
Nos cavalos com ORVA os marcadores de estresse oxidativo estatildeo
aumentados e diretamente relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e infiltrado
inflamatoacuterio neutrofiacutelico (KIRSCHVINK et al 2008) ao aumento da produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por neutroacutefilos sanguiacuteneos apoacutes a exposiccedilatildeo agrave poeira orgacircnica
ambiental (MARR et al 1997) e ao aumento da secreccedilatildeo de muco apresentando
tambeacutem concentraccedilotildees reduzidas de aacutecido ascoacuterbico no fluido do epiteacutelio respiratoacuterio
(DEATON 2006)
O exerciacutecio fiacutesico por sua vez tambeacutem pode causar estresse oxidativo nas
vias aeacutereas em atletas humanos e em cavalos pela geraccedilatildeo de ROS e RNS (MILLS
e HIGGINS 1997 ART e LEKEUX 2005 KIRSCHVINK et al 2008)
Os cavalos de corrida apresentam a habilidade de aumentar o consumo de
oxigecircnio em 60 vezes durante o esforccedilo maacuteximo o que representa um fator de risco
ao estresse oxidativo nesses animais (ART e LEKEUX 2005)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica eacute o marcador de dano oxidativo poacutes exerciacutecio mais
estudado (DEATON e MARLIN 2003) Em atletas humanos houve aumento da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes a realizaccedilatildeo de ultramaratona (MASTALOUDIS et al
2004) mas o treinamento produziu efeitos beneacuteficos e reduccedilatildeo dos marcadores de
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes um periacuteodo de treinamento (MIYAZAKI et al 2001
BALOG et al 2006) Em cavalos o exerciacutecio submaacuteximo induziu um aumento nos
hidroperoacutexidos lipiacutedicos plasmaacuteticos dentro de 5 minutos apoacutes o teacutermino (DEATON e
MARLIN 2003)
As ROS e seus produtos como os peroacutexidos lipiacutedicos podem diretamente
danificar o tecido pulmonar e causar um incremento da pressatildeo vascular pulmonar
pela liberaccedilatildeo aumentada de mediadores inflamatoacuterios vasoconstrictores (pex
PAF) interferindo na atividade do NO como vasodilatador podendo assim contribuir
na patogecircnese da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) nos cavalos
atletas (MILLS e HIGGINS 1997)
34
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE)
A HPIE eacute caracterizada por hipertensatildeo pulmonar edema nas regiotildees de
troca gasosa ruptura dos capilares pulmonares e a presenccedila de sangue nas vias
aeacutereas (ERICKSON e POOLE 2007) sendo extremamente comum em cavalos de
corrida (PEREZ-MORENO et al 2009)
Tem-se relatado que a HPIE ocorre essencialmente em todos os cavalos
PSI de corrida em treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007) mas
tambeacutem constitui um problema em outras raccedilas de cavalos que realizam exerciacutecio
intenso como os trotadores e os quarto de milha e em cavalos realizando exerciacutecio
de menor intensidade como os cavalos de salto e traccedilatildeo (LAPOINTE et al 1994
ERICKSON e POOLE 2007 VICINO 2007)
O comprometimento ao rendimento desportivo causado pela HPIE natildeo havia
sido comprovado ateacute o estudo de HINCHCLIFF et al (2005a) quando demonstraram
que cavalos de corrida com HPIE grau 1 apresentaram 4 vezes mais possibilidades
de vencer em relaccedilatildeo a graduaccedilotildees mais elevadas de hemorragia
Cavalos PSI de corrida estatildeo sob maior risco de apresentar HPIE porque
apresentam pressatildeo capilar pulmonar mais elevada que cavalos de outras raccedilas e
atividades durante o esforccedilo maacuteximo (HACKETT et al 2003)
Adicionalmente a criaccedilatildeo seletiva de cavalos de corrida visando que sejam
cada vez mais capazes de atingir altas velocidades associado a consumo bastante
alto de oxigecircnio resultou em deacutebito cardiacuteaco substancial (WEST e MATHIEU-
COSTELLO 1994) e barreira alveacuteolo-capilar (BAC) bastante fina (WEST e
MATHIEU-COSTELLO 1999) A espessura meacutedia em micrometros do interstiacutecio da
BAC eacute 0175 plusmn 0010 em coelhos 0318 plusmn 0081 em catildees e 0390 plusmn 002 em
cavalos evidenciando que proporcionalmente a BAC dos cavalos eacute mais fina que a
de outras espeacutecies (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1999) Portanto haacute um dilema
envolvendo a evoluccedilatildeo da BAC dos cavalos Por um lado a necessidade de ser
extremamente fina para uma troca gasosa eficiente enquanto de outro a
necessidade de ser resistente o suficiente para suportar o estresse extremamente
alto na parede dos capilares pulmonares quando a pressatildeo capilar se eleva durante
o exerciacutecio (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
A pressatildeo hidrostaacutetica maacutexima nos capilares pulmonares humanos durante o
exerciacutecio supera 30 mmHg Nos cavalos PSI de corrida a pressatildeo capilar ultrapassa
35
100 mmHg aproximando-se da forccedila necessaacuteria para ocorrer a ruptura do colaacutegeno
que suporta a parede capilar na BAC (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
Quando o estresse na parede capilar se eleva demasiadamente ocorrem
alteraccedilotildees ultra-estruturais na BAC uma condiccedilatildeo conhecida como falecircncia por
estresse descrita em atletas de elite humanos e em cavalos (WEST 2000)
BIRKS et al (1997) demonstraram a falecircncia por estresse e consequumlente
ruptura dos capilares pulmonares em cavalos exercitando a altas velocidades
havendo maior risco de ocorrecircncia da HPIE quando encontraram-se sob importante
aumento da pressatildeo arterial pulmonar (FIGURA 7)
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) A ULTRAESTRUTURA CAPILAR NORMAL B RUPTURA DO ENDOTEacuteLIO CAPILAR (SETAS) COM ERITROacuteCITOS ADJACENTES (ASTERISCO) NOTA-SE TAMBEacuteM ERITROacuteCITOS NO ESPACcedilO ALVEOLAR (PONTAS DE SETAS) C ERITROacuteCITO NO INTERSTIacuteCIO (ASTERISCO) D RUPTURA DO EPITEacuteLIO ALVEOLAR (SETAS) A ALVEacuteOLO C CAPILAR BAR 2 microm FONTE BIRKS et al (1997)
36
Portanto a falecircncia por estresse dos capilares pulmonares eacute a teoria aceita
para a ocorrecircncia da HPIE sendo causada pela elevada pressatildeo transmural nos
capilares pulmonares resultado do aumento da pressatildeo arterial pulmonar somada agrave
pressatildeo pleural inspiratoacuteria negativa (WEST 2000) (FIGURA 8)
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) TTMP TENSAtildeO CIRCUNFERENCIAL OU EM ARCO CAUSADA PELA PRESSAtildeO TRANSMURAL CAPILAR TEL Eacute A TENSAtildeO LONGITUDINAL NOS COMPONENTES DA PAREDE ALVEOLAR ASSOCIADA COM A INFLACcedilAtildeO PULMONAR PARTE DESTA Eacute TRASMITIDA Agrave BAC TST Eacute A TENSAtildeO DE SUPERFIacuteCIE DA CAMADA SUPERFICIAL ALVEOLAR ESTA APARENTEMENTE EXERCE UMA FORCcedilA DE ACcedilAtildeO INTERNA PARA SUPORTAR O CAPILAR QUANDO ESTE INTUMESCE PARA DENTRO DO ESPACcedilO ALVEOLAR A ALTAS PRESSOtildeES TRANSMURAL CAPILARES PALV PRESSAtildeO ALVEOLAR PCAP PRESSAtildeO CAPILAR FONTE WEST (2000)
Diversos estudos estiveram envolvidos em avaliar a participaccedilatildeo do NO no
aumento da pressatildeo arterial pulmonar no cavalo durante o exerciacutecio e na
fisiopatologia da HPIE Inicialmente evidenciou-se que cavalos realizando exerciacutecio
intenso apresentam hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE) (CHRISTLEY
et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 DEMPSEY e WAGNER 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) o que resulta na inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO abolindo o
relaxamento vascular dependente do endoteacutelio (MILLS e HIGGINS 1997)
Portanto acreditou-se que a reduccedilatildeo da produccedilatildeo do NO durante o exerciacutecio
intenso poderia contribuir para a alta incidecircncia de HPIE nos cavalos de corrida
Contudo a administraccedilatildeo do antagonista da oacutexido niacutetrico sintase (NOS) N-nitro-L-
arginina metil ester (L-NAME) mostrou que o NO endoacutegeno resulta numa maior
37
extraccedilatildeo de O2 no repouso e no exerciacutecio submaacuteximo mas natildeo causou alteraccedilatildeo no
exerciacutecio intenso (MANOHAR e GOETZ 1998 MANOHAR et al 2006) A
administraccedilatildeo de L-NAME por KINDIG et al (2000) resultou em agravamento da
HPIE nos cinco animais estudados contudo natildeo observou-se aumento da pressatildeo
arterial pulmonar
MANOHAR e GOETZ (1999) avaliaram os efeitos da infusatildeo intravenosa de
nitroglicerina em cavalos realizando exerciacutecio e natildeo observaram alteraccedilotildees sobre a
incidecircncia ou severidade da HPIE
Adicionalmente KINDIG et al (2001) estudaram os efeitos do exerciacutecio na
pressatildeo arterial pulmonar e na HPIE em cavalos inalando NO Comparados aos
controles o grupo que inalou o NO apresentou uma pequena mas consistente
reduccedilatildeo na pressatildeo arterial pulmonar maacutexima mas com um significativo aumento da
HPIE nesses animais avaliado pelo aumento na contagem do nuacutemero de eritroacutecitos
no LBA Os autores entenderam que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete em
parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou como agravou a HPIE
Portanto em face aos achados relacionados agrave participaccedilatildeo do NO e da NOS
no cavalo em exerciacutecio maacuteximo e na HPIE satildeo necessaacuterias outras investigaccedilotildees a
respeito dos efeitos da inibiccedilatildeo da NOS e da produccedilatildeo do NO na circulaccedilatildeo
pulmonar e na HPIE (KINDIG et al 2000)
Apesar da maior atenccedilatildeo aos efeitos da HPIE e da pressatildeo arterial pulmonar
em cavalos realizando exerciacutecios intensos a HPIE tambeacutem passou a ser
demonstrada em cavalos envolvidos em atividades de menor intensidade sugerindo
que outros mecanismos podem estar envolvidos na fisiopatologia (EPP et al 2006)
VICINO (2007) demonstrou a ocorrecircncia de HPIE em cavalos de salto sendo
que cavalos que participaram de provas na altura entre 130 m ndash 150 m
apresentaram maior incidecircncia que aqueles que saltaram provas entre 100 m ndash 120
m
Neste contexto a associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar jaacute foi
demonstrada anteriormente (McKANE et al 1993 SAacuteNCHEZ et al 2005) Em
concordacircncia o estudo epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) evidenciou
38
uma significativa associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos puro
sangue inglecircs (PSI) jovens durante treinamento para corrida
O processo de hemorragia pulmonar pode culminar em irritaccedilatildeo e inflamaccedilatildeo
das vias aeacutereas o que exacerbaria a doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
(ERICKSON e POOLE 2007) WEST e MATHIEU-COSTELLO (1999) sugerem que
alteraccedilotildees na BAC ativariam vias proacute inflamatoacuterias nas vias aeacutereas com a
participaccedilatildeo de LTB4 Possivelmente a membrana basal alveolar exposta apoacutes a
ruptura ativaria macroacutefagos alveolares sendo que estes satildeo ricos em LTB4
DERKSEN et al (2009) sugeriram uma hipoacutetese para a ocorrecircncia da HPIE
(FIGURA 9) onde a ocorrecircncia das altas pressotildees vasculares pulmonares levaria a
alteraccedilotildees venulares culminando na ruptura capilar sangramento inflamaccedilatildeo e
hemossiderose agravando o quadro da HPIE
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO DERSKEN et al (2009)
Contudo mediadores bem como os mecanismos inflamatoacuterios que estatildeo
envolvidos na fisiopatologia da HPIE ainda precisam ser esclarecidos
O diagnoacutestico da HPIE pode ser feito pela evidecircncia de sangue na traqueacuteia
visiacutevel atraveacutes de exame endoscoacutepico (HINCHCLIFF et al 2005b ERICKSON e
POOLE 2007) pela contagem de eritroacutecitos no LBA (MEYER et al 1998) ou pela
39
presenccedila de hemossideroacutefagos (macroacutefagos contendo hemossiderina ou eritroacutecitos)
no AT (EPPINGER 1990 MICHELOTTO JUacuteNIOR et al 2007) eou no LBA
(DOUCET e VIEL 2002 SAacuteNCHEZ et al 2005 BIAVA et al 2006) realizado uma
hora apoacutes o exerciacutecio A presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA eacute considerada a
forma mais sensiacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993)
Em resumo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas acompanhada de
hiperresponsividade e hipersecreccedilatildeo de muco denominada doenccedila inflamatoacuteria das
vias aeacutereas (DIVA) bem como a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) satildeo causas de enormes perdas econocircmicas e de queda de rendimento
desportivo interrupccedilatildeo nos treinamentos e de encerramento de campanha em
cavalos de corrida Apesar disso a maioria dos estudos sobre as doenccedilas
inflamatoacuterias das vias aeacutereas dos cavalos satildeo direcionados para a ORVA e a
fisiopatologia da DIVA ainda estaacute pouco esclarecida bem como os mecanismos
inflamatoacuterios da HPIE ainda precisam ser mais bem estudados
Tendo-se em vista estes aspectos a hipoacutetese levantada no presente estudo
foi de que o desafio ambiental e o exerciacutecio fiacutesico estejam acompanhados de
estresse oxidativo alterando o quadro inflamatoacuterio possivelmente por alterar a
produccedilatildeo de PAF no pulmatildeo com consequumlente alteraccedilatildeo da funcionalidade celular
e que a hemorragia pulmonar pode exercer influecircncia sobre essa situaccedilatildeo As
ceacutelulas estudadas foram os macroacutefagos alveolares os quais podem apresentar um
papel central na regulaccedilatildeo deste processo
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVOS GERAIS
Verificar alteraccedilotildees em paracircmetros cliacutenicos e inflamatoacuterios pulmonares em
cavalos puro sangue inglecircs (PSI) de corrida jovem submetidos ao desafio ambiental
e ao treinamento fiacutesico
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Avaliar os seguintes paracircmetros cliacutenicos e laboratoriais
- Avaliaccedilatildeo cliacutenica
- Avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas
- Avaliaccedilatildeo citoloacutegica das vias aeacutereas atraveacutes das teacutecnicas de aspirado
traqueal (AT) e de lavado broncoalveolar (LBA)
- Avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas
e a produccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos e nitritos no LBA
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por macroacutefagos alveolares
bem como a capacidade fagocitaacuteria e de adesatildeo
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por neutroacutefilos do sangue
perifeacuterico bem como a capacidade fagocitaacuteria
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 REAGENTES E SEDATIVOS
O BN52021 (Gingkolide B) foi obtido da Biomol (Plymouth Meeting PA USA)
Fura-2 AM (cat num F-0888) PAF (β-Acetyl-γ-O-hexadecyl-L-α-
phosphatidylcholine P-4904) foram obtidos da Sigma (St Louis MO USA) A
coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacuteticoreg) foi obtida da Laborclin (Pinhais PR Brasil) e
a acepromazina da Univet (Satildeo Paulo SP Brasil) A xylazina e o butorphanol foram
obtidos do laboratoacuterio Fort Dodge (Satildeo Paulo SP Brasil) Todos os demais
reagentes foram comprados da Sigma (St Louis MO USA)
32 ANIMAIS
Foram utilizados equinos machos adultos jovens (potros) da raccedila puro sangue
inglecircs (PSI) de cinco diferentes criatoacuterios (haras) da regiatildeo metropolitana de Curitiba
estado do Paranaacute (Haras Cifra e Haras dos Girassoacuteis em Piraquara Haras
Palmerini e Haras Belmont em Satildeo Joseacute dos Pinhais e Haras Santa Rita da Serra
em Tijucas do Sul e potros de quatro diferentes cocheiras no Jockey Club do
Paranaacute (Av Viacutector Ferreira do Amaral 2291 Tarumatilde Curitiba PR)
Inicialmente os potros foram divididos em trecircs grupos O primeiro grupo foi
denominado grupo condiccedilotildees naturais (CN n=45) compreendendo os potros dos
haras vivendo soltos em piquetes dia e noite alimentando-se de gramiacuteneas e
leguminosas da pastagem mais complemento peletizado fornecido no campo A
meacutedia de idade dos animais deste grupo foi de 145 plusmn 04 meses O segundo grupo
foi denominado grupo desafio ambiental (DA n=45) constituiacutedo por potros
estabulados por 30 dias com o propoacutesito de preparaacute-los para o iniacutecio de treinamento
Estes animais eram mantidos em grupos de 15 a 20 potros sendo que permaneciam
em baias individuais com dimensotildees de 35m x 35m x 35m em meacutedia em cama de
serragem e alimentados duas vezes ao dia com aveia mais raccedilatildeo peletizada e feno
de gramiacutenea e de alfafa A meacutedia de idade dos potros do grupo DA foi de 217 plusmn 29
meses O terceiro grupo foi denominado de grupo exerciacutecio (EX n=34) onde foram
incluiacutedos potros ineacuteditos (satildeo considerados ineacuteditos animais que ainda natildeo correram
42
em hipoacutedromos oficiais) mas que estavam em treinamento para corrida haacute
aproximadamente cinco meses e mantidos nas mesmas condiccedilotildees de estabulaccedilatildeo e
alimentaccedilatildeo que os potros do grupo DA Estes animais foram acompanhados
durante o periacuteodo de treinamento sendo que a avaliaccedilatildeo cliacutenica endoscoacutepica e a
colheita de LBA ocorreu 24 horas apoacutes seu primeiro exerciacutecio intenso (15 ms ndash 16
ms) em 800m ndash 1000m de distacircncia na pista de areia do Jockey Club do Paranaacute A
meacutedia de idade dos potros do grupo EX foi de 270 plusmn 03 meses
A obtenccedilatildeo de dados para o presente trabalho de pesquisa ocorreu durante
uma sequumlecircncia de experimentos independentes durante um periacuteodo de 18 meses
Durante este periacuteodo grupos de potros foram acompanhados ateacute se encontrarem
nas condiccedilotildees estabelecidas para cada grupo quando entatildeo foram avaliados As
amostras do grupo CN foram obtidas de oito diferentes experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois durante o inverno trecircs durante a primavera e um no outono
As amostras do grupo DA foram provenientes de seis experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois no inverno e dois no outono e para o grupo EX os resultados
advieram de amostras obtidas durante o veratildeo em cinco ocasiotildees e durante a
primavera em quatro totalizando nove experimentos independentes para este grupo
Os resultados apresentados para cada uma das anaacutelises provecircm de pelo menos
trecircs experimentos independentes
Todos os animais estudados eram pertencentes a estabelecimentos com
programa de desverminaccedilatildeo bimensal bem como foram todos vacinados
regularmente contra Influenza Equina e Herpes Viacuterus Equino tipos 1 e 4 A
alimentaccedilatildeo utilizada nos estabelecimentos que cederam os potros para o estudo
era similar bem como a anaacutelise da alimentaccedilatildeo utilizada para os potros dos trecircs
grupos natildeo diferiu no que se refere a constituintes essenciais que poderiam
influenciar nas avaliaccedilotildees realizadas no presente trabalho Os criteacuterios de inclusatildeo
para os potros dos trecircs grupos foram os estabelecidos e jaacute descritos previamente
nas caracteriacutesticas de cada grupo e a exclusatildeo do estudo ocorreu quando da
histoacuteria de doenccedila recente ou diferenccedilas em manejo
As comparaccedilotildees intergrupos foram feitas entre os grupos CN e DA (diferenccedila
ambiental) e entre os grupos DA e EX (diferenccedila no regime de exerciacutecio)
Na segunda etapa do trabalho dedicada ao estudo da hemorragia pulmonar
induzida pelo exerciacutecio (HPIE) avaliou-se somente os potros do grupo EX agora
com n=37 Este grupo foi dividido em subgrupos sendo o subgrupo HPIE pos (n=23
43
constituiacutedo por potros com qualquer percentual de hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo
citoloacutegica do LBA) e subgrupo HPIE neg (n=14 constituiacutedo por potros sem
hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA) Nesta etapa as comparaccedilotildees
realizadas foram entre os subgrupos HPIE pos e HPIE neg
33 ASPECTOS EacuteTICOS
Este trabalho de pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Experimentaccedilatildeo Animal (CEEA) do setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR sob o
nuacutemero de registro 168 e pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso de Animais (CEUA) da
Pontifiacutecia Universidade Catoacutelica do Paranaacute sob o nuacutemero de registro 129 e estaacute de
acordo com o Guiding Principles in the Care and Use of Animals
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA
Preacutevio agrave colheita de material procedeu-se a avaliaccedilatildeo cliacutenica de cada potro
iniciada pela histoacuteria incluindo possiacuteveis ocorrecircncias meacutedicas relevantes agrave sauacutede do
sistema respiratoacuterio manejo alimentaccedilatildeo desverminaccedilatildeo e vacinaccedilatildeo Na histoacuteria
incluiu-se tambeacutem a informaccedilatildeo sobre a ocorrecircncia de tosse espontacircnea quando em
piquetes na baia no momento da alimentaccedilatildeo ou durante o treinamento O exame
fiacutesico incluiu a observaccedilatildeo da presenccedila de secreccedilatildeo nasal estiacutemulo da tosse
palpaccedilatildeo de linfonodos submandibulares e retrofaringeanos auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e
auscultaccedilatildeo traqueal e pulmonar (McGORUM e DIXON 2007)
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS
A avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas foi realizada previamente a
realizaccedilatildeo do LBA com o animal tranquumlilizado atraveacutes da administraccedilatildeo de
acepromazina (acepran 1 Univet) (003 mgkg IM) e apoacutes 30 minutos seguindo-
se a administraccedilatildeo de xilazina (sedazine Fort Dodge) (03-05 mgkg IV) mais
butorfanol (torbugesic Fort Dodge) (005 mgkg IV) (HOFFMAN 1999 HEWSON e
VIEL 2002) Utilizou-se um fibroscoacutepio flexiacutevel Pentax de 170 cm de comprimento e
128 mm de diacircmetro para a avaliaccedilatildeo das vias aeacutereas superiores e inferiores ateacute a
bifurcaccedilatildeo da traqueacuteia
44
A presenccedila de foliacuteculos linfoacuteides na faringe foi graduada segundo RAKER e
BOWLES (1978) adotando-se a graduaccedilatildeo de I a IV (QUADRO 1) e graus III e IV
foram considerados como faringite
A movimentaccedilatildeo das cartilagens aritenoacuteides foi graduada de I a IV segundo
RACKESTRAW et al (1991) (QUADRO 2) e graus III e IV foram considerados como
anormais
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Faringe com poucos foliacuteculos claros na parede dorsal
Grau II Presenccedila de numerosos pequenos foliacuteculos juntamente a
hiperemia cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau III Presenccedila de grandes grupos de foliacuteculos hiperecircmicos
cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau IV Presenccedila de foliacuteculos grandes edematosos e hiperecircmicos
por toda a mucosa faringeana
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA FARINGE FONTE RAKER E BOWLES (1978)
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Movimentaccedilatildeo sincrocircnica e abduccedilatildeo completa das
cartilagens aritenoacuteides
Grau II Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo com abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) conseguida com a degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
Grau III Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo e a abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) natildeo eacute conseguida na degluticcedilatildeo nem na
oclusatildeo nasal
Grau IV
(Hemiplegia
Laringeana)
Cartilagem aritenoacuteide esquerda posicionada
medialmente na glote e natildeo apresenta movimento
quando da degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE I A IV FONTE RACKESTRAW et al (1991)
45
Especial interesse foi dado agrave presenccedila de muco no lume traqueal e sua
quantificaccedilatildeo atraveacutes de graduaccedilatildeo de 0 a 5 conforme GERBER et al (2004)
(FIGURA 10)
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME ENDOSCOacutePICO FONTE GERBER et al 2004
Quando da observaccedilatildeo de muco traqueal este foi aspirado atraveacutes de tubo
de silicone introduzido pelo canal de trabalho do endoscoacutepio sendo imediatamente
transferido para uma lacircmina de microscopia e deixado para secar ao ar As lacircminas
foram coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico Laborclin Pinhais PR
Brasil) e 500 ceacutelulas foram contadas em aumento de 1000X (HODGSON e
HODGSON 2003)
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o aspirado traqueal (AT)
contendo lt10 de linfoacutecitos lt1 de eosinoacutefilos e lt20 de neutroacutefilos (ROBINSON
2003 HODGSON e HODGSON 2007)
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)
Para a realizaccedilatildeo do LBA foi utilizado um cateter flexiacutevel de silicone
especiacutefico para a obtenccedilatildeo de LBA de equinos marca Cook (V-PBAL-300 Cook Vet
Products Hamburg Alemanha) de 300 cm de comprimento e 8 mm de diacircmetro
Este foi introduzido agraves cegas via nasotraqueal preferencialmente do lado direito ateacute
se alojar em um brocircnquio quando o cuff na extremidade distal era inflado com 5-10
mL de ar Utilizou-se 300 mL de soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada (PBS) esteacuteril e
com heparina soacutedica (5 UImL de PBS) preacute-aquecidos a 37oC (HOFFMAN 1999
PICKLES et al 2002abc MORI et al 2003 RIIHIMAumlKI et al 2008b) O PBS era
infundido em aliacutequotas de 120 mL (HEWSON e VIEL 2002) aspirando-se
46
gentilmente apoacutes cada aliacutequota e dispensando-se o LBA recolhido em frascos
plaacutesticos esteacutereis mantidos em isopor com gelo Este procedimento foi repetido ateacute
que o volume de 300 mL era totalmente empregado O material recolhido foi mantido
refrigerado em isopor com gelo ateacute a chegada ao Laboratoacuterio de Metabolismo
Celular no Departamento de Fisiologia do Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR
para o processamento em menos de 3 horas apoacutes a colheita (PICKLES et al 2002c
VIEL e HEWSON 2003)
No laboratoacuterio o LBA era centrifugado a 340g (1300 rpm) por seis minutos a
40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA) e o pellet obtido foi
ressuspendido em 2 mL de PBS para a contagem do nuacutemero total de ceacutelulas
nucleadas (NTCN)
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA
A contagem do NTCN foi realizada usando-se a cacircmara de Neubauer Uma
aliacutequota da suspensatildeo de ceacutelulas foi diluiacuteda 110 em PBS em um frasco de
centrifugaccedilatildeo de 15 mL de fundo cocircnico (Eppendorf) Desta uma aliacutequota de 50 microL
foi misturada a 50 microL do corante vital Azul de Tripan para a contagem das ceacutelulas
vivas A partir do nuacutemero de ceacutelulas vivas por mililitro da suspensatildeo de ceacutelulas a
concentraccedilatildeo da suspensatildeo de ceacutelulas foi ajustada para 5 x 106 ceacutelulasmL para as
avaliaccedilotildees da atividade de macroacutefago alveolar (fagocitose produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e adesatildeo ndash ver toacutepicos 315 316
317 e 318)
Para a avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA lacircminas para microscopia
foram preparadas a partir de 10 μL da suspensatildeo de ceacutelulas distribuiacutedos de forma
circular sobre a lacircmina secadas ao ar e coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski
(Panoacutetico Laborclin Pinhais PR Brasil) (HEWSON e VIEL 2002) e 500 ceacutelulas
foram contadas em aumento de 1000X
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o LBA contendo em meacutedia
60 de macroacutefagos 35 de linfoacutecitos lt5 de neutroacutefilos lt2 de mastoacutecitos lt1
de eosinoacutefilos (ROBINSON 2003 MAZAN e HOFFMAN 2003 RICHARD et al
2009)
47
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957)
Uma porccedilatildeo correspondente a 90 mg de pellet de ceacutelulas do LBA foi
ressuspendido em um solvente extrator (metanolclorofoacutermio12 volvol) na
quantidade de 18 mL e sonicado (6 ciclos de 4 segundos) Os tubos foram
deixados em gelo por 20 minutos
Na etapa seguinte mais metanol foi adicionado (324 microL o caacutelculo eacute a
quantidade de sovente extrator x 0180 resultando na quantidade de metanol em
mililitros) para reduzir a densidade do liacutequido e possibilitar assim a decantaccedilatildeo do
material particulado insoluacutevel no meio Apoacutes o material foi centrifugado a 5000g por
10 minutos a 40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
O sobrenadante foi transferido para tubos de vidro e clorofoacutermio foi
adicionado (648 microL ou seja o dobro da quantidade de metanol utilizada
anteriormente)
Na sequumlecircncia o extrato foi lavado uma vez com 19 mL de aacutegua ultra pura O
sistema bifaacutesico formado foi submetido a uma intensa agitaccedilatildeo ateacute natildeo serem mais
distinguiacuteveis as duas fases (forma-se momentaneamente uma emulsatildeo) Nesta
etapa substacircncias com maior afinidade agrave aacutegua do que ao solvente orgacircnico satildeo
solubilizadas no meio aquoso e portanto se separam dos lipiacutedios
Apoacutes a reconstituiccedilatildeo espontacircnea do sistema bifaacutesico o sobrenadante
(aquoso) foi removido com o auxiacutelio de uma micropipeta cuidando-se para natildeo
retirar o que se encontrava abaixo
Em seguida foi adicionado o FSP (CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM NaCl 497
mM clorofoacutermio 30 metanol 490 aacutegua ultra pura 480) lentamente (para
evitar a formaccedilatildeo de emulsatildeo) e de maneira que as paredes do tubo fossem lavadas
com esta soluccedilatildeo Apoacutes a remoccedilatildeo do sobrenadante este procedimento foi repetido
mais duas vezes
A mistura de clorofoacutermio e metanol na qual estavam dissolvidos os lipiacutedios
foi evaporada em banho-maria a 370C sob corrente de nitrogecircnio O extrato lipiacutedico
seco foi armazenado a -800C em atmosfera de nitrogecircnio Para a determinaccedilatildeo da
bioatividade de PAF (toacutepico 310) esses extratos foram solubilizados em 100 microL de
DMSO sob agitaccedilatildeo intensa
48
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS
O sangue de cavalo foi colhido em bolsas de transfusatildeo (CPDA-1 JP
Induacutestria Farmacecircutica SA Satildeo Paulo Brasil) atraveacutes de punccedilatildeo venosa jugular
O sangue foi diluiacutedo 11 (vv) em PBS e 40 mL do sangue diluiacutedo foram
adicionados a tubos para centriacutefuga esteacutereis (tubos Falcon de 50 mL) sobre 8 mL de
Ficoll Paque Plus e centrifugado (400g por 40 minutos a 40C) para o isolamento das
ceacutelulas PMN por gradiente
Apoacutes a centrifugaccedilatildeo a camada superior composta por plasma soluccedilatildeo de
Ficoll e ceacutelulas mononucleares foi descartada A camada inferior composta
principalmente por PMNs e eritroacutecitos foi dividida em duas aliacutequotas iguais as quais
foram separadas em dois tubos para centriacutefuga A cada aliacutequota foi adicionada
soluccedilatildeo hemoliacutetica (NH4Cl 077 tris[hydroxymethyl]aminomethane 021 pH 74
soluccedilatildeo aquosa) para completar 50 mL e incubadas por 20 minutos a 370C em
estufa
A seguir a suspensatildeo celular livre dos eritroacutecitos foi centrifugada (400g 6
min 4oC) O sobrenadante foi descartado e o pellet de ceacutelulas (basicamente PMNs)
foi ressuspendido em 5 mL de PBS contendo glucose 5 mM A densidade de ceacutelulas
foi determinada em cacircmara de Neubauer e ajustada para 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL
A viabilidade celular foi determinada atraveacutes do corante vital Azul de Tripan e
resultou aproximadamente 95 A percentagem de neutroacutefilos na suspensatildeo de
PMNs foi superior a 90 determinada pela coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico
Laborclin Pinhais PR Brasil)
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE Ca++ EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE et al 2001)
Agrave suspensatildeo de PMNs (toacutepico 39) na densidade de 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL foi adicionado FURA-2 AM (Sigma soluccedilatildeo estoque 1 nM em DMSO)
para concentraccedilatildeo final de 1 microM A suspensatildeo foi incubada em ambiente escuro a
37oC por 45 minutos
Nesta etapa os PMNs incorporaram o FURA-2 AM um indicador fluorescente
de caacutelcio Quando o FURA-2 AM estaacute ligado ao Ca++ haacute reduccedilatildeo da eficiecircncia de
49
excitaccedilatildeo a 380 nm e aumento da eficiecircncia de excitaccedilatildeo a 340 nm observados no
comprimento de onda de emissatildeo de 510 nm Com isso eacute possiacutevel quantificar a
concentraccedilatildeo de Ca++ intracelular nas ceacutelulas carregadas com FURA-2 AM atraveacutes
da relaccedilatildeo da intensidade de emissatildeo a 510 nm entre os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo de 340 nm e de 380 nm (relaccedilatildeo 340380 nm)
Apoacutes a incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram lavadas duas vezes com soluccedilatildeo de
Ringer (NaCl 1425 mM KCl 40 mM CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM 50 mM 4-(2-
hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid glicose 50 mM pH 74 soluccedilatildeo
aquosa) para a remoccedilatildeo do FURA-2 AM que natildeo foi incorporado agraves ceacutelulas
As ceacutelulas entatildeo foram ressuspendidas em soluccedilatildeo de Ringer para uma
concentraccedilatildeo final de 225 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL Esta foi a preparaccedilatildeo utilizada
na leitura de fluorescecircncia
A suspensatildeo de ceacutelulas foi mantida em gelo ateacute a sua utilizaccedilatildeo Aliacutequotas de
2 mL eram previamente incubadas em banho-maria por 4 minutos a 37oC no escuro
(tubo envolto em papel alumiacutenio) previamente a serem transferidas para uma cubeta
para a leitura da fluorescecircncia em espectrofluoriacutemetro acoplado a um
microcomputador (RF5301PC Shimadzu Kyoto Japatildeo) controlado pelo software
Super Ion Probe (Shimadzu Kyoto Japatildeo) Durante esta incubaccedilatildeo as ceacutelulas que
seriam utilizadas como controle negativo para PAF foram tratadas com antagonista
de receptor de PAF BN52021 (Biomol soluccedilatildeo 10 mM em DMSO)
Foi utilizada excitaccedilatildeo dual com comprimentos de onda 340 nm e 380 nm
(janela de leitura de 2 segundos) com emissatildeo registrada a 510 nm A temperatura
foi mantida em 37oC pelo sistema termostatisado do aparelho A leitura da
fluorescecircncia consistiu primeiramente da obtenccedilatildeo de uma linha de base nos
primeiros 50 segundos Apoacutes esta leitura inicial foram adicionados 10 microL do extrato
lipiacutedico (toacutepico 38) agrave suspensatildeo de ceacutelulas seguindo-se a agitaccedilatildeo (por 3
segundos) com uma barra magneacutetica presente dentro da cubeta A leitura foi feita
entatildeo por mais 100 segundos
Para cada amostra foram realizados os procedimentos descritos na presenccedila
e na ausecircncia de BN52021 A resposta maacutexima obtida pelo tratamento da
suspensatildeo de PMNs com extrato lipiacutedico na presenccedila de BN52021 foi subtraiacuteda da
resposta maacutexima obtida na ausecircncia deste antagonista O resultado desta subtraccedilatildeo
foi utilizado como indicador semiquantitativo da bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico e os resultados foram expressos como relaccedilatildeo 340380 nm
50
Antes de analisar as amostras de extrato lipiacutedico para a bioatividade de PAF
a cada experimento a suspensatildeo de PMNs tratada com FURA-2 AM foi testada com
PAF (1-0-palmitil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina soluccedilatildeo estoque de 3 mM em
DMSO da Sigma) nas concentraccedilotildees de 1 10 e 100 nM e com 100 nM na presenccedila
de 150 microM de BN52021 (concentraccedilatildeo suficiente para antagonizar 102 nM de PAF)
A resposta dos PMNs de equinos aos padrotildees de PAF eacute mostrada na FIGURA 11
sendo representativa dos dados obtidos em todos os experimentos
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO REGISTRADA A 510 nm () SUSPENSAtildeO DE PMN () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 1 nM (diams) SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 10 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 100 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + BN52021 150 microM + PAF 100 nM A EMISSAtildeO BASAL DAS CEacuteLULAS PMN FOI REGISTRADA POR 50 SEGUNDOS PREVIAMENTE Agrave ADICcedilAtildeO DE PAF
Os PMNs do sangue de equinos foram utilizados no presente estudo como
uma ferramenta para a avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF (pelo influxo de Ca++ nos
PMNs induzido por PAF) Para a determinaccedilatildeo da viabilidade desta ferramenta
estudou-se a resposta dos PMNs do sangue de equino a diferentes concentraccedilotildees
de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na ausecircncia do antagonista de
PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose de neutroacutefilos e a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio por neutroacutefilos pelas teacutecnicas descritas
51
abaixo (ver toacutepicos 315 ndash fagocitose de macroacutefago alveolar 316 ndash produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar e 317 ndash produccedilatildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio por macroacutefago alveolar) sendo que para cada ensaio foram realizadas
quatro repeticcedilotildees Igualmente estudou-se a resposta do macroacutefago alveolar a
diferentes concentraccedilotildees de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na
ausecircncia do antagonista de PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose e a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem realizando-se quatro
repeticcedilotildees para cada anaacutelise
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)
Em microplaca de 96 poccedilos 250microL de reagente de Bradford (100mg de
Coomassie Blue 50 mL de etanol 95 + 100 mL de aacutecido fosfoacuterico 85 completar
com aacutegua ultra pura para 1000 mL) foi adicionado a 10 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA) Nesta etapa o
corante Comassie eacute complexado por proteiacutenas presentes na amostra o que muda a
sua cor
Apoacutes 5 minutos em temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada a
595 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-Rad
Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) A concentraccedilatildeo de proteiacutenas foi determinada
interpolando-se os valores de absorbacircncia numa curva padratildeo resultante de
concentraccedilotildees conhecidas de albumina seacuterica bovina (Sigma) Os resultados foram
expressos como miligramas de proteiacutenas por mililitro de LBA
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR e MARLETTA 1985)
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA foi utilizada como indicador da produccedilatildeo de
oacutexido niacutetrico na regiatildeo broncoalveolar
Em micro placa de 96 poccedilos adicionou-se 100 microL de reagente de Griess
(mistura de cloreto de naftiletilenodiamina a 005 e por sulfanilamida a 05 em
meio aacutecido proporcionado por H3PO4 a 25) a 100 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA)
52
A sulfanilamida (um derivado de anilina) reage com o aacutecido nitroso e apoacutes
rearranjos intramoleculares forma o iacuteon diazocircnio Apoacutes o iacuteon diazocircnio reage com a
naftiletilenodiamina (um derivado de naftilamina) para formar pigmento roacuteseo
Depois de 5 minutos na temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada
a 550 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-
Rad Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) Os resultados foram expressos como
absorbacircncia a 550 nm
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO
LBA (NOUROOZ-ZADEH et al 1994)
Utilizou-se uma aliacutequota de suspensatildeo de ceacutelulas de LBA na densidade de
15 x 106 ceacutelulasmL de LBA Esta foi ultrasonicada (6 ciclos de 4 segundos) em 1mL
de metanol sendo centrifugada em seguida a 5000g por 5 minutos a 40C
(Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
Uma aliacutequota de 50 microL de sobrenadante foi armazenada para posterior
mensuraccedilatildeo da concentraccedilatildeo total de proteiacutenas
Para cada amostra aliacutequotas de 90 microL foram depositadas em seis frascos
para centriacutefuga (de 15 mL Eppendorf) foi agitada no voacutertex e incubada por 30
minutos a temperatura ambiente A trecircs desses tubos foram adicionados 10 microL de
soluccedilatildeo metanoacutelica de trifenilfosfina (TPP Sigma) 10 mM para ocorrer a reduccedilatildeo
seletiva de hidroperoacutexidos (os grupamentos hidroperoacutexido especificamente os
presentes em lipiacutedios satildeo convertidos a grupamentos hidroxila pela trifenilfosfina)
As amostras contidas nos trecircs tubos restantes receberam apenas 10 microL de metanol
Todos os tubos foram agitados vigorosamente e entatildeo incubados em temperatura
ambiente por 30 minutos
Apoacutes adicionou-se a todos os tubos 900 microL de reagente de FOX2 Este
reagente deve ser preparado no momento do uso consistindo de xilenol laranja 100
microM hidroxitolueno butilado (BHT) 400 mM aacutecido sulfuacuterico 25 mM e sulfato ferroso
de amocircnio 250 microM em metanol 90 (vv em aacutegua) Apoacutes agitaccedilatildeo o meio
reacional foi incubado por mais 30 minutos a temperatura ambiente
Nesta etapa os caacutetions ferrosos (Fe2+) do reativo de FOX2 satildeo oxidados por
hidroperoacutexidos presentes na amostra (tanto pelos hidroperoacutexidos lipiacutedicos quanto
por outros tipos de hidroperoacutexidos presentes na amostra) Como todos os
53
hidroperoacutexidos lipiacutedicos das amostras tratadas com TPP foram reduzidos a
produccedilatildeo de Fe3+ seraacute menor nestas do que nas amostras natildeo tratadas com TPP
O Fe3+ formado eacute entatildeo quelado pelo xilenol laranja o que faz a cor deste
indicador passar de laranja a azul-puacuterpura (passa a absorver luz em 560 nm)
Passado o tempo de incubaccedilatildeo a absorbacircncia foi mensurada a 560 nm
utilizando-se um espectrofotocircmetro (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil
Satildeo Paulo)
Subtraiu-se entatildeo o valor da absorbacircncia das amostras tratadas com TPP
(sem hidroperoacutexidos lipiacutedicos) do valor da absorbacircncia das amostras sem TPP O
valor obtido nessa subtraccedilatildeo (referente apenas agrave quantidade de ferro oxidado por
hidroperoacutexidos lipiacutedicos) foi utilizado na foacutermula da curva padratildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio obtida com soluccedilotildees padratildeo de diferentes concentraccedilotildees (1000 500
250 125 62 31 e 16 microM) submetidas aos mesmos procedimentos descritos
acima para a dosagem de hidroperoacutexidos (com exceccedilatildeo ao tratamento com TPP) O
resultado obtido foi referente agrave concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos
Dividiu-se o valor da concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos pela
concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais do extrato metanoacutelico Os resultados foram
expressos como nmolesmg de proteiacutenas
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984)
Utilizou-se 300 microL de uma suspensatildeo de ceacutelulas de LBA em PBS na
densidade de 5 x 106 ceacutelulasmL que foram centrifugados (10600g por 20min a
4oC) para remoccedilatildeo de partiacuteculas
Apoacutes foi colocada em banho com gelo Uma aliacutequota de 10 microL desse extrato
de ceacutelulas foi adicionada a 990 microL de meio reativo (soluccedilatildeo aquosa de H2O2 20 mM
tris[hidroximetil] aminometano 005M e EDTA 025 mM pH 74)
Imediatamente utilizando-se um espectrofotocircmetro acoplado a um
microcomputador (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil Satildeo Paulo)
monitorou-se a absorbacircncia a 220 nm por 90 segundos a 370C com intervalos de 2
segundos entre leituras consecutivas
A degradaccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio pela catalase causa uma diminuiccedilatildeo
gradual na absorbacircncia do meio reativo a 220 nm a qual indica a atividade da
catalase no extrato de ceacutelulas Os valores de atividade da catalase foram corrigidos
54
pela concentraccedilatildeo de proteiacutenas do extrato de ceacutelulas (realizado conforme descrito
no toacutepico 311) e foram expressos como micromoles de H2O2minmg proteiacutenas
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA et al 1998)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL (= 5 x 105
ceacutelulaspoccedilo) e os macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A
suspensatildeo de ceacutelulas na densidade descrita foi obtida durante o processamento do
LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS e foram adicionados
20microL de zymosan corado com vermelho neutro (67 mgmL) mais 100 microL de PBS
sendo deixados a temperatura ambiente por 30 minutos
Em seguida depois de descartado o sobrenadante as ceacutelulas foram fixadas
com soluccedilatildeo de Baker (4 formaldeiacutedo 2 cloreto de soacutedio 1 acetato de caacutelcio
soluccedilatildeo aquosa) por 30 minutos
Apoacutes os poccedilos foram lavados com PBS para que o zymosan corado com
vermelho neutro natildeo fagocitado por macroacutefagos alveolares fosse retirado
Em seguida o corante vermelho neutro foi solubilizado em cada poccedilo com
200microL de soluccedilatildeo aacutecido-aacutelcool (aacutecido aceacutetico 1 etanol 50 soluccedilatildeo aquosa) e
deixado por 30 minutos
Apoacutes este periacuteodo a absorbacircncia foi mensurada a 550 nm Os resultados
foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 -
Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA et al 1998)
Estimou-se a produccedilatildeo de acircnions pela da formaccedilatildeo de formazan produto da
reduccedilatildeo do NBT (nitroblue tetrazolium) pelo acircnion superoacutexido Avaliou-se a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA
(phorbol myristate acetate) O PMA estimula o complexo NADPH oxidase na
membrana dos fagoacutecitos a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
55
mimetizando o resultado da fagocitose de um microorganismo (DEKKER et al
2000)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para a retirada das
ceacutelulas natildeo aderentes Em seguida adicionou-se a cada poccedilo 100 microL de PBS com
NBT 02 ou com NBT 02 mais PMA 11microM sempre em triplicatas para cada
potro
Apoacutes a incubaccedilatildeo por 1 hora a 370C e em ambiente escuro (a placa deve
estar envolta em papel alumiacutenio) a placa foi centrifugada (800g por 5 minutos a
40C) Em seguida o sobrenadante foi descartado e 100 microL de PBS foram
adicionados a cada poccedilo e a placa foi novamente centrifugada
Apoacutes o sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram fixadas com metanol
por 10 minutos Em seguida a placa passou por nova centrifugaccedilatildeo o sobrenadante
foi descartado e a placa foi deixada secar ao ar em estufa
Em seguida a placa foi lavada duas vezes com metanol 50 e o formazan
(produto da reaccedilatildeo entre o NBT e o acircnion superoacutexido) foi solubilizado atraveacutes da
incubaccedilatildeo por 30 minutos com 120 microL soluccedilatildeo aquosa de hidroacutexido de potaacutessio 2M
e 140 microL de dimetilsulfoacutexido por poccedilo
A absorbacircncia foi lida a 595 nm e os resultados foram corrigidos pela adesatildeo
de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago
Alveolar)
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK e MIZEL 1981)
Mensurou-se a produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) por macroacutefago
alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA atraveacutes da oxidaccedilatildeo do vermelho
fenol pela peroxidase onde esta enzima utiliza nesta reaccedilatildeo o H2O2 O composto
oxidado absorve luz em pH baacutesico com maacutexima intensidade em 550 nm
56
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS observando-se a retirada
de grumos presentes nos poccedilos Em seguida 100 microL de soluccedilatildeo de vermelho fenol
(PRS phenol red solution 140 mM NaCl 10 mM fosfato de potaacutessio 55 mM
dextrose 056 mM vermelho fenol 19 UmL de HRPO horse radish peroxidase pH
70 soluccedilatildeo aquosa) ou soluccedilatildeo de vermelho fenol + PMA 110nM foram adicionados
a cada poccedilo em triplicatas e deixados incubar por 1 hora a 370C no escuro
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo adicionou-se 10 microL de NaOH 1N para
interromper a reaccedilatildeo alcalinizar o meio e permitir a absorbacircncia da soluccedilatildeo que foi
lida a 595 nm apoacutes 30 minutos
Os resultados foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada
potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN e GORDON 1987)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para se selecionar as
ceacutelulas aderentes que a seguir foram fixadas com metanol 50 por 10 minutos
Apoacutes este periacuteodo o sobrenadante foi descartado e 100 microL de corante de
Giemsa a 02 foram adicionados a cada poccedilo e deixados por 40 minutos em
temperatura ambiente
Os poccedilos foram novamente lavados com PBS por duas vezes observando-se
a retirada de grumos nos poccedilos e 200 microL de metanol 50 foram adicionados
Apoacutes 30 minutos a absorbacircncia da suspensatildeo foi lida a 550 nm
A adesatildeo resultou menor no grupo DA (n=17) em comparaccedilatildeo ao grupo CN
(n=36) (P=0010) sendo que o grupo EX (n=26) apresentou adesatildeo maior que o
grupo DA (P=0001) (FIGURA 12) indicando diferenccedilas na capacidade de adesatildeo
em placa acriacutelica possivelmente devido a diferenccedilas no estado funcional das ceacutelulas
57
de cada grupo Por esta razatildeo utilizou-se o ensaio de adesatildeo de macroacutefago
alveolar realizado concomitantemente aos ensaios de funccedilatildeo de macroacutefago
(fagocitose e produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) a cada
experimento realizado durante o estudo A correccedilatildeo dos valores obtidos de
macroacutefago em funccedilatildeo da adesatildeo foi feito atraveacutes da divisatildeo da meacutedia final obtida
para o ensaio de funccedilatildeo de macroacutefago dividido pela meacutedia obtida no ensaio de
adesatildeo para cada potro avaliado e a cada experimento realizado
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 (ROSEN e GORDON 1987) aP=0010 vs CN e bP=0001 vs DA
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
A normalidade na distribuiccedilatildeo dos dados foi avaliada pelo teste de D‟Agostino
e Pearson Valores considerados outliers pelo teste de Grubb foram excluiacutedos das
anaacutelises Para os dados que apresentaram distribuiccedilatildeo normal dos valores
(distribuiccedilatildeo Gaussiana) (contagem percentual de linfoacutecitos concentraccedilatildeo total de
proteiacutenas do LBA bioatividade de PAF catalase hidroperoacutexidos nitritos fagocitose
de macroacutefago alveolar produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio
por macroacutefago alveolar) foi utilizado o teste t natildeo pareado Os dados com
distribuiccedilatildeo natildeo Gaussiana dos valores (contagens percentuais de neutroacutefilos de
58
eosinoacutefilos e de macroacutefagos multinucleados contagem do NTCN do LBA e adesatildeo
de macroacutefago alveolar) foram analisados pelo teste de Mann-Whitney A
comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos de funccedilatildeo de macroacutefago alveolar
estimulado e natildeo estimulado por PMA foi feita por teste t de Student natildeo pareado
Os achados cliacutenicos e endoscoacutepicos foram analisados por meio de teste de Mann-
Whitney A correlaccedilatildeo entre o percentual de um mesmo tipo celular no aspirado
traqueal e no lavado broncoalveolar foi analisada atraveacutes do teste de Spearman
Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas utilizando-se o programa GraphPad
Prism versatildeo 500 para Windows (GraphPad Software San Diego CA EUA) e os
valores apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia (SEM) Valores de
Plt005 foram considerados como significativos
4 RESULTADOS
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica
Nenhum dos potros dos grupos CN e DA apresentou tosse segundo o
histoacuterico obtido Contudo oito potros (235) do grupo EX apresentaram tosse
espontacircnea na cocheira ou durante o treinamento o que resultou em diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0002) (TABELA 1)
A presenccedila de corrimento nasal seroso (coriza) observada nos trecircs grupos
estudados estaacute demonstrada na TABELA 1 Natildeo houve diferenccedila significativa entre
os grupos apesar de o percentual de potros com coriza no grupo DA ter reduzido
em relaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
Os linfonodos submandibulares eou retrofaringeanos estiveram aumentados
em 382 222 e 382 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
natildeo havendo diferenccedila entre os grupos (TABELA 1)
A auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e traqueal resultou normal em todos os potros
avaliados dos trecircs grupos estudados Contudo sons pulmonares crepitantes foram
audiacuteveis em 28 156 e 115 dos potros avaliados nos grupos CN DA e EX
respectivamente havendo um aumento do percentual de crepitaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo DA em ralaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DE CORRIDA
Grupos Tosse
Espontacircnea
Corrimento
Nasal
Linfonodos
Auscultaccedilatildeo
Pulmonar
CN 034
(0)
1534
(441)
1334
(382)
136
(28)
DA 045
(0)
1145
(244)
1045
(222)
745
(156)
EX 834
(235)a
1534
(441)
1334
(382)
326
(115)
aP=0002 vs DA
60
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas
No iniacutecio da avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas primeiramente
considerando os foliacuteculos linfoacuteides faringeanos ou hiperplasia folicular linfoacuteide (HFL)
a distribuiccedilatildeo das diferentes graduaccedilotildees pode ser vista na TABELA 2
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGEANOS OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS DE I A IV SEGUNDO RAKER E BOLES (1978)
Grupos HFL I HFL II HFL III HFL IV
CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)
DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)
EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)
Considerando as graduaccedilotildees de HFL III e IV como faringite esta
anormalidade foi observada em 546 286 e 539 dos potros dos grupos CN
DA e EX respectivamente Houve uma significativa reduccedilatildeo no percentual meacutedio de
observaccedilotildees de faringite para o grupo DA em comparaccedilatildeo ao grupo CN (P=0024)
enquanto no grupo EX o percentual de faringites foi significativamente maior em
relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0039)
Com relaccedilatildeo ao aspecto morfoloacutegico da epiglote um potro do grupo DA e um
potro do grupo EX evidenciaram epiglote com aspecto fraacutegil sendo que os demais
potros foram normais
Com relaccedilatildeo agrave avaliaccedilatildeo funcional da laringe todos os potros foram normais
apresentando graduaccedilotildees I ou II (TABELA 3)
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE ACORDO COM RAKESTRAW et al (1991)
Grupos NLP I NLP II NLP III NLP IV
CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)
DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)
EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)
61
A quantidade de secreccedilatildeo observada no lume traqueal estaacute demonstrada na
TABELA 4
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 SEGUNDO GERBER et al (2004)
Grupos 0 1 2 3 4 5
CN 233
(61)
933
(273)
933
(273)
1133
(332)
233
(61)
033
(0)
DA 742
(167)
1242
(286)
1242
(286)
742
(167)
342
(70)
142
(24)
EX 327
(111)
727
(259)
727
(259)
627
(223)
427
(148)
027
(0)
Quantidade de secreccedilatildeo traqueal acima de grau 2 considerada passiacutevel de
prejuiacutezo agrave troca gasosa e ao rendimento desportivo foi observada em 666 547
e 630 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT)
Os achados de anaacutelise citoloacutegica diferencial para os principais tipos celulares
do AT para os trecircs grupos de potros estudados estatildeo demonstrados na TABELA 5
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN (n=20) DA (n=19) E EX (n=15) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
Grupos Mac Lin Neut Eos Mast Calic Multi Epit Sid
CN 429plusmn63 75
plusmn19
76
plusmn29
12
plusmn07
002
plusmn02
05
plusmn02
02
plusmn01
201
plusmn56
0
DA 591
plusmn41
141
plusmn24
85
plusmn23
11
plusmn05
0 01
plusmn01
11
plusmn02a
161
plusmn48
0
EX 593
plusmn42
134
plusmn23
171
plusmn49
09
plusmn03
0 05
plusmn03
08
plusmn03
71
plusmn32
09
plusmn04
Mac macroacutefago alveolar Lin linfoacutecitos Neut neutroacutefilos Eos eosinoacutefilos Mast mastoacutecitos Calic ceacutelulas caliciformes Multi macroacutefagos multinucleados Epit ceacutelulas epiteliais Sid hemossideroacutefagos aPlt0001 vs CN
62
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA)
As quantidades de LBA recuperado estiveram entre 54 e 59 do volume
infundido para os grupos CN (n=16) DA (n=23) e EX (n=16)
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
A contagem do NTCN e a contagem diferencial de ceacutelulas do LBA estatildeo
demonstradas na TABELA 6
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN (n=45) DA (n=40) E EX (n=34) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
CTCN
(ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Macroacutef
Multi
Hemosid
CN 395
plusmn 38
673
plusmn 17
294
plusmn 15
23
plusmn 04
05
plusmn 03
005
plusmn 004
04
plusmn 01
0
DA 343
plusmn 24
698
plusmn 14
281
plusmn 13
09
plusmn 02
12
plusmn 01
002
plusmn 002
11
plusmn 01d
0
EX 456
plusmn 28a
676
plusmn 18
229
plusmn 15
54
plusmn 11b
15
plusmn 07c
02
plusmn 01
13
plusmn 02
22
plusmn 06
CTCN = contagem total de ceacutelulas nucleadas Macroacutef = macroacutefagos Linfoacutec = linfoacutecitos Neutroacutef = neutroacutefilos Eosino = eosinoacutefilos Masto = mastoacutecitos Macroacutef Multi = macroacutefagos multinucleados Hemosid = hemossideroacutefagos aPlt001 vs DA bPlt0001 vs DA cPlt005 vs DA dPlt0001 vs CN
Hemossideroacutefagos foram observados somente no LBA dos potros do grupo
EX mais especificamente em 23 (622) deles representando 22 do total de
ceacutelulas A quantidade observada de hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 da
contagem citoloacutegica diferencial do LBA
A correlaccedilatildeo entre as contagens percentuais de um mesmo tipo celular no AT
e no LBA foi analisada para os potros do grupo CN (n=11) DA (n=18) e EX (n=12)
que tiveram material colhido para as duas teacutecnicas citoloacutegicas natildeo tendo sido
63
encontrada correlaccedilatildeo entre ambas as teacutecnicas de avaliaccedilatildeo citoloacutegica para
nenhuma das ceacutelulas
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF
A resposta dos neutroacutefilos do sangue de equino frente ao PMA e frente ao
PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na ausecircncia e na presenccedila
do antagonista de PAF BN52021 estaacute demonstrado nas FIGURAS 13 a 15
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF aP=0028 vs controle bPlt0001 vs sem BN52021 cP=0028 vs PMA
64
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0007) 10nM (aP=0003) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA e PAF 1 e 10nM
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF EM TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA ePlt0001 vs PAF 1nM e fPlt0001 vs PAF 1nM e 10nM
65
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF
Tambeacutem se estudou a resposta dos macroacutefagos alveolares de equino frente
ao PMA e frente ao PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 demonstrado nas
FIGURAs 16 a 18
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0003) 10nM (aPlt0001) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0010 vs PMA dPlt0001 vs PAF 01nM e PAF 1nM
66
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0037) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA e PAF 01nM dPlt0001 vs PAF 1nM
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 01nM e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA dPlt001 vs PAF 1nM e 10nM
67
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos
foi mensurada pelo influxo de Ca++ em ceacutelulas PMN de equinos (FIGURA 19)
Registrou-se uma baixa relaccedilatildeo 340380 nm para os grupos CN (0005 plusmn 0002
relaccedilatildeo 340380 nm) e DA (0006 plusmn 0002 relaccedilatildeo 340380 nm) representando um
baixo niacutevel de bioatividade de PAF no LBA dos potros avaliados nestes grupos
Contudo a bioatividade de PAF do grupo EX (0068 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm) foi
significativamente maior em comparaccedilatildeo ao grupo DA (P=0017) Um graacutefico
representativo da bioatividade de PAF em uma das amostras do grupo EX na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 pode ser visto na FIGURA
20
CN DA EX000
002
004
006
008
010 a
Re
laccedil
atildeo
34
03
80
nm
Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedicodas Ceacutelulas do LBA
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE AO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0017 vs DA
68
0 50 100
150
200
0
1
2
3
4
Tempo (segundos)
Bioatividade de PAFR
ela
ccedilatildeo
3403
80n
m
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm A AMOSTRA Eacute ADICIONADA Agrave SUSPENSAtildeO DE CEacuteLULAS PMN APOacuteS 50 SEGUNDOS DE LEITURA BASAL (SETA)
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi maior no grupo DA em relaccedilatildeo
ao grupo CN (014 plusmn 003 vs 003 plusmn 001 mg de proteiacutenasmL de LBA) (P=0001) O
grupo EX apresentou concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA (036 plusmn 006 mg de
proteiacutenasmL de LBA) significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001)
(FIGURA 21)
69
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0001 vs CN bPlt0001 vs DA
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos foi maior no LBA do grupo DA (019 plusmn 001
absorbacircncia 550 nm) em relaccedilatildeo ao grupo CN (014 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm)
(P=0011) O grupo EX apresentou uma reduccedilatildeo significativa na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA (008 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm) significativamente menor em
comparaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001) (FIGURA 22)
70
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0011 vs CN bPlt0001 vs DA
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (1047 plusmn 241 vs 66
plusmn 35 nmolesmg de proteiacutenas) (Plt0001) No grupo EX a concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos nas ceacutelulas do LBA apresentou reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo
DA (352 plusmn 84 vs 1047 plusmn 241 nmolesmg de proteiacutenas) (P=0007) (FIGURA 23)
71
Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos no LBA
CN DA EX0
50
100
150a
b
nm
ole
s
mg
de
pro
teiacuten
as
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX (n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO APRESENTADOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNA DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aPlt0001 vs CN bP=0007 vs DA
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA
No grupo EX a atividade da catalase nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol
H2O2minmg de proteiacutenas) (P=0002) natildeo havendo diferenccedila entre os grupos CN e
DA (FIGURA 24)
72
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO microMOL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOMINUTOMILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0002 vs DA
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
A fagocitose de macroacutefago alveolar foi significativamente maior no grupo DA
em comparaccedilatildeo ao grupo CN (223 plusmn 043 vs 072 plusmn 018 absorbacircncia 550
nmadesatildeo) (P=0002) Observou-se uma diminuiccedilatildeo na fagocitose no grupo EX em
relaccedilatildeo ao grupo DA (104 plusmn 027 vs 223 plusmn 043 absorbacircncia 550 nmadesatildeo)
(P=0006) (FIGURA 25)
73
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A FAGOCITOSE PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (FAGOCITOSEADESAtildeO) aP=0002 vs CN e bP=0006 vs DA
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar
A utilizaccedilatildeo de PMA aumentou significativamente a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido pelos macroacutefagos alveolares dos grupos DA (219 plusmn 053 vs 392 plusmn 062
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0049) e EX (060 plusmn 011 vs 090 plusmn 014
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0031) A produccedilatildeo basal de acircnion superoacutexido foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (219 plusmn 053 vs 025
plusmn 007 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo DA (060 plusmn 011 vs 219 plusmn 053 absorbacircncia 595
nmadesatildeo) (P=0001) A produccedilatildeo de acircnion superoacutexido estimulada por PMA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (392 plusmn 062 vs 046
plusmn 016 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
74
diminuiccedilatildeo na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido em comparaccedilatildeo ao grupo DA (090 plusmn
014 vs 392 plusmn 062 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) (FIGURA 26)
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0049 vs DA bP=0031 vs EX cPlt0001 vs CN dP=0001 vs DA ePlt0001 vs CNe fPlt0001 vs DAe
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
O PMA aumentou a produccedilatildeo de H2O2 pelos macroacutefagos alveolares nos
grupos CN (041 plusmn 008 vs 099 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0004) DA
(035 plusmn 005 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0002) e EX (010 plusmn
001 vs 034 plusmn 008 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) A produccedilatildeo basal de
H2O2 para o grupo EX foi significativamente menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (010 plusmn
001 vs 035 plusmn 005 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) Aleacutem disso a produccedilatildeo
75
de H2O2 estimulada por PMA diminuiu no grupo EX tendo sido significativamente
menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (034 plusmn 008 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia
595nmadesatildeo) (P=0006) (FIGURA 27)
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0004 vs CN bP=0002 vs DA cPlt0001 vs EX dPlt0001 vs DA eP=0006 vs DAe
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
Hemossideroacutefagos foram observados no LBA de 23 potros (622) sendo
que estes foram considerados no subgrupo HPIE pos A quantidade observada de
76
hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 A ausecircncia de hemossideroacutefagos foi
evidenciada em 14 potros (378) sendo que estes foram considerados para o
subgrupo HPIE neg
Dentre os potros avaliados 15 (405) deles (10 potros do subgrupo HPIE
pos e 5 potros do subgrupo HPIE neg) apresentaram mais de 5 de neutroacutefilos eou
mais de 1 de eosinoacutefilos na contagem diferencial de ceacutelulas indicando um perfil
citoloacutegico de LBA compatiacutevel com inflamaccedilatildeo pulmonar
Os valores do NTCN bem como da contagem diferencial de ceacutelulas para o
grupo EX e para os subgrupos estaacute demonstrado na TABELA 7
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX (n=37) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=23) E HPIE NEG (n=14)
CTCN (ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Siderof
Grupo EX
456 plusmn 28
676 plusmn 18
229 plusmn 15
47 plusmn 10
13 plusmn 06
02 plusmn 01
22 plusmn 35
HPIE pos
571
plusmn 78a
645
plusmn 22b
240 plusmn 20
56 plusmn 12
09 plusmn 07
02 plusmn 02
34 plusmn 37
HPIE neg
348 plusmn 38
725 plusmn 30
207 plusmn 25
35 plusmn 18
19 plusmn 11
03 plusmn 01
00
CTCN contagem total de ceacutelulas nucleadas Macrof macoacutefagos Linfoc linfoacutecitos Neutrof
neutroacutefilos Eosinof eosinoacutefilos Mastoc mastoacutecitos Siderof hemossideroacutefagos aP=0005
vs HPIE neg bP=0020 vs HPIE neg
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg
(018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm P=0042) (FIGURA 28)
77
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) e HPIE NEG (n=5) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO RELACcedilAtildeO 340380nm aP=0042 vs HPIE neg
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi significativamente maior no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (039 plusmn 008 vs 019 plusmn
004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) (FIGURA 29)
78
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=13) E HPIE NEG (n=12) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS POR MILILITRO DE LBA aP=0031 vs HPIE neg
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos resultou
significativamente reduzida em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (008 plusmn 003 vs
012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) (FIGURA 30)
79
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) E HPIE NEG (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 550 nm aP=0049 vs HPIE neg
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA dos potros do
subgrupo HPIE pos resultou significativamente maior que no subgrupo HPIE neg
(367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) (FIGURA 31)
80
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) E HPIE NEG (n=8) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS aP=0009 vs HPIE neg
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
Natildeo houve diferenccedila na fagocitose de macroacutefago alveolar entre os grupos
estudados
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-)
A produccedilatildeo basal de O2- por macroacutefagos alveolares resultou similar entre os
grupos estudados A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0047) mas natildeo no subgrupo HPIE pos
(FIGURA 32)
A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA foi significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (081 plusmn 011 vs 124 plusmn
015 absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0042) (FIGURA 32)
81
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) E HPIE NEG (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0047 vs HPIE neg bP=0042 vs HPIE neg e
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
A produccedilatildeo basal de H2O2 por macroacutefago alveolar foi similar entre os grupos
avaliados no presente estudo A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0002) mas natildeo no subgrupo HPIE
neg (FIGURA 33)
A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA resultou significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (025 plusmn 003 vs 067 plusmn 014
absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0001)
82
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) E HPIE NEG (n=6) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2 ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0002 vs HPIE neg bP=001 vs HPIE neg e
5 DISCUSSAtildeO
O estudo da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas de cavalos de corrida adultos jovens
em trecircs diferentes situaccedilotildees em seu ambiente natural foi possiacutevel devido agrave
utilizaccedilatildeo de um grande nuacutemero de animais Assim permitiu-se detectar diferenccedilas
entre os grupos mesmo havendo variaccedilotildees ambientais tais como estaccedilotildees do ano
condiccedilotildees climaacuteticas e diferenccedilas sutis em manejo Como os potros dos trecircs grupos
encontravam-se na mesma faixa etaacuteria de risco para as doenccedilas respiratoacuterias virais
e os experimentos foram realizados durante um mesmo periacuteodo as diferenccedilas entre
os grupos CN e DA foram consideradas como sendo devido ao ambiente e as
diferenccedilas entre os grupos DA e EX foram consideradas como sendo devido ao
treinamento
O grupo CN evidenciou um percentual de observaccedilotildees de faringite na
avaliaccedilatildeo endoscoacutepica (TABELA 2) maior que os 37 relatado por HOBO et al
(1995) em cavalos PSI de corrida de dois anos de idade Os potros deste grupo
foram mantidos integralmente em piquetes e nesta situaccedilatildeo a hiperplasia dos
foliacuteculos linfoacuteides da faringe em cavalos jovens pode ser uma resposta normal a
inalaccedilatildeo de antiacutegenos ambientais ou agentes infecciosos (HOLCOMBE e
DUCHARME 2007)
De fato as vias aeacutereas dos potros desse grupo deram mostra de estarem
sendo desafiadas pelo nuacutemero percentual de corrimento nasal linfonodos
aumentados e quantidades elevadas de secreccedilatildeo traqueal iguais aos demais
grupos (TABELAS 1 e 4) Possivelmente isso tambeacutem se deva a fatores climaacuteticos
pois no estudo de ROBINSON et al (2006) com cavalos de montaria de vaacuterias
idades aqueles que permaneceram fora dos estaacutebulos durante o inverno
apresentaram quantidades elevadas de muco traqueal No entanto diferentemente
do nosso estudo os cavalos avaliados por ROBINSON et al (2006) tiveram nuacutemero
percentual de neutroacutefilos aumentado na secreccedilatildeo traqueal enquanto os potros do
grupo CN resultaram em avaliaccedilatildeo citoloacutegica tanto de AT (TABELA 5) como de LBA
(TABELA 6) normais (ROBINSON 2003 HODGSON e HODGSON 2007)
evidenciando vias aeacutereas especialmente as vias aeacutereas inferiores saudaacuteveis
Com relaccedilatildeo ao desafio ambiental no presente estudo adotou-se um sistema
convencional de estabulaccedilatildeo pois estudos anteriores em modelos semelhantes ao
84
nosso jaacute demonstraram a presenccedila de altas concentraccedilotildees de endotoxinas
(BERNDT et al 2008) bem como de poeira e de aeroalergenos (WOODS et al
1993)
Contudo o desafio ambiental de 30 dias utilizado em nosso estudo resultou
em quadro comparaacutevel ao do grupo CN isento de processo inflamatoacuterio das vias
aeacutereas Possivelmente um periacuteodo maior de desafio pudesse causar um processo
inflamatoacuterio tal como foi demonstrado previamente por HOLCOMBE et al (2001)
onde potros da raccedila puro sangue aacuterabe que sofreram desafio ambiental de 90 dias
apresentaram aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no LBA Contudo no
estudo citado o material utilizado para a cama dos potros foi a palha que tambeacutem
representou um maior risco de desenvolvimento de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas dos
cavalos em outros estudos quando comparada a serragem utilizada na cama dos
potros do grupo DA (BURRELL et al 1996 VANDEPUT et al 1998 GERBER et
al 2000 KLEIBER et al 2005 DEWACHI et al 2006)
Entretanto ateacute o momento os efeitos dos fatores ambientais das cocheiras
nas vias aeacutereas foram relatados em sua maioria em cavalos apresentando ORVA e
natildeo em indiviacuteduos jovens e saudaacuteveis como os potros avaliados em nosso estudo
Nos animais com ORVA um curto periacuteodo de exposiccedilatildeo ambiental (6 a 48 horas)
em baia e recebendo alimentaccedilatildeo composta principalmente por feno causou
aumento da expressatildeo de algumas citocinas (pex IL-4 e IL-5) em alguns estudos
mas nenhuma alteraccedilatildeo em outros (GERBER et al 2000 AINSWORTH et al 2003
CORDEAU et al 2004 KLEIBER et al 2005) sendo que um longo tempo de
exposiccedilatildeo ambiental (variando de cinco semanas a trecircs meses) causou aumento da
expressatildeo de IFN-γ e IL-8 (AINSWORTH et al 2003) IL-9 (DEWACHI et al 2006)
IL-17 (DEBRUE et al 2005) e o desenvolvimento dos sinais cliacutenicos da ORVA
acompanhados de alteraccedilotildees na funccedilatildeo pulmonar (VANDEPUT et al 1998)
Contudo nos potros do grupo DA se evidenciou no AT (TABELA 5) e no LBA
(TABELA 6) um aumento significativo do nuacutemero percentual de macroacutefagos
multinucleados em comparaccedilatildeo ao grupo CN bem como nuacutemero percentual de
eosinoacutefilos acima do valor considerado limite para cavalos normais (ROBINSON
2003) sugerindo que houve uma resposta por parte do sistema de defesa nas vias
aeacutereas dos potros deste grupo
Os macroacutefagos multinucleados ou ceacutelulas gigantes multinucleadas satildeo
formados a partir da fusatildeo de dois ou mais macroacutefagos na resposta imune pulmonar
85
(ANDERSON et al 1999) representando especificamente uma resposta imune do
tipo Th2 com a participaccedilatildeo da IL-4 (HELMING e GORDON 2007) Em pessoas os
macroacutefagos multinucleados satildeo considerados como um achado indicativo de
reaccedilotildees inflamatoacuterias crocircnicas nas vias aeacutereas como a tuberculose por exemplo
(LEMAIRE et al 2006 HELMING e GORDON 2007) Em equinos satildeo escassos os
estudos envolvendo a citologia respiratoacuteria que descrevam o nuacutemero percentual
normal deste tipo celular De qualquer forma eacute relatado que pode ser observado em
pequeno nuacutemero em cavalos sem evidecircncias de doenccedila pulmonar sendo que uma
quantidade aumentada jaacute foi descrita associada agrave inflamaccedilatildeo crocircnica (DECONTO
1983 HODGSON e HODGSON 2007) Estas informaccedilotildees parecem natildeo corroborar
com o aumento no nuacutemero percentual de macroacutefagos multinucleados no grupo DA
em se tratando de potros jovens considerados saudaacuteveis o que demonstra a
necessidade de mais estudos para se entender o papel do macroacutefago multinucleado
no pulmatildeo saudaacutevel e na inflamaccedilatildeo pulmonar dos cavalos
Entretanto o nuacutemero percentual de eosinoacutefilos acima do limite normal no
LBA dos potros do grupo DA pode ser considerado como uma resposta ao
ambiente assim como eacute considerado em humanos (DENGUEZLI-BOUZGARROU et
al 2007) e jaacute relatado em cavalos (COUEumlTIL et al 2007)
O periacuteodo de treinamento por sua vez induziu inflamaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo EX O nuacutemero significativamente aumentado de potros com tosse
(TABELA 1) constituiu a evidecircncia cliacutenica sugerindo inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas nos
potros desse grupo Cavalos saudaacuteveis raramente tossem (ROBINSON 2007)
sendo a tosse um sinal cliacutenico comprovadamente associado agrave inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas (BURRELL et al 1996 McGROUM e DIXON 2007) CHRISTLEY et al
(2001) correlacionaram a tosse com a presenccedila de faringite sendo que tal
associaccedilatildeo tambeacutem foi observada no grupo EX (TABELAS 1 e 2) Adicionalmente
BEDENICE et al (2008) estudaram a relaccedilatildeo entre a tosse e a inflamaccedilatildeo pulmonar
e descreveram que os cavalos avaliados por apresentarem tosse tiveram contagens
percentuais de neutroacutefilos no LBA maiores que 5
No presente estudo um aumento no NTCN e nas contagens percentuais de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos do LBA (TABELA 6) confirmaram a presenccedila de inflamaccedilatildeo
pulmonar no grupo EX (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
COUEumlTIL et al 2007) A neutrofilia no LBA de cavalos de corrida jaacute foi
correlacionada a um baixo rendimento desportivo e constitui sinal chave para o
86
diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007) A eosinofilia no LBA de cavalos de
corrida por sua vez pode ser um achado transitoacuterio (VIEL e HEWSON 2003)
apesar de tambeacutem ter sido associada a um baixo rendimento desportivo aleacutem de
hiperresponsividade das vias aeacutereas em cavalos de corrida jovens (HARE e VIEL
1998) Portanto tais evidecircncias podem ser consideradas como um risco ao futuro
potencial atleacutetico dos potros do grupo EX
No presente estudo natildeo houve correlaccedilatildeo entre os achados citoloacutegicos de AT
e LBA para nenhum dos trecircs grupos estudados e esta falta de correlaccedilatildeo entre AT
e LBA jaacute foi relatada anteriormente Portanto entende-se que os epiteacutelios traqueal e
broncoalveolar respondem diferentemente aos agentes agressores sendo que a
avaliaccedilatildeo de cavalos com tosse ou diminuiccedilatildeo de rendimento desportivo deve ser
realizada por ambas as teacutecnicas associadas (MALIKIDES et al 2003 CHRISTLEY
RUSH 2007 HODGSON e HODGSON 2007)
A ligaccedilatildeo entre o exerciacutecio e a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas provavelmente
envolve diversos mediadores proacute-inflamatoacuterios que uma vez identificados poderatildeo
ser alvo para abordagens terapecircuticas com o objetivo de minimizar os efeitos
deleteacuterios da inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos PSI de corrida jovens Neste
contexto um dos mais potentes e versaacuteteis mediadores proacute inflamatoacuterios envolvidos
na inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas eacute o PAF (UHLIG et al 2005)
PAF eacute quimiotaacutetico para bem como produzido por eosinoacutefilos macroacutefagos e
neutroacutefilos em resposta a estresse fiacutesico ou quiacutemico apresentando muitos dos
criteacuterios essenciais de um mediador proacute inflamatoacuterio (OWEN et al 2005)
De fato estudos realizados in vitro demonstraram que o PAF pode induzir a
migraccedilatildeo de neutroacutefilos e monoacutecitos do cavalo (DAWSON et al 1988) Aleacutem disso
demonstrou-se a quimiotaxia de eosinoacutefilos e neutroacutefilos no trato respiratoacuterio de
murinos e humanos induzida por PAF (LEE et al 2002 ISHII et al 2004) Em
cavalos com ORVA a administraccedilatildeo intravenosa de PAF promoveu uma reduccedilatildeo de
leucoacutecitos no sangue perifeacuterico e apoacutes alguns minutos houve um aumento de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo seguido de uma deterioraccedilatildeo cliacutenica e da funccedilatildeo
respiratoacuteria (FAIRBAIRN et al 1996) Portanto apoiado nestes estudos e nos
resultados de aumento do NTCN e de neutrofilia e eosinofilia no LBA do grupo EX
(TABELA 6) eacute razoaacutevel assumir que o PAF possa contribuir para a induccedilatildeo da
inflamaccedilatildeo pulmonar observada nos potros PSI jovens em treinamento avaliados no
presente estudo
87
A inflamaccedilatildeo pulmonar tambeacutem estaacute associada a um aumento nas
concentraccedilotildees de proteiacutenas no LBA principalmente devido ao extravasamento de
plasma (TSANGARIS et al 2003) que pode ser resultado da accedilatildeo de vaacuterios
mediadores proacute inflamatoacuterios tal como o PAF
Um aumento da permeabilidade microvascular induzida pelo PAF resultando
em extravasamento de plasma e edema foi demonstrado previamente no estudo de
CLAVIJO et al (2001) Aleacutem disso WEST et al (1997) demonstraram o acuacutemulo de
um fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar de cavalos exercitados a velocidades
entre 13 ms e 16 ms No presente estudo o significativo aumento da concentraccedilatildeo
de proteiacutenas no LBA dos potros do grupo EX em comparaccedilatildeo ao grupo DA (FIGURA
21) confirma que a permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) estava
aumentada nos potros do grupo EX e o PAF pode estar envolvido neste mecanismo
Diferentemente o significativo aumento de proteiacutenas no LBA do grupo DA em
comparaccedilatildeo ao grupo CN deve envolver outros mecanismos inflamatoacuterios pois natildeo
houve biotavidade de PAF significativa no LBA destes dois grupos (FIGURA 19)
Contudo os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da disponibilidade de oacutexido niacutetrico (NO) (KIKUCHI et al
2008) Houve uma produccedilatildeo limitada de NO nas vias aeacutereas dos potros do grupo
EX esperada em cavalos realizando exerciacutecio moderado ou proacuteximo do maacuteximo
(MILLS e HIGGINS 1997) Isto pode ser explicado pela hipoxemia arterial induzida
pelo exerciacutecio (HAIE) descrita em atletas humanos (HOPKINS 2005) e em cavalos
exercitando a altas intensidades (MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
DEMPSEY e WAGNER 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005) A produccedilatildeo de NO requer
normoxia (GRIMMINGER et al 1995) sendo que a anoxia abole o relaxamento
vascular dependente do endoteacutelio e a hipoxemia degrada o NO (De MEY e
VANHOUTTE 1980) Adicionalmente ocorre uma inibiccedilatildeo do NO pela hemoglobina
sendo que esta inibiccedilatildeo eacute inversamente proporcional a saturaccedilatildeo de oxigecircnio
(IWAMOTO e MORIN 1993)
A inibiccedilatildeo da siacutentese de NO resultou no aumento da permeabilidade vascular
no estudo de KIKUCHI et al (2008) concordando com os nossos achados
referentes agrave bioatividade de PAF aumentada associada ao aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas e agrave diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de nitritos no LBA
do grupo EX
88
De fato no estudo de BRKOVIC e SIROIS (2007) o PAF e natildeo o NO foi
considerado o mediador proacute inflamatoacuterio e causador do aumento da permeabilidade
vascular enquanto o NO foi considerado como um co-fator para as atividades
inflamatoacuterias do PAF Na relaccedilatildeo entre PAF e NO na microcirculaccedilatildeo parece que
NO apresenta um efeito protetor atenuando as atividades inflamatoacuterias de PAF
tendo inclusive reduzido a formaccedilatildeo de PAF em vecircnulas mesenteacutericas em ratos
(NEVIN e BROADLEY 2002)
Contudo o NO tambeacutem tem papel preponderante na defesa das vias aeacutereas
(NEVIN e BROADLEY 2002 XU et al 2006) e o aumento na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA do grupo DA pode ser considerado uma resposta aos poluentes
ambientais existentes nas cocheira dos cavalos (WOODS et al 1993 BERNDT et
al 2008) Aleacutem disso o NO reage com o acircnion superoacutexido (O -2) para formar
peroxinitrito (ONOO-) um forte oxidante capaz de provocar lesatildeo no tecido pulmonar
resultando em peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (XU et al 2006)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi investigada no presente estudo atraveacutes da
concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA que resultou
aumentada no grupo DA em comparaccedilatildeo com o grupo CN (FIGURA 23) A
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi associada ao acuacutemulo de neutroacutefilos e produccedilatildeo de ROS por
esses nas vias aeacutereas de crianccedilas (BUSS et al 2000) e de pessoas com DPOC
(SANTUS et al 2005) Natildeo houve aumento de neutroacutefilos no LBA dos potros do
grupo DA mas os macroacutefagos alveolares dos potros deste grupo apresentaram
maior produccedilatildeo de ROS (FIGURAS 26 e 27) Isso pode ter contribuiacutedo para o
aumento da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA neste grupo como resultado da
modificaccedilatildeo da funcionalidade dos macroacutefagos alveolares induzida por fatores
ambientais como descrito em estudos em humanos (LUNDBORG et al 2007) e em
cavalos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento resultou em reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos lipiacutedicos no LBA em comparaccedilatildeo com o grupo DA No estudo de
MASTALOUDIS et al (2004) corredores de ultramaratona apresentaram aumento
da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica avaliada por marcadores do sangue destes atletas
Contudo outros relataram a reduccedilatildeo dos marcadores de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes
exerciacutecio intenso em corredores e esquiadores (URSO e CLARKSON 2003) em
indiviacuteduos treinados (BALOG et al 2006) em pessoas apoacutes 6 meses de
89
treinamento e tambeacutem apoacutes um programa de treinamento de 3 semanas (ALDRED
2007) e em pacientes com DPOC apoacutes programa de exerciacutecios (PINHO et al 2007)
Provavelmente essa diminuiccedilatildeo na peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA dos potros do
grupo EX deveu-se a mecanismos protetores pois o treinamento influencia de forma
positiva a capacidade antioxidante do organismo em atletas humanos (URSO e
CLARKSON 2003 PARK et al 2005 BALOG et al 2006 ALDRED 2007 PINHO
et al 2007) e em cavalos (KIRSCHVINK et al 2008)
URSO e CLARKSON (2003) relataram um aumento significativo da atividade
da catalase uma enzima antioxidante nos eritroacutecitos de atletas humanos apoacutes um
exerciacutecio de corrida de longa distacircncia corroborando com os nossos achados de
aumento significativo da atividade da catalase no LBA dos potros do grupo EX em
comparaccedilatildeo com o grupo DA (FIGURA 24)
No presente estudo a atividade de macroacutefago alveolar foi investigada devido
ao papel inerente desta ceacutelula na defesa pulmonar O aumento na atividade dos
macroacutefagos alveolares no grupo DA foi discutida acima e provavelmente deveu-se agrave
presenccedila de aeroalergenos e endotoxinas presentes nas cocheiras dos cavalos
(RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento reduziu tanto a fagocitose de macroacutefago
alveolar (FIGURA 25) como a capacidade de produccedilatildeo de ROS (acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio) (FIGURAS 26 e 27)
O macroacutefago alveolar eacute a ceacutelula efetora do sistema imune predominante nos
espaccedilos alveolares e nas vias aeacutereas condutoras responsaacutevel por ativar as
respostas inflamatoacuterias de forma suficiente a eliminar agentes agressores (PETERS-
GOLDEN 2004) Os macroacutefagos alveolares satildeo essenciais agrave sobrevivecircncia
devendo estar em harmonia com o sistema nervoso e endoacutecrino para responder a
estiacutemulos fisioloacutegicos bem como patoloacutegicos (GORDON 2007) sem exagerar na
resposta a fim de natildeo comprometer a troca gasosa (PETERS-GOLDEN 2004)
Apesar de KIZAKI et al (2008) terem demonstrado que o macroacutefago pode
sofrer uma adaptaccedilatildeo ao exerciacutecio melhorando sua funcionalidade os potros PSI
jovens em treinamento para corrida do grupo EX apresentaram supressatildeo da
imunidade especificamente a relacionada agrave resposta imune inata dos macroacutefagos
alveolares corroborando com estudos anteriores (HUSTON et al 1987 RAIDAL et
al 2000 RAIDAL et al 2001) que avaliaram o LBA de cavalos apoacutes exerciacutecio
90
realizado em esteira de alta velocidade e obtiveram resultados semelhantes aos
nossos
Outro aspecto ainda natildeo relatado em equinos mas demonstrado em
pessoas eacute que a melhora na atividade antioxidante induzida pelo exerciacutecio pode
resultar em diminuiccedilatildeo da atividade da NADPH oxidase na membrana dos
macroacutefagos consequumlentemente reduzindo a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio por essas ceacutelulas (PARK et al 2005) como observado no
grupo EX
Portanto a influencia do exerciacutecio sobre a funcionalidade das ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico como a observada nos macroacutefagos alveolares do grupo EX no
presente estudo explicaria a maior suscetibilidade apresentada por potros de corrida
sob treinamento intenso a infecccedilotildees respiratoacuterias (HINES et al 1996) Em
humanos o exerciacutecio intenso reduziu a capacidade de apresentaccedilatildeo de antiacutegeno
(CEDDIA e WOODS 1999) bem como a resistecircncia antiviral (DAVIS et al 1997) por
macroacutefagos O PMA (phorbol myristate acetate) utilizado nas avaliaccedilotildees da
atividade de macroacutefago alveolar (ver toacutepicos 4114 e 4115) teve como funccedilatildeo
estimular a NADPH oxidase a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
(DEKKER et al 2000 NAKAJIMA et al 2000) mimetizando o estiacutemulo provocado
por agentes infecciosos (JI 2008) Isto de fato ocorreu no grupo EX jaacute que os
macroacutefagos estimulados apresentaram aumento significativo na atividade
comparando-se aos macroacutefagos natildeo estimulados (FIGURAS 26 e 27) entretanto a
atividade ainda foi significativamente menor que no grupo DA evidenciando a
reduccedilatildeo na atividade de macroacutefagos induzida pelo exerciacutecio
Os efeitos do PMA sobre os macroacutefagos alveolares e sobre os PMNs do
sangue de equino podem ser apreciados no experimento de validaccedilatildeo da teacutecnica
de estudo da bioatividade de PAF (FIGURAS 13 a 18) A teacutecnica utilizada para o
estudo da bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos potros
empregando-se PMNs de equinos como ferramenta para se avaliar o influxo de Ca++
induzido por PAF foi ineacutedita em estudos em cavalos Anteriormente a mesma
avaliaccedilatildeo foi realizada utilizando-se PMNs de humanos (GRYNKIEWICZ et al 1985
MARATHE et al 2001) Anteriormente os PMNs de equinos foram empregados
com ecircxito no estudo da bioatividade de PAF em extrato lipiacutedico obtido a partir de
amostras de pulmatildeo de ratos no estudo da asma (MUEHLMANN et al 2009)
91
Portanto a validaccedilatildeo desta teacutecnica se fez necessaacuteria e importante para o
reconhecimento dos resultados obtidos para a bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos investigados No presente estudo o PAF
ativou os PMNs do sangue do cavalo assim como os macroacutefagos alveolares de
forma concentraccedilatildeo dependente Portanto o PAF tendo como uma de suas origens
o macroacutefago alveolar eacute capaz de modificar o comportamento de neutroacutefilos
sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos
neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a ORVA (MARR et al 2002)
As influecircncias exercidas pelo PAF na circulaccedilatildeo pulmonar permeabilidade
capilar pulmonar e na agregaccedilatildeo plaquetaacuteria estimulou o estudo da HPIE nos potros
avaliados no grupo EX Para tal o hemossideroacutefago no LBA foi escolhido como o
marcador da HPIE porque a colheita do LBA 24 horas apoacutes o exerciacutecio resultou que
a observaccedilatildeo endoscoacutepica de sangue na traqueacuteia bem como a contagem do
nuacutemero de eritroacutecitos no LBA natildeo fossem teacutecnicas diagnoacutesticas indicadas nesse
momento
A observaccedilatildeo do hemossideroacutefago no LBA mesmo se constituindo numa
forma confiaacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993) poderia natildeo servir
aos nossos propoacutesitos de identificar diferenccedilas em marcadores inflamatoacuterios e de
estresse oxidativo bem como na funcionalidade de macroacutefagos alveolares dentro
de um mesmo grupo ateacute entatildeo considerado homogecircneo Contudo o
hemossideroacutefago presente no LBA foi confirmado no presente estudo natildeo soacute como
um marcador confiaacutevel da HPIE como tambeacutem foi capaz de diferenciar subgrupos
significativamente distintos dentro do grupo EX
Interessantemente observou-se um percentual de HPIE (determinado pela
presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA) maior que o de inflamaccedilatildeo pulmonar (gt5
de neutroacutefilos eou gt1 de eosinoacutefilos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA)
Isso nos leva a pensar que a HPIE precede a inflamaccedilatildeo no pulmatildeo dos cavalos de
corrida tal como foi sugerido por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) mas que
requer outras investigaccedilotildees para excluir que o contraacuterio estivesse acontecendo isto
eacute um processo inflamatoacuterio em periacuteodo anterior do treinamento que pudesse ter
deixado alguma fragilidade pulmonar Possivelmente o estudo de potros PSI de
corrida tatildeo jovens e em iniacutecio de treinamento permitiu tal discussatildeo visto que se
considera que a HPIE acometa praticamente a totalidade dos cavalos PSI em
treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007)
92
A associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo jaacute foi demonstrada anteriormente
(McKANE et al 1993) e foi considerada como sendo significativa no estudo
epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) apesar dos mecanismos pelos quais
esta associaccedilatildeo ocorre ainda serem apresentados de forma hipoteacutetica como no
recente estudo de DERKSEN et al (2009)
No estudo de COUEumlTIL e DENICOLA (1999) cavalos de corrida com HPIE
apresentaram na avaliaccedilatildeo do LBA um aumento no NTCN associado agrave neutrofilia
De fato isto ocorreu no subgrupo HPIE pos e esses achados de citologia
demonstram que a HPIE esteve associada agrave inflamaccedilatildeo pulmonar nos potros do
subgrupo HPIE pos
Outro achado comum entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar eacute o aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA como observado no subgrupo HPIE pos em
comparaccedilatildeo com o grupo HPIE neg (FIGURA 29) evidenciando um aumento na
permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) no subgrupo HPIE pos
O acuacutemulo de fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar associado agrave
inflamaccedilatildeo pulmonar como demonstrado por TSANGARIS et al (2003) foi discutido
acima Contudo cavalos com HPIE exercitados a altas velocidades tambeacutem
apresentaram aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas no espaccedilo alveolar (WEST e
MATTHIEU-COSTELLO 1999)
Possivelmente o aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas associado agrave HPIE
possa ser devido ao aumento da pressatildeo transmural nos capilares pulmonares
resultando em falecircncia por estresse dos capilares como demonstrado por BIRKS et
al (1997) em cavalos exercitados nas mesmas velocidades que os potros avaliados
no presente estudo
Adicionalmente parece que a HPIE deflagrou um mecanismo inflamatoacuterio
causador de extravasamento de plasma no espaccedilo alveolar nos potros do subgrupo
HPIE pos e a bioatividade de PAF significativamente aumentada no subgrupo HPIE
pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (FIGURA 28) indica a participaccedilatildeo desse
mediador proacute inflamatoacuterio nesse evento
O extravasamento de plasma na microcirculaccedilatildeo pulmonar e a formaccedilatildeo de
edema pulmonar induzidos por PAF foram demonstrados anteriormente e jaacute
discutidos acima (EVANS et al 1987 CLAVIJO et al 2001) No caso da HPIE
provavelmente o PAF induza a formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular
atraveacutes da desorganizaccedilatildeo de proteiacutenas juncionais (JIANG et al 2008) Estes dados
93
concordam com a proposta de WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) de que a
altas pressotildees em capilares pulmonares ocorra a formaccedilatildeo de fendas nas junccedilotildees
entre as ceacutelulas endoteliais Desta forma as evidecircncias indicam que associado ao
evento mecacircnico na etiopatogenia da HPIE um evento inflamatoacuterio tambeacutem estaacute
presente o que representa um fator de risco para o agravamento do quadro
Adicionalmente os eventos inflamatoacuterios presentes na HPIE se constituem em
potencial aacuterea para investigaccedilotildees terapecircuticas visto que ainda natildeo se tem um
tratamento efetivo para a hemorragia pulmonar em cavalos atletas Recentemente
evidecircncias de que a suplementaccedilatildeo de cavalos atletas com aacutecidos graxos ocircmega-3
melhora a fluidez da membrana dos eritroacutecitos (PORTIER et al 2006) sugeriu que a
influecircncia beneacutefica na resposta inflamatoacuteria pulmonar pode reduzir os iacutendices HPIE
(ERICKSON et al 2007)
Portanto eacute razoaacutevel assumir um papel para o PAF na fisiopatologia da HPIE
pelas suas propriedades angiogecircnicas aleacutem de seus efeitos proacute inflamatoacuterios
(APONTE et al 2008) concordando com a hipoacutetese da patogecircnese da HPIE
proposta por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) onde a ruptura dos capilares
pulmonares resultaria em inflamaccedilatildeo sangramento e hemosiderose e
consequumlentemente a ocorrecircncia de angiogecircnese na circulaccedilatildeo bronquial e fibrose
agravando o quadro da HPIE
Adicionalmente ZHANG et al (2003) demonstraram que o aumento da
permeabilidade capilar induzido por PAF envolve a participaccedilatildeo de estresse
oxidativo visto que a enzima antioxidante superoacutexido dismutase (SOD) atenuou os
efeitos do PAF sobre o endoteacutelio De fato o grupo HPIE pos apresentou a
concentraccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos significativamente aumentada em comparaccedilatildeo
ao subgrupo HPIE neg sendo uma evidecircncia de estresse oxidativo no LBA dos
potros deste grupo possivelmente exacerbada pela alta quantidade de ferro da
hemossiderina presente no espaccedilo alveolar (DERSEN et al 2009)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica induz alteraccedilotildees patoloacutegicas no tecido pulmonar
destruindo pneumoacutecitos e ceacutelulas endoteliais do epiteacutelio levando a um aumento da
permeabilidade microvascular inibe a siacutentese e a liberaccedilatildeo de surfactante e interfere
negativamente na atividade do NO O conjunto dessas accedilotildees dos peroacutexidos lipiacutedicos
no pulmatildeo resulta em dano da estrutura pulmonar e leva agrave hipertensatildeo
representando um fator adicional contribuindo para a patogenia da HPIE (MILLS e
HIGGINS 1997)
94
Os macroacutefagos alveolares como ceacutelulas orquestradoras da resposta imune
pulmonar (PETERS-GOLDEN 2004) devem possuir um importante papel na
patogenia da HPIE visto que a obtenccedilatildeo de subgrupos significativamente distintos
a partir do grupo EX no presente estudo se deu pela presenccedila ou ausecircncia de
hemossideroacutefagos THACKER (2006) descreveu que os macroacutefagos ativados
secretam interleucina-1 (IL-1) que atrai e ativa a proliferaccedilatildeo de fibroblastos e a
siacutentese de colaacutegeno para reparar o tecido danificado Em estudo histopatoloacutegico do
pulmatildeo de cavalos com HPIE as aacutereas de ocorrecircncia de hemorragia caracterizaram-
se por hemossiderose e fibrose (DERKSEN et al 2009)
Adicionalmente WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) sugeriram o
envolvimento de leucotrieno B4 (LTB4) no mecanismo inflamatoacuterio envolvido na
HPIE apesar deste mecanismo ainda requerer comprovaccedilatildeo Neste evento a
ruptura do epiteacutelio alveolar com a exposiccedilatildeo da membrana ativaria os macroacutefagos
alveolares os quais satildeo ricos em LTB4
O LTB4 por sua vez tambeacutem conecta o PAF agrave HPIE HOPKINS et al (1997)
estudaram a HPIE em humanos avaliando o LBA de seis ciclistas de elite apoacutes 4 km
de esforccedilo maacuteximo Comparados aos controles os ciclistas que realizaram o esforccedilo
apresentaram altas concentraccedilotildees de eritroacutecitos proteiacutenas e LTB4 no LBA No
estudo citado exceto pelo aumento da LTB4 natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
percentual de neutroacutefilos e nem nos niacuteveis de IL-8 e TNF-α entre os grupos
suportando a hipoacutetese do estresse mecacircnico alterando a BAC na HPIE segundo a
conclusatildeo dos autores Contudo a associaccedilatildeo entre LTB4 e PAF foi demonstrada
anteriormente onde o receptor de LTB4 esteve envolvido com a quimiotaxia
pulmonar e degranulaccedilatildeo de neutroacutefilos induzida por PAF (GAUDREAULT et al
2005) Todavia ateacute o momento este tipo de associaccedilatildeo natildeo foi demonstrada em
cavalos apesar de ter-se relatada a neutrofilia nas vias aeacutereas de cavalos com
ORVA mediada por LTB4 (LINDBERG et al 2004) Portanto reunindo as
informaccedilotildees acima pode-se assumir a hipoacutetese de que a neutrofilia no LBA e o
aumento da permeabilidade da BAC nos potros do subgrupo HPIE pos tenha sido
induzida por PAF e mediada por receptor de LTB4
Adicionalmente reforccedila-se a evidecircncia da importacircncia dos macroacutefagos
alveolares na HPIE e por sua vez como a hemorragia pulmonar pode influenciar a
funcionalidade dos macroacutefagos Na primeira etapa do presente estudo descrevemos
a reduccedilatildeo na fagocitose e na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de
95
hidrogecircnio pelos macroacutefagos alveolares do grupo EX (FIGURAS 25 a 27) Contudo
evidenciamos que a HPIE agravou ainda mais esta situaccedilatildeo (FIGURAS 32 e 33)
pois a resposta de macroacutefago alveolar esteve significativamente reduzida no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg
A reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no subgrupo HPIE pos pode ser
explicada novamente pela HAIE com consequumlente inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO
(MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
favorecendo o aumento da permeabilidade capilar (KIKUCHI et al 2008)
provavelmente agravado pela ocorrecircncia de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica neste grupo (MILLS
e HIGGINS 1997)
Os mecanismos pelos quais o NO modula a permeabilidade microvascular
natildeo satildeo bem conhecidos Em cavalos de PSI de corrida a inibiccedilatildeo da NOS pela
administraccedilatildeo de L-NAME agravou a HPIE enquanto natildeo alterou a pressatildeo arterial
pulmonar (KINDIG et al 2000) e a inalaccedilatildeo de NO durante o exerciacutecio reduziu
ligeiramente a pressatildeo arterial pulmonar enquanto tambeacutem causou agravamento da
HPIE (KINDIG et al 2001) Parece que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete
em parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou mas agravou a HPIE
Adicionalmente corroborando com o aumento da bioatividade de PAF e
reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos o estudo de
KWASNIEWSKI et al (2008) com um modelo de lesatildeo e hemorragia em intestino
delgado demonstrou que o preacute tratamento com antagonista de PAF reduziu as
lesotildees enquanto a inibiccedilatildeo do NO endoacutegeno aumentou consideravelmente as
lesotildees hemorraacutegicas e a mortalidade Portanto o estudo citado demonstrou a
existecircncia da relaccedilatildeo entre PAF e NO na hemorragia ocorrida na microcirculaccedilatildeo
assim como reafirma o papel protetor do NO para os efeitos proacute inflamatoacuterios do
PAF (NEVIN e BROADLEY 2002 BRKOVIC e SIROIS 2007)
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
A hipoacutetese do presente estudo foi confirmada pois tanto o desafio ambiental
como o exerciacutecio causaram alteraccedilotildees no fluido broncoalveolar e modificaram a
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar Potros PSI de corrida jovem em treinamento para
corrida apresentaram depressatildeo da resposta imune inata mais especificamente do
macroacutefago alveolar induzida pelo exerciacutecio e agravada pela ocorrecircncia da HPIE
PAF influencia os neutroacutefilos do sangue bem como os macroacutefagos alveolares
de equinos e no presente estudo esteve presente na inflamaccedilatildeo pulmonar induzida
pelo exerciacutecio nos potros PSI durante o treinamento para corrida
Os achados relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e ao aumento da
bioatividade de PAF no fluido broncoalveolar dos potros exercitados estiveram
relacionados agrave HPIE e agrave presenccedila dos hemossideroacutefagos no LBA o que resultou
numa resposta de macroacutefago alveolar ainda mais reduzida
Desta forma assume-se que os resultados obtidos para o grupo EX podem
ser extrapolados para as populaccedilotildees similares de cavalos PSI jovens em
treinamento para a corrida
Finalmente sugere-se a conduccedilatildeo de novos estudos para o entendimento
dos mecanismos inflamatoacuterios envolvidos na HPIE bem como o papel do PAF neste
processo
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PEDRO VICENTE MICHELOTTO JUacuteNIOR
EFEITOS DO DESAFIO AMBIENTAL E DO EXERCIacuteCIO NA FUNCIONALIDADE
DOS MACROacuteFAGOS DO LAVADO BRONCOALVEOLAR DE CAVALOS PURO
SANGUE INGLEcircS DE CORRIDA
Tese apresentada ao Curso de Poacutes-
Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular
aacuterea de concentraccedilatildeo Fisiologia Setor de
Ciecircncias Bioloacutegicas Universidade Federal do
Paranaacute como requisito parcial agrave obtenccedilatildeo do
tiacutetulo de Doutor em Fisiologia
Orientadora Profa Dra Anita Nishiyama
CURITIBA
2010
A mente que se abre a uma nova ideacuteia
jamais voltaraacute ao seu tamanho
original
Albert Einstein
Obrigado Senhor por na dificuldade
carregar-me no colo pela Sua
presenccedila constante mesmo nos
momentos mais tranquumlilos e por
conceder-me mais esta benccedilatildeo
DEDICATOacuteRIA
Este trabalho eacute dedicado agrave minha esposa Ana
Luacutecia e aos meus filhos Joatildeo Pedro e
Bernardo com todo o meu amor
Aos cavalos por me ensinarem tanto
AGRADECIMENTOS
A Deus por permitir-me concluir mais esta etapa em minha vida
A minha esposa Ana Luacutecia e meus filhos Joatildeo Pedro e Bernardo que estiveram ao
meu lado desde o iniacutecio desta jornada souberam me dar tranquumlilidade e muito amor aleacutem de levarem pizza no laboratoacuterio nos dias de experimento
Aos meus pais Pedro Maria Luis e Zelma pelos exemplos que vocecircs satildeo e por todo o amor e apoio em todos os momentos
Aos meus irmatildeos Marcus e Andreacute cunhados Cristine Dani e Luiz Gustavo sobrinhas Mariana e Juacutelia pela amizade e torcida
A minha orientadora Profa Dra Anita Nishiyama sobretudo pela amizade e incentivo sendo orientadora nos momentos certos sempre com muita competecircncia
Aos meus colegas meacutedicos veterinaacuterios e amigos Alessandro Mercadante Daniel Mendes Campos Fernando Perche e Luis Henrique Costa pelo apoio prestado na execuccedilatildeo deste trabalho permitindo a avaliaccedilatildeo de potros sob sua
responsabilidade
Aos estabelecimentos que me apoiaram e suas equipes de funcionaacuterios sempre
prestativos Haras Belmont Haras Cifra Haras Santa Rita da Serra Haras dos Girassoacuteis Haras Palmerini Haras Santareacuten
Aos treinadores que me apoiaram permitindo a avaliaccedilatildeo dos potros sob sua responsabilidade extensivo agraves suas respectivas equipes de funcionaacuterios Fernando Azevecircdo Beto Feltran Gladston Santos J Ceacutesar A A Farias Marcus Lanza
Agrave incansaacutevel equipe de colheitas de lavado broncoalveolar que em momento algum deixou de madrugar nos 22 experimentos conduzidos Lorena Andrade da Cruz
Renata Schaefer Liacutevia Medalha Arauacutejo Amine do Vale Meira Fabiana Tieme da Silva Mariana Muumlller da Silva Aline Bonfaacute Richard
A maravilhosa equipe da qual tive a felicidade de conhecer e trabalhar Luis Alexandre Muehlmann MS Fernanda Ceccon Grando MS Ana Luacutecia Zanatta Carolina Farias Gabriela Rubbo Eloyse Bieberbach Ana Claacuteudia e Victor Vocecircs
me deram a amizade e o prazer de trabalhar com vocecircs me ensinaram muito e valorizaram o verdadeiro sentido de equipe com simplicidade determinaccedilatildeo e muita competecircncia
Aos amigos do Laboratoacuterio de Metabolismo Celular da UFPR companheiros de poacutes-graduaccedilatildeo de duacutevidas de buscas pelas respostas de risadas e de conquistas
muito obrigado pela amizade ajuda e muita paciecircncia Fabiacuteola Eacuteverson Ricardo Carine Loli Sandro Gleisson Marcelo Jaison Isabela Diogo Paulo Dalton Gina Daniele Pequito
Ao Prof Dr Luiz Claacuteudio Fernandes pela inestimaacutevel oportunidade de poder
trabalhar no seu laboratoacuterio disponibilizando material necessaacuterio e seu tempo quando o solicitei
A minha amiga e soacutecia meacutedica veterinaacuteria MS Cassiana Maria Garcez Ramos
Aos meus amigos da Direccedilatildeo do Curso de Medicina Veterinaacuteria da PUCPR Profa
Dra Claacuteudia Turra Pimpatildeo e Prof Rodrigo Taacutevora Mira por todo o apoio incentivo e amizade incondicionais
Aos amigos professores da PUCPR Rita M Rocha Denise Kozemjakin Antonia Maria Marconi Farias pelo apoio
Ao Decano do Centro de Ciecircncias Agraacuterias e Ambientais da PUCPR Prof Dr Sylvio Peacutellico Neto pelo apoio e incentivo
Ao Professor Metry Bacila por tantos exemplos demonstrados e por nunca haver se omitido em ajudar e entusiasmar
As bibliotecaacuterias da UFPR pela ajuda e tambeacutem da PUCPR Lucieli e Teresinha e equipe
A amiga Monica Echeverria pela amizade e apoio no inglecircs nesta e em muitas outras oportunidades Thank you
Ao Laboratoacuterio Fort Dodge pelo apoio me fornecendo os sedativos e pela dedicaccedilatildeo dos competentes profissionais Alessandra Carol e Leonardo que sempre estiveram dispostos a ajudar
Ao amigo Nilton Reis companheiro de trabalho na Unidade Hospitalar para Equinos da PUCPR pelo apoio
Aos amigos do Regimento de Poliacutecia Montada Coronel Dulciacutedio pela amizade e apoio durante esta etapa Coronel Heraldo Reacutegis Boacuterio da Silva Major Lorival da
Cunha Sobrinho Major Maacutercio Luis Fonseca Capitatildeo Adilar Marcelo de Lima e agrave equipe do Centro Veterinaacuterio da PMPR Sargento Faacutetima Sd Manasseacutes e demais amigos
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS IX
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES XI
LISTA DE TABELAS XV
RESUMO XVI
ABSTRACT XVII
1 INTRODUCcedilAtildeO 18
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 18
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA) 18
13 PAF E VIAS AEacuteREAS 23
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 27
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO 29
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE) 34
2 OBJETIVOS 40
21 OBJETIVOS GERAIS 40
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS 41
31 REAGENTES E SEDATIVOS 41
32 ANIMAIS 41
33 ASPECTOS EacuteTICOS43
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA 43
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS 43
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) 45
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA46
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957) 47
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS 48
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE CA++
EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE ET AL 2001) 48
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)51
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR E MARLETTA 1985) 51
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA
(NOUROOZ-ZADEH ET AL 1994)52
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984) 53
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA ET AL 1998) 54
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA ET AL 1998) 54
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK E MIZEL 1981) 55
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN E GORDON 1987) 56
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 57
4 RESULTADOS 59
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO 59
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica59
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas 60
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT) 61
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA) 62
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem Diferencial de Ceacutelulas do LBA 62
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF 63
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF 65
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 67
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 68
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 69
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 70
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA 71
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 72
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar 73
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 74
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO 75
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA 75
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 76
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 77
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 78
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 79
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 80
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-) 80
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 81
5 DISCUSSAtildeO 83
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 96
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 97
LISTA DE ABREVIATURAS
ACVIM American College of Veterinary Internal Medicine
AT Aspirado traqueal
CN Grupo Condiccedilotildees Naturais
DA Grupo Desafio Ambiental
DIVA Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas
DIVAI Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
DPOC Doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica
EX Grupo Exerciacutecio
HAIE Hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio
HPIE Hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
HRPO Horse radish peroxidase
IFN-γ Interferon gama
IL-1 Interleucina-1
IL-4 Interleucina-4
IL-8 Interleucina-8
IL-9 Interleucina-9
IL-17 Interleucina-17
LBA Lavado broncoalveolar
L-NAME N-nitro-L-arginina metil ester
LTB4 Leucotrieno B4
LTE8 Leucotrieno E8
MLCP Myosin light chain phophatase
NO Oacutexido niacutetrico
NOS Oacutexido niacutetrico sintase
NTCN Nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas
ORVA Obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas
PAF Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PAF-AH Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria acetilhidrolase
PAF-R Receptor de fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PBS Soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada
PMA Phorbol myristate acetate
PMN Polimorfonuclear
PRS Phenol red solution
PSI Puro sangue inglecircs
RNS Espeacutecie reativa do nitrogecircnio
ROS Espeacutecie reativa do oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Th2 Linfoacutecitos T helper 2
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE 20
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO SN-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL 24
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM
RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS 25
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E
SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE 30
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA
ASMA 31
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS 32
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO
A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR
(BAC) 36
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO
DERSKEN et al (2009) 38
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA
FARINGE 44
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS
ARITENOacuteIDES DE I A IV 44
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME
ENDOSCOacutePICO 45
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO
DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO
REGISTRADA A 510 nm 50
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA
ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 57
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA
AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 63
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS
DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 64
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO
ANTAGONISTA DE PAF BN52021 64
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO
ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 65
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 66
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR
PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 66
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++
EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 67
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO
EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA
ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 68
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A
PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 69
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO
SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 70
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX
(n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA 71
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) 72
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) 73
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) 74
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) 75
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) HPIE NEG (n=5) e EX NORMAL (n=4) 76
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE
POS (n=13) HPIE NEG (n=12) E EX NORMAL (n=8) 77
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) HPIE NEG (n=10) E EX NORMAL (n=7) 79
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) HPIE NEG (n=8) E EX NORMAL (n=5) 80
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS
POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) HPIE NEG (n=5) E EX NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE
POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 81
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE
PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) HPIE NEG (n=6) E EX
NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2
ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 82
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS
TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE
INGLEcircS DE CORRIDA 59
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGIANOS
OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS
DE I A IV 60
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS
CARTILAGENS ARITENOacuteIDES 60
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA
ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO
SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE
AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 61
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS
CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN
(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS
DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN
(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM
PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO
LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX E DOS
SUBGRUPOS HPIE POS HPIE NEG E EX NORMAL 76
RESUMO
A doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas (DIVA) e a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) satildeo comuns em cavalos de corrida resultando em interrupccedilatildeo no treinamento A hipoacutetese do presente estudo foi de que o ambiente e o exerciacutecio
causam estresse oxidativo produccedilatildeo do fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF) e inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas de potros PSI de corrida e que haacute uma relaccedilatildeo entre a DIVA e a HPIE Estudou-se potros PSI em ambiente natural (NC n=45) estabulados
por 30 dias (DA n=40) e treinados (EX n=34) Apoacutes os potros do grupo EX foram divididos em trecircs subgrupos HPIE pos (presenccedila de hemossideroacutefagos no lavado broncoalveolar - LBA) HPIE neg (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA) e EX
normal (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA e menos de 5 de neutroacutefilos e menos de 1 de eosinoacutefilos no LBA) Avaliou-se perfil citoloacutegico e paracircmetros do LBA relacionados a estresse oxidativo bioatividade de PAF atividade da catalase e
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar (MA) Os percentuais de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no LBA do grupo EX foram maiores (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 e 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectivamente) que os limites superiores para cavalos normais
(5 para neutroacutefilos e 1 para eosinoacutefilos) juntamente com um maior nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 ceacutelulasmicroL de LBA P=0017) evidenciaram a ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo pulmonar A bioatividade de PAF e a
concentraccedilatildeo de proteiacutenas no LBA foram maiores no grupo EX (relaccedilatildeo 340380 nm 0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg de proteiacutenasmL de LBA Plt0001) A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos no LBA foi maior
no grupo DA (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg de proteiacutenas Plt0001) e a atividade da catalase foi maior no grupo EX (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg de proteiacutenas P=0002) A fagocitose de MA (P=0006) bem como a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido (Plt0001) e peroacutexido de hidrogecircnio (P=0006) foram
significativamente menores no grupo EX Vinte e trecircs (622) potros do grupo EX foram HPIE pos e o LBA desse subgrupo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutenas (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) bioatividade de
PAF (relaccedilatildeo 340380 nm 0180 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 P=0042) e concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) significativamente maiores que o subgrupo HPIE neg A concentraccedilatildeo de nitritos
(008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) e a atividade de MA foi menor em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg O ambiente e o exerciacutecio modificaram o fluido broncoalveolar confirmando a hipoacutetese do presente estudo
Houve aumento da resposta de MA induzida pelo ambiente enquanto o exerciacutecio fiacutesico resultou em HPIE inflamaccedilatildeo pulmonar e diminuiccedilatildeo na resposta imune inata relacionada aos macroacutefagos alveolares nos potros PSI jovens durante o treinamento
para corrida e o PAF esteve presente nesse processo Sugere-se a conduccedilatildeo de novas investigaccedilotildees para elucidar os mecanismos inflamatoacuterios da HPIE bem como o papel do PAF neste processo como um potencial alvo terapecircutico
Palavras-chave cavalo fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria hemorragia pulmonar inflamaccedilatildeo pulmonar fluido broncoalveolar
ABSTRACT
Inflammatory airway disease (IAD) and exercise-induced pulmonary hemorrhage (EIPH) are common in racehorses during training being important ailments interrupting training of thoroughbred racehorses The present study hypothesis was
that stabling and exercise cause oxidative stress release of platelet-activating factor (PAF) and inflammation in airways of Thoroughbred colts and that there is an association between IAD and EIPH The subjects were colts in breeding farms (NC
n=45) stabled for 30 days (EC n=40) and race trained (EX n=34) Colts of the EX group were subdivided into three subgroups EIPH pos (presence of hemosiderophages in BALF) EIPH neg (absence of hemosiderophages in BALF)
and Normal EX (absence of hemosiderophages and less than 5 neutrophils and 1 eosinophils in BALF) Cytological profile and parameters of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) related to oxidative stress bioactivity of the pro-inflammatory
mediator PAF catalase activity and alveolar macrophage (AM) activity were studied Percentages of neutrophils and eosinophils in the BALF of the EX group were higher (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 and 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectively)
than the upper limits for normal horses (5 of neutrophils and 1 of eosinophils) that associated with a significantly higher total nucleated cell count (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 cellsmicroL of BALF P=0017) displayed pulmonary inflammation PAF
bioactivity and the total protein concentration in the BALF were higher in the EX group (0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 340380nm ratio P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg of proteinsmL of BALF Plt0001) Concentration of BALF hydroperoxides
was higher in the EC group (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg of proteins Plt0001) and catalase activity was higher in the EX group (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg of proteins P=0002) AM phagocytosis (P=0006) as well as production of superoxide anion (Plt0001) and hydrogen peroxide (P=0006) were
significantly lower in EX group Twenty three (622) colts of the EX group were EIPH pos and the BALF of this subgroup presented a significantly higher protein concentration (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg of proteinsmL of BALF P=0031) PAF
bioactivity (018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 340380 nm ratio P=0042) and lipid hydroperoxide concentration (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg of proteins P=0009) as well as lower nitrite concentration (008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007
absorbance 550 nm P=0049) and AM activity than EIPH neg subgroup Environment and exercise modified the bronchoalveolar fluid confirming the hypothesis of the present study Environment increased AM response as exercise resulted in EIPH
pulmonary inflammation and decreased innate immune response of alveolar macrophages in young Thoroughbred horses during race training and PAF participated in this event Further studies should be conducted to better understand
the inflammatory mechanisms of EIPH and the role of PAF in this process as a potential therapeutic target
Keywords horse platelet-activating factor pulmonary hemorrhage pulmonary
inflammation bronchoalveolar fluid
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
As doenccedilas respiratoacuterias satildeo comuns nos cavalos e as condiccedilotildees a que
estatildeo sujeitos fazem com que a inflamaccedilatildeo seja uma manifestaccedilatildeo frequumlente dessas
afecccedilotildees O epiteacutelio das vias aeacutereas superiores e dos pulmotildees estatildeo expostos a
patoacutegenos invasores e fatores ambientais Portanto o conhecimento dos
mecanismos da resposta inflamatoacuteria nas vias aeacutereas se faz importante a fim de se
estabelecer estrateacutegias para reduzir o impacto e os danos causados (THACKER
2006)
A inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apresenta um agravante o papel dos pulmotildees
na troca gasosa Assim as quatro principais consequumlecircncias de um processo
inflamatoacuterio desencadeado nas vias aeacutereas incluem vasodilataccedilatildeo e a reduccedilatildeo no
fluxo sanguiacuteneo resultando em capilares ingurgitados o aumento da permeabilidade
capilar permitindo a passagem de fluiacutedo e ceacutelulas para os tecidos o influxo e
acuacutemulo de fagoacutecitos e ceacutelulas ativadas no local e a bronconstricccedilatildeo (LUNN et al
2007)
O estudo das doenccedilas respiratoacuterias em cavalos eacute relevante particularmente
nos cavalos jovens de corrida onde a taxa de inflamaccedilatildeo detectada nas vias aeacutereas
eacute significativa (CHRISTLEY e RUSH 2007)
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA)
Os termos ldquodoenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereasrdquo (DIVA) e ldquodoenccedila
inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferioresrdquo (DIVAI) tecircm sido usados para descrever uma
siacutendrome inflamatoacuteria do trato respiratoacuterio de cavalos de corrida (CHRISTLEY e
RUSH 2007)
Tem-se relatado que a DIVA ocorre em 11 a 50 dos cavalos de corrida em
treinamento chegando a afetar ateacute 80 dos cavalos de corrida de dois anos de
idade (CHRISTLEY e RUSH 2007) MALIKIDES (2003) estudou a prevalecircncia da
DIVA em cavalos de corrida na Austraacutelia evidenciando que 41 deles apresentaram
inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apoacutes duas semanas de iniciarem treinamento
19
A DIVA eacute considerada a segunda afecccedilatildeo mais comum a interromper o
treinamento para corridas (WILSHER et al 2006) podendo resultar em prejuiacutezos a
troca gasosa e diminuiccedilatildeo da capacidade atleacutetica (COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005)
Cavalos com DIVA ou com hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) apresentaram uma maior hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE)
(CHRISTLEY et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
(FIGURA 1)
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE EIPH HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO IAD DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS UAO OBSTRUCcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS SUPERIORES FONTE SAacuteNCHEZ et al (2005)
Cavalos trotadores de corrida diagnosticados com DIVA tiveram a mecacircnica
pulmonar (volume corrente frequumlecircncia respiratoacuteria ventilaccedilatildeo pulmonar duraccedilatildeo da
inspiraccedilatildeo e da expiraccedilatildeo complacecircncia dinacircmica) alterada apresentaram um
significativo aumento da carga ventilatoacuteria e da energia requerida para a respiraccedilatildeo
sofrendo restriccedilotildees em seu rendimento atleacutetico (PIRRONE et al 2007)
Contudo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas dos cavalos atletas natildeo eacute entendida
por completo especialmente pela falta de consistecircncia e precisatildeo na definiccedilatildeo
dessa siacutendrome (CHRISTLEY e RUSH 2007)
Recentemente um painel de discussatildeo promovido pelo American College of
Veterinary Internal Medicine (ACVIM) definiu que a DIVA pode ocorrer em cavalos
de qualquer idade e eacute caracterizada pelo seguinte fenoacutetipo (COUEumlTIL et al 2007)
20
- Baixo rendimento desportivo intoleracircncia ao exerciacutecio
- Tosse com ou sem quantidade excessiva de muco traqueal
- Inflamaccedilatildeo natildeo seacuteptica detectada pela avaliaccedilatildeo citoloacutegica do fluido do LBA
ou disfunccedilatildeo pulmonar baseada em evidecircncia de obstruccedilatildeo de vias aeacutereas
inferiores hiperresponsividade das vias aeacutereas ou prejuiacutezo a troca gasosa durante o
repouso ou exerciacutecio
Este painel formado por experts e pesquisadores da aacuterea propocircs tambeacutem
alguns fatores de exclusatildeo para a DIVA
- Evidecircncia de sinais sistecircmicos de infecccedilatildeo (febre alteraccedilotildees hematoloacutegicas
compatiacuteveis com infecccedilatildeo)
- Aumento do esforccedilo respiratoacuterio durante o repouso
A etiopatogenia da DIVA eacute pouco definida Acredita-se que uma variedade de
fatores de risco estejam envolvidos variando nas diferentes populaccedilotildees de cavalos
baseado na alimentaccedilatildeo manejo praacuteticas preventivas distribuiccedilatildeo de agentes
infecciosos e influecircncias geneacuteticas (COUEumlTIL et al 2007)
Alguns autores encontraram uma reduccedilatildeo da incidecircncia desta afecccedilatildeo em
cavalos mais velhos (BURRELL et al 1996 CHAPMAN et al 2000 CHRISTLEY et
al 2001 WOOD et al 2005) sendo que a idade natildeo provocou diferenccedila no estudo
de McKANE et al (1993)
O ambiente da cocheira representa um risco adicional para a DIVA nos
cavalos (BURRELL et al 1996 HOLCOMBE et al2001 CLEMENTS e PIRIE
2007 BERNDT et al 2008) bem como para a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas das
pessoas envolvidas no trabalho com os cavalos (ELFMAN et al 2009)
HOLCOMBE et al (2001) associaram o manejo de estabulaccedilatildeo com a
ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas inferiores Estudaram 14 potros aacuterabes
que foram transferidos da pastagem para cocheiras com cama de palha Apoacutes 90
dias de estabulados houve um aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no
lavado broncoalveolar (LBA) Cavalos estabulados em cama de palha tambeacutem
apresentaram maior chance de apresentar DIVA em outros estudos (BURRELL et
al 1996 WOODS et al 1993)
No entanto em cavalos de montaria no estado norte-americano de Michigan
foi a permanecircncia em piquetes durante o inverno que esteve associado com
aumento do acuacutemulo de muco traqueal com maior nuacutemero de neutroacutefilos Neste
21
estudo a alimentaccedilatildeo com feno tambeacutem representou risco para a ocorrecircncia de
inflamaccedilatildeo (ROBINSON et al 2006)
Contudo o ambiente de cocheiras em modelos convencionais de manejo aos
quais os cavalos em treinamento estatildeo submetidos reconhecidamente apresenta
riscos para as vias aeacutereas Nestes haacute aumento nas concentraccedilotildees de partiacuteculas
inalaacuteveis contendo partiacuteculas orgacircnicas e inorgacircnicas incluindo endotoxinas β-D-
glucan partiacuteculas ultra finas (lt100 nm de diacircmetro) microorganismos esporos de
fungos material vegetal poeira inorgacircnica e gases toacutexicos (COUEumlTIL et al 2007)
Recentemente no estudo de BERNDT et al (2008) se demonstrou que o ambiente
de cocheira apresenta uma concentraccedilatildeo de endotoxinas 8 vezes maior que nos
piquetes
Aleacutem disso haacute muito jaacute foi descrita a presenccedila de actinomicetos termofiacutelicos
como a Micropolyspora faeni nos fenos fornecidos aos cavalos capazes de serem
inalados atingindo as vias aeacutereas inferiores (McPHERSON e THOMSON 1983)
Assim a praacutetica de encharcar o feno antes da administraccedilatildeo para diminuir a
quantidade de poeira disponiacutevel resultou em benefiacutecio agraves vias aeacutereas dos cavalos
(CLEMENTS e PIRIE 2007)
Por outro lado a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA ainda
natildeo estaacute bem esclarecida Cavalos com sinais cliacutenicos de inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas apresentaram maior frequecircncia de isolados bacterianos nos estudos de
CHRISTLEY et al (2001) e WOOD et al (2005) apesar de o painel do ACVIM
entender que a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA precisa ser
melhor estudada (COUEumlTIL et al 2007)
O exerciacutecio tambeacutem tem sido associado agrave inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas
inferiores dos cavalos atletas (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) A prevalecircncia da DIVA eacute maior em cavalos em treinamento
que em cavalos do mesmo grupo mas sem treinamento talvez pela inalaccedilatildeo de
maiores quantidades de partiacuteculas pela exposiccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores ao ar
frio ou pela ocorrecircncia da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (DAVIS et
al 2006 CHRISTLEY e RUSH 2007)
O diagnoacutestico da DIVA inclui a histoacuteria e o exame fiacutesico detalhados para a
identificaccedilatildeo de potenciais fatores etioloacutegicos A tosse durante o exerciacutecio ou
durante a alimentaccedilatildeo constitui a queixa mais comum (CHRISTLEY e RUSH 2007)
esteve associada agrave presenccedila de quantidades aumentadas de secreccedilatildeo traqueal bem
22
como a um maior percentual de neutroacutefilos tanto na secreccedilatildeo traqueal (CHRISTLEY
et al 2001) como no LBA (BENEDICE et al 2008) mas sua ausecircncia natildeo descarta
o diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
A presenccedila de descarga nasal mucopurulenta eacute achado comum em cavalos
de corrida de dois anos de idade sendo menos comum em cavalos mais velhos
Sua relaccedilatildeo com a DIVA todavia natildeo eacute sabida (COUEumlTIL et al 2007)
A auscultaccedilatildeo toraacutecica durante o repouso raramente evidencia alteraccedilotildees em
cavalos atletas com inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores (MAZAN e HOFFMAN
2003 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007) sendo necessaacuteria a
utilizaccedilatildeo de uma sacola para o cavalo respirar no seu interior ampliando o esforccedilo
respiratoacuterio (bdquorebreathing bagrsquo) podendo tornar audiacuteveis alguns sons anormais em
certos casos (MAZAN e HOFFMAN 2003 COUEumlTIL et al 2007)
MAZAN e HOFFMAN (2003) relataram que os testes de funccedilatildeo pulmonar
como o pneumotacoacutegrafo e o teste de broncoprovocaccedilatildeo com histamina podem
auxiliar tornando o diagnoacutestico da DIVA definitivo Contudo o diagnoacutestico precoce
da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores deve enfatizar a avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA
e natildeo os testes de funccedilatildeo pulmonar (COUEumlTIL et al 2007)
A avaliaccedilatildeo citoloacutegica do AT tambeacutem tem contribuido ao diagnoacutestico dos
processos inflamatoacuterios das vias aeacutereas contudo natildeo eacute considerado suficiente para
o diagnoacutestico da DIVA Isto se deve a falta de concordacircncia entre os achados
citoloacutegicos do AT e do LBA e da falta de estudos associando os achados no AT e o
rendimento atleacutetico (HODGSON e HODGSON 2003 HUGHES et al 2003
COUEumlTIL et al 2007) Ainda um cuidado a ser levado em conta quando da
realizaccedilatildeo de AT eacute o tempo da colheita jaacute que a realizaccedilatildeo de exerciacutecio
esteneuante pode aumentar o percentual de neutroacutefilos na amostra obtida
(MALIKIDES et al 2007)
O LBA por sua vez eacute o meacutetodo para a obtenccedilatildeo de amostras de ceacutelulas
presentes nas vias aeacutereas mais distais e espaccedilo alveolar (HOFFMAN 1999
FERNANDES et al 2000 LESSA et al 2005) considerado como uma bioacutepsia
liacutequida (MAZAN e HOFFMAN 2003) sendo a teacutecnica de avaliaccedilatildeo citoloacutegica
preferida para o diangoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
Um aumento no percentual de ceacutelulas inflamatoacuterias no fluido do LBA eacute um dos
principais criteacuterios diagnoacutesticos para a DIVA Usualmente ocorre uma predominacircncia
de neutroacutefilos mas tambeacutem pode ocorrer aumento nos nuacutemeros percentuais de
23
eosinoacutefilos linfoacutecitos e mastoacutecitos normalmente associados com diminuiccedilatildeo no
rendimento desportivo e hiperresponsividade das vias aeacutereas (McKANE et al 1993
HARE e VIEL 1998 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007)
O perfil citoloacutegico de LBA mais comumente encontrado em cavalos com DIVA
eacute caracterizado por aumento no nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (NTCN) com
discreta neutrofilia (gt5) linfocitose e monocitose Tambeacutem pode ser encontrado
um aumento do nuacutemero percentual de eosinoacutefilos (gt01) e mastoacutecitos (gt2)
(HOFFMAN 1999 COUEumlTIL et al 2007)
O painel de estudo da DIVA promovido pelo ACVIM apontou direccedilotildees para as
pesquisas nesta aacuterea e dentre elas o estudo das citocinas e mediadores
inflamatoacuterios envolvidos no processo (COUEumlTIL et al 2007)
Sabe-se que ocorre um incremento da imunidade inata nas vias aeacutereas dos
cavalos estabulados com o envolvimento de IL-6 (RIIHIMAumlKI et al 2008a) Em
cavalos trotadores de corrida em treinamento ocorre uma eosinofilia transitoacuteria no
fluido broncoalveolar e um aumento da expressatildeo de IL-4 e IL-5 contudo natildeo foi
encontrada correlaccedilatildeo entre estes eventos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Dentre os mediadores quiacutemicos participantes do processo inflamatoacuter io nas
vias aeacutereas o PAF (platelet-activating factor) estaacute especialmente implicado na asma
sepse e injuacuteria pulmonar aguda (THACKER 2006) presente tambeacutem na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas em cavalos mais velhos
(FAIRBAIRN et al 1996) Contudo a participaccedilatildeo do PAF no processo inflamatoacuterio
nas vias aeacutereas de cavalos atletas ainda natildeo eacute conhecida
13 PAF E VIAS AEacuteREAS
O fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocoline)
eacute um potente mediador proacute inflamatoacuterio envolvido na angiogecircnese aterosclerose
anafilaxia cicatrizaccedilatildeo inflamaccedilatildeo apoptose e endotoxemia (MARATHE et al
2001 STAFFORINI et al 2003 OWEN et al 2005) O PAF eacute produzido por
eosinoacutefilos macroacutefagos alveolares neutroacutefilos plaquetas e ceacutelulas endoteliais
(BAKER et al 2002 STAFFORINI et al 2003 GAUDREAULT et al 2005 SUMITA
et al 2005) a partir de uma subclasse especiacutefica de fosfatidilcolina que conteacutem um
eacuteter ao inveacutes de um eacutester ligado a posiccedilatildeo sn-1 do esqueleto de glicerol (FIGURA
24
2) A fosfatidilcolina eacute o mais abundante fosfolipiacutedio presente nas membranas
bioloacutegicas (MARATHE et al 2001 OWEN et al 2005)
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO sn-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL FONTE MARATHE et al (2001)
O PAF tambeacutem estaacute envolvido numa variedade de funccedilotildees pulmonares como
por exemplo no tocircnus vascular e das vias aeacutereas na frequumlecircncia de movimentaccedilatildeo
dos ciacutelios e na permeabilidade endotelial causando um aumento da secreccedilatildeo de
fluido traqueal broncoconstricccedilatildeo edema e hiperresponsividade das vias aeacutereas
resultando em prejuiacutezos a troca gasosa (CLAVIJO et al 2001 GABRIJELCIC et al
2003 ISHII et al 2004 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008)
Os efeitos do PAF sobre a circulaccedilatildeo pulmonar foram descritos por diversos
autores CHEN et al (1992) demonstraram um aumento das pressotildees arterial e
microvascular pulmonares e edema apoacutes a injeccedilatildeo de PAF SHIBAMOTO et al
(1993) estudaram os efeitos do PAF na circulaccedilatildeo venosa em pulmatildeo de catildeo onde
o PAF causou venoconstricccedilatildeo e aumento da pressatildeo capilar sem aumento da
permeabilidade vascular OHAR et al (1994) tambeacutem demonstraram
venoconstricccedilatildeo em estudo com pulmatildeo de coelhos mas demostraram que a
reduccedilatildeo da complacecircncia e aumento da resistecircncia vascular deveu-se a alteraccedilatildeo
estrutural vascular por perda de colaacutegeno intersticial induzida por PAF
Contudo o papel do PAF como causador de aumento da permeabilidade
vascular e edema pulmonar estaacute bem estudado devido a sua participaccedilatildeo na
fisiopatologia da anafilaxia da endotoxemia e da asma (EVANS et al 1987
25
CLAVIJO et al 2001 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008
MUEHLMANN et al 2009)
Em estudo preacutevio o extravasamento microvascular ocorrido apoacutes a infusatildeo de
PAF natildeo foi acompanhado de aumento da pressatildeo arterial pulmonar assim os
autores concluiacuteram que o edema pulmonar mediado por PAF resulta de aumento da
permeabilidade microvascular pulmonar (CLAVIJO et al 2001)
De fato demonstrou-se que o aumento da permeabilidade capilar induzida
por PAF ocorre pela formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular devido a
desorganizaccedilatildeo das proteiacutenas juncionais VE-caderina e ocludina (ZHANG et al
2003 JIANG et al 2008) mediada por receptores especiacuteficos (EVANS et al 1987)
e atraveacutes da ativaccedilatildeo da via do insositol trisphosphato e influxo de caacutelcio (GOumlGGEL
e UHLIG 2005) (FIGURA 3)
PLC phopholipase C IP3 inositol 145-trisphosphato IP3R receptor de IP3
MLCK myosin light chain kinase ML-7 5-iodonaphthalene-1sulphonyl-
homopiperazine L108 edelfosina Inibiccedilatildeo ativaccedilatildeo
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS NO LADO ESQUERDO OBSERVA-SE O EFEITO DO PAF EM CEacuteLULAS ENDOTELIAIS NO LADO DIREITO OBSERVA-SE OS EFEITOS DO PAF EM CEacuteLULAS DA MUSCULATURA LISA VASCULAR E DAS VIAS AEacuteREAS A QUAL Eacute ALTAMENTE MEDIADA POR TROMBOXANO NESTE A VIA PRINCIPAL Eacute ATRAVEacuteS DA ATIVACcedilAtildeO DE RHO E PROTEIacuteNAS KINASES ASSOCIADAS Agrave RHO QUE ATENUAM A ATIVIDADE DA MLCP (MYOSIN LIGHT CHAIN PHOPHATASE) COM CONSEQUumlENTE AUMENTO DA FOSFORILACcedilAtildeO DA CADEIA LEVE DA MIOSINA E PORTANTO A CONTRACcedilAtildeO FONTE GOumlGGEL e UHLIG (2005)
26
Adicionalmente os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) (BELLAN et al 1992) O
aumento da produccedilatildeo de NO induzida por PAF via ativaccedilatildeo de receptor de PAF foi
demonstrado em ceacutelulas do endoteacutelio vascular humano considerado como um efeito
cardioprotetor (KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Contudo particularmente
na microcirculaccedilatildeo o NO contra-ataca muitos dos efeitos bioloacutegicos do PAF inibindo
a vasoconstricccedilatildeo arteriolar e o aumento da permeabilidade vascular aleacutem de inibir
a adesatildeo de plaquetas e de leucoacutecitos ao endoteacutelio (BRKOVIC e SIROIS 2007
KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Mas os mecanismos pelos quais o NO
modula a permeabilidade microvascular ainda natildeo satildeo bem entendidos podendo ser
confusos e dependentes do estado das ceacutelulas endoteliais (RAMIREZ et al 2006)
A inibiccedilatildeo da NO sintase (NOS) em ceacutelulas endoteliais atenuou o aumento da
permeabilidade microvascular induzida por PAF no estudo de ZHU et al (2004) Por
outro lado estudando a participaccedilatildeo de NO e PAF em lesotildees de intestino delgado
de ratos KWASNIEWSKI et al (2008) evidenciaram que a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de
NO endoacutegeno aumentou bastante as lesotildees hemorraacutegicas e a taxa de mortalidade
demonstrando o papel proacute inflamatoacuterio do PAF e o efeito protetor do NO na
microcirculaccedilatildeo Tal relaccedilatildeo tambeacutem foi descrita por BRKOVIC e SIROIS (2007)
estudando o papel do PAF e do NO nos efeitos proacute inflamatoacuterios resultantes da
participaccedilatildeo de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e concluindo que eacute
o PAF que diretamente aumenta a permeabilidade vascular sendo o NO um cofator
A atuaccedilatildeo do PAF como mediador inflamatoacuterio eacute bastante importante na
asma onde aleacutem de provocar aumento da permeabilidade vascular tambeacutem induz
uma neutropenia transitoacuteria seguida de neutrofilia resultando no recrutamento de
neutroacutefilos para o pulmatildeo evidenciado atraveacutes de estudo citoloacutegico do lavado
broncoalveolar (LEE et al 2002 GABRIJELCIC et al 2003)
No estudo de AU et al (2001) a ativaccedilatildeo de neutroacutefilos resultou em ativaccedilatildeo
dos receptores de PAF aumento da fagocitose de neutroacutefilos e subsequumlente
liberaccedilatildeo de interleucina-8 (IL-8) causando mais quimiotaxia de neutroacutefilos
Adicionalmente demonstrou-se que haacute envolvimento de receptor 1 de leucotrieno B4
(LTB4) nas atividades de neutroacutefilos humanos mediadas por PAF (GAUDREAULT et
al 2005)
Em indiviacuteduos asmaacuteticos e com doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC)
o influxo de neutroacutefilos mediado por PAF nas vias aeacutereas foi modulado pelo aumento
27
de LTB4 provavelmente pelo estiacutemulo de PAF para a liberaccedilatildeo de LTB4 dos
macroacutefagos alveolares (SHINDO et al 1998 GABRIJELCIC et al 2003 FINNEY-
HAYWARD et al 2009)
Nas vias aeacutereas dos cavalos se demonstrou a participaccedilatildeo do PAF na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas (ORVA) levando a um
aumento do recrutamento de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo resultando em
prejuiacutezos agrave funccedilatildeo pulmonar (FAIRBAIRN et al 1996)
O PAF tendo como uma de suas origens o macroacutefago alveolar eacute capaz de
modificar o comportamento de neutroacutefilos sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da
adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a
ORVA (MARR et al 2002)
A participaccedilatildeo do PAF na asma humana e em outras espeacutecies foi evidenciada
pela sua capacidade em reproduzir mecanismos fisiopatoloacutegicos tais como a
broncoconstricccedilatildeo hiperresponsividade das vias aeacutereas aumento da
permeabilidade na microcirculaccedilatildeo pulmonar e aumento na secreccedilatildeo de muco (LOU
et al 1998 ISHII et al 2004 MUEHLMANN et al 2009)
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
Os desafios indutores de alteraccedilotildees na funcionalidade dos macroacutefagos
alveolares resultando em quimiotaxia de neutroacutefilos para as vias aeacutereas levam a um
quadro inflamatoacuterio pulmonar acompanhado de hipersecreccedilatildeo de muco Por sua vez
o muco presente nas vias aeacutereas possui uma seacuterie de funccedilotildees essenciais que
coletivamente levam a proteccedilatildeo das vias aeacutereas Juntamente com as ceacutelulas
epiteliais forma o sistema mucociliar que associado agrave tosse eacute essencial para
manter as vias aeacutereas desobstruiacutedas (ADLER 2005)
Por outro lado a produccedilatildeo excessiva de muco representa um fator importante
de morbidade e mortalidade nas doenccedilas das vias aeacutereas (THORNTON e
SHEEHAN 2004) Assim a resposta imunoloacutegica do epiteacutelio das vias aeacutereas frente
a infecccedilotildees virais e bacterianas e endotoxinas inaladas eacute caracterizada pela
liberaccedilatildeo de citocinas e pela produccedilatildeo de mucinas para prover proteccedilatildeo adicional
(HODGSON et al 2003 GERBER et al 2004 LORA et al 2005) Entretanto nos
quadros inflamatoacuterios os danos teciduais substanciais podem levar a produccedilatildeo
28
excessiva de muco e comprometimento da funccedilatildeo respiratoacuteria (LORA et al 2005
ROBINSON 2005)
O muco eacute uma mistura de aacutegua (~95) eletroacutelitos (~1) lipiacutedios (~1)
proteiacutenas (2-3) enzimas proteiacutenas seacutericas e mucinas (GERBER 2001) As
mucinas glicoproteiacutenas oligomeacutericas representam um constituinte importante do
muco sendo o gene responsaacutevel pela produccedilatildeo de mucinas o MUC5 (THORNTON
e SHEEHAN 2004)
Nas vias aeacutereas a produccedilatildeo de mucinas ocorre predominantemente pelas
ceacutelulas caliciformes do epiteacutelio e em menor parte nas glacircndulas da submucosa
(GERBER et al 2004 THORNTON e SHEEHAN 2004) A produccedilatildeo de
quantidades excessivas de muco pode representar a causa direta de obstruccedilatildeo
bronquial podendo amplificar o efeito de estreitamento luminal da broncoconstricccedilatildeo
e estar associada ao comprometimento da funccedilatildeo pulmonar tosse e capacidade
reduzida para a corrida em atletas humanos (HALLSTRAND et al 2007) e em
cavalos de corrida (CHRISTLEY et al 2001 HOLCOMBE et al 2006)
Assim a quantidade de muco secretado apresenta uma correlaccedilatildeo estreita
com a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas (GERBER et al 2004 ROBINSON et al 2003
HOLCOMBE et al 2006 ROBINSON 2005) De fato haacute uma evidente associaccedilatildeo
entre a hipersecreccedilatildeo de muco e presenccedila de quantidades aumentadas de
neutroacutefilos nas secreccedilotildees respiratoacuterias em seres humanos e em cavalos
(HODGSON et al 2003 ROBINSON et al 2003 ADLER 2005) Contagens de
neutroacutefilos no LBA menores que 30 ceacutelulasμL correspondem a pequenas
quantidades de muco nas vias aeacutereas e os acuacutemulos de secreccedilatildeo aumentam
quando as quantidades de neutroacutefilos estatildeo entre 30 e 100 ceacutelulasμL Entre 100 e
1000 ceacutelulasμL ocorre obstruccedilatildeo mensuraacutevel das vias aeacutereas Possivelmente esse
mecanismo pode estar relacionado com a secreccedilatildeo de proteiacutenas pelos neutroacutefilos
(ROBINSON et al 2003) De fato jaacute foi demonstrado que o neutroacutefilo secreta
elastase a qual estaacute associada com um aumento nas secreccedilotildees relacionadas com a
expressatildeo do gene MUC5 (SHAO e NADEL 2005) e metaplasia de ceacutelulas
caliciformes (VOYNOW et al 2004)
A expressatildeo anormal de neutroacutefilos e de moleacuteculas de adesatildeo em indiviacuteduos
com asma e doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC) foi demonstrada por
GABRIJELCIC et al (2003) Aleacutem do aumento no nuacutemero de neutroacutefilos tambeacutem
foram observados diferentes padrotildees de ativaccedilatildeo e niacuteveis aumentados de elastase
29
neutrofiacutelica e IL-8 Estes uacuteltimos bem como a expressatildeo do gene MUC5 estatildeo
associados a um aumento no estresse oxidativo pulmonar (DROST et al 2005
SHAO e NADEL 2005)
A associaccedilatildeo entre a severidade da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas e o estresse
oxidativo em cavalos com ORVA foi relatada por KIRSCHVINK et al (2008) os
quais relacionaram a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas ao aumento da glutationa oxidada
do aacutecido uacuterico e de isoprostano (8-iso-PGF2α) no LBA
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO
Estresse oxidativo eacute o termo utilizado para descrever os danos causados
quando as espeacutecies reativas do oxigecircnio (ROS) superam a capacidade de defesa
antioxidante do indiviacuteduo (WOOD et al 2003)
Entretanto tanto as ROS como as espeacutecies reativas do nitrogecircnio (RNS)
ocorrendo em concentraccedilotildees pequenas a moderadas apresentam importante papel
na fisiologia celular incluindo a defesa contra invasores e atuando em diversas vias
de sinalizaccedilatildeo celular e na induccedilatildeo da resposta mitogecircnica O estresse oxidativo
propriamente dito ocorre quando o sistema redox sofre desequiliacutebrio pela produccedilatildeo
aumentada de ROS eou RNS ou produccedilatildeo reduzida de antioxidantes (VALKO et al
2007)
Os pulmotildees encontram-se sujeitos ao estresse oxidativo pois estatildeo
diretamente expostos a quantidades muito elevadas de oxigecircnio o que torna
imperativo que este oacutergatildeo possua um arsenal para a defesa contra possiacuteveis
ataques oxidativos Portanto os pulmotildees satildeo providos de um desenvolvido sistema
de defesa endoacutegeno constituiacutedo de agentes chamados antioxidantes Os
antioxidantes ajudam os pulmotildees a se livrarem dos efeitos de uma variedade de
oxidantes provenientes do oxigecircnio (ROS) como o acircnion superoacutexido radical
hidroxila peroacutexido de hidrogecircnio e do nitrogecircnio (RNS) como o oacutexido niacutetrico (NO)
peroxinitrito e nitritos endoacutegenos e do ambiente Os principais sistemas
antioxidantes natildeo enzimaacuteticos dos pulmotildees satildeo a glutationa a vitamina C a
vitamina E o beta-caroteno e o aacutecido uacuterico enquanto os antioxidantes enzimaacuteticos
satildeo as superoacutexido dismutases a catalase e as peroxidases (RAHMAN et al 2006)
(FIGURA 4)
30
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE O2- AcircNION SUPEROacuteXIDO NO OacuteXIDO NIacuteTRICO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO ONOO- PEROXINITRITO FE2+ IacuteON FERROSO GPX GLUTATIONA PEROXIDASE FONTE RAHMAN et al (2006)
O estresse oxidativo pode resultar em muitos prejuiacutezos agraves funccedilotildees das vias
aeacutereas incluindo a contraccedilatildeo da musculatura lisa das vias aeacutereas a induccedilatildeo de
hiperresponsividade das vias aeacutereas a hipersecreccedilatildeo de muco danos ao epiteacutelio
respiratoacuterio e aumento da permeabilidade capilar (WOOD et al 2003)
A fisiopatologia da asma e da DPOC caracteriza-se por inflamaccedilatildeo crocircnica
localizada e estresse oxidativo O estresse oxidativo ocorre pelo aumento de
agentes oxidantes que satildeo inalados bem como por grandes quantidades de ROS
liberadas das ceacutelulas inflamatoacuterias Niacuteveis aumentados de ROS aumentam a
resposta inflamatoacuteria diretamente ou via formaccedilatildeo de produtos da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica levando a um aumento na severidade da doenccedila (KIRKHAM e RAHMAN
2006)
A peroxidaccedilatildeo dos lipiacutedios da membrana celular leva a geraccedilatildeo de
isoprostanos (FIGURA 5) um composto bioativo semelhante agraves prostaglandinas Os
isoprostanos satildeo produzidos independentemente das enzimas ciclooxigenases via
peroxidaccedilatildeo do aacutecido aracdocircnico catalizada por ROS apresentando potente efeito
31
constritor na musculatura lisa respiratoacuteria hiperresponsividade e exsudaccedilatildeo de
plasma nas vias aeacutereas (WOOD et al 2003)
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA ASMA IL INTERLEUCINA TH2 CEacuteLULAS T-HELPER TIPO 2 ROS ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO O2
- AcircNION SUPEROacuteXIDO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO NADPH NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO REDUZIDA NADP NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO SOD SUPEROacuteXIDO DISMUTASE EPO PEROXIDASE EOSINOFIacuteLICA MPO MIELOPEROXIDASE NF FATOR DE TRANSCRICcedilAtildeO NUCLEAR FONTE WOOD et al (2003)
O oacutexido niacutetrico (NO) sintetizado enzimaticamente pela oxidaccedilatildeo do
aminoaacutecido L-arginina para L-citrulina apresenta diversas funccedilotildees fisioloacutegicas nas
vias aeacutereas como o relaxamento da musculatura lisa a regulaccedilatildeo da responsividade
e da permeabilidade das vias aeacutereas e na defesa contra invasores Contudo em
altas concentraccedilotildees o NO apresenta diversos efeitos proacute inflamatoacuterios participando
da infiltraccedilatildeo de ceacutelulas inflamatoacuterias e apresentando efeitos citotoacutexicos sobre
32
diversas ceacutelulas tal como a ceacutelula do epiteacutelio respiratoacuterio especialmente por
interagir com o acircnion superoacutexido formando o peroxinitrito (REDINGTON 2006)
As ceacutelulas inflamatoacuterias recrutadas agraves vias aeacutereas do indiviacuteduo asmaacutetico
apresentam excepcional capacidade de produccedilatildeo de oxidantes Eosinoacutefilos
neutroacutefilos e macroacutefagos bem como ceacutelulas do epiteacutelio respiratoacuterio podem gerar
oxidantes Inicialmente ocorre a formaccedilatildeo de acircnion superoacutexido no complexo
dependente de NADPH oxidase na membrana celular no sistema xantina oxidase
citosoacutelico e na cadeia respiratoacuteria mitocondrial (FIGURA 6) (CARAMORI e PAPI
2004) A seguir a interaccedilatildeo do acircnion superoacutexido com outros oxidantes e o ataque
oxidativo ao tecido pulmonar leva agrave peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e danos ao tecido pulmonar
(MILLS e HIGGINS 1997 KIRKHAM e RAHMAN 2006)
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS FONTE CARAMORI E PAPI (2004)
O estudo do estresse oxidativo na asma se utiliza de modelos que podem
envolver os murinos (MUEHLMANN et al 2009) ou mesmo os cavalos jaacute que estes
naturalmente desenvolvem a ORVA doenccedila respiratoacuteria com diversas similaridades
com a asma humana (DEATON 2006)
33
Nos cavalos com ORVA os marcadores de estresse oxidativo estatildeo
aumentados e diretamente relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e infiltrado
inflamatoacuterio neutrofiacutelico (KIRSCHVINK et al 2008) ao aumento da produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por neutroacutefilos sanguiacuteneos apoacutes a exposiccedilatildeo agrave poeira orgacircnica
ambiental (MARR et al 1997) e ao aumento da secreccedilatildeo de muco apresentando
tambeacutem concentraccedilotildees reduzidas de aacutecido ascoacuterbico no fluido do epiteacutelio respiratoacuterio
(DEATON 2006)
O exerciacutecio fiacutesico por sua vez tambeacutem pode causar estresse oxidativo nas
vias aeacutereas em atletas humanos e em cavalos pela geraccedilatildeo de ROS e RNS (MILLS
e HIGGINS 1997 ART e LEKEUX 2005 KIRSCHVINK et al 2008)
Os cavalos de corrida apresentam a habilidade de aumentar o consumo de
oxigecircnio em 60 vezes durante o esforccedilo maacuteximo o que representa um fator de risco
ao estresse oxidativo nesses animais (ART e LEKEUX 2005)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica eacute o marcador de dano oxidativo poacutes exerciacutecio mais
estudado (DEATON e MARLIN 2003) Em atletas humanos houve aumento da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes a realizaccedilatildeo de ultramaratona (MASTALOUDIS et al
2004) mas o treinamento produziu efeitos beneacuteficos e reduccedilatildeo dos marcadores de
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes um periacuteodo de treinamento (MIYAZAKI et al 2001
BALOG et al 2006) Em cavalos o exerciacutecio submaacuteximo induziu um aumento nos
hidroperoacutexidos lipiacutedicos plasmaacuteticos dentro de 5 minutos apoacutes o teacutermino (DEATON e
MARLIN 2003)
As ROS e seus produtos como os peroacutexidos lipiacutedicos podem diretamente
danificar o tecido pulmonar e causar um incremento da pressatildeo vascular pulmonar
pela liberaccedilatildeo aumentada de mediadores inflamatoacuterios vasoconstrictores (pex
PAF) interferindo na atividade do NO como vasodilatador podendo assim contribuir
na patogecircnese da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) nos cavalos
atletas (MILLS e HIGGINS 1997)
34
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE)
A HPIE eacute caracterizada por hipertensatildeo pulmonar edema nas regiotildees de
troca gasosa ruptura dos capilares pulmonares e a presenccedila de sangue nas vias
aeacutereas (ERICKSON e POOLE 2007) sendo extremamente comum em cavalos de
corrida (PEREZ-MORENO et al 2009)
Tem-se relatado que a HPIE ocorre essencialmente em todos os cavalos
PSI de corrida em treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007) mas
tambeacutem constitui um problema em outras raccedilas de cavalos que realizam exerciacutecio
intenso como os trotadores e os quarto de milha e em cavalos realizando exerciacutecio
de menor intensidade como os cavalos de salto e traccedilatildeo (LAPOINTE et al 1994
ERICKSON e POOLE 2007 VICINO 2007)
O comprometimento ao rendimento desportivo causado pela HPIE natildeo havia
sido comprovado ateacute o estudo de HINCHCLIFF et al (2005a) quando demonstraram
que cavalos de corrida com HPIE grau 1 apresentaram 4 vezes mais possibilidades
de vencer em relaccedilatildeo a graduaccedilotildees mais elevadas de hemorragia
Cavalos PSI de corrida estatildeo sob maior risco de apresentar HPIE porque
apresentam pressatildeo capilar pulmonar mais elevada que cavalos de outras raccedilas e
atividades durante o esforccedilo maacuteximo (HACKETT et al 2003)
Adicionalmente a criaccedilatildeo seletiva de cavalos de corrida visando que sejam
cada vez mais capazes de atingir altas velocidades associado a consumo bastante
alto de oxigecircnio resultou em deacutebito cardiacuteaco substancial (WEST e MATHIEU-
COSTELLO 1994) e barreira alveacuteolo-capilar (BAC) bastante fina (WEST e
MATHIEU-COSTELLO 1999) A espessura meacutedia em micrometros do interstiacutecio da
BAC eacute 0175 plusmn 0010 em coelhos 0318 plusmn 0081 em catildees e 0390 plusmn 002 em
cavalos evidenciando que proporcionalmente a BAC dos cavalos eacute mais fina que a
de outras espeacutecies (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1999) Portanto haacute um dilema
envolvendo a evoluccedilatildeo da BAC dos cavalos Por um lado a necessidade de ser
extremamente fina para uma troca gasosa eficiente enquanto de outro a
necessidade de ser resistente o suficiente para suportar o estresse extremamente
alto na parede dos capilares pulmonares quando a pressatildeo capilar se eleva durante
o exerciacutecio (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
A pressatildeo hidrostaacutetica maacutexima nos capilares pulmonares humanos durante o
exerciacutecio supera 30 mmHg Nos cavalos PSI de corrida a pressatildeo capilar ultrapassa
35
100 mmHg aproximando-se da forccedila necessaacuteria para ocorrer a ruptura do colaacutegeno
que suporta a parede capilar na BAC (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
Quando o estresse na parede capilar se eleva demasiadamente ocorrem
alteraccedilotildees ultra-estruturais na BAC uma condiccedilatildeo conhecida como falecircncia por
estresse descrita em atletas de elite humanos e em cavalos (WEST 2000)
BIRKS et al (1997) demonstraram a falecircncia por estresse e consequumlente
ruptura dos capilares pulmonares em cavalos exercitando a altas velocidades
havendo maior risco de ocorrecircncia da HPIE quando encontraram-se sob importante
aumento da pressatildeo arterial pulmonar (FIGURA 7)
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) A ULTRAESTRUTURA CAPILAR NORMAL B RUPTURA DO ENDOTEacuteLIO CAPILAR (SETAS) COM ERITROacuteCITOS ADJACENTES (ASTERISCO) NOTA-SE TAMBEacuteM ERITROacuteCITOS NO ESPACcedilO ALVEOLAR (PONTAS DE SETAS) C ERITROacuteCITO NO INTERSTIacuteCIO (ASTERISCO) D RUPTURA DO EPITEacuteLIO ALVEOLAR (SETAS) A ALVEacuteOLO C CAPILAR BAR 2 microm FONTE BIRKS et al (1997)
36
Portanto a falecircncia por estresse dos capilares pulmonares eacute a teoria aceita
para a ocorrecircncia da HPIE sendo causada pela elevada pressatildeo transmural nos
capilares pulmonares resultado do aumento da pressatildeo arterial pulmonar somada agrave
pressatildeo pleural inspiratoacuteria negativa (WEST 2000) (FIGURA 8)
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) TTMP TENSAtildeO CIRCUNFERENCIAL OU EM ARCO CAUSADA PELA PRESSAtildeO TRANSMURAL CAPILAR TEL Eacute A TENSAtildeO LONGITUDINAL NOS COMPONENTES DA PAREDE ALVEOLAR ASSOCIADA COM A INFLACcedilAtildeO PULMONAR PARTE DESTA Eacute TRASMITIDA Agrave BAC TST Eacute A TENSAtildeO DE SUPERFIacuteCIE DA CAMADA SUPERFICIAL ALVEOLAR ESTA APARENTEMENTE EXERCE UMA FORCcedilA DE ACcedilAtildeO INTERNA PARA SUPORTAR O CAPILAR QUANDO ESTE INTUMESCE PARA DENTRO DO ESPACcedilO ALVEOLAR A ALTAS PRESSOtildeES TRANSMURAL CAPILARES PALV PRESSAtildeO ALVEOLAR PCAP PRESSAtildeO CAPILAR FONTE WEST (2000)
Diversos estudos estiveram envolvidos em avaliar a participaccedilatildeo do NO no
aumento da pressatildeo arterial pulmonar no cavalo durante o exerciacutecio e na
fisiopatologia da HPIE Inicialmente evidenciou-se que cavalos realizando exerciacutecio
intenso apresentam hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE) (CHRISTLEY
et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 DEMPSEY e WAGNER 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) o que resulta na inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO abolindo o
relaxamento vascular dependente do endoteacutelio (MILLS e HIGGINS 1997)
Portanto acreditou-se que a reduccedilatildeo da produccedilatildeo do NO durante o exerciacutecio
intenso poderia contribuir para a alta incidecircncia de HPIE nos cavalos de corrida
Contudo a administraccedilatildeo do antagonista da oacutexido niacutetrico sintase (NOS) N-nitro-L-
arginina metil ester (L-NAME) mostrou que o NO endoacutegeno resulta numa maior
37
extraccedilatildeo de O2 no repouso e no exerciacutecio submaacuteximo mas natildeo causou alteraccedilatildeo no
exerciacutecio intenso (MANOHAR e GOETZ 1998 MANOHAR et al 2006) A
administraccedilatildeo de L-NAME por KINDIG et al (2000) resultou em agravamento da
HPIE nos cinco animais estudados contudo natildeo observou-se aumento da pressatildeo
arterial pulmonar
MANOHAR e GOETZ (1999) avaliaram os efeitos da infusatildeo intravenosa de
nitroglicerina em cavalos realizando exerciacutecio e natildeo observaram alteraccedilotildees sobre a
incidecircncia ou severidade da HPIE
Adicionalmente KINDIG et al (2001) estudaram os efeitos do exerciacutecio na
pressatildeo arterial pulmonar e na HPIE em cavalos inalando NO Comparados aos
controles o grupo que inalou o NO apresentou uma pequena mas consistente
reduccedilatildeo na pressatildeo arterial pulmonar maacutexima mas com um significativo aumento da
HPIE nesses animais avaliado pelo aumento na contagem do nuacutemero de eritroacutecitos
no LBA Os autores entenderam que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete em
parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou como agravou a HPIE
Portanto em face aos achados relacionados agrave participaccedilatildeo do NO e da NOS
no cavalo em exerciacutecio maacuteximo e na HPIE satildeo necessaacuterias outras investigaccedilotildees a
respeito dos efeitos da inibiccedilatildeo da NOS e da produccedilatildeo do NO na circulaccedilatildeo
pulmonar e na HPIE (KINDIG et al 2000)
Apesar da maior atenccedilatildeo aos efeitos da HPIE e da pressatildeo arterial pulmonar
em cavalos realizando exerciacutecios intensos a HPIE tambeacutem passou a ser
demonstrada em cavalos envolvidos em atividades de menor intensidade sugerindo
que outros mecanismos podem estar envolvidos na fisiopatologia (EPP et al 2006)
VICINO (2007) demonstrou a ocorrecircncia de HPIE em cavalos de salto sendo
que cavalos que participaram de provas na altura entre 130 m ndash 150 m
apresentaram maior incidecircncia que aqueles que saltaram provas entre 100 m ndash 120
m
Neste contexto a associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar jaacute foi
demonstrada anteriormente (McKANE et al 1993 SAacuteNCHEZ et al 2005) Em
concordacircncia o estudo epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) evidenciou
38
uma significativa associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos puro
sangue inglecircs (PSI) jovens durante treinamento para corrida
O processo de hemorragia pulmonar pode culminar em irritaccedilatildeo e inflamaccedilatildeo
das vias aeacutereas o que exacerbaria a doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
(ERICKSON e POOLE 2007) WEST e MATHIEU-COSTELLO (1999) sugerem que
alteraccedilotildees na BAC ativariam vias proacute inflamatoacuterias nas vias aeacutereas com a
participaccedilatildeo de LTB4 Possivelmente a membrana basal alveolar exposta apoacutes a
ruptura ativaria macroacutefagos alveolares sendo que estes satildeo ricos em LTB4
DERKSEN et al (2009) sugeriram uma hipoacutetese para a ocorrecircncia da HPIE
(FIGURA 9) onde a ocorrecircncia das altas pressotildees vasculares pulmonares levaria a
alteraccedilotildees venulares culminando na ruptura capilar sangramento inflamaccedilatildeo e
hemossiderose agravando o quadro da HPIE
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO DERSKEN et al (2009)
Contudo mediadores bem como os mecanismos inflamatoacuterios que estatildeo
envolvidos na fisiopatologia da HPIE ainda precisam ser esclarecidos
O diagnoacutestico da HPIE pode ser feito pela evidecircncia de sangue na traqueacuteia
visiacutevel atraveacutes de exame endoscoacutepico (HINCHCLIFF et al 2005b ERICKSON e
POOLE 2007) pela contagem de eritroacutecitos no LBA (MEYER et al 1998) ou pela
39
presenccedila de hemossideroacutefagos (macroacutefagos contendo hemossiderina ou eritroacutecitos)
no AT (EPPINGER 1990 MICHELOTTO JUacuteNIOR et al 2007) eou no LBA
(DOUCET e VIEL 2002 SAacuteNCHEZ et al 2005 BIAVA et al 2006) realizado uma
hora apoacutes o exerciacutecio A presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA eacute considerada a
forma mais sensiacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993)
Em resumo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas acompanhada de
hiperresponsividade e hipersecreccedilatildeo de muco denominada doenccedila inflamatoacuteria das
vias aeacutereas (DIVA) bem como a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) satildeo causas de enormes perdas econocircmicas e de queda de rendimento
desportivo interrupccedilatildeo nos treinamentos e de encerramento de campanha em
cavalos de corrida Apesar disso a maioria dos estudos sobre as doenccedilas
inflamatoacuterias das vias aeacutereas dos cavalos satildeo direcionados para a ORVA e a
fisiopatologia da DIVA ainda estaacute pouco esclarecida bem como os mecanismos
inflamatoacuterios da HPIE ainda precisam ser mais bem estudados
Tendo-se em vista estes aspectos a hipoacutetese levantada no presente estudo
foi de que o desafio ambiental e o exerciacutecio fiacutesico estejam acompanhados de
estresse oxidativo alterando o quadro inflamatoacuterio possivelmente por alterar a
produccedilatildeo de PAF no pulmatildeo com consequumlente alteraccedilatildeo da funcionalidade celular
e que a hemorragia pulmonar pode exercer influecircncia sobre essa situaccedilatildeo As
ceacutelulas estudadas foram os macroacutefagos alveolares os quais podem apresentar um
papel central na regulaccedilatildeo deste processo
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVOS GERAIS
Verificar alteraccedilotildees em paracircmetros cliacutenicos e inflamatoacuterios pulmonares em
cavalos puro sangue inglecircs (PSI) de corrida jovem submetidos ao desafio ambiental
e ao treinamento fiacutesico
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Avaliar os seguintes paracircmetros cliacutenicos e laboratoriais
- Avaliaccedilatildeo cliacutenica
- Avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas
- Avaliaccedilatildeo citoloacutegica das vias aeacutereas atraveacutes das teacutecnicas de aspirado
traqueal (AT) e de lavado broncoalveolar (LBA)
- Avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas
e a produccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos e nitritos no LBA
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por macroacutefagos alveolares
bem como a capacidade fagocitaacuteria e de adesatildeo
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por neutroacutefilos do sangue
perifeacuterico bem como a capacidade fagocitaacuteria
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 REAGENTES E SEDATIVOS
O BN52021 (Gingkolide B) foi obtido da Biomol (Plymouth Meeting PA USA)
Fura-2 AM (cat num F-0888) PAF (β-Acetyl-γ-O-hexadecyl-L-α-
phosphatidylcholine P-4904) foram obtidos da Sigma (St Louis MO USA) A
coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacuteticoreg) foi obtida da Laborclin (Pinhais PR Brasil) e
a acepromazina da Univet (Satildeo Paulo SP Brasil) A xylazina e o butorphanol foram
obtidos do laboratoacuterio Fort Dodge (Satildeo Paulo SP Brasil) Todos os demais
reagentes foram comprados da Sigma (St Louis MO USA)
32 ANIMAIS
Foram utilizados equinos machos adultos jovens (potros) da raccedila puro sangue
inglecircs (PSI) de cinco diferentes criatoacuterios (haras) da regiatildeo metropolitana de Curitiba
estado do Paranaacute (Haras Cifra e Haras dos Girassoacuteis em Piraquara Haras
Palmerini e Haras Belmont em Satildeo Joseacute dos Pinhais e Haras Santa Rita da Serra
em Tijucas do Sul e potros de quatro diferentes cocheiras no Jockey Club do
Paranaacute (Av Viacutector Ferreira do Amaral 2291 Tarumatilde Curitiba PR)
Inicialmente os potros foram divididos em trecircs grupos O primeiro grupo foi
denominado grupo condiccedilotildees naturais (CN n=45) compreendendo os potros dos
haras vivendo soltos em piquetes dia e noite alimentando-se de gramiacuteneas e
leguminosas da pastagem mais complemento peletizado fornecido no campo A
meacutedia de idade dos animais deste grupo foi de 145 plusmn 04 meses O segundo grupo
foi denominado grupo desafio ambiental (DA n=45) constituiacutedo por potros
estabulados por 30 dias com o propoacutesito de preparaacute-los para o iniacutecio de treinamento
Estes animais eram mantidos em grupos de 15 a 20 potros sendo que permaneciam
em baias individuais com dimensotildees de 35m x 35m x 35m em meacutedia em cama de
serragem e alimentados duas vezes ao dia com aveia mais raccedilatildeo peletizada e feno
de gramiacutenea e de alfafa A meacutedia de idade dos potros do grupo DA foi de 217 plusmn 29
meses O terceiro grupo foi denominado de grupo exerciacutecio (EX n=34) onde foram
incluiacutedos potros ineacuteditos (satildeo considerados ineacuteditos animais que ainda natildeo correram
42
em hipoacutedromos oficiais) mas que estavam em treinamento para corrida haacute
aproximadamente cinco meses e mantidos nas mesmas condiccedilotildees de estabulaccedilatildeo e
alimentaccedilatildeo que os potros do grupo DA Estes animais foram acompanhados
durante o periacuteodo de treinamento sendo que a avaliaccedilatildeo cliacutenica endoscoacutepica e a
colheita de LBA ocorreu 24 horas apoacutes seu primeiro exerciacutecio intenso (15 ms ndash 16
ms) em 800m ndash 1000m de distacircncia na pista de areia do Jockey Club do Paranaacute A
meacutedia de idade dos potros do grupo EX foi de 270 plusmn 03 meses
A obtenccedilatildeo de dados para o presente trabalho de pesquisa ocorreu durante
uma sequumlecircncia de experimentos independentes durante um periacuteodo de 18 meses
Durante este periacuteodo grupos de potros foram acompanhados ateacute se encontrarem
nas condiccedilotildees estabelecidas para cada grupo quando entatildeo foram avaliados As
amostras do grupo CN foram obtidas de oito diferentes experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois durante o inverno trecircs durante a primavera e um no outono
As amostras do grupo DA foram provenientes de seis experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois no inverno e dois no outono e para o grupo EX os resultados
advieram de amostras obtidas durante o veratildeo em cinco ocasiotildees e durante a
primavera em quatro totalizando nove experimentos independentes para este grupo
Os resultados apresentados para cada uma das anaacutelises provecircm de pelo menos
trecircs experimentos independentes
Todos os animais estudados eram pertencentes a estabelecimentos com
programa de desverminaccedilatildeo bimensal bem como foram todos vacinados
regularmente contra Influenza Equina e Herpes Viacuterus Equino tipos 1 e 4 A
alimentaccedilatildeo utilizada nos estabelecimentos que cederam os potros para o estudo
era similar bem como a anaacutelise da alimentaccedilatildeo utilizada para os potros dos trecircs
grupos natildeo diferiu no que se refere a constituintes essenciais que poderiam
influenciar nas avaliaccedilotildees realizadas no presente trabalho Os criteacuterios de inclusatildeo
para os potros dos trecircs grupos foram os estabelecidos e jaacute descritos previamente
nas caracteriacutesticas de cada grupo e a exclusatildeo do estudo ocorreu quando da
histoacuteria de doenccedila recente ou diferenccedilas em manejo
As comparaccedilotildees intergrupos foram feitas entre os grupos CN e DA (diferenccedila
ambiental) e entre os grupos DA e EX (diferenccedila no regime de exerciacutecio)
Na segunda etapa do trabalho dedicada ao estudo da hemorragia pulmonar
induzida pelo exerciacutecio (HPIE) avaliou-se somente os potros do grupo EX agora
com n=37 Este grupo foi dividido em subgrupos sendo o subgrupo HPIE pos (n=23
43
constituiacutedo por potros com qualquer percentual de hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo
citoloacutegica do LBA) e subgrupo HPIE neg (n=14 constituiacutedo por potros sem
hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA) Nesta etapa as comparaccedilotildees
realizadas foram entre os subgrupos HPIE pos e HPIE neg
33 ASPECTOS EacuteTICOS
Este trabalho de pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Experimentaccedilatildeo Animal (CEEA) do setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR sob o
nuacutemero de registro 168 e pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso de Animais (CEUA) da
Pontifiacutecia Universidade Catoacutelica do Paranaacute sob o nuacutemero de registro 129 e estaacute de
acordo com o Guiding Principles in the Care and Use of Animals
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA
Preacutevio agrave colheita de material procedeu-se a avaliaccedilatildeo cliacutenica de cada potro
iniciada pela histoacuteria incluindo possiacuteveis ocorrecircncias meacutedicas relevantes agrave sauacutede do
sistema respiratoacuterio manejo alimentaccedilatildeo desverminaccedilatildeo e vacinaccedilatildeo Na histoacuteria
incluiu-se tambeacutem a informaccedilatildeo sobre a ocorrecircncia de tosse espontacircnea quando em
piquetes na baia no momento da alimentaccedilatildeo ou durante o treinamento O exame
fiacutesico incluiu a observaccedilatildeo da presenccedila de secreccedilatildeo nasal estiacutemulo da tosse
palpaccedilatildeo de linfonodos submandibulares e retrofaringeanos auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e
auscultaccedilatildeo traqueal e pulmonar (McGORUM e DIXON 2007)
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS
A avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas foi realizada previamente a
realizaccedilatildeo do LBA com o animal tranquumlilizado atraveacutes da administraccedilatildeo de
acepromazina (acepran 1 Univet) (003 mgkg IM) e apoacutes 30 minutos seguindo-
se a administraccedilatildeo de xilazina (sedazine Fort Dodge) (03-05 mgkg IV) mais
butorfanol (torbugesic Fort Dodge) (005 mgkg IV) (HOFFMAN 1999 HEWSON e
VIEL 2002) Utilizou-se um fibroscoacutepio flexiacutevel Pentax de 170 cm de comprimento e
128 mm de diacircmetro para a avaliaccedilatildeo das vias aeacutereas superiores e inferiores ateacute a
bifurcaccedilatildeo da traqueacuteia
44
A presenccedila de foliacuteculos linfoacuteides na faringe foi graduada segundo RAKER e
BOWLES (1978) adotando-se a graduaccedilatildeo de I a IV (QUADRO 1) e graus III e IV
foram considerados como faringite
A movimentaccedilatildeo das cartilagens aritenoacuteides foi graduada de I a IV segundo
RACKESTRAW et al (1991) (QUADRO 2) e graus III e IV foram considerados como
anormais
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Faringe com poucos foliacuteculos claros na parede dorsal
Grau II Presenccedila de numerosos pequenos foliacuteculos juntamente a
hiperemia cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau III Presenccedila de grandes grupos de foliacuteculos hiperecircmicos
cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau IV Presenccedila de foliacuteculos grandes edematosos e hiperecircmicos
por toda a mucosa faringeana
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA FARINGE FONTE RAKER E BOWLES (1978)
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Movimentaccedilatildeo sincrocircnica e abduccedilatildeo completa das
cartilagens aritenoacuteides
Grau II Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo com abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) conseguida com a degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
Grau III Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo e a abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) natildeo eacute conseguida na degluticcedilatildeo nem na
oclusatildeo nasal
Grau IV
(Hemiplegia
Laringeana)
Cartilagem aritenoacuteide esquerda posicionada
medialmente na glote e natildeo apresenta movimento
quando da degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE I A IV FONTE RACKESTRAW et al (1991)
45
Especial interesse foi dado agrave presenccedila de muco no lume traqueal e sua
quantificaccedilatildeo atraveacutes de graduaccedilatildeo de 0 a 5 conforme GERBER et al (2004)
(FIGURA 10)
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME ENDOSCOacutePICO FONTE GERBER et al 2004
Quando da observaccedilatildeo de muco traqueal este foi aspirado atraveacutes de tubo
de silicone introduzido pelo canal de trabalho do endoscoacutepio sendo imediatamente
transferido para uma lacircmina de microscopia e deixado para secar ao ar As lacircminas
foram coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico Laborclin Pinhais PR
Brasil) e 500 ceacutelulas foram contadas em aumento de 1000X (HODGSON e
HODGSON 2003)
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o aspirado traqueal (AT)
contendo lt10 de linfoacutecitos lt1 de eosinoacutefilos e lt20 de neutroacutefilos (ROBINSON
2003 HODGSON e HODGSON 2007)
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)
Para a realizaccedilatildeo do LBA foi utilizado um cateter flexiacutevel de silicone
especiacutefico para a obtenccedilatildeo de LBA de equinos marca Cook (V-PBAL-300 Cook Vet
Products Hamburg Alemanha) de 300 cm de comprimento e 8 mm de diacircmetro
Este foi introduzido agraves cegas via nasotraqueal preferencialmente do lado direito ateacute
se alojar em um brocircnquio quando o cuff na extremidade distal era inflado com 5-10
mL de ar Utilizou-se 300 mL de soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada (PBS) esteacuteril e
com heparina soacutedica (5 UImL de PBS) preacute-aquecidos a 37oC (HOFFMAN 1999
PICKLES et al 2002abc MORI et al 2003 RIIHIMAumlKI et al 2008b) O PBS era
infundido em aliacutequotas de 120 mL (HEWSON e VIEL 2002) aspirando-se
46
gentilmente apoacutes cada aliacutequota e dispensando-se o LBA recolhido em frascos
plaacutesticos esteacutereis mantidos em isopor com gelo Este procedimento foi repetido ateacute
que o volume de 300 mL era totalmente empregado O material recolhido foi mantido
refrigerado em isopor com gelo ateacute a chegada ao Laboratoacuterio de Metabolismo
Celular no Departamento de Fisiologia do Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR
para o processamento em menos de 3 horas apoacutes a colheita (PICKLES et al 2002c
VIEL e HEWSON 2003)
No laboratoacuterio o LBA era centrifugado a 340g (1300 rpm) por seis minutos a
40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA) e o pellet obtido foi
ressuspendido em 2 mL de PBS para a contagem do nuacutemero total de ceacutelulas
nucleadas (NTCN)
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA
A contagem do NTCN foi realizada usando-se a cacircmara de Neubauer Uma
aliacutequota da suspensatildeo de ceacutelulas foi diluiacuteda 110 em PBS em um frasco de
centrifugaccedilatildeo de 15 mL de fundo cocircnico (Eppendorf) Desta uma aliacutequota de 50 microL
foi misturada a 50 microL do corante vital Azul de Tripan para a contagem das ceacutelulas
vivas A partir do nuacutemero de ceacutelulas vivas por mililitro da suspensatildeo de ceacutelulas a
concentraccedilatildeo da suspensatildeo de ceacutelulas foi ajustada para 5 x 106 ceacutelulasmL para as
avaliaccedilotildees da atividade de macroacutefago alveolar (fagocitose produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e adesatildeo ndash ver toacutepicos 315 316
317 e 318)
Para a avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA lacircminas para microscopia
foram preparadas a partir de 10 μL da suspensatildeo de ceacutelulas distribuiacutedos de forma
circular sobre a lacircmina secadas ao ar e coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski
(Panoacutetico Laborclin Pinhais PR Brasil) (HEWSON e VIEL 2002) e 500 ceacutelulas
foram contadas em aumento de 1000X
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o LBA contendo em meacutedia
60 de macroacutefagos 35 de linfoacutecitos lt5 de neutroacutefilos lt2 de mastoacutecitos lt1
de eosinoacutefilos (ROBINSON 2003 MAZAN e HOFFMAN 2003 RICHARD et al
2009)
47
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957)
Uma porccedilatildeo correspondente a 90 mg de pellet de ceacutelulas do LBA foi
ressuspendido em um solvente extrator (metanolclorofoacutermio12 volvol) na
quantidade de 18 mL e sonicado (6 ciclos de 4 segundos) Os tubos foram
deixados em gelo por 20 minutos
Na etapa seguinte mais metanol foi adicionado (324 microL o caacutelculo eacute a
quantidade de sovente extrator x 0180 resultando na quantidade de metanol em
mililitros) para reduzir a densidade do liacutequido e possibilitar assim a decantaccedilatildeo do
material particulado insoluacutevel no meio Apoacutes o material foi centrifugado a 5000g por
10 minutos a 40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
O sobrenadante foi transferido para tubos de vidro e clorofoacutermio foi
adicionado (648 microL ou seja o dobro da quantidade de metanol utilizada
anteriormente)
Na sequumlecircncia o extrato foi lavado uma vez com 19 mL de aacutegua ultra pura O
sistema bifaacutesico formado foi submetido a uma intensa agitaccedilatildeo ateacute natildeo serem mais
distinguiacuteveis as duas fases (forma-se momentaneamente uma emulsatildeo) Nesta
etapa substacircncias com maior afinidade agrave aacutegua do que ao solvente orgacircnico satildeo
solubilizadas no meio aquoso e portanto se separam dos lipiacutedios
Apoacutes a reconstituiccedilatildeo espontacircnea do sistema bifaacutesico o sobrenadante
(aquoso) foi removido com o auxiacutelio de uma micropipeta cuidando-se para natildeo
retirar o que se encontrava abaixo
Em seguida foi adicionado o FSP (CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM NaCl 497
mM clorofoacutermio 30 metanol 490 aacutegua ultra pura 480) lentamente (para
evitar a formaccedilatildeo de emulsatildeo) e de maneira que as paredes do tubo fossem lavadas
com esta soluccedilatildeo Apoacutes a remoccedilatildeo do sobrenadante este procedimento foi repetido
mais duas vezes
A mistura de clorofoacutermio e metanol na qual estavam dissolvidos os lipiacutedios
foi evaporada em banho-maria a 370C sob corrente de nitrogecircnio O extrato lipiacutedico
seco foi armazenado a -800C em atmosfera de nitrogecircnio Para a determinaccedilatildeo da
bioatividade de PAF (toacutepico 310) esses extratos foram solubilizados em 100 microL de
DMSO sob agitaccedilatildeo intensa
48
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS
O sangue de cavalo foi colhido em bolsas de transfusatildeo (CPDA-1 JP
Induacutestria Farmacecircutica SA Satildeo Paulo Brasil) atraveacutes de punccedilatildeo venosa jugular
O sangue foi diluiacutedo 11 (vv) em PBS e 40 mL do sangue diluiacutedo foram
adicionados a tubos para centriacutefuga esteacutereis (tubos Falcon de 50 mL) sobre 8 mL de
Ficoll Paque Plus e centrifugado (400g por 40 minutos a 40C) para o isolamento das
ceacutelulas PMN por gradiente
Apoacutes a centrifugaccedilatildeo a camada superior composta por plasma soluccedilatildeo de
Ficoll e ceacutelulas mononucleares foi descartada A camada inferior composta
principalmente por PMNs e eritroacutecitos foi dividida em duas aliacutequotas iguais as quais
foram separadas em dois tubos para centriacutefuga A cada aliacutequota foi adicionada
soluccedilatildeo hemoliacutetica (NH4Cl 077 tris[hydroxymethyl]aminomethane 021 pH 74
soluccedilatildeo aquosa) para completar 50 mL e incubadas por 20 minutos a 370C em
estufa
A seguir a suspensatildeo celular livre dos eritroacutecitos foi centrifugada (400g 6
min 4oC) O sobrenadante foi descartado e o pellet de ceacutelulas (basicamente PMNs)
foi ressuspendido em 5 mL de PBS contendo glucose 5 mM A densidade de ceacutelulas
foi determinada em cacircmara de Neubauer e ajustada para 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL
A viabilidade celular foi determinada atraveacutes do corante vital Azul de Tripan e
resultou aproximadamente 95 A percentagem de neutroacutefilos na suspensatildeo de
PMNs foi superior a 90 determinada pela coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico
Laborclin Pinhais PR Brasil)
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE Ca++ EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE et al 2001)
Agrave suspensatildeo de PMNs (toacutepico 39) na densidade de 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL foi adicionado FURA-2 AM (Sigma soluccedilatildeo estoque 1 nM em DMSO)
para concentraccedilatildeo final de 1 microM A suspensatildeo foi incubada em ambiente escuro a
37oC por 45 minutos
Nesta etapa os PMNs incorporaram o FURA-2 AM um indicador fluorescente
de caacutelcio Quando o FURA-2 AM estaacute ligado ao Ca++ haacute reduccedilatildeo da eficiecircncia de
49
excitaccedilatildeo a 380 nm e aumento da eficiecircncia de excitaccedilatildeo a 340 nm observados no
comprimento de onda de emissatildeo de 510 nm Com isso eacute possiacutevel quantificar a
concentraccedilatildeo de Ca++ intracelular nas ceacutelulas carregadas com FURA-2 AM atraveacutes
da relaccedilatildeo da intensidade de emissatildeo a 510 nm entre os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo de 340 nm e de 380 nm (relaccedilatildeo 340380 nm)
Apoacutes a incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram lavadas duas vezes com soluccedilatildeo de
Ringer (NaCl 1425 mM KCl 40 mM CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM 50 mM 4-(2-
hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid glicose 50 mM pH 74 soluccedilatildeo
aquosa) para a remoccedilatildeo do FURA-2 AM que natildeo foi incorporado agraves ceacutelulas
As ceacutelulas entatildeo foram ressuspendidas em soluccedilatildeo de Ringer para uma
concentraccedilatildeo final de 225 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL Esta foi a preparaccedilatildeo utilizada
na leitura de fluorescecircncia
A suspensatildeo de ceacutelulas foi mantida em gelo ateacute a sua utilizaccedilatildeo Aliacutequotas de
2 mL eram previamente incubadas em banho-maria por 4 minutos a 37oC no escuro
(tubo envolto em papel alumiacutenio) previamente a serem transferidas para uma cubeta
para a leitura da fluorescecircncia em espectrofluoriacutemetro acoplado a um
microcomputador (RF5301PC Shimadzu Kyoto Japatildeo) controlado pelo software
Super Ion Probe (Shimadzu Kyoto Japatildeo) Durante esta incubaccedilatildeo as ceacutelulas que
seriam utilizadas como controle negativo para PAF foram tratadas com antagonista
de receptor de PAF BN52021 (Biomol soluccedilatildeo 10 mM em DMSO)
Foi utilizada excitaccedilatildeo dual com comprimentos de onda 340 nm e 380 nm
(janela de leitura de 2 segundos) com emissatildeo registrada a 510 nm A temperatura
foi mantida em 37oC pelo sistema termostatisado do aparelho A leitura da
fluorescecircncia consistiu primeiramente da obtenccedilatildeo de uma linha de base nos
primeiros 50 segundos Apoacutes esta leitura inicial foram adicionados 10 microL do extrato
lipiacutedico (toacutepico 38) agrave suspensatildeo de ceacutelulas seguindo-se a agitaccedilatildeo (por 3
segundos) com uma barra magneacutetica presente dentro da cubeta A leitura foi feita
entatildeo por mais 100 segundos
Para cada amostra foram realizados os procedimentos descritos na presenccedila
e na ausecircncia de BN52021 A resposta maacutexima obtida pelo tratamento da
suspensatildeo de PMNs com extrato lipiacutedico na presenccedila de BN52021 foi subtraiacuteda da
resposta maacutexima obtida na ausecircncia deste antagonista O resultado desta subtraccedilatildeo
foi utilizado como indicador semiquantitativo da bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico e os resultados foram expressos como relaccedilatildeo 340380 nm
50
Antes de analisar as amostras de extrato lipiacutedico para a bioatividade de PAF
a cada experimento a suspensatildeo de PMNs tratada com FURA-2 AM foi testada com
PAF (1-0-palmitil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina soluccedilatildeo estoque de 3 mM em
DMSO da Sigma) nas concentraccedilotildees de 1 10 e 100 nM e com 100 nM na presenccedila
de 150 microM de BN52021 (concentraccedilatildeo suficiente para antagonizar 102 nM de PAF)
A resposta dos PMNs de equinos aos padrotildees de PAF eacute mostrada na FIGURA 11
sendo representativa dos dados obtidos em todos os experimentos
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO REGISTRADA A 510 nm () SUSPENSAtildeO DE PMN () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 1 nM (diams) SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 10 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 100 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + BN52021 150 microM + PAF 100 nM A EMISSAtildeO BASAL DAS CEacuteLULAS PMN FOI REGISTRADA POR 50 SEGUNDOS PREVIAMENTE Agrave ADICcedilAtildeO DE PAF
Os PMNs do sangue de equinos foram utilizados no presente estudo como
uma ferramenta para a avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF (pelo influxo de Ca++ nos
PMNs induzido por PAF) Para a determinaccedilatildeo da viabilidade desta ferramenta
estudou-se a resposta dos PMNs do sangue de equino a diferentes concentraccedilotildees
de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na ausecircncia do antagonista de
PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose de neutroacutefilos e a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio por neutroacutefilos pelas teacutecnicas descritas
51
abaixo (ver toacutepicos 315 ndash fagocitose de macroacutefago alveolar 316 ndash produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar e 317 ndash produccedilatildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio por macroacutefago alveolar) sendo que para cada ensaio foram realizadas
quatro repeticcedilotildees Igualmente estudou-se a resposta do macroacutefago alveolar a
diferentes concentraccedilotildees de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na
ausecircncia do antagonista de PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose e a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem realizando-se quatro
repeticcedilotildees para cada anaacutelise
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)
Em microplaca de 96 poccedilos 250microL de reagente de Bradford (100mg de
Coomassie Blue 50 mL de etanol 95 + 100 mL de aacutecido fosfoacuterico 85 completar
com aacutegua ultra pura para 1000 mL) foi adicionado a 10 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA) Nesta etapa o
corante Comassie eacute complexado por proteiacutenas presentes na amostra o que muda a
sua cor
Apoacutes 5 minutos em temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada a
595 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-Rad
Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) A concentraccedilatildeo de proteiacutenas foi determinada
interpolando-se os valores de absorbacircncia numa curva padratildeo resultante de
concentraccedilotildees conhecidas de albumina seacuterica bovina (Sigma) Os resultados foram
expressos como miligramas de proteiacutenas por mililitro de LBA
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR e MARLETTA 1985)
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA foi utilizada como indicador da produccedilatildeo de
oacutexido niacutetrico na regiatildeo broncoalveolar
Em micro placa de 96 poccedilos adicionou-se 100 microL de reagente de Griess
(mistura de cloreto de naftiletilenodiamina a 005 e por sulfanilamida a 05 em
meio aacutecido proporcionado por H3PO4 a 25) a 100 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA)
52
A sulfanilamida (um derivado de anilina) reage com o aacutecido nitroso e apoacutes
rearranjos intramoleculares forma o iacuteon diazocircnio Apoacutes o iacuteon diazocircnio reage com a
naftiletilenodiamina (um derivado de naftilamina) para formar pigmento roacuteseo
Depois de 5 minutos na temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada
a 550 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-
Rad Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) Os resultados foram expressos como
absorbacircncia a 550 nm
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO
LBA (NOUROOZ-ZADEH et al 1994)
Utilizou-se uma aliacutequota de suspensatildeo de ceacutelulas de LBA na densidade de
15 x 106 ceacutelulasmL de LBA Esta foi ultrasonicada (6 ciclos de 4 segundos) em 1mL
de metanol sendo centrifugada em seguida a 5000g por 5 minutos a 40C
(Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
Uma aliacutequota de 50 microL de sobrenadante foi armazenada para posterior
mensuraccedilatildeo da concentraccedilatildeo total de proteiacutenas
Para cada amostra aliacutequotas de 90 microL foram depositadas em seis frascos
para centriacutefuga (de 15 mL Eppendorf) foi agitada no voacutertex e incubada por 30
minutos a temperatura ambiente A trecircs desses tubos foram adicionados 10 microL de
soluccedilatildeo metanoacutelica de trifenilfosfina (TPP Sigma) 10 mM para ocorrer a reduccedilatildeo
seletiva de hidroperoacutexidos (os grupamentos hidroperoacutexido especificamente os
presentes em lipiacutedios satildeo convertidos a grupamentos hidroxila pela trifenilfosfina)
As amostras contidas nos trecircs tubos restantes receberam apenas 10 microL de metanol
Todos os tubos foram agitados vigorosamente e entatildeo incubados em temperatura
ambiente por 30 minutos
Apoacutes adicionou-se a todos os tubos 900 microL de reagente de FOX2 Este
reagente deve ser preparado no momento do uso consistindo de xilenol laranja 100
microM hidroxitolueno butilado (BHT) 400 mM aacutecido sulfuacuterico 25 mM e sulfato ferroso
de amocircnio 250 microM em metanol 90 (vv em aacutegua) Apoacutes agitaccedilatildeo o meio
reacional foi incubado por mais 30 minutos a temperatura ambiente
Nesta etapa os caacutetions ferrosos (Fe2+) do reativo de FOX2 satildeo oxidados por
hidroperoacutexidos presentes na amostra (tanto pelos hidroperoacutexidos lipiacutedicos quanto
por outros tipos de hidroperoacutexidos presentes na amostra) Como todos os
53
hidroperoacutexidos lipiacutedicos das amostras tratadas com TPP foram reduzidos a
produccedilatildeo de Fe3+ seraacute menor nestas do que nas amostras natildeo tratadas com TPP
O Fe3+ formado eacute entatildeo quelado pelo xilenol laranja o que faz a cor deste
indicador passar de laranja a azul-puacuterpura (passa a absorver luz em 560 nm)
Passado o tempo de incubaccedilatildeo a absorbacircncia foi mensurada a 560 nm
utilizando-se um espectrofotocircmetro (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil
Satildeo Paulo)
Subtraiu-se entatildeo o valor da absorbacircncia das amostras tratadas com TPP
(sem hidroperoacutexidos lipiacutedicos) do valor da absorbacircncia das amostras sem TPP O
valor obtido nessa subtraccedilatildeo (referente apenas agrave quantidade de ferro oxidado por
hidroperoacutexidos lipiacutedicos) foi utilizado na foacutermula da curva padratildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio obtida com soluccedilotildees padratildeo de diferentes concentraccedilotildees (1000 500
250 125 62 31 e 16 microM) submetidas aos mesmos procedimentos descritos
acima para a dosagem de hidroperoacutexidos (com exceccedilatildeo ao tratamento com TPP) O
resultado obtido foi referente agrave concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos
Dividiu-se o valor da concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos pela
concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais do extrato metanoacutelico Os resultados foram
expressos como nmolesmg de proteiacutenas
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984)
Utilizou-se 300 microL de uma suspensatildeo de ceacutelulas de LBA em PBS na
densidade de 5 x 106 ceacutelulasmL que foram centrifugados (10600g por 20min a
4oC) para remoccedilatildeo de partiacuteculas
Apoacutes foi colocada em banho com gelo Uma aliacutequota de 10 microL desse extrato
de ceacutelulas foi adicionada a 990 microL de meio reativo (soluccedilatildeo aquosa de H2O2 20 mM
tris[hidroximetil] aminometano 005M e EDTA 025 mM pH 74)
Imediatamente utilizando-se um espectrofotocircmetro acoplado a um
microcomputador (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil Satildeo Paulo)
monitorou-se a absorbacircncia a 220 nm por 90 segundos a 370C com intervalos de 2
segundos entre leituras consecutivas
A degradaccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio pela catalase causa uma diminuiccedilatildeo
gradual na absorbacircncia do meio reativo a 220 nm a qual indica a atividade da
catalase no extrato de ceacutelulas Os valores de atividade da catalase foram corrigidos
54
pela concentraccedilatildeo de proteiacutenas do extrato de ceacutelulas (realizado conforme descrito
no toacutepico 311) e foram expressos como micromoles de H2O2minmg proteiacutenas
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA et al 1998)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL (= 5 x 105
ceacutelulaspoccedilo) e os macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A
suspensatildeo de ceacutelulas na densidade descrita foi obtida durante o processamento do
LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS e foram adicionados
20microL de zymosan corado com vermelho neutro (67 mgmL) mais 100 microL de PBS
sendo deixados a temperatura ambiente por 30 minutos
Em seguida depois de descartado o sobrenadante as ceacutelulas foram fixadas
com soluccedilatildeo de Baker (4 formaldeiacutedo 2 cloreto de soacutedio 1 acetato de caacutelcio
soluccedilatildeo aquosa) por 30 minutos
Apoacutes os poccedilos foram lavados com PBS para que o zymosan corado com
vermelho neutro natildeo fagocitado por macroacutefagos alveolares fosse retirado
Em seguida o corante vermelho neutro foi solubilizado em cada poccedilo com
200microL de soluccedilatildeo aacutecido-aacutelcool (aacutecido aceacutetico 1 etanol 50 soluccedilatildeo aquosa) e
deixado por 30 minutos
Apoacutes este periacuteodo a absorbacircncia foi mensurada a 550 nm Os resultados
foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 -
Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA et al 1998)
Estimou-se a produccedilatildeo de acircnions pela da formaccedilatildeo de formazan produto da
reduccedilatildeo do NBT (nitroblue tetrazolium) pelo acircnion superoacutexido Avaliou-se a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA
(phorbol myristate acetate) O PMA estimula o complexo NADPH oxidase na
membrana dos fagoacutecitos a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
55
mimetizando o resultado da fagocitose de um microorganismo (DEKKER et al
2000)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para a retirada das
ceacutelulas natildeo aderentes Em seguida adicionou-se a cada poccedilo 100 microL de PBS com
NBT 02 ou com NBT 02 mais PMA 11microM sempre em triplicatas para cada
potro
Apoacutes a incubaccedilatildeo por 1 hora a 370C e em ambiente escuro (a placa deve
estar envolta em papel alumiacutenio) a placa foi centrifugada (800g por 5 minutos a
40C) Em seguida o sobrenadante foi descartado e 100 microL de PBS foram
adicionados a cada poccedilo e a placa foi novamente centrifugada
Apoacutes o sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram fixadas com metanol
por 10 minutos Em seguida a placa passou por nova centrifugaccedilatildeo o sobrenadante
foi descartado e a placa foi deixada secar ao ar em estufa
Em seguida a placa foi lavada duas vezes com metanol 50 e o formazan
(produto da reaccedilatildeo entre o NBT e o acircnion superoacutexido) foi solubilizado atraveacutes da
incubaccedilatildeo por 30 minutos com 120 microL soluccedilatildeo aquosa de hidroacutexido de potaacutessio 2M
e 140 microL de dimetilsulfoacutexido por poccedilo
A absorbacircncia foi lida a 595 nm e os resultados foram corrigidos pela adesatildeo
de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago
Alveolar)
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK e MIZEL 1981)
Mensurou-se a produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) por macroacutefago
alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA atraveacutes da oxidaccedilatildeo do vermelho
fenol pela peroxidase onde esta enzima utiliza nesta reaccedilatildeo o H2O2 O composto
oxidado absorve luz em pH baacutesico com maacutexima intensidade em 550 nm
56
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS observando-se a retirada
de grumos presentes nos poccedilos Em seguida 100 microL de soluccedilatildeo de vermelho fenol
(PRS phenol red solution 140 mM NaCl 10 mM fosfato de potaacutessio 55 mM
dextrose 056 mM vermelho fenol 19 UmL de HRPO horse radish peroxidase pH
70 soluccedilatildeo aquosa) ou soluccedilatildeo de vermelho fenol + PMA 110nM foram adicionados
a cada poccedilo em triplicatas e deixados incubar por 1 hora a 370C no escuro
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo adicionou-se 10 microL de NaOH 1N para
interromper a reaccedilatildeo alcalinizar o meio e permitir a absorbacircncia da soluccedilatildeo que foi
lida a 595 nm apoacutes 30 minutos
Os resultados foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada
potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN e GORDON 1987)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para se selecionar as
ceacutelulas aderentes que a seguir foram fixadas com metanol 50 por 10 minutos
Apoacutes este periacuteodo o sobrenadante foi descartado e 100 microL de corante de
Giemsa a 02 foram adicionados a cada poccedilo e deixados por 40 minutos em
temperatura ambiente
Os poccedilos foram novamente lavados com PBS por duas vezes observando-se
a retirada de grumos nos poccedilos e 200 microL de metanol 50 foram adicionados
Apoacutes 30 minutos a absorbacircncia da suspensatildeo foi lida a 550 nm
A adesatildeo resultou menor no grupo DA (n=17) em comparaccedilatildeo ao grupo CN
(n=36) (P=0010) sendo que o grupo EX (n=26) apresentou adesatildeo maior que o
grupo DA (P=0001) (FIGURA 12) indicando diferenccedilas na capacidade de adesatildeo
em placa acriacutelica possivelmente devido a diferenccedilas no estado funcional das ceacutelulas
57
de cada grupo Por esta razatildeo utilizou-se o ensaio de adesatildeo de macroacutefago
alveolar realizado concomitantemente aos ensaios de funccedilatildeo de macroacutefago
(fagocitose e produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) a cada
experimento realizado durante o estudo A correccedilatildeo dos valores obtidos de
macroacutefago em funccedilatildeo da adesatildeo foi feito atraveacutes da divisatildeo da meacutedia final obtida
para o ensaio de funccedilatildeo de macroacutefago dividido pela meacutedia obtida no ensaio de
adesatildeo para cada potro avaliado e a cada experimento realizado
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 (ROSEN e GORDON 1987) aP=0010 vs CN e bP=0001 vs DA
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
A normalidade na distribuiccedilatildeo dos dados foi avaliada pelo teste de D‟Agostino
e Pearson Valores considerados outliers pelo teste de Grubb foram excluiacutedos das
anaacutelises Para os dados que apresentaram distribuiccedilatildeo normal dos valores
(distribuiccedilatildeo Gaussiana) (contagem percentual de linfoacutecitos concentraccedilatildeo total de
proteiacutenas do LBA bioatividade de PAF catalase hidroperoacutexidos nitritos fagocitose
de macroacutefago alveolar produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio
por macroacutefago alveolar) foi utilizado o teste t natildeo pareado Os dados com
distribuiccedilatildeo natildeo Gaussiana dos valores (contagens percentuais de neutroacutefilos de
58
eosinoacutefilos e de macroacutefagos multinucleados contagem do NTCN do LBA e adesatildeo
de macroacutefago alveolar) foram analisados pelo teste de Mann-Whitney A
comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos de funccedilatildeo de macroacutefago alveolar
estimulado e natildeo estimulado por PMA foi feita por teste t de Student natildeo pareado
Os achados cliacutenicos e endoscoacutepicos foram analisados por meio de teste de Mann-
Whitney A correlaccedilatildeo entre o percentual de um mesmo tipo celular no aspirado
traqueal e no lavado broncoalveolar foi analisada atraveacutes do teste de Spearman
Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas utilizando-se o programa GraphPad
Prism versatildeo 500 para Windows (GraphPad Software San Diego CA EUA) e os
valores apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia (SEM) Valores de
Plt005 foram considerados como significativos
4 RESULTADOS
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica
Nenhum dos potros dos grupos CN e DA apresentou tosse segundo o
histoacuterico obtido Contudo oito potros (235) do grupo EX apresentaram tosse
espontacircnea na cocheira ou durante o treinamento o que resultou em diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0002) (TABELA 1)
A presenccedila de corrimento nasal seroso (coriza) observada nos trecircs grupos
estudados estaacute demonstrada na TABELA 1 Natildeo houve diferenccedila significativa entre
os grupos apesar de o percentual de potros com coriza no grupo DA ter reduzido
em relaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
Os linfonodos submandibulares eou retrofaringeanos estiveram aumentados
em 382 222 e 382 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
natildeo havendo diferenccedila entre os grupos (TABELA 1)
A auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e traqueal resultou normal em todos os potros
avaliados dos trecircs grupos estudados Contudo sons pulmonares crepitantes foram
audiacuteveis em 28 156 e 115 dos potros avaliados nos grupos CN DA e EX
respectivamente havendo um aumento do percentual de crepitaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo DA em ralaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DE CORRIDA
Grupos Tosse
Espontacircnea
Corrimento
Nasal
Linfonodos
Auscultaccedilatildeo
Pulmonar
CN 034
(0)
1534
(441)
1334
(382)
136
(28)
DA 045
(0)
1145
(244)
1045
(222)
745
(156)
EX 834
(235)a
1534
(441)
1334
(382)
326
(115)
aP=0002 vs DA
60
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas
No iniacutecio da avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas primeiramente
considerando os foliacuteculos linfoacuteides faringeanos ou hiperplasia folicular linfoacuteide (HFL)
a distribuiccedilatildeo das diferentes graduaccedilotildees pode ser vista na TABELA 2
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGEANOS OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS DE I A IV SEGUNDO RAKER E BOLES (1978)
Grupos HFL I HFL II HFL III HFL IV
CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)
DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)
EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)
Considerando as graduaccedilotildees de HFL III e IV como faringite esta
anormalidade foi observada em 546 286 e 539 dos potros dos grupos CN
DA e EX respectivamente Houve uma significativa reduccedilatildeo no percentual meacutedio de
observaccedilotildees de faringite para o grupo DA em comparaccedilatildeo ao grupo CN (P=0024)
enquanto no grupo EX o percentual de faringites foi significativamente maior em
relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0039)
Com relaccedilatildeo ao aspecto morfoloacutegico da epiglote um potro do grupo DA e um
potro do grupo EX evidenciaram epiglote com aspecto fraacutegil sendo que os demais
potros foram normais
Com relaccedilatildeo agrave avaliaccedilatildeo funcional da laringe todos os potros foram normais
apresentando graduaccedilotildees I ou II (TABELA 3)
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE ACORDO COM RAKESTRAW et al (1991)
Grupos NLP I NLP II NLP III NLP IV
CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)
DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)
EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)
61
A quantidade de secreccedilatildeo observada no lume traqueal estaacute demonstrada na
TABELA 4
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 SEGUNDO GERBER et al (2004)
Grupos 0 1 2 3 4 5
CN 233
(61)
933
(273)
933
(273)
1133
(332)
233
(61)
033
(0)
DA 742
(167)
1242
(286)
1242
(286)
742
(167)
342
(70)
142
(24)
EX 327
(111)
727
(259)
727
(259)
627
(223)
427
(148)
027
(0)
Quantidade de secreccedilatildeo traqueal acima de grau 2 considerada passiacutevel de
prejuiacutezo agrave troca gasosa e ao rendimento desportivo foi observada em 666 547
e 630 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT)
Os achados de anaacutelise citoloacutegica diferencial para os principais tipos celulares
do AT para os trecircs grupos de potros estudados estatildeo demonstrados na TABELA 5
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN (n=20) DA (n=19) E EX (n=15) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
Grupos Mac Lin Neut Eos Mast Calic Multi Epit Sid
CN 429plusmn63 75
plusmn19
76
plusmn29
12
plusmn07
002
plusmn02
05
plusmn02
02
plusmn01
201
plusmn56
0
DA 591
plusmn41
141
plusmn24
85
plusmn23
11
plusmn05
0 01
plusmn01
11
plusmn02a
161
plusmn48
0
EX 593
plusmn42
134
plusmn23
171
plusmn49
09
plusmn03
0 05
plusmn03
08
plusmn03
71
plusmn32
09
plusmn04
Mac macroacutefago alveolar Lin linfoacutecitos Neut neutroacutefilos Eos eosinoacutefilos Mast mastoacutecitos Calic ceacutelulas caliciformes Multi macroacutefagos multinucleados Epit ceacutelulas epiteliais Sid hemossideroacutefagos aPlt0001 vs CN
62
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA)
As quantidades de LBA recuperado estiveram entre 54 e 59 do volume
infundido para os grupos CN (n=16) DA (n=23) e EX (n=16)
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
A contagem do NTCN e a contagem diferencial de ceacutelulas do LBA estatildeo
demonstradas na TABELA 6
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN (n=45) DA (n=40) E EX (n=34) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
CTCN
(ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Macroacutef
Multi
Hemosid
CN 395
plusmn 38
673
plusmn 17
294
plusmn 15
23
plusmn 04
05
plusmn 03
005
plusmn 004
04
plusmn 01
0
DA 343
plusmn 24
698
plusmn 14
281
plusmn 13
09
plusmn 02
12
plusmn 01
002
plusmn 002
11
plusmn 01d
0
EX 456
plusmn 28a
676
plusmn 18
229
plusmn 15
54
plusmn 11b
15
plusmn 07c
02
plusmn 01
13
plusmn 02
22
plusmn 06
CTCN = contagem total de ceacutelulas nucleadas Macroacutef = macroacutefagos Linfoacutec = linfoacutecitos Neutroacutef = neutroacutefilos Eosino = eosinoacutefilos Masto = mastoacutecitos Macroacutef Multi = macroacutefagos multinucleados Hemosid = hemossideroacutefagos aPlt001 vs DA bPlt0001 vs DA cPlt005 vs DA dPlt0001 vs CN
Hemossideroacutefagos foram observados somente no LBA dos potros do grupo
EX mais especificamente em 23 (622) deles representando 22 do total de
ceacutelulas A quantidade observada de hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 da
contagem citoloacutegica diferencial do LBA
A correlaccedilatildeo entre as contagens percentuais de um mesmo tipo celular no AT
e no LBA foi analisada para os potros do grupo CN (n=11) DA (n=18) e EX (n=12)
que tiveram material colhido para as duas teacutecnicas citoloacutegicas natildeo tendo sido
63
encontrada correlaccedilatildeo entre ambas as teacutecnicas de avaliaccedilatildeo citoloacutegica para
nenhuma das ceacutelulas
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF
A resposta dos neutroacutefilos do sangue de equino frente ao PMA e frente ao
PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na ausecircncia e na presenccedila
do antagonista de PAF BN52021 estaacute demonstrado nas FIGURAS 13 a 15
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF aP=0028 vs controle bPlt0001 vs sem BN52021 cP=0028 vs PMA
64
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0007) 10nM (aP=0003) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA e PAF 1 e 10nM
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF EM TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA ePlt0001 vs PAF 1nM e fPlt0001 vs PAF 1nM e 10nM
65
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF
Tambeacutem se estudou a resposta dos macroacutefagos alveolares de equino frente
ao PMA e frente ao PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 demonstrado nas
FIGURAs 16 a 18
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0003) 10nM (aPlt0001) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0010 vs PMA dPlt0001 vs PAF 01nM e PAF 1nM
66
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0037) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA e PAF 01nM dPlt0001 vs PAF 1nM
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 01nM e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA dPlt001 vs PAF 1nM e 10nM
67
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos
foi mensurada pelo influxo de Ca++ em ceacutelulas PMN de equinos (FIGURA 19)
Registrou-se uma baixa relaccedilatildeo 340380 nm para os grupos CN (0005 plusmn 0002
relaccedilatildeo 340380 nm) e DA (0006 plusmn 0002 relaccedilatildeo 340380 nm) representando um
baixo niacutevel de bioatividade de PAF no LBA dos potros avaliados nestes grupos
Contudo a bioatividade de PAF do grupo EX (0068 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm) foi
significativamente maior em comparaccedilatildeo ao grupo DA (P=0017) Um graacutefico
representativo da bioatividade de PAF em uma das amostras do grupo EX na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 pode ser visto na FIGURA
20
CN DA EX000
002
004
006
008
010 a
Re
laccedil
atildeo
34
03
80
nm
Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedicodas Ceacutelulas do LBA
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE AO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0017 vs DA
68
0 50 100
150
200
0
1
2
3
4
Tempo (segundos)
Bioatividade de PAFR
ela
ccedilatildeo
3403
80n
m
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm A AMOSTRA Eacute ADICIONADA Agrave SUSPENSAtildeO DE CEacuteLULAS PMN APOacuteS 50 SEGUNDOS DE LEITURA BASAL (SETA)
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi maior no grupo DA em relaccedilatildeo
ao grupo CN (014 plusmn 003 vs 003 plusmn 001 mg de proteiacutenasmL de LBA) (P=0001) O
grupo EX apresentou concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA (036 plusmn 006 mg de
proteiacutenasmL de LBA) significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001)
(FIGURA 21)
69
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0001 vs CN bPlt0001 vs DA
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos foi maior no LBA do grupo DA (019 plusmn 001
absorbacircncia 550 nm) em relaccedilatildeo ao grupo CN (014 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm)
(P=0011) O grupo EX apresentou uma reduccedilatildeo significativa na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA (008 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm) significativamente menor em
comparaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001) (FIGURA 22)
70
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0011 vs CN bPlt0001 vs DA
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (1047 plusmn 241 vs 66
plusmn 35 nmolesmg de proteiacutenas) (Plt0001) No grupo EX a concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos nas ceacutelulas do LBA apresentou reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo
DA (352 plusmn 84 vs 1047 plusmn 241 nmolesmg de proteiacutenas) (P=0007) (FIGURA 23)
71
Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos no LBA
CN DA EX0
50
100
150a
b
nm
ole
s
mg
de
pro
teiacuten
as
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX (n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO APRESENTADOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNA DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aPlt0001 vs CN bP=0007 vs DA
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA
No grupo EX a atividade da catalase nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol
H2O2minmg de proteiacutenas) (P=0002) natildeo havendo diferenccedila entre os grupos CN e
DA (FIGURA 24)
72
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO microMOL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOMINUTOMILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0002 vs DA
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
A fagocitose de macroacutefago alveolar foi significativamente maior no grupo DA
em comparaccedilatildeo ao grupo CN (223 plusmn 043 vs 072 plusmn 018 absorbacircncia 550
nmadesatildeo) (P=0002) Observou-se uma diminuiccedilatildeo na fagocitose no grupo EX em
relaccedilatildeo ao grupo DA (104 plusmn 027 vs 223 plusmn 043 absorbacircncia 550 nmadesatildeo)
(P=0006) (FIGURA 25)
73
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A FAGOCITOSE PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (FAGOCITOSEADESAtildeO) aP=0002 vs CN e bP=0006 vs DA
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar
A utilizaccedilatildeo de PMA aumentou significativamente a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido pelos macroacutefagos alveolares dos grupos DA (219 plusmn 053 vs 392 plusmn 062
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0049) e EX (060 plusmn 011 vs 090 plusmn 014
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0031) A produccedilatildeo basal de acircnion superoacutexido foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (219 plusmn 053 vs 025
plusmn 007 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo DA (060 plusmn 011 vs 219 plusmn 053 absorbacircncia 595
nmadesatildeo) (P=0001) A produccedilatildeo de acircnion superoacutexido estimulada por PMA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (392 plusmn 062 vs 046
plusmn 016 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
74
diminuiccedilatildeo na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido em comparaccedilatildeo ao grupo DA (090 plusmn
014 vs 392 plusmn 062 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) (FIGURA 26)
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0049 vs DA bP=0031 vs EX cPlt0001 vs CN dP=0001 vs DA ePlt0001 vs CNe fPlt0001 vs DAe
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
O PMA aumentou a produccedilatildeo de H2O2 pelos macroacutefagos alveolares nos
grupos CN (041 plusmn 008 vs 099 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0004) DA
(035 plusmn 005 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0002) e EX (010 plusmn
001 vs 034 plusmn 008 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) A produccedilatildeo basal de
H2O2 para o grupo EX foi significativamente menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (010 plusmn
001 vs 035 plusmn 005 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) Aleacutem disso a produccedilatildeo
75
de H2O2 estimulada por PMA diminuiu no grupo EX tendo sido significativamente
menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (034 plusmn 008 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia
595nmadesatildeo) (P=0006) (FIGURA 27)
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0004 vs CN bP=0002 vs DA cPlt0001 vs EX dPlt0001 vs DA eP=0006 vs DAe
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
Hemossideroacutefagos foram observados no LBA de 23 potros (622) sendo
que estes foram considerados no subgrupo HPIE pos A quantidade observada de
76
hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 A ausecircncia de hemossideroacutefagos foi
evidenciada em 14 potros (378) sendo que estes foram considerados para o
subgrupo HPIE neg
Dentre os potros avaliados 15 (405) deles (10 potros do subgrupo HPIE
pos e 5 potros do subgrupo HPIE neg) apresentaram mais de 5 de neutroacutefilos eou
mais de 1 de eosinoacutefilos na contagem diferencial de ceacutelulas indicando um perfil
citoloacutegico de LBA compatiacutevel com inflamaccedilatildeo pulmonar
Os valores do NTCN bem como da contagem diferencial de ceacutelulas para o
grupo EX e para os subgrupos estaacute demonstrado na TABELA 7
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX (n=37) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=23) E HPIE NEG (n=14)
CTCN (ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Siderof
Grupo EX
456 plusmn 28
676 plusmn 18
229 plusmn 15
47 plusmn 10
13 plusmn 06
02 plusmn 01
22 plusmn 35
HPIE pos
571
plusmn 78a
645
plusmn 22b
240 plusmn 20
56 plusmn 12
09 plusmn 07
02 plusmn 02
34 plusmn 37
HPIE neg
348 plusmn 38
725 plusmn 30
207 plusmn 25
35 plusmn 18
19 plusmn 11
03 plusmn 01
00
CTCN contagem total de ceacutelulas nucleadas Macrof macoacutefagos Linfoc linfoacutecitos Neutrof
neutroacutefilos Eosinof eosinoacutefilos Mastoc mastoacutecitos Siderof hemossideroacutefagos aP=0005
vs HPIE neg bP=0020 vs HPIE neg
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg
(018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm P=0042) (FIGURA 28)
77
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) e HPIE NEG (n=5) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO RELACcedilAtildeO 340380nm aP=0042 vs HPIE neg
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi significativamente maior no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (039 plusmn 008 vs 019 plusmn
004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) (FIGURA 29)
78
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=13) E HPIE NEG (n=12) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS POR MILILITRO DE LBA aP=0031 vs HPIE neg
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos resultou
significativamente reduzida em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (008 plusmn 003 vs
012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) (FIGURA 30)
79
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) E HPIE NEG (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 550 nm aP=0049 vs HPIE neg
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA dos potros do
subgrupo HPIE pos resultou significativamente maior que no subgrupo HPIE neg
(367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) (FIGURA 31)
80
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) E HPIE NEG (n=8) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS aP=0009 vs HPIE neg
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
Natildeo houve diferenccedila na fagocitose de macroacutefago alveolar entre os grupos
estudados
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-)
A produccedilatildeo basal de O2- por macroacutefagos alveolares resultou similar entre os
grupos estudados A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0047) mas natildeo no subgrupo HPIE pos
(FIGURA 32)
A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA foi significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (081 plusmn 011 vs 124 plusmn
015 absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0042) (FIGURA 32)
81
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) E HPIE NEG (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0047 vs HPIE neg bP=0042 vs HPIE neg e
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
A produccedilatildeo basal de H2O2 por macroacutefago alveolar foi similar entre os grupos
avaliados no presente estudo A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0002) mas natildeo no subgrupo HPIE
neg (FIGURA 33)
A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA resultou significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (025 plusmn 003 vs 067 plusmn 014
absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0001)
82
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) E HPIE NEG (n=6) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2 ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0002 vs HPIE neg bP=001 vs HPIE neg e
5 DISCUSSAtildeO
O estudo da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas de cavalos de corrida adultos jovens
em trecircs diferentes situaccedilotildees em seu ambiente natural foi possiacutevel devido agrave
utilizaccedilatildeo de um grande nuacutemero de animais Assim permitiu-se detectar diferenccedilas
entre os grupos mesmo havendo variaccedilotildees ambientais tais como estaccedilotildees do ano
condiccedilotildees climaacuteticas e diferenccedilas sutis em manejo Como os potros dos trecircs grupos
encontravam-se na mesma faixa etaacuteria de risco para as doenccedilas respiratoacuterias virais
e os experimentos foram realizados durante um mesmo periacuteodo as diferenccedilas entre
os grupos CN e DA foram consideradas como sendo devido ao ambiente e as
diferenccedilas entre os grupos DA e EX foram consideradas como sendo devido ao
treinamento
O grupo CN evidenciou um percentual de observaccedilotildees de faringite na
avaliaccedilatildeo endoscoacutepica (TABELA 2) maior que os 37 relatado por HOBO et al
(1995) em cavalos PSI de corrida de dois anos de idade Os potros deste grupo
foram mantidos integralmente em piquetes e nesta situaccedilatildeo a hiperplasia dos
foliacuteculos linfoacuteides da faringe em cavalos jovens pode ser uma resposta normal a
inalaccedilatildeo de antiacutegenos ambientais ou agentes infecciosos (HOLCOMBE e
DUCHARME 2007)
De fato as vias aeacutereas dos potros desse grupo deram mostra de estarem
sendo desafiadas pelo nuacutemero percentual de corrimento nasal linfonodos
aumentados e quantidades elevadas de secreccedilatildeo traqueal iguais aos demais
grupos (TABELAS 1 e 4) Possivelmente isso tambeacutem se deva a fatores climaacuteticos
pois no estudo de ROBINSON et al (2006) com cavalos de montaria de vaacuterias
idades aqueles que permaneceram fora dos estaacutebulos durante o inverno
apresentaram quantidades elevadas de muco traqueal No entanto diferentemente
do nosso estudo os cavalos avaliados por ROBINSON et al (2006) tiveram nuacutemero
percentual de neutroacutefilos aumentado na secreccedilatildeo traqueal enquanto os potros do
grupo CN resultaram em avaliaccedilatildeo citoloacutegica tanto de AT (TABELA 5) como de LBA
(TABELA 6) normais (ROBINSON 2003 HODGSON e HODGSON 2007)
evidenciando vias aeacutereas especialmente as vias aeacutereas inferiores saudaacuteveis
Com relaccedilatildeo ao desafio ambiental no presente estudo adotou-se um sistema
convencional de estabulaccedilatildeo pois estudos anteriores em modelos semelhantes ao
84
nosso jaacute demonstraram a presenccedila de altas concentraccedilotildees de endotoxinas
(BERNDT et al 2008) bem como de poeira e de aeroalergenos (WOODS et al
1993)
Contudo o desafio ambiental de 30 dias utilizado em nosso estudo resultou
em quadro comparaacutevel ao do grupo CN isento de processo inflamatoacuterio das vias
aeacutereas Possivelmente um periacuteodo maior de desafio pudesse causar um processo
inflamatoacuterio tal como foi demonstrado previamente por HOLCOMBE et al (2001)
onde potros da raccedila puro sangue aacuterabe que sofreram desafio ambiental de 90 dias
apresentaram aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no LBA Contudo no
estudo citado o material utilizado para a cama dos potros foi a palha que tambeacutem
representou um maior risco de desenvolvimento de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas dos
cavalos em outros estudos quando comparada a serragem utilizada na cama dos
potros do grupo DA (BURRELL et al 1996 VANDEPUT et al 1998 GERBER et
al 2000 KLEIBER et al 2005 DEWACHI et al 2006)
Entretanto ateacute o momento os efeitos dos fatores ambientais das cocheiras
nas vias aeacutereas foram relatados em sua maioria em cavalos apresentando ORVA e
natildeo em indiviacuteduos jovens e saudaacuteveis como os potros avaliados em nosso estudo
Nos animais com ORVA um curto periacuteodo de exposiccedilatildeo ambiental (6 a 48 horas)
em baia e recebendo alimentaccedilatildeo composta principalmente por feno causou
aumento da expressatildeo de algumas citocinas (pex IL-4 e IL-5) em alguns estudos
mas nenhuma alteraccedilatildeo em outros (GERBER et al 2000 AINSWORTH et al 2003
CORDEAU et al 2004 KLEIBER et al 2005) sendo que um longo tempo de
exposiccedilatildeo ambiental (variando de cinco semanas a trecircs meses) causou aumento da
expressatildeo de IFN-γ e IL-8 (AINSWORTH et al 2003) IL-9 (DEWACHI et al 2006)
IL-17 (DEBRUE et al 2005) e o desenvolvimento dos sinais cliacutenicos da ORVA
acompanhados de alteraccedilotildees na funccedilatildeo pulmonar (VANDEPUT et al 1998)
Contudo nos potros do grupo DA se evidenciou no AT (TABELA 5) e no LBA
(TABELA 6) um aumento significativo do nuacutemero percentual de macroacutefagos
multinucleados em comparaccedilatildeo ao grupo CN bem como nuacutemero percentual de
eosinoacutefilos acima do valor considerado limite para cavalos normais (ROBINSON
2003) sugerindo que houve uma resposta por parte do sistema de defesa nas vias
aeacutereas dos potros deste grupo
Os macroacutefagos multinucleados ou ceacutelulas gigantes multinucleadas satildeo
formados a partir da fusatildeo de dois ou mais macroacutefagos na resposta imune pulmonar
85
(ANDERSON et al 1999) representando especificamente uma resposta imune do
tipo Th2 com a participaccedilatildeo da IL-4 (HELMING e GORDON 2007) Em pessoas os
macroacutefagos multinucleados satildeo considerados como um achado indicativo de
reaccedilotildees inflamatoacuterias crocircnicas nas vias aeacutereas como a tuberculose por exemplo
(LEMAIRE et al 2006 HELMING e GORDON 2007) Em equinos satildeo escassos os
estudos envolvendo a citologia respiratoacuteria que descrevam o nuacutemero percentual
normal deste tipo celular De qualquer forma eacute relatado que pode ser observado em
pequeno nuacutemero em cavalos sem evidecircncias de doenccedila pulmonar sendo que uma
quantidade aumentada jaacute foi descrita associada agrave inflamaccedilatildeo crocircnica (DECONTO
1983 HODGSON e HODGSON 2007) Estas informaccedilotildees parecem natildeo corroborar
com o aumento no nuacutemero percentual de macroacutefagos multinucleados no grupo DA
em se tratando de potros jovens considerados saudaacuteveis o que demonstra a
necessidade de mais estudos para se entender o papel do macroacutefago multinucleado
no pulmatildeo saudaacutevel e na inflamaccedilatildeo pulmonar dos cavalos
Entretanto o nuacutemero percentual de eosinoacutefilos acima do limite normal no
LBA dos potros do grupo DA pode ser considerado como uma resposta ao
ambiente assim como eacute considerado em humanos (DENGUEZLI-BOUZGARROU et
al 2007) e jaacute relatado em cavalos (COUEumlTIL et al 2007)
O periacuteodo de treinamento por sua vez induziu inflamaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo EX O nuacutemero significativamente aumentado de potros com tosse
(TABELA 1) constituiu a evidecircncia cliacutenica sugerindo inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas nos
potros desse grupo Cavalos saudaacuteveis raramente tossem (ROBINSON 2007)
sendo a tosse um sinal cliacutenico comprovadamente associado agrave inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas (BURRELL et al 1996 McGROUM e DIXON 2007) CHRISTLEY et al
(2001) correlacionaram a tosse com a presenccedila de faringite sendo que tal
associaccedilatildeo tambeacutem foi observada no grupo EX (TABELAS 1 e 2) Adicionalmente
BEDENICE et al (2008) estudaram a relaccedilatildeo entre a tosse e a inflamaccedilatildeo pulmonar
e descreveram que os cavalos avaliados por apresentarem tosse tiveram contagens
percentuais de neutroacutefilos no LBA maiores que 5
No presente estudo um aumento no NTCN e nas contagens percentuais de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos do LBA (TABELA 6) confirmaram a presenccedila de inflamaccedilatildeo
pulmonar no grupo EX (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
COUEumlTIL et al 2007) A neutrofilia no LBA de cavalos de corrida jaacute foi
correlacionada a um baixo rendimento desportivo e constitui sinal chave para o
86
diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007) A eosinofilia no LBA de cavalos de
corrida por sua vez pode ser um achado transitoacuterio (VIEL e HEWSON 2003)
apesar de tambeacutem ter sido associada a um baixo rendimento desportivo aleacutem de
hiperresponsividade das vias aeacutereas em cavalos de corrida jovens (HARE e VIEL
1998) Portanto tais evidecircncias podem ser consideradas como um risco ao futuro
potencial atleacutetico dos potros do grupo EX
No presente estudo natildeo houve correlaccedilatildeo entre os achados citoloacutegicos de AT
e LBA para nenhum dos trecircs grupos estudados e esta falta de correlaccedilatildeo entre AT
e LBA jaacute foi relatada anteriormente Portanto entende-se que os epiteacutelios traqueal e
broncoalveolar respondem diferentemente aos agentes agressores sendo que a
avaliaccedilatildeo de cavalos com tosse ou diminuiccedilatildeo de rendimento desportivo deve ser
realizada por ambas as teacutecnicas associadas (MALIKIDES et al 2003 CHRISTLEY
RUSH 2007 HODGSON e HODGSON 2007)
A ligaccedilatildeo entre o exerciacutecio e a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas provavelmente
envolve diversos mediadores proacute-inflamatoacuterios que uma vez identificados poderatildeo
ser alvo para abordagens terapecircuticas com o objetivo de minimizar os efeitos
deleteacuterios da inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos PSI de corrida jovens Neste
contexto um dos mais potentes e versaacuteteis mediadores proacute inflamatoacuterios envolvidos
na inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas eacute o PAF (UHLIG et al 2005)
PAF eacute quimiotaacutetico para bem como produzido por eosinoacutefilos macroacutefagos e
neutroacutefilos em resposta a estresse fiacutesico ou quiacutemico apresentando muitos dos
criteacuterios essenciais de um mediador proacute inflamatoacuterio (OWEN et al 2005)
De fato estudos realizados in vitro demonstraram que o PAF pode induzir a
migraccedilatildeo de neutroacutefilos e monoacutecitos do cavalo (DAWSON et al 1988) Aleacutem disso
demonstrou-se a quimiotaxia de eosinoacutefilos e neutroacutefilos no trato respiratoacuterio de
murinos e humanos induzida por PAF (LEE et al 2002 ISHII et al 2004) Em
cavalos com ORVA a administraccedilatildeo intravenosa de PAF promoveu uma reduccedilatildeo de
leucoacutecitos no sangue perifeacuterico e apoacutes alguns minutos houve um aumento de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo seguido de uma deterioraccedilatildeo cliacutenica e da funccedilatildeo
respiratoacuteria (FAIRBAIRN et al 1996) Portanto apoiado nestes estudos e nos
resultados de aumento do NTCN e de neutrofilia e eosinofilia no LBA do grupo EX
(TABELA 6) eacute razoaacutevel assumir que o PAF possa contribuir para a induccedilatildeo da
inflamaccedilatildeo pulmonar observada nos potros PSI jovens em treinamento avaliados no
presente estudo
87
A inflamaccedilatildeo pulmonar tambeacutem estaacute associada a um aumento nas
concentraccedilotildees de proteiacutenas no LBA principalmente devido ao extravasamento de
plasma (TSANGARIS et al 2003) que pode ser resultado da accedilatildeo de vaacuterios
mediadores proacute inflamatoacuterios tal como o PAF
Um aumento da permeabilidade microvascular induzida pelo PAF resultando
em extravasamento de plasma e edema foi demonstrado previamente no estudo de
CLAVIJO et al (2001) Aleacutem disso WEST et al (1997) demonstraram o acuacutemulo de
um fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar de cavalos exercitados a velocidades
entre 13 ms e 16 ms No presente estudo o significativo aumento da concentraccedilatildeo
de proteiacutenas no LBA dos potros do grupo EX em comparaccedilatildeo ao grupo DA (FIGURA
21) confirma que a permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) estava
aumentada nos potros do grupo EX e o PAF pode estar envolvido neste mecanismo
Diferentemente o significativo aumento de proteiacutenas no LBA do grupo DA em
comparaccedilatildeo ao grupo CN deve envolver outros mecanismos inflamatoacuterios pois natildeo
houve biotavidade de PAF significativa no LBA destes dois grupos (FIGURA 19)
Contudo os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da disponibilidade de oacutexido niacutetrico (NO) (KIKUCHI et al
2008) Houve uma produccedilatildeo limitada de NO nas vias aeacutereas dos potros do grupo
EX esperada em cavalos realizando exerciacutecio moderado ou proacuteximo do maacuteximo
(MILLS e HIGGINS 1997) Isto pode ser explicado pela hipoxemia arterial induzida
pelo exerciacutecio (HAIE) descrita em atletas humanos (HOPKINS 2005) e em cavalos
exercitando a altas intensidades (MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
DEMPSEY e WAGNER 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005) A produccedilatildeo de NO requer
normoxia (GRIMMINGER et al 1995) sendo que a anoxia abole o relaxamento
vascular dependente do endoteacutelio e a hipoxemia degrada o NO (De MEY e
VANHOUTTE 1980) Adicionalmente ocorre uma inibiccedilatildeo do NO pela hemoglobina
sendo que esta inibiccedilatildeo eacute inversamente proporcional a saturaccedilatildeo de oxigecircnio
(IWAMOTO e MORIN 1993)
A inibiccedilatildeo da siacutentese de NO resultou no aumento da permeabilidade vascular
no estudo de KIKUCHI et al (2008) concordando com os nossos achados
referentes agrave bioatividade de PAF aumentada associada ao aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas e agrave diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de nitritos no LBA
do grupo EX
88
De fato no estudo de BRKOVIC e SIROIS (2007) o PAF e natildeo o NO foi
considerado o mediador proacute inflamatoacuterio e causador do aumento da permeabilidade
vascular enquanto o NO foi considerado como um co-fator para as atividades
inflamatoacuterias do PAF Na relaccedilatildeo entre PAF e NO na microcirculaccedilatildeo parece que
NO apresenta um efeito protetor atenuando as atividades inflamatoacuterias de PAF
tendo inclusive reduzido a formaccedilatildeo de PAF em vecircnulas mesenteacutericas em ratos
(NEVIN e BROADLEY 2002)
Contudo o NO tambeacutem tem papel preponderante na defesa das vias aeacutereas
(NEVIN e BROADLEY 2002 XU et al 2006) e o aumento na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA do grupo DA pode ser considerado uma resposta aos poluentes
ambientais existentes nas cocheira dos cavalos (WOODS et al 1993 BERNDT et
al 2008) Aleacutem disso o NO reage com o acircnion superoacutexido (O -2) para formar
peroxinitrito (ONOO-) um forte oxidante capaz de provocar lesatildeo no tecido pulmonar
resultando em peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (XU et al 2006)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi investigada no presente estudo atraveacutes da
concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA que resultou
aumentada no grupo DA em comparaccedilatildeo com o grupo CN (FIGURA 23) A
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi associada ao acuacutemulo de neutroacutefilos e produccedilatildeo de ROS por
esses nas vias aeacutereas de crianccedilas (BUSS et al 2000) e de pessoas com DPOC
(SANTUS et al 2005) Natildeo houve aumento de neutroacutefilos no LBA dos potros do
grupo DA mas os macroacutefagos alveolares dos potros deste grupo apresentaram
maior produccedilatildeo de ROS (FIGURAS 26 e 27) Isso pode ter contribuiacutedo para o
aumento da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA neste grupo como resultado da
modificaccedilatildeo da funcionalidade dos macroacutefagos alveolares induzida por fatores
ambientais como descrito em estudos em humanos (LUNDBORG et al 2007) e em
cavalos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento resultou em reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos lipiacutedicos no LBA em comparaccedilatildeo com o grupo DA No estudo de
MASTALOUDIS et al (2004) corredores de ultramaratona apresentaram aumento
da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica avaliada por marcadores do sangue destes atletas
Contudo outros relataram a reduccedilatildeo dos marcadores de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes
exerciacutecio intenso em corredores e esquiadores (URSO e CLARKSON 2003) em
indiviacuteduos treinados (BALOG et al 2006) em pessoas apoacutes 6 meses de
89
treinamento e tambeacutem apoacutes um programa de treinamento de 3 semanas (ALDRED
2007) e em pacientes com DPOC apoacutes programa de exerciacutecios (PINHO et al 2007)
Provavelmente essa diminuiccedilatildeo na peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA dos potros do
grupo EX deveu-se a mecanismos protetores pois o treinamento influencia de forma
positiva a capacidade antioxidante do organismo em atletas humanos (URSO e
CLARKSON 2003 PARK et al 2005 BALOG et al 2006 ALDRED 2007 PINHO
et al 2007) e em cavalos (KIRSCHVINK et al 2008)
URSO e CLARKSON (2003) relataram um aumento significativo da atividade
da catalase uma enzima antioxidante nos eritroacutecitos de atletas humanos apoacutes um
exerciacutecio de corrida de longa distacircncia corroborando com os nossos achados de
aumento significativo da atividade da catalase no LBA dos potros do grupo EX em
comparaccedilatildeo com o grupo DA (FIGURA 24)
No presente estudo a atividade de macroacutefago alveolar foi investigada devido
ao papel inerente desta ceacutelula na defesa pulmonar O aumento na atividade dos
macroacutefagos alveolares no grupo DA foi discutida acima e provavelmente deveu-se agrave
presenccedila de aeroalergenos e endotoxinas presentes nas cocheiras dos cavalos
(RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento reduziu tanto a fagocitose de macroacutefago
alveolar (FIGURA 25) como a capacidade de produccedilatildeo de ROS (acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio) (FIGURAS 26 e 27)
O macroacutefago alveolar eacute a ceacutelula efetora do sistema imune predominante nos
espaccedilos alveolares e nas vias aeacutereas condutoras responsaacutevel por ativar as
respostas inflamatoacuterias de forma suficiente a eliminar agentes agressores (PETERS-
GOLDEN 2004) Os macroacutefagos alveolares satildeo essenciais agrave sobrevivecircncia
devendo estar em harmonia com o sistema nervoso e endoacutecrino para responder a
estiacutemulos fisioloacutegicos bem como patoloacutegicos (GORDON 2007) sem exagerar na
resposta a fim de natildeo comprometer a troca gasosa (PETERS-GOLDEN 2004)
Apesar de KIZAKI et al (2008) terem demonstrado que o macroacutefago pode
sofrer uma adaptaccedilatildeo ao exerciacutecio melhorando sua funcionalidade os potros PSI
jovens em treinamento para corrida do grupo EX apresentaram supressatildeo da
imunidade especificamente a relacionada agrave resposta imune inata dos macroacutefagos
alveolares corroborando com estudos anteriores (HUSTON et al 1987 RAIDAL et
al 2000 RAIDAL et al 2001) que avaliaram o LBA de cavalos apoacutes exerciacutecio
90
realizado em esteira de alta velocidade e obtiveram resultados semelhantes aos
nossos
Outro aspecto ainda natildeo relatado em equinos mas demonstrado em
pessoas eacute que a melhora na atividade antioxidante induzida pelo exerciacutecio pode
resultar em diminuiccedilatildeo da atividade da NADPH oxidase na membrana dos
macroacutefagos consequumlentemente reduzindo a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio por essas ceacutelulas (PARK et al 2005) como observado no
grupo EX
Portanto a influencia do exerciacutecio sobre a funcionalidade das ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico como a observada nos macroacutefagos alveolares do grupo EX no
presente estudo explicaria a maior suscetibilidade apresentada por potros de corrida
sob treinamento intenso a infecccedilotildees respiratoacuterias (HINES et al 1996) Em
humanos o exerciacutecio intenso reduziu a capacidade de apresentaccedilatildeo de antiacutegeno
(CEDDIA e WOODS 1999) bem como a resistecircncia antiviral (DAVIS et al 1997) por
macroacutefagos O PMA (phorbol myristate acetate) utilizado nas avaliaccedilotildees da
atividade de macroacutefago alveolar (ver toacutepicos 4114 e 4115) teve como funccedilatildeo
estimular a NADPH oxidase a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
(DEKKER et al 2000 NAKAJIMA et al 2000) mimetizando o estiacutemulo provocado
por agentes infecciosos (JI 2008) Isto de fato ocorreu no grupo EX jaacute que os
macroacutefagos estimulados apresentaram aumento significativo na atividade
comparando-se aos macroacutefagos natildeo estimulados (FIGURAS 26 e 27) entretanto a
atividade ainda foi significativamente menor que no grupo DA evidenciando a
reduccedilatildeo na atividade de macroacutefagos induzida pelo exerciacutecio
Os efeitos do PMA sobre os macroacutefagos alveolares e sobre os PMNs do
sangue de equino podem ser apreciados no experimento de validaccedilatildeo da teacutecnica
de estudo da bioatividade de PAF (FIGURAS 13 a 18) A teacutecnica utilizada para o
estudo da bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos potros
empregando-se PMNs de equinos como ferramenta para se avaliar o influxo de Ca++
induzido por PAF foi ineacutedita em estudos em cavalos Anteriormente a mesma
avaliaccedilatildeo foi realizada utilizando-se PMNs de humanos (GRYNKIEWICZ et al 1985
MARATHE et al 2001) Anteriormente os PMNs de equinos foram empregados
com ecircxito no estudo da bioatividade de PAF em extrato lipiacutedico obtido a partir de
amostras de pulmatildeo de ratos no estudo da asma (MUEHLMANN et al 2009)
91
Portanto a validaccedilatildeo desta teacutecnica se fez necessaacuteria e importante para o
reconhecimento dos resultados obtidos para a bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos investigados No presente estudo o PAF
ativou os PMNs do sangue do cavalo assim como os macroacutefagos alveolares de
forma concentraccedilatildeo dependente Portanto o PAF tendo como uma de suas origens
o macroacutefago alveolar eacute capaz de modificar o comportamento de neutroacutefilos
sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos
neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a ORVA (MARR et al 2002)
As influecircncias exercidas pelo PAF na circulaccedilatildeo pulmonar permeabilidade
capilar pulmonar e na agregaccedilatildeo plaquetaacuteria estimulou o estudo da HPIE nos potros
avaliados no grupo EX Para tal o hemossideroacutefago no LBA foi escolhido como o
marcador da HPIE porque a colheita do LBA 24 horas apoacutes o exerciacutecio resultou que
a observaccedilatildeo endoscoacutepica de sangue na traqueacuteia bem como a contagem do
nuacutemero de eritroacutecitos no LBA natildeo fossem teacutecnicas diagnoacutesticas indicadas nesse
momento
A observaccedilatildeo do hemossideroacutefago no LBA mesmo se constituindo numa
forma confiaacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993) poderia natildeo servir
aos nossos propoacutesitos de identificar diferenccedilas em marcadores inflamatoacuterios e de
estresse oxidativo bem como na funcionalidade de macroacutefagos alveolares dentro
de um mesmo grupo ateacute entatildeo considerado homogecircneo Contudo o
hemossideroacutefago presente no LBA foi confirmado no presente estudo natildeo soacute como
um marcador confiaacutevel da HPIE como tambeacutem foi capaz de diferenciar subgrupos
significativamente distintos dentro do grupo EX
Interessantemente observou-se um percentual de HPIE (determinado pela
presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA) maior que o de inflamaccedilatildeo pulmonar (gt5
de neutroacutefilos eou gt1 de eosinoacutefilos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA)
Isso nos leva a pensar que a HPIE precede a inflamaccedilatildeo no pulmatildeo dos cavalos de
corrida tal como foi sugerido por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) mas que
requer outras investigaccedilotildees para excluir que o contraacuterio estivesse acontecendo isto
eacute um processo inflamatoacuterio em periacuteodo anterior do treinamento que pudesse ter
deixado alguma fragilidade pulmonar Possivelmente o estudo de potros PSI de
corrida tatildeo jovens e em iniacutecio de treinamento permitiu tal discussatildeo visto que se
considera que a HPIE acometa praticamente a totalidade dos cavalos PSI em
treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007)
92
A associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo jaacute foi demonstrada anteriormente
(McKANE et al 1993) e foi considerada como sendo significativa no estudo
epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) apesar dos mecanismos pelos quais
esta associaccedilatildeo ocorre ainda serem apresentados de forma hipoteacutetica como no
recente estudo de DERKSEN et al (2009)
No estudo de COUEumlTIL e DENICOLA (1999) cavalos de corrida com HPIE
apresentaram na avaliaccedilatildeo do LBA um aumento no NTCN associado agrave neutrofilia
De fato isto ocorreu no subgrupo HPIE pos e esses achados de citologia
demonstram que a HPIE esteve associada agrave inflamaccedilatildeo pulmonar nos potros do
subgrupo HPIE pos
Outro achado comum entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar eacute o aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA como observado no subgrupo HPIE pos em
comparaccedilatildeo com o grupo HPIE neg (FIGURA 29) evidenciando um aumento na
permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) no subgrupo HPIE pos
O acuacutemulo de fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar associado agrave
inflamaccedilatildeo pulmonar como demonstrado por TSANGARIS et al (2003) foi discutido
acima Contudo cavalos com HPIE exercitados a altas velocidades tambeacutem
apresentaram aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas no espaccedilo alveolar (WEST e
MATTHIEU-COSTELLO 1999)
Possivelmente o aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas associado agrave HPIE
possa ser devido ao aumento da pressatildeo transmural nos capilares pulmonares
resultando em falecircncia por estresse dos capilares como demonstrado por BIRKS et
al (1997) em cavalos exercitados nas mesmas velocidades que os potros avaliados
no presente estudo
Adicionalmente parece que a HPIE deflagrou um mecanismo inflamatoacuterio
causador de extravasamento de plasma no espaccedilo alveolar nos potros do subgrupo
HPIE pos e a bioatividade de PAF significativamente aumentada no subgrupo HPIE
pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (FIGURA 28) indica a participaccedilatildeo desse
mediador proacute inflamatoacuterio nesse evento
O extravasamento de plasma na microcirculaccedilatildeo pulmonar e a formaccedilatildeo de
edema pulmonar induzidos por PAF foram demonstrados anteriormente e jaacute
discutidos acima (EVANS et al 1987 CLAVIJO et al 2001) No caso da HPIE
provavelmente o PAF induza a formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular
atraveacutes da desorganizaccedilatildeo de proteiacutenas juncionais (JIANG et al 2008) Estes dados
93
concordam com a proposta de WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) de que a
altas pressotildees em capilares pulmonares ocorra a formaccedilatildeo de fendas nas junccedilotildees
entre as ceacutelulas endoteliais Desta forma as evidecircncias indicam que associado ao
evento mecacircnico na etiopatogenia da HPIE um evento inflamatoacuterio tambeacutem estaacute
presente o que representa um fator de risco para o agravamento do quadro
Adicionalmente os eventos inflamatoacuterios presentes na HPIE se constituem em
potencial aacuterea para investigaccedilotildees terapecircuticas visto que ainda natildeo se tem um
tratamento efetivo para a hemorragia pulmonar em cavalos atletas Recentemente
evidecircncias de que a suplementaccedilatildeo de cavalos atletas com aacutecidos graxos ocircmega-3
melhora a fluidez da membrana dos eritroacutecitos (PORTIER et al 2006) sugeriu que a
influecircncia beneacutefica na resposta inflamatoacuteria pulmonar pode reduzir os iacutendices HPIE
(ERICKSON et al 2007)
Portanto eacute razoaacutevel assumir um papel para o PAF na fisiopatologia da HPIE
pelas suas propriedades angiogecircnicas aleacutem de seus efeitos proacute inflamatoacuterios
(APONTE et al 2008) concordando com a hipoacutetese da patogecircnese da HPIE
proposta por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) onde a ruptura dos capilares
pulmonares resultaria em inflamaccedilatildeo sangramento e hemosiderose e
consequumlentemente a ocorrecircncia de angiogecircnese na circulaccedilatildeo bronquial e fibrose
agravando o quadro da HPIE
Adicionalmente ZHANG et al (2003) demonstraram que o aumento da
permeabilidade capilar induzido por PAF envolve a participaccedilatildeo de estresse
oxidativo visto que a enzima antioxidante superoacutexido dismutase (SOD) atenuou os
efeitos do PAF sobre o endoteacutelio De fato o grupo HPIE pos apresentou a
concentraccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos significativamente aumentada em comparaccedilatildeo
ao subgrupo HPIE neg sendo uma evidecircncia de estresse oxidativo no LBA dos
potros deste grupo possivelmente exacerbada pela alta quantidade de ferro da
hemossiderina presente no espaccedilo alveolar (DERSEN et al 2009)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica induz alteraccedilotildees patoloacutegicas no tecido pulmonar
destruindo pneumoacutecitos e ceacutelulas endoteliais do epiteacutelio levando a um aumento da
permeabilidade microvascular inibe a siacutentese e a liberaccedilatildeo de surfactante e interfere
negativamente na atividade do NO O conjunto dessas accedilotildees dos peroacutexidos lipiacutedicos
no pulmatildeo resulta em dano da estrutura pulmonar e leva agrave hipertensatildeo
representando um fator adicional contribuindo para a patogenia da HPIE (MILLS e
HIGGINS 1997)
94
Os macroacutefagos alveolares como ceacutelulas orquestradoras da resposta imune
pulmonar (PETERS-GOLDEN 2004) devem possuir um importante papel na
patogenia da HPIE visto que a obtenccedilatildeo de subgrupos significativamente distintos
a partir do grupo EX no presente estudo se deu pela presenccedila ou ausecircncia de
hemossideroacutefagos THACKER (2006) descreveu que os macroacutefagos ativados
secretam interleucina-1 (IL-1) que atrai e ativa a proliferaccedilatildeo de fibroblastos e a
siacutentese de colaacutegeno para reparar o tecido danificado Em estudo histopatoloacutegico do
pulmatildeo de cavalos com HPIE as aacutereas de ocorrecircncia de hemorragia caracterizaram-
se por hemossiderose e fibrose (DERKSEN et al 2009)
Adicionalmente WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) sugeriram o
envolvimento de leucotrieno B4 (LTB4) no mecanismo inflamatoacuterio envolvido na
HPIE apesar deste mecanismo ainda requerer comprovaccedilatildeo Neste evento a
ruptura do epiteacutelio alveolar com a exposiccedilatildeo da membrana ativaria os macroacutefagos
alveolares os quais satildeo ricos em LTB4
O LTB4 por sua vez tambeacutem conecta o PAF agrave HPIE HOPKINS et al (1997)
estudaram a HPIE em humanos avaliando o LBA de seis ciclistas de elite apoacutes 4 km
de esforccedilo maacuteximo Comparados aos controles os ciclistas que realizaram o esforccedilo
apresentaram altas concentraccedilotildees de eritroacutecitos proteiacutenas e LTB4 no LBA No
estudo citado exceto pelo aumento da LTB4 natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
percentual de neutroacutefilos e nem nos niacuteveis de IL-8 e TNF-α entre os grupos
suportando a hipoacutetese do estresse mecacircnico alterando a BAC na HPIE segundo a
conclusatildeo dos autores Contudo a associaccedilatildeo entre LTB4 e PAF foi demonstrada
anteriormente onde o receptor de LTB4 esteve envolvido com a quimiotaxia
pulmonar e degranulaccedilatildeo de neutroacutefilos induzida por PAF (GAUDREAULT et al
2005) Todavia ateacute o momento este tipo de associaccedilatildeo natildeo foi demonstrada em
cavalos apesar de ter-se relatada a neutrofilia nas vias aeacutereas de cavalos com
ORVA mediada por LTB4 (LINDBERG et al 2004) Portanto reunindo as
informaccedilotildees acima pode-se assumir a hipoacutetese de que a neutrofilia no LBA e o
aumento da permeabilidade da BAC nos potros do subgrupo HPIE pos tenha sido
induzida por PAF e mediada por receptor de LTB4
Adicionalmente reforccedila-se a evidecircncia da importacircncia dos macroacutefagos
alveolares na HPIE e por sua vez como a hemorragia pulmonar pode influenciar a
funcionalidade dos macroacutefagos Na primeira etapa do presente estudo descrevemos
a reduccedilatildeo na fagocitose e na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de
95
hidrogecircnio pelos macroacutefagos alveolares do grupo EX (FIGURAS 25 a 27) Contudo
evidenciamos que a HPIE agravou ainda mais esta situaccedilatildeo (FIGURAS 32 e 33)
pois a resposta de macroacutefago alveolar esteve significativamente reduzida no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg
A reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no subgrupo HPIE pos pode ser
explicada novamente pela HAIE com consequumlente inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO
(MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
favorecendo o aumento da permeabilidade capilar (KIKUCHI et al 2008)
provavelmente agravado pela ocorrecircncia de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica neste grupo (MILLS
e HIGGINS 1997)
Os mecanismos pelos quais o NO modula a permeabilidade microvascular
natildeo satildeo bem conhecidos Em cavalos de PSI de corrida a inibiccedilatildeo da NOS pela
administraccedilatildeo de L-NAME agravou a HPIE enquanto natildeo alterou a pressatildeo arterial
pulmonar (KINDIG et al 2000) e a inalaccedilatildeo de NO durante o exerciacutecio reduziu
ligeiramente a pressatildeo arterial pulmonar enquanto tambeacutem causou agravamento da
HPIE (KINDIG et al 2001) Parece que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete
em parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou mas agravou a HPIE
Adicionalmente corroborando com o aumento da bioatividade de PAF e
reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos o estudo de
KWASNIEWSKI et al (2008) com um modelo de lesatildeo e hemorragia em intestino
delgado demonstrou que o preacute tratamento com antagonista de PAF reduziu as
lesotildees enquanto a inibiccedilatildeo do NO endoacutegeno aumentou consideravelmente as
lesotildees hemorraacutegicas e a mortalidade Portanto o estudo citado demonstrou a
existecircncia da relaccedilatildeo entre PAF e NO na hemorragia ocorrida na microcirculaccedilatildeo
assim como reafirma o papel protetor do NO para os efeitos proacute inflamatoacuterios do
PAF (NEVIN e BROADLEY 2002 BRKOVIC e SIROIS 2007)
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
A hipoacutetese do presente estudo foi confirmada pois tanto o desafio ambiental
como o exerciacutecio causaram alteraccedilotildees no fluido broncoalveolar e modificaram a
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar Potros PSI de corrida jovem em treinamento para
corrida apresentaram depressatildeo da resposta imune inata mais especificamente do
macroacutefago alveolar induzida pelo exerciacutecio e agravada pela ocorrecircncia da HPIE
PAF influencia os neutroacutefilos do sangue bem como os macroacutefagos alveolares
de equinos e no presente estudo esteve presente na inflamaccedilatildeo pulmonar induzida
pelo exerciacutecio nos potros PSI durante o treinamento para corrida
Os achados relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e ao aumento da
bioatividade de PAF no fluido broncoalveolar dos potros exercitados estiveram
relacionados agrave HPIE e agrave presenccedila dos hemossideroacutefagos no LBA o que resultou
numa resposta de macroacutefago alveolar ainda mais reduzida
Desta forma assume-se que os resultados obtidos para o grupo EX podem
ser extrapolados para as populaccedilotildees similares de cavalos PSI jovens em
treinamento para a corrida
Finalmente sugere-se a conduccedilatildeo de novos estudos para o entendimento
dos mecanismos inflamatoacuterios envolvidos na HPIE bem como o papel do PAF neste
processo
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caveolin-1 scaffolding domain facilitated by Antennapedia homeodomain attenuates PAF-induced increase in microvessel permeability American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology v 286 p H195-H201 2004
A mente que se abre a uma nova ideacuteia
jamais voltaraacute ao seu tamanho
original
Albert Einstein
Obrigado Senhor por na dificuldade
carregar-me no colo pela Sua
presenccedila constante mesmo nos
momentos mais tranquumlilos e por
conceder-me mais esta benccedilatildeo
DEDICATOacuteRIA
Este trabalho eacute dedicado agrave minha esposa Ana
Luacutecia e aos meus filhos Joatildeo Pedro e
Bernardo com todo o meu amor
Aos cavalos por me ensinarem tanto
AGRADECIMENTOS
A Deus por permitir-me concluir mais esta etapa em minha vida
A minha esposa Ana Luacutecia e meus filhos Joatildeo Pedro e Bernardo que estiveram ao
meu lado desde o iniacutecio desta jornada souberam me dar tranquumlilidade e muito amor aleacutem de levarem pizza no laboratoacuterio nos dias de experimento
Aos meus pais Pedro Maria Luis e Zelma pelos exemplos que vocecircs satildeo e por todo o amor e apoio em todos os momentos
Aos meus irmatildeos Marcus e Andreacute cunhados Cristine Dani e Luiz Gustavo sobrinhas Mariana e Juacutelia pela amizade e torcida
A minha orientadora Profa Dra Anita Nishiyama sobretudo pela amizade e incentivo sendo orientadora nos momentos certos sempre com muita competecircncia
Aos meus colegas meacutedicos veterinaacuterios e amigos Alessandro Mercadante Daniel Mendes Campos Fernando Perche e Luis Henrique Costa pelo apoio prestado na execuccedilatildeo deste trabalho permitindo a avaliaccedilatildeo de potros sob sua
responsabilidade
Aos estabelecimentos que me apoiaram e suas equipes de funcionaacuterios sempre
prestativos Haras Belmont Haras Cifra Haras Santa Rita da Serra Haras dos Girassoacuteis Haras Palmerini Haras Santareacuten
Aos treinadores que me apoiaram permitindo a avaliaccedilatildeo dos potros sob sua responsabilidade extensivo agraves suas respectivas equipes de funcionaacuterios Fernando Azevecircdo Beto Feltran Gladston Santos J Ceacutesar A A Farias Marcus Lanza
Agrave incansaacutevel equipe de colheitas de lavado broncoalveolar que em momento algum deixou de madrugar nos 22 experimentos conduzidos Lorena Andrade da Cruz
Renata Schaefer Liacutevia Medalha Arauacutejo Amine do Vale Meira Fabiana Tieme da Silva Mariana Muumlller da Silva Aline Bonfaacute Richard
A maravilhosa equipe da qual tive a felicidade de conhecer e trabalhar Luis Alexandre Muehlmann MS Fernanda Ceccon Grando MS Ana Luacutecia Zanatta Carolina Farias Gabriela Rubbo Eloyse Bieberbach Ana Claacuteudia e Victor Vocecircs
me deram a amizade e o prazer de trabalhar com vocecircs me ensinaram muito e valorizaram o verdadeiro sentido de equipe com simplicidade determinaccedilatildeo e muita competecircncia
Aos amigos do Laboratoacuterio de Metabolismo Celular da UFPR companheiros de poacutes-graduaccedilatildeo de duacutevidas de buscas pelas respostas de risadas e de conquistas
muito obrigado pela amizade ajuda e muita paciecircncia Fabiacuteola Eacuteverson Ricardo Carine Loli Sandro Gleisson Marcelo Jaison Isabela Diogo Paulo Dalton Gina Daniele Pequito
Ao Prof Dr Luiz Claacuteudio Fernandes pela inestimaacutevel oportunidade de poder
trabalhar no seu laboratoacuterio disponibilizando material necessaacuterio e seu tempo quando o solicitei
A minha amiga e soacutecia meacutedica veterinaacuteria MS Cassiana Maria Garcez Ramos
Aos meus amigos da Direccedilatildeo do Curso de Medicina Veterinaacuteria da PUCPR Profa
Dra Claacuteudia Turra Pimpatildeo e Prof Rodrigo Taacutevora Mira por todo o apoio incentivo e amizade incondicionais
Aos amigos professores da PUCPR Rita M Rocha Denise Kozemjakin Antonia Maria Marconi Farias pelo apoio
Ao Decano do Centro de Ciecircncias Agraacuterias e Ambientais da PUCPR Prof Dr Sylvio Peacutellico Neto pelo apoio e incentivo
Ao Professor Metry Bacila por tantos exemplos demonstrados e por nunca haver se omitido em ajudar e entusiasmar
As bibliotecaacuterias da UFPR pela ajuda e tambeacutem da PUCPR Lucieli e Teresinha e equipe
A amiga Monica Echeverria pela amizade e apoio no inglecircs nesta e em muitas outras oportunidades Thank you
Ao Laboratoacuterio Fort Dodge pelo apoio me fornecendo os sedativos e pela dedicaccedilatildeo dos competentes profissionais Alessandra Carol e Leonardo que sempre estiveram dispostos a ajudar
Ao amigo Nilton Reis companheiro de trabalho na Unidade Hospitalar para Equinos da PUCPR pelo apoio
Aos amigos do Regimento de Poliacutecia Montada Coronel Dulciacutedio pela amizade e apoio durante esta etapa Coronel Heraldo Reacutegis Boacuterio da Silva Major Lorival da
Cunha Sobrinho Major Maacutercio Luis Fonseca Capitatildeo Adilar Marcelo de Lima e agrave equipe do Centro Veterinaacuterio da PMPR Sargento Faacutetima Sd Manasseacutes e demais amigos
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS IX
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES XI
LISTA DE TABELAS XV
RESUMO XVI
ABSTRACT XVII
1 INTRODUCcedilAtildeO 18
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 18
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA) 18
13 PAF E VIAS AEacuteREAS 23
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 27
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO 29
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE) 34
2 OBJETIVOS 40
21 OBJETIVOS GERAIS 40
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS 41
31 REAGENTES E SEDATIVOS 41
32 ANIMAIS 41
33 ASPECTOS EacuteTICOS43
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA 43
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS 43
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) 45
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA46
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957) 47
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS 48
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE CA++
EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE ET AL 2001) 48
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)51
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR E MARLETTA 1985) 51
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA
(NOUROOZ-ZADEH ET AL 1994)52
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984) 53
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA ET AL 1998) 54
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA ET AL 1998) 54
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK E MIZEL 1981) 55
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN E GORDON 1987) 56
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 57
4 RESULTADOS 59
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO 59
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica59
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas 60
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT) 61
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA) 62
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem Diferencial de Ceacutelulas do LBA 62
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF 63
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF 65
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 67
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 68
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 69
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 70
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA 71
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 72
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar 73
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 74
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO 75
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA 75
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 76
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 77
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 78
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 79
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 80
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-) 80
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 81
5 DISCUSSAtildeO 83
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 96
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 97
LISTA DE ABREVIATURAS
ACVIM American College of Veterinary Internal Medicine
AT Aspirado traqueal
CN Grupo Condiccedilotildees Naturais
DA Grupo Desafio Ambiental
DIVA Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas
DIVAI Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
DPOC Doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica
EX Grupo Exerciacutecio
HAIE Hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio
HPIE Hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
HRPO Horse radish peroxidase
IFN-γ Interferon gama
IL-1 Interleucina-1
IL-4 Interleucina-4
IL-8 Interleucina-8
IL-9 Interleucina-9
IL-17 Interleucina-17
LBA Lavado broncoalveolar
L-NAME N-nitro-L-arginina metil ester
LTB4 Leucotrieno B4
LTE8 Leucotrieno E8
MLCP Myosin light chain phophatase
NO Oacutexido niacutetrico
NOS Oacutexido niacutetrico sintase
NTCN Nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas
ORVA Obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas
PAF Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PAF-AH Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria acetilhidrolase
PAF-R Receptor de fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PBS Soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada
PMA Phorbol myristate acetate
PMN Polimorfonuclear
PRS Phenol red solution
PSI Puro sangue inglecircs
RNS Espeacutecie reativa do nitrogecircnio
ROS Espeacutecie reativa do oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Th2 Linfoacutecitos T helper 2
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE 20
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO SN-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL 24
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM
RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS 25
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E
SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE 30
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA
ASMA 31
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS 32
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO
A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR
(BAC) 36
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO
DERSKEN et al (2009) 38
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA
FARINGE 44
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS
ARITENOacuteIDES DE I A IV 44
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME
ENDOSCOacutePICO 45
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO
DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO
REGISTRADA A 510 nm 50
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA
ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 57
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA
AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 63
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS
DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 64
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO
ANTAGONISTA DE PAF BN52021 64
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO
ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 65
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 66
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR
PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 66
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++
EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 67
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO
EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA
ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 68
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A
PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 69
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO
SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 70
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX
(n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA 71
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) 72
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) 73
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) 74
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) 75
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) HPIE NEG (n=5) e EX NORMAL (n=4) 76
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE
POS (n=13) HPIE NEG (n=12) E EX NORMAL (n=8) 77
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) HPIE NEG (n=10) E EX NORMAL (n=7) 79
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) HPIE NEG (n=8) E EX NORMAL (n=5) 80
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS
POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) HPIE NEG (n=5) E EX NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE
POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 81
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE
PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) HPIE NEG (n=6) E EX
NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2
ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 82
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS
TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE
INGLEcircS DE CORRIDA 59
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGIANOS
OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS
DE I A IV 60
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS
CARTILAGENS ARITENOacuteIDES 60
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA
ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO
SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE
AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 61
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS
CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN
(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS
DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN
(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM
PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO
LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX E DOS
SUBGRUPOS HPIE POS HPIE NEG E EX NORMAL 76
RESUMO
A doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas (DIVA) e a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) satildeo comuns em cavalos de corrida resultando em interrupccedilatildeo no treinamento A hipoacutetese do presente estudo foi de que o ambiente e o exerciacutecio
causam estresse oxidativo produccedilatildeo do fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF) e inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas de potros PSI de corrida e que haacute uma relaccedilatildeo entre a DIVA e a HPIE Estudou-se potros PSI em ambiente natural (NC n=45) estabulados
por 30 dias (DA n=40) e treinados (EX n=34) Apoacutes os potros do grupo EX foram divididos em trecircs subgrupos HPIE pos (presenccedila de hemossideroacutefagos no lavado broncoalveolar - LBA) HPIE neg (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA) e EX
normal (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA e menos de 5 de neutroacutefilos e menos de 1 de eosinoacutefilos no LBA) Avaliou-se perfil citoloacutegico e paracircmetros do LBA relacionados a estresse oxidativo bioatividade de PAF atividade da catalase e
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar (MA) Os percentuais de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no LBA do grupo EX foram maiores (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 e 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectivamente) que os limites superiores para cavalos normais
(5 para neutroacutefilos e 1 para eosinoacutefilos) juntamente com um maior nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 ceacutelulasmicroL de LBA P=0017) evidenciaram a ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo pulmonar A bioatividade de PAF e a
concentraccedilatildeo de proteiacutenas no LBA foram maiores no grupo EX (relaccedilatildeo 340380 nm 0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg de proteiacutenasmL de LBA Plt0001) A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos no LBA foi maior
no grupo DA (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg de proteiacutenas Plt0001) e a atividade da catalase foi maior no grupo EX (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg de proteiacutenas P=0002) A fagocitose de MA (P=0006) bem como a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido (Plt0001) e peroacutexido de hidrogecircnio (P=0006) foram
significativamente menores no grupo EX Vinte e trecircs (622) potros do grupo EX foram HPIE pos e o LBA desse subgrupo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutenas (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) bioatividade de
PAF (relaccedilatildeo 340380 nm 0180 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 P=0042) e concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) significativamente maiores que o subgrupo HPIE neg A concentraccedilatildeo de nitritos
(008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) e a atividade de MA foi menor em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg O ambiente e o exerciacutecio modificaram o fluido broncoalveolar confirmando a hipoacutetese do presente estudo
Houve aumento da resposta de MA induzida pelo ambiente enquanto o exerciacutecio fiacutesico resultou em HPIE inflamaccedilatildeo pulmonar e diminuiccedilatildeo na resposta imune inata relacionada aos macroacutefagos alveolares nos potros PSI jovens durante o treinamento
para corrida e o PAF esteve presente nesse processo Sugere-se a conduccedilatildeo de novas investigaccedilotildees para elucidar os mecanismos inflamatoacuterios da HPIE bem como o papel do PAF neste processo como um potencial alvo terapecircutico
Palavras-chave cavalo fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria hemorragia pulmonar inflamaccedilatildeo pulmonar fluido broncoalveolar
ABSTRACT
Inflammatory airway disease (IAD) and exercise-induced pulmonary hemorrhage (EIPH) are common in racehorses during training being important ailments interrupting training of thoroughbred racehorses The present study hypothesis was
that stabling and exercise cause oxidative stress release of platelet-activating factor (PAF) and inflammation in airways of Thoroughbred colts and that there is an association between IAD and EIPH The subjects were colts in breeding farms (NC
n=45) stabled for 30 days (EC n=40) and race trained (EX n=34) Colts of the EX group were subdivided into three subgroups EIPH pos (presence of hemosiderophages in BALF) EIPH neg (absence of hemosiderophages in BALF)
and Normal EX (absence of hemosiderophages and less than 5 neutrophils and 1 eosinophils in BALF) Cytological profile and parameters of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) related to oxidative stress bioactivity of the pro-inflammatory
mediator PAF catalase activity and alveolar macrophage (AM) activity were studied Percentages of neutrophils and eosinophils in the BALF of the EX group were higher (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 and 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectively)
than the upper limits for normal horses (5 of neutrophils and 1 of eosinophils) that associated with a significantly higher total nucleated cell count (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 cellsmicroL of BALF P=0017) displayed pulmonary inflammation PAF
bioactivity and the total protein concentration in the BALF were higher in the EX group (0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 340380nm ratio P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg of proteinsmL of BALF Plt0001) Concentration of BALF hydroperoxides
was higher in the EC group (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg of proteins Plt0001) and catalase activity was higher in the EX group (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg of proteins P=0002) AM phagocytosis (P=0006) as well as production of superoxide anion (Plt0001) and hydrogen peroxide (P=0006) were
significantly lower in EX group Twenty three (622) colts of the EX group were EIPH pos and the BALF of this subgroup presented a significantly higher protein concentration (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg of proteinsmL of BALF P=0031) PAF
bioactivity (018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 340380 nm ratio P=0042) and lipid hydroperoxide concentration (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg of proteins P=0009) as well as lower nitrite concentration (008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007
absorbance 550 nm P=0049) and AM activity than EIPH neg subgroup Environment and exercise modified the bronchoalveolar fluid confirming the hypothesis of the present study Environment increased AM response as exercise resulted in EIPH
pulmonary inflammation and decreased innate immune response of alveolar macrophages in young Thoroughbred horses during race training and PAF participated in this event Further studies should be conducted to better understand
the inflammatory mechanisms of EIPH and the role of PAF in this process as a potential therapeutic target
Keywords horse platelet-activating factor pulmonary hemorrhage pulmonary
inflammation bronchoalveolar fluid
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
As doenccedilas respiratoacuterias satildeo comuns nos cavalos e as condiccedilotildees a que
estatildeo sujeitos fazem com que a inflamaccedilatildeo seja uma manifestaccedilatildeo frequumlente dessas
afecccedilotildees O epiteacutelio das vias aeacutereas superiores e dos pulmotildees estatildeo expostos a
patoacutegenos invasores e fatores ambientais Portanto o conhecimento dos
mecanismos da resposta inflamatoacuteria nas vias aeacutereas se faz importante a fim de se
estabelecer estrateacutegias para reduzir o impacto e os danos causados (THACKER
2006)
A inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apresenta um agravante o papel dos pulmotildees
na troca gasosa Assim as quatro principais consequumlecircncias de um processo
inflamatoacuterio desencadeado nas vias aeacutereas incluem vasodilataccedilatildeo e a reduccedilatildeo no
fluxo sanguiacuteneo resultando em capilares ingurgitados o aumento da permeabilidade
capilar permitindo a passagem de fluiacutedo e ceacutelulas para os tecidos o influxo e
acuacutemulo de fagoacutecitos e ceacutelulas ativadas no local e a bronconstricccedilatildeo (LUNN et al
2007)
O estudo das doenccedilas respiratoacuterias em cavalos eacute relevante particularmente
nos cavalos jovens de corrida onde a taxa de inflamaccedilatildeo detectada nas vias aeacutereas
eacute significativa (CHRISTLEY e RUSH 2007)
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA)
Os termos ldquodoenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereasrdquo (DIVA) e ldquodoenccedila
inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferioresrdquo (DIVAI) tecircm sido usados para descrever uma
siacutendrome inflamatoacuteria do trato respiratoacuterio de cavalos de corrida (CHRISTLEY e
RUSH 2007)
Tem-se relatado que a DIVA ocorre em 11 a 50 dos cavalos de corrida em
treinamento chegando a afetar ateacute 80 dos cavalos de corrida de dois anos de
idade (CHRISTLEY e RUSH 2007) MALIKIDES (2003) estudou a prevalecircncia da
DIVA em cavalos de corrida na Austraacutelia evidenciando que 41 deles apresentaram
inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apoacutes duas semanas de iniciarem treinamento
19
A DIVA eacute considerada a segunda afecccedilatildeo mais comum a interromper o
treinamento para corridas (WILSHER et al 2006) podendo resultar em prejuiacutezos a
troca gasosa e diminuiccedilatildeo da capacidade atleacutetica (COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005)
Cavalos com DIVA ou com hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) apresentaram uma maior hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE)
(CHRISTLEY et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
(FIGURA 1)
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE EIPH HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO IAD DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS UAO OBSTRUCcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS SUPERIORES FONTE SAacuteNCHEZ et al (2005)
Cavalos trotadores de corrida diagnosticados com DIVA tiveram a mecacircnica
pulmonar (volume corrente frequumlecircncia respiratoacuteria ventilaccedilatildeo pulmonar duraccedilatildeo da
inspiraccedilatildeo e da expiraccedilatildeo complacecircncia dinacircmica) alterada apresentaram um
significativo aumento da carga ventilatoacuteria e da energia requerida para a respiraccedilatildeo
sofrendo restriccedilotildees em seu rendimento atleacutetico (PIRRONE et al 2007)
Contudo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas dos cavalos atletas natildeo eacute entendida
por completo especialmente pela falta de consistecircncia e precisatildeo na definiccedilatildeo
dessa siacutendrome (CHRISTLEY e RUSH 2007)
Recentemente um painel de discussatildeo promovido pelo American College of
Veterinary Internal Medicine (ACVIM) definiu que a DIVA pode ocorrer em cavalos
de qualquer idade e eacute caracterizada pelo seguinte fenoacutetipo (COUEumlTIL et al 2007)
20
- Baixo rendimento desportivo intoleracircncia ao exerciacutecio
- Tosse com ou sem quantidade excessiva de muco traqueal
- Inflamaccedilatildeo natildeo seacuteptica detectada pela avaliaccedilatildeo citoloacutegica do fluido do LBA
ou disfunccedilatildeo pulmonar baseada em evidecircncia de obstruccedilatildeo de vias aeacutereas
inferiores hiperresponsividade das vias aeacutereas ou prejuiacutezo a troca gasosa durante o
repouso ou exerciacutecio
Este painel formado por experts e pesquisadores da aacuterea propocircs tambeacutem
alguns fatores de exclusatildeo para a DIVA
- Evidecircncia de sinais sistecircmicos de infecccedilatildeo (febre alteraccedilotildees hematoloacutegicas
compatiacuteveis com infecccedilatildeo)
- Aumento do esforccedilo respiratoacuterio durante o repouso
A etiopatogenia da DIVA eacute pouco definida Acredita-se que uma variedade de
fatores de risco estejam envolvidos variando nas diferentes populaccedilotildees de cavalos
baseado na alimentaccedilatildeo manejo praacuteticas preventivas distribuiccedilatildeo de agentes
infecciosos e influecircncias geneacuteticas (COUEumlTIL et al 2007)
Alguns autores encontraram uma reduccedilatildeo da incidecircncia desta afecccedilatildeo em
cavalos mais velhos (BURRELL et al 1996 CHAPMAN et al 2000 CHRISTLEY et
al 2001 WOOD et al 2005) sendo que a idade natildeo provocou diferenccedila no estudo
de McKANE et al (1993)
O ambiente da cocheira representa um risco adicional para a DIVA nos
cavalos (BURRELL et al 1996 HOLCOMBE et al2001 CLEMENTS e PIRIE
2007 BERNDT et al 2008) bem como para a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas das
pessoas envolvidas no trabalho com os cavalos (ELFMAN et al 2009)
HOLCOMBE et al (2001) associaram o manejo de estabulaccedilatildeo com a
ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas inferiores Estudaram 14 potros aacuterabes
que foram transferidos da pastagem para cocheiras com cama de palha Apoacutes 90
dias de estabulados houve um aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no
lavado broncoalveolar (LBA) Cavalos estabulados em cama de palha tambeacutem
apresentaram maior chance de apresentar DIVA em outros estudos (BURRELL et
al 1996 WOODS et al 1993)
No entanto em cavalos de montaria no estado norte-americano de Michigan
foi a permanecircncia em piquetes durante o inverno que esteve associado com
aumento do acuacutemulo de muco traqueal com maior nuacutemero de neutroacutefilos Neste
21
estudo a alimentaccedilatildeo com feno tambeacutem representou risco para a ocorrecircncia de
inflamaccedilatildeo (ROBINSON et al 2006)
Contudo o ambiente de cocheiras em modelos convencionais de manejo aos
quais os cavalos em treinamento estatildeo submetidos reconhecidamente apresenta
riscos para as vias aeacutereas Nestes haacute aumento nas concentraccedilotildees de partiacuteculas
inalaacuteveis contendo partiacuteculas orgacircnicas e inorgacircnicas incluindo endotoxinas β-D-
glucan partiacuteculas ultra finas (lt100 nm de diacircmetro) microorganismos esporos de
fungos material vegetal poeira inorgacircnica e gases toacutexicos (COUEumlTIL et al 2007)
Recentemente no estudo de BERNDT et al (2008) se demonstrou que o ambiente
de cocheira apresenta uma concentraccedilatildeo de endotoxinas 8 vezes maior que nos
piquetes
Aleacutem disso haacute muito jaacute foi descrita a presenccedila de actinomicetos termofiacutelicos
como a Micropolyspora faeni nos fenos fornecidos aos cavalos capazes de serem
inalados atingindo as vias aeacutereas inferiores (McPHERSON e THOMSON 1983)
Assim a praacutetica de encharcar o feno antes da administraccedilatildeo para diminuir a
quantidade de poeira disponiacutevel resultou em benefiacutecio agraves vias aeacutereas dos cavalos
(CLEMENTS e PIRIE 2007)
Por outro lado a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA ainda
natildeo estaacute bem esclarecida Cavalos com sinais cliacutenicos de inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas apresentaram maior frequecircncia de isolados bacterianos nos estudos de
CHRISTLEY et al (2001) e WOOD et al (2005) apesar de o painel do ACVIM
entender que a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA precisa ser
melhor estudada (COUEumlTIL et al 2007)
O exerciacutecio tambeacutem tem sido associado agrave inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas
inferiores dos cavalos atletas (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) A prevalecircncia da DIVA eacute maior em cavalos em treinamento
que em cavalos do mesmo grupo mas sem treinamento talvez pela inalaccedilatildeo de
maiores quantidades de partiacuteculas pela exposiccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores ao ar
frio ou pela ocorrecircncia da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (DAVIS et
al 2006 CHRISTLEY e RUSH 2007)
O diagnoacutestico da DIVA inclui a histoacuteria e o exame fiacutesico detalhados para a
identificaccedilatildeo de potenciais fatores etioloacutegicos A tosse durante o exerciacutecio ou
durante a alimentaccedilatildeo constitui a queixa mais comum (CHRISTLEY e RUSH 2007)
esteve associada agrave presenccedila de quantidades aumentadas de secreccedilatildeo traqueal bem
22
como a um maior percentual de neutroacutefilos tanto na secreccedilatildeo traqueal (CHRISTLEY
et al 2001) como no LBA (BENEDICE et al 2008) mas sua ausecircncia natildeo descarta
o diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
A presenccedila de descarga nasal mucopurulenta eacute achado comum em cavalos
de corrida de dois anos de idade sendo menos comum em cavalos mais velhos
Sua relaccedilatildeo com a DIVA todavia natildeo eacute sabida (COUEumlTIL et al 2007)
A auscultaccedilatildeo toraacutecica durante o repouso raramente evidencia alteraccedilotildees em
cavalos atletas com inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores (MAZAN e HOFFMAN
2003 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007) sendo necessaacuteria a
utilizaccedilatildeo de uma sacola para o cavalo respirar no seu interior ampliando o esforccedilo
respiratoacuterio (bdquorebreathing bagrsquo) podendo tornar audiacuteveis alguns sons anormais em
certos casos (MAZAN e HOFFMAN 2003 COUEumlTIL et al 2007)
MAZAN e HOFFMAN (2003) relataram que os testes de funccedilatildeo pulmonar
como o pneumotacoacutegrafo e o teste de broncoprovocaccedilatildeo com histamina podem
auxiliar tornando o diagnoacutestico da DIVA definitivo Contudo o diagnoacutestico precoce
da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores deve enfatizar a avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA
e natildeo os testes de funccedilatildeo pulmonar (COUEumlTIL et al 2007)
A avaliaccedilatildeo citoloacutegica do AT tambeacutem tem contribuido ao diagnoacutestico dos
processos inflamatoacuterios das vias aeacutereas contudo natildeo eacute considerado suficiente para
o diagnoacutestico da DIVA Isto se deve a falta de concordacircncia entre os achados
citoloacutegicos do AT e do LBA e da falta de estudos associando os achados no AT e o
rendimento atleacutetico (HODGSON e HODGSON 2003 HUGHES et al 2003
COUEumlTIL et al 2007) Ainda um cuidado a ser levado em conta quando da
realizaccedilatildeo de AT eacute o tempo da colheita jaacute que a realizaccedilatildeo de exerciacutecio
esteneuante pode aumentar o percentual de neutroacutefilos na amostra obtida
(MALIKIDES et al 2007)
O LBA por sua vez eacute o meacutetodo para a obtenccedilatildeo de amostras de ceacutelulas
presentes nas vias aeacutereas mais distais e espaccedilo alveolar (HOFFMAN 1999
FERNANDES et al 2000 LESSA et al 2005) considerado como uma bioacutepsia
liacutequida (MAZAN e HOFFMAN 2003) sendo a teacutecnica de avaliaccedilatildeo citoloacutegica
preferida para o diangoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
Um aumento no percentual de ceacutelulas inflamatoacuterias no fluido do LBA eacute um dos
principais criteacuterios diagnoacutesticos para a DIVA Usualmente ocorre uma predominacircncia
de neutroacutefilos mas tambeacutem pode ocorrer aumento nos nuacutemeros percentuais de
23
eosinoacutefilos linfoacutecitos e mastoacutecitos normalmente associados com diminuiccedilatildeo no
rendimento desportivo e hiperresponsividade das vias aeacutereas (McKANE et al 1993
HARE e VIEL 1998 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007)
O perfil citoloacutegico de LBA mais comumente encontrado em cavalos com DIVA
eacute caracterizado por aumento no nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (NTCN) com
discreta neutrofilia (gt5) linfocitose e monocitose Tambeacutem pode ser encontrado
um aumento do nuacutemero percentual de eosinoacutefilos (gt01) e mastoacutecitos (gt2)
(HOFFMAN 1999 COUEumlTIL et al 2007)
O painel de estudo da DIVA promovido pelo ACVIM apontou direccedilotildees para as
pesquisas nesta aacuterea e dentre elas o estudo das citocinas e mediadores
inflamatoacuterios envolvidos no processo (COUEumlTIL et al 2007)
Sabe-se que ocorre um incremento da imunidade inata nas vias aeacutereas dos
cavalos estabulados com o envolvimento de IL-6 (RIIHIMAumlKI et al 2008a) Em
cavalos trotadores de corrida em treinamento ocorre uma eosinofilia transitoacuteria no
fluido broncoalveolar e um aumento da expressatildeo de IL-4 e IL-5 contudo natildeo foi
encontrada correlaccedilatildeo entre estes eventos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Dentre os mediadores quiacutemicos participantes do processo inflamatoacuter io nas
vias aeacutereas o PAF (platelet-activating factor) estaacute especialmente implicado na asma
sepse e injuacuteria pulmonar aguda (THACKER 2006) presente tambeacutem na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas em cavalos mais velhos
(FAIRBAIRN et al 1996) Contudo a participaccedilatildeo do PAF no processo inflamatoacuterio
nas vias aeacutereas de cavalos atletas ainda natildeo eacute conhecida
13 PAF E VIAS AEacuteREAS
O fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocoline)
eacute um potente mediador proacute inflamatoacuterio envolvido na angiogecircnese aterosclerose
anafilaxia cicatrizaccedilatildeo inflamaccedilatildeo apoptose e endotoxemia (MARATHE et al
2001 STAFFORINI et al 2003 OWEN et al 2005) O PAF eacute produzido por
eosinoacutefilos macroacutefagos alveolares neutroacutefilos plaquetas e ceacutelulas endoteliais
(BAKER et al 2002 STAFFORINI et al 2003 GAUDREAULT et al 2005 SUMITA
et al 2005) a partir de uma subclasse especiacutefica de fosfatidilcolina que conteacutem um
eacuteter ao inveacutes de um eacutester ligado a posiccedilatildeo sn-1 do esqueleto de glicerol (FIGURA
24
2) A fosfatidilcolina eacute o mais abundante fosfolipiacutedio presente nas membranas
bioloacutegicas (MARATHE et al 2001 OWEN et al 2005)
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO sn-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL FONTE MARATHE et al (2001)
O PAF tambeacutem estaacute envolvido numa variedade de funccedilotildees pulmonares como
por exemplo no tocircnus vascular e das vias aeacutereas na frequumlecircncia de movimentaccedilatildeo
dos ciacutelios e na permeabilidade endotelial causando um aumento da secreccedilatildeo de
fluido traqueal broncoconstricccedilatildeo edema e hiperresponsividade das vias aeacutereas
resultando em prejuiacutezos a troca gasosa (CLAVIJO et al 2001 GABRIJELCIC et al
2003 ISHII et al 2004 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008)
Os efeitos do PAF sobre a circulaccedilatildeo pulmonar foram descritos por diversos
autores CHEN et al (1992) demonstraram um aumento das pressotildees arterial e
microvascular pulmonares e edema apoacutes a injeccedilatildeo de PAF SHIBAMOTO et al
(1993) estudaram os efeitos do PAF na circulaccedilatildeo venosa em pulmatildeo de catildeo onde
o PAF causou venoconstricccedilatildeo e aumento da pressatildeo capilar sem aumento da
permeabilidade vascular OHAR et al (1994) tambeacutem demonstraram
venoconstricccedilatildeo em estudo com pulmatildeo de coelhos mas demostraram que a
reduccedilatildeo da complacecircncia e aumento da resistecircncia vascular deveu-se a alteraccedilatildeo
estrutural vascular por perda de colaacutegeno intersticial induzida por PAF
Contudo o papel do PAF como causador de aumento da permeabilidade
vascular e edema pulmonar estaacute bem estudado devido a sua participaccedilatildeo na
fisiopatologia da anafilaxia da endotoxemia e da asma (EVANS et al 1987
25
CLAVIJO et al 2001 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008
MUEHLMANN et al 2009)
Em estudo preacutevio o extravasamento microvascular ocorrido apoacutes a infusatildeo de
PAF natildeo foi acompanhado de aumento da pressatildeo arterial pulmonar assim os
autores concluiacuteram que o edema pulmonar mediado por PAF resulta de aumento da
permeabilidade microvascular pulmonar (CLAVIJO et al 2001)
De fato demonstrou-se que o aumento da permeabilidade capilar induzida
por PAF ocorre pela formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular devido a
desorganizaccedilatildeo das proteiacutenas juncionais VE-caderina e ocludina (ZHANG et al
2003 JIANG et al 2008) mediada por receptores especiacuteficos (EVANS et al 1987)
e atraveacutes da ativaccedilatildeo da via do insositol trisphosphato e influxo de caacutelcio (GOumlGGEL
e UHLIG 2005) (FIGURA 3)
PLC phopholipase C IP3 inositol 145-trisphosphato IP3R receptor de IP3
MLCK myosin light chain kinase ML-7 5-iodonaphthalene-1sulphonyl-
homopiperazine L108 edelfosina Inibiccedilatildeo ativaccedilatildeo
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS NO LADO ESQUERDO OBSERVA-SE O EFEITO DO PAF EM CEacuteLULAS ENDOTELIAIS NO LADO DIREITO OBSERVA-SE OS EFEITOS DO PAF EM CEacuteLULAS DA MUSCULATURA LISA VASCULAR E DAS VIAS AEacuteREAS A QUAL Eacute ALTAMENTE MEDIADA POR TROMBOXANO NESTE A VIA PRINCIPAL Eacute ATRAVEacuteS DA ATIVACcedilAtildeO DE RHO E PROTEIacuteNAS KINASES ASSOCIADAS Agrave RHO QUE ATENUAM A ATIVIDADE DA MLCP (MYOSIN LIGHT CHAIN PHOPHATASE) COM CONSEQUumlENTE AUMENTO DA FOSFORILACcedilAtildeO DA CADEIA LEVE DA MIOSINA E PORTANTO A CONTRACcedilAtildeO FONTE GOumlGGEL e UHLIG (2005)
26
Adicionalmente os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) (BELLAN et al 1992) O
aumento da produccedilatildeo de NO induzida por PAF via ativaccedilatildeo de receptor de PAF foi
demonstrado em ceacutelulas do endoteacutelio vascular humano considerado como um efeito
cardioprotetor (KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Contudo particularmente
na microcirculaccedilatildeo o NO contra-ataca muitos dos efeitos bioloacutegicos do PAF inibindo
a vasoconstricccedilatildeo arteriolar e o aumento da permeabilidade vascular aleacutem de inibir
a adesatildeo de plaquetas e de leucoacutecitos ao endoteacutelio (BRKOVIC e SIROIS 2007
KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Mas os mecanismos pelos quais o NO
modula a permeabilidade microvascular ainda natildeo satildeo bem entendidos podendo ser
confusos e dependentes do estado das ceacutelulas endoteliais (RAMIREZ et al 2006)
A inibiccedilatildeo da NO sintase (NOS) em ceacutelulas endoteliais atenuou o aumento da
permeabilidade microvascular induzida por PAF no estudo de ZHU et al (2004) Por
outro lado estudando a participaccedilatildeo de NO e PAF em lesotildees de intestino delgado
de ratos KWASNIEWSKI et al (2008) evidenciaram que a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de
NO endoacutegeno aumentou bastante as lesotildees hemorraacutegicas e a taxa de mortalidade
demonstrando o papel proacute inflamatoacuterio do PAF e o efeito protetor do NO na
microcirculaccedilatildeo Tal relaccedilatildeo tambeacutem foi descrita por BRKOVIC e SIROIS (2007)
estudando o papel do PAF e do NO nos efeitos proacute inflamatoacuterios resultantes da
participaccedilatildeo de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e concluindo que eacute
o PAF que diretamente aumenta a permeabilidade vascular sendo o NO um cofator
A atuaccedilatildeo do PAF como mediador inflamatoacuterio eacute bastante importante na
asma onde aleacutem de provocar aumento da permeabilidade vascular tambeacutem induz
uma neutropenia transitoacuteria seguida de neutrofilia resultando no recrutamento de
neutroacutefilos para o pulmatildeo evidenciado atraveacutes de estudo citoloacutegico do lavado
broncoalveolar (LEE et al 2002 GABRIJELCIC et al 2003)
No estudo de AU et al (2001) a ativaccedilatildeo de neutroacutefilos resultou em ativaccedilatildeo
dos receptores de PAF aumento da fagocitose de neutroacutefilos e subsequumlente
liberaccedilatildeo de interleucina-8 (IL-8) causando mais quimiotaxia de neutroacutefilos
Adicionalmente demonstrou-se que haacute envolvimento de receptor 1 de leucotrieno B4
(LTB4) nas atividades de neutroacutefilos humanos mediadas por PAF (GAUDREAULT et
al 2005)
Em indiviacuteduos asmaacuteticos e com doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC)
o influxo de neutroacutefilos mediado por PAF nas vias aeacutereas foi modulado pelo aumento
27
de LTB4 provavelmente pelo estiacutemulo de PAF para a liberaccedilatildeo de LTB4 dos
macroacutefagos alveolares (SHINDO et al 1998 GABRIJELCIC et al 2003 FINNEY-
HAYWARD et al 2009)
Nas vias aeacutereas dos cavalos se demonstrou a participaccedilatildeo do PAF na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas (ORVA) levando a um
aumento do recrutamento de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo resultando em
prejuiacutezos agrave funccedilatildeo pulmonar (FAIRBAIRN et al 1996)
O PAF tendo como uma de suas origens o macroacutefago alveolar eacute capaz de
modificar o comportamento de neutroacutefilos sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da
adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a
ORVA (MARR et al 2002)
A participaccedilatildeo do PAF na asma humana e em outras espeacutecies foi evidenciada
pela sua capacidade em reproduzir mecanismos fisiopatoloacutegicos tais como a
broncoconstricccedilatildeo hiperresponsividade das vias aeacutereas aumento da
permeabilidade na microcirculaccedilatildeo pulmonar e aumento na secreccedilatildeo de muco (LOU
et al 1998 ISHII et al 2004 MUEHLMANN et al 2009)
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
Os desafios indutores de alteraccedilotildees na funcionalidade dos macroacutefagos
alveolares resultando em quimiotaxia de neutroacutefilos para as vias aeacutereas levam a um
quadro inflamatoacuterio pulmonar acompanhado de hipersecreccedilatildeo de muco Por sua vez
o muco presente nas vias aeacutereas possui uma seacuterie de funccedilotildees essenciais que
coletivamente levam a proteccedilatildeo das vias aeacutereas Juntamente com as ceacutelulas
epiteliais forma o sistema mucociliar que associado agrave tosse eacute essencial para
manter as vias aeacutereas desobstruiacutedas (ADLER 2005)
Por outro lado a produccedilatildeo excessiva de muco representa um fator importante
de morbidade e mortalidade nas doenccedilas das vias aeacutereas (THORNTON e
SHEEHAN 2004) Assim a resposta imunoloacutegica do epiteacutelio das vias aeacutereas frente
a infecccedilotildees virais e bacterianas e endotoxinas inaladas eacute caracterizada pela
liberaccedilatildeo de citocinas e pela produccedilatildeo de mucinas para prover proteccedilatildeo adicional
(HODGSON et al 2003 GERBER et al 2004 LORA et al 2005) Entretanto nos
quadros inflamatoacuterios os danos teciduais substanciais podem levar a produccedilatildeo
28
excessiva de muco e comprometimento da funccedilatildeo respiratoacuteria (LORA et al 2005
ROBINSON 2005)
O muco eacute uma mistura de aacutegua (~95) eletroacutelitos (~1) lipiacutedios (~1)
proteiacutenas (2-3) enzimas proteiacutenas seacutericas e mucinas (GERBER 2001) As
mucinas glicoproteiacutenas oligomeacutericas representam um constituinte importante do
muco sendo o gene responsaacutevel pela produccedilatildeo de mucinas o MUC5 (THORNTON
e SHEEHAN 2004)
Nas vias aeacutereas a produccedilatildeo de mucinas ocorre predominantemente pelas
ceacutelulas caliciformes do epiteacutelio e em menor parte nas glacircndulas da submucosa
(GERBER et al 2004 THORNTON e SHEEHAN 2004) A produccedilatildeo de
quantidades excessivas de muco pode representar a causa direta de obstruccedilatildeo
bronquial podendo amplificar o efeito de estreitamento luminal da broncoconstricccedilatildeo
e estar associada ao comprometimento da funccedilatildeo pulmonar tosse e capacidade
reduzida para a corrida em atletas humanos (HALLSTRAND et al 2007) e em
cavalos de corrida (CHRISTLEY et al 2001 HOLCOMBE et al 2006)
Assim a quantidade de muco secretado apresenta uma correlaccedilatildeo estreita
com a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas (GERBER et al 2004 ROBINSON et al 2003
HOLCOMBE et al 2006 ROBINSON 2005) De fato haacute uma evidente associaccedilatildeo
entre a hipersecreccedilatildeo de muco e presenccedila de quantidades aumentadas de
neutroacutefilos nas secreccedilotildees respiratoacuterias em seres humanos e em cavalos
(HODGSON et al 2003 ROBINSON et al 2003 ADLER 2005) Contagens de
neutroacutefilos no LBA menores que 30 ceacutelulasμL correspondem a pequenas
quantidades de muco nas vias aeacutereas e os acuacutemulos de secreccedilatildeo aumentam
quando as quantidades de neutroacutefilos estatildeo entre 30 e 100 ceacutelulasμL Entre 100 e
1000 ceacutelulasμL ocorre obstruccedilatildeo mensuraacutevel das vias aeacutereas Possivelmente esse
mecanismo pode estar relacionado com a secreccedilatildeo de proteiacutenas pelos neutroacutefilos
(ROBINSON et al 2003) De fato jaacute foi demonstrado que o neutroacutefilo secreta
elastase a qual estaacute associada com um aumento nas secreccedilotildees relacionadas com a
expressatildeo do gene MUC5 (SHAO e NADEL 2005) e metaplasia de ceacutelulas
caliciformes (VOYNOW et al 2004)
A expressatildeo anormal de neutroacutefilos e de moleacuteculas de adesatildeo em indiviacuteduos
com asma e doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC) foi demonstrada por
GABRIJELCIC et al (2003) Aleacutem do aumento no nuacutemero de neutroacutefilos tambeacutem
foram observados diferentes padrotildees de ativaccedilatildeo e niacuteveis aumentados de elastase
29
neutrofiacutelica e IL-8 Estes uacuteltimos bem como a expressatildeo do gene MUC5 estatildeo
associados a um aumento no estresse oxidativo pulmonar (DROST et al 2005
SHAO e NADEL 2005)
A associaccedilatildeo entre a severidade da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas e o estresse
oxidativo em cavalos com ORVA foi relatada por KIRSCHVINK et al (2008) os
quais relacionaram a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas ao aumento da glutationa oxidada
do aacutecido uacuterico e de isoprostano (8-iso-PGF2α) no LBA
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO
Estresse oxidativo eacute o termo utilizado para descrever os danos causados
quando as espeacutecies reativas do oxigecircnio (ROS) superam a capacidade de defesa
antioxidante do indiviacuteduo (WOOD et al 2003)
Entretanto tanto as ROS como as espeacutecies reativas do nitrogecircnio (RNS)
ocorrendo em concentraccedilotildees pequenas a moderadas apresentam importante papel
na fisiologia celular incluindo a defesa contra invasores e atuando em diversas vias
de sinalizaccedilatildeo celular e na induccedilatildeo da resposta mitogecircnica O estresse oxidativo
propriamente dito ocorre quando o sistema redox sofre desequiliacutebrio pela produccedilatildeo
aumentada de ROS eou RNS ou produccedilatildeo reduzida de antioxidantes (VALKO et al
2007)
Os pulmotildees encontram-se sujeitos ao estresse oxidativo pois estatildeo
diretamente expostos a quantidades muito elevadas de oxigecircnio o que torna
imperativo que este oacutergatildeo possua um arsenal para a defesa contra possiacuteveis
ataques oxidativos Portanto os pulmotildees satildeo providos de um desenvolvido sistema
de defesa endoacutegeno constituiacutedo de agentes chamados antioxidantes Os
antioxidantes ajudam os pulmotildees a se livrarem dos efeitos de uma variedade de
oxidantes provenientes do oxigecircnio (ROS) como o acircnion superoacutexido radical
hidroxila peroacutexido de hidrogecircnio e do nitrogecircnio (RNS) como o oacutexido niacutetrico (NO)
peroxinitrito e nitritos endoacutegenos e do ambiente Os principais sistemas
antioxidantes natildeo enzimaacuteticos dos pulmotildees satildeo a glutationa a vitamina C a
vitamina E o beta-caroteno e o aacutecido uacuterico enquanto os antioxidantes enzimaacuteticos
satildeo as superoacutexido dismutases a catalase e as peroxidases (RAHMAN et al 2006)
(FIGURA 4)
30
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE O2- AcircNION SUPEROacuteXIDO NO OacuteXIDO NIacuteTRICO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO ONOO- PEROXINITRITO FE2+ IacuteON FERROSO GPX GLUTATIONA PEROXIDASE FONTE RAHMAN et al (2006)
O estresse oxidativo pode resultar em muitos prejuiacutezos agraves funccedilotildees das vias
aeacutereas incluindo a contraccedilatildeo da musculatura lisa das vias aeacutereas a induccedilatildeo de
hiperresponsividade das vias aeacutereas a hipersecreccedilatildeo de muco danos ao epiteacutelio
respiratoacuterio e aumento da permeabilidade capilar (WOOD et al 2003)
A fisiopatologia da asma e da DPOC caracteriza-se por inflamaccedilatildeo crocircnica
localizada e estresse oxidativo O estresse oxidativo ocorre pelo aumento de
agentes oxidantes que satildeo inalados bem como por grandes quantidades de ROS
liberadas das ceacutelulas inflamatoacuterias Niacuteveis aumentados de ROS aumentam a
resposta inflamatoacuteria diretamente ou via formaccedilatildeo de produtos da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica levando a um aumento na severidade da doenccedila (KIRKHAM e RAHMAN
2006)
A peroxidaccedilatildeo dos lipiacutedios da membrana celular leva a geraccedilatildeo de
isoprostanos (FIGURA 5) um composto bioativo semelhante agraves prostaglandinas Os
isoprostanos satildeo produzidos independentemente das enzimas ciclooxigenases via
peroxidaccedilatildeo do aacutecido aracdocircnico catalizada por ROS apresentando potente efeito
31
constritor na musculatura lisa respiratoacuteria hiperresponsividade e exsudaccedilatildeo de
plasma nas vias aeacutereas (WOOD et al 2003)
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA ASMA IL INTERLEUCINA TH2 CEacuteLULAS T-HELPER TIPO 2 ROS ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO O2
- AcircNION SUPEROacuteXIDO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO NADPH NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO REDUZIDA NADP NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO SOD SUPEROacuteXIDO DISMUTASE EPO PEROXIDASE EOSINOFIacuteLICA MPO MIELOPEROXIDASE NF FATOR DE TRANSCRICcedilAtildeO NUCLEAR FONTE WOOD et al (2003)
O oacutexido niacutetrico (NO) sintetizado enzimaticamente pela oxidaccedilatildeo do
aminoaacutecido L-arginina para L-citrulina apresenta diversas funccedilotildees fisioloacutegicas nas
vias aeacutereas como o relaxamento da musculatura lisa a regulaccedilatildeo da responsividade
e da permeabilidade das vias aeacutereas e na defesa contra invasores Contudo em
altas concentraccedilotildees o NO apresenta diversos efeitos proacute inflamatoacuterios participando
da infiltraccedilatildeo de ceacutelulas inflamatoacuterias e apresentando efeitos citotoacutexicos sobre
32
diversas ceacutelulas tal como a ceacutelula do epiteacutelio respiratoacuterio especialmente por
interagir com o acircnion superoacutexido formando o peroxinitrito (REDINGTON 2006)
As ceacutelulas inflamatoacuterias recrutadas agraves vias aeacutereas do indiviacuteduo asmaacutetico
apresentam excepcional capacidade de produccedilatildeo de oxidantes Eosinoacutefilos
neutroacutefilos e macroacutefagos bem como ceacutelulas do epiteacutelio respiratoacuterio podem gerar
oxidantes Inicialmente ocorre a formaccedilatildeo de acircnion superoacutexido no complexo
dependente de NADPH oxidase na membrana celular no sistema xantina oxidase
citosoacutelico e na cadeia respiratoacuteria mitocondrial (FIGURA 6) (CARAMORI e PAPI
2004) A seguir a interaccedilatildeo do acircnion superoacutexido com outros oxidantes e o ataque
oxidativo ao tecido pulmonar leva agrave peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e danos ao tecido pulmonar
(MILLS e HIGGINS 1997 KIRKHAM e RAHMAN 2006)
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS FONTE CARAMORI E PAPI (2004)
O estudo do estresse oxidativo na asma se utiliza de modelos que podem
envolver os murinos (MUEHLMANN et al 2009) ou mesmo os cavalos jaacute que estes
naturalmente desenvolvem a ORVA doenccedila respiratoacuteria com diversas similaridades
com a asma humana (DEATON 2006)
33
Nos cavalos com ORVA os marcadores de estresse oxidativo estatildeo
aumentados e diretamente relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e infiltrado
inflamatoacuterio neutrofiacutelico (KIRSCHVINK et al 2008) ao aumento da produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por neutroacutefilos sanguiacuteneos apoacutes a exposiccedilatildeo agrave poeira orgacircnica
ambiental (MARR et al 1997) e ao aumento da secreccedilatildeo de muco apresentando
tambeacutem concentraccedilotildees reduzidas de aacutecido ascoacuterbico no fluido do epiteacutelio respiratoacuterio
(DEATON 2006)
O exerciacutecio fiacutesico por sua vez tambeacutem pode causar estresse oxidativo nas
vias aeacutereas em atletas humanos e em cavalos pela geraccedilatildeo de ROS e RNS (MILLS
e HIGGINS 1997 ART e LEKEUX 2005 KIRSCHVINK et al 2008)
Os cavalos de corrida apresentam a habilidade de aumentar o consumo de
oxigecircnio em 60 vezes durante o esforccedilo maacuteximo o que representa um fator de risco
ao estresse oxidativo nesses animais (ART e LEKEUX 2005)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica eacute o marcador de dano oxidativo poacutes exerciacutecio mais
estudado (DEATON e MARLIN 2003) Em atletas humanos houve aumento da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes a realizaccedilatildeo de ultramaratona (MASTALOUDIS et al
2004) mas o treinamento produziu efeitos beneacuteficos e reduccedilatildeo dos marcadores de
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes um periacuteodo de treinamento (MIYAZAKI et al 2001
BALOG et al 2006) Em cavalos o exerciacutecio submaacuteximo induziu um aumento nos
hidroperoacutexidos lipiacutedicos plasmaacuteticos dentro de 5 minutos apoacutes o teacutermino (DEATON e
MARLIN 2003)
As ROS e seus produtos como os peroacutexidos lipiacutedicos podem diretamente
danificar o tecido pulmonar e causar um incremento da pressatildeo vascular pulmonar
pela liberaccedilatildeo aumentada de mediadores inflamatoacuterios vasoconstrictores (pex
PAF) interferindo na atividade do NO como vasodilatador podendo assim contribuir
na patogecircnese da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) nos cavalos
atletas (MILLS e HIGGINS 1997)
34
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE)
A HPIE eacute caracterizada por hipertensatildeo pulmonar edema nas regiotildees de
troca gasosa ruptura dos capilares pulmonares e a presenccedila de sangue nas vias
aeacutereas (ERICKSON e POOLE 2007) sendo extremamente comum em cavalos de
corrida (PEREZ-MORENO et al 2009)
Tem-se relatado que a HPIE ocorre essencialmente em todos os cavalos
PSI de corrida em treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007) mas
tambeacutem constitui um problema em outras raccedilas de cavalos que realizam exerciacutecio
intenso como os trotadores e os quarto de milha e em cavalos realizando exerciacutecio
de menor intensidade como os cavalos de salto e traccedilatildeo (LAPOINTE et al 1994
ERICKSON e POOLE 2007 VICINO 2007)
O comprometimento ao rendimento desportivo causado pela HPIE natildeo havia
sido comprovado ateacute o estudo de HINCHCLIFF et al (2005a) quando demonstraram
que cavalos de corrida com HPIE grau 1 apresentaram 4 vezes mais possibilidades
de vencer em relaccedilatildeo a graduaccedilotildees mais elevadas de hemorragia
Cavalos PSI de corrida estatildeo sob maior risco de apresentar HPIE porque
apresentam pressatildeo capilar pulmonar mais elevada que cavalos de outras raccedilas e
atividades durante o esforccedilo maacuteximo (HACKETT et al 2003)
Adicionalmente a criaccedilatildeo seletiva de cavalos de corrida visando que sejam
cada vez mais capazes de atingir altas velocidades associado a consumo bastante
alto de oxigecircnio resultou em deacutebito cardiacuteaco substancial (WEST e MATHIEU-
COSTELLO 1994) e barreira alveacuteolo-capilar (BAC) bastante fina (WEST e
MATHIEU-COSTELLO 1999) A espessura meacutedia em micrometros do interstiacutecio da
BAC eacute 0175 plusmn 0010 em coelhos 0318 plusmn 0081 em catildees e 0390 plusmn 002 em
cavalos evidenciando que proporcionalmente a BAC dos cavalos eacute mais fina que a
de outras espeacutecies (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1999) Portanto haacute um dilema
envolvendo a evoluccedilatildeo da BAC dos cavalos Por um lado a necessidade de ser
extremamente fina para uma troca gasosa eficiente enquanto de outro a
necessidade de ser resistente o suficiente para suportar o estresse extremamente
alto na parede dos capilares pulmonares quando a pressatildeo capilar se eleva durante
o exerciacutecio (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
A pressatildeo hidrostaacutetica maacutexima nos capilares pulmonares humanos durante o
exerciacutecio supera 30 mmHg Nos cavalos PSI de corrida a pressatildeo capilar ultrapassa
35
100 mmHg aproximando-se da forccedila necessaacuteria para ocorrer a ruptura do colaacutegeno
que suporta a parede capilar na BAC (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
Quando o estresse na parede capilar se eleva demasiadamente ocorrem
alteraccedilotildees ultra-estruturais na BAC uma condiccedilatildeo conhecida como falecircncia por
estresse descrita em atletas de elite humanos e em cavalos (WEST 2000)
BIRKS et al (1997) demonstraram a falecircncia por estresse e consequumlente
ruptura dos capilares pulmonares em cavalos exercitando a altas velocidades
havendo maior risco de ocorrecircncia da HPIE quando encontraram-se sob importante
aumento da pressatildeo arterial pulmonar (FIGURA 7)
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) A ULTRAESTRUTURA CAPILAR NORMAL B RUPTURA DO ENDOTEacuteLIO CAPILAR (SETAS) COM ERITROacuteCITOS ADJACENTES (ASTERISCO) NOTA-SE TAMBEacuteM ERITROacuteCITOS NO ESPACcedilO ALVEOLAR (PONTAS DE SETAS) C ERITROacuteCITO NO INTERSTIacuteCIO (ASTERISCO) D RUPTURA DO EPITEacuteLIO ALVEOLAR (SETAS) A ALVEacuteOLO C CAPILAR BAR 2 microm FONTE BIRKS et al (1997)
36
Portanto a falecircncia por estresse dos capilares pulmonares eacute a teoria aceita
para a ocorrecircncia da HPIE sendo causada pela elevada pressatildeo transmural nos
capilares pulmonares resultado do aumento da pressatildeo arterial pulmonar somada agrave
pressatildeo pleural inspiratoacuteria negativa (WEST 2000) (FIGURA 8)
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) TTMP TENSAtildeO CIRCUNFERENCIAL OU EM ARCO CAUSADA PELA PRESSAtildeO TRANSMURAL CAPILAR TEL Eacute A TENSAtildeO LONGITUDINAL NOS COMPONENTES DA PAREDE ALVEOLAR ASSOCIADA COM A INFLACcedilAtildeO PULMONAR PARTE DESTA Eacute TRASMITIDA Agrave BAC TST Eacute A TENSAtildeO DE SUPERFIacuteCIE DA CAMADA SUPERFICIAL ALVEOLAR ESTA APARENTEMENTE EXERCE UMA FORCcedilA DE ACcedilAtildeO INTERNA PARA SUPORTAR O CAPILAR QUANDO ESTE INTUMESCE PARA DENTRO DO ESPACcedilO ALVEOLAR A ALTAS PRESSOtildeES TRANSMURAL CAPILARES PALV PRESSAtildeO ALVEOLAR PCAP PRESSAtildeO CAPILAR FONTE WEST (2000)
Diversos estudos estiveram envolvidos em avaliar a participaccedilatildeo do NO no
aumento da pressatildeo arterial pulmonar no cavalo durante o exerciacutecio e na
fisiopatologia da HPIE Inicialmente evidenciou-se que cavalos realizando exerciacutecio
intenso apresentam hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE) (CHRISTLEY
et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 DEMPSEY e WAGNER 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) o que resulta na inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO abolindo o
relaxamento vascular dependente do endoteacutelio (MILLS e HIGGINS 1997)
Portanto acreditou-se que a reduccedilatildeo da produccedilatildeo do NO durante o exerciacutecio
intenso poderia contribuir para a alta incidecircncia de HPIE nos cavalos de corrida
Contudo a administraccedilatildeo do antagonista da oacutexido niacutetrico sintase (NOS) N-nitro-L-
arginina metil ester (L-NAME) mostrou que o NO endoacutegeno resulta numa maior
37
extraccedilatildeo de O2 no repouso e no exerciacutecio submaacuteximo mas natildeo causou alteraccedilatildeo no
exerciacutecio intenso (MANOHAR e GOETZ 1998 MANOHAR et al 2006) A
administraccedilatildeo de L-NAME por KINDIG et al (2000) resultou em agravamento da
HPIE nos cinco animais estudados contudo natildeo observou-se aumento da pressatildeo
arterial pulmonar
MANOHAR e GOETZ (1999) avaliaram os efeitos da infusatildeo intravenosa de
nitroglicerina em cavalos realizando exerciacutecio e natildeo observaram alteraccedilotildees sobre a
incidecircncia ou severidade da HPIE
Adicionalmente KINDIG et al (2001) estudaram os efeitos do exerciacutecio na
pressatildeo arterial pulmonar e na HPIE em cavalos inalando NO Comparados aos
controles o grupo que inalou o NO apresentou uma pequena mas consistente
reduccedilatildeo na pressatildeo arterial pulmonar maacutexima mas com um significativo aumento da
HPIE nesses animais avaliado pelo aumento na contagem do nuacutemero de eritroacutecitos
no LBA Os autores entenderam que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete em
parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou como agravou a HPIE
Portanto em face aos achados relacionados agrave participaccedilatildeo do NO e da NOS
no cavalo em exerciacutecio maacuteximo e na HPIE satildeo necessaacuterias outras investigaccedilotildees a
respeito dos efeitos da inibiccedilatildeo da NOS e da produccedilatildeo do NO na circulaccedilatildeo
pulmonar e na HPIE (KINDIG et al 2000)
Apesar da maior atenccedilatildeo aos efeitos da HPIE e da pressatildeo arterial pulmonar
em cavalos realizando exerciacutecios intensos a HPIE tambeacutem passou a ser
demonstrada em cavalos envolvidos em atividades de menor intensidade sugerindo
que outros mecanismos podem estar envolvidos na fisiopatologia (EPP et al 2006)
VICINO (2007) demonstrou a ocorrecircncia de HPIE em cavalos de salto sendo
que cavalos que participaram de provas na altura entre 130 m ndash 150 m
apresentaram maior incidecircncia que aqueles que saltaram provas entre 100 m ndash 120
m
Neste contexto a associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar jaacute foi
demonstrada anteriormente (McKANE et al 1993 SAacuteNCHEZ et al 2005) Em
concordacircncia o estudo epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) evidenciou
38
uma significativa associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos puro
sangue inglecircs (PSI) jovens durante treinamento para corrida
O processo de hemorragia pulmonar pode culminar em irritaccedilatildeo e inflamaccedilatildeo
das vias aeacutereas o que exacerbaria a doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
(ERICKSON e POOLE 2007) WEST e MATHIEU-COSTELLO (1999) sugerem que
alteraccedilotildees na BAC ativariam vias proacute inflamatoacuterias nas vias aeacutereas com a
participaccedilatildeo de LTB4 Possivelmente a membrana basal alveolar exposta apoacutes a
ruptura ativaria macroacutefagos alveolares sendo que estes satildeo ricos em LTB4
DERKSEN et al (2009) sugeriram uma hipoacutetese para a ocorrecircncia da HPIE
(FIGURA 9) onde a ocorrecircncia das altas pressotildees vasculares pulmonares levaria a
alteraccedilotildees venulares culminando na ruptura capilar sangramento inflamaccedilatildeo e
hemossiderose agravando o quadro da HPIE
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO DERSKEN et al (2009)
Contudo mediadores bem como os mecanismos inflamatoacuterios que estatildeo
envolvidos na fisiopatologia da HPIE ainda precisam ser esclarecidos
O diagnoacutestico da HPIE pode ser feito pela evidecircncia de sangue na traqueacuteia
visiacutevel atraveacutes de exame endoscoacutepico (HINCHCLIFF et al 2005b ERICKSON e
POOLE 2007) pela contagem de eritroacutecitos no LBA (MEYER et al 1998) ou pela
39
presenccedila de hemossideroacutefagos (macroacutefagos contendo hemossiderina ou eritroacutecitos)
no AT (EPPINGER 1990 MICHELOTTO JUacuteNIOR et al 2007) eou no LBA
(DOUCET e VIEL 2002 SAacuteNCHEZ et al 2005 BIAVA et al 2006) realizado uma
hora apoacutes o exerciacutecio A presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA eacute considerada a
forma mais sensiacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993)
Em resumo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas acompanhada de
hiperresponsividade e hipersecreccedilatildeo de muco denominada doenccedila inflamatoacuteria das
vias aeacutereas (DIVA) bem como a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) satildeo causas de enormes perdas econocircmicas e de queda de rendimento
desportivo interrupccedilatildeo nos treinamentos e de encerramento de campanha em
cavalos de corrida Apesar disso a maioria dos estudos sobre as doenccedilas
inflamatoacuterias das vias aeacutereas dos cavalos satildeo direcionados para a ORVA e a
fisiopatologia da DIVA ainda estaacute pouco esclarecida bem como os mecanismos
inflamatoacuterios da HPIE ainda precisam ser mais bem estudados
Tendo-se em vista estes aspectos a hipoacutetese levantada no presente estudo
foi de que o desafio ambiental e o exerciacutecio fiacutesico estejam acompanhados de
estresse oxidativo alterando o quadro inflamatoacuterio possivelmente por alterar a
produccedilatildeo de PAF no pulmatildeo com consequumlente alteraccedilatildeo da funcionalidade celular
e que a hemorragia pulmonar pode exercer influecircncia sobre essa situaccedilatildeo As
ceacutelulas estudadas foram os macroacutefagos alveolares os quais podem apresentar um
papel central na regulaccedilatildeo deste processo
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVOS GERAIS
Verificar alteraccedilotildees em paracircmetros cliacutenicos e inflamatoacuterios pulmonares em
cavalos puro sangue inglecircs (PSI) de corrida jovem submetidos ao desafio ambiental
e ao treinamento fiacutesico
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Avaliar os seguintes paracircmetros cliacutenicos e laboratoriais
- Avaliaccedilatildeo cliacutenica
- Avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas
- Avaliaccedilatildeo citoloacutegica das vias aeacutereas atraveacutes das teacutecnicas de aspirado
traqueal (AT) e de lavado broncoalveolar (LBA)
- Avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas
e a produccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos e nitritos no LBA
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por macroacutefagos alveolares
bem como a capacidade fagocitaacuteria e de adesatildeo
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por neutroacutefilos do sangue
perifeacuterico bem como a capacidade fagocitaacuteria
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 REAGENTES E SEDATIVOS
O BN52021 (Gingkolide B) foi obtido da Biomol (Plymouth Meeting PA USA)
Fura-2 AM (cat num F-0888) PAF (β-Acetyl-γ-O-hexadecyl-L-α-
phosphatidylcholine P-4904) foram obtidos da Sigma (St Louis MO USA) A
coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacuteticoreg) foi obtida da Laborclin (Pinhais PR Brasil) e
a acepromazina da Univet (Satildeo Paulo SP Brasil) A xylazina e o butorphanol foram
obtidos do laboratoacuterio Fort Dodge (Satildeo Paulo SP Brasil) Todos os demais
reagentes foram comprados da Sigma (St Louis MO USA)
32 ANIMAIS
Foram utilizados equinos machos adultos jovens (potros) da raccedila puro sangue
inglecircs (PSI) de cinco diferentes criatoacuterios (haras) da regiatildeo metropolitana de Curitiba
estado do Paranaacute (Haras Cifra e Haras dos Girassoacuteis em Piraquara Haras
Palmerini e Haras Belmont em Satildeo Joseacute dos Pinhais e Haras Santa Rita da Serra
em Tijucas do Sul e potros de quatro diferentes cocheiras no Jockey Club do
Paranaacute (Av Viacutector Ferreira do Amaral 2291 Tarumatilde Curitiba PR)
Inicialmente os potros foram divididos em trecircs grupos O primeiro grupo foi
denominado grupo condiccedilotildees naturais (CN n=45) compreendendo os potros dos
haras vivendo soltos em piquetes dia e noite alimentando-se de gramiacuteneas e
leguminosas da pastagem mais complemento peletizado fornecido no campo A
meacutedia de idade dos animais deste grupo foi de 145 plusmn 04 meses O segundo grupo
foi denominado grupo desafio ambiental (DA n=45) constituiacutedo por potros
estabulados por 30 dias com o propoacutesito de preparaacute-los para o iniacutecio de treinamento
Estes animais eram mantidos em grupos de 15 a 20 potros sendo que permaneciam
em baias individuais com dimensotildees de 35m x 35m x 35m em meacutedia em cama de
serragem e alimentados duas vezes ao dia com aveia mais raccedilatildeo peletizada e feno
de gramiacutenea e de alfafa A meacutedia de idade dos potros do grupo DA foi de 217 plusmn 29
meses O terceiro grupo foi denominado de grupo exerciacutecio (EX n=34) onde foram
incluiacutedos potros ineacuteditos (satildeo considerados ineacuteditos animais que ainda natildeo correram
42
em hipoacutedromos oficiais) mas que estavam em treinamento para corrida haacute
aproximadamente cinco meses e mantidos nas mesmas condiccedilotildees de estabulaccedilatildeo e
alimentaccedilatildeo que os potros do grupo DA Estes animais foram acompanhados
durante o periacuteodo de treinamento sendo que a avaliaccedilatildeo cliacutenica endoscoacutepica e a
colheita de LBA ocorreu 24 horas apoacutes seu primeiro exerciacutecio intenso (15 ms ndash 16
ms) em 800m ndash 1000m de distacircncia na pista de areia do Jockey Club do Paranaacute A
meacutedia de idade dos potros do grupo EX foi de 270 plusmn 03 meses
A obtenccedilatildeo de dados para o presente trabalho de pesquisa ocorreu durante
uma sequumlecircncia de experimentos independentes durante um periacuteodo de 18 meses
Durante este periacuteodo grupos de potros foram acompanhados ateacute se encontrarem
nas condiccedilotildees estabelecidas para cada grupo quando entatildeo foram avaliados As
amostras do grupo CN foram obtidas de oito diferentes experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois durante o inverno trecircs durante a primavera e um no outono
As amostras do grupo DA foram provenientes de seis experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois no inverno e dois no outono e para o grupo EX os resultados
advieram de amostras obtidas durante o veratildeo em cinco ocasiotildees e durante a
primavera em quatro totalizando nove experimentos independentes para este grupo
Os resultados apresentados para cada uma das anaacutelises provecircm de pelo menos
trecircs experimentos independentes
Todos os animais estudados eram pertencentes a estabelecimentos com
programa de desverminaccedilatildeo bimensal bem como foram todos vacinados
regularmente contra Influenza Equina e Herpes Viacuterus Equino tipos 1 e 4 A
alimentaccedilatildeo utilizada nos estabelecimentos que cederam os potros para o estudo
era similar bem como a anaacutelise da alimentaccedilatildeo utilizada para os potros dos trecircs
grupos natildeo diferiu no que se refere a constituintes essenciais que poderiam
influenciar nas avaliaccedilotildees realizadas no presente trabalho Os criteacuterios de inclusatildeo
para os potros dos trecircs grupos foram os estabelecidos e jaacute descritos previamente
nas caracteriacutesticas de cada grupo e a exclusatildeo do estudo ocorreu quando da
histoacuteria de doenccedila recente ou diferenccedilas em manejo
As comparaccedilotildees intergrupos foram feitas entre os grupos CN e DA (diferenccedila
ambiental) e entre os grupos DA e EX (diferenccedila no regime de exerciacutecio)
Na segunda etapa do trabalho dedicada ao estudo da hemorragia pulmonar
induzida pelo exerciacutecio (HPIE) avaliou-se somente os potros do grupo EX agora
com n=37 Este grupo foi dividido em subgrupos sendo o subgrupo HPIE pos (n=23
43
constituiacutedo por potros com qualquer percentual de hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo
citoloacutegica do LBA) e subgrupo HPIE neg (n=14 constituiacutedo por potros sem
hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA) Nesta etapa as comparaccedilotildees
realizadas foram entre os subgrupos HPIE pos e HPIE neg
33 ASPECTOS EacuteTICOS
Este trabalho de pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Experimentaccedilatildeo Animal (CEEA) do setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR sob o
nuacutemero de registro 168 e pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso de Animais (CEUA) da
Pontifiacutecia Universidade Catoacutelica do Paranaacute sob o nuacutemero de registro 129 e estaacute de
acordo com o Guiding Principles in the Care and Use of Animals
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA
Preacutevio agrave colheita de material procedeu-se a avaliaccedilatildeo cliacutenica de cada potro
iniciada pela histoacuteria incluindo possiacuteveis ocorrecircncias meacutedicas relevantes agrave sauacutede do
sistema respiratoacuterio manejo alimentaccedilatildeo desverminaccedilatildeo e vacinaccedilatildeo Na histoacuteria
incluiu-se tambeacutem a informaccedilatildeo sobre a ocorrecircncia de tosse espontacircnea quando em
piquetes na baia no momento da alimentaccedilatildeo ou durante o treinamento O exame
fiacutesico incluiu a observaccedilatildeo da presenccedila de secreccedilatildeo nasal estiacutemulo da tosse
palpaccedilatildeo de linfonodos submandibulares e retrofaringeanos auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e
auscultaccedilatildeo traqueal e pulmonar (McGORUM e DIXON 2007)
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS
A avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas foi realizada previamente a
realizaccedilatildeo do LBA com o animal tranquumlilizado atraveacutes da administraccedilatildeo de
acepromazina (acepran 1 Univet) (003 mgkg IM) e apoacutes 30 minutos seguindo-
se a administraccedilatildeo de xilazina (sedazine Fort Dodge) (03-05 mgkg IV) mais
butorfanol (torbugesic Fort Dodge) (005 mgkg IV) (HOFFMAN 1999 HEWSON e
VIEL 2002) Utilizou-se um fibroscoacutepio flexiacutevel Pentax de 170 cm de comprimento e
128 mm de diacircmetro para a avaliaccedilatildeo das vias aeacutereas superiores e inferiores ateacute a
bifurcaccedilatildeo da traqueacuteia
44
A presenccedila de foliacuteculos linfoacuteides na faringe foi graduada segundo RAKER e
BOWLES (1978) adotando-se a graduaccedilatildeo de I a IV (QUADRO 1) e graus III e IV
foram considerados como faringite
A movimentaccedilatildeo das cartilagens aritenoacuteides foi graduada de I a IV segundo
RACKESTRAW et al (1991) (QUADRO 2) e graus III e IV foram considerados como
anormais
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Faringe com poucos foliacuteculos claros na parede dorsal
Grau II Presenccedila de numerosos pequenos foliacuteculos juntamente a
hiperemia cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau III Presenccedila de grandes grupos de foliacuteculos hiperecircmicos
cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau IV Presenccedila de foliacuteculos grandes edematosos e hiperecircmicos
por toda a mucosa faringeana
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA FARINGE FONTE RAKER E BOWLES (1978)
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Movimentaccedilatildeo sincrocircnica e abduccedilatildeo completa das
cartilagens aritenoacuteides
Grau II Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo com abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) conseguida com a degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
Grau III Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo e a abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) natildeo eacute conseguida na degluticcedilatildeo nem na
oclusatildeo nasal
Grau IV
(Hemiplegia
Laringeana)
Cartilagem aritenoacuteide esquerda posicionada
medialmente na glote e natildeo apresenta movimento
quando da degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE I A IV FONTE RACKESTRAW et al (1991)
45
Especial interesse foi dado agrave presenccedila de muco no lume traqueal e sua
quantificaccedilatildeo atraveacutes de graduaccedilatildeo de 0 a 5 conforme GERBER et al (2004)
(FIGURA 10)
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME ENDOSCOacutePICO FONTE GERBER et al 2004
Quando da observaccedilatildeo de muco traqueal este foi aspirado atraveacutes de tubo
de silicone introduzido pelo canal de trabalho do endoscoacutepio sendo imediatamente
transferido para uma lacircmina de microscopia e deixado para secar ao ar As lacircminas
foram coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico Laborclin Pinhais PR
Brasil) e 500 ceacutelulas foram contadas em aumento de 1000X (HODGSON e
HODGSON 2003)
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o aspirado traqueal (AT)
contendo lt10 de linfoacutecitos lt1 de eosinoacutefilos e lt20 de neutroacutefilos (ROBINSON
2003 HODGSON e HODGSON 2007)
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)
Para a realizaccedilatildeo do LBA foi utilizado um cateter flexiacutevel de silicone
especiacutefico para a obtenccedilatildeo de LBA de equinos marca Cook (V-PBAL-300 Cook Vet
Products Hamburg Alemanha) de 300 cm de comprimento e 8 mm de diacircmetro
Este foi introduzido agraves cegas via nasotraqueal preferencialmente do lado direito ateacute
se alojar em um brocircnquio quando o cuff na extremidade distal era inflado com 5-10
mL de ar Utilizou-se 300 mL de soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada (PBS) esteacuteril e
com heparina soacutedica (5 UImL de PBS) preacute-aquecidos a 37oC (HOFFMAN 1999
PICKLES et al 2002abc MORI et al 2003 RIIHIMAumlKI et al 2008b) O PBS era
infundido em aliacutequotas de 120 mL (HEWSON e VIEL 2002) aspirando-se
46
gentilmente apoacutes cada aliacutequota e dispensando-se o LBA recolhido em frascos
plaacutesticos esteacutereis mantidos em isopor com gelo Este procedimento foi repetido ateacute
que o volume de 300 mL era totalmente empregado O material recolhido foi mantido
refrigerado em isopor com gelo ateacute a chegada ao Laboratoacuterio de Metabolismo
Celular no Departamento de Fisiologia do Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR
para o processamento em menos de 3 horas apoacutes a colheita (PICKLES et al 2002c
VIEL e HEWSON 2003)
No laboratoacuterio o LBA era centrifugado a 340g (1300 rpm) por seis minutos a
40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA) e o pellet obtido foi
ressuspendido em 2 mL de PBS para a contagem do nuacutemero total de ceacutelulas
nucleadas (NTCN)
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA
A contagem do NTCN foi realizada usando-se a cacircmara de Neubauer Uma
aliacutequota da suspensatildeo de ceacutelulas foi diluiacuteda 110 em PBS em um frasco de
centrifugaccedilatildeo de 15 mL de fundo cocircnico (Eppendorf) Desta uma aliacutequota de 50 microL
foi misturada a 50 microL do corante vital Azul de Tripan para a contagem das ceacutelulas
vivas A partir do nuacutemero de ceacutelulas vivas por mililitro da suspensatildeo de ceacutelulas a
concentraccedilatildeo da suspensatildeo de ceacutelulas foi ajustada para 5 x 106 ceacutelulasmL para as
avaliaccedilotildees da atividade de macroacutefago alveolar (fagocitose produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e adesatildeo ndash ver toacutepicos 315 316
317 e 318)
Para a avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA lacircminas para microscopia
foram preparadas a partir de 10 μL da suspensatildeo de ceacutelulas distribuiacutedos de forma
circular sobre a lacircmina secadas ao ar e coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski
(Panoacutetico Laborclin Pinhais PR Brasil) (HEWSON e VIEL 2002) e 500 ceacutelulas
foram contadas em aumento de 1000X
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o LBA contendo em meacutedia
60 de macroacutefagos 35 de linfoacutecitos lt5 de neutroacutefilos lt2 de mastoacutecitos lt1
de eosinoacutefilos (ROBINSON 2003 MAZAN e HOFFMAN 2003 RICHARD et al
2009)
47
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957)
Uma porccedilatildeo correspondente a 90 mg de pellet de ceacutelulas do LBA foi
ressuspendido em um solvente extrator (metanolclorofoacutermio12 volvol) na
quantidade de 18 mL e sonicado (6 ciclos de 4 segundos) Os tubos foram
deixados em gelo por 20 minutos
Na etapa seguinte mais metanol foi adicionado (324 microL o caacutelculo eacute a
quantidade de sovente extrator x 0180 resultando na quantidade de metanol em
mililitros) para reduzir a densidade do liacutequido e possibilitar assim a decantaccedilatildeo do
material particulado insoluacutevel no meio Apoacutes o material foi centrifugado a 5000g por
10 minutos a 40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
O sobrenadante foi transferido para tubos de vidro e clorofoacutermio foi
adicionado (648 microL ou seja o dobro da quantidade de metanol utilizada
anteriormente)
Na sequumlecircncia o extrato foi lavado uma vez com 19 mL de aacutegua ultra pura O
sistema bifaacutesico formado foi submetido a uma intensa agitaccedilatildeo ateacute natildeo serem mais
distinguiacuteveis as duas fases (forma-se momentaneamente uma emulsatildeo) Nesta
etapa substacircncias com maior afinidade agrave aacutegua do que ao solvente orgacircnico satildeo
solubilizadas no meio aquoso e portanto se separam dos lipiacutedios
Apoacutes a reconstituiccedilatildeo espontacircnea do sistema bifaacutesico o sobrenadante
(aquoso) foi removido com o auxiacutelio de uma micropipeta cuidando-se para natildeo
retirar o que se encontrava abaixo
Em seguida foi adicionado o FSP (CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM NaCl 497
mM clorofoacutermio 30 metanol 490 aacutegua ultra pura 480) lentamente (para
evitar a formaccedilatildeo de emulsatildeo) e de maneira que as paredes do tubo fossem lavadas
com esta soluccedilatildeo Apoacutes a remoccedilatildeo do sobrenadante este procedimento foi repetido
mais duas vezes
A mistura de clorofoacutermio e metanol na qual estavam dissolvidos os lipiacutedios
foi evaporada em banho-maria a 370C sob corrente de nitrogecircnio O extrato lipiacutedico
seco foi armazenado a -800C em atmosfera de nitrogecircnio Para a determinaccedilatildeo da
bioatividade de PAF (toacutepico 310) esses extratos foram solubilizados em 100 microL de
DMSO sob agitaccedilatildeo intensa
48
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS
O sangue de cavalo foi colhido em bolsas de transfusatildeo (CPDA-1 JP
Induacutestria Farmacecircutica SA Satildeo Paulo Brasil) atraveacutes de punccedilatildeo venosa jugular
O sangue foi diluiacutedo 11 (vv) em PBS e 40 mL do sangue diluiacutedo foram
adicionados a tubos para centriacutefuga esteacutereis (tubos Falcon de 50 mL) sobre 8 mL de
Ficoll Paque Plus e centrifugado (400g por 40 minutos a 40C) para o isolamento das
ceacutelulas PMN por gradiente
Apoacutes a centrifugaccedilatildeo a camada superior composta por plasma soluccedilatildeo de
Ficoll e ceacutelulas mononucleares foi descartada A camada inferior composta
principalmente por PMNs e eritroacutecitos foi dividida em duas aliacutequotas iguais as quais
foram separadas em dois tubos para centriacutefuga A cada aliacutequota foi adicionada
soluccedilatildeo hemoliacutetica (NH4Cl 077 tris[hydroxymethyl]aminomethane 021 pH 74
soluccedilatildeo aquosa) para completar 50 mL e incubadas por 20 minutos a 370C em
estufa
A seguir a suspensatildeo celular livre dos eritroacutecitos foi centrifugada (400g 6
min 4oC) O sobrenadante foi descartado e o pellet de ceacutelulas (basicamente PMNs)
foi ressuspendido em 5 mL de PBS contendo glucose 5 mM A densidade de ceacutelulas
foi determinada em cacircmara de Neubauer e ajustada para 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL
A viabilidade celular foi determinada atraveacutes do corante vital Azul de Tripan e
resultou aproximadamente 95 A percentagem de neutroacutefilos na suspensatildeo de
PMNs foi superior a 90 determinada pela coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico
Laborclin Pinhais PR Brasil)
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE Ca++ EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE et al 2001)
Agrave suspensatildeo de PMNs (toacutepico 39) na densidade de 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL foi adicionado FURA-2 AM (Sigma soluccedilatildeo estoque 1 nM em DMSO)
para concentraccedilatildeo final de 1 microM A suspensatildeo foi incubada em ambiente escuro a
37oC por 45 minutos
Nesta etapa os PMNs incorporaram o FURA-2 AM um indicador fluorescente
de caacutelcio Quando o FURA-2 AM estaacute ligado ao Ca++ haacute reduccedilatildeo da eficiecircncia de
49
excitaccedilatildeo a 380 nm e aumento da eficiecircncia de excitaccedilatildeo a 340 nm observados no
comprimento de onda de emissatildeo de 510 nm Com isso eacute possiacutevel quantificar a
concentraccedilatildeo de Ca++ intracelular nas ceacutelulas carregadas com FURA-2 AM atraveacutes
da relaccedilatildeo da intensidade de emissatildeo a 510 nm entre os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo de 340 nm e de 380 nm (relaccedilatildeo 340380 nm)
Apoacutes a incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram lavadas duas vezes com soluccedilatildeo de
Ringer (NaCl 1425 mM KCl 40 mM CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM 50 mM 4-(2-
hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid glicose 50 mM pH 74 soluccedilatildeo
aquosa) para a remoccedilatildeo do FURA-2 AM que natildeo foi incorporado agraves ceacutelulas
As ceacutelulas entatildeo foram ressuspendidas em soluccedilatildeo de Ringer para uma
concentraccedilatildeo final de 225 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL Esta foi a preparaccedilatildeo utilizada
na leitura de fluorescecircncia
A suspensatildeo de ceacutelulas foi mantida em gelo ateacute a sua utilizaccedilatildeo Aliacutequotas de
2 mL eram previamente incubadas em banho-maria por 4 minutos a 37oC no escuro
(tubo envolto em papel alumiacutenio) previamente a serem transferidas para uma cubeta
para a leitura da fluorescecircncia em espectrofluoriacutemetro acoplado a um
microcomputador (RF5301PC Shimadzu Kyoto Japatildeo) controlado pelo software
Super Ion Probe (Shimadzu Kyoto Japatildeo) Durante esta incubaccedilatildeo as ceacutelulas que
seriam utilizadas como controle negativo para PAF foram tratadas com antagonista
de receptor de PAF BN52021 (Biomol soluccedilatildeo 10 mM em DMSO)
Foi utilizada excitaccedilatildeo dual com comprimentos de onda 340 nm e 380 nm
(janela de leitura de 2 segundos) com emissatildeo registrada a 510 nm A temperatura
foi mantida em 37oC pelo sistema termostatisado do aparelho A leitura da
fluorescecircncia consistiu primeiramente da obtenccedilatildeo de uma linha de base nos
primeiros 50 segundos Apoacutes esta leitura inicial foram adicionados 10 microL do extrato
lipiacutedico (toacutepico 38) agrave suspensatildeo de ceacutelulas seguindo-se a agitaccedilatildeo (por 3
segundos) com uma barra magneacutetica presente dentro da cubeta A leitura foi feita
entatildeo por mais 100 segundos
Para cada amostra foram realizados os procedimentos descritos na presenccedila
e na ausecircncia de BN52021 A resposta maacutexima obtida pelo tratamento da
suspensatildeo de PMNs com extrato lipiacutedico na presenccedila de BN52021 foi subtraiacuteda da
resposta maacutexima obtida na ausecircncia deste antagonista O resultado desta subtraccedilatildeo
foi utilizado como indicador semiquantitativo da bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico e os resultados foram expressos como relaccedilatildeo 340380 nm
50
Antes de analisar as amostras de extrato lipiacutedico para a bioatividade de PAF
a cada experimento a suspensatildeo de PMNs tratada com FURA-2 AM foi testada com
PAF (1-0-palmitil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina soluccedilatildeo estoque de 3 mM em
DMSO da Sigma) nas concentraccedilotildees de 1 10 e 100 nM e com 100 nM na presenccedila
de 150 microM de BN52021 (concentraccedilatildeo suficiente para antagonizar 102 nM de PAF)
A resposta dos PMNs de equinos aos padrotildees de PAF eacute mostrada na FIGURA 11
sendo representativa dos dados obtidos em todos os experimentos
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO REGISTRADA A 510 nm () SUSPENSAtildeO DE PMN () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 1 nM (diams) SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 10 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 100 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + BN52021 150 microM + PAF 100 nM A EMISSAtildeO BASAL DAS CEacuteLULAS PMN FOI REGISTRADA POR 50 SEGUNDOS PREVIAMENTE Agrave ADICcedilAtildeO DE PAF
Os PMNs do sangue de equinos foram utilizados no presente estudo como
uma ferramenta para a avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF (pelo influxo de Ca++ nos
PMNs induzido por PAF) Para a determinaccedilatildeo da viabilidade desta ferramenta
estudou-se a resposta dos PMNs do sangue de equino a diferentes concentraccedilotildees
de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na ausecircncia do antagonista de
PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose de neutroacutefilos e a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio por neutroacutefilos pelas teacutecnicas descritas
51
abaixo (ver toacutepicos 315 ndash fagocitose de macroacutefago alveolar 316 ndash produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar e 317 ndash produccedilatildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio por macroacutefago alveolar) sendo que para cada ensaio foram realizadas
quatro repeticcedilotildees Igualmente estudou-se a resposta do macroacutefago alveolar a
diferentes concentraccedilotildees de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na
ausecircncia do antagonista de PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose e a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem realizando-se quatro
repeticcedilotildees para cada anaacutelise
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)
Em microplaca de 96 poccedilos 250microL de reagente de Bradford (100mg de
Coomassie Blue 50 mL de etanol 95 + 100 mL de aacutecido fosfoacuterico 85 completar
com aacutegua ultra pura para 1000 mL) foi adicionado a 10 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA) Nesta etapa o
corante Comassie eacute complexado por proteiacutenas presentes na amostra o que muda a
sua cor
Apoacutes 5 minutos em temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada a
595 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-Rad
Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) A concentraccedilatildeo de proteiacutenas foi determinada
interpolando-se os valores de absorbacircncia numa curva padratildeo resultante de
concentraccedilotildees conhecidas de albumina seacuterica bovina (Sigma) Os resultados foram
expressos como miligramas de proteiacutenas por mililitro de LBA
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR e MARLETTA 1985)
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA foi utilizada como indicador da produccedilatildeo de
oacutexido niacutetrico na regiatildeo broncoalveolar
Em micro placa de 96 poccedilos adicionou-se 100 microL de reagente de Griess
(mistura de cloreto de naftiletilenodiamina a 005 e por sulfanilamida a 05 em
meio aacutecido proporcionado por H3PO4 a 25) a 100 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA)
52
A sulfanilamida (um derivado de anilina) reage com o aacutecido nitroso e apoacutes
rearranjos intramoleculares forma o iacuteon diazocircnio Apoacutes o iacuteon diazocircnio reage com a
naftiletilenodiamina (um derivado de naftilamina) para formar pigmento roacuteseo
Depois de 5 minutos na temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada
a 550 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-
Rad Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) Os resultados foram expressos como
absorbacircncia a 550 nm
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO
LBA (NOUROOZ-ZADEH et al 1994)
Utilizou-se uma aliacutequota de suspensatildeo de ceacutelulas de LBA na densidade de
15 x 106 ceacutelulasmL de LBA Esta foi ultrasonicada (6 ciclos de 4 segundos) em 1mL
de metanol sendo centrifugada em seguida a 5000g por 5 minutos a 40C
(Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
Uma aliacutequota de 50 microL de sobrenadante foi armazenada para posterior
mensuraccedilatildeo da concentraccedilatildeo total de proteiacutenas
Para cada amostra aliacutequotas de 90 microL foram depositadas em seis frascos
para centriacutefuga (de 15 mL Eppendorf) foi agitada no voacutertex e incubada por 30
minutos a temperatura ambiente A trecircs desses tubos foram adicionados 10 microL de
soluccedilatildeo metanoacutelica de trifenilfosfina (TPP Sigma) 10 mM para ocorrer a reduccedilatildeo
seletiva de hidroperoacutexidos (os grupamentos hidroperoacutexido especificamente os
presentes em lipiacutedios satildeo convertidos a grupamentos hidroxila pela trifenilfosfina)
As amostras contidas nos trecircs tubos restantes receberam apenas 10 microL de metanol
Todos os tubos foram agitados vigorosamente e entatildeo incubados em temperatura
ambiente por 30 minutos
Apoacutes adicionou-se a todos os tubos 900 microL de reagente de FOX2 Este
reagente deve ser preparado no momento do uso consistindo de xilenol laranja 100
microM hidroxitolueno butilado (BHT) 400 mM aacutecido sulfuacuterico 25 mM e sulfato ferroso
de amocircnio 250 microM em metanol 90 (vv em aacutegua) Apoacutes agitaccedilatildeo o meio
reacional foi incubado por mais 30 minutos a temperatura ambiente
Nesta etapa os caacutetions ferrosos (Fe2+) do reativo de FOX2 satildeo oxidados por
hidroperoacutexidos presentes na amostra (tanto pelos hidroperoacutexidos lipiacutedicos quanto
por outros tipos de hidroperoacutexidos presentes na amostra) Como todos os
53
hidroperoacutexidos lipiacutedicos das amostras tratadas com TPP foram reduzidos a
produccedilatildeo de Fe3+ seraacute menor nestas do que nas amostras natildeo tratadas com TPP
O Fe3+ formado eacute entatildeo quelado pelo xilenol laranja o que faz a cor deste
indicador passar de laranja a azul-puacuterpura (passa a absorver luz em 560 nm)
Passado o tempo de incubaccedilatildeo a absorbacircncia foi mensurada a 560 nm
utilizando-se um espectrofotocircmetro (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil
Satildeo Paulo)
Subtraiu-se entatildeo o valor da absorbacircncia das amostras tratadas com TPP
(sem hidroperoacutexidos lipiacutedicos) do valor da absorbacircncia das amostras sem TPP O
valor obtido nessa subtraccedilatildeo (referente apenas agrave quantidade de ferro oxidado por
hidroperoacutexidos lipiacutedicos) foi utilizado na foacutermula da curva padratildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio obtida com soluccedilotildees padratildeo de diferentes concentraccedilotildees (1000 500
250 125 62 31 e 16 microM) submetidas aos mesmos procedimentos descritos
acima para a dosagem de hidroperoacutexidos (com exceccedilatildeo ao tratamento com TPP) O
resultado obtido foi referente agrave concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos
Dividiu-se o valor da concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos pela
concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais do extrato metanoacutelico Os resultados foram
expressos como nmolesmg de proteiacutenas
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984)
Utilizou-se 300 microL de uma suspensatildeo de ceacutelulas de LBA em PBS na
densidade de 5 x 106 ceacutelulasmL que foram centrifugados (10600g por 20min a
4oC) para remoccedilatildeo de partiacuteculas
Apoacutes foi colocada em banho com gelo Uma aliacutequota de 10 microL desse extrato
de ceacutelulas foi adicionada a 990 microL de meio reativo (soluccedilatildeo aquosa de H2O2 20 mM
tris[hidroximetil] aminometano 005M e EDTA 025 mM pH 74)
Imediatamente utilizando-se um espectrofotocircmetro acoplado a um
microcomputador (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil Satildeo Paulo)
monitorou-se a absorbacircncia a 220 nm por 90 segundos a 370C com intervalos de 2
segundos entre leituras consecutivas
A degradaccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio pela catalase causa uma diminuiccedilatildeo
gradual na absorbacircncia do meio reativo a 220 nm a qual indica a atividade da
catalase no extrato de ceacutelulas Os valores de atividade da catalase foram corrigidos
54
pela concentraccedilatildeo de proteiacutenas do extrato de ceacutelulas (realizado conforme descrito
no toacutepico 311) e foram expressos como micromoles de H2O2minmg proteiacutenas
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA et al 1998)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL (= 5 x 105
ceacutelulaspoccedilo) e os macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A
suspensatildeo de ceacutelulas na densidade descrita foi obtida durante o processamento do
LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS e foram adicionados
20microL de zymosan corado com vermelho neutro (67 mgmL) mais 100 microL de PBS
sendo deixados a temperatura ambiente por 30 minutos
Em seguida depois de descartado o sobrenadante as ceacutelulas foram fixadas
com soluccedilatildeo de Baker (4 formaldeiacutedo 2 cloreto de soacutedio 1 acetato de caacutelcio
soluccedilatildeo aquosa) por 30 minutos
Apoacutes os poccedilos foram lavados com PBS para que o zymosan corado com
vermelho neutro natildeo fagocitado por macroacutefagos alveolares fosse retirado
Em seguida o corante vermelho neutro foi solubilizado em cada poccedilo com
200microL de soluccedilatildeo aacutecido-aacutelcool (aacutecido aceacutetico 1 etanol 50 soluccedilatildeo aquosa) e
deixado por 30 minutos
Apoacutes este periacuteodo a absorbacircncia foi mensurada a 550 nm Os resultados
foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 -
Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA et al 1998)
Estimou-se a produccedilatildeo de acircnions pela da formaccedilatildeo de formazan produto da
reduccedilatildeo do NBT (nitroblue tetrazolium) pelo acircnion superoacutexido Avaliou-se a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA
(phorbol myristate acetate) O PMA estimula o complexo NADPH oxidase na
membrana dos fagoacutecitos a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
55
mimetizando o resultado da fagocitose de um microorganismo (DEKKER et al
2000)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para a retirada das
ceacutelulas natildeo aderentes Em seguida adicionou-se a cada poccedilo 100 microL de PBS com
NBT 02 ou com NBT 02 mais PMA 11microM sempre em triplicatas para cada
potro
Apoacutes a incubaccedilatildeo por 1 hora a 370C e em ambiente escuro (a placa deve
estar envolta em papel alumiacutenio) a placa foi centrifugada (800g por 5 minutos a
40C) Em seguida o sobrenadante foi descartado e 100 microL de PBS foram
adicionados a cada poccedilo e a placa foi novamente centrifugada
Apoacutes o sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram fixadas com metanol
por 10 minutos Em seguida a placa passou por nova centrifugaccedilatildeo o sobrenadante
foi descartado e a placa foi deixada secar ao ar em estufa
Em seguida a placa foi lavada duas vezes com metanol 50 e o formazan
(produto da reaccedilatildeo entre o NBT e o acircnion superoacutexido) foi solubilizado atraveacutes da
incubaccedilatildeo por 30 minutos com 120 microL soluccedilatildeo aquosa de hidroacutexido de potaacutessio 2M
e 140 microL de dimetilsulfoacutexido por poccedilo
A absorbacircncia foi lida a 595 nm e os resultados foram corrigidos pela adesatildeo
de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago
Alveolar)
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK e MIZEL 1981)
Mensurou-se a produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) por macroacutefago
alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA atraveacutes da oxidaccedilatildeo do vermelho
fenol pela peroxidase onde esta enzima utiliza nesta reaccedilatildeo o H2O2 O composto
oxidado absorve luz em pH baacutesico com maacutexima intensidade em 550 nm
56
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS observando-se a retirada
de grumos presentes nos poccedilos Em seguida 100 microL de soluccedilatildeo de vermelho fenol
(PRS phenol red solution 140 mM NaCl 10 mM fosfato de potaacutessio 55 mM
dextrose 056 mM vermelho fenol 19 UmL de HRPO horse radish peroxidase pH
70 soluccedilatildeo aquosa) ou soluccedilatildeo de vermelho fenol + PMA 110nM foram adicionados
a cada poccedilo em triplicatas e deixados incubar por 1 hora a 370C no escuro
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo adicionou-se 10 microL de NaOH 1N para
interromper a reaccedilatildeo alcalinizar o meio e permitir a absorbacircncia da soluccedilatildeo que foi
lida a 595 nm apoacutes 30 minutos
Os resultados foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada
potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN e GORDON 1987)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para se selecionar as
ceacutelulas aderentes que a seguir foram fixadas com metanol 50 por 10 minutos
Apoacutes este periacuteodo o sobrenadante foi descartado e 100 microL de corante de
Giemsa a 02 foram adicionados a cada poccedilo e deixados por 40 minutos em
temperatura ambiente
Os poccedilos foram novamente lavados com PBS por duas vezes observando-se
a retirada de grumos nos poccedilos e 200 microL de metanol 50 foram adicionados
Apoacutes 30 minutos a absorbacircncia da suspensatildeo foi lida a 550 nm
A adesatildeo resultou menor no grupo DA (n=17) em comparaccedilatildeo ao grupo CN
(n=36) (P=0010) sendo que o grupo EX (n=26) apresentou adesatildeo maior que o
grupo DA (P=0001) (FIGURA 12) indicando diferenccedilas na capacidade de adesatildeo
em placa acriacutelica possivelmente devido a diferenccedilas no estado funcional das ceacutelulas
57
de cada grupo Por esta razatildeo utilizou-se o ensaio de adesatildeo de macroacutefago
alveolar realizado concomitantemente aos ensaios de funccedilatildeo de macroacutefago
(fagocitose e produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) a cada
experimento realizado durante o estudo A correccedilatildeo dos valores obtidos de
macroacutefago em funccedilatildeo da adesatildeo foi feito atraveacutes da divisatildeo da meacutedia final obtida
para o ensaio de funccedilatildeo de macroacutefago dividido pela meacutedia obtida no ensaio de
adesatildeo para cada potro avaliado e a cada experimento realizado
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 (ROSEN e GORDON 1987) aP=0010 vs CN e bP=0001 vs DA
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
A normalidade na distribuiccedilatildeo dos dados foi avaliada pelo teste de D‟Agostino
e Pearson Valores considerados outliers pelo teste de Grubb foram excluiacutedos das
anaacutelises Para os dados que apresentaram distribuiccedilatildeo normal dos valores
(distribuiccedilatildeo Gaussiana) (contagem percentual de linfoacutecitos concentraccedilatildeo total de
proteiacutenas do LBA bioatividade de PAF catalase hidroperoacutexidos nitritos fagocitose
de macroacutefago alveolar produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio
por macroacutefago alveolar) foi utilizado o teste t natildeo pareado Os dados com
distribuiccedilatildeo natildeo Gaussiana dos valores (contagens percentuais de neutroacutefilos de
58
eosinoacutefilos e de macroacutefagos multinucleados contagem do NTCN do LBA e adesatildeo
de macroacutefago alveolar) foram analisados pelo teste de Mann-Whitney A
comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos de funccedilatildeo de macroacutefago alveolar
estimulado e natildeo estimulado por PMA foi feita por teste t de Student natildeo pareado
Os achados cliacutenicos e endoscoacutepicos foram analisados por meio de teste de Mann-
Whitney A correlaccedilatildeo entre o percentual de um mesmo tipo celular no aspirado
traqueal e no lavado broncoalveolar foi analisada atraveacutes do teste de Spearman
Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas utilizando-se o programa GraphPad
Prism versatildeo 500 para Windows (GraphPad Software San Diego CA EUA) e os
valores apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia (SEM) Valores de
Plt005 foram considerados como significativos
4 RESULTADOS
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica
Nenhum dos potros dos grupos CN e DA apresentou tosse segundo o
histoacuterico obtido Contudo oito potros (235) do grupo EX apresentaram tosse
espontacircnea na cocheira ou durante o treinamento o que resultou em diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0002) (TABELA 1)
A presenccedila de corrimento nasal seroso (coriza) observada nos trecircs grupos
estudados estaacute demonstrada na TABELA 1 Natildeo houve diferenccedila significativa entre
os grupos apesar de o percentual de potros com coriza no grupo DA ter reduzido
em relaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
Os linfonodos submandibulares eou retrofaringeanos estiveram aumentados
em 382 222 e 382 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
natildeo havendo diferenccedila entre os grupos (TABELA 1)
A auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e traqueal resultou normal em todos os potros
avaliados dos trecircs grupos estudados Contudo sons pulmonares crepitantes foram
audiacuteveis em 28 156 e 115 dos potros avaliados nos grupos CN DA e EX
respectivamente havendo um aumento do percentual de crepitaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo DA em ralaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DE CORRIDA
Grupos Tosse
Espontacircnea
Corrimento
Nasal
Linfonodos
Auscultaccedilatildeo
Pulmonar
CN 034
(0)
1534
(441)
1334
(382)
136
(28)
DA 045
(0)
1145
(244)
1045
(222)
745
(156)
EX 834
(235)a
1534
(441)
1334
(382)
326
(115)
aP=0002 vs DA
60
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas
No iniacutecio da avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas primeiramente
considerando os foliacuteculos linfoacuteides faringeanos ou hiperplasia folicular linfoacuteide (HFL)
a distribuiccedilatildeo das diferentes graduaccedilotildees pode ser vista na TABELA 2
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGEANOS OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS DE I A IV SEGUNDO RAKER E BOLES (1978)
Grupos HFL I HFL II HFL III HFL IV
CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)
DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)
EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)
Considerando as graduaccedilotildees de HFL III e IV como faringite esta
anormalidade foi observada em 546 286 e 539 dos potros dos grupos CN
DA e EX respectivamente Houve uma significativa reduccedilatildeo no percentual meacutedio de
observaccedilotildees de faringite para o grupo DA em comparaccedilatildeo ao grupo CN (P=0024)
enquanto no grupo EX o percentual de faringites foi significativamente maior em
relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0039)
Com relaccedilatildeo ao aspecto morfoloacutegico da epiglote um potro do grupo DA e um
potro do grupo EX evidenciaram epiglote com aspecto fraacutegil sendo que os demais
potros foram normais
Com relaccedilatildeo agrave avaliaccedilatildeo funcional da laringe todos os potros foram normais
apresentando graduaccedilotildees I ou II (TABELA 3)
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE ACORDO COM RAKESTRAW et al (1991)
Grupos NLP I NLP II NLP III NLP IV
CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)
DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)
EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)
61
A quantidade de secreccedilatildeo observada no lume traqueal estaacute demonstrada na
TABELA 4
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 SEGUNDO GERBER et al (2004)
Grupos 0 1 2 3 4 5
CN 233
(61)
933
(273)
933
(273)
1133
(332)
233
(61)
033
(0)
DA 742
(167)
1242
(286)
1242
(286)
742
(167)
342
(70)
142
(24)
EX 327
(111)
727
(259)
727
(259)
627
(223)
427
(148)
027
(0)
Quantidade de secreccedilatildeo traqueal acima de grau 2 considerada passiacutevel de
prejuiacutezo agrave troca gasosa e ao rendimento desportivo foi observada em 666 547
e 630 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT)
Os achados de anaacutelise citoloacutegica diferencial para os principais tipos celulares
do AT para os trecircs grupos de potros estudados estatildeo demonstrados na TABELA 5
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN (n=20) DA (n=19) E EX (n=15) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
Grupos Mac Lin Neut Eos Mast Calic Multi Epit Sid
CN 429plusmn63 75
plusmn19
76
plusmn29
12
plusmn07
002
plusmn02
05
plusmn02
02
plusmn01
201
plusmn56
0
DA 591
plusmn41
141
plusmn24
85
plusmn23
11
plusmn05
0 01
plusmn01
11
plusmn02a
161
plusmn48
0
EX 593
plusmn42
134
plusmn23
171
plusmn49
09
plusmn03
0 05
plusmn03
08
plusmn03
71
plusmn32
09
plusmn04
Mac macroacutefago alveolar Lin linfoacutecitos Neut neutroacutefilos Eos eosinoacutefilos Mast mastoacutecitos Calic ceacutelulas caliciformes Multi macroacutefagos multinucleados Epit ceacutelulas epiteliais Sid hemossideroacutefagos aPlt0001 vs CN
62
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA)
As quantidades de LBA recuperado estiveram entre 54 e 59 do volume
infundido para os grupos CN (n=16) DA (n=23) e EX (n=16)
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
A contagem do NTCN e a contagem diferencial de ceacutelulas do LBA estatildeo
demonstradas na TABELA 6
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN (n=45) DA (n=40) E EX (n=34) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
CTCN
(ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Macroacutef
Multi
Hemosid
CN 395
plusmn 38
673
plusmn 17
294
plusmn 15
23
plusmn 04
05
plusmn 03
005
plusmn 004
04
plusmn 01
0
DA 343
plusmn 24
698
plusmn 14
281
plusmn 13
09
plusmn 02
12
plusmn 01
002
plusmn 002
11
plusmn 01d
0
EX 456
plusmn 28a
676
plusmn 18
229
plusmn 15
54
plusmn 11b
15
plusmn 07c
02
plusmn 01
13
plusmn 02
22
plusmn 06
CTCN = contagem total de ceacutelulas nucleadas Macroacutef = macroacutefagos Linfoacutec = linfoacutecitos Neutroacutef = neutroacutefilos Eosino = eosinoacutefilos Masto = mastoacutecitos Macroacutef Multi = macroacutefagos multinucleados Hemosid = hemossideroacutefagos aPlt001 vs DA bPlt0001 vs DA cPlt005 vs DA dPlt0001 vs CN
Hemossideroacutefagos foram observados somente no LBA dos potros do grupo
EX mais especificamente em 23 (622) deles representando 22 do total de
ceacutelulas A quantidade observada de hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 da
contagem citoloacutegica diferencial do LBA
A correlaccedilatildeo entre as contagens percentuais de um mesmo tipo celular no AT
e no LBA foi analisada para os potros do grupo CN (n=11) DA (n=18) e EX (n=12)
que tiveram material colhido para as duas teacutecnicas citoloacutegicas natildeo tendo sido
63
encontrada correlaccedilatildeo entre ambas as teacutecnicas de avaliaccedilatildeo citoloacutegica para
nenhuma das ceacutelulas
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF
A resposta dos neutroacutefilos do sangue de equino frente ao PMA e frente ao
PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na ausecircncia e na presenccedila
do antagonista de PAF BN52021 estaacute demonstrado nas FIGURAS 13 a 15
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF aP=0028 vs controle bPlt0001 vs sem BN52021 cP=0028 vs PMA
64
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0007) 10nM (aP=0003) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA e PAF 1 e 10nM
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF EM TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA ePlt0001 vs PAF 1nM e fPlt0001 vs PAF 1nM e 10nM
65
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF
Tambeacutem se estudou a resposta dos macroacutefagos alveolares de equino frente
ao PMA e frente ao PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 demonstrado nas
FIGURAs 16 a 18
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0003) 10nM (aPlt0001) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0010 vs PMA dPlt0001 vs PAF 01nM e PAF 1nM
66
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0037) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA e PAF 01nM dPlt0001 vs PAF 1nM
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 01nM e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA dPlt001 vs PAF 1nM e 10nM
67
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos
foi mensurada pelo influxo de Ca++ em ceacutelulas PMN de equinos (FIGURA 19)
Registrou-se uma baixa relaccedilatildeo 340380 nm para os grupos CN (0005 plusmn 0002
relaccedilatildeo 340380 nm) e DA (0006 plusmn 0002 relaccedilatildeo 340380 nm) representando um
baixo niacutevel de bioatividade de PAF no LBA dos potros avaliados nestes grupos
Contudo a bioatividade de PAF do grupo EX (0068 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm) foi
significativamente maior em comparaccedilatildeo ao grupo DA (P=0017) Um graacutefico
representativo da bioatividade de PAF em uma das amostras do grupo EX na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 pode ser visto na FIGURA
20
CN DA EX000
002
004
006
008
010 a
Re
laccedil
atildeo
34
03
80
nm
Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedicodas Ceacutelulas do LBA
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE AO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0017 vs DA
68
0 50 100
150
200
0
1
2
3
4
Tempo (segundos)
Bioatividade de PAFR
ela
ccedilatildeo
3403
80n
m
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm A AMOSTRA Eacute ADICIONADA Agrave SUSPENSAtildeO DE CEacuteLULAS PMN APOacuteS 50 SEGUNDOS DE LEITURA BASAL (SETA)
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi maior no grupo DA em relaccedilatildeo
ao grupo CN (014 plusmn 003 vs 003 plusmn 001 mg de proteiacutenasmL de LBA) (P=0001) O
grupo EX apresentou concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA (036 plusmn 006 mg de
proteiacutenasmL de LBA) significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001)
(FIGURA 21)
69
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0001 vs CN bPlt0001 vs DA
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos foi maior no LBA do grupo DA (019 plusmn 001
absorbacircncia 550 nm) em relaccedilatildeo ao grupo CN (014 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm)
(P=0011) O grupo EX apresentou uma reduccedilatildeo significativa na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA (008 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm) significativamente menor em
comparaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001) (FIGURA 22)
70
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0011 vs CN bPlt0001 vs DA
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (1047 plusmn 241 vs 66
plusmn 35 nmolesmg de proteiacutenas) (Plt0001) No grupo EX a concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos nas ceacutelulas do LBA apresentou reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo
DA (352 plusmn 84 vs 1047 plusmn 241 nmolesmg de proteiacutenas) (P=0007) (FIGURA 23)
71
Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos no LBA
CN DA EX0
50
100
150a
b
nm
ole
s
mg
de
pro
teiacuten
as
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX (n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO APRESENTADOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNA DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aPlt0001 vs CN bP=0007 vs DA
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA
No grupo EX a atividade da catalase nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol
H2O2minmg de proteiacutenas) (P=0002) natildeo havendo diferenccedila entre os grupos CN e
DA (FIGURA 24)
72
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO microMOL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOMINUTOMILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0002 vs DA
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
A fagocitose de macroacutefago alveolar foi significativamente maior no grupo DA
em comparaccedilatildeo ao grupo CN (223 plusmn 043 vs 072 plusmn 018 absorbacircncia 550
nmadesatildeo) (P=0002) Observou-se uma diminuiccedilatildeo na fagocitose no grupo EX em
relaccedilatildeo ao grupo DA (104 plusmn 027 vs 223 plusmn 043 absorbacircncia 550 nmadesatildeo)
(P=0006) (FIGURA 25)
73
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A FAGOCITOSE PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (FAGOCITOSEADESAtildeO) aP=0002 vs CN e bP=0006 vs DA
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar
A utilizaccedilatildeo de PMA aumentou significativamente a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido pelos macroacutefagos alveolares dos grupos DA (219 plusmn 053 vs 392 plusmn 062
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0049) e EX (060 plusmn 011 vs 090 plusmn 014
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0031) A produccedilatildeo basal de acircnion superoacutexido foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (219 plusmn 053 vs 025
plusmn 007 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo DA (060 plusmn 011 vs 219 plusmn 053 absorbacircncia 595
nmadesatildeo) (P=0001) A produccedilatildeo de acircnion superoacutexido estimulada por PMA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (392 plusmn 062 vs 046
plusmn 016 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
74
diminuiccedilatildeo na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido em comparaccedilatildeo ao grupo DA (090 plusmn
014 vs 392 plusmn 062 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) (FIGURA 26)
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0049 vs DA bP=0031 vs EX cPlt0001 vs CN dP=0001 vs DA ePlt0001 vs CNe fPlt0001 vs DAe
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
O PMA aumentou a produccedilatildeo de H2O2 pelos macroacutefagos alveolares nos
grupos CN (041 plusmn 008 vs 099 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0004) DA
(035 plusmn 005 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0002) e EX (010 plusmn
001 vs 034 plusmn 008 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) A produccedilatildeo basal de
H2O2 para o grupo EX foi significativamente menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (010 plusmn
001 vs 035 plusmn 005 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) Aleacutem disso a produccedilatildeo
75
de H2O2 estimulada por PMA diminuiu no grupo EX tendo sido significativamente
menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (034 plusmn 008 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia
595nmadesatildeo) (P=0006) (FIGURA 27)
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0004 vs CN bP=0002 vs DA cPlt0001 vs EX dPlt0001 vs DA eP=0006 vs DAe
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
Hemossideroacutefagos foram observados no LBA de 23 potros (622) sendo
que estes foram considerados no subgrupo HPIE pos A quantidade observada de
76
hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 A ausecircncia de hemossideroacutefagos foi
evidenciada em 14 potros (378) sendo que estes foram considerados para o
subgrupo HPIE neg
Dentre os potros avaliados 15 (405) deles (10 potros do subgrupo HPIE
pos e 5 potros do subgrupo HPIE neg) apresentaram mais de 5 de neutroacutefilos eou
mais de 1 de eosinoacutefilos na contagem diferencial de ceacutelulas indicando um perfil
citoloacutegico de LBA compatiacutevel com inflamaccedilatildeo pulmonar
Os valores do NTCN bem como da contagem diferencial de ceacutelulas para o
grupo EX e para os subgrupos estaacute demonstrado na TABELA 7
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX (n=37) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=23) E HPIE NEG (n=14)
CTCN (ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Siderof
Grupo EX
456 plusmn 28
676 plusmn 18
229 plusmn 15
47 plusmn 10
13 plusmn 06
02 plusmn 01
22 plusmn 35
HPIE pos
571
plusmn 78a
645
plusmn 22b
240 plusmn 20
56 plusmn 12
09 plusmn 07
02 plusmn 02
34 plusmn 37
HPIE neg
348 plusmn 38
725 plusmn 30
207 plusmn 25
35 plusmn 18
19 plusmn 11
03 plusmn 01
00
CTCN contagem total de ceacutelulas nucleadas Macrof macoacutefagos Linfoc linfoacutecitos Neutrof
neutroacutefilos Eosinof eosinoacutefilos Mastoc mastoacutecitos Siderof hemossideroacutefagos aP=0005
vs HPIE neg bP=0020 vs HPIE neg
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg
(018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm P=0042) (FIGURA 28)
77
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) e HPIE NEG (n=5) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO RELACcedilAtildeO 340380nm aP=0042 vs HPIE neg
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi significativamente maior no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (039 plusmn 008 vs 019 plusmn
004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) (FIGURA 29)
78
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=13) E HPIE NEG (n=12) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS POR MILILITRO DE LBA aP=0031 vs HPIE neg
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos resultou
significativamente reduzida em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (008 plusmn 003 vs
012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) (FIGURA 30)
79
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) E HPIE NEG (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 550 nm aP=0049 vs HPIE neg
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA dos potros do
subgrupo HPIE pos resultou significativamente maior que no subgrupo HPIE neg
(367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) (FIGURA 31)
80
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) E HPIE NEG (n=8) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS aP=0009 vs HPIE neg
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
Natildeo houve diferenccedila na fagocitose de macroacutefago alveolar entre os grupos
estudados
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-)
A produccedilatildeo basal de O2- por macroacutefagos alveolares resultou similar entre os
grupos estudados A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0047) mas natildeo no subgrupo HPIE pos
(FIGURA 32)
A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA foi significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (081 plusmn 011 vs 124 plusmn
015 absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0042) (FIGURA 32)
81
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) E HPIE NEG (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0047 vs HPIE neg bP=0042 vs HPIE neg e
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
A produccedilatildeo basal de H2O2 por macroacutefago alveolar foi similar entre os grupos
avaliados no presente estudo A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0002) mas natildeo no subgrupo HPIE
neg (FIGURA 33)
A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA resultou significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (025 plusmn 003 vs 067 plusmn 014
absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0001)
82
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) E HPIE NEG (n=6) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2 ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0002 vs HPIE neg bP=001 vs HPIE neg e
5 DISCUSSAtildeO
O estudo da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas de cavalos de corrida adultos jovens
em trecircs diferentes situaccedilotildees em seu ambiente natural foi possiacutevel devido agrave
utilizaccedilatildeo de um grande nuacutemero de animais Assim permitiu-se detectar diferenccedilas
entre os grupos mesmo havendo variaccedilotildees ambientais tais como estaccedilotildees do ano
condiccedilotildees climaacuteticas e diferenccedilas sutis em manejo Como os potros dos trecircs grupos
encontravam-se na mesma faixa etaacuteria de risco para as doenccedilas respiratoacuterias virais
e os experimentos foram realizados durante um mesmo periacuteodo as diferenccedilas entre
os grupos CN e DA foram consideradas como sendo devido ao ambiente e as
diferenccedilas entre os grupos DA e EX foram consideradas como sendo devido ao
treinamento
O grupo CN evidenciou um percentual de observaccedilotildees de faringite na
avaliaccedilatildeo endoscoacutepica (TABELA 2) maior que os 37 relatado por HOBO et al
(1995) em cavalos PSI de corrida de dois anos de idade Os potros deste grupo
foram mantidos integralmente em piquetes e nesta situaccedilatildeo a hiperplasia dos
foliacuteculos linfoacuteides da faringe em cavalos jovens pode ser uma resposta normal a
inalaccedilatildeo de antiacutegenos ambientais ou agentes infecciosos (HOLCOMBE e
DUCHARME 2007)
De fato as vias aeacutereas dos potros desse grupo deram mostra de estarem
sendo desafiadas pelo nuacutemero percentual de corrimento nasal linfonodos
aumentados e quantidades elevadas de secreccedilatildeo traqueal iguais aos demais
grupos (TABELAS 1 e 4) Possivelmente isso tambeacutem se deva a fatores climaacuteticos
pois no estudo de ROBINSON et al (2006) com cavalos de montaria de vaacuterias
idades aqueles que permaneceram fora dos estaacutebulos durante o inverno
apresentaram quantidades elevadas de muco traqueal No entanto diferentemente
do nosso estudo os cavalos avaliados por ROBINSON et al (2006) tiveram nuacutemero
percentual de neutroacutefilos aumentado na secreccedilatildeo traqueal enquanto os potros do
grupo CN resultaram em avaliaccedilatildeo citoloacutegica tanto de AT (TABELA 5) como de LBA
(TABELA 6) normais (ROBINSON 2003 HODGSON e HODGSON 2007)
evidenciando vias aeacutereas especialmente as vias aeacutereas inferiores saudaacuteveis
Com relaccedilatildeo ao desafio ambiental no presente estudo adotou-se um sistema
convencional de estabulaccedilatildeo pois estudos anteriores em modelos semelhantes ao
84
nosso jaacute demonstraram a presenccedila de altas concentraccedilotildees de endotoxinas
(BERNDT et al 2008) bem como de poeira e de aeroalergenos (WOODS et al
1993)
Contudo o desafio ambiental de 30 dias utilizado em nosso estudo resultou
em quadro comparaacutevel ao do grupo CN isento de processo inflamatoacuterio das vias
aeacutereas Possivelmente um periacuteodo maior de desafio pudesse causar um processo
inflamatoacuterio tal como foi demonstrado previamente por HOLCOMBE et al (2001)
onde potros da raccedila puro sangue aacuterabe que sofreram desafio ambiental de 90 dias
apresentaram aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no LBA Contudo no
estudo citado o material utilizado para a cama dos potros foi a palha que tambeacutem
representou um maior risco de desenvolvimento de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas dos
cavalos em outros estudos quando comparada a serragem utilizada na cama dos
potros do grupo DA (BURRELL et al 1996 VANDEPUT et al 1998 GERBER et
al 2000 KLEIBER et al 2005 DEWACHI et al 2006)
Entretanto ateacute o momento os efeitos dos fatores ambientais das cocheiras
nas vias aeacutereas foram relatados em sua maioria em cavalos apresentando ORVA e
natildeo em indiviacuteduos jovens e saudaacuteveis como os potros avaliados em nosso estudo
Nos animais com ORVA um curto periacuteodo de exposiccedilatildeo ambiental (6 a 48 horas)
em baia e recebendo alimentaccedilatildeo composta principalmente por feno causou
aumento da expressatildeo de algumas citocinas (pex IL-4 e IL-5) em alguns estudos
mas nenhuma alteraccedilatildeo em outros (GERBER et al 2000 AINSWORTH et al 2003
CORDEAU et al 2004 KLEIBER et al 2005) sendo que um longo tempo de
exposiccedilatildeo ambiental (variando de cinco semanas a trecircs meses) causou aumento da
expressatildeo de IFN-γ e IL-8 (AINSWORTH et al 2003) IL-9 (DEWACHI et al 2006)
IL-17 (DEBRUE et al 2005) e o desenvolvimento dos sinais cliacutenicos da ORVA
acompanhados de alteraccedilotildees na funccedilatildeo pulmonar (VANDEPUT et al 1998)
Contudo nos potros do grupo DA se evidenciou no AT (TABELA 5) e no LBA
(TABELA 6) um aumento significativo do nuacutemero percentual de macroacutefagos
multinucleados em comparaccedilatildeo ao grupo CN bem como nuacutemero percentual de
eosinoacutefilos acima do valor considerado limite para cavalos normais (ROBINSON
2003) sugerindo que houve uma resposta por parte do sistema de defesa nas vias
aeacutereas dos potros deste grupo
Os macroacutefagos multinucleados ou ceacutelulas gigantes multinucleadas satildeo
formados a partir da fusatildeo de dois ou mais macroacutefagos na resposta imune pulmonar
85
(ANDERSON et al 1999) representando especificamente uma resposta imune do
tipo Th2 com a participaccedilatildeo da IL-4 (HELMING e GORDON 2007) Em pessoas os
macroacutefagos multinucleados satildeo considerados como um achado indicativo de
reaccedilotildees inflamatoacuterias crocircnicas nas vias aeacutereas como a tuberculose por exemplo
(LEMAIRE et al 2006 HELMING e GORDON 2007) Em equinos satildeo escassos os
estudos envolvendo a citologia respiratoacuteria que descrevam o nuacutemero percentual
normal deste tipo celular De qualquer forma eacute relatado que pode ser observado em
pequeno nuacutemero em cavalos sem evidecircncias de doenccedila pulmonar sendo que uma
quantidade aumentada jaacute foi descrita associada agrave inflamaccedilatildeo crocircnica (DECONTO
1983 HODGSON e HODGSON 2007) Estas informaccedilotildees parecem natildeo corroborar
com o aumento no nuacutemero percentual de macroacutefagos multinucleados no grupo DA
em se tratando de potros jovens considerados saudaacuteveis o que demonstra a
necessidade de mais estudos para se entender o papel do macroacutefago multinucleado
no pulmatildeo saudaacutevel e na inflamaccedilatildeo pulmonar dos cavalos
Entretanto o nuacutemero percentual de eosinoacutefilos acima do limite normal no
LBA dos potros do grupo DA pode ser considerado como uma resposta ao
ambiente assim como eacute considerado em humanos (DENGUEZLI-BOUZGARROU et
al 2007) e jaacute relatado em cavalos (COUEumlTIL et al 2007)
O periacuteodo de treinamento por sua vez induziu inflamaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo EX O nuacutemero significativamente aumentado de potros com tosse
(TABELA 1) constituiu a evidecircncia cliacutenica sugerindo inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas nos
potros desse grupo Cavalos saudaacuteveis raramente tossem (ROBINSON 2007)
sendo a tosse um sinal cliacutenico comprovadamente associado agrave inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas (BURRELL et al 1996 McGROUM e DIXON 2007) CHRISTLEY et al
(2001) correlacionaram a tosse com a presenccedila de faringite sendo que tal
associaccedilatildeo tambeacutem foi observada no grupo EX (TABELAS 1 e 2) Adicionalmente
BEDENICE et al (2008) estudaram a relaccedilatildeo entre a tosse e a inflamaccedilatildeo pulmonar
e descreveram que os cavalos avaliados por apresentarem tosse tiveram contagens
percentuais de neutroacutefilos no LBA maiores que 5
No presente estudo um aumento no NTCN e nas contagens percentuais de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos do LBA (TABELA 6) confirmaram a presenccedila de inflamaccedilatildeo
pulmonar no grupo EX (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
COUEumlTIL et al 2007) A neutrofilia no LBA de cavalos de corrida jaacute foi
correlacionada a um baixo rendimento desportivo e constitui sinal chave para o
86
diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007) A eosinofilia no LBA de cavalos de
corrida por sua vez pode ser um achado transitoacuterio (VIEL e HEWSON 2003)
apesar de tambeacutem ter sido associada a um baixo rendimento desportivo aleacutem de
hiperresponsividade das vias aeacutereas em cavalos de corrida jovens (HARE e VIEL
1998) Portanto tais evidecircncias podem ser consideradas como um risco ao futuro
potencial atleacutetico dos potros do grupo EX
No presente estudo natildeo houve correlaccedilatildeo entre os achados citoloacutegicos de AT
e LBA para nenhum dos trecircs grupos estudados e esta falta de correlaccedilatildeo entre AT
e LBA jaacute foi relatada anteriormente Portanto entende-se que os epiteacutelios traqueal e
broncoalveolar respondem diferentemente aos agentes agressores sendo que a
avaliaccedilatildeo de cavalos com tosse ou diminuiccedilatildeo de rendimento desportivo deve ser
realizada por ambas as teacutecnicas associadas (MALIKIDES et al 2003 CHRISTLEY
RUSH 2007 HODGSON e HODGSON 2007)
A ligaccedilatildeo entre o exerciacutecio e a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas provavelmente
envolve diversos mediadores proacute-inflamatoacuterios que uma vez identificados poderatildeo
ser alvo para abordagens terapecircuticas com o objetivo de minimizar os efeitos
deleteacuterios da inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos PSI de corrida jovens Neste
contexto um dos mais potentes e versaacuteteis mediadores proacute inflamatoacuterios envolvidos
na inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas eacute o PAF (UHLIG et al 2005)
PAF eacute quimiotaacutetico para bem como produzido por eosinoacutefilos macroacutefagos e
neutroacutefilos em resposta a estresse fiacutesico ou quiacutemico apresentando muitos dos
criteacuterios essenciais de um mediador proacute inflamatoacuterio (OWEN et al 2005)
De fato estudos realizados in vitro demonstraram que o PAF pode induzir a
migraccedilatildeo de neutroacutefilos e monoacutecitos do cavalo (DAWSON et al 1988) Aleacutem disso
demonstrou-se a quimiotaxia de eosinoacutefilos e neutroacutefilos no trato respiratoacuterio de
murinos e humanos induzida por PAF (LEE et al 2002 ISHII et al 2004) Em
cavalos com ORVA a administraccedilatildeo intravenosa de PAF promoveu uma reduccedilatildeo de
leucoacutecitos no sangue perifeacuterico e apoacutes alguns minutos houve um aumento de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo seguido de uma deterioraccedilatildeo cliacutenica e da funccedilatildeo
respiratoacuteria (FAIRBAIRN et al 1996) Portanto apoiado nestes estudos e nos
resultados de aumento do NTCN e de neutrofilia e eosinofilia no LBA do grupo EX
(TABELA 6) eacute razoaacutevel assumir que o PAF possa contribuir para a induccedilatildeo da
inflamaccedilatildeo pulmonar observada nos potros PSI jovens em treinamento avaliados no
presente estudo
87
A inflamaccedilatildeo pulmonar tambeacutem estaacute associada a um aumento nas
concentraccedilotildees de proteiacutenas no LBA principalmente devido ao extravasamento de
plasma (TSANGARIS et al 2003) que pode ser resultado da accedilatildeo de vaacuterios
mediadores proacute inflamatoacuterios tal como o PAF
Um aumento da permeabilidade microvascular induzida pelo PAF resultando
em extravasamento de plasma e edema foi demonstrado previamente no estudo de
CLAVIJO et al (2001) Aleacutem disso WEST et al (1997) demonstraram o acuacutemulo de
um fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar de cavalos exercitados a velocidades
entre 13 ms e 16 ms No presente estudo o significativo aumento da concentraccedilatildeo
de proteiacutenas no LBA dos potros do grupo EX em comparaccedilatildeo ao grupo DA (FIGURA
21) confirma que a permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) estava
aumentada nos potros do grupo EX e o PAF pode estar envolvido neste mecanismo
Diferentemente o significativo aumento de proteiacutenas no LBA do grupo DA em
comparaccedilatildeo ao grupo CN deve envolver outros mecanismos inflamatoacuterios pois natildeo
houve biotavidade de PAF significativa no LBA destes dois grupos (FIGURA 19)
Contudo os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da disponibilidade de oacutexido niacutetrico (NO) (KIKUCHI et al
2008) Houve uma produccedilatildeo limitada de NO nas vias aeacutereas dos potros do grupo
EX esperada em cavalos realizando exerciacutecio moderado ou proacuteximo do maacuteximo
(MILLS e HIGGINS 1997) Isto pode ser explicado pela hipoxemia arterial induzida
pelo exerciacutecio (HAIE) descrita em atletas humanos (HOPKINS 2005) e em cavalos
exercitando a altas intensidades (MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
DEMPSEY e WAGNER 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005) A produccedilatildeo de NO requer
normoxia (GRIMMINGER et al 1995) sendo que a anoxia abole o relaxamento
vascular dependente do endoteacutelio e a hipoxemia degrada o NO (De MEY e
VANHOUTTE 1980) Adicionalmente ocorre uma inibiccedilatildeo do NO pela hemoglobina
sendo que esta inibiccedilatildeo eacute inversamente proporcional a saturaccedilatildeo de oxigecircnio
(IWAMOTO e MORIN 1993)
A inibiccedilatildeo da siacutentese de NO resultou no aumento da permeabilidade vascular
no estudo de KIKUCHI et al (2008) concordando com os nossos achados
referentes agrave bioatividade de PAF aumentada associada ao aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas e agrave diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de nitritos no LBA
do grupo EX
88
De fato no estudo de BRKOVIC e SIROIS (2007) o PAF e natildeo o NO foi
considerado o mediador proacute inflamatoacuterio e causador do aumento da permeabilidade
vascular enquanto o NO foi considerado como um co-fator para as atividades
inflamatoacuterias do PAF Na relaccedilatildeo entre PAF e NO na microcirculaccedilatildeo parece que
NO apresenta um efeito protetor atenuando as atividades inflamatoacuterias de PAF
tendo inclusive reduzido a formaccedilatildeo de PAF em vecircnulas mesenteacutericas em ratos
(NEVIN e BROADLEY 2002)
Contudo o NO tambeacutem tem papel preponderante na defesa das vias aeacutereas
(NEVIN e BROADLEY 2002 XU et al 2006) e o aumento na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA do grupo DA pode ser considerado uma resposta aos poluentes
ambientais existentes nas cocheira dos cavalos (WOODS et al 1993 BERNDT et
al 2008) Aleacutem disso o NO reage com o acircnion superoacutexido (O -2) para formar
peroxinitrito (ONOO-) um forte oxidante capaz de provocar lesatildeo no tecido pulmonar
resultando em peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (XU et al 2006)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi investigada no presente estudo atraveacutes da
concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA que resultou
aumentada no grupo DA em comparaccedilatildeo com o grupo CN (FIGURA 23) A
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi associada ao acuacutemulo de neutroacutefilos e produccedilatildeo de ROS por
esses nas vias aeacutereas de crianccedilas (BUSS et al 2000) e de pessoas com DPOC
(SANTUS et al 2005) Natildeo houve aumento de neutroacutefilos no LBA dos potros do
grupo DA mas os macroacutefagos alveolares dos potros deste grupo apresentaram
maior produccedilatildeo de ROS (FIGURAS 26 e 27) Isso pode ter contribuiacutedo para o
aumento da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA neste grupo como resultado da
modificaccedilatildeo da funcionalidade dos macroacutefagos alveolares induzida por fatores
ambientais como descrito em estudos em humanos (LUNDBORG et al 2007) e em
cavalos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento resultou em reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos lipiacutedicos no LBA em comparaccedilatildeo com o grupo DA No estudo de
MASTALOUDIS et al (2004) corredores de ultramaratona apresentaram aumento
da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica avaliada por marcadores do sangue destes atletas
Contudo outros relataram a reduccedilatildeo dos marcadores de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes
exerciacutecio intenso em corredores e esquiadores (URSO e CLARKSON 2003) em
indiviacuteduos treinados (BALOG et al 2006) em pessoas apoacutes 6 meses de
89
treinamento e tambeacutem apoacutes um programa de treinamento de 3 semanas (ALDRED
2007) e em pacientes com DPOC apoacutes programa de exerciacutecios (PINHO et al 2007)
Provavelmente essa diminuiccedilatildeo na peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA dos potros do
grupo EX deveu-se a mecanismos protetores pois o treinamento influencia de forma
positiva a capacidade antioxidante do organismo em atletas humanos (URSO e
CLARKSON 2003 PARK et al 2005 BALOG et al 2006 ALDRED 2007 PINHO
et al 2007) e em cavalos (KIRSCHVINK et al 2008)
URSO e CLARKSON (2003) relataram um aumento significativo da atividade
da catalase uma enzima antioxidante nos eritroacutecitos de atletas humanos apoacutes um
exerciacutecio de corrida de longa distacircncia corroborando com os nossos achados de
aumento significativo da atividade da catalase no LBA dos potros do grupo EX em
comparaccedilatildeo com o grupo DA (FIGURA 24)
No presente estudo a atividade de macroacutefago alveolar foi investigada devido
ao papel inerente desta ceacutelula na defesa pulmonar O aumento na atividade dos
macroacutefagos alveolares no grupo DA foi discutida acima e provavelmente deveu-se agrave
presenccedila de aeroalergenos e endotoxinas presentes nas cocheiras dos cavalos
(RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento reduziu tanto a fagocitose de macroacutefago
alveolar (FIGURA 25) como a capacidade de produccedilatildeo de ROS (acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio) (FIGURAS 26 e 27)
O macroacutefago alveolar eacute a ceacutelula efetora do sistema imune predominante nos
espaccedilos alveolares e nas vias aeacutereas condutoras responsaacutevel por ativar as
respostas inflamatoacuterias de forma suficiente a eliminar agentes agressores (PETERS-
GOLDEN 2004) Os macroacutefagos alveolares satildeo essenciais agrave sobrevivecircncia
devendo estar em harmonia com o sistema nervoso e endoacutecrino para responder a
estiacutemulos fisioloacutegicos bem como patoloacutegicos (GORDON 2007) sem exagerar na
resposta a fim de natildeo comprometer a troca gasosa (PETERS-GOLDEN 2004)
Apesar de KIZAKI et al (2008) terem demonstrado que o macroacutefago pode
sofrer uma adaptaccedilatildeo ao exerciacutecio melhorando sua funcionalidade os potros PSI
jovens em treinamento para corrida do grupo EX apresentaram supressatildeo da
imunidade especificamente a relacionada agrave resposta imune inata dos macroacutefagos
alveolares corroborando com estudos anteriores (HUSTON et al 1987 RAIDAL et
al 2000 RAIDAL et al 2001) que avaliaram o LBA de cavalos apoacutes exerciacutecio
90
realizado em esteira de alta velocidade e obtiveram resultados semelhantes aos
nossos
Outro aspecto ainda natildeo relatado em equinos mas demonstrado em
pessoas eacute que a melhora na atividade antioxidante induzida pelo exerciacutecio pode
resultar em diminuiccedilatildeo da atividade da NADPH oxidase na membrana dos
macroacutefagos consequumlentemente reduzindo a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio por essas ceacutelulas (PARK et al 2005) como observado no
grupo EX
Portanto a influencia do exerciacutecio sobre a funcionalidade das ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico como a observada nos macroacutefagos alveolares do grupo EX no
presente estudo explicaria a maior suscetibilidade apresentada por potros de corrida
sob treinamento intenso a infecccedilotildees respiratoacuterias (HINES et al 1996) Em
humanos o exerciacutecio intenso reduziu a capacidade de apresentaccedilatildeo de antiacutegeno
(CEDDIA e WOODS 1999) bem como a resistecircncia antiviral (DAVIS et al 1997) por
macroacutefagos O PMA (phorbol myristate acetate) utilizado nas avaliaccedilotildees da
atividade de macroacutefago alveolar (ver toacutepicos 4114 e 4115) teve como funccedilatildeo
estimular a NADPH oxidase a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
(DEKKER et al 2000 NAKAJIMA et al 2000) mimetizando o estiacutemulo provocado
por agentes infecciosos (JI 2008) Isto de fato ocorreu no grupo EX jaacute que os
macroacutefagos estimulados apresentaram aumento significativo na atividade
comparando-se aos macroacutefagos natildeo estimulados (FIGURAS 26 e 27) entretanto a
atividade ainda foi significativamente menor que no grupo DA evidenciando a
reduccedilatildeo na atividade de macroacutefagos induzida pelo exerciacutecio
Os efeitos do PMA sobre os macroacutefagos alveolares e sobre os PMNs do
sangue de equino podem ser apreciados no experimento de validaccedilatildeo da teacutecnica
de estudo da bioatividade de PAF (FIGURAS 13 a 18) A teacutecnica utilizada para o
estudo da bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos potros
empregando-se PMNs de equinos como ferramenta para se avaliar o influxo de Ca++
induzido por PAF foi ineacutedita em estudos em cavalos Anteriormente a mesma
avaliaccedilatildeo foi realizada utilizando-se PMNs de humanos (GRYNKIEWICZ et al 1985
MARATHE et al 2001) Anteriormente os PMNs de equinos foram empregados
com ecircxito no estudo da bioatividade de PAF em extrato lipiacutedico obtido a partir de
amostras de pulmatildeo de ratos no estudo da asma (MUEHLMANN et al 2009)
91
Portanto a validaccedilatildeo desta teacutecnica se fez necessaacuteria e importante para o
reconhecimento dos resultados obtidos para a bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos investigados No presente estudo o PAF
ativou os PMNs do sangue do cavalo assim como os macroacutefagos alveolares de
forma concentraccedilatildeo dependente Portanto o PAF tendo como uma de suas origens
o macroacutefago alveolar eacute capaz de modificar o comportamento de neutroacutefilos
sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos
neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a ORVA (MARR et al 2002)
As influecircncias exercidas pelo PAF na circulaccedilatildeo pulmonar permeabilidade
capilar pulmonar e na agregaccedilatildeo plaquetaacuteria estimulou o estudo da HPIE nos potros
avaliados no grupo EX Para tal o hemossideroacutefago no LBA foi escolhido como o
marcador da HPIE porque a colheita do LBA 24 horas apoacutes o exerciacutecio resultou que
a observaccedilatildeo endoscoacutepica de sangue na traqueacuteia bem como a contagem do
nuacutemero de eritroacutecitos no LBA natildeo fossem teacutecnicas diagnoacutesticas indicadas nesse
momento
A observaccedilatildeo do hemossideroacutefago no LBA mesmo se constituindo numa
forma confiaacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993) poderia natildeo servir
aos nossos propoacutesitos de identificar diferenccedilas em marcadores inflamatoacuterios e de
estresse oxidativo bem como na funcionalidade de macroacutefagos alveolares dentro
de um mesmo grupo ateacute entatildeo considerado homogecircneo Contudo o
hemossideroacutefago presente no LBA foi confirmado no presente estudo natildeo soacute como
um marcador confiaacutevel da HPIE como tambeacutem foi capaz de diferenciar subgrupos
significativamente distintos dentro do grupo EX
Interessantemente observou-se um percentual de HPIE (determinado pela
presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA) maior que o de inflamaccedilatildeo pulmonar (gt5
de neutroacutefilos eou gt1 de eosinoacutefilos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA)
Isso nos leva a pensar que a HPIE precede a inflamaccedilatildeo no pulmatildeo dos cavalos de
corrida tal como foi sugerido por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) mas que
requer outras investigaccedilotildees para excluir que o contraacuterio estivesse acontecendo isto
eacute um processo inflamatoacuterio em periacuteodo anterior do treinamento que pudesse ter
deixado alguma fragilidade pulmonar Possivelmente o estudo de potros PSI de
corrida tatildeo jovens e em iniacutecio de treinamento permitiu tal discussatildeo visto que se
considera que a HPIE acometa praticamente a totalidade dos cavalos PSI em
treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007)
92
A associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo jaacute foi demonstrada anteriormente
(McKANE et al 1993) e foi considerada como sendo significativa no estudo
epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) apesar dos mecanismos pelos quais
esta associaccedilatildeo ocorre ainda serem apresentados de forma hipoteacutetica como no
recente estudo de DERKSEN et al (2009)
No estudo de COUEumlTIL e DENICOLA (1999) cavalos de corrida com HPIE
apresentaram na avaliaccedilatildeo do LBA um aumento no NTCN associado agrave neutrofilia
De fato isto ocorreu no subgrupo HPIE pos e esses achados de citologia
demonstram que a HPIE esteve associada agrave inflamaccedilatildeo pulmonar nos potros do
subgrupo HPIE pos
Outro achado comum entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar eacute o aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA como observado no subgrupo HPIE pos em
comparaccedilatildeo com o grupo HPIE neg (FIGURA 29) evidenciando um aumento na
permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) no subgrupo HPIE pos
O acuacutemulo de fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar associado agrave
inflamaccedilatildeo pulmonar como demonstrado por TSANGARIS et al (2003) foi discutido
acima Contudo cavalos com HPIE exercitados a altas velocidades tambeacutem
apresentaram aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas no espaccedilo alveolar (WEST e
MATTHIEU-COSTELLO 1999)
Possivelmente o aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas associado agrave HPIE
possa ser devido ao aumento da pressatildeo transmural nos capilares pulmonares
resultando em falecircncia por estresse dos capilares como demonstrado por BIRKS et
al (1997) em cavalos exercitados nas mesmas velocidades que os potros avaliados
no presente estudo
Adicionalmente parece que a HPIE deflagrou um mecanismo inflamatoacuterio
causador de extravasamento de plasma no espaccedilo alveolar nos potros do subgrupo
HPIE pos e a bioatividade de PAF significativamente aumentada no subgrupo HPIE
pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (FIGURA 28) indica a participaccedilatildeo desse
mediador proacute inflamatoacuterio nesse evento
O extravasamento de plasma na microcirculaccedilatildeo pulmonar e a formaccedilatildeo de
edema pulmonar induzidos por PAF foram demonstrados anteriormente e jaacute
discutidos acima (EVANS et al 1987 CLAVIJO et al 2001) No caso da HPIE
provavelmente o PAF induza a formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular
atraveacutes da desorganizaccedilatildeo de proteiacutenas juncionais (JIANG et al 2008) Estes dados
93
concordam com a proposta de WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) de que a
altas pressotildees em capilares pulmonares ocorra a formaccedilatildeo de fendas nas junccedilotildees
entre as ceacutelulas endoteliais Desta forma as evidecircncias indicam que associado ao
evento mecacircnico na etiopatogenia da HPIE um evento inflamatoacuterio tambeacutem estaacute
presente o que representa um fator de risco para o agravamento do quadro
Adicionalmente os eventos inflamatoacuterios presentes na HPIE se constituem em
potencial aacuterea para investigaccedilotildees terapecircuticas visto que ainda natildeo se tem um
tratamento efetivo para a hemorragia pulmonar em cavalos atletas Recentemente
evidecircncias de que a suplementaccedilatildeo de cavalos atletas com aacutecidos graxos ocircmega-3
melhora a fluidez da membrana dos eritroacutecitos (PORTIER et al 2006) sugeriu que a
influecircncia beneacutefica na resposta inflamatoacuteria pulmonar pode reduzir os iacutendices HPIE
(ERICKSON et al 2007)
Portanto eacute razoaacutevel assumir um papel para o PAF na fisiopatologia da HPIE
pelas suas propriedades angiogecircnicas aleacutem de seus efeitos proacute inflamatoacuterios
(APONTE et al 2008) concordando com a hipoacutetese da patogecircnese da HPIE
proposta por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) onde a ruptura dos capilares
pulmonares resultaria em inflamaccedilatildeo sangramento e hemosiderose e
consequumlentemente a ocorrecircncia de angiogecircnese na circulaccedilatildeo bronquial e fibrose
agravando o quadro da HPIE
Adicionalmente ZHANG et al (2003) demonstraram que o aumento da
permeabilidade capilar induzido por PAF envolve a participaccedilatildeo de estresse
oxidativo visto que a enzima antioxidante superoacutexido dismutase (SOD) atenuou os
efeitos do PAF sobre o endoteacutelio De fato o grupo HPIE pos apresentou a
concentraccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos significativamente aumentada em comparaccedilatildeo
ao subgrupo HPIE neg sendo uma evidecircncia de estresse oxidativo no LBA dos
potros deste grupo possivelmente exacerbada pela alta quantidade de ferro da
hemossiderina presente no espaccedilo alveolar (DERSEN et al 2009)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica induz alteraccedilotildees patoloacutegicas no tecido pulmonar
destruindo pneumoacutecitos e ceacutelulas endoteliais do epiteacutelio levando a um aumento da
permeabilidade microvascular inibe a siacutentese e a liberaccedilatildeo de surfactante e interfere
negativamente na atividade do NO O conjunto dessas accedilotildees dos peroacutexidos lipiacutedicos
no pulmatildeo resulta em dano da estrutura pulmonar e leva agrave hipertensatildeo
representando um fator adicional contribuindo para a patogenia da HPIE (MILLS e
HIGGINS 1997)
94
Os macroacutefagos alveolares como ceacutelulas orquestradoras da resposta imune
pulmonar (PETERS-GOLDEN 2004) devem possuir um importante papel na
patogenia da HPIE visto que a obtenccedilatildeo de subgrupos significativamente distintos
a partir do grupo EX no presente estudo se deu pela presenccedila ou ausecircncia de
hemossideroacutefagos THACKER (2006) descreveu que os macroacutefagos ativados
secretam interleucina-1 (IL-1) que atrai e ativa a proliferaccedilatildeo de fibroblastos e a
siacutentese de colaacutegeno para reparar o tecido danificado Em estudo histopatoloacutegico do
pulmatildeo de cavalos com HPIE as aacutereas de ocorrecircncia de hemorragia caracterizaram-
se por hemossiderose e fibrose (DERKSEN et al 2009)
Adicionalmente WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) sugeriram o
envolvimento de leucotrieno B4 (LTB4) no mecanismo inflamatoacuterio envolvido na
HPIE apesar deste mecanismo ainda requerer comprovaccedilatildeo Neste evento a
ruptura do epiteacutelio alveolar com a exposiccedilatildeo da membrana ativaria os macroacutefagos
alveolares os quais satildeo ricos em LTB4
O LTB4 por sua vez tambeacutem conecta o PAF agrave HPIE HOPKINS et al (1997)
estudaram a HPIE em humanos avaliando o LBA de seis ciclistas de elite apoacutes 4 km
de esforccedilo maacuteximo Comparados aos controles os ciclistas que realizaram o esforccedilo
apresentaram altas concentraccedilotildees de eritroacutecitos proteiacutenas e LTB4 no LBA No
estudo citado exceto pelo aumento da LTB4 natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
percentual de neutroacutefilos e nem nos niacuteveis de IL-8 e TNF-α entre os grupos
suportando a hipoacutetese do estresse mecacircnico alterando a BAC na HPIE segundo a
conclusatildeo dos autores Contudo a associaccedilatildeo entre LTB4 e PAF foi demonstrada
anteriormente onde o receptor de LTB4 esteve envolvido com a quimiotaxia
pulmonar e degranulaccedilatildeo de neutroacutefilos induzida por PAF (GAUDREAULT et al
2005) Todavia ateacute o momento este tipo de associaccedilatildeo natildeo foi demonstrada em
cavalos apesar de ter-se relatada a neutrofilia nas vias aeacutereas de cavalos com
ORVA mediada por LTB4 (LINDBERG et al 2004) Portanto reunindo as
informaccedilotildees acima pode-se assumir a hipoacutetese de que a neutrofilia no LBA e o
aumento da permeabilidade da BAC nos potros do subgrupo HPIE pos tenha sido
induzida por PAF e mediada por receptor de LTB4
Adicionalmente reforccedila-se a evidecircncia da importacircncia dos macroacutefagos
alveolares na HPIE e por sua vez como a hemorragia pulmonar pode influenciar a
funcionalidade dos macroacutefagos Na primeira etapa do presente estudo descrevemos
a reduccedilatildeo na fagocitose e na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de
95
hidrogecircnio pelos macroacutefagos alveolares do grupo EX (FIGURAS 25 a 27) Contudo
evidenciamos que a HPIE agravou ainda mais esta situaccedilatildeo (FIGURAS 32 e 33)
pois a resposta de macroacutefago alveolar esteve significativamente reduzida no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg
A reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no subgrupo HPIE pos pode ser
explicada novamente pela HAIE com consequumlente inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO
(MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
favorecendo o aumento da permeabilidade capilar (KIKUCHI et al 2008)
provavelmente agravado pela ocorrecircncia de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica neste grupo (MILLS
e HIGGINS 1997)
Os mecanismos pelos quais o NO modula a permeabilidade microvascular
natildeo satildeo bem conhecidos Em cavalos de PSI de corrida a inibiccedilatildeo da NOS pela
administraccedilatildeo de L-NAME agravou a HPIE enquanto natildeo alterou a pressatildeo arterial
pulmonar (KINDIG et al 2000) e a inalaccedilatildeo de NO durante o exerciacutecio reduziu
ligeiramente a pressatildeo arterial pulmonar enquanto tambeacutem causou agravamento da
HPIE (KINDIG et al 2001) Parece que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete
em parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou mas agravou a HPIE
Adicionalmente corroborando com o aumento da bioatividade de PAF e
reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos o estudo de
KWASNIEWSKI et al (2008) com um modelo de lesatildeo e hemorragia em intestino
delgado demonstrou que o preacute tratamento com antagonista de PAF reduziu as
lesotildees enquanto a inibiccedilatildeo do NO endoacutegeno aumentou consideravelmente as
lesotildees hemorraacutegicas e a mortalidade Portanto o estudo citado demonstrou a
existecircncia da relaccedilatildeo entre PAF e NO na hemorragia ocorrida na microcirculaccedilatildeo
assim como reafirma o papel protetor do NO para os efeitos proacute inflamatoacuterios do
PAF (NEVIN e BROADLEY 2002 BRKOVIC e SIROIS 2007)
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
A hipoacutetese do presente estudo foi confirmada pois tanto o desafio ambiental
como o exerciacutecio causaram alteraccedilotildees no fluido broncoalveolar e modificaram a
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar Potros PSI de corrida jovem em treinamento para
corrida apresentaram depressatildeo da resposta imune inata mais especificamente do
macroacutefago alveolar induzida pelo exerciacutecio e agravada pela ocorrecircncia da HPIE
PAF influencia os neutroacutefilos do sangue bem como os macroacutefagos alveolares
de equinos e no presente estudo esteve presente na inflamaccedilatildeo pulmonar induzida
pelo exerciacutecio nos potros PSI durante o treinamento para corrida
Os achados relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e ao aumento da
bioatividade de PAF no fluido broncoalveolar dos potros exercitados estiveram
relacionados agrave HPIE e agrave presenccedila dos hemossideroacutefagos no LBA o que resultou
numa resposta de macroacutefago alveolar ainda mais reduzida
Desta forma assume-se que os resultados obtidos para o grupo EX podem
ser extrapolados para as populaccedilotildees similares de cavalos PSI jovens em
treinamento para a corrida
Finalmente sugere-se a conduccedilatildeo de novos estudos para o entendimento
dos mecanismos inflamatoacuterios envolvidos na HPIE bem como o papel do PAF neste
processo
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DEDICATOacuteRIA
Este trabalho eacute dedicado agrave minha esposa Ana
Luacutecia e aos meus filhos Joatildeo Pedro e
Bernardo com todo o meu amor
Aos cavalos por me ensinarem tanto
AGRADECIMENTOS
A Deus por permitir-me concluir mais esta etapa em minha vida
A minha esposa Ana Luacutecia e meus filhos Joatildeo Pedro e Bernardo que estiveram ao
meu lado desde o iniacutecio desta jornada souberam me dar tranquumlilidade e muito amor aleacutem de levarem pizza no laboratoacuterio nos dias de experimento
Aos meus pais Pedro Maria Luis e Zelma pelos exemplos que vocecircs satildeo e por todo o amor e apoio em todos os momentos
Aos meus irmatildeos Marcus e Andreacute cunhados Cristine Dani e Luiz Gustavo sobrinhas Mariana e Juacutelia pela amizade e torcida
A minha orientadora Profa Dra Anita Nishiyama sobretudo pela amizade e incentivo sendo orientadora nos momentos certos sempre com muita competecircncia
Aos meus colegas meacutedicos veterinaacuterios e amigos Alessandro Mercadante Daniel Mendes Campos Fernando Perche e Luis Henrique Costa pelo apoio prestado na execuccedilatildeo deste trabalho permitindo a avaliaccedilatildeo de potros sob sua
responsabilidade
Aos estabelecimentos que me apoiaram e suas equipes de funcionaacuterios sempre
prestativos Haras Belmont Haras Cifra Haras Santa Rita da Serra Haras dos Girassoacuteis Haras Palmerini Haras Santareacuten
Aos treinadores que me apoiaram permitindo a avaliaccedilatildeo dos potros sob sua responsabilidade extensivo agraves suas respectivas equipes de funcionaacuterios Fernando Azevecircdo Beto Feltran Gladston Santos J Ceacutesar A A Farias Marcus Lanza
Agrave incansaacutevel equipe de colheitas de lavado broncoalveolar que em momento algum deixou de madrugar nos 22 experimentos conduzidos Lorena Andrade da Cruz
Renata Schaefer Liacutevia Medalha Arauacutejo Amine do Vale Meira Fabiana Tieme da Silva Mariana Muumlller da Silva Aline Bonfaacute Richard
A maravilhosa equipe da qual tive a felicidade de conhecer e trabalhar Luis Alexandre Muehlmann MS Fernanda Ceccon Grando MS Ana Luacutecia Zanatta Carolina Farias Gabriela Rubbo Eloyse Bieberbach Ana Claacuteudia e Victor Vocecircs
me deram a amizade e o prazer de trabalhar com vocecircs me ensinaram muito e valorizaram o verdadeiro sentido de equipe com simplicidade determinaccedilatildeo e muita competecircncia
Aos amigos do Laboratoacuterio de Metabolismo Celular da UFPR companheiros de poacutes-graduaccedilatildeo de duacutevidas de buscas pelas respostas de risadas e de conquistas
muito obrigado pela amizade ajuda e muita paciecircncia Fabiacuteola Eacuteverson Ricardo Carine Loli Sandro Gleisson Marcelo Jaison Isabela Diogo Paulo Dalton Gina Daniele Pequito
Ao Prof Dr Luiz Claacuteudio Fernandes pela inestimaacutevel oportunidade de poder
trabalhar no seu laboratoacuterio disponibilizando material necessaacuterio e seu tempo quando o solicitei
A minha amiga e soacutecia meacutedica veterinaacuteria MS Cassiana Maria Garcez Ramos
Aos meus amigos da Direccedilatildeo do Curso de Medicina Veterinaacuteria da PUCPR Profa
Dra Claacuteudia Turra Pimpatildeo e Prof Rodrigo Taacutevora Mira por todo o apoio incentivo e amizade incondicionais
Aos amigos professores da PUCPR Rita M Rocha Denise Kozemjakin Antonia Maria Marconi Farias pelo apoio
Ao Decano do Centro de Ciecircncias Agraacuterias e Ambientais da PUCPR Prof Dr Sylvio Peacutellico Neto pelo apoio e incentivo
Ao Professor Metry Bacila por tantos exemplos demonstrados e por nunca haver se omitido em ajudar e entusiasmar
As bibliotecaacuterias da UFPR pela ajuda e tambeacutem da PUCPR Lucieli e Teresinha e equipe
A amiga Monica Echeverria pela amizade e apoio no inglecircs nesta e em muitas outras oportunidades Thank you
Ao Laboratoacuterio Fort Dodge pelo apoio me fornecendo os sedativos e pela dedicaccedilatildeo dos competentes profissionais Alessandra Carol e Leonardo que sempre estiveram dispostos a ajudar
Ao amigo Nilton Reis companheiro de trabalho na Unidade Hospitalar para Equinos da PUCPR pelo apoio
Aos amigos do Regimento de Poliacutecia Montada Coronel Dulciacutedio pela amizade e apoio durante esta etapa Coronel Heraldo Reacutegis Boacuterio da Silva Major Lorival da
Cunha Sobrinho Major Maacutercio Luis Fonseca Capitatildeo Adilar Marcelo de Lima e agrave equipe do Centro Veterinaacuterio da PMPR Sargento Faacutetima Sd Manasseacutes e demais amigos
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS IX
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES XI
LISTA DE TABELAS XV
RESUMO XVI
ABSTRACT XVII
1 INTRODUCcedilAtildeO 18
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 18
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA) 18
13 PAF E VIAS AEacuteREAS 23
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 27
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO 29
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE) 34
2 OBJETIVOS 40
21 OBJETIVOS GERAIS 40
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS 41
31 REAGENTES E SEDATIVOS 41
32 ANIMAIS 41
33 ASPECTOS EacuteTICOS43
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA 43
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS 43
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) 45
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA46
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957) 47
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS 48
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE CA++
EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE ET AL 2001) 48
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)51
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR E MARLETTA 1985) 51
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA
(NOUROOZ-ZADEH ET AL 1994)52
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984) 53
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA ET AL 1998) 54
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA ET AL 1998) 54
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK E MIZEL 1981) 55
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN E GORDON 1987) 56
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 57
4 RESULTADOS 59
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO 59
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica59
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas 60
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT) 61
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA) 62
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem Diferencial de Ceacutelulas do LBA 62
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF 63
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF 65
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 67
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 68
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 69
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 70
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA 71
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 72
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar 73
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 74
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO 75
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA 75
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 76
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 77
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 78
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 79
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 80
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-) 80
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 81
5 DISCUSSAtildeO 83
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 96
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 97
LISTA DE ABREVIATURAS
ACVIM American College of Veterinary Internal Medicine
AT Aspirado traqueal
CN Grupo Condiccedilotildees Naturais
DA Grupo Desafio Ambiental
DIVA Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas
DIVAI Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
DPOC Doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica
EX Grupo Exerciacutecio
HAIE Hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio
HPIE Hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
HRPO Horse radish peroxidase
IFN-γ Interferon gama
IL-1 Interleucina-1
IL-4 Interleucina-4
IL-8 Interleucina-8
IL-9 Interleucina-9
IL-17 Interleucina-17
LBA Lavado broncoalveolar
L-NAME N-nitro-L-arginina metil ester
LTB4 Leucotrieno B4
LTE8 Leucotrieno E8
MLCP Myosin light chain phophatase
NO Oacutexido niacutetrico
NOS Oacutexido niacutetrico sintase
NTCN Nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas
ORVA Obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas
PAF Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PAF-AH Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria acetilhidrolase
PAF-R Receptor de fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PBS Soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada
PMA Phorbol myristate acetate
PMN Polimorfonuclear
PRS Phenol red solution
PSI Puro sangue inglecircs
RNS Espeacutecie reativa do nitrogecircnio
ROS Espeacutecie reativa do oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Th2 Linfoacutecitos T helper 2
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE 20
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO SN-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL 24
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM
RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS 25
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E
SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE 30
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA
ASMA 31
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS 32
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO
A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR
(BAC) 36
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO
DERSKEN et al (2009) 38
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA
FARINGE 44
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS
ARITENOacuteIDES DE I A IV 44
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME
ENDOSCOacutePICO 45
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO
DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO
REGISTRADA A 510 nm 50
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA
ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 57
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA
AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 63
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS
DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 64
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO
ANTAGONISTA DE PAF BN52021 64
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO
ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 65
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 66
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR
PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 66
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++
EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 67
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO
EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA
ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 68
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A
PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 69
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO
SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 70
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX
(n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA 71
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) 72
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) 73
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) 74
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) 75
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) HPIE NEG (n=5) e EX NORMAL (n=4) 76
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE
POS (n=13) HPIE NEG (n=12) E EX NORMAL (n=8) 77
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) HPIE NEG (n=10) E EX NORMAL (n=7) 79
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) HPIE NEG (n=8) E EX NORMAL (n=5) 80
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS
POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) HPIE NEG (n=5) E EX NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE
POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 81
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE
PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) HPIE NEG (n=6) E EX
NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2
ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 82
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS
TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE
INGLEcircS DE CORRIDA 59
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGIANOS
OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS
DE I A IV 60
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS
CARTILAGENS ARITENOacuteIDES 60
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA
ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO
SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE
AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 61
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS
CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN
(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS
DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN
(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM
PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO
LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX E DOS
SUBGRUPOS HPIE POS HPIE NEG E EX NORMAL 76
RESUMO
A doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas (DIVA) e a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) satildeo comuns em cavalos de corrida resultando em interrupccedilatildeo no treinamento A hipoacutetese do presente estudo foi de que o ambiente e o exerciacutecio
causam estresse oxidativo produccedilatildeo do fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF) e inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas de potros PSI de corrida e que haacute uma relaccedilatildeo entre a DIVA e a HPIE Estudou-se potros PSI em ambiente natural (NC n=45) estabulados
por 30 dias (DA n=40) e treinados (EX n=34) Apoacutes os potros do grupo EX foram divididos em trecircs subgrupos HPIE pos (presenccedila de hemossideroacutefagos no lavado broncoalveolar - LBA) HPIE neg (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA) e EX
normal (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA e menos de 5 de neutroacutefilos e menos de 1 de eosinoacutefilos no LBA) Avaliou-se perfil citoloacutegico e paracircmetros do LBA relacionados a estresse oxidativo bioatividade de PAF atividade da catalase e
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar (MA) Os percentuais de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no LBA do grupo EX foram maiores (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 e 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectivamente) que os limites superiores para cavalos normais
(5 para neutroacutefilos e 1 para eosinoacutefilos) juntamente com um maior nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 ceacutelulasmicroL de LBA P=0017) evidenciaram a ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo pulmonar A bioatividade de PAF e a
concentraccedilatildeo de proteiacutenas no LBA foram maiores no grupo EX (relaccedilatildeo 340380 nm 0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg de proteiacutenasmL de LBA Plt0001) A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos no LBA foi maior
no grupo DA (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg de proteiacutenas Plt0001) e a atividade da catalase foi maior no grupo EX (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg de proteiacutenas P=0002) A fagocitose de MA (P=0006) bem como a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido (Plt0001) e peroacutexido de hidrogecircnio (P=0006) foram
significativamente menores no grupo EX Vinte e trecircs (622) potros do grupo EX foram HPIE pos e o LBA desse subgrupo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutenas (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) bioatividade de
PAF (relaccedilatildeo 340380 nm 0180 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 P=0042) e concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) significativamente maiores que o subgrupo HPIE neg A concentraccedilatildeo de nitritos
(008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) e a atividade de MA foi menor em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg O ambiente e o exerciacutecio modificaram o fluido broncoalveolar confirmando a hipoacutetese do presente estudo
Houve aumento da resposta de MA induzida pelo ambiente enquanto o exerciacutecio fiacutesico resultou em HPIE inflamaccedilatildeo pulmonar e diminuiccedilatildeo na resposta imune inata relacionada aos macroacutefagos alveolares nos potros PSI jovens durante o treinamento
para corrida e o PAF esteve presente nesse processo Sugere-se a conduccedilatildeo de novas investigaccedilotildees para elucidar os mecanismos inflamatoacuterios da HPIE bem como o papel do PAF neste processo como um potencial alvo terapecircutico
Palavras-chave cavalo fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria hemorragia pulmonar inflamaccedilatildeo pulmonar fluido broncoalveolar
ABSTRACT
Inflammatory airway disease (IAD) and exercise-induced pulmonary hemorrhage (EIPH) are common in racehorses during training being important ailments interrupting training of thoroughbred racehorses The present study hypothesis was
that stabling and exercise cause oxidative stress release of platelet-activating factor (PAF) and inflammation in airways of Thoroughbred colts and that there is an association between IAD and EIPH The subjects were colts in breeding farms (NC
n=45) stabled for 30 days (EC n=40) and race trained (EX n=34) Colts of the EX group were subdivided into three subgroups EIPH pos (presence of hemosiderophages in BALF) EIPH neg (absence of hemosiderophages in BALF)
and Normal EX (absence of hemosiderophages and less than 5 neutrophils and 1 eosinophils in BALF) Cytological profile and parameters of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) related to oxidative stress bioactivity of the pro-inflammatory
mediator PAF catalase activity and alveolar macrophage (AM) activity were studied Percentages of neutrophils and eosinophils in the BALF of the EX group were higher (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 and 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectively)
than the upper limits for normal horses (5 of neutrophils and 1 of eosinophils) that associated with a significantly higher total nucleated cell count (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 cellsmicroL of BALF P=0017) displayed pulmonary inflammation PAF
bioactivity and the total protein concentration in the BALF were higher in the EX group (0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 340380nm ratio P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg of proteinsmL of BALF Plt0001) Concentration of BALF hydroperoxides
was higher in the EC group (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg of proteins Plt0001) and catalase activity was higher in the EX group (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg of proteins P=0002) AM phagocytosis (P=0006) as well as production of superoxide anion (Plt0001) and hydrogen peroxide (P=0006) were
significantly lower in EX group Twenty three (622) colts of the EX group were EIPH pos and the BALF of this subgroup presented a significantly higher protein concentration (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg of proteinsmL of BALF P=0031) PAF
bioactivity (018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 340380 nm ratio P=0042) and lipid hydroperoxide concentration (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg of proteins P=0009) as well as lower nitrite concentration (008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007
absorbance 550 nm P=0049) and AM activity than EIPH neg subgroup Environment and exercise modified the bronchoalveolar fluid confirming the hypothesis of the present study Environment increased AM response as exercise resulted in EIPH
pulmonary inflammation and decreased innate immune response of alveolar macrophages in young Thoroughbred horses during race training and PAF participated in this event Further studies should be conducted to better understand
the inflammatory mechanisms of EIPH and the role of PAF in this process as a potential therapeutic target
Keywords horse platelet-activating factor pulmonary hemorrhage pulmonary
inflammation bronchoalveolar fluid
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
As doenccedilas respiratoacuterias satildeo comuns nos cavalos e as condiccedilotildees a que
estatildeo sujeitos fazem com que a inflamaccedilatildeo seja uma manifestaccedilatildeo frequumlente dessas
afecccedilotildees O epiteacutelio das vias aeacutereas superiores e dos pulmotildees estatildeo expostos a
patoacutegenos invasores e fatores ambientais Portanto o conhecimento dos
mecanismos da resposta inflamatoacuteria nas vias aeacutereas se faz importante a fim de se
estabelecer estrateacutegias para reduzir o impacto e os danos causados (THACKER
2006)
A inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apresenta um agravante o papel dos pulmotildees
na troca gasosa Assim as quatro principais consequumlecircncias de um processo
inflamatoacuterio desencadeado nas vias aeacutereas incluem vasodilataccedilatildeo e a reduccedilatildeo no
fluxo sanguiacuteneo resultando em capilares ingurgitados o aumento da permeabilidade
capilar permitindo a passagem de fluiacutedo e ceacutelulas para os tecidos o influxo e
acuacutemulo de fagoacutecitos e ceacutelulas ativadas no local e a bronconstricccedilatildeo (LUNN et al
2007)
O estudo das doenccedilas respiratoacuterias em cavalos eacute relevante particularmente
nos cavalos jovens de corrida onde a taxa de inflamaccedilatildeo detectada nas vias aeacutereas
eacute significativa (CHRISTLEY e RUSH 2007)
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA)
Os termos ldquodoenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereasrdquo (DIVA) e ldquodoenccedila
inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferioresrdquo (DIVAI) tecircm sido usados para descrever uma
siacutendrome inflamatoacuteria do trato respiratoacuterio de cavalos de corrida (CHRISTLEY e
RUSH 2007)
Tem-se relatado que a DIVA ocorre em 11 a 50 dos cavalos de corrida em
treinamento chegando a afetar ateacute 80 dos cavalos de corrida de dois anos de
idade (CHRISTLEY e RUSH 2007) MALIKIDES (2003) estudou a prevalecircncia da
DIVA em cavalos de corrida na Austraacutelia evidenciando que 41 deles apresentaram
inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apoacutes duas semanas de iniciarem treinamento
19
A DIVA eacute considerada a segunda afecccedilatildeo mais comum a interromper o
treinamento para corridas (WILSHER et al 2006) podendo resultar em prejuiacutezos a
troca gasosa e diminuiccedilatildeo da capacidade atleacutetica (COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005)
Cavalos com DIVA ou com hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) apresentaram uma maior hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE)
(CHRISTLEY et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
(FIGURA 1)
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE EIPH HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO IAD DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS UAO OBSTRUCcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS SUPERIORES FONTE SAacuteNCHEZ et al (2005)
Cavalos trotadores de corrida diagnosticados com DIVA tiveram a mecacircnica
pulmonar (volume corrente frequumlecircncia respiratoacuteria ventilaccedilatildeo pulmonar duraccedilatildeo da
inspiraccedilatildeo e da expiraccedilatildeo complacecircncia dinacircmica) alterada apresentaram um
significativo aumento da carga ventilatoacuteria e da energia requerida para a respiraccedilatildeo
sofrendo restriccedilotildees em seu rendimento atleacutetico (PIRRONE et al 2007)
Contudo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas dos cavalos atletas natildeo eacute entendida
por completo especialmente pela falta de consistecircncia e precisatildeo na definiccedilatildeo
dessa siacutendrome (CHRISTLEY e RUSH 2007)
Recentemente um painel de discussatildeo promovido pelo American College of
Veterinary Internal Medicine (ACVIM) definiu que a DIVA pode ocorrer em cavalos
de qualquer idade e eacute caracterizada pelo seguinte fenoacutetipo (COUEumlTIL et al 2007)
20
- Baixo rendimento desportivo intoleracircncia ao exerciacutecio
- Tosse com ou sem quantidade excessiva de muco traqueal
- Inflamaccedilatildeo natildeo seacuteptica detectada pela avaliaccedilatildeo citoloacutegica do fluido do LBA
ou disfunccedilatildeo pulmonar baseada em evidecircncia de obstruccedilatildeo de vias aeacutereas
inferiores hiperresponsividade das vias aeacutereas ou prejuiacutezo a troca gasosa durante o
repouso ou exerciacutecio
Este painel formado por experts e pesquisadores da aacuterea propocircs tambeacutem
alguns fatores de exclusatildeo para a DIVA
- Evidecircncia de sinais sistecircmicos de infecccedilatildeo (febre alteraccedilotildees hematoloacutegicas
compatiacuteveis com infecccedilatildeo)
- Aumento do esforccedilo respiratoacuterio durante o repouso
A etiopatogenia da DIVA eacute pouco definida Acredita-se que uma variedade de
fatores de risco estejam envolvidos variando nas diferentes populaccedilotildees de cavalos
baseado na alimentaccedilatildeo manejo praacuteticas preventivas distribuiccedilatildeo de agentes
infecciosos e influecircncias geneacuteticas (COUEumlTIL et al 2007)
Alguns autores encontraram uma reduccedilatildeo da incidecircncia desta afecccedilatildeo em
cavalos mais velhos (BURRELL et al 1996 CHAPMAN et al 2000 CHRISTLEY et
al 2001 WOOD et al 2005) sendo que a idade natildeo provocou diferenccedila no estudo
de McKANE et al (1993)
O ambiente da cocheira representa um risco adicional para a DIVA nos
cavalos (BURRELL et al 1996 HOLCOMBE et al2001 CLEMENTS e PIRIE
2007 BERNDT et al 2008) bem como para a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas das
pessoas envolvidas no trabalho com os cavalos (ELFMAN et al 2009)
HOLCOMBE et al (2001) associaram o manejo de estabulaccedilatildeo com a
ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas inferiores Estudaram 14 potros aacuterabes
que foram transferidos da pastagem para cocheiras com cama de palha Apoacutes 90
dias de estabulados houve um aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no
lavado broncoalveolar (LBA) Cavalos estabulados em cama de palha tambeacutem
apresentaram maior chance de apresentar DIVA em outros estudos (BURRELL et
al 1996 WOODS et al 1993)
No entanto em cavalos de montaria no estado norte-americano de Michigan
foi a permanecircncia em piquetes durante o inverno que esteve associado com
aumento do acuacutemulo de muco traqueal com maior nuacutemero de neutroacutefilos Neste
21
estudo a alimentaccedilatildeo com feno tambeacutem representou risco para a ocorrecircncia de
inflamaccedilatildeo (ROBINSON et al 2006)
Contudo o ambiente de cocheiras em modelos convencionais de manejo aos
quais os cavalos em treinamento estatildeo submetidos reconhecidamente apresenta
riscos para as vias aeacutereas Nestes haacute aumento nas concentraccedilotildees de partiacuteculas
inalaacuteveis contendo partiacuteculas orgacircnicas e inorgacircnicas incluindo endotoxinas β-D-
glucan partiacuteculas ultra finas (lt100 nm de diacircmetro) microorganismos esporos de
fungos material vegetal poeira inorgacircnica e gases toacutexicos (COUEumlTIL et al 2007)
Recentemente no estudo de BERNDT et al (2008) se demonstrou que o ambiente
de cocheira apresenta uma concentraccedilatildeo de endotoxinas 8 vezes maior que nos
piquetes
Aleacutem disso haacute muito jaacute foi descrita a presenccedila de actinomicetos termofiacutelicos
como a Micropolyspora faeni nos fenos fornecidos aos cavalos capazes de serem
inalados atingindo as vias aeacutereas inferiores (McPHERSON e THOMSON 1983)
Assim a praacutetica de encharcar o feno antes da administraccedilatildeo para diminuir a
quantidade de poeira disponiacutevel resultou em benefiacutecio agraves vias aeacutereas dos cavalos
(CLEMENTS e PIRIE 2007)
Por outro lado a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA ainda
natildeo estaacute bem esclarecida Cavalos com sinais cliacutenicos de inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas apresentaram maior frequecircncia de isolados bacterianos nos estudos de
CHRISTLEY et al (2001) e WOOD et al (2005) apesar de o painel do ACVIM
entender que a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA precisa ser
melhor estudada (COUEumlTIL et al 2007)
O exerciacutecio tambeacutem tem sido associado agrave inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas
inferiores dos cavalos atletas (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) A prevalecircncia da DIVA eacute maior em cavalos em treinamento
que em cavalos do mesmo grupo mas sem treinamento talvez pela inalaccedilatildeo de
maiores quantidades de partiacuteculas pela exposiccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores ao ar
frio ou pela ocorrecircncia da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (DAVIS et
al 2006 CHRISTLEY e RUSH 2007)
O diagnoacutestico da DIVA inclui a histoacuteria e o exame fiacutesico detalhados para a
identificaccedilatildeo de potenciais fatores etioloacutegicos A tosse durante o exerciacutecio ou
durante a alimentaccedilatildeo constitui a queixa mais comum (CHRISTLEY e RUSH 2007)
esteve associada agrave presenccedila de quantidades aumentadas de secreccedilatildeo traqueal bem
22
como a um maior percentual de neutroacutefilos tanto na secreccedilatildeo traqueal (CHRISTLEY
et al 2001) como no LBA (BENEDICE et al 2008) mas sua ausecircncia natildeo descarta
o diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
A presenccedila de descarga nasal mucopurulenta eacute achado comum em cavalos
de corrida de dois anos de idade sendo menos comum em cavalos mais velhos
Sua relaccedilatildeo com a DIVA todavia natildeo eacute sabida (COUEumlTIL et al 2007)
A auscultaccedilatildeo toraacutecica durante o repouso raramente evidencia alteraccedilotildees em
cavalos atletas com inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores (MAZAN e HOFFMAN
2003 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007) sendo necessaacuteria a
utilizaccedilatildeo de uma sacola para o cavalo respirar no seu interior ampliando o esforccedilo
respiratoacuterio (bdquorebreathing bagrsquo) podendo tornar audiacuteveis alguns sons anormais em
certos casos (MAZAN e HOFFMAN 2003 COUEumlTIL et al 2007)
MAZAN e HOFFMAN (2003) relataram que os testes de funccedilatildeo pulmonar
como o pneumotacoacutegrafo e o teste de broncoprovocaccedilatildeo com histamina podem
auxiliar tornando o diagnoacutestico da DIVA definitivo Contudo o diagnoacutestico precoce
da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores deve enfatizar a avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA
e natildeo os testes de funccedilatildeo pulmonar (COUEumlTIL et al 2007)
A avaliaccedilatildeo citoloacutegica do AT tambeacutem tem contribuido ao diagnoacutestico dos
processos inflamatoacuterios das vias aeacutereas contudo natildeo eacute considerado suficiente para
o diagnoacutestico da DIVA Isto se deve a falta de concordacircncia entre os achados
citoloacutegicos do AT e do LBA e da falta de estudos associando os achados no AT e o
rendimento atleacutetico (HODGSON e HODGSON 2003 HUGHES et al 2003
COUEumlTIL et al 2007) Ainda um cuidado a ser levado em conta quando da
realizaccedilatildeo de AT eacute o tempo da colheita jaacute que a realizaccedilatildeo de exerciacutecio
esteneuante pode aumentar o percentual de neutroacutefilos na amostra obtida
(MALIKIDES et al 2007)
O LBA por sua vez eacute o meacutetodo para a obtenccedilatildeo de amostras de ceacutelulas
presentes nas vias aeacutereas mais distais e espaccedilo alveolar (HOFFMAN 1999
FERNANDES et al 2000 LESSA et al 2005) considerado como uma bioacutepsia
liacutequida (MAZAN e HOFFMAN 2003) sendo a teacutecnica de avaliaccedilatildeo citoloacutegica
preferida para o diangoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
Um aumento no percentual de ceacutelulas inflamatoacuterias no fluido do LBA eacute um dos
principais criteacuterios diagnoacutesticos para a DIVA Usualmente ocorre uma predominacircncia
de neutroacutefilos mas tambeacutem pode ocorrer aumento nos nuacutemeros percentuais de
23
eosinoacutefilos linfoacutecitos e mastoacutecitos normalmente associados com diminuiccedilatildeo no
rendimento desportivo e hiperresponsividade das vias aeacutereas (McKANE et al 1993
HARE e VIEL 1998 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007)
O perfil citoloacutegico de LBA mais comumente encontrado em cavalos com DIVA
eacute caracterizado por aumento no nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (NTCN) com
discreta neutrofilia (gt5) linfocitose e monocitose Tambeacutem pode ser encontrado
um aumento do nuacutemero percentual de eosinoacutefilos (gt01) e mastoacutecitos (gt2)
(HOFFMAN 1999 COUEumlTIL et al 2007)
O painel de estudo da DIVA promovido pelo ACVIM apontou direccedilotildees para as
pesquisas nesta aacuterea e dentre elas o estudo das citocinas e mediadores
inflamatoacuterios envolvidos no processo (COUEumlTIL et al 2007)
Sabe-se que ocorre um incremento da imunidade inata nas vias aeacutereas dos
cavalos estabulados com o envolvimento de IL-6 (RIIHIMAumlKI et al 2008a) Em
cavalos trotadores de corrida em treinamento ocorre uma eosinofilia transitoacuteria no
fluido broncoalveolar e um aumento da expressatildeo de IL-4 e IL-5 contudo natildeo foi
encontrada correlaccedilatildeo entre estes eventos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Dentre os mediadores quiacutemicos participantes do processo inflamatoacuter io nas
vias aeacutereas o PAF (platelet-activating factor) estaacute especialmente implicado na asma
sepse e injuacuteria pulmonar aguda (THACKER 2006) presente tambeacutem na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas em cavalos mais velhos
(FAIRBAIRN et al 1996) Contudo a participaccedilatildeo do PAF no processo inflamatoacuterio
nas vias aeacutereas de cavalos atletas ainda natildeo eacute conhecida
13 PAF E VIAS AEacuteREAS
O fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocoline)
eacute um potente mediador proacute inflamatoacuterio envolvido na angiogecircnese aterosclerose
anafilaxia cicatrizaccedilatildeo inflamaccedilatildeo apoptose e endotoxemia (MARATHE et al
2001 STAFFORINI et al 2003 OWEN et al 2005) O PAF eacute produzido por
eosinoacutefilos macroacutefagos alveolares neutroacutefilos plaquetas e ceacutelulas endoteliais
(BAKER et al 2002 STAFFORINI et al 2003 GAUDREAULT et al 2005 SUMITA
et al 2005) a partir de uma subclasse especiacutefica de fosfatidilcolina que conteacutem um
eacuteter ao inveacutes de um eacutester ligado a posiccedilatildeo sn-1 do esqueleto de glicerol (FIGURA
24
2) A fosfatidilcolina eacute o mais abundante fosfolipiacutedio presente nas membranas
bioloacutegicas (MARATHE et al 2001 OWEN et al 2005)
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO sn-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL FONTE MARATHE et al (2001)
O PAF tambeacutem estaacute envolvido numa variedade de funccedilotildees pulmonares como
por exemplo no tocircnus vascular e das vias aeacutereas na frequumlecircncia de movimentaccedilatildeo
dos ciacutelios e na permeabilidade endotelial causando um aumento da secreccedilatildeo de
fluido traqueal broncoconstricccedilatildeo edema e hiperresponsividade das vias aeacutereas
resultando em prejuiacutezos a troca gasosa (CLAVIJO et al 2001 GABRIJELCIC et al
2003 ISHII et al 2004 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008)
Os efeitos do PAF sobre a circulaccedilatildeo pulmonar foram descritos por diversos
autores CHEN et al (1992) demonstraram um aumento das pressotildees arterial e
microvascular pulmonares e edema apoacutes a injeccedilatildeo de PAF SHIBAMOTO et al
(1993) estudaram os efeitos do PAF na circulaccedilatildeo venosa em pulmatildeo de catildeo onde
o PAF causou venoconstricccedilatildeo e aumento da pressatildeo capilar sem aumento da
permeabilidade vascular OHAR et al (1994) tambeacutem demonstraram
venoconstricccedilatildeo em estudo com pulmatildeo de coelhos mas demostraram que a
reduccedilatildeo da complacecircncia e aumento da resistecircncia vascular deveu-se a alteraccedilatildeo
estrutural vascular por perda de colaacutegeno intersticial induzida por PAF
Contudo o papel do PAF como causador de aumento da permeabilidade
vascular e edema pulmonar estaacute bem estudado devido a sua participaccedilatildeo na
fisiopatologia da anafilaxia da endotoxemia e da asma (EVANS et al 1987
25
CLAVIJO et al 2001 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008
MUEHLMANN et al 2009)
Em estudo preacutevio o extravasamento microvascular ocorrido apoacutes a infusatildeo de
PAF natildeo foi acompanhado de aumento da pressatildeo arterial pulmonar assim os
autores concluiacuteram que o edema pulmonar mediado por PAF resulta de aumento da
permeabilidade microvascular pulmonar (CLAVIJO et al 2001)
De fato demonstrou-se que o aumento da permeabilidade capilar induzida
por PAF ocorre pela formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular devido a
desorganizaccedilatildeo das proteiacutenas juncionais VE-caderina e ocludina (ZHANG et al
2003 JIANG et al 2008) mediada por receptores especiacuteficos (EVANS et al 1987)
e atraveacutes da ativaccedilatildeo da via do insositol trisphosphato e influxo de caacutelcio (GOumlGGEL
e UHLIG 2005) (FIGURA 3)
PLC phopholipase C IP3 inositol 145-trisphosphato IP3R receptor de IP3
MLCK myosin light chain kinase ML-7 5-iodonaphthalene-1sulphonyl-
homopiperazine L108 edelfosina Inibiccedilatildeo ativaccedilatildeo
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS NO LADO ESQUERDO OBSERVA-SE O EFEITO DO PAF EM CEacuteLULAS ENDOTELIAIS NO LADO DIREITO OBSERVA-SE OS EFEITOS DO PAF EM CEacuteLULAS DA MUSCULATURA LISA VASCULAR E DAS VIAS AEacuteREAS A QUAL Eacute ALTAMENTE MEDIADA POR TROMBOXANO NESTE A VIA PRINCIPAL Eacute ATRAVEacuteS DA ATIVACcedilAtildeO DE RHO E PROTEIacuteNAS KINASES ASSOCIADAS Agrave RHO QUE ATENUAM A ATIVIDADE DA MLCP (MYOSIN LIGHT CHAIN PHOPHATASE) COM CONSEQUumlENTE AUMENTO DA FOSFORILACcedilAtildeO DA CADEIA LEVE DA MIOSINA E PORTANTO A CONTRACcedilAtildeO FONTE GOumlGGEL e UHLIG (2005)
26
Adicionalmente os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) (BELLAN et al 1992) O
aumento da produccedilatildeo de NO induzida por PAF via ativaccedilatildeo de receptor de PAF foi
demonstrado em ceacutelulas do endoteacutelio vascular humano considerado como um efeito
cardioprotetor (KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Contudo particularmente
na microcirculaccedilatildeo o NO contra-ataca muitos dos efeitos bioloacutegicos do PAF inibindo
a vasoconstricccedilatildeo arteriolar e o aumento da permeabilidade vascular aleacutem de inibir
a adesatildeo de plaquetas e de leucoacutecitos ao endoteacutelio (BRKOVIC e SIROIS 2007
KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Mas os mecanismos pelos quais o NO
modula a permeabilidade microvascular ainda natildeo satildeo bem entendidos podendo ser
confusos e dependentes do estado das ceacutelulas endoteliais (RAMIREZ et al 2006)
A inibiccedilatildeo da NO sintase (NOS) em ceacutelulas endoteliais atenuou o aumento da
permeabilidade microvascular induzida por PAF no estudo de ZHU et al (2004) Por
outro lado estudando a participaccedilatildeo de NO e PAF em lesotildees de intestino delgado
de ratos KWASNIEWSKI et al (2008) evidenciaram que a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de
NO endoacutegeno aumentou bastante as lesotildees hemorraacutegicas e a taxa de mortalidade
demonstrando o papel proacute inflamatoacuterio do PAF e o efeito protetor do NO na
microcirculaccedilatildeo Tal relaccedilatildeo tambeacutem foi descrita por BRKOVIC e SIROIS (2007)
estudando o papel do PAF e do NO nos efeitos proacute inflamatoacuterios resultantes da
participaccedilatildeo de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e concluindo que eacute
o PAF que diretamente aumenta a permeabilidade vascular sendo o NO um cofator
A atuaccedilatildeo do PAF como mediador inflamatoacuterio eacute bastante importante na
asma onde aleacutem de provocar aumento da permeabilidade vascular tambeacutem induz
uma neutropenia transitoacuteria seguida de neutrofilia resultando no recrutamento de
neutroacutefilos para o pulmatildeo evidenciado atraveacutes de estudo citoloacutegico do lavado
broncoalveolar (LEE et al 2002 GABRIJELCIC et al 2003)
No estudo de AU et al (2001) a ativaccedilatildeo de neutroacutefilos resultou em ativaccedilatildeo
dos receptores de PAF aumento da fagocitose de neutroacutefilos e subsequumlente
liberaccedilatildeo de interleucina-8 (IL-8) causando mais quimiotaxia de neutroacutefilos
Adicionalmente demonstrou-se que haacute envolvimento de receptor 1 de leucotrieno B4
(LTB4) nas atividades de neutroacutefilos humanos mediadas por PAF (GAUDREAULT et
al 2005)
Em indiviacuteduos asmaacuteticos e com doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC)
o influxo de neutroacutefilos mediado por PAF nas vias aeacutereas foi modulado pelo aumento
27
de LTB4 provavelmente pelo estiacutemulo de PAF para a liberaccedilatildeo de LTB4 dos
macroacutefagos alveolares (SHINDO et al 1998 GABRIJELCIC et al 2003 FINNEY-
HAYWARD et al 2009)
Nas vias aeacutereas dos cavalos se demonstrou a participaccedilatildeo do PAF na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas (ORVA) levando a um
aumento do recrutamento de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo resultando em
prejuiacutezos agrave funccedilatildeo pulmonar (FAIRBAIRN et al 1996)
O PAF tendo como uma de suas origens o macroacutefago alveolar eacute capaz de
modificar o comportamento de neutroacutefilos sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da
adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a
ORVA (MARR et al 2002)
A participaccedilatildeo do PAF na asma humana e em outras espeacutecies foi evidenciada
pela sua capacidade em reproduzir mecanismos fisiopatoloacutegicos tais como a
broncoconstricccedilatildeo hiperresponsividade das vias aeacutereas aumento da
permeabilidade na microcirculaccedilatildeo pulmonar e aumento na secreccedilatildeo de muco (LOU
et al 1998 ISHII et al 2004 MUEHLMANN et al 2009)
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
Os desafios indutores de alteraccedilotildees na funcionalidade dos macroacutefagos
alveolares resultando em quimiotaxia de neutroacutefilos para as vias aeacutereas levam a um
quadro inflamatoacuterio pulmonar acompanhado de hipersecreccedilatildeo de muco Por sua vez
o muco presente nas vias aeacutereas possui uma seacuterie de funccedilotildees essenciais que
coletivamente levam a proteccedilatildeo das vias aeacutereas Juntamente com as ceacutelulas
epiteliais forma o sistema mucociliar que associado agrave tosse eacute essencial para
manter as vias aeacutereas desobstruiacutedas (ADLER 2005)
Por outro lado a produccedilatildeo excessiva de muco representa um fator importante
de morbidade e mortalidade nas doenccedilas das vias aeacutereas (THORNTON e
SHEEHAN 2004) Assim a resposta imunoloacutegica do epiteacutelio das vias aeacutereas frente
a infecccedilotildees virais e bacterianas e endotoxinas inaladas eacute caracterizada pela
liberaccedilatildeo de citocinas e pela produccedilatildeo de mucinas para prover proteccedilatildeo adicional
(HODGSON et al 2003 GERBER et al 2004 LORA et al 2005) Entretanto nos
quadros inflamatoacuterios os danos teciduais substanciais podem levar a produccedilatildeo
28
excessiva de muco e comprometimento da funccedilatildeo respiratoacuteria (LORA et al 2005
ROBINSON 2005)
O muco eacute uma mistura de aacutegua (~95) eletroacutelitos (~1) lipiacutedios (~1)
proteiacutenas (2-3) enzimas proteiacutenas seacutericas e mucinas (GERBER 2001) As
mucinas glicoproteiacutenas oligomeacutericas representam um constituinte importante do
muco sendo o gene responsaacutevel pela produccedilatildeo de mucinas o MUC5 (THORNTON
e SHEEHAN 2004)
Nas vias aeacutereas a produccedilatildeo de mucinas ocorre predominantemente pelas
ceacutelulas caliciformes do epiteacutelio e em menor parte nas glacircndulas da submucosa
(GERBER et al 2004 THORNTON e SHEEHAN 2004) A produccedilatildeo de
quantidades excessivas de muco pode representar a causa direta de obstruccedilatildeo
bronquial podendo amplificar o efeito de estreitamento luminal da broncoconstricccedilatildeo
e estar associada ao comprometimento da funccedilatildeo pulmonar tosse e capacidade
reduzida para a corrida em atletas humanos (HALLSTRAND et al 2007) e em
cavalos de corrida (CHRISTLEY et al 2001 HOLCOMBE et al 2006)
Assim a quantidade de muco secretado apresenta uma correlaccedilatildeo estreita
com a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas (GERBER et al 2004 ROBINSON et al 2003
HOLCOMBE et al 2006 ROBINSON 2005) De fato haacute uma evidente associaccedilatildeo
entre a hipersecreccedilatildeo de muco e presenccedila de quantidades aumentadas de
neutroacutefilos nas secreccedilotildees respiratoacuterias em seres humanos e em cavalos
(HODGSON et al 2003 ROBINSON et al 2003 ADLER 2005) Contagens de
neutroacutefilos no LBA menores que 30 ceacutelulasμL correspondem a pequenas
quantidades de muco nas vias aeacutereas e os acuacutemulos de secreccedilatildeo aumentam
quando as quantidades de neutroacutefilos estatildeo entre 30 e 100 ceacutelulasμL Entre 100 e
1000 ceacutelulasμL ocorre obstruccedilatildeo mensuraacutevel das vias aeacutereas Possivelmente esse
mecanismo pode estar relacionado com a secreccedilatildeo de proteiacutenas pelos neutroacutefilos
(ROBINSON et al 2003) De fato jaacute foi demonstrado que o neutroacutefilo secreta
elastase a qual estaacute associada com um aumento nas secreccedilotildees relacionadas com a
expressatildeo do gene MUC5 (SHAO e NADEL 2005) e metaplasia de ceacutelulas
caliciformes (VOYNOW et al 2004)
A expressatildeo anormal de neutroacutefilos e de moleacuteculas de adesatildeo em indiviacuteduos
com asma e doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC) foi demonstrada por
GABRIJELCIC et al (2003) Aleacutem do aumento no nuacutemero de neutroacutefilos tambeacutem
foram observados diferentes padrotildees de ativaccedilatildeo e niacuteveis aumentados de elastase
29
neutrofiacutelica e IL-8 Estes uacuteltimos bem como a expressatildeo do gene MUC5 estatildeo
associados a um aumento no estresse oxidativo pulmonar (DROST et al 2005
SHAO e NADEL 2005)
A associaccedilatildeo entre a severidade da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas e o estresse
oxidativo em cavalos com ORVA foi relatada por KIRSCHVINK et al (2008) os
quais relacionaram a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas ao aumento da glutationa oxidada
do aacutecido uacuterico e de isoprostano (8-iso-PGF2α) no LBA
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO
Estresse oxidativo eacute o termo utilizado para descrever os danos causados
quando as espeacutecies reativas do oxigecircnio (ROS) superam a capacidade de defesa
antioxidante do indiviacuteduo (WOOD et al 2003)
Entretanto tanto as ROS como as espeacutecies reativas do nitrogecircnio (RNS)
ocorrendo em concentraccedilotildees pequenas a moderadas apresentam importante papel
na fisiologia celular incluindo a defesa contra invasores e atuando em diversas vias
de sinalizaccedilatildeo celular e na induccedilatildeo da resposta mitogecircnica O estresse oxidativo
propriamente dito ocorre quando o sistema redox sofre desequiliacutebrio pela produccedilatildeo
aumentada de ROS eou RNS ou produccedilatildeo reduzida de antioxidantes (VALKO et al
2007)
Os pulmotildees encontram-se sujeitos ao estresse oxidativo pois estatildeo
diretamente expostos a quantidades muito elevadas de oxigecircnio o que torna
imperativo que este oacutergatildeo possua um arsenal para a defesa contra possiacuteveis
ataques oxidativos Portanto os pulmotildees satildeo providos de um desenvolvido sistema
de defesa endoacutegeno constituiacutedo de agentes chamados antioxidantes Os
antioxidantes ajudam os pulmotildees a se livrarem dos efeitos de uma variedade de
oxidantes provenientes do oxigecircnio (ROS) como o acircnion superoacutexido radical
hidroxila peroacutexido de hidrogecircnio e do nitrogecircnio (RNS) como o oacutexido niacutetrico (NO)
peroxinitrito e nitritos endoacutegenos e do ambiente Os principais sistemas
antioxidantes natildeo enzimaacuteticos dos pulmotildees satildeo a glutationa a vitamina C a
vitamina E o beta-caroteno e o aacutecido uacuterico enquanto os antioxidantes enzimaacuteticos
satildeo as superoacutexido dismutases a catalase e as peroxidases (RAHMAN et al 2006)
(FIGURA 4)
30
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE O2- AcircNION SUPEROacuteXIDO NO OacuteXIDO NIacuteTRICO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO ONOO- PEROXINITRITO FE2+ IacuteON FERROSO GPX GLUTATIONA PEROXIDASE FONTE RAHMAN et al (2006)
O estresse oxidativo pode resultar em muitos prejuiacutezos agraves funccedilotildees das vias
aeacutereas incluindo a contraccedilatildeo da musculatura lisa das vias aeacutereas a induccedilatildeo de
hiperresponsividade das vias aeacutereas a hipersecreccedilatildeo de muco danos ao epiteacutelio
respiratoacuterio e aumento da permeabilidade capilar (WOOD et al 2003)
A fisiopatologia da asma e da DPOC caracteriza-se por inflamaccedilatildeo crocircnica
localizada e estresse oxidativo O estresse oxidativo ocorre pelo aumento de
agentes oxidantes que satildeo inalados bem como por grandes quantidades de ROS
liberadas das ceacutelulas inflamatoacuterias Niacuteveis aumentados de ROS aumentam a
resposta inflamatoacuteria diretamente ou via formaccedilatildeo de produtos da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica levando a um aumento na severidade da doenccedila (KIRKHAM e RAHMAN
2006)
A peroxidaccedilatildeo dos lipiacutedios da membrana celular leva a geraccedilatildeo de
isoprostanos (FIGURA 5) um composto bioativo semelhante agraves prostaglandinas Os
isoprostanos satildeo produzidos independentemente das enzimas ciclooxigenases via
peroxidaccedilatildeo do aacutecido aracdocircnico catalizada por ROS apresentando potente efeito
31
constritor na musculatura lisa respiratoacuteria hiperresponsividade e exsudaccedilatildeo de
plasma nas vias aeacutereas (WOOD et al 2003)
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA ASMA IL INTERLEUCINA TH2 CEacuteLULAS T-HELPER TIPO 2 ROS ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO O2
- AcircNION SUPEROacuteXIDO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO NADPH NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO REDUZIDA NADP NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO SOD SUPEROacuteXIDO DISMUTASE EPO PEROXIDASE EOSINOFIacuteLICA MPO MIELOPEROXIDASE NF FATOR DE TRANSCRICcedilAtildeO NUCLEAR FONTE WOOD et al (2003)
O oacutexido niacutetrico (NO) sintetizado enzimaticamente pela oxidaccedilatildeo do
aminoaacutecido L-arginina para L-citrulina apresenta diversas funccedilotildees fisioloacutegicas nas
vias aeacutereas como o relaxamento da musculatura lisa a regulaccedilatildeo da responsividade
e da permeabilidade das vias aeacutereas e na defesa contra invasores Contudo em
altas concentraccedilotildees o NO apresenta diversos efeitos proacute inflamatoacuterios participando
da infiltraccedilatildeo de ceacutelulas inflamatoacuterias e apresentando efeitos citotoacutexicos sobre
32
diversas ceacutelulas tal como a ceacutelula do epiteacutelio respiratoacuterio especialmente por
interagir com o acircnion superoacutexido formando o peroxinitrito (REDINGTON 2006)
As ceacutelulas inflamatoacuterias recrutadas agraves vias aeacutereas do indiviacuteduo asmaacutetico
apresentam excepcional capacidade de produccedilatildeo de oxidantes Eosinoacutefilos
neutroacutefilos e macroacutefagos bem como ceacutelulas do epiteacutelio respiratoacuterio podem gerar
oxidantes Inicialmente ocorre a formaccedilatildeo de acircnion superoacutexido no complexo
dependente de NADPH oxidase na membrana celular no sistema xantina oxidase
citosoacutelico e na cadeia respiratoacuteria mitocondrial (FIGURA 6) (CARAMORI e PAPI
2004) A seguir a interaccedilatildeo do acircnion superoacutexido com outros oxidantes e o ataque
oxidativo ao tecido pulmonar leva agrave peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e danos ao tecido pulmonar
(MILLS e HIGGINS 1997 KIRKHAM e RAHMAN 2006)
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS FONTE CARAMORI E PAPI (2004)
O estudo do estresse oxidativo na asma se utiliza de modelos que podem
envolver os murinos (MUEHLMANN et al 2009) ou mesmo os cavalos jaacute que estes
naturalmente desenvolvem a ORVA doenccedila respiratoacuteria com diversas similaridades
com a asma humana (DEATON 2006)
33
Nos cavalos com ORVA os marcadores de estresse oxidativo estatildeo
aumentados e diretamente relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e infiltrado
inflamatoacuterio neutrofiacutelico (KIRSCHVINK et al 2008) ao aumento da produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por neutroacutefilos sanguiacuteneos apoacutes a exposiccedilatildeo agrave poeira orgacircnica
ambiental (MARR et al 1997) e ao aumento da secreccedilatildeo de muco apresentando
tambeacutem concentraccedilotildees reduzidas de aacutecido ascoacuterbico no fluido do epiteacutelio respiratoacuterio
(DEATON 2006)
O exerciacutecio fiacutesico por sua vez tambeacutem pode causar estresse oxidativo nas
vias aeacutereas em atletas humanos e em cavalos pela geraccedilatildeo de ROS e RNS (MILLS
e HIGGINS 1997 ART e LEKEUX 2005 KIRSCHVINK et al 2008)
Os cavalos de corrida apresentam a habilidade de aumentar o consumo de
oxigecircnio em 60 vezes durante o esforccedilo maacuteximo o que representa um fator de risco
ao estresse oxidativo nesses animais (ART e LEKEUX 2005)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica eacute o marcador de dano oxidativo poacutes exerciacutecio mais
estudado (DEATON e MARLIN 2003) Em atletas humanos houve aumento da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes a realizaccedilatildeo de ultramaratona (MASTALOUDIS et al
2004) mas o treinamento produziu efeitos beneacuteficos e reduccedilatildeo dos marcadores de
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes um periacuteodo de treinamento (MIYAZAKI et al 2001
BALOG et al 2006) Em cavalos o exerciacutecio submaacuteximo induziu um aumento nos
hidroperoacutexidos lipiacutedicos plasmaacuteticos dentro de 5 minutos apoacutes o teacutermino (DEATON e
MARLIN 2003)
As ROS e seus produtos como os peroacutexidos lipiacutedicos podem diretamente
danificar o tecido pulmonar e causar um incremento da pressatildeo vascular pulmonar
pela liberaccedilatildeo aumentada de mediadores inflamatoacuterios vasoconstrictores (pex
PAF) interferindo na atividade do NO como vasodilatador podendo assim contribuir
na patogecircnese da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) nos cavalos
atletas (MILLS e HIGGINS 1997)
34
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE)
A HPIE eacute caracterizada por hipertensatildeo pulmonar edema nas regiotildees de
troca gasosa ruptura dos capilares pulmonares e a presenccedila de sangue nas vias
aeacutereas (ERICKSON e POOLE 2007) sendo extremamente comum em cavalos de
corrida (PEREZ-MORENO et al 2009)
Tem-se relatado que a HPIE ocorre essencialmente em todos os cavalos
PSI de corrida em treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007) mas
tambeacutem constitui um problema em outras raccedilas de cavalos que realizam exerciacutecio
intenso como os trotadores e os quarto de milha e em cavalos realizando exerciacutecio
de menor intensidade como os cavalos de salto e traccedilatildeo (LAPOINTE et al 1994
ERICKSON e POOLE 2007 VICINO 2007)
O comprometimento ao rendimento desportivo causado pela HPIE natildeo havia
sido comprovado ateacute o estudo de HINCHCLIFF et al (2005a) quando demonstraram
que cavalos de corrida com HPIE grau 1 apresentaram 4 vezes mais possibilidades
de vencer em relaccedilatildeo a graduaccedilotildees mais elevadas de hemorragia
Cavalos PSI de corrida estatildeo sob maior risco de apresentar HPIE porque
apresentam pressatildeo capilar pulmonar mais elevada que cavalos de outras raccedilas e
atividades durante o esforccedilo maacuteximo (HACKETT et al 2003)
Adicionalmente a criaccedilatildeo seletiva de cavalos de corrida visando que sejam
cada vez mais capazes de atingir altas velocidades associado a consumo bastante
alto de oxigecircnio resultou em deacutebito cardiacuteaco substancial (WEST e MATHIEU-
COSTELLO 1994) e barreira alveacuteolo-capilar (BAC) bastante fina (WEST e
MATHIEU-COSTELLO 1999) A espessura meacutedia em micrometros do interstiacutecio da
BAC eacute 0175 plusmn 0010 em coelhos 0318 plusmn 0081 em catildees e 0390 plusmn 002 em
cavalos evidenciando que proporcionalmente a BAC dos cavalos eacute mais fina que a
de outras espeacutecies (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1999) Portanto haacute um dilema
envolvendo a evoluccedilatildeo da BAC dos cavalos Por um lado a necessidade de ser
extremamente fina para uma troca gasosa eficiente enquanto de outro a
necessidade de ser resistente o suficiente para suportar o estresse extremamente
alto na parede dos capilares pulmonares quando a pressatildeo capilar se eleva durante
o exerciacutecio (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
A pressatildeo hidrostaacutetica maacutexima nos capilares pulmonares humanos durante o
exerciacutecio supera 30 mmHg Nos cavalos PSI de corrida a pressatildeo capilar ultrapassa
35
100 mmHg aproximando-se da forccedila necessaacuteria para ocorrer a ruptura do colaacutegeno
que suporta a parede capilar na BAC (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
Quando o estresse na parede capilar se eleva demasiadamente ocorrem
alteraccedilotildees ultra-estruturais na BAC uma condiccedilatildeo conhecida como falecircncia por
estresse descrita em atletas de elite humanos e em cavalos (WEST 2000)
BIRKS et al (1997) demonstraram a falecircncia por estresse e consequumlente
ruptura dos capilares pulmonares em cavalos exercitando a altas velocidades
havendo maior risco de ocorrecircncia da HPIE quando encontraram-se sob importante
aumento da pressatildeo arterial pulmonar (FIGURA 7)
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) A ULTRAESTRUTURA CAPILAR NORMAL B RUPTURA DO ENDOTEacuteLIO CAPILAR (SETAS) COM ERITROacuteCITOS ADJACENTES (ASTERISCO) NOTA-SE TAMBEacuteM ERITROacuteCITOS NO ESPACcedilO ALVEOLAR (PONTAS DE SETAS) C ERITROacuteCITO NO INTERSTIacuteCIO (ASTERISCO) D RUPTURA DO EPITEacuteLIO ALVEOLAR (SETAS) A ALVEacuteOLO C CAPILAR BAR 2 microm FONTE BIRKS et al (1997)
36
Portanto a falecircncia por estresse dos capilares pulmonares eacute a teoria aceita
para a ocorrecircncia da HPIE sendo causada pela elevada pressatildeo transmural nos
capilares pulmonares resultado do aumento da pressatildeo arterial pulmonar somada agrave
pressatildeo pleural inspiratoacuteria negativa (WEST 2000) (FIGURA 8)
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) TTMP TENSAtildeO CIRCUNFERENCIAL OU EM ARCO CAUSADA PELA PRESSAtildeO TRANSMURAL CAPILAR TEL Eacute A TENSAtildeO LONGITUDINAL NOS COMPONENTES DA PAREDE ALVEOLAR ASSOCIADA COM A INFLACcedilAtildeO PULMONAR PARTE DESTA Eacute TRASMITIDA Agrave BAC TST Eacute A TENSAtildeO DE SUPERFIacuteCIE DA CAMADA SUPERFICIAL ALVEOLAR ESTA APARENTEMENTE EXERCE UMA FORCcedilA DE ACcedilAtildeO INTERNA PARA SUPORTAR O CAPILAR QUANDO ESTE INTUMESCE PARA DENTRO DO ESPACcedilO ALVEOLAR A ALTAS PRESSOtildeES TRANSMURAL CAPILARES PALV PRESSAtildeO ALVEOLAR PCAP PRESSAtildeO CAPILAR FONTE WEST (2000)
Diversos estudos estiveram envolvidos em avaliar a participaccedilatildeo do NO no
aumento da pressatildeo arterial pulmonar no cavalo durante o exerciacutecio e na
fisiopatologia da HPIE Inicialmente evidenciou-se que cavalos realizando exerciacutecio
intenso apresentam hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE) (CHRISTLEY
et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 DEMPSEY e WAGNER 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) o que resulta na inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO abolindo o
relaxamento vascular dependente do endoteacutelio (MILLS e HIGGINS 1997)
Portanto acreditou-se que a reduccedilatildeo da produccedilatildeo do NO durante o exerciacutecio
intenso poderia contribuir para a alta incidecircncia de HPIE nos cavalos de corrida
Contudo a administraccedilatildeo do antagonista da oacutexido niacutetrico sintase (NOS) N-nitro-L-
arginina metil ester (L-NAME) mostrou que o NO endoacutegeno resulta numa maior
37
extraccedilatildeo de O2 no repouso e no exerciacutecio submaacuteximo mas natildeo causou alteraccedilatildeo no
exerciacutecio intenso (MANOHAR e GOETZ 1998 MANOHAR et al 2006) A
administraccedilatildeo de L-NAME por KINDIG et al (2000) resultou em agravamento da
HPIE nos cinco animais estudados contudo natildeo observou-se aumento da pressatildeo
arterial pulmonar
MANOHAR e GOETZ (1999) avaliaram os efeitos da infusatildeo intravenosa de
nitroglicerina em cavalos realizando exerciacutecio e natildeo observaram alteraccedilotildees sobre a
incidecircncia ou severidade da HPIE
Adicionalmente KINDIG et al (2001) estudaram os efeitos do exerciacutecio na
pressatildeo arterial pulmonar e na HPIE em cavalos inalando NO Comparados aos
controles o grupo que inalou o NO apresentou uma pequena mas consistente
reduccedilatildeo na pressatildeo arterial pulmonar maacutexima mas com um significativo aumento da
HPIE nesses animais avaliado pelo aumento na contagem do nuacutemero de eritroacutecitos
no LBA Os autores entenderam que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete em
parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou como agravou a HPIE
Portanto em face aos achados relacionados agrave participaccedilatildeo do NO e da NOS
no cavalo em exerciacutecio maacuteximo e na HPIE satildeo necessaacuterias outras investigaccedilotildees a
respeito dos efeitos da inibiccedilatildeo da NOS e da produccedilatildeo do NO na circulaccedilatildeo
pulmonar e na HPIE (KINDIG et al 2000)
Apesar da maior atenccedilatildeo aos efeitos da HPIE e da pressatildeo arterial pulmonar
em cavalos realizando exerciacutecios intensos a HPIE tambeacutem passou a ser
demonstrada em cavalos envolvidos em atividades de menor intensidade sugerindo
que outros mecanismos podem estar envolvidos na fisiopatologia (EPP et al 2006)
VICINO (2007) demonstrou a ocorrecircncia de HPIE em cavalos de salto sendo
que cavalos que participaram de provas na altura entre 130 m ndash 150 m
apresentaram maior incidecircncia que aqueles que saltaram provas entre 100 m ndash 120
m
Neste contexto a associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar jaacute foi
demonstrada anteriormente (McKANE et al 1993 SAacuteNCHEZ et al 2005) Em
concordacircncia o estudo epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) evidenciou
38
uma significativa associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos puro
sangue inglecircs (PSI) jovens durante treinamento para corrida
O processo de hemorragia pulmonar pode culminar em irritaccedilatildeo e inflamaccedilatildeo
das vias aeacutereas o que exacerbaria a doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
(ERICKSON e POOLE 2007) WEST e MATHIEU-COSTELLO (1999) sugerem que
alteraccedilotildees na BAC ativariam vias proacute inflamatoacuterias nas vias aeacutereas com a
participaccedilatildeo de LTB4 Possivelmente a membrana basal alveolar exposta apoacutes a
ruptura ativaria macroacutefagos alveolares sendo que estes satildeo ricos em LTB4
DERKSEN et al (2009) sugeriram uma hipoacutetese para a ocorrecircncia da HPIE
(FIGURA 9) onde a ocorrecircncia das altas pressotildees vasculares pulmonares levaria a
alteraccedilotildees venulares culminando na ruptura capilar sangramento inflamaccedilatildeo e
hemossiderose agravando o quadro da HPIE
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO DERSKEN et al (2009)
Contudo mediadores bem como os mecanismos inflamatoacuterios que estatildeo
envolvidos na fisiopatologia da HPIE ainda precisam ser esclarecidos
O diagnoacutestico da HPIE pode ser feito pela evidecircncia de sangue na traqueacuteia
visiacutevel atraveacutes de exame endoscoacutepico (HINCHCLIFF et al 2005b ERICKSON e
POOLE 2007) pela contagem de eritroacutecitos no LBA (MEYER et al 1998) ou pela
39
presenccedila de hemossideroacutefagos (macroacutefagos contendo hemossiderina ou eritroacutecitos)
no AT (EPPINGER 1990 MICHELOTTO JUacuteNIOR et al 2007) eou no LBA
(DOUCET e VIEL 2002 SAacuteNCHEZ et al 2005 BIAVA et al 2006) realizado uma
hora apoacutes o exerciacutecio A presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA eacute considerada a
forma mais sensiacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993)
Em resumo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas acompanhada de
hiperresponsividade e hipersecreccedilatildeo de muco denominada doenccedila inflamatoacuteria das
vias aeacutereas (DIVA) bem como a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) satildeo causas de enormes perdas econocircmicas e de queda de rendimento
desportivo interrupccedilatildeo nos treinamentos e de encerramento de campanha em
cavalos de corrida Apesar disso a maioria dos estudos sobre as doenccedilas
inflamatoacuterias das vias aeacutereas dos cavalos satildeo direcionados para a ORVA e a
fisiopatologia da DIVA ainda estaacute pouco esclarecida bem como os mecanismos
inflamatoacuterios da HPIE ainda precisam ser mais bem estudados
Tendo-se em vista estes aspectos a hipoacutetese levantada no presente estudo
foi de que o desafio ambiental e o exerciacutecio fiacutesico estejam acompanhados de
estresse oxidativo alterando o quadro inflamatoacuterio possivelmente por alterar a
produccedilatildeo de PAF no pulmatildeo com consequumlente alteraccedilatildeo da funcionalidade celular
e que a hemorragia pulmonar pode exercer influecircncia sobre essa situaccedilatildeo As
ceacutelulas estudadas foram os macroacutefagos alveolares os quais podem apresentar um
papel central na regulaccedilatildeo deste processo
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVOS GERAIS
Verificar alteraccedilotildees em paracircmetros cliacutenicos e inflamatoacuterios pulmonares em
cavalos puro sangue inglecircs (PSI) de corrida jovem submetidos ao desafio ambiental
e ao treinamento fiacutesico
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Avaliar os seguintes paracircmetros cliacutenicos e laboratoriais
- Avaliaccedilatildeo cliacutenica
- Avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas
- Avaliaccedilatildeo citoloacutegica das vias aeacutereas atraveacutes das teacutecnicas de aspirado
traqueal (AT) e de lavado broncoalveolar (LBA)
- Avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas
e a produccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos e nitritos no LBA
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por macroacutefagos alveolares
bem como a capacidade fagocitaacuteria e de adesatildeo
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por neutroacutefilos do sangue
perifeacuterico bem como a capacidade fagocitaacuteria
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 REAGENTES E SEDATIVOS
O BN52021 (Gingkolide B) foi obtido da Biomol (Plymouth Meeting PA USA)
Fura-2 AM (cat num F-0888) PAF (β-Acetyl-γ-O-hexadecyl-L-α-
phosphatidylcholine P-4904) foram obtidos da Sigma (St Louis MO USA) A
coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacuteticoreg) foi obtida da Laborclin (Pinhais PR Brasil) e
a acepromazina da Univet (Satildeo Paulo SP Brasil) A xylazina e o butorphanol foram
obtidos do laboratoacuterio Fort Dodge (Satildeo Paulo SP Brasil) Todos os demais
reagentes foram comprados da Sigma (St Louis MO USA)
32 ANIMAIS
Foram utilizados equinos machos adultos jovens (potros) da raccedila puro sangue
inglecircs (PSI) de cinco diferentes criatoacuterios (haras) da regiatildeo metropolitana de Curitiba
estado do Paranaacute (Haras Cifra e Haras dos Girassoacuteis em Piraquara Haras
Palmerini e Haras Belmont em Satildeo Joseacute dos Pinhais e Haras Santa Rita da Serra
em Tijucas do Sul e potros de quatro diferentes cocheiras no Jockey Club do
Paranaacute (Av Viacutector Ferreira do Amaral 2291 Tarumatilde Curitiba PR)
Inicialmente os potros foram divididos em trecircs grupos O primeiro grupo foi
denominado grupo condiccedilotildees naturais (CN n=45) compreendendo os potros dos
haras vivendo soltos em piquetes dia e noite alimentando-se de gramiacuteneas e
leguminosas da pastagem mais complemento peletizado fornecido no campo A
meacutedia de idade dos animais deste grupo foi de 145 plusmn 04 meses O segundo grupo
foi denominado grupo desafio ambiental (DA n=45) constituiacutedo por potros
estabulados por 30 dias com o propoacutesito de preparaacute-los para o iniacutecio de treinamento
Estes animais eram mantidos em grupos de 15 a 20 potros sendo que permaneciam
em baias individuais com dimensotildees de 35m x 35m x 35m em meacutedia em cama de
serragem e alimentados duas vezes ao dia com aveia mais raccedilatildeo peletizada e feno
de gramiacutenea e de alfafa A meacutedia de idade dos potros do grupo DA foi de 217 plusmn 29
meses O terceiro grupo foi denominado de grupo exerciacutecio (EX n=34) onde foram
incluiacutedos potros ineacuteditos (satildeo considerados ineacuteditos animais que ainda natildeo correram
42
em hipoacutedromos oficiais) mas que estavam em treinamento para corrida haacute
aproximadamente cinco meses e mantidos nas mesmas condiccedilotildees de estabulaccedilatildeo e
alimentaccedilatildeo que os potros do grupo DA Estes animais foram acompanhados
durante o periacuteodo de treinamento sendo que a avaliaccedilatildeo cliacutenica endoscoacutepica e a
colheita de LBA ocorreu 24 horas apoacutes seu primeiro exerciacutecio intenso (15 ms ndash 16
ms) em 800m ndash 1000m de distacircncia na pista de areia do Jockey Club do Paranaacute A
meacutedia de idade dos potros do grupo EX foi de 270 plusmn 03 meses
A obtenccedilatildeo de dados para o presente trabalho de pesquisa ocorreu durante
uma sequumlecircncia de experimentos independentes durante um periacuteodo de 18 meses
Durante este periacuteodo grupos de potros foram acompanhados ateacute se encontrarem
nas condiccedilotildees estabelecidas para cada grupo quando entatildeo foram avaliados As
amostras do grupo CN foram obtidas de oito diferentes experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois durante o inverno trecircs durante a primavera e um no outono
As amostras do grupo DA foram provenientes de seis experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois no inverno e dois no outono e para o grupo EX os resultados
advieram de amostras obtidas durante o veratildeo em cinco ocasiotildees e durante a
primavera em quatro totalizando nove experimentos independentes para este grupo
Os resultados apresentados para cada uma das anaacutelises provecircm de pelo menos
trecircs experimentos independentes
Todos os animais estudados eram pertencentes a estabelecimentos com
programa de desverminaccedilatildeo bimensal bem como foram todos vacinados
regularmente contra Influenza Equina e Herpes Viacuterus Equino tipos 1 e 4 A
alimentaccedilatildeo utilizada nos estabelecimentos que cederam os potros para o estudo
era similar bem como a anaacutelise da alimentaccedilatildeo utilizada para os potros dos trecircs
grupos natildeo diferiu no que se refere a constituintes essenciais que poderiam
influenciar nas avaliaccedilotildees realizadas no presente trabalho Os criteacuterios de inclusatildeo
para os potros dos trecircs grupos foram os estabelecidos e jaacute descritos previamente
nas caracteriacutesticas de cada grupo e a exclusatildeo do estudo ocorreu quando da
histoacuteria de doenccedila recente ou diferenccedilas em manejo
As comparaccedilotildees intergrupos foram feitas entre os grupos CN e DA (diferenccedila
ambiental) e entre os grupos DA e EX (diferenccedila no regime de exerciacutecio)
Na segunda etapa do trabalho dedicada ao estudo da hemorragia pulmonar
induzida pelo exerciacutecio (HPIE) avaliou-se somente os potros do grupo EX agora
com n=37 Este grupo foi dividido em subgrupos sendo o subgrupo HPIE pos (n=23
43
constituiacutedo por potros com qualquer percentual de hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo
citoloacutegica do LBA) e subgrupo HPIE neg (n=14 constituiacutedo por potros sem
hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA) Nesta etapa as comparaccedilotildees
realizadas foram entre os subgrupos HPIE pos e HPIE neg
33 ASPECTOS EacuteTICOS
Este trabalho de pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Experimentaccedilatildeo Animal (CEEA) do setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR sob o
nuacutemero de registro 168 e pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso de Animais (CEUA) da
Pontifiacutecia Universidade Catoacutelica do Paranaacute sob o nuacutemero de registro 129 e estaacute de
acordo com o Guiding Principles in the Care and Use of Animals
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA
Preacutevio agrave colheita de material procedeu-se a avaliaccedilatildeo cliacutenica de cada potro
iniciada pela histoacuteria incluindo possiacuteveis ocorrecircncias meacutedicas relevantes agrave sauacutede do
sistema respiratoacuterio manejo alimentaccedilatildeo desverminaccedilatildeo e vacinaccedilatildeo Na histoacuteria
incluiu-se tambeacutem a informaccedilatildeo sobre a ocorrecircncia de tosse espontacircnea quando em
piquetes na baia no momento da alimentaccedilatildeo ou durante o treinamento O exame
fiacutesico incluiu a observaccedilatildeo da presenccedila de secreccedilatildeo nasal estiacutemulo da tosse
palpaccedilatildeo de linfonodos submandibulares e retrofaringeanos auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e
auscultaccedilatildeo traqueal e pulmonar (McGORUM e DIXON 2007)
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS
A avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas foi realizada previamente a
realizaccedilatildeo do LBA com o animal tranquumlilizado atraveacutes da administraccedilatildeo de
acepromazina (acepran 1 Univet) (003 mgkg IM) e apoacutes 30 minutos seguindo-
se a administraccedilatildeo de xilazina (sedazine Fort Dodge) (03-05 mgkg IV) mais
butorfanol (torbugesic Fort Dodge) (005 mgkg IV) (HOFFMAN 1999 HEWSON e
VIEL 2002) Utilizou-se um fibroscoacutepio flexiacutevel Pentax de 170 cm de comprimento e
128 mm de diacircmetro para a avaliaccedilatildeo das vias aeacutereas superiores e inferiores ateacute a
bifurcaccedilatildeo da traqueacuteia
44
A presenccedila de foliacuteculos linfoacuteides na faringe foi graduada segundo RAKER e
BOWLES (1978) adotando-se a graduaccedilatildeo de I a IV (QUADRO 1) e graus III e IV
foram considerados como faringite
A movimentaccedilatildeo das cartilagens aritenoacuteides foi graduada de I a IV segundo
RACKESTRAW et al (1991) (QUADRO 2) e graus III e IV foram considerados como
anormais
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Faringe com poucos foliacuteculos claros na parede dorsal
Grau II Presenccedila de numerosos pequenos foliacuteculos juntamente a
hiperemia cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau III Presenccedila de grandes grupos de foliacuteculos hiperecircmicos
cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau IV Presenccedila de foliacuteculos grandes edematosos e hiperecircmicos
por toda a mucosa faringeana
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA FARINGE FONTE RAKER E BOWLES (1978)
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Movimentaccedilatildeo sincrocircnica e abduccedilatildeo completa das
cartilagens aritenoacuteides
Grau II Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo com abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) conseguida com a degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
Grau III Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo e a abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) natildeo eacute conseguida na degluticcedilatildeo nem na
oclusatildeo nasal
Grau IV
(Hemiplegia
Laringeana)
Cartilagem aritenoacuteide esquerda posicionada
medialmente na glote e natildeo apresenta movimento
quando da degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE I A IV FONTE RACKESTRAW et al (1991)
45
Especial interesse foi dado agrave presenccedila de muco no lume traqueal e sua
quantificaccedilatildeo atraveacutes de graduaccedilatildeo de 0 a 5 conforme GERBER et al (2004)
(FIGURA 10)
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME ENDOSCOacutePICO FONTE GERBER et al 2004
Quando da observaccedilatildeo de muco traqueal este foi aspirado atraveacutes de tubo
de silicone introduzido pelo canal de trabalho do endoscoacutepio sendo imediatamente
transferido para uma lacircmina de microscopia e deixado para secar ao ar As lacircminas
foram coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico Laborclin Pinhais PR
Brasil) e 500 ceacutelulas foram contadas em aumento de 1000X (HODGSON e
HODGSON 2003)
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o aspirado traqueal (AT)
contendo lt10 de linfoacutecitos lt1 de eosinoacutefilos e lt20 de neutroacutefilos (ROBINSON
2003 HODGSON e HODGSON 2007)
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)
Para a realizaccedilatildeo do LBA foi utilizado um cateter flexiacutevel de silicone
especiacutefico para a obtenccedilatildeo de LBA de equinos marca Cook (V-PBAL-300 Cook Vet
Products Hamburg Alemanha) de 300 cm de comprimento e 8 mm de diacircmetro
Este foi introduzido agraves cegas via nasotraqueal preferencialmente do lado direito ateacute
se alojar em um brocircnquio quando o cuff na extremidade distal era inflado com 5-10
mL de ar Utilizou-se 300 mL de soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada (PBS) esteacuteril e
com heparina soacutedica (5 UImL de PBS) preacute-aquecidos a 37oC (HOFFMAN 1999
PICKLES et al 2002abc MORI et al 2003 RIIHIMAumlKI et al 2008b) O PBS era
infundido em aliacutequotas de 120 mL (HEWSON e VIEL 2002) aspirando-se
46
gentilmente apoacutes cada aliacutequota e dispensando-se o LBA recolhido em frascos
plaacutesticos esteacutereis mantidos em isopor com gelo Este procedimento foi repetido ateacute
que o volume de 300 mL era totalmente empregado O material recolhido foi mantido
refrigerado em isopor com gelo ateacute a chegada ao Laboratoacuterio de Metabolismo
Celular no Departamento de Fisiologia do Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR
para o processamento em menos de 3 horas apoacutes a colheita (PICKLES et al 2002c
VIEL e HEWSON 2003)
No laboratoacuterio o LBA era centrifugado a 340g (1300 rpm) por seis minutos a
40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA) e o pellet obtido foi
ressuspendido em 2 mL de PBS para a contagem do nuacutemero total de ceacutelulas
nucleadas (NTCN)
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA
A contagem do NTCN foi realizada usando-se a cacircmara de Neubauer Uma
aliacutequota da suspensatildeo de ceacutelulas foi diluiacuteda 110 em PBS em um frasco de
centrifugaccedilatildeo de 15 mL de fundo cocircnico (Eppendorf) Desta uma aliacutequota de 50 microL
foi misturada a 50 microL do corante vital Azul de Tripan para a contagem das ceacutelulas
vivas A partir do nuacutemero de ceacutelulas vivas por mililitro da suspensatildeo de ceacutelulas a
concentraccedilatildeo da suspensatildeo de ceacutelulas foi ajustada para 5 x 106 ceacutelulasmL para as
avaliaccedilotildees da atividade de macroacutefago alveolar (fagocitose produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e adesatildeo ndash ver toacutepicos 315 316
317 e 318)
Para a avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA lacircminas para microscopia
foram preparadas a partir de 10 μL da suspensatildeo de ceacutelulas distribuiacutedos de forma
circular sobre a lacircmina secadas ao ar e coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski
(Panoacutetico Laborclin Pinhais PR Brasil) (HEWSON e VIEL 2002) e 500 ceacutelulas
foram contadas em aumento de 1000X
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o LBA contendo em meacutedia
60 de macroacutefagos 35 de linfoacutecitos lt5 de neutroacutefilos lt2 de mastoacutecitos lt1
de eosinoacutefilos (ROBINSON 2003 MAZAN e HOFFMAN 2003 RICHARD et al
2009)
47
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957)
Uma porccedilatildeo correspondente a 90 mg de pellet de ceacutelulas do LBA foi
ressuspendido em um solvente extrator (metanolclorofoacutermio12 volvol) na
quantidade de 18 mL e sonicado (6 ciclos de 4 segundos) Os tubos foram
deixados em gelo por 20 minutos
Na etapa seguinte mais metanol foi adicionado (324 microL o caacutelculo eacute a
quantidade de sovente extrator x 0180 resultando na quantidade de metanol em
mililitros) para reduzir a densidade do liacutequido e possibilitar assim a decantaccedilatildeo do
material particulado insoluacutevel no meio Apoacutes o material foi centrifugado a 5000g por
10 minutos a 40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
O sobrenadante foi transferido para tubos de vidro e clorofoacutermio foi
adicionado (648 microL ou seja o dobro da quantidade de metanol utilizada
anteriormente)
Na sequumlecircncia o extrato foi lavado uma vez com 19 mL de aacutegua ultra pura O
sistema bifaacutesico formado foi submetido a uma intensa agitaccedilatildeo ateacute natildeo serem mais
distinguiacuteveis as duas fases (forma-se momentaneamente uma emulsatildeo) Nesta
etapa substacircncias com maior afinidade agrave aacutegua do que ao solvente orgacircnico satildeo
solubilizadas no meio aquoso e portanto se separam dos lipiacutedios
Apoacutes a reconstituiccedilatildeo espontacircnea do sistema bifaacutesico o sobrenadante
(aquoso) foi removido com o auxiacutelio de uma micropipeta cuidando-se para natildeo
retirar o que se encontrava abaixo
Em seguida foi adicionado o FSP (CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM NaCl 497
mM clorofoacutermio 30 metanol 490 aacutegua ultra pura 480) lentamente (para
evitar a formaccedilatildeo de emulsatildeo) e de maneira que as paredes do tubo fossem lavadas
com esta soluccedilatildeo Apoacutes a remoccedilatildeo do sobrenadante este procedimento foi repetido
mais duas vezes
A mistura de clorofoacutermio e metanol na qual estavam dissolvidos os lipiacutedios
foi evaporada em banho-maria a 370C sob corrente de nitrogecircnio O extrato lipiacutedico
seco foi armazenado a -800C em atmosfera de nitrogecircnio Para a determinaccedilatildeo da
bioatividade de PAF (toacutepico 310) esses extratos foram solubilizados em 100 microL de
DMSO sob agitaccedilatildeo intensa
48
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS
O sangue de cavalo foi colhido em bolsas de transfusatildeo (CPDA-1 JP
Induacutestria Farmacecircutica SA Satildeo Paulo Brasil) atraveacutes de punccedilatildeo venosa jugular
O sangue foi diluiacutedo 11 (vv) em PBS e 40 mL do sangue diluiacutedo foram
adicionados a tubos para centriacutefuga esteacutereis (tubos Falcon de 50 mL) sobre 8 mL de
Ficoll Paque Plus e centrifugado (400g por 40 minutos a 40C) para o isolamento das
ceacutelulas PMN por gradiente
Apoacutes a centrifugaccedilatildeo a camada superior composta por plasma soluccedilatildeo de
Ficoll e ceacutelulas mononucleares foi descartada A camada inferior composta
principalmente por PMNs e eritroacutecitos foi dividida em duas aliacutequotas iguais as quais
foram separadas em dois tubos para centriacutefuga A cada aliacutequota foi adicionada
soluccedilatildeo hemoliacutetica (NH4Cl 077 tris[hydroxymethyl]aminomethane 021 pH 74
soluccedilatildeo aquosa) para completar 50 mL e incubadas por 20 minutos a 370C em
estufa
A seguir a suspensatildeo celular livre dos eritroacutecitos foi centrifugada (400g 6
min 4oC) O sobrenadante foi descartado e o pellet de ceacutelulas (basicamente PMNs)
foi ressuspendido em 5 mL de PBS contendo glucose 5 mM A densidade de ceacutelulas
foi determinada em cacircmara de Neubauer e ajustada para 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL
A viabilidade celular foi determinada atraveacutes do corante vital Azul de Tripan e
resultou aproximadamente 95 A percentagem de neutroacutefilos na suspensatildeo de
PMNs foi superior a 90 determinada pela coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico
Laborclin Pinhais PR Brasil)
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE Ca++ EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE et al 2001)
Agrave suspensatildeo de PMNs (toacutepico 39) na densidade de 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL foi adicionado FURA-2 AM (Sigma soluccedilatildeo estoque 1 nM em DMSO)
para concentraccedilatildeo final de 1 microM A suspensatildeo foi incubada em ambiente escuro a
37oC por 45 minutos
Nesta etapa os PMNs incorporaram o FURA-2 AM um indicador fluorescente
de caacutelcio Quando o FURA-2 AM estaacute ligado ao Ca++ haacute reduccedilatildeo da eficiecircncia de
49
excitaccedilatildeo a 380 nm e aumento da eficiecircncia de excitaccedilatildeo a 340 nm observados no
comprimento de onda de emissatildeo de 510 nm Com isso eacute possiacutevel quantificar a
concentraccedilatildeo de Ca++ intracelular nas ceacutelulas carregadas com FURA-2 AM atraveacutes
da relaccedilatildeo da intensidade de emissatildeo a 510 nm entre os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo de 340 nm e de 380 nm (relaccedilatildeo 340380 nm)
Apoacutes a incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram lavadas duas vezes com soluccedilatildeo de
Ringer (NaCl 1425 mM KCl 40 mM CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM 50 mM 4-(2-
hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid glicose 50 mM pH 74 soluccedilatildeo
aquosa) para a remoccedilatildeo do FURA-2 AM que natildeo foi incorporado agraves ceacutelulas
As ceacutelulas entatildeo foram ressuspendidas em soluccedilatildeo de Ringer para uma
concentraccedilatildeo final de 225 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL Esta foi a preparaccedilatildeo utilizada
na leitura de fluorescecircncia
A suspensatildeo de ceacutelulas foi mantida em gelo ateacute a sua utilizaccedilatildeo Aliacutequotas de
2 mL eram previamente incubadas em banho-maria por 4 minutos a 37oC no escuro
(tubo envolto em papel alumiacutenio) previamente a serem transferidas para uma cubeta
para a leitura da fluorescecircncia em espectrofluoriacutemetro acoplado a um
microcomputador (RF5301PC Shimadzu Kyoto Japatildeo) controlado pelo software
Super Ion Probe (Shimadzu Kyoto Japatildeo) Durante esta incubaccedilatildeo as ceacutelulas que
seriam utilizadas como controle negativo para PAF foram tratadas com antagonista
de receptor de PAF BN52021 (Biomol soluccedilatildeo 10 mM em DMSO)
Foi utilizada excitaccedilatildeo dual com comprimentos de onda 340 nm e 380 nm
(janela de leitura de 2 segundos) com emissatildeo registrada a 510 nm A temperatura
foi mantida em 37oC pelo sistema termostatisado do aparelho A leitura da
fluorescecircncia consistiu primeiramente da obtenccedilatildeo de uma linha de base nos
primeiros 50 segundos Apoacutes esta leitura inicial foram adicionados 10 microL do extrato
lipiacutedico (toacutepico 38) agrave suspensatildeo de ceacutelulas seguindo-se a agitaccedilatildeo (por 3
segundos) com uma barra magneacutetica presente dentro da cubeta A leitura foi feita
entatildeo por mais 100 segundos
Para cada amostra foram realizados os procedimentos descritos na presenccedila
e na ausecircncia de BN52021 A resposta maacutexima obtida pelo tratamento da
suspensatildeo de PMNs com extrato lipiacutedico na presenccedila de BN52021 foi subtraiacuteda da
resposta maacutexima obtida na ausecircncia deste antagonista O resultado desta subtraccedilatildeo
foi utilizado como indicador semiquantitativo da bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico e os resultados foram expressos como relaccedilatildeo 340380 nm
50
Antes de analisar as amostras de extrato lipiacutedico para a bioatividade de PAF
a cada experimento a suspensatildeo de PMNs tratada com FURA-2 AM foi testada com
PAF (1-0-palmitil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina soluccedilatildeo estoque de 3 mM em
DMSO da Sigma) nas concentraccedilotildees de 1 10 e 100 nM e com 100 nM na presenccedila
de 150 microM de BN52021 (concentraccedilatildeo suficiente para antagonizar 102 nM de PAF)
A resposta dos PMNs de equinos aos padrotildees de PAF eacute mostrada na FIGURA 11
sendo representativa dos dados obtidos em todos os experimentos
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO REGISTRADA A 510 nm () SUSPENSAtildeO DE PMN () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 1 nM (diams) SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 10 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 100 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + BN52021 150 microM + PAF 100 nM A EMISSAtildeO BASAL DAS CEacuteLULAS PMN FOI REGISTRADA POR 50 SEGUNDOS PREVIAMENTE Agrave ADICcedilAtildeO DE PAF
Os PMNs do sangue de equinos foram utilizados no presente estudo como
uma ferramenta para a avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF (pelo influxo de Ca++ nos
PMNs induzido por PAF) Para a determinaccedilatildeo da viabilidade desta ferramenta
estudou-se a resposta dos PMNs do sangue de equino a diferentes concentraccedilotildees
de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na ausecircncia do antagonista de
PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose de neutroacutefilos e a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio por neutroacutefilos pelas teacutecnicas descritas
51
abaixo (ver toacutepicos 315 ndash fagocitose de macroacutefago alveolar 316 ndash produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar e 317 ndash produccedilatildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio por macroacutefago alveolar) sendo que para cada ensaio foram realizadas
quatro repeticcedilotildees Igualmente estudou-se a resposta do macroacutefago alveolar a
diferentes concentraccedilotildees de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na
ausecircncia do antagonista de PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose e a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem realizando-se quatro
repeticcedilotildees para cada anaacutelise
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)
Em microplaca de 96 poccedilos 250microL de reagente de Bradford (100mg de
Coomassie Blue 50 mL de etanol 95 + 100 mL de aacutecido fosfoacuterico 85 completar
com aacutegua ultra pura para 1000 mL) foi adicionado a 10 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA) Nesta etapa o
corante Comassie eacute complexado por proteiacutenas presentes na amostra o que muda a
sua cor
Apoacutes 5 minutos em temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada a
595 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-Rad
Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) A concentraccedilatildeo de proteiacutenas foi determinada
interpolando-se os valores de absorbacircncia numa curva padratildeo resultante de
concentraccedilotildees conhecidas de albumina seacuterica bovina (Sigma) Os resultados foram
expressos como miligramas de proteiacutenas por mililitro de LBA
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR e MARLETTA 1985)
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA foi utilizada como indicador da produccedilatildeo de
oacutexido niacutetrico na regiatildeo broncoalveolar
Em micro placa de 96 poccedilos adicionou-se 100 microL de reagente de Griess
(mistura de cloreto de naftiletilenodiamina a 005 e por sulfanilamida a 05 em
meio aacutecido proporcionado por H3PO4 a 25) a 100 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA)
52
A sulfanilamida (um derivado de anilina) reage com o aacutecido nitroso e apoacutes
rearranjos intramoleculares forma o iacuteon diazocircnio Apoacutes o iacuteon diazocircnio reage com a
naftiletilenodiamina (um derivado de naftilamina) para formar pigmento roacuteseo
Depois de 5 minutos na temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada
a 550 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-
Rad Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) Os resultados foram expressos como
absorbacircncia a 550 nm
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO
LBA (NOUROOZ-ZADEH et al 1994)
Utilizou-se uma aliacutequota de suspensatildeo de ceacutelulas de LBA na densidade de
15 x 106 ceacutelulasmL de LBA Esta foi ultrasonicada (6 ciclos de 4 segundos) em 1mL
de metanol sendo centrifugada em seguida a 5000g por 5 minutos a 40C
(Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
Uma aliacutequota de 50 microL de sobrenadante foi armazenada para posterior
mensuraccedilatildeo da concentraccedilatildeo total de proteiacutenas
Para cada amostra aliacutequotas de 90 microL foram depositadas em seis frascos
para centriacutefuga (de 15 mL Eppendorf) foi agitada no voacutertex e incubada por 30
minutos a temperatura ambiente A trecircs desses tubos foram adicionados 10 microL de
soluccedilatildeo metanoacutelica de trifenilfosfina (TPP Sigma) 10 mM para ocorrer a reduccedilatildeo
seletiva de hidroperoacutexidos (os grupamentos hidroperoacutexido especificamente os
presentes em lipiacutedios satildeo convertidos a grupamentos hidroxila pela trifenilfosfina)
As amostras contidas nos trecircs tubos restantes receberam apenas 10 microL de metanol
Todos os tubos foram agitados vigorosamente e entatildeo incubados em temperatura
ambiente por 30 minutos
Apoacutes adicionou-se a todos os tubos 900 microL de reagente de FOX2 Este
reagente deve ser preparado no momento do uso consistindo de xilenol laranja 100
microM hidroxitolueno butilado (BHT) 400 mM aacutecido sulfuacuterico 25 mM e sulfato ferroso
de amocircnio 250 microM em metanol 90 (vv em aacutegua) Apoacutes agitaccedilatildeo o meio
reacional foi incubado por mais 30 minutos a temperatura ambiente
Nesta etapa os caacutetions ferrosos (Fe2+) do reativo de FOX2 satildeo oxidados por
hidroperoacutexidos presentes na amostra (tanto pelos hidroperoacutexidos lipiacutedicos quanto
por outros tipos de hidroperoacutexidos presentes na amostra) Como todos os
53
hidroperoacutexidos lipiacutedicos das amostras tratadas com TPP foram reduzidos a
produccedilatildeo de Fe3+ seraacute menor nestas do que nas amostras natildeo tratadas com TPP
O Fe3+ formado eacute entatildeo quelado pelo xilenol laranja o que faz a cor deste
indicador passar de laranja a azul-puacuterpura (passa a absorver luz em 560 nm)
Passado o tempo de incubaccedilatildeo a absorbacircncia foi mensurada a 560 nm
utilizando-se um espectrofotocircmetro (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil
Satildeo Paulo)
Subtraiu-se entatildeo o valor da absorbacircncia das amostras tratadas com TPP
(sem hidroperoacutexidos lipiacutedicos) do valor da absorbacircncia das amostras sem TPP O
valor obtido nessa subtraccedilatildeo (referente apenas agrave quantidade de ferro oxidado por
hidroperoacutexidos lipiacutedicos) foi utilizado na foacutermula da curva padratildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio obtida com soluccedilotildees padratildeo de diferentes concentraccedilotildees (1000 500
250 125 62 31 e 16 microM) submetidas aos mesmos procedimentos descritos
acima para a dosagem de hidroperoacutexidos (com exceccedilatildeo ao tratamento com TPP) O
resultado obtido foi referente agrave concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos
Dividiu-se o valor da concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos pela
concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais do extrato metanoacutelico Os resultados foram
expressos como nmolesmg de proteiacutenas
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984)
Utilizou-se 300 microL de uma suspensatildeo de ceacutelulas de LBA em PBS na
densidade de 5 x 106 ceacutelulasmL que foram centrifugados (10600g por 20min a
4oC) para remoccedilatildeo de partiacuteculas
Apoacutes foi colocada em banho com gelo Uma aliacutequota de 10 microL desse extrato
de ceacutelulas foi adicionada a 990 microL de meio reativo (soluccedilatildeo aquosa de H2O2 20 mM
tris[hidroximetil] aminometano 005M e EDTA 025 mM pH 74)
Imediatamente utilizando-se um espectrofotocircmetro acoplado a um
microcomputador (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil Satildeo Paulo)
monitorou-se a absorbacircncia a 220 nm por 90 segundos a 370C com intervalos de 2
segundos entre leituras consecutivas
A degradaccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio pela catalase causa uma diminuiccedilatildeo
gradual na absorbacircncia do meio reativo a 220 nm a qual indica a atividade da
catalase no extrato de ceacutelulas Os valores de atividade da catalase foram corrigidos
54
pela concentraccedilatildeo de proteiacutenas do extrato de ceacutelulas (realizado conforme descrito
no toacutepico 311) e foram expressos como micromoles de H2O2minmg proteiacutenas
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA et al 1998)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL (= 5 x 105
ceacutelulaspoccedilo) e os macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A
suspensatildeo de ceacutelulas na densidade descrita foi obtida durante o processamento do
LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS e foram adicionados
20microL de zymosan corado com vermelho neutro (67 mgmL) mais 100 microL de PBS
sendo deixados a temperatura ambiente por 30 minutos
Em seguida depois de descartado o sobrenadante as ceacutelulas foram fixadas
com soluccedilatildeo de Baker (4 formaldeiacutedo 2 cloreto de soacutedio 1 acetato de caacutelcio
soluccedilatildeo aquosa) por 30 minutos
Apoacutes os poccedilos foram lavados com PBS para que o zymosan corado com
vermelho neutro natildeo fagocitado por macroacutefagos alveolares fosse retirado
Em seguida o corante vermelho neutro foi solubilizado em cada poccedilo com
200microL de soluccedilatildeo aacutecido-aacutelcool (aacutecido aceacutetico 1 etanol 50 soluccedilatildeo aquosa) e
deixado por 30 minutos
Apoacutes este periacuteodo a absorbacircncia foi mensurada a 550 nm Os resultados
foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 -
Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA et al 1998)
Estimou-se a produccedilatildeo de acircnions pela da formaccedilatildeo de formazan produto da
reduccedilatildeo do NBT (nitroblue tetrazolium) pelo acircnion superoacutexido Avaliou-se a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA
(phorbol myristate acetate) O PMA estimula o complexo NADPH oxidase na
membrana dos fagoacutecitos a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
55
mimetizando o resultado da fagocitose de um microorganismo (DEKKER et al
2000)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para a retirada das
ceacutelulas natildeo aderentes Em seguida adicionou-se a cada poccedilo 100 microL de PBS com
NBT 02 ou com NBT 02 mais PMA 11microM sempre em triplicatas para cada
potro
Apoacutes a incubaccedilatildeo por 1 hora a 370C e em ambiente escuro (a placa deve
estar envolta em papel alumiacutenio) a placa foi centrifugada (800g por 5 minutos a
40C) Em seguida o sobrenadante foi descartado e 100 microL de PBS foram
adicionados a cada poccedilo e a placa foi novamente centrifugada
Apoacutes o sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram fixadas com metanol
por 10 minutos Em seguida a placa passou por nova centrifugaccedilatildeo o sobrenadante
foi descartado e a placa foi deixada secar ao ar em estufa
Em seguida a placa foi lavada duas vezes com metanol 50 e o formazan
(produto da reaccedilatildeo entre o NBT e o acircnion superoacutexido) foi solubilizado atraveacutes da
incubaccedilatildeo por 30 minutos com 120 microL soluccedilatildeo aquosa de hidroacutexido de potaacutessio 2M
e 140 microL de dimetilsulfoacutexido por poccedilo
A absorbacircncia foi lida a 595 nm e os resultados foram corrigidos pela adesatildeo
de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago
Alveolar)
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK e MIZEL 1981)
Mensurou-se a produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) por macroacutefago
alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA atraveacutes da oxidaccedilatildeo do vermelho
fenol pela peroxidase onde esta enzima utiliza nesta reaccedilatildeo o H2O2 O composto
oxidado absorve luz em pH baacutesico com maacutexima intensidade em 550 nm
56
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS observando-se a retirada
de grumos presentes nos poccedilos Em seguida 100 microL de soluccedilatildeo de vermelho fenol
(PRS phenol red solution 140 mM NaCl 10 mM fosfato de potaacutessio 55 mM
dextrose 056 mM vermelho fenol 19 UmL de HRPO horse radish peroxidase pH
70 soluccedilatildeo aquosa) ou soluccedilatildeo de vermelho fenol + PMA 110nM foram adicionados
a cada poccedilo em triplicatas e deixados incubar por 1 hora a 370C no escuro
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo adicionou-se 10 microL de NaOH 1N para
interromper a reaccedilatildeo alcalinizar o meio e permitir a absorbacircncia da soluccedilatildeo que foi
lida a 595 nm apoacutes 30 minutos
Os resultados foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada
potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN e GORDON 1987)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para se selecionar as
ceacutelulas aderentes que a seguir foram fixadas com metanol 50 por 10 minutos
Apoacutes este periacuteodo o sobrenadante foi descartado e 100 microL de corante de
Giemsa a 02 foram adicionados a cada poccedilo e deixados por 40 minutos em
temperatura ambiente
Os poccedilos foram novamente lavados com PBS por duas vezes observando-se
a retirada de grumos nos poccedilos e 200 microL de metanol 50 foram adicionados
Apoacutes 30 minutos a absorbacircncia da suspensatildeo foi lida a 550 nm
A adesatildeo resultou menor no grupo DA (n=17) em comparaccedilatildeo ao grupo CN
(n=36) (P=0010) sendo que o grupo EX (n=26) apresentou adesatildeo maior que o
grupo DA (P=0001) (FIGURA 12) indicando diferenccedilas na capacidade de adesatildeo
em placa acriacutelica possivelmente devido a diferenccedilas no estado funcional das ceacutelulas
57
de cada grupo Por esta razatildeo utilizou-se o ensaio de adesatildeo de macroacutefago
alveolar realizado concomitantemente aos ensaios de funccedilatildeo de macroacutefago
(fagocitose e produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) a cada
experimento realizado durante o estudo A correccedilatildeo dos valores obtidos de
macroacutefago em funccedilatildeo da adesatildeo foi feito atraveacutes da divisatildeo da meacutedia final obtida
para o ensaio de funccedilatildeo de macroacutefago dividido pela meacutedia obtida no ensaio de
adesatildeo para cada potro avaliado e a cada experimento realizado
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 (ROSEN e GORDON 1987) aP=0010 vs CN e bP=0001 vs DA
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
A normalidade na distribuiccedilatildeo dos dados foi avaliada pelo teste de D‟Agostino
e Pearson Valores considerados outliers pelo teste de Grubb foram excluiacutedos das
anaacutelises Para os dados que apresentaram distribuiccedilatildeo normal dos valores
(distribuiccedilatildeo Gaussiana) (contagem percentual de linfoacutecitos concentraccedilatildeo total de
proteiacutenas do LBA bioatividade de PAF catalase hidroperoacutexidos nitritos fagocitose
de macroacutefago alveolar produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio
por macroacutefago alveolar) foi utilizado o teste t natildeo pareado Os dados com
distribuiccedilatildeo natildeo Gaussiana dos valores (contagens percentuais de neutroacutefilos de
58
eosinoacutefilos e de macroacutefagos multinucleados contagem do NTCN do LBA e adesatildeo
de macroacutefago alveolar) foram analisados pelo teste de Mann-Whitney A
comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos de funccedilatildeo de macroacutefago alveolar
estimulado e natildeo estimulado por PMA foi feita por teste t de Student natildeo pareado
Os achados cliacutenicos e endoscoacutepicos foram analisados por meio de teste de Mann-
Whitney A correlaccedilatildeo entre o percentual de um mesmo tipo celular no aspirado
traqueal e no lavado broncoalveolar foi analisada atraveacutes do teste de Spearman
Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas utilizando-se o programa GraphPad
Prism versatildeo 500 para Windows (GraphPad Software San Diego CA EUA) e os
valores apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia (SEM) Valores de
Plt005 foram considerados como significativos
4 RESULTADOS
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica
Nenhum dos potros dos grupos CN e DA apresentou tosse segundo o
histoacuterico obtido Contudo oito potros (235) do grupo EX apresentaram tosse
espontacircnea na cocheira ou durante o treinamento o que resultou em diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0002) (TABELA 1)
A presenccedila de corrimento nasal seroso (coriza) observada nos trecircs grupos
estudados estaacute demonstrada na TABELA 1 Natildeo houve diferenccedila significativa entre
os grupos apesar de o percentual de potros com coriza no grupo DA ter reduzido
em relaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
Os linfonodos submandibulares eou retrofaringeanos estiveram aumentados
em 382 222 e 382 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
natildeo havendo diferenccedila entre os grupos (TABELA 1)
A auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e traqueal resultou normal em todos os potros
avaliados dos trecircs grupos estudados Contudo sons pulmonares crepitantes foram
audiacuteveis em 28 156 e 115 dos potros avaliados nos grupos CN DA e EX
respectivamente havendo um aumento do percentual de crepitaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo DA em ralaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DE CORRIDA
Grupos Tosse
Espontacircnea
Corrimento
Nasal
Linfonodos
Auscultaccedilatildeo
Pulmonar
CN 034
(0)
1534
(441)
1334
(382)
136
(28)
DA 045
(0)
1145
(244)
1045
(222)
745
(156)
EX 834
(235)a
1534
(441)
1334
(382)
326
(115)
aP=0002 vs DA
60
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas
No iniacutecio da avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas primeiramente
considerando os foliacuteculos linfoacuteides faringeanos ou hiperplasia folicular linfoacuteide (HFL)
a distribuiccedilatildeo das diferentes graduaccedilotildees pode ser vista na TABELA 2
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGEANOS OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS DE I A IV SEGUNDO RAKER E BOLES (1978)
Grupos HFL I HFL II HFL III HFL IV
CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)
DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)
EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)
Considerando as graduaccedilotildees de HFL III e IV como faringite esta
anormalidade foi observada em 546 286 e 539 dos potros dos grupos CN
DA e EX respectivamente Houve uma significativa reduccedilatildeo no percentual meacutedio de
observaccedilotildees de faringite para o grupo DA em comparaccedilatildeo ao grupo CN (P=0024)
enquanto no grupo EX o percentual de faringites foi significativamente maior em
relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0039)
Com relaccedilatildeo ao aspecto morfoloacutegico da epiglote um potro do grupo DA e um
potro do grupo EX evidenciaram epiglote com aspecto fraacutegil sendo que os demais
potros foram normais
Com relaccedilatildeo agrave avaliaccedilatildeo funcional da laringe todos os potros foram normais
apresentando graduaccedilotildees I ou II (TABELA 3)
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE ACORDO COM RAKESTRAW et al (1991)
Grupos NLP I NLP II NLP III NLP IV
CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)
DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)
EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)
61
A quantidade de secreccedilatildeo observada no lume traqueal estaacute demonstrada na
TABELA 4
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 SEGUNDO GERBER et al (2004)
Grupos 0 1 2 3 4 5
CN 233
(61)
933
(273)
933
(273)
1133
(332)
233
(61)
033
(0)
DA 742
(167)
1242
(286)
1242
(286)
742
(167)
342
(70)
142
(24)
EX 327
(111)
727
(259)
727
(259)
627
(223)
427
(148)
027
(0)
Quantidade de secreccedilatildeo traqueal acima de grau 2 considerada passiacutevel de
prejuiacutezo agrave troca gasosa e ao rendimento desportivo foi observada em 666 547
e 630 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT)
Os achados de anaacutelise citoloacutegica diferencial para os principais tipos celulares
do AT para os trecircs grupos de potros estudados estatildeo demonstrados na TABELA 5
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN (n=20) DA (n=19) E EX (n=15) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
Grupos Mac Lin Neut Eos Mast Calic Multi Epit Sid
CN 429plusmn63 75
plusmn19
76
plusmn29
12
plusmn07
002
plusmn02
05
plusmn02
02
plusmn01
201
plusmn56
0
DA 591
plusmn41
141
plusmn24
85
plusmn23
11
plusmn05
0 01
plusmn01
11
plusmn02a
161
plusmn48
0
EX 593
plusmn42
134
plusmn23
171
plusmn49
09
plusmn03
0 05
plusmn03
08
plusmn03
71
plusmn32
09
plusmn04
Mac macroacutefago alveolar Lin linfoacutecitos Neut neutroacutefilos Eos eosinoacutefilos Mast mastoacutecitos Calic ceacutelulas caliciformes Multi macroacutefagos multinucleados Epit ceacutelulas epiteliais Sid hemossideroacutefagos aPlt0001 vs CN
62
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA)
As quantidades de LBA recuperado estiveram entre 54 e 59 do volume
infundido para os grupos CN (n=16) DA (n=23) e EX (n=16)
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
A contagem do NTCN e a contagem diferencial de ceacutelulas do LBA estatildeo
demonstradas na TABELA 6
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN (n=45) DA (n=40) E EX (n=34) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
CTCN
(ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Macroacutef
Multi
Hemosid
CN 395
plusmn 38
673
plusmn 17
294
plusmn 15
23
plusmn 04
05
plusmn 03
005
plusmn 004
04
plusmn 01
0
DA 343
plusmn 24
698
plusmn 14
281
plusmn 13
09
plusmn 02
12
plusmn 01
002
plusmn 002
11
plusmn 01d
0
EX 456
plusmn 28a
676
plusmn 18
229
plusmn 15
54
plusmn 11b
15
plusmn 07c
02
plusmn 01
13
plusmn 02
22
plusmn 06
CTCN = contagem total de ceacutelulas nucleadas Macroacutef = macroacutefagos Linfoacutec = linfoacutecitos Neutroacutef = neutroacutefilos Eosino = eosinoacutefilos Masto = mastoacutecitos Macroacutef Multi = macroacutefagos multinucleados Hemosid = hemossideroacutefagos aPlt001 vs DA bPlt0001 vs DA cPlt005 vs DA dPlt0001 vs CN
Hemossideroacutefagos foram observados somente no LBA dos potros do grupo
EX mais especificamente em 23 (622) deles representando 22 do total de
ceacutelulas A quantidade observada de hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 da
contagem citoloacutegica diferencial do LBA
A correlaccedilatildeo entre as contagens percentuais de um mesmo tipo celular no AT
e no LBA foi analisada para os potros do grupo CN (n=11) DA (n=18) e EX (n=12)
que tiveram material colhido para as duas teacutecnicas citoloacutegicas natildeo tendo sido
63
encontrada correlaccedilatildeo entre ambas as teacutecnicas de avaliaccedilatildeo citoloacutegica para
nenhuma das ceacutelulas
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF
A resposta dos neutroacutefilos do sangue de equino frente ao PMA e frente ao
PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na ausecircncia e na presenccedila
do antagonista de PAF BN52021 estaacute demonstrado nas FIGURAS 13 a 15
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF aP=0028 vs controle bPlt0001 vs sem BN52021 cP=0028 vs PMA
64
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0007) 10nM (aP=0003) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA e PAF 1 e 10nM
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF EM TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA ePlt0001 vs PAF 1nM e fPlt0001 vs PAF 1nM e 10nM
65
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF
Tambeacutem se estudou a resposta dos macroacutefagos alveolares de equino frente
ao PMA e frente ao PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 demonstrado nas
FIGURAs 16 a 18
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0003) 10nM (aPlt0001) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0010 vs PMA dPlt0001 vs PAF 01nM e PAF 1nM
66
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0037) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA e PAF 01nM dPlt0001 vs PAF 1nM
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 01nM e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA dPlt001 vs PAF 1nM e 10nM
67
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos
foi mensurada pelo influxo de Ca++ em ceacutelulas PMN de equinos (FIGURA 19)
Registrou-se uma baixa relaccedilatildeo 340380 nm para os grupos CN (0005 plusmn 0002
relaccedilatildeo 340380 nm) e DA (0006 plusmn 0002 relaccedilatildeo 340380 nm) representando um
baixo niacutevel de bioatividade de PAF no LBA dos potros avaliados nestes grupos
Contudo a bioatividade de PAF do grupo EX (0068 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm) foi
significativamente maior em comparaccedilatildeo ao grupo DA (P=0017) Um graacutefico
representativo da bioatividade de PAF em uma das amostras do grupo EX na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 pode ser visto na FIGURA
20
CN DA EX000
002
004
006
008
010 a
Re
laccedil
atildeo
34
03
80
nm
Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedicodas Ceacutelulas do LBA
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE AO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0017 vs DA
68
0 50 100
150
200
0
1
2
3
4
Tempo (segundos)
Bioatividade de PAFR
ela
ccedilatildeo
3403
80n
m
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm A AMOSTRA Eacute ADICIONADA Agrave SUSPENSAtildeO DE CEacuteLULAS PMN APOacuteS 50 SEGUNDOS DE LEITURA BASAL (SETA)
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi maior no grupo DA em relaccedilatildeo
ao grupo CN (014 plusmn 003 vs 003 plusmn 001 mg de proteiacutenasmL de LBA) (P=0001) O
grupo EX apresentou concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA (036 plusmn 006 mg de
proteiacutenasmL de LBA) significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001)
(FIGURA 21)
69
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0001 vs CN bPlt0001 vs DA
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos foi maior no LBA do grupo DA (019 plusmn 001
absorbacircncia 550 nm) em relaccedilatildeo ao grupo CN (014 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm)
(P=0011) O grupo EX apresentou uma reduccedilatildeo significativa na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA (008 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm) significativamente menor em
comparaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001) (FIGURA 22)
70
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0011 vs CN bPlt0001 vs DA
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (1047 plusmn 241 vs 66
plusmn 35 nmolesmg de proteiacutenas) (Plt0001) No grupo EX a concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos nas ceacutelulas do LBA apresentou reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo
DA (352 plusmn 84 vs 1047 plusmn 241 nmolesmg de proteiacutenas) (P=0007) (FIGURA 23)
71
Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos no LBA
CN DA EX0
50
100
150a
b
nm
ole
s
mg
de
pro
teiacuten
as
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX (n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO APRESENTADOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNA DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aPlt0001 vs CN bP=0007 vs DA
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA
No grupo EX a atividade da catalase nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol
H2O2minmg de proteiacutenas) (P=0002) natildeo havendo diferenccedila entre os grupos CN e
DA (FIGURA 24)
72
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO microMOL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOMINUTOMILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0002 vs DA
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
A fagocitose de macroacutefago alveolar foi significativamente maior no grupo DA
em comparaccedilatildeo ao grupo CN (223 plusmn 043 vs 072 plusmn 018 absorbacircncia 550
nmadesatildeo) (P=0002) Observou-se uma diminuiccedilatildeo na fagocitose no grupo EX em
relaccedilatildeo ao grupo DA (104 plusmn 027 vs 223 plusmn 043 absorbacircncia 550 nmadesatildeo)
(P=0006) (FIGURA 25)
73
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A FAGOCITOSE PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (FAGOCITOSEADESAtildeO) aP=0002 vs CN e bP=0006 vs DA
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar
A utilizaccedilatildeo de PMA aumentou significativamente a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido pelos macroacutefagos alveolares dos grupos DA (219 plusmn 053 vs 392 plusmn 062
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0049) e EX (060 plusmn 011 vs 090 plusmn 014
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0031) A produccedilatildeo basal de acircnion superoacutexido foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (219 plusmn 053 vs 025
plusmn 007 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo DA (060 plusmn 011 vs 219 plusmn 053 absorbacircncia 595
nmadesatildeo) (P=0001) A produccedilatildeo de acircnion superoacutexido estimulada por PMA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (392 plusmn 062 vs 046
plusmn 016 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
74
diminuiccedilatildeo na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido em comparaccedilatildeo ao grupo DA (090 plusmn
014 vs 392 plusmn 062 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) (FIGURA 26)
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0049 vs DA bP=0031 vs EX cPlt0001 vs CN dP=0001 vs DA ePlt0001 vs CNe fPlt0001 vs DAe
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
O PMA aumentou a produccedilatildeo de H2O2 pelos macroacutefagos alveolares nos
grupos CN (041 plusmn 008 vs 099 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0004) DA
(035 plusmn 005 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0002) e EX (010 plusmn
001 vs 034 plusmn 008 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) A produccedilatildeo basal de
H2O2 para o grupo EX foi significativamente menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (010 plusmn
001 vs 035 plusmn 005 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) Aleacutem disso a produccedilatildeo
75
de H2O2 estimulada por PMA diminuiu no grupo EX tendo sido significativamente
menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (034 plusmn 008 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia
595nmadesatildeo) (P=0006) (FIGURA 27)
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0004 vs CN bP=0002 vs DA cPlt0001 vs EX dPlt0001 vs DA eP=0006 vs DAe
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
Hemossideroacutefagos foram observados no LBA de 23 potros (622) sendo
que estes foram considerados no subgrupo HPIE pos A quantidade observada de
76
hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 A ausecircncia de hemossideroacutefagos foi
evidenciada em 14 potros (378) sendo que estes foram considerados para o
subgrupo HPIE neg
Dentre os potros avaliados 15 (405) deles (10 potros do subgrupo HPIE
pos e 5 potros do subgrupo HPIE neg) apresentaram mais de 5 de neutroacutefilos eou
mais de 1 de eosinoacutefilos na contagem diferencial de ceacutelulas indicando um perfil
citoloacutegico de LBA compatiacutevel com inflamaccedilatildeo pulmonar
Os valores do NTCN bem como da contagem diferencial de ceacutelulas para o
grupo EX e para os subgrupos estaacute demonstrado na TABELA 7
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX (n=37) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=23) E HPIE NEG (n=14)
CTCN (ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Siderof
Grupo EX
456 plusmn 28
676 plusmn 18
229 plusmn 15
47 plusmn 10
13 plusmn 06
02 plusmn 01
22 plusmn 35
HPIE pos
571
plusmn 78a
645
plusmn 22b
240 plusmn 20
56 plusmn 12
09 plusmn 07
02 plusmn 02
34 plusmn 37
HPIE neg
348 plusmn 38
725 plusmn 30
207 plusmn 25
35 plusmn 18
19 plusmn 11
03 plusmn 01
00
CTCN contagem total de ceacutelulas nucleadas Macrof macoacutefagos Linfoc linfoacutecitos Neutrof
neutroacutefilos Eosinof eosinoacutefilos Mastoc mastoacutecitos Siderof hemossideroacutefagos aP=0005
vs HPIE neg bP=0020 vs HPIE neg
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg
(018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm P=0042) (FIGURA 28)
77
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) e HPIE NEG (n=5) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO RELACcedilAtildeO 340380nm aP=0042 vs HPIE neg
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi significativamente maior no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (039 plusmn 008 vs 019 plusmn
004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) (FIGURA 29)
78
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=13) E HPIE NEG (n=12) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS POR MILILITRO DE LBA aP=0031 vs HPIE neg
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos resultou
significativamente reduzida em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (008 plusmn 003 vs
012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) (FIGURA 30)
79
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) E HPIE NEG (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 550 nm aP=0049 vs HPIE neg
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA dos potros do
subgrupo HPIE pos resultou significativamente maior que no subgrupo HPIE neg
(367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) (FIGURA 31)
80
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) E HPIE NEG (n=8) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS aP=0009 vs HPIE neg
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
Natildeo houve diferenccedila na fagocitose de macroacutefago alveolar entre os grupos
estudados
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-)
A produccedilatildeo basal de O2- por macroacutefagos alveolares resultou similar entre os
grupos estudados A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0047) mas natildeo no subgrupo HPIE pos
(FIGURA 32)
A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA foi significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (081 plusmn 011 vs 124 plusmn
015 absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0042) (FIGURA 32)
81
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) E HPIE NEG (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0047 vs HPIE neg bP=0042 vs HPIE neg e
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
A produccedilatildeo basal de H2O2 por macroacutefago alveolar foi similar entre os grupos
avaliados no presente estudo A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0002) mas natildeo no subgrupo HPIE
neg (FIGURA 33)
A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA resultou significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (025 plusmn 003 vs 067 plusmn 014
absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0001)
82
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) E HPIE NEG (n=6) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2 ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0002 vs HPIE neg bP=001 vs HPIE neg e
5 DISCUSSAtildeO
O estudo da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas de cavalos de corrida adultos jovens
em trecircs diferentes situaccedilotildees em seu ambiente natural foi possiacutevel devido agrave
utilizaccedilatildeo de um grande nuacutemero de animais Assim permitiu-se detectar diferenccedilas
entre os grupos mesmo havendo variaccedilotildees ambientais tais como estaccedilotildees do ano
condiccedilotildees climaacuteticas e diferenccedilas sutis em manejo Como os potros dos trecircs grupos
encontravam-se na mesma faixa etaacuteria de risco para as doenccedilas respiratoacuterias virais
e os experimentos foram realizados durante um mesmo periacuteodo as diferenccedilas entre
os grupos CN e DA foram consideradas como sendo devido ao ambiente e as
diferenccedilas entre os grupos DA e EX foram consideradas como sendo devido ao
treinamento
O grupo CN evidenciou um percentual de observaccedilotildees de faringite na
avaliaccedilatildeo endoscoacutepica (TABELA 2) maior que os 37 relatado por HOBO et al
(1995) em cavalos PSI de corrida de dois anos de idade Os potros deste grupo
foram mantidos integralmente em piquetes e nesta situaccedilatildeo a hiperplasia dos
foliacuteculos linfoacuteides da faringe em cavalos jovens pode ser uma resposta normal a
inalaccedilatildeo de antiacutegenos ambientais ou agentes infecciosos (HOLCOMBE e
DUCHARME 2007)
De fato as vias aeacutereas dos potros desse grupo deram mostra de estarem
sendo desafiadas pelo nuacutemero percentual de corrimento nasal linfonodos
aumentados e quantidades elevadas de secreccedilatildeo traqueal iguais aos demais
grupos (TABELAS 1 e 4) Possivelmente isso tambeacutem se deva a fatores climaacuteticos
pois no estudo de ROBINSON et al (2006) com cavalos de montaria de vaacuterias
idades aqueles que permaneceram fora dos estaacutebulos durante o inverno
apresentaram quantidades elevadas de muco traqueal No entanto diferentemente
do nosso estudo os cavalos avaliados por ROBINSON et al (2006) tiveram nuacutemero
percentual de neutroacutefilos aumentado na secreccedilatildeo traqueal enquanto os potros do
grupo CN resultaram em avaliaccedilatildeo citoloacutegica tanto de AT (TABELA 5) como de LBA
(TABELA 6) normais (ROBINSON 2003 HODGSON e HODGSON 2007)
evidenciando vias aeacutereas especialmente as vias aeacutereas inferiores saudaacuteveis
Com relaccedilatildeo ao desafio ambiental no presente estudo adotou-se um sistema
convencional de estabulaccedilatildeo pois estudos anteriores em modelos semelhantes ao
84
nosso jaacute demonstraram a presenccedila de altas concentraccedilotildees de endotoxinas
(BERNDT et al 2008) bem como de poeira e de aeroalergenos (WOODS et al
1993)
Contudo o desafio ambiental de 30 dias utilizado em nosso estudo resultou
em quadro comparaacutevel ao do grupo CN isento de processo inflamatoacuterio das vias
aeacutereas Possivelmente um periacuteodo maior de desafio pudesse causar um processo
inflamatoacuterio tal como foi demonstrado previamente por HOLCOMBE et al (2001)
onde potros da raccedila puro sangue aacuterabe que sofreram desafio ambiental de 90 dias
apresentaram aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no LBA Contudo no
estudo citado o material utilizado para a cama dos potros foi a palha que tambeacutem
representou um maior risco de desenvolvimento de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas dos
cavalos em outros estudos quando comparada a serragem utilizada na cama dos
potros do grupo DA (BURRELL et al 1996 VANDEPUT et al 1998 GERBER et
al 2000 KLEIBER et al 2005 DEWACHI et al 2006)
Entretanto ateacute o momento os efeitos dos fatores ambientais das cocheiras
nas vias aeacutereas foram relatados em sua maioria em cavalos apresentando ORVA e
natildeo em indiviacuteduos jovens e saudaacuteveis como os potros avaliados em nosso estudo
Nos animais com ORVA um curto periacuteodo de exposiccedilatildeo ambiental (6 a 48 horas)
em baia e recebendo alimentaccedilatildeo composta principalmente por feno causou
aumento da expressatildeo de algumas citocinas (pex IL-4 e IL-5) em alguns estudos
mas nenhuma alteraccedilatildeo em outros (GERBER et al 2000 AINSWORTH et al 2003
CORDEAU et al 2004 KLEIBER et al 2005) sendo que um longo tempo de
exposiccedilatildeo ambiental (variando de cinco semanas a trecircs meses) causou aumento da
expressatildeo de IFN-γ e IL-8 (AINSWORTH et al 2003) IL-9 (DEWACHI et al 2006)
IL-17 (DEBRUE et al 2005) e o desenvolvimento dos sinais cliacutenicos da ORVA
acompanhados de alteraccedilotildees na funccedilatildeo pulmonar (VANDEPUT et al 1998)
Contudo nos potros do grupo DA se evidenciou no AT (TABELA 5) e no LBA
(TABELA 6) um aumento significativo do nuacutemero percentual de macroacutefagos
multinucleados em comparaccedilatildeo ao grupo CN bem como nuacutemero percentual de
eosinoacutefilos acima do valor considerado limite para cavalos normais (ROBINSON
2003) sugerindo que houve uma resposta por parte do sistema de defesa nas vias
aeacutereas dos potros deste grupo
Os macroacutefagos multinucleados ou ceacutelulas gigantes multinucleadas satildeo
formados a partir da fusatildeo de dois ou mais macroacutefagos na resposta imune pulmonar
85
(ANDERSON et al 1999) representando especificamente uma resposta imune do
tipo Th2 com a participaccedilatildeo da IL-4 (HELMING e GORDON 2007) Em pessoas os
macroacutefagos multinucleados satildeo considerados como um achado indicativo de
reaccedilotildees inflamatoacuterias crocircnicas nas vias aeacutereas como a tuberculose por exemplo
(LEMAIRE et al 2006 HELMING e GORDON 2007) Em equinos satildeo escassos os
estudos envolvendo a citologia respiratoacuteria que descrevam o nuacutemero percentual
normal deste tipo celular De qualquer forma eacute relatado que pode ser observado em
pequeno nuacutemero em cavalos sem evidecircncias de doenccedila pulmonar sendo que uma
quantidade aumentada jaacute foi descrita associada agrave inflamaccedilatildeo crocircnica (DECONTO
1983 HODGSON e HODGSON 2007) Estas informaccedilotildees parecem natildeo corroborar
com o aumento no nuacutemero percentual de macroacutefagos multinucleados no grupo DA
em se tratando de potros jovens considerados saudaacuteveis o que demonstra a
necessidade de mais estudos para se entender o papel do macroacutefago multinucleado
no pulmatildeo saudaacutevel e na inflamaccedilatildeo pulmonar dos cavalos
Entretanto o nuacutemero percentual de eosinoacutefilos acima do limite normal no
LBA dos potros do grupo DA pode ser considerado como uma resposta ao
ambiente assim como eacute considerado em humanos (DENGUEZLI-BOUZGARROU et
al 2007) e jaacute relatado em cavalos (COUEumlTIL et al 2007)
O periacuteodo de treinamento por sua vez induziu inflamaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo EX O nuacutemero significativamente aumentado de potros com tosse
(TABELA 1) constituiu a evidecircncia cliacutenica sugerindo inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas nos
potros desse grupo Cavalos saudaacuteveis raramente tossem (ROBINSON 2007)
sendo a tosse um sinal cliacutenico comprovadamente associado agrave inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas (BURRELL et al 1996 McGROUM e DIXON 2007) CHRISTLEY et al
(2001) correlacionaram a tosse com a presenccedila de faringite sendo que tal
associaccedilatildeo tambeacutem foi observada no grupo EX (TABELAS 1 e 2) Adicionalmente
BEDENICE et al (2008) estudaram a relaccedilatildeo entre a tosse e a inflamaccedilatildeo pulmonar
e descreveram que os cavalos avaliados por apresentarem tosse tiveram contagens
percentuais de neutroacutefilos no LBA maiores que 5
No presente estudo um aumento no NTCN e nas contagens percentuais de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos do LBA (TABELA 6) confirmaram a presenccedila de inflamaccedilatildeo
pulmonar no grupo EX (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
COUEumlTIL et al 2007) A neutrofilia no LBA de cavalos de corrida jaacute foi
correlacionada a um baixo rendimento desportivo e constitui sinal chave para o
86
diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007) A eosinofilia no LBA de cavalos de
corrida por sua vez pode ser um achado transitoacuterio (VIEL e HEWSON 2003)
apesar de tambeacutem ter sido associada a um baixo rendimento desportivo aleacutem de
hiperresponsividade das vias aeacutereas em cavalos de corrida jovens (HARE e VIEL
1998) Portanto tais evidecircncias podem ser consideradas como um risco ao futuro
potencial atleacutetico dos potros do grupo EX
No presente estudo natildeo houve correlaccedilatildeo entre os achados citoloacutegicos de AT
e LBA para nenhum dos trecircs grupos estudados e esta falta de correlaccedilatildeo entre AT
e LBA jaacute foi relatada anteriormente Portanto entende-se que os epiteacutelios traqueal e
broncoalveolar respondem diferentemente aos agentes agressores sendo que a
avaliaccedilatildeo de cavalos com tosse ou diminuiccedilatildeo de rendimento desportivo deve ser
realizada por ambas as teacutecnicas associadas (MALIKIDES et al 2003 CHRISTLEY
RUSH 2007 HODGSON e HODGSON 2007)
A ligaccedilatildeo entre o exerciacutecio e a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas provavelmente
envolve diversos mediadores proacute-inflamatoacuterios que uma vez identificados poderatildeo
ser alvo para abordagens terapecircuticas com o objetivo de minimizar os efeitos
deleteacuterios da inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos PSI de corrida jovens Neste
contexto um dos mais potentes e versaacuteteis mediadores proacute inflamatoacuterios envolvidos
na inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas eacute o PAF (UHLIG et al 2005)
PAF eacute quimiotaacutetico para bem como produzido por eosinoacutefilos macroacutefagos e
neutroacutefilos em resposta a estresse fiacutesico ou quiacutemico apresentando muitos dos
criteacuterios essenciais de um mediador proacute inflamatoacuterio (OWEN et al 2005)
De fato estudos realizados in vitro demonstraram que o PAF pode induzir a
migraccedilatildeo de neutroacutefilos e monoacutecitos do cavalo (DAWSON et al 1988) Aleacutem disso
demonstrou-se a quimiotaxia de eosinoacutefilos e neutroacutefilos no trato respiratoacuterio de
murinos e humanos induzida por PAF (LEE et al 2002 ISHII et al 2004) Em
cavalos com ORVA a administraccedilatildeo intravenosa de PAF promoveu uma reduccedilatildeo de
leucoacutecitos no sangue perifeacuterico e apoacutes alguns minutos houve um aumento de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo seguido de uma deterioraccedilatildeo cliacutenica e da funccedilatildeo
respiratoacuteria (FAIRBAIRN et al 1996) Portanto apoiado nestes estudos e nos
resultados de aumento do NTCN e de neutrofilia e eosinofilia no LBA do grupo EX
(TABELA 6) eacute razoaacutevel assumir que o PAF possa contribuir para a induccedilatildeo da
inflamaccedilatildeo pulmonar observada nos potros PSI jovens em treinamento avaliados no
presente estudo
87
A inflamaccedilatildeo pulmonar tambeacutem estaacute associada a um aumento nas
concentraccedilotildees de proteiacutenas no LBA principalmente devido ao extravasamento de
plasma (TSANGARIS et al 2003) que pode ser resultado da accedilatildeo de vaacuterios
mediadores proacute inflamatoacuterios tal como o PAF
Um aumento da permeabilidade microvascular induzida pelo PAF resultando
em extravasamento de plasma e edema foi demonstrado previamente no estudo de
CLAVIJO et al (2001) Aleacutem disso WEST et al (1997) demonstraram o acuacutemulo de
um fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar de cavalos exercitados a velocidades
entre 13 ms e 16 ms No presente estudo o significativo aumento da concentraccedilatildeo
de proteiacutenas no LBA dos potros do grupo EX em comparaccedilatildeo ao grupo DA (FIGURA
21) confirma que a permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) estava
aumentada nos potros do grupo EX e o PAF pode estar envolvido neste mecanismo
Diferentemente o significativo aumento de proteiacutenas no LBA do grupo DA em
comparaccedilatildeo ao grupo CN deve envolver outros mecanismos inflamatoacuterios pois natildeo
houve biotavidade de PAF significativa no LBA destes dois grupos (FIGURA 19)
Contudo os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da disponibilidade de oacutexido niacutetrico (NO) (KIKUCHI et al
2008) Houve uma produccedilatildeo limitada de NO nas vias aeacutereas dos potros do grupo
EX esperada em cavalos realizando exerciacutecio moderado ou proacuteximo do maacuteximo
(MILLS e HIGGINS 1997) Isto pode ser explicado pela hipoxemia arterial induzida
pelo exerciacutecio (HAIE) descrita em atletas humanos (HOPKINS 2005) e em cavalos
exercitando a altas intensidades (MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
DEMPSEY e WAGNER 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005) A produccedilatildeo de NO requer
normoxia (GRIMMINGER et al 1995) sendo que a anoxia abole o relaxamento
vascular dependente do endoteacutelio e a hipoxemia degrada o NO (De MEY e
VANHOUTTE 1980) Adicionalmente ocorre uma inibiccedilatildeo do NO pela hemoglobina
sendo que esta inibiccedilatildeo eacute inversamente proporcional a saturaccedilatildeo de oxigecircnio
(IWAMOTO e MORIN 1993)
A inibiccedilatildeo da siacutentese de NO resultou no aumento da permeabilidade vascular
no estudo de KIKUCHI et al (2008) concordando com os nossos achados
referentes agrave bioatividade de PAF aumentada associada ao aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas e agrave diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de nitritos no LBA
do grupo EX
88
De fato no estudo de BRKOVIC e SIROIS (2007) o PAF e natildeo o NO foi
considerado o mediador proacute inflamatoacuterio e causador do aumento da permeabilidade
vascular enquanto o NO foi considerado como um co-fator para as atividades
inflamatoacuterias do PAF Na relaccedilatildeo entre PAF e NO na microcirculaccedilatildeo parece que
NO apresenta um efeito protetor atenuando as atividades inflamatoacuterias de PAF
tendo inclusive reduzido a formaccedilatildeo de PAF em vecircnulas mesenteacutericas em ratos
(NEVIN e BROADLEY 2002)
Contudo o NO tambeacutem tem papel preponderante na defesa das vias aeacutereas
(NEVIN e BROADLEY 2002 XU et al 2006) e o aumento na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA do grupo DA pode ser considerado uma resposta aos poluentes
ambientais existentes nas cocheira dos cavalos (WOODS et al 1993 BERNDT et
al 2008) Aleacutem disso o NO reage com o acircnion superoacutexido (O -2) para formar
peroxinitrito (ONOO-) um forte oxidante capaz de provocar lesatildeo no tecido pulmonar
resultando em peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (XU et al 2006)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi investigada no presente estudo atraveacutes da
concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA que resultou
aumentada no grupo DA em comparaccedilatildeo com o grupo CN (FIGURA 23) A
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi associada ao acuacutemulo de neutroacutefilos e produccedilatildeo de ROS por
esses nas vias aeacutereas de crianccedilas (BUSS et al 2000) e de pessoas com DPOC
(SANTUS et al 2005) Natildeo houve aumento de neutroacutefilos no LBA dos potros do
grupo DA mas os macroacutefagos alveolares dos potros deste grupo apresentaram
maior produccedilatildeo de ROS (FIGURAS 26 e 27) Isso pode ter contribuiacutedo para o
aumento da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA neste grupo como resultado da
modificaccedilatildeo da funcionalidade dos macroacutefagos alveolares induzida por fatores
ambientais como descrito em estudos em humanos (LUNDBORG et al 2007) e em
cavalos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento resultou em reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos lipiacutedicos no LBA em comparaccedilatildeo com o grupo DA No estudo de
MASTALOUDIS et al (2004) corredores de ultramaratona apresentaram aumento
da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica avaliada por marcadores do sangue destes atletas
Contudo outros relataram a reduccedilatildeo dos marcadores de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes
exerciacutecio intenso em corredores e esquiadores (URSO e CLARKSON 2003) em
indiviacuteduos treinados (BALOG et al 2006) em pessoas apoacutes 6 meses de
89
treinamento e tambeacutem apoacutes um programa de treinamento de 3 semanas (ALDRED
2007) e em pacientes com DPOC apoacutes programa de exerciacutecios (PINHO et al 2007)
Provavelmente essa diminuiccedilatildeo na peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA dos potros do
grupo EX deveu-se a mecanismos protetores pois o treinamento influencia de forma
positiva a capacidade antioxidante do organismo em atletas humanos (URSO e
CLARKSON 2003 PARK et al 2005 BALOG et al 2006 ALDRED 2007 PINHO
et al 2007) e em cavalos (KIRSCHVINK et al 2008)
URSO e CLARKSON (2003) relataram um aumento significativo da atividade
da catalase uma enzima antioxidante nos eritroacutecitos de atletas humanos apoacutes um
exerciacutecio de corrida de longa distacircncia corroborando com os nossos achados de
aumento significativo da atividade da catalase no LBA dos potros do grupo EX em
comparaccedilatildeo com o grupo DA (FIGURA 24)
No presente estudo a atividade de macroacutefago alveolar foi investigada devido
ao papel inerente desta ceacutelula na defesa pulmonar O aumento na atividade dos
macroacutefagos alveolares no grupo DA foi discutida acima e provavelmente deveu-se agrave
presenccedila de aeroalergenos e endotoxinas presentes nas cocheiras dos cavalos
(RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento reduziu tanto a fagocitose de macroacutefago
alveolar (FIGURA 25) como a capacidade de produccedilatildeo de ROS (acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio) (FIGURAS 26 e 27)
O macroacutefago alveolar eacute a ceacutelula efetora do sistema imune predominante nos
espaccedilos alveolares e nas vias aeacutereas condutoras responsaacutevel por ativar as
respostas inflamatoacuterias de forma suficiente a eliminar agentes agressores (PETERS-
GOLDEN 2004) Os macroacutefagos alveolares satildeo essenciais agrave sobrevivecircncia
devendo estar em harmonia com o sistema nervoso e endoacutecrino para responder a
estiacutemulos fisioloacutegicos bem como patoloacutegicos (GORDON 2007) sem exagerar na
resposta a fim de natildeo comprometer a troca gasosa (PETERS-GOLDEN 2004)
Apesar de KIZAKI et al (2008) terem demonstrado que o macroacutefago pode
sofrer uma adaptaccedilatildeo ao exerciacutecio melhorando sua funcionalidade os potros PSI
jovens em treinamento para corrida do grupo EX apresentaram supressatildeo da
imunidade especificamente a relacionada agrave resposta imune inata dos macroacutefagos
alveolares corroborando com estudos anteriores (HUSTON et al 1987 RAIDAL et
al 2000 RAIDAL et al 2001) que avaliaram o LBA de cavalos apoacutes exerciacutecio
90
realizado em esteira de alta velocidade e obtiveram resultados semelhantes aos
nossos
Outro aspecto ainda natildeo relatado em equinos mas demonstrado em
pessoas eacute que a melhora na atividade antioxidante induzida pelo exerciacutecio pode
resultar em diminuiccedilatildeo da atividade da NADPH oxidase na membrana dos
macroacutefagos consequumlentemente reduzindo a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio por essas ceacutelulas (PARK et al 2005) como observado no
grupo EX
Portanto a influencia do exerciacutecio sobre a funcionalidade das ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico como a observada nos macroacutefagos alveolares do grupo EX no
presente estudo explicaria a maior suscetibilidade apresentada por potros de corrida
sob treinamento intenso a infecccedilotildees respiratoacuterias (HINES et al 1996) Em
humanos o exerciacutecio intenso reduziu a capacidade de apresentaccedilatildeo de antiacutegeno
(CEDDIA e WOODS 1999) bem como a resistecircncia antiviral (DAVIS et al 1997) por
macroacutefagos O PMA (phorbol myristate acetate) utilizado nas avaliaccedilotildees da
atividade de macroacutefago alveolar (ver toacutepicos 4114 e 4115) teve como funccedilatildeo
estimular a NADPH oxidase a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
(DEKKER et al 2000 NAKAJIMA et al 2000) mimetizando o estiacutemulo provocado
por agentes infecciosos (JI 2008) Isto de fato ocorreu no grupo EX jaacute que os
macroacutefagos estimulados apresentaram aumento significativo na atividade
comparando-se aos macroacutefagos natildeo estimulados (FIGURAS 26 e 27) entretanto a
atividade ainda foi significativamente menor que no grupo DA evidenciando a
reduccedilatildeo na atividade de macroacutefagos induzida pelo exerciacutecio
Os efeitos do PMA sobre os macroacutefagos alveolares e sobre os PMNs do
sangue de equino podem ser apreciados no experimento de validaccedilatildeo da teacutecnica
de estudo da bioatividade de PAF (FIGURAS 13 a 18) A teacutecnica utilizada para o
estudo da bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos potros
empregando-se PMNs de equinos como ferramenta para se avaliar o influxo de Ca++
induzido por PAF foi ineacutedita em estudos em cavalos Anteriormente a mesma
avaliaccedilatildeo foi realizada utilizando-se PMNs de humanos (GRYNKIEWICZ et al 1985
MARATHE et al 2001) Anteriormente os PMNs de equinos foram empregados
com ecircxito no estudo da bioatividade de PAF em extrato lipiacutedico obtido a partir de
amostras de pulmatildeo de ratos no estudo da asma (MUEHLMANN et al 2009)
91
Portanto a validaccedilatildeo desta teacutecnica se fez necessaacuteria e importante para o
reconhecimento dos resultados obtidos para a bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos investigados No presente estudo o PAF
ativou os PMNs do sangue do cavalo assim como os macroacutefagos alveolares de
forma concentraccedilatildeo dependente Portanto o PAF tendo como uma de suas origens
o macroacutefago alveolar eacute capaz de modificar o comportamento de neutroacutefilos
sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos
neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a ORVA (MARR et al 2002)
As influecircncias exercidas pelo PAF na circulaccedilatildeo pulmonar permeabilidade
capilar pulmonar e na agregaccedilatildeo plaquetaacuteria estimulou o estudo da HPIE nos potros
avaliados no grupo EX Para tal o hemossideroacutefago no LBA foi escolhido como o
marcador da HPIE porque a colheita do LBA 24 horas apoacutes o exerciacutecio resultou que
a observaccedilatildeo endoscoacutepica de sangue na traqueacuteia bem como a contagem do
nuacutemero de eritroacutecitos no LBA natildeo fossem teacutecnicas diagnoacutesticas indicadas nesse
momento
A observaccedilatildeo do hemossideroacutefago no LBA mesmo se constituindo numa
forma confiaacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993) poderia natildeo servir
aos nossos propoacutesitos de identificar diferenccedilas em marcadores inflamatoacuterios e de
estresse oxidativo bem como na funcionalidade de macroacutefagos alveolares dentro
de um mesmo grupo ateacute entatildeo considerado homogecircneo Contudo o
hemossideroacutefago presente no LBA foi confirmado no presente estudo natildeo soacute como
um marcador confiaacutevel da HPIE como tambeacutem foi capaz de diferenciar subgrupos
significativamente distintos dentro do grupo EX
Interessantemente observou-se um percentual de HPIE (determinado pela
presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA) maior que o de inflamaccedilatildeo pulmonar (gt5
de neutroacutefilos eou gt1 de eosinoacutefilos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA)
Isso nos leva a pensar que a HPIE precede a inflamaccedilatildeo no pulmatildeo dos cavalos de
corrida tal como foi sugerido por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) mas que
requer outras investigaccedilotildees para excluir que o contraacuterio estivesse acontecendo isto
eacute um processo inflamatoacuterio em periacuteodo anterior do treinamento que pudesse ter
deixado alguma fragilidade pulmonar Possivelmente o estudo de potros PSI de
corrida tatildeo jovens e em iniacutecio de treinamento permitiu tal discussatildeo visto que se
considera que a HPIE acometa praticamente a totalidade dos cavalos PSI em
treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007)
92
A associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo jaacute foi demonstrada anteriormente
(McKANE et al 1993) e foi considerada como sendo significativa no estudo
epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) apesar dos mecanismos pelos quais
esta associaccedilatildeo ocorre ainda serem apresentados de forma hipoteacutetica como no
recente estudo de DERKSEN et al (2009)
No estudo de COUEumlTIL e DENICOLA (1999) cavalos de corrida com HPIE
apresentaram na avaliaccedilatildeo do LBA um aumento no NTCN associado agrave neutrofilia
De fato isto ocorreu no subgrupo HPIE pos e esses achados de citologia
demonstram que a HPIE esteve associada agrave inflamaccedilatildeo pulmonar nos potros do
subgrupo HPIE pos
Outro achado comum entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar eacute o aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA como observado no subgrupo HPIE pos em
comparaccedilatildeo com o grupo HPIE neg (FIGURA 29) evidenciando um aumento na
permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) no subgrupo HPIE pos
O acuacutemulo de fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar associado agrave
inflamaccedilatildeo pulmonar como demonstrado por TSANGARIS et al (2003) foi discutido
acima Contudo cavalos com HPIE exercitados a altas velocidades tambeacutem
apresentaram aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas no espaccedilo alveolar (WEST e
MATTHIEU-COSTELLO 1999)
Possivelmente o aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas associado agrave HPIE
possa ser devido ao aumento da pressatildeo transmural nos capilares pulmonares
resultando em falecircncia por estresse dos capilares como demonstrado por BIRKS et
al (1997) em cavalos exercitados nas mesmas velocidades que os potros avaliados
no presente estudo
Adicionalmente parece que a HPIE deflagrou um mecanismo inflamatoacuterio
causador de extravasamento de plasma no espaccedilo alveolar nos potros do subgrupo
HPIE pos e a bioatividade de PAF significativamente aumentada no subgrupo HPIE
pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (FIGURA 28) indica a participaccedilatildeo desse
mediador proacute inflamatoacuterio nesse evento
O extravasamento de plasma na microcirculaccedilatildeo pulmonar e a formaccedilatildeo de
edema pulmonar induzidos por PAF foram demonstrados anteriormente e jaacute
discutidos acima (EVANS et al 1987 CLAVIJO et al 2001) No caso da HPIE
provavelmente o PAF induza a formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular
atraveacutes da desorganizaccedilatildeo de proteiacutenas juncionais (JIANG et al 2008) Estes dados
93
concordam com a proposta de WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) de que a
altas pressotildees em capilares pulmonares ocorra a formaccedilatildeo de fendas nas junccedilotildees
entre as ceacutelulas endoteliais Desta forma as evidecircncias indicam que associado ao
evento mecacircnico na etiopatogenia da HPIE um evento inflamatoacuterio tambeacutem estaacute
presente o que representa um fator de risco para o agravamento do quadro
Adicionalmente os eventos inflamatoacuterios presentes na HPIE se constituem em
potencial aacuterea para investigaccedilotildees terapecircuticas visto que ainda natildeo se tem um
tratamento efetivo para a hemorragia pulmonar em cavalos atletas Recentemente
evidecircncias de que a suplementaccedilatildeo de cavalos atletas com aacutecidos graxos ocircmega-3
melhora a fluidez da membrana dos eritroacutecitos (PORTIER et al 2006) sugeriu que a
influecircncia beneacutefica na resposta inflamatoacuteria pulmonar pode reduzir os iacutendices HPIE
(ERICKSON et al 2007)
Portanto eacute razoaacutevel assumir um papel para o PAF na fisiopatologia da HPIE
pelas suas propriedades angiogecircnicas aleacutem de seus efeitos proacute inflamatoacuterios
(APONTE et al 2008) concordando com a hipoacutetese da patogecircnese da HPIE
proposta por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) onde a ruptura dos capilares
pulmonares resultaria em inflamaccedilatildeo sangramento e hemosiderose e
consequumlentemente a ocorrecircncia de angiogecircnese na circulaccedilatildeo bronquial e fibrose
agravando o quadro da HPIE
Adicionalmente ZHANG et al (2003) demonstraram que o aumento da
permeabilidade capilar induzido por PAF envolve a participaccedilatildeo de estresse
oxidativo visto que a enzima antioxidante superoacutexido dismutase (SOD) atenuou os
efeitos do PAF sobre o endoteacutelio De fato o grupo HPIE pos apresentou a
concentraccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos significativamente aumentada em comparaccedilatildeo
ao subgrupo HPIE neg sendo uma evidecircncia de estresse oxidativo no LBA dos
potros deste grupo possivelmente exacerbada pela alta quantidade de ferro da
hemossiderina presente no espaccedilo alveolar (DERSEN et al 2009)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica induz alteraccedilotildees patoloacutegicas no tecido pulmonar
destruindo pneumoacutecitos e ceacutelulas endoteliais do epiteacutelio levando a um aumento da
permeabilidade microvascular inibe a siacutentese e a liberaccedilatildeo de surfactante e interfere
negativamente na atividade do NO O conjunto dessas accedilotildees dos peroacutexidos lipiacutedicos
no pulmatildeo resulta em dano da estrutura pulmonar e leva agrave hipertensatildeo
representando um fator adicional contribuindo para a patogenia da HPIE (MILLS e
HIGGINS 1997)
94
Os macroacutefagos alveolares como ceacutelulas orquestradoras da resposta imune
pulmonar (PETERS-GOLDEN 2004) devem possuir um importante papel na
patogenia da HPIE visto que a obtenccedilatildeo de subgrupos significativamente distintos
a partir do grupo EX no presente estudo se deu pela presenccedila ou ausecircncia de
hemossideroacutefagos THACKER (2006) descreveu que os macroacutefagos ativados
secretam interleucina-1 (IL-1) que atrai e ativa a proliferaccedilatildeo de fibroblastos e a
siacutentese de colaacutegeno para reparar o tecido danificado Em estudo histopatoloacutegico do
pulmatildeo de cavalos com HPIE as aacutereas de ocorrecircncia de hemorragia caracterizaram-
se por hemossiderose e fibrose (DERKSEN et al 2009)
Adicionalmente WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) sugeriram o
envolvimento de leucotrieno B4 (LTB4) no mecanismo inflamatoacuterio envolvido na
HPIE apesar deste mecanismo ainda requerer comprovaccedilatildeo Neste evento a
ruptura do epiteacutelio alveolar com a exposiccedilatildeo da membrana ativaria os macroacutefagos
alveolares os quais satildeo ricos em LTB4
O LTB4 por sua vez tambeacutem conecta o PAF agrave HPIE HOPKINS et al (1997)
estudaram a HPIE em humanos avaliando o LBA de seis ciclistas de elite apoacutes 4 km
de esforccedilo maacuteximo Comparados aos controles os ciclistas que realizaram o esforccedilo
apresentaram altas concentraccedilotildees de eritroacutecitos proteiacutenas e LTB4 no LBA No
estudo citado exceto pelo aumento da LTB4 natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
percentual de neutroacutefilos e nem nos niacuteveis de IL-8 e TNF-α entre os grupos
suportando a hipoacutetese do estresse mecacircnico alterando a BAC na HPIE segundo a
conclusatildeo dos autores Contudo a associaccedilatildeo entre LTB4 e PAF foi demonstrada
anteriormente onde o receptor de LTB4 esteve envolvido com a quimiotaxia
pulmonar e degranulaccedilatildeo de neutroacutefilos induzida por PAF (GAUDREAULT et al
2005) Todavia ateacute o momento este tipo de associaccedilatildeo natildeo foi demonstrada em
cavalos apesar de ter-se relatada a neutrofilia nas vias aeacutereas de cavalos com
ORVA mediada por LTB4 (LINDBERG et al 2004) Portanto reunindo as
informaccedilotildees acima pode-se assumir a hipoacutetese de que a neutrofilia no LBA e o
aumento da permeabilidade da BAC nos potros do subgrupo HPIE pos tenha sido
induzida por PAF e mediada por receptor de LTB4
Adicionalmente reforccedila-se a evidecircncia da importacircncia dos macroacutefagos
alveolares na HPIE e por sua vez como a hemorragia pulmonar pode influenciar a
funcionalidade dos macroacutefagos Na primeira etapa do presente estudo descrevemos
a reduccedilatildeo na fagocitose e na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de
95
hidrogecircnio pelos macroacutefagos alveolares do grupo EX (FIGURAS 25 a 27) Contudo
evidenciamos que a HPIE agravou ainda mais esta situaccedilatildeo (FIGURAS 32 e 33)
pois a resposta de macroacutefago alveolar esteve significativamente reduzida no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg
A reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no subgrupo HPIE pos pode ser
explicada novamente pela HAIE com consequumlente inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO
(MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
favorecendo o aumento da permeabilidade capilar (KIKUCHI et al 2008)
provavelmente agravado pela ocorrecircncia de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica neste grupo (MILLS
e HIGGINS 1997)
Os mecanismos pelos quais o NO modula a permeabilidade microvascular
natildeo satildeo bem conhecidos Em cavalos de PSI de corrida a inibiccedilatildeo da NOS pela
administraccedilatildeo de L-NAME agravou a HPIE enquanto natildeo alterou a pressatildeo arterial
pulmonar (KINDIG et al 2000) e a inalaccedilatildeo de NO durante o exerciacutecio reduziu
ligeiramente a pressatildeo arterial pulmonar enquanto tambeacutem causou agravamento da
HPIE (KINDIG et al 2001) Parece que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete
em parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou mas agravou a HPIE
Adicionalmente corroborando com o aumento da bioatividade de PAF e
reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos o estudo de
KWASNIEWSKI et al (2008) com um modelo de lesatildeo e hemorragia em intestino
delgado demonstrou que o preacute tratamento com antagonista de PAF reduziu as
lesotildees enquanto a inibiccedilatildeo do NO endoacutegeno aumentou consideravelmente as
lesotildees hemorraacutegicas e a mortalidade Portanto o estudo citado demonstrou a
existecircncia da relaccedilatildeo entre PAF e NO na hemorragia ocorrida na microcirculaccedilatildeo
assim como reafirma o papel protetor do NO para os efeitos proacute inflamatoacuterios do
PAF (NEVIN e BROADLEY 2002 BRKOVIC e SIROIS 2007)
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
A hipoacutetese do presente estudo foi confirmada pois tanto o desafio ambiental
como o exerciacutecio causaram alteraccedilotildees no fluido broncoalveolar e modificaram a
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar Potros PSI de corrida jovem em treinamento para
corrida apresentaram depressatildeo da resposta imune inata mais especificamente do
macroacutefago alveolar induzida pelo exerciacutecio e agravada pela ocorrecircncia da HPIE
PAF influencia os neutroacutefilos do sangue bem como os macroacutefagos alveolares
de equinos e no presente estudo esteve presente na inflamaccedilatildeo pulmonar induzida
pelo exerciacutecio nos potros PSI durante o treinamento para corrida
Os achados relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e ao aumento da
bioatividade de PAF no fluido broncoalveolar dos potros exercitados estiveram
relacionados agrave HPIE e agrave presenccedila dos hemossideroacutefagos no LBA o que resultou
numa resposta de macroacutefago alveolar ainda mais reduzida
Desta forma assume-se que os resultados obtidos para o grupo EX podem
ser extrapolados para as populaccedilotildees similares de cavalos PSI jovens em
treinamento para a corrida
Finalmente sugere-se a conduccedilatildeo de novos estudos para o entendimento
dos mecanismos inflamatoacuterios envolvidos na HPIE bem como o papel do PAF neste
processo
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AGRADECIMENTOS
A Deus por permitir-me concluir mais esta etapa em minha vida
A minha esposa Ana Luacutecia e meus filhos Joatildeo Pedro e Bernardo que estiveram ao
meu lado desde o iniacutecio desta jornada souberam me dar tranquumlilidade e muito amor aleacutem de levarem pizza no laboratoacuterio nos dias de experimento
Aos meus pais Pedro Maria Luis e Zelma pelos exemplos que vocecircs satildeo e por todo o amor e apoio em todos os momentos
Aos meus irmatildeos Marcus e Andreacute cunhados Cristine Dani e Luiz Gustavo sobrinhas Mariana e Juacutelia pela amizade e torcida
A minha orientadora Profa Dra Anita Nishiyama sobretudo pela amizade e incentivo sendo orientadora nos momentos certos sempre com muita competecircncia
Aos meus colegas meacutedicos veterinaacuterios e amigos Alessandro Mercadante Daniel Mendes Campos Fernando Perche e Luis Henrique Costa pelo apoio prestado na execuccedilatildeo deste trabalho permitindo a avaliaccedilatildeo de potros sob sua
responsabilidade
Aos estabelecimentos que me apoiaram e suas equipes de funcionaacuterios sempre
prestativos Haras Belmont Haras Cifra Haras Santa Rita da Serra Haras dos Girassoacuteis Haras Palmerini Haras Santareacuten
Aos treinadores que me apoiaram permitindo a avaliaccedilatildeo dos potros sob sua responsabilidade extensivo agraves suas respectivas equipes de funcionaacuterios Fernando Azevecircdo Beto Feltran Gladston Santos J Ceacutesar A A Farias Marcus Lanza
Agrave incansaacutevel equipe de colheitas de lavado broncoalveolar que em momento algum deixou de madrugar nos 22 experimentos conduzidos Lorena Andrade da Cruz
Renata Schaefer Liacutevia Medalha Arauacutejo Amine do Vale Meira Fabiana Tieme da Silva Mariana Muumlller da Silva Aline Bonfaacute Richard
A maravilhosa equipe da qual tive a felicidade de conhecer e trabalhar Luis Alexandre Muehlmann MS Fernanda Ceccon Grando MS Ana Luacutecia Zanatta Carolina Farias Gabriela Rubbo Eloyse Bieberbach Ana Claacuteudia e Victor Vocecircs
me deram a amizade e o prazer de trabalhar com vocecircs me ensinaram muito e valorizaram o verdadeiro sentido de equipe com simplicidade determinaccedilatildeo e muita competecircncia
Aos amigos do Laboratoacuterio de Metabolismo Celular da UFPR companheiros de poacutes-graduaccedilatildeo de duacutevidas de buscas pelas respostas de risadas e de conquistas
muito obrigado pela amizade ajuda e muita paciecircncia Fabiacuteola Eacuteverson Ricardo Carine Loli Sandro Gleisson Marcelo Jaison Isabela Diogo Paulo Dalton Gina Daniele Pequito
Ao Prof Dr Luiz Claacuteudio Fernandes pela inestimaacutevel oportunidade de poder
trabalhar no seu laboratoacuterio disponibilizando material necessaacuterio e seu tempo quando o solicitei
A minha amiga e soacutecia meacutedica veterinaacuteria MS Cassiana Maria Garcez Ramos
Aos meus amigos da Direccedilatildeo do Curso de Medicina Veterinaacuteria da PUCPR Profa
Dra Claacuteudia Turra Pimpatildeo e Prof Rodrigo Taacutevora Mira por todo o apoio incentivo e amizade incondicionais
Aos amigos professores da PUCPR Rita M Rocha Denise Kozemjakin Antonia Maria Marconi Farias pelo apoio
Ao Decano do Centro de Ciecircncias Agraacuterias e Ambientais da PUCPR Prof Dr Sylvio Peacutellico Neto pelo apoio e incentivo
Ao Professor Metry Bacila por tantos exemplos demonstrados e por nunca haver se omitido em ajudar e entusiasmar
As bibliotecaacuterias da UFPR pela ajuda e tambeacutem da PUCPR Lucieli e Teresinha e equipe
A amiga Monica Echeverria pela amizade e apoio no inglecircs nesta e em muitas outras oportunidades Thank you
Ao Laboratoacuterio Fort Dodge pelo apoio me fornecendo os sedativos e pela dedicaccedilatildeo dos competentes profissionais Alessandra Carol e Leonardo que sempre estiveram dispostos a ajudar
Ao amigo Nilton Reis companheiro de trabalho na Unidade Hospitalar para Equinos da PUCPR pelo apoio
Aos amigos do Regimento de Poliacutecia Montada Coronel Dulciacutedio pela amizade e apoio durante esta etapa Coronel Heraldo Reacutegis Boacuterio da Silva Major Lorival da
Cunha Sobrinho Major Maacutercio Luis Fonseca Capitatildeo Adilar Marcelo de Lima e agrave equipe do Centro Veterinaacuterio da PMPR Sargento Faacutetima Sd Manasseacutes e demais amigos
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS IX
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES XI
LISTA DE TABELAS XV
RESUMO XVI
ABSTRACT XVII
1 INTRODUCcedilAtildeO 18
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 18
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA) 18
13 PAF E VIAS AEacuteREAS 23
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 27
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO 29
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE) 34
2 OBJETIVOS 40
21 OBJETIVOS GERAIS 40
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS 41
31 REAGENTES E SEDATIVOS 41
32 ANIMAIS 41
33 ASPECTOS EacuteTICOS43
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA 43
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS 43
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) 45
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA46
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957) 47
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS 48
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE CA++
EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE ET AL 2001) 48
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)51
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR E MARLETTA 1985) 51
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA
(NOUROOZ-ZADEH ET AL 1994)52
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984) 53
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA ET AL 1998) 54
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA ET AL 1998) 54
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK E MIZEL 1981) 55
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN E GORDON 1987) 56
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 57
4 RESULTADOS 59
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO 59
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica59
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas 60
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT) 61
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA) 62
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem Diferencial de Ceacutelulas do LBA 62
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF 63
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF 65
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 67
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 68
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 69
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 70
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA 71
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 72
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar 73
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 74
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO 75
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA 75
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 76
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 77
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 78
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 79
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 80
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-) 80
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 81
5 DISCUSSAtildeO 83
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 96
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 97
LISTA DE ABREVIATURAS
ACVIM American College of Veterinary Internal Medicine
AT Aspirado traqueal
CN Grupo Condiccedilotildees Naturais
DA Grupo Desafio Ambiental
DIVA Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas
DIVAI Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
DPOC Doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica
EX Grupo Exerciacutecio
HAIE Hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio
HPIE Hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
HRPO Horse radish peroxidase
IFN-γ Interferon gama
IL-1 Interleucina-1
IL-4 Interleucina-4
IL-8 Interleucina-8
IL-9 Interleucina-9
IL-17 Interleucina-17
LBA Lavado broncoalveolar
L-NAME N-nitro-L-arginina metil ester
LTB4 Leucotrieno B4
LTE8 Leucotrieno E8
MLCP Myosin light chain phophatase
NO Oacutexido niacutetrico
NOS Oacutexido niacutetrico sintase
NTCN Nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas
ORVA Obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas
PAF Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PAF-AH Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria acetilhidrolase
PAF-R Receptor de fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PBS Soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada
PMA Phorbol myristate acetate
PMN Polimorfonuclear
PRS Phenol red solution
PSI Puro sangue inglecircs
RNS Espeacutecie reativa do nitrogecircnio
ROS Espeacutecie reativa do oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Th2 Linfoacutecitos T helper 2
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE 20
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO SN-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL 24
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM
RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS 25
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E
SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE 30
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA
ASMA 31
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS 32
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO
A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR
(BAC) 36
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO
DERSKEN et al (2009) 38
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA
FARINGE 44
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS
ARITENOacuteIDES DE I A IV 44
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME
ENDOSCOacutePICO 45
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO
DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO
REGISTRADA A 510 nm 50
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA
ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 57
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA
AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 63
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS
DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 64
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO
ANTAGONISTA DE PAF BN52021 64
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO
ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 65
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 66
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR
PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 66
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++
EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 67
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO
EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA
ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 68
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A
PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 69
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO
SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 70
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX
(n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA 71
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) 72
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) 73
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) 74
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) 75
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) HPIE NEG (n=5) e EX NORMAL (n=4) 76
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE
POS (n=13) HPIE NEG (n=12) E EX NORMAL (n=8) 77
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) HPIE NEG (n=10) E EX NORMAL (n=7) 79
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) HPIE NEG (n=8) E EX NORMAL (n=5) 80
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS
POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) HPIE NEG (n=5) E EX NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE
POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 81
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE
PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) HPIE NEG (n=6) E EX
NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2
ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 82
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS
TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE
INGLEcircS DE CORRIDA 59
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGIANOS
OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS
DE I A IV 60
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS
CARTILAGENS ARITENOacuteIDES 60
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA
ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO
SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE
AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 61
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS
CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN
(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS
DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN
(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM
PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO
LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX E DOS
SUBGRUPOS HPIE POS HPIE NEG E EX NORMAL 76
RESUMO
A doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas (DIVA) e a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) satildeo comuns em cavalos de corrida resultando em interrupccedilatildeo no treinamento A hipoacutetese do presente estudo foi de que o ambiente e o exerciacutecio
causam estresse oxidativo produccedilatildeo do fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF) e inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas de potros PSI de corrida e que haacute uma relaccedilatildeo entre a DIVA e a HPIE Estudou-se potros PSI em ambiente natural (NC n=45) estabulados
por 30 dias (DA n=40) e treinados (EX n=34) Apoacutes os potros do grupo EX foram divididos em trecircs subgrupos HPIE pos (presenccedila de hemossideroacutefagos no lavado broncoalveolar - LBA) HPIE neg (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA) e EX
normal (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA e menos de 5 de neutroacutefilos e menos de 1 de eosinoacutefilos no LBA) Avaliou-se perfil citoloacutegico e paracircmetros do LBA relacionados a estresse oxidativo bioatividade de PAF atividade da catalase e
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar (MA) Os percentuais de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no LBA do grupo EX foram maiores (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 e 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectivamente) que os limites superiores para cavalos normais
(5 para neutroacutefilos e 1 para eosinoacutefilos) juntamente com um maior nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 ceacutelulasmicroL de LBA P=0017) evidenciaram a ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo pulmonar A bioatividade de PAF e a
concentraccedilatildeo de proteiacutenas no LBA foram maiores no grupo EX (relaccedilatildeo 340380 nm 0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg de proteiacutenasmL de LBA Plt0001) A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos no LBA foi maior
no grupo DA (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg de proteiacutenas Plt0001) e a atividade da catalase foi maior no grupo EX (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg de proteiacutenas P=0002) A fagocitose de MA (P=0006) bem como a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido (Plt0001) e peroacutexido de hidrogecircnio (P=0006) foram
significativamente menores no grupo EX Vinte e trecircs (622) potros do grupo EX foram HPIE pos e o LBA desse subgrupo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutenas (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) bioatividade de
PAF (relaccedilatildeo 340380 nm 0180 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 P=0042) e concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) significativamente maiores que o subgrupo HPIE neg A concentraccedilatildeo de nitritos
(008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) e a atividade de MA foi menor em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg O ambiente e o exerciacutecio modificaram o fluido broncoalveolar confirmando a hipoacutetese do presente estudo
Houve aumento da resposta de MA induzida pelo ambiente enquanto o exerciacutecio fiacutesico resultou em HPIE inflamaccedilatildeo pulmonar e diminuiccedilatildeo na resposta imune inata relacionada aos macroacutefagos alveolares nos potros PSI jovens durante o treinamento
para corrida e o PAF esteve presente nesse processo Sugere-se a conduccedilatildeo de novas investigaccedilotildees para elucidar os mecanismos inflamatoacuterios da HPIE bem como o papel do PAF neste processo como um potencial alvo terapecircutico
Palavras-chave cavalo fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria hemorragia pulmonar inflamaccedilatildeo pulmonar fluido broncoalveolar
ABSTRACT
Inflammatory airway disease (IAD) and exercise-induced pulmonary hemorrhage (EIPH) are common in racehorses during training being important ailments interrupting training of thoroughbred racehorses The present study hypothesis was
that stabling and exercise cause oxidative stress release of platelet-activating factor (PAF) and inflammation in airways of Thoroughbred colts and that there is an association between IAD and EIPH The subjects were colts in breeding farms (NC
n=45) stabled for 30 days (EC n=40) and race trained (EX n=34) Colts of the EX group were subdivided into three subgroups EIPH pos (presence of hemosiderophages in BALF) EIPH neg (absence of hemosiderophages in BALF)
and Normal EX (absence of hemosiderophages and less than 5 neutrophils and 1 eosinophils in BALF) Cytological profile and parameters of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) related to oxidative stress bioactivity of the pro-inflammatory
mediator PAF catalase activity and alveolar macrophage (AM) activity were studied Percentages of neutrophils and eosinophils in the BALF of the EX group were higher (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 and 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectively)
than the upper limits for normal horses (5 of neutrophils and 1 of eosinophils) that associated with a significantly higher total nucleated cell count (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 cellsmicroL of BALF P=0017) displayed pulmonary inflammation PAF
bioactivity and the total protein concentration in the BALF were higher in the EX group (0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 340380nm ratio P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg of proteinsmL of BALF Plt0001) Concentration of BALF hydroperoxides
was higher in the EC group (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg of proteins Plt0001) and catalase activity was higher in the EX group (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg of proteins P=0002) AM phagocytosis (P=0006) as well as production of superoxide anion (Plt0001) and hydrogen peroxide (P=0006) were
significantly lower in EX group Twenty three (622) colts of the EX group were EIPH pos and the BALF of this subgroup presented a significantly higher protein concentration (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg of proteinsmL of BALF P=0031) PAF
bioactivity (018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 340380 nm ratio P=0042) and lipid hydroperoxide concentration (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg of proteins P=0009) as well as lower nitrite concentration (008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007
absorbance 550 nm P=0049) and AM activity than EIPH neg subgroup Environment and exercise modified the bronchoalveolar fluid confirming the hypothesis of the present study Environment increased AM response as exercise resulted in EIPH
pulmonary inflammation and decreased innate immune response of alveolar macrophages in young Thoroughbred horses during race training and PAF participated in this event Further studies should be conducted to better understand
the inflammatory mechanisms of EIPH and the role of PAF in this process as a potential therapeutic target
Keywords horse platelet-activating factor pulmonary hemorrhage pulmonary
inflammation bronchoalveolar fluid
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
As doenccedilas respiratoacuterias satildeo comuns nos cavalos e as condiccedilotildees a que
estatildeo sujeitos fazem com que a inflamaccedilatildeo seja uma manifestaccedilatildeo frequumlente dessas
afecccedilotildees O epiteacutelio das vias aeacutereas superiores e dos pulmotildees estatildeo expostos a
patoacutegenos invasores e fatores ambientais Portanto o conhecimento dos
mecanismos da resposta inflamatoacuteria nas vias aeacutereas se faz importante a fim de se
estabelecer estrateacutegias para reduzir o impacto e os danos causados (THACKER
2006)
A inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apresenta um agravante o papel dos pulmotildees
na troca gasosa Assim as quatro principais consequumlecircncias de um processo
inflamatoacuterio desencadeado nas vias aeacutereas incluem vasodilataccedilatildeo e a reduccedilatildeo no
fluxo sanguiacuteneo resultando em capilares ingurgitados o aumento da permeabilidade
capilar permitindo a passagem de fluiacutedo e ceacutelulas para os tecidos o influxo e
acuacutemulo de fagoacutecitos e ceacutelulas ativadas no local e a bronconstricccedilatildeo (LUNN et al
2007)
O estudo das doenccedilas respiratoacuterias em cavalos eacute relevante particularmente
nos cavalos jovens de corrida onde a taxa de inflamaccedilatildeo detectada nas vias aeacutereas
eacute significativa (CHRISTLEY e RUSH 2007)
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA)
Os termos ldquodoenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereasrdquo (DIVA) e ldquodoenccedila
inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferioresrdquo (DIVAI) tecircm sido usados para descrever uma
siacutendrome inflamatoacuteria do trato respiratoacuterio de cavalos de corrida (CHRISTLEY e
RUSH 2007)
Tem-se relatado que a DIVA ocorre em 11 a 50 dos cavalos de corrida em
treinamento chegando a afetar ateacute 80 dos cavalos de corrida de dois anos de
idade (CHRISTLEY e RUSH 2007) MALIKIDES (2003) estudou a prevalecircncia da
DIVA em cavalos de corrida na Austraacutelia evidenciando que 41 deles apresentaram
inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apoacutes duas semanas de iniciarem treinamento
19
A DIVA eacute considerada a segunda afecccedilatildeo mais comum a interromper o
treinamento para corridas (WILSHER et al 2006) podendo resultar em prejuiacutezos a
troca gasosa e diminuiccedilatildeo da capacidade atleacutetica (COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005)
Cavalos com DIVA ou com hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) apresentaram uma maior hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE)
(CHRISTLEY et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
(FIGURA 1)
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE EIPH HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO IAD DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS UAO OBSTRUCcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS SUPERIORES FONTE SAacuteNCHEZ et al (2005)
Cavalos trotadores de corrida diagnosticados com DIVA tiveram a mecacircnica
pulmonar (volume corrente frequumlecircncia respiratoacuteria ventilaccedilatildeo pulmonar duraccedilatildeo da
inspiraccedilatildeo e da expiraccedilatildeo complacecircncia dinacircmica) alterada apresentaram um
significativo aumento da carga ventilatoacuteria e da energia requerida para a respiraccedilatildeo
sofrendo restriccedilotildees em seu rendimento atleacutetico (PIRRONE et al 2007)
Contudo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas dos cavalos atletas natildeo eacute entendida
por completo especialmente pela falta de consistecircncia e precisatildeo na definiccedilatildeo
dessa siacutendrome (CHRISTLEY e RUSH 2007)
Recentemente um painel de discussatildeo promovido pelo American College of
Veterinary Internal Medicine (ACVIM) definiu que a DIVA pode ocorrer em cavalos
de qualquer idade e eacute caracterizada pelo seguinte fenoacutetipo (COUEumlTIL et al 2007)
20
- Baixo rendimento desportivo intoleracircncia ao exerciacutecio
- Tosse com ou sem quantidade excessiva de muco traqueal
- Inflamaccedilatildeo natildeo seacuteptica detectada pela avaliaccedilatildeo citoloacutegica do fluido do LBA
ou disfunccedilatildeo pulmonar baseada em evidecircncia de obstruccedilatildeo de vias aeacutereas
inferiores hiperresponsividade das vias aeacutereas ou prejuiacutezo a troca gasosa durante o
repouso ou exerciacutecio
Este painel formado por experts e pesquisadores da aacuterea propocircs tambeacutem
alguns fatores de exclusatildeo para a DIVA
- Evidecircncia de sinais sistecircmicos de infecccedilatildeo (febre alteraccedilotildees hematoloacutegicas
compatiacuteveis com infecccedilatildeo)
- Aumento do esforccedilo respiratoacuterio durante o repouso
A etiopatogenia da DIVA eacute pouco definida Acredita-se que uma variedade de
fatores de risco estejam envolvidos variando nas diferentes populaccedilotildees de cavalos
baseado na alimentaccedilatildeo manejo praacuteticas preventivas distribuiccedilatildeo de agentes
infecciosos e influecircncias geneacuteticas (COUEumlTIL et al 2007)
Alguns autores encontraram uma reduccedilatildeo da incidecircncia desta afecccedilatildeo em
cavalos mais velhos (BURRELL et al 1996 CHAPMAN et al 2000 CHRISTLEY et
al 2001 WOOD et al 2005) sendo que a idade natildeo provocou diferenccedila no estudo
de McKANE et al (1993)
O ambiente da cocheira representa um risco adicional para a DIVA nos
cavalos (BURRELL et al 1996 HOLCOMBE et al2001 CLEMENTS e PIRIE
2007 BERNDT et al 2008) bem como para a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas das
pessoas envolvidas no trabalho com os cavalos (ELFMAN et al 2009)
HOLCOMBE et al (2001) associaram o manejo de estabulaccedilatildeo com a
ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas inferiores Estudaram 14 potros aacuterabes
que foram transferidos da pastagem para cocheiras com cama de palha Apoacutes 90
dias de estabulados houve um aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no
lavado broncoalveolar (LBA) Cavalos estabulados em cama de palha tambeacutem
apresentaram maior chance de apresentar DIVA em outros estudos (BURRELL et
al 1996 WOODS et al 1993)
No entanto em cavalos de montaria no estado norte-americano de Michigan
foi a permanecircncia em piquetes durante o inverno que esteve associado com
aumento do acuacutemulo de muco traqueal com maior nuacutemero de neutroacutefilos Neste
21
estudo a alimentaccedilatildeo com feno tambeacutem representou risco para a ocorrecircncia de
inflamaccedilatildeo (ROBINSON et al 2006)
Contudo o ambiente de cocheiras em modelos convencionais de manejo aos
quais os cavalos em treinamento estatildeo submetidos reconhecidamente apresenta
riscos para as vias aeacutereas Nestes haacute aumento nas concentraccedilotildees de partiacuteculas
inalaacuteveis contendo partiacuteculas orgacircnicas e inorgacircnicas incluindo endotoxinas β-D-
glucan partiacuteculas ultra finas (lt100 nm de diacircmetro) microorganismos esporos de
fungos material vegetal poeira inorgacircnica e gases toacutexicos (COUEumlTIL et al 2007)
Recentemente no estudo de BERNDT et al (2008) se demonstrou que o ambiente
de cocheira apresenta uma concentraccedilatildeo de endotoxinas 8 vezes maior que nos
piquetes
Aleacutem disso haacute muito jaacute foi descrita a presenccedila de actinomicetos termofiacutelicos
como a Micropolyspora faeni nos fenos fornecidos aos cavalos capazes de serem
inalados atingindo as vias aeacutereas inferiores (McPHERSON e THOMSON 1983)
Assim a praacutetica de encharcar o feno antes da administraccedilatildeo para diminuir a
quantidade de poeira disponiacutevel resultou em benefiacutecio agraves vias aeacutereas dos cavalos
(CLEMENTS e PIRIE 2007)
Por outro lado a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA ainda
natildeo estaacute bem esclarecida Cavalos com sinais cliacutenicos de inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas apresentaram maior frequecircncia de isolados bacterianos nos estudos de
CHRISTLEY et al (2001) e WOOD et al (2005) apesar de o painel do ACVIM
entender que a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA precisa ser
melhor estudada (COUEumlTIL et al 2007)
O exerciacutecio tambeacutem tem sido associado agrave inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas
inferiores dos cavalos atletas (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) A prevalecircncia da DIVA eacute maior em cavalos em treinamento
que em cavalos do mesmo grupo mas sem treinamento talvez pela inalaccedilatildeo de
maiores quantidades de partiacuteculas pela exposiccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores ao ar
frio ou pela ocorrecircncia da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (DAVIS et
al 2006 CHRISTLEY e RUSH 2007)
O diagnoacutestico da DIVA inclui a histoacuteria e o exame fiacutesico detalhados para a
identificaccedilatildeo de potenciais fatores etioloacutegicos A tosse durante o exerciacutecio ou
durante a alimentaccedilatildeo constitui a queixa mais comum (CHRISTLEY e RUSH 2007)
esteve associada agrave presenccedila de quantidades aumentadas de secreccedilatildeo traqueal bem
22
como a um maior percentual de neutroacutefilos tanto na secreccedilatildeo traqueal (CHRISTLEY
et al 2001) como no LBA (BENEDICE et al 2008) mas sua ausecircncia natildeo descarta
o diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
A presenccedila de descarga nasal mucopurulenta eacute achado comum em cavalos
de corrida de dois anos de idade sendo menos comum em cavalos mais velhos
Sua relaccedilatildeo com a DIVA todavia natildeo eacute sabida (COUEumlTIL et al 2007)
A auscultaccedilatildeo toraacutecica durante o repouso raramente evidencia alteraccedilotildees em
cavalos atletas com inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores (MAZAN e HOFFMAN
2003 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007) sendo necessaacuteria a
utilizaccedilatildeo de uma sacola para o cavalo respirar no seu interior ampliando o esforccedilo
respiratoacuterio (bdquorebreathing bagrsquo) podendo tornar audiacuteveis alguns sons anormais em
certos casos (MAZAN e HOFFMAN 2003 COUEumlTIL et al 2007)
MAZAN e HOFFMAN (2003) relataram que os testes de funccedilatildeo pulmonar
como o pneumotacoacutegrafo e o teste de broncoprovocaccedilatildeo com histamina podem
auxiliar tornando o diagnoacutestico da DIVA definitivo Contudo o diagnoacutestico precoce
da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores deve enfatizar a avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA
e natildeo os testes de funccedilatildeo pulmonar (COUEumlTIL et al 2007)
A avaliaccedilatildeo citoloacutegica do AT tambeacutem tem contribuido ao diagnoacutestico dos
processos inflamatoacuterios das vias aeacutereas contudo natildeo eacute considerado suficiente para
o diagnoacutestico da DIVA Isto se deve a falta de concordacircncia entre os achados
citoloacutegicos do AT e do LBA e da falta de estudos associando os achados no AT e o
rendimento atleacutetico (HODGSON e HODGSON 2003 HUGHES et al 2003
COUEumlTIL et al 2007) Ainda um cuidado a ser levado em conta quando da
realizaccedilatildeo de AT eacute o tempo da colheita jaacute que a realizaccedilatildeo de exerciacutecio
esteneuante pode aumentar o percentual de neutroacutefilos na amostra obtida
(MALIKIDES et al 2007)
O LBA por sua vez eacute o meacutetodo para a obtenccedilatildeo de amostras de ceacutelulas
presentes nas vias aeacutereas mais distais e espaccedilo alveolar (HOFFMAN 1999
FERNANDES et al 2000 LESSA et al 2005) considerado como uma bioacutepsia
liacutequida (MAZAN e HOFFMAN 2003) sendo a teacutecnica de avaliaccedilatildeo citoloacutegica
preferida para o diangoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
Um aumento no percentual de ceacutelulas inflamatoacuterias no fluido do LBA eacute um dos
principais criteacuterios diagnoacutesticos para a DIVA Usualmente ocorre uma predominacircncia
de neutroacutefilos mas tambeacutem pode ocorrer aumento nos nuacutemeros percentuais de
23
eosinoacutefilos linfoacutecitos e mastoacutecitos normalmente associados com diminuiccedilatildeo no
rendimento desportivo e hiperresponsividade das vias aeacutereas (McKANE et al 1993
HARE e VIEL 1998 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007)
O perfil citoloacutegico de LBA mais comumente encontrado em cavalos com DIVA
eacute caracterizado por aumento no nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (NTCN) com
discreta neutrofilia (gt5) linfocitose e monocitose Tambeacutem pode ser encontrado
um aumento do nuacutemero percentual de eosinoacutefilos (gt01) e mastoacutecitos (gt2)
(HOFFMAN 1999 COUEumlTIL et al 2007)
O painel de estudo da DIVA promovido pelo ACVIM apontou direccedilotildees para as
pesquisas nesta aacuterea e dentre elas o estudo das citocinas e mediadores
inflamatoacuterios envolvidos no processo (COUEumlTIL et al 2007)
Sabe-se que ocorre um incremento da imunidade inata nas vias aeacutereas dos
cavalos estabulados com o envolvimento de IL-6 (RIIHIMAumlKI et al 2008a) Em
cavalos trotadores de corrida em treinamento ocorre uma eosinofilia transitoacuteria no
fluido broncoalveolar e um aumento da expressatildeo de IL-4 e IL-5 contudo natildeo foi
encontrada correlaccedilatildeo entre estes eventos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Dentre os mediadores quiacutemicos participantes do processo inflamatoacuter io nas
vias aeacutereas o PAF (platelet-activating factor) estaacute especialmente implicado na asma
sepse e injuacuteria pulmonar aguda (THACKER 2006) presente tambeacutem na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas em cavalos mais velhos
(FAIRBAIRN et al 1996) Contudo a participaccedilatildeo do PAF no processo inflamatoacuterio
nas vias aeacutereas de cavalos atletas ainda natildeo eacute conhecida
13 PAF E VIAS AEacuteREAS
O fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocoline)
eacute um potente mediador proacute inflamatoacuterio envolvido na angiogecircnese aterosclerose
anafilaxia cicatrizaccedilatildeo inflamaccedilatildeo apoptose e endotoxemia (MARATHE et al
2001 STAFFORINI et al 2003 OWEN et al 2005) O PAF eacute produzido por
eosinoacutefilos macroacutefagos alveolares neutroacutefilos plaquetas e ceacutelulas endoteliais
(BAKER et al 2002 STAFFORINI et al 2003 GAUDREAULT et al 2005 SUMITA
et al 2005) a partir de uma subclasse especiacutefica de fosfatidilcolina que conteacutem um
eacuteter ao inveacutes de um eacutester ligado a posiccedilatildeo sn-1 do esqueleto de glicerol (FIGURA
24
2) A fosfatidilcolina eacute o mais abundante fosfolipiacutedio presente nas membranas
bioloacutegicas (MARATHE et al 2001 OWEN et al 2005)
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO sn-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL FONTE MARATHE et al (2001)
O PAF tambeacutem estaacute envolvido numa variedade de funccedilotildees pulmonares como
por exemplo no tocircnus vascular e das vias aeacutereas na frequumlecircncia de movimentaccedilatildeo
dos ciacutelios e na permeabilidade endotelial causando um aumento da secreccedilatildeo de
fluido traqueal broncoconstricccedilatildeo edema e hiperresponsividade das vias aeacutereas
resultando em prejuiacutezos a troca gasosa (CLAVIJO et al 2001 GABRIJELCIC et al
2003 ISHII et al 2004 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008)
Os efeitos do PAF sobre a circulaccedilatildeo pulmonar foram descritos por diversos
autores CHEN et al (1992) demonstraram um aumento das pressotildees arterial e
microvascular pulmonares e edema apoacutes a injeccedilatildeo de PAF SHIBAMOTO et al
(1993) estudaram os efeitos do PAF na circulaccedilatildeo venosa em pulmatildeo de catildeo onde
o PAF causou venoconstricccedilatildeo e aumento da pressatildeo capilar sem aumento da
permeabilidade vascular OHAR et al (1994) tambeacutem demonstraram
venoconstricccedilatildeo em estudo com pulmatildeo de coelhos mas demostraram que a
reduccedilatildeo da complacecircncia e aumento da resistecircncia vascular deveu-se a alteraccedilatildeo
estrutural vascular por perda de colaacutegeno intersticial induzida por PAF
Contudo o papel do PAF como causador de aumento da permeabilidade
vascular e edema pulmonar estaacute bem estudado devido a sua participaccedilatildeo na
fisiopatologia da anafilaxia da endotoxemia e da asma (EVANS et al 1987
25
CLAVIJO et al 2001 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008
MUEHLMANN et al 2009)
Em estudo preacutevio o extravasamento microvascular ocorrido apoacutes a infusatildeo de
PAF natildeo foi acompanhado de aumento da pressatildeo arterial pulmonar assim os
autores concluiacuteram que o edema pulmonar mediado por PAF resulta de aumento da
permeabilidade microvascular pulmonar (CLAVIJO et al 2001)
De fato demonstrou-se que o aumento da permeabilidade capilar induzida
por PAF ocorre pela formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular devido a
desorganizaccedilatildeo das proteiacutenas juncionais VE-caderina e ocludina (ZHANG et al
2003 JIANG et al 2008) mediada por receptores especiacuteficos (EVANS et al 1987)
e atraveacutes da ativaccedilatildeo da via do insositol trisphosphato e influxo de caacutelcio (GOumlGGEL
e UHLIG 2005) (FIGURA 3)
PLC phopholipase C IP3 inositol 145-trisphosphato IP3R receptor de IP3
MLCK myosin light chain kinase ML-7 5-iodonaphthalene-1sulphonyl-
homopiperazine L108 edelfosina Inibiccedilatildeo ativaccedilatildeo
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS NO LADO ESQUERDO OBSERVA-SE O EFEITO DO PAF EM CEacuteLULAS ENDOTELIAIS NO LADO DIREITO OBSERVA-SE OS EFEITOS DO PAF EM CEacuteLULAS DA MUSCULATURA LISA VASCULAR E DAS VIAS AEacuteREAS A QUAL Eacute ALTAMENTE MEDIADA POR TROMBOXANO NESTE A VIA PRINCIPAL Eacute ATRAVEacuteS DA ATIVACcedilAtildeO DE RHO E PROTEIacuteNAS KINASES ASSOCIADAS Agrave RHO QUE ATENUAM A ATIVIDADE DA MLCP (MYOSIN LIGHT CHAIN PHOPHATASE) COM CONSEQUumlENTE AUMENTO DA FOSFORILACcedilAtildeO DA CADEIA LEVE DA MIOSINA E PORTANTO A CONTRACcedilAtildeO FONTE GOumlGGEL e UHLIG (2005)
26
Adicionalmente os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) (BELLAN et al 1992) O
aumento da produccedilatildeo de NO induzida por PAF via ativaccedilatildeo de receptor de PAF foi
demonstrado em ceacutelulas do endoteacutelio vascular humano considerado como um efeito
cardioprotetor (KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Contudo particularmente
na microcirculaccedilatildeo o NO contra-ataca muitos dos efeitos bioloacutegicos do PAF inibindo
a vasoconstricccedilatildeo arteriolar e o aumento da permeabilidade vascular aleacutem de inibir
a adesatildeo de plaquetas e de leucoacutecitos ao endoteacutelio (BRKOVIC e SIROIS 2007
KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Mas os mecanismos pelos quais o NO
modula a permeabilidade microvascular ainda natildeo satildeo bem entendidos podendo ser
confusos e dependentes do estado das ceacutelulas endoteliais (RAMIREZ et al 2006)
A inibiccedilatildeo da NO sintase (NOS) em ceacutelulas endoteliais atenuou o aumento da
permeabilidade microvascular induzida por PAF no estudo de ZHU et al (2004) Por
outro lado estudando a participaccedilatildeo de NO e PAF em lesotildees de intestino delgado
de ratos KWASNIEWSKI et al (2008) evidenciaram que a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de
NO endoacutegeno aumentou bastante as lesotildees hemorraacutegicas e a taxa de mortalidade
demonstrando o papel proacute inflamatoacuterio do PAF e o efeito protetor do NO na
microcirculaccedilatildeo Tal relaccedilatildeo tambeacutem foi descrita por BRKOVIC e SIROIS (2007)
estudando o papel do PAF e do NO nos efeitos proacute inflamatoacuterios resultantes da
participaccedilatildeo de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e concluindo que eacute
o PAF que diretamente aumenta a permeabilidade vascular sendo o NO um cofator
A atuaccedilatildeo do PAF como mediador inflamatoacuterio eacute bastante importante na
asma onde aleacutem de provocar aumento da permeabilidade vascular tambeacutem induz
uma neutropenia transitoacuteria seguida de neutrofilia resultando no recrutamento de
neutroacutefilos para o pulmatildeo evidenciado atraveacutes de estudo citoloacutegico do lavado
broncoalveolar (LEE et al 2002 GABRIJELCIC et al 2003)
No estudo de AU et al (2001) a ativaccedilatildeo de neutroacutefilos resultou em ativaccedilatildeo
dos receptores de PAF aumento da fagocitose de neutroacutefilos e subsequumlente
liberaccedilatildeo de interleucina-8 (IL-8) causando mais quimiotaxia de neutroacutefilos
Adicionalmente demonstrou-se que haacute envolvimento de receptor 1 de leucotrieno B4
(LTB4) nas atividades de neutroacutefilos humanos mediadas por PAF (GAUDREAULT et
al 2005)
Em indiviacuteduos asmaacuteticos e com doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC)
o influxo de neutroacutefilos mediado por PAF nas vias aeacutereas foi modulado pelo aumento
27
de LTB4 provavelmente pelo estiacutemulo de PAF para a liberaccedilatildeo de LTB4 dos
macroacutefagos alveolares (SHINDO et al 1998 GABRIJELCIC et al 2003 FINNEY-
HAYWARD et al 2009)
Nas vias aeacutereas dos cavalos se demonstrou a participaccedilatildeo do PAF na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas (ORVA) levando a um
aumento do recrutamento de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo resultando em
prejuiacutezos agrave funccedilatildeo pulmonar (FAIRBAIRN et al 1996)
O PAF tendo como uma de suas origens o macroacutefago alveolar eacute capaz de
modificar o comportamento de neutroacutefilos sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da
adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a
ORVA (MARR et al 2002)
A participaccedilatildeo do PAF na asma humana e em outras espeacutecies foi evidenciada
pela sua capacidade em reproduzir mecanismos fisiopatoloacutegicos tais como a
broncoconstricccedilatildeo hiperresponsividade das vias aeacutereas aumento da
permeabilidade na microcirculaccedilatildeo pulmonar e aumento na secreccedilatildeo de muco (LOU
et al 1998 ISHII et al 2004 MUEHLMANN et al 2009)
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
Os desafios indutores de alteraccedilotildees na funcionalidade dos macroacutefagos
alveolares resultando em quimiotaxia de neutroacutefilos para as vias aeacutereas levam a um
quadro inflamatoacuterio pulmonar acompanhado de hipersecreccedilatildeo de muco Por sua vez
o muco presente nas vias aeacutereas possui uma seacuterie de funccedilotildees essenciais que
coletivamente levam a proteccedilatildeo das vias aeacutereas Juntamente com as ceacutelulas
epiteliais forma o sistema mucociliar que associado agrave tosse eacute essencial para
manter as vias aeacutereas desobstruiacutedas (ADLER 2005)
Por outro lado a produccedilatildeo excessiva de muco representa um fator importante
de morbidade e mortalidade nas doenccedilas das vias aeacutereas (THORNTON e
SHEEHAN 2004) Assim a resposta imunoloacutegica do epiteacutelio das vias aeacutereas frente
a infecccedilotildees virais e bacterianas e endotoxinas inaladas eacute caracterizada pela
liberaccedilatildeo de citocinas e pela produccedilatildeo de mucinas para prover proteccedilatildeo adicional
(HODGSON et al 2003 GERBER et al 2004 LORA et al 2005) Entretanto nos
quadros inflamatoacuterios os danos teciduais substanciais podem levar a produccedilatildeo
28
excessiva de muco e comprometimento da funccedilatildeo respiratoacuteria (LORA et al 2005
ROBINSON 2005)
O muco eacute uma mistura de aacutegua (~95) eletroacutelitos (~1) lipiacutedios (~1)
proteiacutenas (2-3) enzimas proteiacutenas seacutericas e mucinas (GERBER 2001) As
mucinas glicoproteiacutenas oligomeacutericas representam um constituinte importante do
muco sendo o gene responsaacutevel pela produccedilatildeo de mucinas o MUC5 (THORNTON
e SHEEHAN 2004)
Nas vias aeacutereas a produccedilatildeo de mucinas ocorre predominantemente pelas
ceacutelulas caliciformes do epiteacutelio e em menor parte nas glacircndulas da submucosa
(GERBER et al 2004 THORNTON e SHEEHAN 2004) A produccedilatildeo de
quantidades excessivas de muco pode representar a causa direta de obstruccedilatildeo
bronquial podendo amplificar o efeito de estreitamento luminal da broncoconstricccedilatildeo
e estar associada ao comprometimento da funccedilatildeo pulmonar tosse e capacidade
reduzida para a corrida em atletas humanos (HALLSTRAND et al 2007) e em
cavalos de corrida (CHRISTLEY et al 2001 HOLCOMBE et al 2006)
Assim a quantidade de muco secretado apresenta uma correlaccedilatildeo estreita
com a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas (GERBER et al 2004 ROBINSON et al 2003
HOLCOMBE et al 2006 ROBINSON 2005) De fato haacute uma evidente associaccedilatildeo
entre a hipersecreccedilatildeo de muco e presenccedila de quantidades aumentadas de
neutroacutefilos nas secreccedilotildees respiratoacuterias em seres humanos e em cavalos
(HODGSON et al 2003 ROBINSON et al 2003 ADLER 2005) Contagens de
neutroacutefilos no LBA menores que 30 ceacutelulasμL correspondem a pequenas
quantidades de muco nas vias aeacutereas e os acuacutemulos de secreccedilatildeo aumentam
quando as quantidades de neutroacutefilos estatildeo entre 30 e 100 ceacutelulasμL Entre 100 e
1000 ceacutelulasμL ocorre obstruccedilatildeo mensuraacutevel das vias aeacutereas Possivelmente esse
mecanismo pode estar relacionado com a secreccedilatildeo de proteiacutenas pelos neutroacutefilos
(ROBINSON et al 2003) De fato jaacute foi demonstrado que o neutroacutefilo secreta
elastase a qual estaacute associada com um aumento nas secreccedilotildees relacionadas com a
expressatildeo do gene MUC5 (SHAO e NADEL 2005) e metaplasia de ceacutelulas
caliciformes (VOYNOW et al 2004)
A expressatildeo anormal de neutroacutefilos e de moleacuteculas de adesatildeo em indiviacuteduos
com asma e doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC) foi demonstrada por
GABRIJELCIC et al (2003) Aleacutem do aumento no nuacutemero de neutroacutefilos tambeacutem
foram observados diferentes padrotildees de ativaccedilatildeo e niacuteveis aumentados de elastase
29
neutrofiacutelica e IL-8 Estes uacuteltimos bem como a expressatildeo do gene MUC5 estatildeo
associados a um aumento no estresse oxidativo pulmonar (DROST et al 2005
SHAO e NADEL 2005)
A associaccedilatildeo entre a severidade da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas e o estresse
oxidativo em cavalos com ORVA foi relatada por KIRSCHVINK et al (2008) os
quais relacionaram a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas ao aumento da glutationa oxidada
do aacutecido uacuterico e de isoprostano (8-iso-PGF2α) no LBA
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO
Estresse oxidativo eacute o termo utilizado para descrever os danos causados
quando as espeacutecies reativas do oxigecircnio (ROS) superam a capacidade de defesa
antioxidante do indiviacuteduo (WOOD et al 2003)
Entretanto tanto as ROS como as espeacutecies reativas do nitrogecircnio (RNS)
ocorrendo em concentraccedilotildees pequenas a moderadas apresentam importante papel
na fisiologia celular incluindo a defesa contra invasores e atuando em diversas vias
de sinalizaccedilatildeo celular e na induccedilatildeo da resposta mitogecircnica O estresse oxidativo
propriamente dito ocorre quando o sistema redox sofre desequiliacutebrio pela produccedilatildeo
aumentada de ROS eou RNS ou produccedilatildeo reduzida de antioxidantes (VALKO et al
2007)
Os pulmotildees encontram-se sujeitos ao estresse oxidativo pois estatildeo
diretamente expostos a quantidades muito elevadas de oxigecircnio o que torna
imperativo que este oacutergatildeo possua um arsenal para a defesa contra possiacuteveis
ataques oxidativos Portanto os pulmotildees satildeo providos de um desenvolvido sistema
de defesa endoacutegeno constituiacutedo de agentes chamados antioxidantes Os
antioxidantes ajudam os pulmotildees a se livrarem dos efeitos de uma variedade de
oxidantes provenientes do oxigecircnio (ROS) como o acircnion superoacutexido radical
hidroxila peroacutexido de hidrogecircnio e do nitrogecircnio (RNS) como o oacutexido niacutetrico (NO)
peroxinitrito e nitritos endoacutegenos e do ambiente Os principais sistemas
antioxidantes natildeo enzimaacuteticos dos pulmotildees satildeo a glutationa a vitamina C a
vitamina E o beta-caroteno e o aacutecido uacuterico enquanto os antioxidantes enzimaacuteticos
satildeo as superoacutexido dismutases a catalase e as peroxidases (RAHMAN et al 2006)
(FIGURA 4)
30
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE O2- AcircNION SUPEROacuteXIDO NO OacuteXIDO NIacuteTRICO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO ONOO- PEROXINITRITO FE2+ IacuteON FERROSO GPX GLUTATIONA PEROXIDASE FONTE RAHMAN et al (2006)
O estresse oxidativo pode resultar em muitos prejuiacutezos agraves funccedilotildees das vias
aeacutereas incluindo a contraccedilatildeo da musculatura lisa das vias aeacutereas a induccedilatildeo de
hiperresponsividade das vias aeacutereas a hipersecreccedilatildeo de muco danos ao epiteacutelio
respiratoacuterio e aumento da permeabilidade capilar (WOOD et al 2003)
A fisiopatologia da asma e da DPOC caracteriza-se por inflamaccedilatildeo crocircnica
localizada e estresse oxidativo O estresse oxidativo ocorre pelo aumento de
agentes oxidantes que satildeo inalados bem como por grandes quantidades de ROS
liberadas das ceacutelulas inflamatoacuterias Niacuteveis aumentados de ROS aumentam a
resposta inflamatoacuteria diretamente ou via formaccedilatildeo de produtos da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica levando a um aumento na severidade da doenccedila (KIRKHAM e RAHMAN
2006)
A peroxidaccedilatildeo dos lipiacutedios da membrana celular leva a geraccedilatildeo de
isoprostanos (FIGURA 5) um composto bioativo semelhante agraves prostaglandinas Os
isoprostanos satildeo produzidos independentemente das enzimas ciclooxigenases via
peroxidaccedilatildeo do aacutecido aracdocircnico catalizada por ROS apresentando potente efeito
31
constritor na musculatura lisa respiratoacuteria hiperresponsividade e exsudaccedilatildeo de
plasma nas vias aeacutereas (WOOD et al 2003)
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA ASMA IL INTERLEUCINA TH2 CEacuteLULAS T-HELPER TIPO 2 ROS ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO O2
- AcircNION SUPEROacuteXIDO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO NADPH NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO REDUZIDA NADP NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO SOD SUPEROacuteXIDO DISMUTASE EPO PEROXIDASE EOSINOFIacuteLICA MPO MIELOPEROXIDASE NF FATOR DE TRANSCRICcedilAtildeO NUCLEAR FONTE WOOD et al (2003)
O oacutexido niacutetrico (NO) sintetizado enzimaticamente pela oxidaccedilatildeo do
aminoaacutecido L-arginina para L-citrulina apresenta diversas funccedilotildees fisioloacutegicas nas
vias aeacutereas como o relaxamento da musculatura lisa a regulaccedilatildeo da responsividade
e da permeabilidade das vias aeacutereas e na defesa contra invasores Contudo em
altas concentraccedilotildees o NO apresenta diversos efeitos proacute inflamatoacuterios participando
da infiltraccedilatildeo de ceacutelulas inflamatoacuterias e apresentando efeitos citotoacutexicos sobre
32
diversas ceacutelulas tal como a ceacutelula do epiteacutelio respiratoacuterio especialmente por
interagir com o acircnion superoacutexido formando o peroxinitrito (REDINGTON 2006)
As ceacutelulas inflamatoacuterias recrutadas agraves vias aeacutereas do indiviacuteduo asmaacutetico
apresentam excepcional capacidade de produccedilatildeo de oxidantes Eosinoacutefilos
neutroacutefilos e macroacutefagos bem como ceacutelulas do epiteacutelio respiratoacuterio podem gerar
oxidantes Inicialmente ocorre a formaccedilatildeo de acircnion superoacutexido no complexo
dependente de NADPH oxidase na membrana celular no sistema xantina oxidase
citosoacutelico e na cadeia respiratoacuteria mitocondrial (FIGURA 6) (CARAMORI e PAPI
2004) A seguir a interaccedilatildeo do acircnion superoacutexido com outros oxidantes e o ataque
oxidativo ao tecido pulmonar leva agrave peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e danos ao tecido pulmonar
(MILLS e HIGGINS 1997 KIRKHAM e RAHMAN 2006)
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS FONTE CARAMORI E PAPI (2004)
O estudo do estresse oxidativo na asma se utiliza de modelos que podem
envolver os murinos (MUEHLMANN et al 2009) ou mesmo os cavalos jaacute que estes
naturalmente desenvolvem a ORVA doenccedila respiratoacuteria com diversas similaridades
com a asma humana (DEATON 2006)
33
Nos cavalos com ORVA os marcadores de estresse oxidativo estatildeo
aumentados e diretamente relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e infiltrado
inflamatoacuterio neutrofiacutelico (KIRSCHVINK et al 2008) ao aumento da produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por neutroacutefilos sanguiacuteneos apoacutes a exposiccedilatildeo agrave poeira orgacircnica
ambiental (MARR et al 1997) e ao aumento da secreccedilatildeo de muco apresentando
tambeacutem concentraccedilotildees reduzidas de aacutecido ascoacuterbico no fluido do epiteacutelio respiratoacuterio
(DEATON 2006)
O exerciacutecio fiacutesico por sua vez tambeacutem pode causar estresse oxidativo nas
vias aeacutereas em atletas humanos e em cavalos pela geraccedilatildeo de ROS e RNS (MILLS
e HIGGINS 1997 ART e LEKEUX 2005 KIRSCHVINK et al 2008)
Os cavalos de corrida apresentam a habilidade de aumentar o consumo de
oxigecircnio em 60 vezes durante o esforccedilo maacuteximo o que representa um fator de risco
ao estresse oxidativo nesses animais (ART e LEKEUX 2005)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica eacute o marcador de dano oxidativo poacutes exerciacutecio mais
estudado (DEATON e MARLIN 2003) Em atletas humanos houve aumento da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes a realizaccedilatildeo de ultramaratona (MASTALOUDIS et al
2004) mas o treinamento produziu efeitos beneacuteficos e reduccedilatildeo dos marcadores de
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes um periacuteodo de treinamento (MIYAZAKI et al 2001
BALOG et al 2006) Em cavalos o exerciacutecio submaacuteximo induziu um aumento nos
hidroperoacutexidos lipiacutedicos plasmaacuteticos dentro de 5 minutos apoacutes o teacutermino (DEATON e
MARLIN 2003)
As ROS e seus produtos como os peroacutexidos lipiacutedicos podem diretamente
danificar o tecido pulmonar e causar um incremento da pressatildeo vascular pulmonar
pela liberaccedilatildeo aumentada de mediadores inflamatoacuterios vasoconstrictores (pex
PAF) interferindo na atividade do NO como vasodilatador podendo assim contribuir
na patogecircnese da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) nos cavalos
atletas (MILLS e HIGGINS 1997)
34
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE)
A HPIE eacute caracterizada por hipertensatildeo pulmonar edema nas regiotildees de
troca gasosa ruptura dos capilares pulmonares e a presenccedila de sangue nas vias
aeacutereas (ERICKSON e POOLE 2007) sendo extremamente comum em cavalos de
corrida (PEREZ-MORENO et al 2009)
Tem-se relatado que a HPIE ocorre essencialmente em todos os cavalos
PSI de corrida em treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007) mas
tambeacutem constitui um problema em outras raccedilas de cavalos que realizam exerciacutecio
intenso como os trotadores e os quarto de milha e em cavalos realizando exerciacutecio
de menor intensidade como os cavalos de salto e traccedilatildeo (LAPOINTE et al 1994
ERICKSON e POOLE 2007 VICINO 2007)
O comprometimento ao rendimento desportivo causado pela HPIE natildeo havia
sido comprovado ateacute o estudo de HINCHCLIFF et al (2005a) quando demonstraram
que cavalos de corrida com HPIE grau 1 apresentaram 4 vezes mais possibilidades
de vencer em relaccedilatildeo a graduaccedilotildees mais elevadas de hemorragia
Cavalos PSI de corrida estatildeo sob maior risco de apresentar HPIE porque
apresentam pressatildeo capilar pulmonar mais elevada que cavalos de outras raccedilas e
atividades durante o esforccedilo maacuteximo (HACKETT et al 2003)
Adicionalmente a criaccedilatildeo seletiva de cavalos de corrida visando que sejam
cada vez mais capazes de atingir altas velocidades associado a consumo bastante
alto de oxigecircnio resultou em deacutebito cardiacuteaco substancial (WEST e MATHIEU-
COSTELLO 1994) e barreira alveacuteolo-capilar (BAC) bastante fina (WEST e
MATHIEU-COSTELLO 1999) A espessura meacutedia em micrometros do interstiacutecio da
BAC eacute 0175 plusmn 0010 em coelhos 0318 plusmn 0081 em catildees e 0390 plusmn 002 em
cavalos evidenciando que proporcionalmente a BAC dos cavalos eacute mais fina que a
de outras espeacutecies (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1999) Portanto haacute um dilema
envolvendo a evoluccedilatildeo da BAC dos cavalos Por um lado a necessidade de ser
extremamente fina para uma troca gasosa eficiente enquanto de outro a
necessidade de ser resistente o suficiente para suportar o estresse extremamente
alto na parede dos capilares pulmonares quando a pressatildeo capilar se eleva durante
o exerciacutecio (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
A pressatildeo hidrostaacutetica maacutexima nos capilares pulmonares humanos durante o
exerciacutecio supera 30 mmHg Nos cavalos PSI de corrida a pressatildeo capilar ultrapassa
35
100 mmHg aproximando-se da forccedila necessaacuteria para ocorrer a ruptura do colaacutegeno
que suporta a parede capilar na BAC (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
Quando o estresse na parede capilar se eleva demasiadamente ocorrem
alteraccedilotildees ultra-estruturais na BAC uma condiccedilatildeo conhecida como falecircncia por
estresse descrita em atletas de elite humanos e em cavalos (WEST 2000)
BIRKS et al (1997) demonstraram a falecircncia por estresse e consequumlente
ruptura dos capilares pulmonares em cavalos exercitando a altas velocidades
havendo maior risco de ocorrecircncia da HPIE quando encontraram-se sob importante
aumento da pressatildeo arterial pulmonar (FIGURA 7)
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) A ULTRAESTRUTURA CAPILAR NORMAL B RUPTURA DO ENDOTEacuteLIO CAPILAR (SETAS) COM ERITROacuteCITOS ADJACENTES (ASTERISCO) NOTA-SE TAMBEacuteM ERITROacuteCITOS NO ESPACcedilO ALVEOLAR (PONTAS DE SETAS) C ERITROacuteCITO NO INTERSTIacuteCIO (ASTERISCO) D RUPTURA DO EPITEacuteLIO ALVEOLAR (SETAS) A ALVEacuteOLO C CAPILAR BAR 2 microm FONTE BIRKS et al (1997)
36
Portanto a falecircncia por estresse dos capilares pulmonares eacute a teoria aceita
para a ocorrecircncia da HPIE sendo causada pela elevada pressatildeo transmural nos
capilares pulmonares resultado do aumento da pressatildeo arterial pulmonar somada agrave
pressatildeo pleural inspiratoacuteria negativa (WEST 2000) (FIGURA 8)
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) TTMP TENSAtildeO CIRCUNFERENCIAL OU EM ARCO CAUSADA PELA PRESSAtildeO TRANSMURAL CAPILAR TEL Eacute A TENSAtildeO LONGITUDINAL NOS COMPONENTES DA PAREDE ALVEOLAR ASSOCIADA COM A INFLACcedilAtildeO PULMONAR PARTE DESTA Eacute TRASMITIDA Agrave BAC TST Eacute A TENSAtildeO DE SUPERFIacuteCIE DA CAMADA SUPERFICIAL ALVEOLAR ESTA APARENTEMENTE EXERCE UMA FORCcedilA DE ACcedilAtildeO INTERNA PARA SUPORTAR O CAPILAR QUANDO ESTE INTUMESCE PARA DENTRO DO ESPACcedilO ALVEOLAR A ALTAS PRESSOtildeES TRANSMURAL CAPILARES PALV PRESSAtildeO ALVEOLAR PCAP PRESSAtildeO CAPILAR FONTE WEST (2000)
Diversos estudos estiveram envolvidos em avaliar a participaccedilatildeo do NO no
aumento da pressatildeo arterial pulmonar no cavalo durante o exerciacutecio e na
fisiopatologia da HPIE Inicialmente evidenciou-se que cavalos realizando exerciacutecio
intenso apresentam hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE) (CHRISTLEY
et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 DEMPSEY e WAGNER 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) o que resulta na inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO abolindo o
relaxamento vascular dependente do endoteacutelio (MILLS e HIGGINS 1997)
Portanto acreditou-se que a reduccedilatildeo da produccedilatildeo do NO durante o exerciacutecio
intenso poderia contribuir para a alta incidecircncia de HPIE nos cavalos de corrida
Contudo a administraccedilatildeo do antagonista da oacutexido niacutetrico sintase (NOS) N-nitro-L-
arginina metil ester (L-NAME) mostrou que o NO endoacutegeno resulta numa maior
37
extraccedilatildeo de O2 no repouso e no exerciacutecio submaacuteximo mas natildeo causou alteraccedilatildeo no
exerciacutecio intenso (MANOHAR e GOETZ 1998 MANOHAR et al 2006) A
administraccedilatildeo de L-NAME por KINDIG et al (2000) resultou em agravamento da
HPIE nos cinco animais estudados contudo natildeo observou-se aumento da pressatildeo
arterial pulmonar
MANOHAR e GOETZ (1999) avaliaram os efeitos da infusatildeo intravenosa de
nitroglicerina em cavalos realizando exerciacutecio e natildeo observaram alteraccedilotildees sobre a
incidecircncia ou severidade da HPIE
Adicionalmente KINDIG et al (2001) estudaram os efeitos do exerciacutecio na
pressatildeo arterial pulmonar e na HPIE em cavalos inalando NO Comparados aos
controles o grupo que inalou o NO apresentou uma pequena mas consistente
reduccedilatildeo na pressatildeo arterial pulmonar maacutexima mas com um significativo aumento da
HPIE nesses animais avaliado pelo aumento na contagem do nuacutemero de eritroacutecitos
no LBA Os autores entenderam que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete em
parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou como agravou a HPIE
Portanto em face aos achados relacionados agrave participaccedilatildeo do NO e da NOS
no cavalo em exerciacutecio maacuteximo e na HPIE satildeo necessaacuterias outras investigaccedilotildees a
respeito dos efeitos da inibiccedilatildeo da NOS e da produccedilatildeo do NO na circulaccedilatildeo
pulmonar e na HPIE (KINDIG et al 2000)
Apesar da maior atenccedilatildeo aos efeitos da HPIE e da pressatildeo arterial pulmonar
em cavalos realizando exerciacutecios intensos a HPIE tambeacutem passou a ser
demonstrada em cavalos envolvidos em atividades de menor intensidade sugerindo
que outros mecanismos podem estar envolvidos na fisiopatologia (EPP et al 2006)
VICINO (2007) demonstrou a ocorrecircncia de HPIE em cavalos de salto sendo
que cavalos que participaram de provas na altura entre 130 m ndash 150 m
apresentaram maior incidecircncia que aqueles que saltaram provas entre 100 m ndash 120
m
Neste contexto a associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar jaacute foi
demonstrada anteriormente (McKANE et al 1993 SAacuteNCHEZ et al 2005) Em
concordacircncia o estudo epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) evidenciou
38
uma significativa associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos puro
sangue inglecircs (PSI) jovens durante treinamento para corrida
O processo de hemorragia pulmonar pode culminar em irritaccedilatildeo e inflamaccedilatildeo
das vias aeacutereas o que exacerbaria a doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
(ERICKSON e POOLE 2007) WEST e MATHIEU-COSTELLO (1999) sugerem que
alteraccedilotildees na BAC ativariam vias proacute inflamatoacuterias nas vias aeacutereas com a
participaccedilatildeo de LTB4 Possivelmente a membrana basal alveolar exposta apoacutes a
ruptura ativaria macroacutefagos alveolares sendo que estes satildeo ricos em LTB4
DERKSEN et al (2009) sugeriram uma hipoacutetese para a ocorrecircncia da HPIE
(FIGURA 9) onde a ocorrecircncia das altas pressotildees vasculares pulmonares levaria a
alteraccedilotildees venulares culminando na ruptura capilar sangramento inflamaccedilatildeo e
hemossiderose agravando o quadro da HPIE
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO DERSKEN et al (2009)
Contudo mediadores bem como os mecanismos inflamatoacuterios que estatildeo
envolvidos na fisiopatologia da HPIE ainda precisam ser esclarecidos
O diagnoacutestico da HPIE pode ser feito pela evidecircncia de sangue na traqueacuteia
visiacutevel atraveacutes de exame endoscoacutepico (HINCHCLIFF et al 2005b ERICKSON e
POOLE 2007) pela contagem de eritroacutecitos no LBA (MEYER et al 1998) ou pela
39
presenccedila de hemossideroacutefagos (macroacutefagos contendo hemossiderina ou eritroacutecitos)
no AT (EPPINGER 1990 MICHELOTTO JUacuteNIOR et al 2007) eou no LBA
(DOUCET e VIEL 2002 SAacuteNCHEZ et al 2005 BIAVA et al 2006) realizado uma
hora apoacutes o exerciacutecio A presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA eacute considerada a
forma mais sensiacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993)
Em resumo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas acompanhada de
hiperresponsividade e hipersecreccedilatildeo de muco denominada doenccedila inflamatoacuteria das
vias aeacutereas (DIVA) bem como a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) satildeo causas de enormes perdas econocircmicas e de queda de rendimento
desportivo interrupccedilatildeo nos treinamentos e de encerramento de campanha em
cavalos de corrida Apesar disso a maioria dos estudos sobre as doenccedilas
inflamatoacuterias das vias aeacutereas dos cavalos satildeo direcionados para a ORVA e a
fisiopatologia da DIVA ainda estaacute pouco esclarecida bem como os mecanismos
inflamatoacuterios da HPIE ainda precisam ser mais bem estudados
Tendo-se em vista estes aspectos a hipoacutetese levantada no presente estudo
foi de que o desafio ambiental e o exerciacutecio fiacutesico estejam acompanhados de
estresse oxidativo alterando o quadro inflamatoacuterio possivelmente por alterar a
produccedilatildeo de PAF no pulmatildeo com consequumlente alteraccedilatildeo da funcionalidade celular
e que a hemorragia pulmonar pode exercer influecircncia sobre essa situaccedilatildeo As
ceacutelulas estudadas foram os macroacutefagos alveolares os quais podem apresentar um
papel central na regulaccedilatildeo deste processo
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVOS GERAIS
Verificar alteraccedilotildees em paracircmetros cliacutenicos e inflamatoacuterios pulmonares em
cavalos puro sangue inglecircs (PSI) de corrida jovem submetidos ao desafio ambiental
e ao treinamento fiacutesico
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Avaliar os seguintes paracircmetros cliacutenicos e laboratoriais
- Avaliaccedilatildeo cliacutenica
- Avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas
- Avaliaccedilatildeo citoloacutegica das vias aeacutereas atraveacutes das teacutecnicas de aspirado
traqueal (AT) e de lavado broncoalveolar (LBA)
- Avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas
e a produccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos e nitritos no LBA
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por macroacutefagos alveolares
bem como a capacidade fagocitaacuteria e de adesatildeo
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por neutroacutefilos do sangue
perifeacuterico bem como a capacidade fagocitaacuteria
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 REAGENTES E SEDATIVOS
O BN52021 (Gingkolide B) foi obtido da Biomol (Plymouth Meeting PA USA)
Fura-2 AM (cat num F-0888) PAF (β-Acetyl-γ-O-hexadecyl-L-α-
phosphatidylcholine P-4904) foram obtidos da Sigma (St Louis MO USA) A
coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacuteticoreg) foi obtida da Laborclin (Pinhais PR Brasil) e
a acepromazina da Univet (Satildeo Paulo SP Brasil) A xylazina e o butorphanol foram
obtidos do laboratoacuterio Fort Dodge (Satildeo Paulo SP Brasil) Todos os demais
reagentes foram comprados da Sigma (St Louis MO USA)
32 ANIMAIS
Foram utilizados equinos machos adultos jovens (potros) da raccedila puro sangue
inglecircs (PSI) de cinco diferentes criatoacuterios (haras) da regiatildeo metropolitana de Curitiba
estado do Paranaacute (Haras Cifra e Haras dos Girassoacuteis em Piraquara Haras
Palmerini e Haras Belmont em Satildeo Joseacute dos Pinhais e Haras Santa Rita da Serra
em Tijucas do Sul e potros de quatro diferentes cocheiras no Jockey Club do
Paranaacute (Av Viacutector Ferreira do Amaral 2291 Tarumatilde Curitiba PR)
Inicialmente os potros foram divididos em trecircs grupos O primeiro grupo foi
denominado grupo condiccedilotildees naturais (CN n=45) compreendendo os potros dos
haras vivendo soltos em piquetes dia e noite alimentando-se de gramiacuteneas e
leguminosas da pastagem mais complemento peletizado fornecido no campo A
meacutedia de idade dos animais deste grupo foi de 145 plusmn 04 meses O segundo grupo
foi denominado grupo desafio ambiental (DA n=45) constituiacutedo por potros
estabulados por 30 dias com o propoacutesito de preparaacute-los para o iniacutecio de treinamento
Estes animais eram mantidos em grupos de 15 a 20 potros sendo que permaneciam
em baias individuais com dimensotildees de 35m x 35m x 35m em meacutedia em cama de
serragem e alimentados duas vezes ao dia com aveia mais raccedilatildeo peletizada e feno
de gramiacutenea e de alfafa A meacutedia de idade dos potros do grupo DA foi de 217 plusmn 29
meses O terceiro grupo foi denominado de grupo exerciacutecio (EX n=34) onde foram
incluiacutedos potros ineacuteditos (satildeo considerados ineacuteditos animais que ainda natildeo correram
42
em hipoacutedromos oficiais) mas que estavam em treinamento para corrida haacute
aproximadamente cinco meses e mantidos nas mesmas condiccedilotildees de estabulaccedilatildeo e
alimentaccedilatildeo que os potros do grupo DA Estes animais foram acompanhados
durante o periacuteodo de treinamento sendo que a avaliaccedilatildeo cliacutenica endoscoacutepica e a
colheita de LBA ocorreu 24 horas apoacutes seu primeiro exerciacutecio intenso (15 ms ndash 16
ms) em 800m ndash 1000m de distacircncia na pista de areia do Jockey Club do Paranaacute A
meacutedia de idade dos potros do grupo EX foi de 270 plusmn 03 meses
A obtenccedilatildeo de dados para o presente trabalho de pesquisa ocorreu durante
uma sequumlecircncia de experimentos independentes durante um periacuteodo de 18 meses
Durante este periacuteodo grupos de potros foram acompanhados ateacute se encontrarem
nas condiccedilotildees estabelecidas para cada grupo quando entatildeo foram avaliados As
amostras do grupo CN foram obtidas de oito diferentes experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois durante o inverno trecircs durante a primavera e um no outono
As amostras do grupo DA foram provenientes de seis experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois no inverno e dois no outono e para o grupo EX os resultados
advieram de amostras obtidas durante o veratildeo em cinco ocasiotildees e durante a
primavera em quatro totalizando nove experimentos independentes para este grupo
Os resultados apresentados para cada uma das anaacutelises provecircm de pelo menos
trecircs experimentos independentes
Todos os animais estudados eram pertencentes a estabelecimentos com
programa de desverminaccedilatildeo bimensal bem como foram todos vacinados
regularmente contra Influenza Equina e Herpes Viacuterus Equino tipos 1 e 4 A
alimentaccedilatildeo utilizada nos estabelecimentos que cederam os potros para o estudo
era similar bem como a anaacutelise da alimentaccedilatildeo utilizada para os potros dos trecircs
grupos natildeo diferiu no que se refere a constituintes essenciais que poderiam
influenciar nas avaliaccedilotildees realizadas no presente trabalho Os criteacuterios de inclusatildeo
para os potros dos trecircs grupos foram os estabelecidos e jaacute descritos previamente
nas caracteriacutesticas de cada grupo e a exclusatildeo do estudo ocorreu quando da
histoacuteria de doenccedila recente ou diferenccedilas em manejo
As comparaccedilotildees intergrupos foram feitas entre os grupos CN e DA (diferenccedila
ambiental) e entre os grupos DA e EX (diferenccedila no regime de exerciacutecio)
Na segunda etapa do trabalho dedicada ao estudo da hemorragia pulmonar
induzida pelo exerciacutecio (HPIE) avaliou-se somente os potros do grupo EX agora
com n=37 Este grupo foi dividido em subgrupos sendo o subgrupo HPIE pos (n=23
43
constituiacutedo por potros com qualquer percentual de hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo
citoloacutegica do LBA) e subgrupo HPIE neg (n=14 constituiacutedo por potros sem
hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA) Nesta etapa as comparaccedilotildees
realizadas foram entre os subgrupos HPIE pos e HPIE neg
33 ASPECTOS EacuteTICOS
Este trabalho de pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Experimentaccedilatildeo Animal (CEEA) do setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR sob o
nuacutemero de registro 168 e pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso de Animais (CEUA) da
Pontifiacutecia Universidade Catoacutelica do Paranaacute sob o nuacutemero de registro 129 e estaacute de
acordo com o Guiding Principles in the Care and Use of Animals
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA
Preacutevio agrave colheita de material procedeu-se a avaliaccedilatildeo cliacutenica de cada potro
iniciada pela histoacuteria incluindo possiacuteveis ocorrecircncias meacutedicas relevantes agrave sauacutede do
sistema respiratoacuterio manejo alimentaccedilatildeo desverminaccedilatildeo e vacinaccedilatildeo Na histoacuteria
incluiu-se tambeacutem a informaccedilatildeo sobre a ocorrecircncia de tosse espontacircnea quando em
piquetes na baia no momento da alimentaccedilatildeo ou durante o treinamento O exame
fiacutesico incluiu a observaccedilatildeo da presenccedila de secreccedilatildeo nasal estiacutemulo da tosse
palpaccedilatildeo de linfonodos submandibulares e retrofaringeanos auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e
auscultaccedilatildeo traqueal e pulmonar (McGORUM e DIXON 2007)
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS
A avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas foi realizada previamente a
realizaccedilatildeo do LBA com o animal tranquumlilizado atraveacutes da administraccedilatildeo de
acepromazina (acepran 1 Univet) (003 mgkg IM) e apoacutes 30 minutos seguindo-
se a administraccedilatildeo de xilazina (sedazine Fort Dodge) (03-05 mgkg IV) mais
butorfanol (torbugesic Fort Dodge) (005 mgkg IV) (HOFFMAN 1999 HEWSON e
VIEL 2002) Utilizou-se um fibroscoacutepio flexiacutevel Pentax de 170 cm de comprimento e
128 mm de diacircmetro para a avaliaccedilatildeo das vias aeacutereas superiores e inferiores ateacute a
bifurcaccedilatildeo da traqueacuteia
44
A presenccedila de foliacuteculos linfoacuteides na faringe foi graduada segundo RAKER e
BOWLES (1978) adotando-se a graduaccedilatildeo de I a IV (QUADRO 1) e graus III e IV
foram considerados como faringite
A movimentaccedilatildeo das cartilagens aritenoacuteides foi graduada de I a IV segundo
RACKESTRAW et al (1991) (QUADRO 2) e graus III e IV foram considerados como
anormais
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Faringe com poucos foliacuteculos claros na parede dorsal
Grau II Presenccedila de numerosos pequenos foliacuteculos juntamente a
hiperemia cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau III Presenccedila de grandes grupos de foliacuteculos hiperecircmicos
cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau IV Presenccedila de foliacuteculos grandes edematosos e hiperecircmicos
por toda a mucosa faringeana
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA FARINGE FONTE RAKER E BOWLES (1978)
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Movimentaccedilatildeo sincrocircnica e abduccedilatildeo completa das
cartilagens aritenoacuteides
Grau II Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo com abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) conseguida com a degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
Grau III Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo e a abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) natildeo eacute conseguida na degluticcedilatildeo nem na
oclusatildeo nasal
Grau IV
(Hemiplegia
Laringeana)
Cartilagem aritenoacuteide esquerda posicionada
medialmente na glote e natildeo apresenta movimento
quando da degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE I A IV FONTE RACKESTRAW et al (1991)
45
Especial interesse foi dado agrave presenccedila de muco no lume traqueal e sua
quantificaccedilatildeo atraveacutes de graduaccedilatildeo de 0 a 5 conforme GERBER et al (2004)
(FIGURA 10)
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME ENDOSCOacutePICO FONTE GERBER et al 2004
Quando da observaccedilatildeo de muco traqueal este foi aspirado atraveacutes de tubo
de silicone introduzido pelo canal de trabalho do endoscoacutepio sendo imediatamente
transferido para uma lacircmina de microscopia e deixado para secar ao ar As lacircminas
foram coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico Laborclin Pinhais PR
Brasil) e 500 ceacutelulas foram contadas em aumento de 1000X (HODGSON e
HODGSON 2003)
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o aspirado traqueal (AT)
contendo lt10 de linfoacutecitos lt1 de eosinoacutefilos e lt20 de neutroacutefilos (ROBINSON
2003 HODGSON e HODGSON 2007)
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)
Para a realizaccedilatildeo do LBA foi utilizado um cateter flexiacutevel de silicone
especiacutefico para a obtenccedilatildeo de LBA de equinos marca Cook (V-PBAL-300 Cook Vet
Products Hamburg Alemanha) de 300 cm de comprimento e 8 mm de diacircmetro
Este foi introduzido agraves cegas via nasotraqueal preferencialmente do lado direito ateacute
se alojar em um brocircnquio quando o cuff na extremidade distal era inflado com 5-10
mL de ar Utilizou-se 300 mL de soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada (PBS) esteacuteril e
com heparina soacutedica (5 UImL de PBS) preacute-aquecidos a 37oC (HOFFMAN 1999
PICKLES et al 2002abc MORI et al 2003 RIIHIMAumlKI et al 2008b) O PBS era
infundido em aliacutequotas de 120 mL (HEWSON e VIEL 2002) aspirando-se
46
gentilmente apoacutes cada aliacutequota e dispensando-se o LBA recolhido em frascos
plaacutesticos esteacutereis mantidos em isopor com gelo Este procedimento foi repetido ateacute
que o volume de 300 mL era totalmente empregado O material recolhido foi mantido
refrigerado em isopor com gelo ateacute a chegada ao Laboratoacuterio de Metabolismo
Celular no Departamento de Fisiologia do Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR
para o processamento em menos de 3 horas apoacutes a colheita (PICKLES et al 2002c
VIEL e HEWSON 2003)
No laboratoacuterio o LBA era centrifugado a 340g (1300 rpm) por seis minutos a
40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA) e o pellet obtido foi
ressuspendido em 2 mL de PBS para a contagem do nuacutemero total de ceacutelulas
nucleadas (NTCN)
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA
A contagem do NTCN foi realizada usando-se a cacircmara de Neubauer Uma
aliacutequota da suspensatildeo de ceacutelulas foi diluiacuteda 110 em PBS em um frasco de
centrifugaccedilatildeo de 15 mL de fundo cocircnico (Eppendorf) Desta uma aliacutequota de 50 microL
foi misturada a 50 microL do corante vital Azul de Tripan para a contagem das ceacutelulas
vivas A partir do nuacutemero de ceacutelulas vivas por mililitro da suspensatildeo de ceacutelulas a
concentraccedilatildeo da suspensatildeo de ceacutelulas foi ajustada para 5 x 106 ceacutelulasmL para as
avaliaccedilotildees da atividade de macroacutefago alveolar (fagocitose produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e adesatildeo ndash ver toacutepicos 315 316
317 e 318)
Para a avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA lacircminas para microscopia
foram preparadas a partir de 10 μL da suspensatildeo de ceacutelulas distribuiacutedos de forma
circular sobre a lacircmina secadas ao ar e coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski
(Panoacutetico Laborclin Pinhais PR Brasil) (HEWSON e VIEL 2002) e 500 ceacutelulas
foram contadas em aumento de 1000X
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o LBA contendo em meacutedia
60 de macroacutefagos 35 de linfoacutecitos lt5 de neutroacutefilos lt2 de mastoacutecitos lt1
de eosinoacutefilos (ROBINSON 2003 MAZAN e HOFFMAN 2003 RICHARD et al
2009)
47
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957)
Uma porccedilatildeo correspondente a 90 mg de pellet de ceacutelulas do LBA foi
ressuspendido em um solvente extrator (metanolclorofoacutermio12 volvol) na
quantidade de 18 mL e sonicado (6 ciclos de 4 segundos) Os tubos foram
deixados em gelo por 20 minutos
Na etapa seguinte mais metanol foi adicionado (324 microL o caacutelculo eacute a
quantidade de sovente extrator x 0180 resultando na quantidade de metanol em
mililitros) para reduzir a densidade do liacutequido e possibilitar assim a decantaccedilatildeo do
material particulado insoluacutevel no meio Apoacutes o material foi centrifugado a 5000g por
10 minutos a 40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
O sobrenadante foi transferido para tubos de vidro e clorofoacutermio foi
adicionado (648 microL ou seja o dobro da quantidade de metanol utilizada
anteriormente)
Na sequumlecircncia o extrato foi lavado uma vez com 19 mL de aacutegua ultra pura O
sistema bifaacutesico formado foi submetido a uma intensa agitaccedilatildeo ateacute natildeo serem mais
distinguiacuteveis as duas fases (forma-se momentaneamente uma emulsatildeo) Nesta
etapa substacircncias com maior afinidade agrave aacutegua do que ao solvente orgacircnico satildeo
solubilizadas no meio aquoso e portanto se separam dos lipiacutedios
Apoacutes a reconstituiccedilatildeo espontacircnea do sistema bifaacutesico o sobrenadante
(aquoso) foi removido com o auxiacutelio de uma micropipeta cuidando-se para natildeo
retirar o que se encontrava abaixo
Em seguida foi adicionado o FSP (CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM NaCl 497
mM clorofoacutermio 30 metanol 490 aacutegua ultra pura 480) lentamente (para
evitar a formaccedilatildeo de emulsatildeo) e de maneira que as paredes do tubo fossem lavadas
com esta soluccedilatildeo Apoacutes a remoccedilatildeo do sobrenadante este procedimento foi repetido
mais duas vezes
A mistura de clorofoacutermio e metanol na qual estavam dissolvidos os lipiacutedios
foi evaporada em banho-maria a 370C sob corrente de nitrogecircnio O extrato lipiacutedico
seco foi armazenado a -800C em atmosfera de nitrogecircnio Para a determinaccedilatildeo da
bioatividade de PAF (toacutepico 310) esses extratos foram solubilizados em 100 microL de
DMSO sob agitaccedilatildeo intensa
48
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS
O sangue de cavalo foi colhido em bolsas de transfusatildeo (CPDA-1 JP
Induacutestria Farmacecircutica SA Satildeo Paulo Brasil) atraveacutes de punccedilatildeo venosa jugular
O sangue foi diluiacutedo 11 (vv) em PBS e 40 mL do sangue diluiacutedo foram
adicionados a tubos para centriacutefuga esteacutereis (tubos Falcon de 50 mL) sobre 8 mL de
Ficoll Paque Plus e centrifugado (400g por 40 minutos a 40C) para o isolamento das
ceacutelulas PMN por gradiente
Apoacutes a centrifugaccedilatildeo a camada superior composta por plasma soluccedilatildeo de
Ficoll e ceacutelulas mononucleares foi descartada A camada inferior composta
principalmente por PMNs e eritroacutecitos foi dividida em duas aliacutequotas iguais as quais
foram separadas em dois tubos para centriacutefuga A cada aliacutequota foi adicionada
soluccedilatildeo hemoliacutetica (NH4Cl 077 tris[hydroxymethyl]aminomethane 021 pH 74
soluccedilatildeo aquosa) para completar 50 mL e incubadas por 20 minutos a 370C em
estufa
A seguir a suspensatildeo celular livre dos eritroacutecitos foi centrifugada (400g 6
min 4oC) O sobrenadante foi descartado e o pellet de ceacutelulas (basicamente PMNs)
foi ressuspendido em 5 mL de PBS contendo glucose 5 mM A densidade de ceacutelulas
foi determinada em cacircmara de Neubauer e ajustada para 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL
A viabilidade celular foi determinada atraveacutes do corante vital Azul de Tripan e
resultou aproximadamente 95 A percentagem de neutroacutefilos na suspensatildeo de
PMNs foi superior a 90 determinada pela coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico
Laborclin Pinhais PR Brasil)
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE Ca++ EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE et al 2001)
Agrave suspensatildeo de PMNs (toacutepico 39) na densidade de 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL foi adicionado FURA-2 AM (Sigma soluccedilatildeo estoque 1 nM em DMSO)
para concentraccedilatildeo final de 1 microM A suspensatildeo foi incubada em ambiente escuro a
37oC por 45 minutos
Nesta etapa os PMNs incorporaram o FURA-2 AM um indicador fluorescente
de caacutelcio Quando o FURA-2 AM estaacute ligado ao Ca++ haacute reduccedilatildeo da eficiecircncia de
49
excitaccedilatildeo a 380 nm e aumento da eficiecircncia de excitaccedilatildeo a 340 nm observados no
comprimento de onda de emissatildeo de 510 nm Com isso eacute possiacutevel quantificar a
concentraccedilatildeo de Ca++ intracelular nas ceacutelulas carregadas com FURA-2 AM atraveacutes
da relaccedilatildeo da intensidade de emissatildeo a 510 nm entre os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo de 340 nm e de 380 nm (relaccedilatildeo 340380 nm)
Apoacutes a incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram lavadas duas vezes com soluccedilatildeo de
Ringer (NaCl 1425 mM KCl 40 mM CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM 50 mM 4-(2-
hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid glicose 50 mM pH 74 soluccedilatildeo
aquosa) para a remoccedilatildeo do FURA-2 AM que natildeo foi incorporado agraves ceacutelulas
As ceacutelulas entatildeo foram ressuspendidas em soluccedilatildeo de Ringer para uma
concentraccedilatildeo final de 225 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL Esta foi a preparaccedilatildeo utilizada
na leitura de fluorescecircncia
A suspensatildeo de ceacutelulas foi mantida em gelo ateacute a sua utilizaccedilatildeo Aliacutequotas de
2 mL eram previamente incubadas em banho-maria por 4 minutos a 37oC no escuro
(tubo envolto em papel alumiacutenio) previamente a serem transferidas para uma cubeta
para a leitura da fluorescecircncia em espectrofluoriacutemetro acoplado a um
microcomputador (RF5301PC Shimadzu Kyoto Japatildeo) controlado pelo software
Super Ion Probe (Shimadzu Kyoto Japatildeo) Durante esta incubaccedilatildeo as ceacutelulas que
seriam utilizadas como controle negativo para PAF foram tratadas com antagonista
de receptor de PAF BN52021 (Biomol soluccedilatildeo 10 mM em DMSO)
Foi utilizada excitaccedilatildeo dual com comprimentos de onda 340 nm e 380 nm
(janela de leitura de 2 segundos) com emissatildeo registrada a 510 nm A temperatura
foi mantida em 37oC pelo sistema termostatisado do aparelho A leitura da
fluorescecircncia consistiu primeiramente da obtenccedilatildeo de uma linha de base nos
primeiros 50 segundos Apoacutes esta leitura inicial foram adicionados 10 microL do extrato
lipiacutedico (toacutepico 38) agrave suspensatildeo de ceacutelulas seguindo-se a agitaccedilatildeo (por 3
segundos) com uma barra magneacutetica presente dentro da cubeta A leitura foi feita
entatildeo por mais 100 segundos
Para cada amostra foram realizados os procedimentos descritos na presenccedila
e na ausecircncia de BN52021 A resposta maacutexima obtida pelo tratamento da
suspensatildeo de PMNs com extrato lipiacutedico na presenccedila de BN52021 foi subtraiacuteda da
resposta maacutexima obtida na ausecircncia deste antagonista O resultado desta subtraccedilatildeo
foi utilizado como indicador semiquantitativo da bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico e os resultados foram expressos como relaccedilatildeo 340380 nm
50
Antes de analisar as amostras de extrato lipiacutedico para a bioatividade de PAF
a cada experimento a suspensatildeo de PMNs tratada com FURA-2 AM foi testada com
PAF (1-0-palmitil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina soluccedilatildeo estoque de 3 mM em
DMSO da Sigma) nas concentraccedilotildees de 1 10 e 100 nM e com 100 nM na presenccedila
de 150 microM de BN52021 (concentraccedilatildeo suficiente para antagonizar 102 nM de PAF)
A resposta dos PMNs de equinos aos padrotildees de PAF eacute mostrada na FIGURA 11
sendo representativa dos dados obtidos em todos os experimentos
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO REGISTRADA A 510 nm () SUSPENSAtildeO DE PMN () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 1 nM (diams) SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 10 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 100 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + BN52021 150 microM + PAF 100 nM A EMISSAtildeO BASAL DAS CEacuteLULAS PMN FOI REGISTRADA POR 50 SEGUNDOS PREVIAMENTE Agrave ADICcedilAtildeO DE PAF
Os PMNs do sangue de equinos foram utilizados no presente estudo como
uma ferramenta para a avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF (pelo influxo de Ca++ nos
PMNs induzido por PAF) Para a determinaccedilatildeo da viabilidade desta ferramenta
estudou-se a resposta dos PMNs do sangue de equino a diferentes concentraccedilotildees
de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na ausecircncia do antagonista de
PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose de neutroacutefilos e a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio por neutroacutefilos pelas teacutecnicas descritas
51
abaixo (ver toacutepicos 315 ndash fagocitose de macroacutefago alveolar 316 ndash produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar e 317 ndash produccedilatildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio por macroacutefago alveolar) sendo que para cada ensaio foram realizadas
quatro repeticcedilotildees Igualmente estudou-se a resposta do macroacutefago alveolar a
diferentes concentraccedilotildees de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na
ausecircncia do antagonista de PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose e a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem realizando-se quatro
repeticcedilotildees para cada anaacutelise
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)
Em microplaca de 96 poccedilos 250microL de reagente de Bradford (100mg de
Coomassie Blue 50 mL de etanol 95 + 100 mL de aacutecido fosfoacuterico 85 completar
com aacutegua ultra pura para 1000 mL) foi adicionado a 10 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA) Nesta etapa o
corante Comassie eacute complexado por proteiacutenas presentes na amostra o que muda a
sua cor
Apoacutes 5 minutos em temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada a
595 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-Rad
Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) A concentraccedilatildeo de proteiacutenas foi determinada
interpolando-se os valores de absorbacircncia numa curva padratildeo resultante de
concentraccedilotildees conhecidas de albumina seacuterica bovina (Sigma) Os resultados foram
expressos como miligramas de proteiacutenas por mililitro de LBA
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR e MARLETTA 1985)
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA foi utilizada como indicador da produccedilatildeo de
oacutexido niacutetrico na regiatildeo broncoalveolar
Em micro placa de 96 poccedilos adicionou-se 100 microL de reagente de Griess
(mistura de cloreto de naftiletilenodiamina a 005 e por sulfanilamida a 05 em
meio aacutecido proporcionado por H3PO4 a 25) a 100 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA)
52
A sulfanilamida (um derivado de anilina) reage com o aacutecido nitroso e apoacutes
rearranjos intramoleculares forma o iacuteon diazocircnio Apoacutes o iacuteon diazocircnio reage com a
naftiletilenodiamina (um derivado de naftilamina) para formar pigmento roacuteseo
Depois de 5 minutos na temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada
a 550 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-
Rad Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) Os resultados foram expressos como
absorbacircncia a 550 nm
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO
LBA (NOUROOZ-ZADEH et al 1994)
Utilizou-se uma aliacutequota de suspensatildeo de ceacutelulas de LBA na densidade de
15 x 106 ceacutelulasmL de LBA Esta foi ultrasonicada (6 ciclos de 4 segundos) em 1mL
de metanol sendo centrifugada em seguida a 5000g por 5 minutos a 40C
(Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
Uma aliacutequota de 50 microL de sobrenadante foi armazenada para posterior
mensuraccedilatildeo da concentraccedilatildeo total de proteiacutenas
Para cada amostra aliacutequotas de 90 microL foram depositadas em seis frascos
para centriacutefuga (de 15 mL Eppendorf) foi agitada no voacutertex e incubada por 30
minutos a temperatura ambiente A trecircs desses tubos foram adicionados 10 microL de
soluccedilatildeo metanoacutelica de trifenilfosfina (TPP Sigma) 10 mM para ocorrer a reduccedilatildeo
seletiva de hidroperoacutexidos (os grupamentos hidroperoacutexido especificamente os
presentes em lipiacutedios satildeo convertidos a grupamentos hidroxila pela trifenilfosfina)
As amostras contidas nos trecircs tubos restantes receberam apenas 10 microL de metanol
Todos os tubos foram agitados vigorosamente e entatildeo incubados em temperatura
ambiente por 30 minutos
Apoacutes adicionou-se a todos os tubos 900 microL de reagente de FOX2 Este
reagente deve ser preparado no momento do uso consistindo de xilenol laranja 100
microM hidroxitolueno butilado (BHT) 400 mM aacutecido sulfuacuterico 25 mM e sulfato ferroso
de amocircnio 250 microM em metanol 90 (vv em aacutegua) Apoacutes agitaccedilatildeo o meio
reacional foi incubado por mais 30 minutos a temperatura ambiente
Nesta etapa os caacutetions ferrosos (Fe2+) do reativo de FOX2 satildeo oxidados por
hidroperoacutexidos presentes na amostra (tanto pelos hidroperoacutexidos lipiacutedicos quanto
por outros tipos de hidroperoacutexidos presentes na amostra) Como todos os
53
hidroperoacutexidos lipiacutedicos das amostras tratadas com TPP foram reduzidos a
produccedilatildeo de Fe3+ seraacute menor nestas do que nas amostras natildeo tratadas com TPP
O Fe3+ formado eacute entatildeo quelado pelo xilenol laranja o que faz a cor deste
indicador passar de laranja a azul-puacuterpura (passa a absorver luz em 560 nm)
Passado o tempo de incubaccedilatildeo a absorbacircncia foi mensurada a 560 nm
utilizando-se um espectrofotocircmetro (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil
Satildeo Paulo)
Subtraiu-se entatildeo o valor da absorbacircncia das amostras tratadas com TPP
(sem hidroperoacutexidos lipiacutedicos) do valor da absorbacircncia das amostras sem TPP O
valor obtido nessa subtraccedilatildeo (referente apenas agrave quantidade de ferro oxidado por
hidroperoacutexidos lipiacutedicos) foi utilizado na foacutermula da curva padratildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio obtida com soluccedilotildees padratildeo de diferentes concentraccedilotildees (1000 500
250 125 62 31 e 16 microM) submetidas aos mesmos procedimentos descritos
acima para a dosagem de hidroperoacutexidos (com exceccedilatildeo ao tratamento com TPP) O
resultado obtido foi referente agrave concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos
Dividiu-se o valor da concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos pela
concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais do extrato metanoacutelico Os resultados foram
expressos como nmolesmg de proteiacutenas
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984)
Utilizou-se 300 microL de uma suspensatildeo de ceacutelulas de LBA em PBS na
densidade de 5 x 106 ceacutelulasmL que foram centrifugados (10600g por 20min a
4oC) para remoccedilatildeo de partiacuteculas
Apoacutes foi colocada em banho com gelo Uma aliacutequota de 10 microL desse extrato
de ceacutelulas foi adicionada a 990 microL de meio reativo (soluccedilatildeo aquosa de H2O2 20 mM
tris[hidroximetil] aminometano 005M e EDTA 025 mM pH 74)
Imediatamente utilizando-se um espectrofotocircmetro acoplado a um
microcomputador (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil Satildeo Paulo)
monitorou-se a absorbacircncia a 220 nm por 90 segundos a 370C com intervalos de 2
segundos entre leituras consecutivas
A degradaccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio pela catalase causa uma diminuiccedilatildeo
gradual na absorbacircncia do meio reativo a 220 nm a qual indica a atividade da
catalase no extrato de ceacutelulas Os valores de atividade da catalase foram corrigidos
54
pela concentraccedilatildeo de proteiacutenas do extrato de ceacutelulas (realizado conforme descrito
no toacutepico 311) e foram expressos como micromoles de H2O2minmg proteiacutenas
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA et al 1998)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL (= 5 x 105
ceacutelulaspoccedilo) e os macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A
suspensatildeo de ceacutelulas na densidade descrita foi obtida durante o processamento do
LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS e foram adicionados
20microL de zymosan corado com vermelho neutro (67 mgmL) mais 100 microL de PBS
sendo deixados a temperatura ambiente por 30 minutos
Em seguida depois de descartado o sobrenadante as ceacutelulas foram fixadas
com soluccedilatildeo de Baker (4 formaldeiacutedo 2 cloreto de soacutedio 1 acetato de caacutelcio
soluccedilatildeo aquosa) por 30 minutos
Apoacutes os poccedilos foram lavados com PBS para que o zymosan corado com
vermelho neutro natildeo fagocitado por macroacutefagos alveolares fosse retirado
Em seguida o corante vermelho neutro foi solubilizado em cada poccedilo com
200microL de soluccedilatildeo aacutecido-aacutelcool (aacutecido aceacutetico 1 etanol 50 soluccedilatildeo aquosa) e
deixado por 30 minutos
Apoacutes este periacuteodo a absorbacircncia foi mensurada a 550 nm Os resultados
foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 -
Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA et al 1998)
Estimou-se a produccedilatildeo de acircnions pela da formaccedilatildeo de formazan produto da
reduccedilatildeo do NBT (nitroblue tetrazolium) pelo acircnion superoacutexido Avaliou-se a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA
(phorbol myristate acetate) O PMA estimula o complexo NADPH oxidase na
membrana dos fagoacutecitos a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
55
mimetizando o resultado da fagocitose de um microorganismo (DEKKER et al
2000)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para a retirada das
ceacutelulas natildeo aderentes Em seguida adicionou-se a cada poccedilo 100 microL de PBS com
NBT 02 ou com NBT 02 mais PMA 11microM sempre em triplicatas para cada
potro
Apoacutes a incubaccedilatildeo por 1 hora a 370C e em ambiente escuro (a placa deve
estar envolta em papel alumiacutenio) a placa foi centrifugada (800g por 5 minutos a
40C) Em seguida o sobrenadante foi descartado e 100 microL de PBS foram
adicionados a cada poccedilo e a placa foi novamente centrifugada
Apoacutes o sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram fixadas com metanol
por 10 minutos Em seguida a placa passou por nova centrifugaccedilatildeo o sobrenadante
foi descartado e a placa foi deixada secar ao ar em estufa
Em seguida a placa foi lavada duas vezes com metanol 50 e o formazan
(produto da reaccedilatildeo entre o NBT e o acircnion superoacutexido) foi solubilizado atraveacutes da
incubaccedilatildeo por 30 minutos com 120 microL soluccedilatildeo aquosa de hidroacutexido de potaacutessio 2M
e 140 microL de dimetilsulfoacutexido por poccedilo
A absorbacircncia foi lida a 595 nm e os resultados foram corrigidos pela adesatildeo
de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago
Alveolar)
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK e MIZEL 1981)
Mensurou-se a produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) por macroacutefago
alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA atraveacutes da oxidaccedilatildeo do vermelho
fenol pela peroxidase onde esta enzima utiliza nesta reaccedilatildeo o H2O2 O composto
oxidado absorve luz em pH baacutesico com maacutexima intensidade em 550 nm
56
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS observando-se a retirada
de grumos presentes nos poccedilos Em seguida 100 microL de soluccedilatildeo de vermelho fenol
(PRS phenol red solution 140 mM NaCl 10 mM fosfato de potaacutessio 55 mM
dextrose 056 mM vermelho fenol 19 UmL de HRPO horse radish peroxidase pH
70 soluccedilatildeo aquosa) ou soluccedilatildeo de vermelho fenol + PMA 110nM foram adicionados
a cada poccedilo em triplicatas e deixados incubar por 1 hora a 370C no escuro
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo adicionou-se 10 microL de NaOH 1N para
interromper a reaccedilatildeo alcalinizar o meio e permitir a absorbacircncia da soluccedilatildeo que foi
lida a 595 nm apoacutes 30 minutos
Os resultados foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada
potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN e GORDON 1987)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para se selecionar as
ceacutelulas aderentes que a seguir foram fixadas com metanol 50 por 10 minutos
Apoacutes este periacuteodo o sobrenadante foi descartado e 100 microL de corante de
Giemsa a 02 foram adicionados a cada poccedilo e deixados por 40 minutos em
temperatura ambiente
Os poccedilos foram novamente lavados com PBS por duas vezes observando-se
a retirada de grumos nos poccedilos e 200 microL de metanol 50 foram adicionados
Apoacutes 30 minutos a absorbacircncia da suspensatildeo foi lida a 550 nm
A adesatildeo resultou menor no grupo DA (n=17) em comparaccedilatildeo ao grupo CN
(n=36) (P=0010) sendo que o grupo EX (n=26) apresentou adesatildeo maior que o
grupo DA (P=0001) (FIGURA 12) indicando diferenccedilas na capacidade de adesatildeo
em placa acriacutelica possivelmente devido a diferenccedilas no estado funcional das ceacutelulas
57
de cada grupo Por esta razatildeo utilizou-se o ensaio de adesatildeo de macroacutefago
alveolar realizado concomitantemente aos ensaios de funccedilatildeo de macroacutefago
(fagocitose e produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) a cada
experimento realizado durante o estudo A correccedilatildeo dos valores obtidos de
macroacutefago em funccedilatildeo da adesatildeo foi feito atraveacutes da divisatildeo da meacutedia final obtida
para o ensaio de funccedilatildeo de macroacutefago dividido pela meacutedia obtida no ensaio de
adesatildeo para cada potro avaliado e a cada experimento realizado
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 (ROSEN e GORDON 1987) aP=0010 vs CN e bP=0001 vs DA
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
A normalidade na distribuiccedilatildeo dos dados foi avaliada pelo teste de D‟Agostino
e Pearson Valores considerados outliers pelo teste de Grubb foram excluiacutedos das
anaacutelises Para os dados que apresentaram distribuiccedilatildeo normal dos valores
(distribuiccedilatildeo Gaussiana) (contagem percentual de linfoacutecitos concentraccedilatildeo total de
proteiacutenas do LBA bioatividade de PAF catalase hidroperoacutexidos nitritos fagocitose
de macroacutefago alveolar produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio
por macroacutefago alveolar) foi utilizado o teste t natildeo pareado Os dados com
distribuiccedilatildeo natildeo Gaussiana dos valores (contagens percentuais de neutroacutefilos de
58
eosinoacutefilos e de macroacutefagos multinucleados contagem do NTCN do LBA e adesatildeo
de macroacutefago alveolar) foram analisados pelo teste de Mann-Whitney A
comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos de funccedilatildeo de macroacutefago alveolar
estimulado e natildeo estimulado por PMA foi feita por teste t de Student natildeo pareado
Os achados cliacutenicos e endoscoacutepicos foram analisados por meio de teste de Mann-
Whitney A correlaccedilatildeo entre o percentual de um mesmo tipo celular no aspirado
traqueal e no lavado broncoalveolar foi analisada atraveacutes do teste de Spearman
Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas utilizando-se o programa GraphPad
Prism versatildeo 500 para Windows (GraphPad Software San Diego CA EUA) e os
valores apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia (SEM) Valores de
Plt005 foram considerados como significativos
4 RESULTADOS
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica
Nenhum dos potros dos grupos CN e DA apresentou tosse segundo o
histoacuterico obtido Contudo oito potros (235) do grupo EX apresentaram tosse
espontacircnea na cocheira ou durante o treinamento o que resultou em diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0002) (TABELA 1)
A presenccedila de corrimento nasal seroso (coriza) observada nos trecircs grupos
estudados estaacute demonstrada na TABELA 1 Natildeo houve diferenccedila significativa entre
os grupos apesar de o percentual de potros com coriza no grupo DA ter reduzido
em relaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
Os linfonodos submandibulares eou retrofaringeanos estiveram aumentados
em 382 222 e 382 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
natildeo havendo diferenccedila entre os grupos (TABELA 1)
A auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e traqueal resultou normal em todos os potros
avaliados dos trecircs grupos estudados Contudo sons pulmonares crepitantes foram
audiacuteveis em 28 156 e 115 dos potros avaliados nos grupos CN DA e EX
respectivamente havendo um aumento do percentual de crepitaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo DA em ralaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DE CORRIDA
Grupos Tosse
Espontacircnea
Corrimento
Nasal
Linfonodos
Auscultaccedilatildeo
Pulmonar
CN 034
(0)
1534
(441)
1334
(382)
136
(28)
DA 045
(0)
1145
(244)
1045
(222)
745
(156)
EX 834
(235)a
1534
(441)
1334
(382)
326
(115)
aP=0002 vs DA
60
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas
No iniacutecio da avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas primeiramente
considerando os foliacuteculos linfoacuteides faringeanos ou hiperplasia folicular linfoacuteide (HFL)
a distribuiccedilatildeo das diferentes graduaccedilotildees pode ser vista na TABELA 2
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGEANOS OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS DE I A IV SEGUNDO RAKER E BOLES (1978)
Grupos HFL I HFL II HFL III HFL IV
CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)
DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)
EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)
Considerando as graduaccedilotildees de HFL III e IV como faringite esta
anormalidade foi observada em 546 286 e 539 dos potros dos grupos CN
DA e EX respectivamente Houve uma significativa reduccedilatildeo no percentual meacutedio de
observaccedilotildees de faringite para o grupo DA em comparaccedilatildeo ao grupo CN (P=0024)
enquanto no grupo EX o percentual de faringites foi significativamente maior em
relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0039)
Com relaccedilatildeo ao aspecto morfoloacutegico da epiglote um potro do grupo DA e um
potro do grupo EX evidenciaram epiglote com aspecto fraacutegil sendo que os demais
potros foram normais
Com relaccedilatildeo agrave avaliaccedilatildeo funcional da laringe todos os potros foram normais
apresentando graduaccedilotildees I ou II (TABELA 3)
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE ACORDO COM RAKESTRAW et al (1991)
Grupos NLP I NLP II NLP III NLP IV
CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)
DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)
EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)
61
A quantidade de secreccedilatildeo observada no lume traqueal estaacute demonstrada na
TABELA 4
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 SEGUNDO GERBER et al (2004)
Grupos 0 1 2 3 4 5
CN 233
(61)
933
(273)
933
(273)
1133
(332)
233
(61)
033
(0)
DA 742
(167)
1242
(286)
1242
(286)
742
(167)
342
(70)
142
(24)
EX 327
(111)
727
(259)
727
(259)
627
(223)
427
(148)
027
(0)
Quantidade de secreccedilatildeo traqueal acima de grau 2 considerada passiacutevel de
prejuiacutezo agrave troca gasosa e ao rendimento desportivo foi observada em 666 547
e 630 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT)
Os achados de anaacutelise citoloacutegica diferencial para os principais tipos celulares
do AT para os trecircs grupos de potros estudados estatildeo demonstrados na TABELA 5
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN (n=20) DA (n=19) E EX (n=15) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
Grupos Mac Lin Neut Eos Mast Calic Multi Epit Sid
CN 429plusmn63 75
plusmn19
76
plusmn29
12
plusmn07
002
plusmn02
05
plusmn02
02
plusmn01
201
plusmn56
0
DA 591
plusmn41
141
plusmn24
85
plusmn23
11
plusmn05
0 01
plusmn01
11
plusmn02a
161
plusmn48
0
EX 593
plusmn42
134
plusmn23
171
plusmn49
09
plusmn03
0 05
plusmn03
08
plusmn03
71
plusmn32
09
plusmn04
Mac macroacutefago alveolar Lin linfoacutecitos Neut neutroacutefilos Eos eosinoacutefilos Mast mastoacutecitos Calic ceacutelulas caliciformes Multi macroacutefagos multinucleados Epit ceacutelulas epiteliais Sid hemossideroacutefagos aPlt0001 vs CN
62
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA)
As quantidades de LBA recuperado estiveram entre 54 e 59 do volume
infundido para os grupos CN (n=16) DA (n=23) e EX (n=16)
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
A contagem do NTCN e a contagem diferencial de ceacutelulas do LBA estatildeo
demonstradas na TABELA 6
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN (n=45) DA (n=40) E EX (n=34) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
CTCN
(ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Macroacutef
Multi
Hemosid
CN 395
plusmn 38
673
plusmn 17
294
plusmn 15
23
plusmn 04
05
plusmn 03
005
plusmn 004
04
plusmn 01
0
DA 343
plusmn 24
698
plusmn 14
281
plusmn 13
09
plusmn 02
12
plusmn 01
002
plusmn 002
11
plusmn 01d
0
EX 456
plusmn 28a
676
plusmn 18
229
plusmn 15
54
plusmn 11b
15
plusmn 07c
02
plusmn 01
13
plusmn 02
22
plusmn 06
CTCN = contagem total de ceacutelulas nucleadas Macroacutef = macroacutefagos Linfoacutec = linfoacutecitos Neutroacutef = neutroacutefilos Eosino = eosinoacutefilos Masto = mastoacutecitos Macroacutef Multi = macroacutefagos multinucleados Hemosid = hemossideroacutefagos aPlt001 vs DA bPlt0001 vs DA cPlt005 vs DA dPlt0001 vs CN
Hemossideroacutefagos foram observados somente no LBA dos potros do grupo
EX mais especificamente em 23 (622) deles representando 22 do total de
ceacutelulas A quantidade observada de hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 da
contagem citoloacutegica diferencial do LBA
A correlaccedilatildeo entre as contagens percentuais de um mesmo tipo celular no AT
e no LBA foi analisada para os potros do grupo CN (n=11) DA (n=18) e EX (n=12)
que tiveram material colhido para as duas teacutecnicas citoloacutegicas natildeo tendo sido
63
encontrada correlaccedilatildeo entre ambas as teacutecnicas de avaliaccedilatildeo citoloacutegica para
nenhuma das ceacutelulas
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF
A resposta dos neutroacutefilos do sangue de equino frente ao PMA e frente ao
PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na ausecircncia e na presenccedila
do antagonista de PAF BN52021 estaacute demonstrado nas FIGURAS 13 a 15
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF aP=0028 vs controle bPlt0001 vs sem BN52021 cP=0028 vs PMA
64
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0007) 10nM (aP=0003) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA e PAF 1 e 10nM
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF EM TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA ePlt0001 vs PAF 1nM e fPlt0001 vs PAF 1nM e 10nM
65
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF
Tambeacutem se estudou a resposta dos macroacutefagos alveolares de equino frente
ao PMA e frente ao PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 demonstrado nas
FIGURAs 16 a 18
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0003) 10nM (aPlt0001) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0010 vs PMA dPlt0001 vs PAF 01nM e PAF 1nM
66
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0037) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA e PAF 01nM dPlt0001 vs PAF 1nM
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 01nM e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA dPlt001 vs PAF 1nM e 10nM
67
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos
foi mensurada pelo influxo de Ca++ em ceacutelulas PMN de equinos (FIGURA 19)
Registrou-se uma baixa relaccedilatildeo 340380 nm para os grupos CN (0005 plusmn 0002
relaccedilatildeo 340380 nm) e DA (0006 plusmn 0002 relaccedilatildeo 340380 nm) representando um
baixo niacutevel de bioatividade de PAF no LBA dos potros avaliados nestes grupos
Contudo a bioatividade de PAF do grupo EX (0068 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm) foi
significativamente maior em comparaccedilatildeo ao grupo DA (P=0017) Um graacutefico
representativo da bioatividade de PAF em uma das amostras do grupo EX na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 pode ser visto na FIGURA
20
CN DA EX000
002
004
006
008
010 a
Re
laccedil
atildeo
34
03
80
nm
Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedicodas Ceacutelulas do LBA
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE AO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0017 vs DA
68
0 50 100
150
200
0
1
2
3
4
Tempo (segundos)
Bioatividade de PAFR
ela
ccedilatildeo
3403
80n
m
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm A AMOSTRA Eacute ADICIONADA Agrave SUSPENSAtildeO DE CEacuteLULAS PMN APOacuteS 50 SEGUNDOS DE LEITURA BASAL (SETA)
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi maior no grupo DA em relaccedilatildeo
ao grupo CN (014 plusmn 003 vs 003 plusmn 001 mg de proteiacutenasmL de LBA) (P=0001) O
grupo EX apresentou concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA (036 plusmn 006 mg de
proteiacutenasmL de LBA) significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001)
(FIGURA 21)
69
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0001 vs CN bPlt0001 vs DA
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos foi maior no LBA do grupo DA (019 plusmn 001
absorbacircncia 550 nm) em relaccedilatildeo ao grupo CN (014 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm)
(P=0011) O grupo EX apresentou uma reduccedilatildeo significativa na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA (008 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm) significativamente menor em
comparaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001) (FIGURA 22)
70
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0011 vs CN bPlt0001 vs DA
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (1047 plusmn 241 vs 66
plusmn 35 nmolesmg de proteiacutenas) (Plt0001) No grupo EX a concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos nas ceacutelulas do LBA apresentou reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo
DA (352 plusmn 84 vs 1047 plusmn 241 nmolesmg de proteiacutenas) (P=0007) (FIGURA 23)
71
Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos no LBA
CN DA EX0
50
100
150a
b
nm
ole
s
mg
de
pro
teiacuten
as
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX (n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO APRESENTADOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNA DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aPlt0001 vs CN bP=0007 vs DA
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA
No grupo EX a atividade da catalase nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol
H2O2minmg de proteiacutenas) (P=0002) natildeo havendo diferenccedila entre os grupos CN e
DA (FIGURA 24)
72
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO microMOL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOMINUTOMILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0002 vs DA
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
A fagocitose de macroacutefago alveolar foi significativamente maior no grupo DA
em comparaccedilatildeo ao grupo CN (223 plusmn 043 vs 072 plusmn 018 absorbacircncia 550
nmadesatildeo) (P=0002) Observou-se uma diminuiccedilatildeo na fagocitose no grupo EX em
relaccedilatildeo ao grupo DA (104 plusmn 027 vs 223 plusmn 043 absorbacircncia 550 nmadesatildeo)
(P=0006) (FIGURA 25)
73
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A FAGOCITOSE PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (FAGOCITOSEADESAtildeO) aP=0002 vs CN e bP=0006 vs DA
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar
A utilizaccedilatildeo de PMA aumentou significativamente a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido pelos macroacutefagos alveolares dos grupos DA (219 plusmn 053 vs 392 plusmn 062
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0049) e EX (060 plusmn 011 vs 090 plusmn 014
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0031) A produccedilatildeo basal de acircnion superoacutexido foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (219 plusmn 053 vs 025
plusmn 007 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo DA (060 plusmn 011 vs 219 plusmn 053 absorbacircncia 595
nmadesatildeo) (P=0001) A produccedilatildeo de acircnion superoacutexido estimulada por PMA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (392 plusmn 062 vs 046
plusmn 016 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
74
diminuiccedilatildeo na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido em comparaccedilatildeo ao grupo DA (090 plusmn
014 vs 392 plusmn 062 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) (FIGURA 26)
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0049 vs DA bP=0031 vs EX cPlt0001 vs CN dP=0001 vs DA ePlt0001 vs CNe fPlt0001 vs DAe
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
O PMA aumentou a produccedilatildeo de H2O2 pelos macroacutefagos alveolares nos
grupos CN (041 plusmn 008 vs 099 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0004) DA
(035 plusmn 005 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0002) e EX (010 plusmn
001 vs 034 plusmn 008 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) A produccedilatildeo basal de
H2O2 para o grupo EX foi significativamente menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (010 plusmn
001 vs 035 plusmn 005 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) Aleacutem disso a produccedilatildeo
75
de H2O2 estimulada por PMA diminuiu no grupo EX tendo sido significativamente
menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (034 plusmn 008 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia
595nmadesatildeo) (P=0006) (FIGURA 27)
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0004 vs CN bP=0002 vs DA cPlt0001 vs EX dPlt0001 vs DA eP=0006 vs DAe
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
Hemossideroacutefagos foram observados no LBA de 23 potros (622) sendo
que estes foram considerados no subgrupo HPIE pos A quantidade observada de
76
hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 A ausecircncia de hemossideroacutefagos foi
evidenciada em 14 potros (378) sendo que estes foram considerados para o
subgrupo HPIE neg
Dentre os potros avaliados 15 (405) deles (10 potros do subgrupo HPIE
pos e 5 potros do subgrupo HPIE neg) apresentaram mais de 5 de neutroacutefilos eou
mais de 1 de eosinoacutefilos na contagem diferencial de ceacutelulas indicando um perfil
citoloacutegico de LBA compatiacutevel com inflamaccedilatildeo pulmonar
Os valores do NTCN bem como da contagem diferencial de ceacutelulas para o
grupo EX e para os subgrupos estaacute demonstrado na TABELA 7
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX (n=37) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=23) E HPIE NEG (n=14)
CTCN (ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Siderof
Grupo EX
456 plusmn 28
676 plusmn 18
229 plusmn 15
47 plusmn 10
13 plusmn 06
02 plusmn 01
22 plusmn 35
HPIE pos
571
plusmn 78a
645
plusmn 22b
240 plusmn 20
56 plusmn 12
09 plusmn 07
02 plusmn 02
34 plusmn 37
HPIE neg
348 plusmn 38
725 plusmn 30
207 plusmn 25
35 plusmn 18
19 plusmn 11
03 plusmn 01
00
CTCN contagem total de ceacutelulas nucleadas Macrof macoacutefagos Linfoc linfoacutecitos Neutrof
neutroacutefilos Eosinof eosinoacutefilos Mastoc mastoacutecitos Siderof hemossideroacutefagos aP=0005
vs HPIE neg bP=0020 vs HPIE neg
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg
(018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm P=0042) (FIGURA 28)
77
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) e HPIE NEG (n=5) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO RELACcedilAtildeO 340380nm aP=0042 vs HPIE neg
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi significativamente maior no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (039 plusmn 008 vs 019 plusmn
004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) (FIGURA 29)
78
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=13) E HPIE NEG (n=12) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS POR MILILITRO DE LBA aP=0031 vs HPIE neg
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos resultou
significativamente reduzida em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (008 plusmn 003 vs
012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) (FIGURA 30)
79
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) E HPIE NEG (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 550 nm aP=0049 vs HPIE neg
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA dos potros do
subgrupo HPIE pos resultou significativamente maior que no subgrupo HPIE neg
(367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) (FIGURA 31)
80
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) E HPIE NEG (n=8) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS aP=0009 vs HPIE neg
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
Natildeo houve diferenccedila na fagocitose de macroacutefago alveolar entre os grupos
estudados
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-)
A produccedilatildeo basal de O2- por macroacutefagos alveolares resultou similar entre os
grupos estudados A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0047) mas natildeo no subgrupo HPIE pos
(FIGURA 32)
A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA foi significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (081 plusmn 011 vs 124 plusmn
015 absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0042) (FIGURA 32)
81
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) E HPIE NEG (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0047 vs HPIE neg bP=0042 vs HPIE neg e
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
A produccedilatildeo basal de H2O2 por macroacutefago alveolar foi similar entre os grupos
avaliados no presente estudo A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0002) mas natildeo no subgrupo HPIE
neg (FIGURA 33)
A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA resultou significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (025 plusmn 003 vs 067 plusmn 014
absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0001)
82
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) E HPIE NEG (n=6) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2 ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0002 vs HPIE neg bP=001 vs HPIE neg e
5 DISCUSSAtildeO
O estudo da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas de cavalos de corrida adultos jovens
em trecircs diferentes situaccedilotildees em seu ambiente natural foi possiacutevel devido agrave
utilizaccedilatildeo de um grande nuacutemero de animais Assim permitiu-se detectar diferenccedilas
entre os grupos mesmo havendo variaccedilotildees ambientais tais como estaccedilotildees do ano
condiccedilotildees climaacuteticas e diferenccedilas sutis em manejo Como os potros dos trecircs grupos
encontravam-se na mesma faixa etaacuteria de risco para as doenccedilas respiratoacuterias virais
e os experimentos foram realizados durante um mesmo periacuteodo as diferenccedilas entre
os grupos CN e DA foram consideradas como sendo devido ao ambiente e as
diferenccedilas entre os grupos DA e EX foram consideradas como sendo devido ao
treinamento
O grupo CN evidenciou um percentual de observaccedilotildees de faringite na
avaliaccedilatildeo endoscoacutepica (TABELA 2) maior que os 37 relatado por HOBO et al
(1995) em cavalos PSI de corrida de dois anos de idade Os potros deste grupo
foram mantidos integralmente em piquetes e nesta situaccedilatildeo a hiperplasia dos
foliacuteculos linfoacuteides da faringe em cavalos jovens pode ser uma resposta normal a
inalaccedilatildeo de antiacutegenos ambientais ou agentes infecciosos (HOLCOMBE e
DUCHARME 2007)
De fato as vias aeacutereas dos potros desse grupo deram mostra de estarem
sendo desafiadas pelo nuacutemero percentual de corrimento nasal linfonodos
aumentados e quantidades elevadas de secreccedilatildeo traqueal iguais aos demais
grupos (TABELAS 1 e 4) Possivelmente isso tambeacutem se deva a fatores climaacuteticos
pois no estudo de ROBINSON et al (2006) com cavalos de montaria de vaacuterias
idades aqueles que permaneceram fora dos estaacutebulos durante o inverno
apresentaram quantidades elevadas de muco traqueal No entanto diferentemente
do nosso estudo os cavalos avaliados por ROBINSON et al (2006) tiveram nuacutemero
percentual de neutroacutefilos aumentado na secreccedilatildeo traqueal enquanto os potros do
grupo CN resultaram em avaliaccedilatildeo citoloacutegica tanto de AT (TABELA 5) como de LBA
(TABELA 6) normais (ROBINSON 2003 HODGSON e HODGSON 2007)
evidenciando vias aeacutereas especialmente as vias aeacutereas inferiores saudaacuteveis
Com relaccedilatildeo ao desafio ambiental no presente estudo adotou-se um sistema
convencional de estabulaccedilatildeo pois estudos anteriores em modelos semelhantes ao
84
nosso jaacute demonstraram a presenccedila de altas concentraccedilotildees de endotoxinas
(BERNDT et al 2008) bem como de poeira e de aeroalergenos (WOODS et al
1993)
Contudo o desafio ambiental de 30 dias utilizado em nosso estudo resultou
em quadro comparaacutevel ao do grupo CN isento de processo inflamatoacuterio das vias
aeacutereas Possivelmente um periacuteodo maior de desafio pudesse causar um processo
inflamatoacuterio tal como foi demonstrado previamente por HOLCOMBE et al (2001)
onde potros da raccedila puro sangue aacuterabe que sofreram desafio ambiental de 90 dias
apresentaram aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no LBA Contudo no
estudo citado o material utilizado para a cama dos potros foi a palha que tambeacutem
representou um maior risco de desenvolvimento de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas dos
cavalos em outros estudos quando comparada a serragem utilizada na cama dos
potros do grupo DA (BURRELL et al 1996 VANDEPUT et al 1998 GERBER et
al 2000 KLEIBER et al 2005 DEWACHI et al 2006)
Entretanto ateacute o momento os efeitos dos fatores ambientais das cocheiras
nas vias aeacutereas foram relatados em sua maioria em cavalos apresentando ORVA e
natildeo em indiviacuteduos jovens e saudaacuteveis como os potros avaliados em nosso estudo
Nos animais com ORVA um curto periacuteodo de exposiccedilatildeo ambiental (6 a 48 horas)
em baia e recebendo alimentaccedilatildeo composta principalmente por feno causou
aumento da expressatildeo de algumas citocinas (pex IL-4 e IL-5) em alguns estudos
mas nenhuma alteraccedilatildeo em outros (GERBER et al 2000 AINSWORTH et al 2003
CORDEAU et al 2004 KLEIBER et al 2005) sendo que um longo tempo de
exposiccedilatildeo ambiental (variando de cinco semanas a trecircs meses) causou aumento da
expressatildeo de IFN-γ e IL-8 (AINSWORTH et al 2003) IL-9 (DEWACHI et al 2006)
IL-17 (DEBRUE et al 2005) e o desenvolvimento dos sinais cliacutenicos da ORVA
acompanhados de alteraccedilotildees na funccedilatildeo pulmonar (VANDEPUT et al 1998)
Contudo nos potros do grupo DA se evidenciou no AT (TABELA 5) e no LBA
(TABELA 6) um aumento significativo do nuacutemero percentual de macroacutefagos
multinucleados em comparaccedilatildeo ao grupo CN bem como nuacutemero percentual de
eosinoacutefilos acima do valor considerado limite para cavalos normais (ROBINSON
2003) sugerindo que houve uma resposta por parte do sistema de defesa nas vias
aeacutereas dos potros deste grupo
Os macroacutefagos multinucleados ou ceacutelulas gigantes multinucleadas satildeo
formados a partir da fusatildeo de dois ou mais macroacutefagos na resposta imune pulmonar
85
(ANDERSON et al 1999) representando especificamente uma resposta imune do
tipo Th2 com a participaccedilatildeo da IL-4 (HELMING e GORDON 2007) Em pessoas os
macroacutefagos multinucleados satildeo considerados como um achado indicativo de
reaccedilotildees inflamatoacuterias crocircnicas nas vias aeacutereas como a tuberculose por exemplo
(LEMAIRE et al 2006 HELMING e GORDON 2007) Em equinos satildeo escassos os
estudos envolvendo a citologia respiratoacuteria que descrevam o nuacutemero percentual
normal deste tipo celular De qualquer forma eacute relatado que pode ser observado em
pequeno nuacutemero em cavalos sem evidecircncias de doenccedila pulmonar sendo que uma
quantidade aumentada jaacute foi descrita associada agrave inflamaccedilatildeo crocircnica (DECONTO
1983 HODGSON e HODGSON 2007) Estas informaccedilotildees parecem natildeo corroborar
com o aumento no nuacutemero percentual de macroacutefagos multinucleados no grupo DA
em se tratando de potros jovens considerados saudaacuteveis o que demonstra a
necessidade de mais estudos para se entender o papel do macroacutefago multinucleado
no pulmatildeo saudaacutevel e na inflamaccedilatildeo pulmonar dos cavalos
Entretanto o nuacutemero percentual de eosinoacutefilos acima do limite normal no
LBA dos potros do grupo DA pode ser considerado como uma resposta ao
ambiente assim como eacute considerado em humanos (DENGUEZLI-BOUZGARROU et
al 2007) e jaacute relatado em cavalos (COUEumlTIL et al 2007)
O periacuteodo de treinamento por sua vez induziu inflamaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo EX O nuacutemero significativamente aumentado de potros com tosse
(TABELA 1) constituiu a evidecircncia cliacutenica sugerindo inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas nos
potros desse grupo Cavalos saudaacuteveis raramente tossem (ROBINSON 2007)
sendo a tosse um sinal cliacutenico comprovadamente associado agrave inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas (BURRELL et al 1996 McGROUM e DIXON 2007) CHRISTLEY et al
(2001) correlacionaram a tosse com a presenccedila de faringite sendo que tal
associaccedilatildeo tambeacutem foi observada no grupo EX (TABELAS 1 e 2) Adicionalmente
BEDENICE et al (2008) estudaram a relaccedilatildeo entre a tosse e a inflamaccedilatildeo pulmonar
e descreveram que os cavalos avaliados por apresentarem tosse tiveram contagens
percentuais de neutroacutefilos no LBA maiores que 5
No presente estudo um aumento no NTCN e nas contagens percentuais de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos do LBA (TABELA 6) confirmaram a presenccedila de inflamaccedilatildeo
pulmonar no grupo EX (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
COUEumlTIL et al 2007) A neutrofilia no LBA de cavalos de corrida jaacute foi
correlacionada a um baixo rendimento desportivo e constitui sinal chave para o
86
diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007) A eosinofilia no LBA de cavalos de
corrida por sua vez pode ser um achado transitoacuterio (VIEL e HEWSON 2003)
apesar de tambeacutem ter sido associada a um baixo rendimento desportivo aleacutem de
hiperresponsividade das vias aeacutereas em cavalos de corrida jovens (HARE e VIEL
1998) Portanto tais evidecircncias podem ser consideradas como um risco ao futuro
potencial atleacutetico dos potros do grupo EX
No presente estudo natildeo houve correlaccedilatildeo entre os achados citoloacutegicos de AT
e LBA para nenhum dos trecircs grupos estudados e esta falta de correlaccedilatildeo entre AT
e LBA jaacute foi relatada anteriormente Portanto entende-se que os epiteacutelios traqueal e
broncoalveolar respondem diferentemente aos agentes agressores sendo que a
avaliaccedilatildeo de cavalos com tosse ou diminuiccedilatildeo de rendimento desportivo deve ser
realizada por ambas as teacutecnicas associadas (MALIKIDES et al 2003 CHRISTLEY
RUSH 2007 HODGSON e HODGSON 2007)
A ligaccedilatildeo entre o exerciacutecio e a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas provavelmente
envolve diversos mediadores proacute-inflamatoacuterios que uma vez identificados poderatildeo
ser alvo para abordagens terapecircuticas com o objetivo de minimizar os efeitos
deleteacuterios da inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos PSI de corrida jovens Neste
contexto um dos mais potentes e versaacuteteis mediadores proacute inflamatoacuterios envolvidos
na inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas eacute o PAF (UHLIG et al 2005)
PAF eacute quimiotaacutetico para bem como produzido por eosinoacutefilos macroacutefagos e
neutroacutefilos em resposta a estresse fiacutesico ou quiacutemico apresentando muitos dos
criteacuterios essenciais de um mediador proacute inflamatoacuterio (OWEN et al 2005)
De fato estudos realizados in vitro demonstraram que o PAF pode induzir a
migraccedilatildeo de neutroacutefilos e monoacutecitos do cavalo (DAWSON et al 1988) Aleacutem disso
demonstrou-se a quimiotaxia de eosinoacutefilos e neutroacutefilos no trato respiratoacuterio de
murinos e humanos induzida por PAF (LEE et al 2002 ISHII et al 2004) Em
cavalos com ORVA a administraccedilatildeo intravenosa de PAF promoveu uma reduccedilatildeo de
leucoacutecitos no sangue perifeacuterico e apoacutes alguns minutos houve um aumento de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo seguido de uma deterioraccedilatildeo cliacutenica e da funccedilatildeo
respiratoacuteria (FAIRBAIRN et al 1996) Portanto apoiado nestes estudos e nos
resultados de aumento do NTCN e de neutrofilia e eosinofilia no LBA do grupo EX
(TABELA 6) eacute razoaacutevel assumir que o PAF possa contribuir para a induccedilatildeo da
inflamaccedilatildeo pulmonar observada nos potros PSI jovens em treinamento avaliados no
presente estudo
87
A inflamaccedilatildeo pulmonar tambeacutem estaacute associada a um aumento nas
concentraccedilotildees de proteiacutenas no LBA principalmente devido ao extravasamento de
plasma (TSANGARIS et al 2003) que pode ser resultado da accedilatildeo de vaacuterios
mediadores proacute inflamatoacuterios tal como o PAF
Um aumento da permeabilidade microvascular induzida pelo PAF resultando
em extravasamento de plasma e edema foi demonstrado previamente no estudo de
CLAVIJO et al (2001) Aleacutem disso WEST et al (1997) demonstraram o acuacutemulo de
um fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar de cavalos exercitados a velocidades
entre 13 ms e 16 ms No presente estudo o significativo aumento da concentraccedilatildeo
de proteiacutenas no LBA dos potros do grupo EX em comparaccedilatildeo ao grupo DA (FIGURA
21) confirma que a permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) estava
aumentada nos potros do grupo EX e o PAF pode estar envolvido neste mecanismo
Diferentemente o significativo aumento de proteiacutenas no LBA do grupo DA em
comparaccedilatildeo ao grupo CN deve envolver outros mecanismos inflamatoacuterios pois natildeo
houve biotavidade de PAF significativa no LBA destes dois grupos (FIGURA 19)
Contudo os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da disponibilidade de oacutexido niacutetrico (NO) (KIKUCHI et al
2008) Houve uma produccedilatildeo limitada de NO nas vias aeacutereas dos potros do grupo
EX esperada em cavalos realizando exerciacutecio moderado ou proacuteximo do maacuteximo
(MILLS e HIGGINS 1997) Isto pode ser explicado pela hipoxemia arterial induzida
pelo exerciacutecio (HAIE) descrita em atletas humanos (HOPKINS 2005) e em cavalos
exercitando a altas intensidades (MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
DEMPSEY e WAGNER 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005) A produccedilatildeo de NO requer
normoxia (GRIMMINGER et al 1995) sendo que a anoxia abole o relaxamento
vascular dependente do endoteacutelio e a hipoxemia degrada o NO (De MEY e
VANHOUTTE 1980) Adicionalmente ocorre uma inibiccedilatildeo do NO pela hemoglobina
sendo que esta inibiccedilatildeo eacute inversamente proporcional a saturaccedilatildeo de oxigecircnio
(IWAMOTO e MORIN 1993)
A inibiccedilatildeo da siacutentese de NO resultou no aumento da permeabilidade vascular
no estudo de KIKUCHI et al (2008) concordando com os nossos achados
referentes agrave bioatividade de PAF aumentada associada ao aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas e agrave diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de nitritos no LBA
do grupo EX
88
De fato no estudo de BRKOVIC e SIROIS (2007) o PAF e natildeo o NO foi
considerado o mediador proacute inflamatoacuterio e causador do aumento da permeabilidade
vascular enquanto o NO foi considerado como um co-fator para as atividades
inflamatoacuterias do PAF Na relaccedilatildeo entre PAF e NO na microcirculaccedilatildeo parece que
NO apresenta um efeito protetor atenuando as atividades inflamatoacuterias de PAF
tendo inclusive reduzido a formaccedilatildeo de PAF em vecircnulas mesenteacutericas em ratos
(NEVIN e BROADLEY 2002)
Contudo o NO tambeacutem tem papel preponderante na defesa das vias aeacutereas
(NEVIN e BROADLEY 2002 XU et al 2006) e o aumento na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA do grupo DA pode ser considerado uma resposta aos poluentes
ambientais existentes nas cocheira dos cavalos (WOODS et al 1993 BERNDT et
al 2008) Aleacutem disso o NO reage com o acircnion superoacutexido (O -2) para formar
peroxinitrito (ONOO-) um forte oxidante capaz de provocar lesatildeo no tecido pulmonar
resultando em peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (XU et al 2006)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi investigada no presente estudo atraveacutes da
concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA que resultou
aumentada no grupo DA em comparaccedilatildeo com o grupo CN (FIGURA 23) A
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi associada ao acuacutemulo de neutroacutefilos e produccedilatildeo de ROS por
esses nas vias aeacutereas de crianccedilas (BUSS et al 2000) e de pessoas com DPOC
(SANTUS et al 2005) Natildeo houve aumento de neutroacutefilos no LBA dos potros do
grupo DA mas os macroacutefagos alveolares dos potros deste grupo apresentaram
maior produccedilatildeo de ROS (FIGURAS 26 e 27) Isso pode ter contribuiacutedo para o
aumento da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA neste grupo como resultado da
modificaccedilatildeo da funcionalidade dos macroacutefagos alveolares induzida por fatores
ambientais como descrito em estudos em humanos (LUNDBORG et al 2007) e em
cavalos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento resultou em reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos lipiacutedicos no LBA em comparaccedilatildeo com o grupo DA No estudo de
MASTALOUDIS et al (2004) corredores de ultramaratona apresentaram aumento
da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica avaliada por marcadores do sangue destes atletas
Contudo outros relataram a reduccedilatildeo dos marcadores de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes
exerciacutecio intenso em corredores e esquiadores (URSO e CLARKSON 2003) em
indiviacuteduos treinados (BALOG et al 2006) em pessoas apoacutes 6 meses de
89
treinamento e tambeacutem apoacutes um programa de treinamento de 3 semanas (ALDRED
2007) e em pacientes com DPOC apoacutes programa de exerciacutecios (PINHO et al 2007)
Provavelmente essa diminuiccedilatildeo na peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA dos potros do
grupo EX deveu-se a mecanismos protetores pois o treinamento influencia de forma
positiva a capacidade antioxidante do organismo em atletas humanos (URSO e
CLARKSON 2003 PARK et al 2005 BALOG et al 2006 ALDRED 2007 PINHO
et al 2007) e em cavalos (KIRSCHVINK et al 2008)
URSO e CLARKSON (2003) relataram um aumento significativo da atividade
da catalase uma enzima antioxidante nos eritroacutecitos de atletas humanos apoacutes um
exerciacutecio de corrida de longa distacircncia corroborando com os nossos achados de
aumento significativo da atividade da catalase no LBA dos potros do grupo EX em
comparaccedilatildeo com o grupo DA (FIGURA 24)
No presente estudo a atividade de macroacutefago alveolar foi investigada devido
ao papel inerente desta ceacutelula na defesa pulmonar O aumento na atividade dos
macroacutefagos alveolares no grupo DA foi discutida acima e provavelmente deveu-se agrave
presenccedila de aeroalergenos e endotoxinas presentes nas cocheiras dos cavalos
(RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento reduziu tanto a fagocitose de macroacutefago
alveolar (FIGURA 25) como a capacidade de produccedilatildeo de ROS (acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio) (FIGURAS 26 e 27)
O macroacutefago alveolar eacute a ceacutelula efetora do sistema imune predominante nos
espaccedilos alveolares e nas vias aeacutereas condutoras responsaacutevel por ativar as
respostas inflamatoacuterias de forma suficiente a eliminar agentes agressores (PETERS-
GOLDEN 2004) Os macroacutefagos alveolares satildeo essenciais agrave sobrevivecircncia
devendo estar em harmonia com o sistema nervoso e endoacutecrino para responder a
estiacutemulos fisioloacutegicos bem como patoloacutegicos (GORDON 2007) sem exagerar na
resposta a fim de natildeo comprometer a troca gasosa (PETERS-GOLDEN 2004)
Apesar de KIZAKI et al (2008) terem demonstrado que o macroacutefago pode
sofrer uma adaptaccedilatildeo ao exerciacutecio melhorando sua funcionalidade os potros PSI
jovens em treinamento para corrida do grupo EX apresentaram supressatildeo da
imunidade especificamente a relacionada agrave resposta imune inata dos macroacutefagos
alveolares corroborando com estudos anteriores (HUSTON et al 1987 RAIDAL et
al 2000 RAIDAL et al 2001) que avaliaram o LBA de cavalos apoacutes exerciacutecio
90
realizado em esteira de alta velocidade e obtiveram resultados semelhantes aos
nossos
Outro aspecto ainda natildeo relatado em equinos mas demonstrado em
pessoas eacute que a melhora na atividade antioxidante induzida pelo exerciacutecio pode
resultar em diminuiccedilatildeo da atividade da NADPH oxidase na membrana dos
macroacutefagos consequumlentemente reduzindo a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio por essas ceacutelulas (PARK et al 2005) como observado no
grupo EX
Portanto a influencia do exerciacutecio sobre a funcionalidade das ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico como a observada nos macroacutefagos alveolares do grupo EX no
presente estudo explicaria a maior suscetibilidade apresentada por potros de corrida
sob treinamento intenso a infecccedilotildees respiratoacuterias (HINES et al 1996) Em
humanos o exerciacutecio intenso reduziu a capacidade de apresentaccedilatildeo de antiacutegeno
(CEDDIA e WOODS 1999) bem como a resistecircncia antiviral (DAVIS et al 1997) por
macroacutefagos O PMA (phorbol myristate acetate) utilizado nas avaliaccedilotildees da
atividade de macroacutefago alveolar (ver toacutepicos 4114 e 4115) teve como funccedilatildeo
estimular a NADPH oxidase a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
(DEKKER et al 2000 NAKAJIMA et al 2000) mimetizando o estiacutemulo provocado
por agentes infecciosos (JI 2008) Isto de fato ocorreu no grupo EX jaacute que os
macroacutefagos estimulados apresentaram aumento significativo na atividade
comparando-se aos macroacutefagos natildeo estimulados (FIGURAS 26 e 27) entretanto a
atividade ainda foi significativamente menor que no grupo DA evidenciando a
reduccedilatildeo na atividade de macroacutefagos induzida pelo exerciacutecio
Os efeitos do PMA sobre os macroacutefagos alveolares e sobre os PMNs do
sangue de equino podem ser apreciados no experimento de validaccedilatildeo da teacutecnica
de estudo da bioatividade de PAF (FIGURAS 13 a 18) A teacutecnica utilizada para o
estudo da bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos potros
empregando-se PMNs de equinos como ferramenta para se avaliar o influxo de Ca++
induzido por PAF foi ineacutedita em estudos em cavalos Anteriormente a mesma
avaliaccedilatildeo foi realizada utilizando-se PMNs de humanos (GRYNKIEWICZ et al 1985
MARATHE et al 2001) Anteriormente os PMNs de equinos foram empregados
com ecircxito no estudo da bioatividade de PAF em extrato lipiacutedico obtido a partir de
amostras de pulmatildeo de ratos no estudo da asma (MUEHLMANN et al 2009)
91
Portanto a validaccedilatildeo desta teacutecnica se fez necessaacuteria e importante para o
reconhecimento dos resultados obtidos para a bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos investigados No presente estudo o PAF
ativou os PMNs do sangue do cavalo assim como os macroacutefagos alveolares de
forma concentraccedilatildeo dependente Portanto o PAF tendo como uma de suas origens
o macroacutefago alveolar eacute capaz de modificar o comportamento de neutroacutefilos
sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos
neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a ORVA (MARR et al 2002)
As influecircncias exercidas pelo PAF na circulaccedilatildeo pulmonar permeabilidade
capilar pulmonar e na agregaccedilatildeo plaquetaacuteria estimulou o estudo da HPIE nos potros
avaliados no grupo EX Para tal o hemossideroacutefago no LBA foi escolhido como o
marcador da HPIE porque a colheita do LBA 24 horas apoacutes o exerciacutecio resultou que
a observaccedilatildeo endoscoacutepica de sangue na traqueacuteia bem como a contagem do
nuacutemero de eritroacutecitos no LBA natildeo fossem teacutecnicas diagnoacutesticas indicadas nesse
momento
A observaccedilatildeo do hemossideroacutefago no LBA mesmo se constituindo numa
forma confiaacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993) poderia natildeo servir
aos nossos propoacutesitos de identificar diferenccedilas em marcadores inflamatoacuterios e de
estresse oxidativo bem como na funcionalidade de macroacutefagos alveolares dentro
de um mesmo grupo ateacute entatildeo considerado homogecircneo Contudo o
hemossideroacutefago presente no LBA foi confirmado no presente estudo natildeo soacute como
um marcador confiaacutevel da HPIE como tambeacutem foi capaz de diferenciar subgrupos
significativamente distintos dentro do grupo EX
Interessantemente observou-se um percentual de HPIE (determinado pela
presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA) maior que o de inflamaccedilatildeo pulmonar (gt5
de neutroacutefilos eou gt1 de eosinoacutefilos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA)
Isso nos leva a pensar que a HPIE precede a inflamaccedilatildeo no pulmatildeo dos cavalos de
corrida tal como foi sugerido por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) mas que
requer outras investigaccedilotildees para excluir que o contraacuterio estivesse acontecendo isto
eacute um processo inflamatoacuterio em periacuteodo anterior do treinamento que pudesse ter
deixado alguma fragilidade pulmonar Possivelmente o estudo de potros PSI de
corrida tatildeo jovens e em iniacutecio de treinamento permitiu tal discussatildeo visto que se
considera que a HPIE acometa praticamente a totalidade dos cavalos PSI em
treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007)
92
A associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo jaacute foi demonstrada anteriormente
(McKANE et al 1993) e foi considerada como sendo significativa no estudo
epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) apesar dos mecanismos pelos quais
esta associaccedilatildeo ocorre ainda serem apresentados de forma hipoteacutetica como no
recente estudo de DERKSEN et al (2009)
No estudo de COUEumlTIL e DENICOLA (1999) cavalos de corrida com HPIE
apresentaram na avaliaccedilatildeo do LBA um aumento no NTCN associado agrave neutrofilia
De fato isto ocorreu no subgrupo HPIE pos e esses achados de citologia
demonstram que a HPIE esteve associada agrave inflamaccedilatildeo pulmonar nos potros do
subgrupo HPIE pos
Outro achado comum entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar eacute o aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA como observado no subgrupo HPIE pos em
comparaccedilatildeo com o grupo HPIE neg (FIGURA 29) evidenciando um aumento na
permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) no subgrupo HPIE pos
O acuacutemulo de fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar associado agrave
inflamaccedilatildeo pulmonar como demonstrado por TSANGARIS et al (2003) foi discutido
acima Contudo cavalos com HPIE exercitados a altas velocidades tambeacutem
apresentaram aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas no espaccedilo alveolar (WEST e
MATTHIEU-COSTELLO 1999)
Possivelmente o aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas associado agrave HPIE
possa ser devido ao aumento da pressatildeo transmural nos capilares pulmonares
resultando em falecircncia por estresse dos capilares como demonstrado por BIRKS et
al (1997) em cavalos exercitados nas mesmas velocidades que os potros avaliados
no presente estudo
Adicionalmente parece que a HPIE deflagrou um mecanismo inflamatoacuterio
causador de extravasamento de plasma no espaccedilo alveolar nos potros do subgrupo
HPIE pos e a bioatividade de PAF significativamente aumentada no subgrupo HPIE
pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (FIGURA 28) indica a participaccedilatildeo desse
mediador proacute inflamatoacuterio nesse evento
O extravasamento de plasma na microcirculaccedilatildeo pulmonar e a formaccedilatildeo de
edema pulmonar induzidos por PAF foram demonstrados anteriormente e jaacute
discutidos acima (EVANS et al 1987 CLAVIJO et al 2001) No caso da HPIE
provavelmente o PAF induza a formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular
atraveacutes da desorganizaccedilatildeo de proteiacutenas juncionais (JIANG et al 2008) Estes dados
93
concordam com a proposta de WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) de que a
altas pressotildees em capilares pulmonares ocorra a formaccedilatildeo de fendas nas junccedilotildees
entre as ceacutelulas endoteliais Desta forma as evidecircncias indicam que associado ao
evento mecacircnico na etiopatogenia da HPIE um evento inflamatoacuterio tambeacutem estaacute
presente o que representa um fator de risco para o agravamento do quadro
Adicionalmente os eventos inflamatoacuterios presentes na HPIE se constituem em
potencial aacuterea para investigaccedilotildees terapecircuticas visto que ainda natildeo se tem um
tratamento efetivo para a hemorragia pulmonar em cavalos atletas Recentemente
evidecircncias de que a suplementaccedilatildeo de cavalos atletas com aacutecidos graxos ocircmega-3
melhora a fluidez da membrana dos eritroacutecitos (PORTIER et al 2006) sugeriu que a
influecircncia beneacutefica na resposta inflamatoacuteria pulmonar pode reduzir os iacutendices HPIE
(ERICKSON et al 2007)
Portanto eacute razoaacutevel assumir um papel para o PAF na fisiopatologia da HPIE
pelas suas propriedades angiogecircnicas aleacutem de seus efeitos proacute inflamatoacuterios
(APONTE et al 2008) concordando com a hipoacutetese da patogecircnese da HPIE
proposta por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) onde a ruptura dos capilares
pulmonares resultaria em inflamaccedilatildeo sangramento e hemosiderose e
consequumlentemente a ocorrecircncia de angiogecircnese na circulaccedilatildeo bronquial e fibrose
agravando o quadro da HPIE
Adicionalmente ZHANG et al (2003) demonstraram que o aumento da
permeabilidade capilar induzido por PAF envolve a participaccedilatildeo de estresse
oxidativo visto que a enzima antioxidante superoacutexido dismutase (SOD) atenuou os
efeitos do PAF sobre o endoteacutelio De fato o grupo HPIE pos apresentou a
concentraccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos significativamente aumentada em comparaccedilatildeo
ao subgrupo HPIE neg sendo uma evidecircncia de estresse oxidativo no LBA dos
potros deste grupo possivelmente exacerbada pela alta quantidade de ferro da
hemossiderina presente no espaccedilo alveolar (DERSEN et al 2009)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica induz alteraccedilotildees patoloacutegicas no tecido pulmonar
destruindo pneumoacutecitos e ceacutelulas endoteliais do epiteacutelio levando a um aumento da
permeabilidade microvascular inibe a siacutentese e a liberaccedilatildeo de surfactante e interfere
negativamente na atividade do NO O conjunto dessas accedilotildees dos peroacutexidos lipiacutedicos
no pulmatildeo resulta em dano da estrutura pulmonar e leva agrave hipertensatildeo
representando um fator adicional contribuindo para a patogenia da HPIE (MILLS e
HIGGINS 1997)
94
Os macroacutefagos alveolares como ceacutelulas orquestradoras da resposta imune
pulmonar (PETERS-GOLDEN 2004) devem possuir um importante papel na
patogenia da HPIE visto que a obtenccedilatildeo de subgrupos significativamente distintos
a partir do grupo EX no presente estudo se deu pela presenccedila ou ausecircncia de
hemossideroacutefagos THACKER (2006) descreveu que os macroacutefagos ativados
secretam interleucina-1 (IL-1) que atrai e ativa a proliferaccedilatildeo de fibroblastos e a
siacutentese de colaacutegeno para reparar o tecido danificado Em estudo histopatoloacutegico do
pulmatildeo de cavalos com HPIE as aacutereas de ocorrecircncia de hemorragia caracterizaram-
se por hemossiderose e fibrose (DERKSEN et al 2009)
Adicionalmente WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) sugeriram o
envolvimento de leucotrieno B4 (LTB4) no mecanismo inflamatoacuterio envolvido na
HPIE apesar deste mecanismo ainda requerer comprovaccedilatildeo Neste evento a
ruptura do epiteacutelio alveolar com a exposiccedilatildeo da membrana ativaria os macroacutefagos
alveolares os quais satildeo ricos em LTB4
O LTB4 por sua vez tambeacutem conecta o PAF agrave HPIE HOPKINS et al (1997)
estudaram a HPIE em humanos avaliando o LBA de seis ciclistas de elite apoacutes 4 km
de esforccedilo maacuteximo Comparados aos controles os ciclistas que realizaram o esforccedilo
apresentaram altas concentraccedilotildees de eritroacutecitos proteiacutenas e LTB4 no LBA No
estudo citado exceto pelo aumento da LTB4 natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
percentual de neutroacutefilos e nem nos niacuteveis de IL-8 e TNF-α entre os grupos
suportando a hipoacutetese do estresse mecacircnico alterando a BAC na HPIE segundo a
conclusatildeo dos autores Contudo a associaccedilatildeo entre LTB4 e PAF foi demonstrada
anteriormente onde o receptor de LTB4 esteve envolvido com a quimiotaxia
pulmonar e degranulaccedilatildeo de neutroacutefilos induzida por PAF (GAUDREAULT et al
2005) Todavia ateacute o momento este tipo de associaccedilatildeo natildeo foi demonstrada em
cavalos apesar de ter-se relatada a neutrofilia nas vias aeacutereas de cavalos com
ORVA mediada por LTB4 (LINDBERG et al 2004) Portanto reunindo as
informaccedilotildees acima pode-se assumir a hipoacutetese de que a neutrofilia no LBA e o
aumento da permeabilidade da BAC nos potros do subgrupo HPIE pos tenha sido
induzida por PAF e mediada por receptor de LTB4
Adicionalmente reforccedila-se a evidecircncia da importacircncia dos macroacutefagos
alveolares na HPIE e por sua vez como a hemorragia pulmonar pode influenciar a
funcionalidade dos macroacutefagos Na primeira etapa do presente estudo descrevemos
a reduccedilatildeo na fagocitose e na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de
95
hidrogecircnio pelos macroacutefagos alveolares do grupo EX (FIGURAS 25 a 27) Contudo
evidenciamos que a HPIE agravou ainda mais esta situaccedilatildeo (FIGURAS 32 e 33)
pois a resposta de macroacutefago alveolar esteve significativamente reduzida no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg
A reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no subgrupo HPIE pos pode ser
explicada novamente pela HAIE com consequumlente inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO
(MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
favorecendo o aumento da permeabilidade capilar (KIKUCHI et al 2008)
provavelmente agravado pela ocorrecircncia de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica neste grupo (MILLS
e HIGGINS 1997)
Os mecanismos pelos quais o NO modula a permeabilidade microvascular
natildeo satildeo bem conhecidos Em cavalos de PSI de corrida a inibiccedilatildeo da NOS pela
administraccedilatildeo de L-NAME agravou a HPIE enquanto natildeo alterou a pressatildeo arterial
pulmonar (KINDIG et al 2000) e a inalaccedilatildeo de NO durante o exerciacutecio reduziu
ligeiramente a pressatildeo arterial pulmonar enquanto tambeacutem causou agravamento da
HPIE (KINDIG et al 2001) Parece que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete
em parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou mas agravou a HPIE
Adicionalmente corroborando com o aumento da bioatividade de PAF e
reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos o estudo de
KWASNIEWSKI et al (2008) com um modelo de lesatildeo e hemorragia em intestino
delgado demonstrou que o preacute tratamento com antagonista de PAF reduziu as
lesotildees enquanto a inibiccedilatildeo do NO endoacutegeno aumentou consideravelmente as
lesotildees hemorraacutegicas e a mortalidade Portanto o estudo citado demonstrou a
existecircncia da relaccedilatildeo entre PAF e NO na hemorragia ocorrida na microcirculaccedilatildeo
assim como reafirma o papel protetor do NO para os efeitos proacute inflamatoacuterios do
PAF (NEVIN e BROADLEY 2002 BRKOVIC e SIROIS 2007)
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
A hipoacutetese do presente estudo foi confirmada pois tanto o desafio ambiental
como o exerciacutecio causaram alteraccedilotildees no fluido broncoalveolar e modificaram a
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar Potros PSI de corrida jovem em treinamento para
corrida apresentaram depressatildeo da resposta imune inata mais especificamente do
macroacutefago alveolar induzida pelo exerciacutecio e agravada pela ocorrecircncia da HPIE
PAF influencia os neutroacutefilos do sangue bem como os macroacutefagos alveolares
de equinos e no presente estudo esteve presente na inflamaccedilatildeo pulmonar induzida
pelo exerciacutecio nos potros PSI durante o treinamento para corrida
Os achados relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e ao aumento da
bioatividade de PAF no fluido broncoalveolar dos potros exercitados estiveram
relacionados agrave HPIE e agrave presenccedila dos hemossideroacutefagos no LBA o que resultou
numa resposta de macroacutefago alveolar ainda mais reduzida
Desta forma assume-se que os resultados obtidos para o grupo EX podem
ser extrapolados para as populaccedilotildees similares de cavalos PSI jovens em
treinamento para a corrida
Finalmente sugere-se a conduccedilatildeo de novos estudos para o entendimento
dos mecanismos inflamatoacuterios envolvidos na HPIE bem como o papel do PAF neste
processo
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Ao Prof Dr Luiz Claacuteudio Fernandes pela inestimaacutevel oportunidade de poder
trabalhar no seu laboratoacuterio disponibilizando material necessaacuterio e seu tempo quando o solicitei
A minha amiga e soacutecia meacutedica veterinaacuteria MS Cassiana Maria Garcez Ramos
Aos meus amigos da Direccedilatildeo do Curso de Medicina Veterinaacuteria da PUCPR Profa
Dra Claacuteudia Turra Pimpatildeo e Prof Rodrigo Taacutevora Mira por todo o apoio incentivo e amizade incondicionais
Aos amigos professores da PUCPR Rita M Rocha Denise Kozemjakin Antonia Maria Marconi Farias pelo apoio
Ao Decano do Centro de Ciecircncias Agraacuterias e Ambientais da PUCPR Prof Dr Sylvio Peacutellico Neto pelo apoio e incentivo
Ao Professor Metry Bacila por tantos exemplos demonstrados e por nunca haver se omitido em ajudar e entusiasmar
As bibliotecaacuterias da UFPR pela ajuda e tambeacutem da PUCPR Lucieli e Teresinha e equipe
A amiga Monica Echeverria pela amizade e apoio no inglecircs nesta e em muitas outras oportunidades Thank you
Ao Laboratoacuterio Fort Dodge pelo apoio me fornecendo os sedativos e pela dedicaccedilatildeo dos competentes profissionais Alessandra Carol e Leonardo que sempre estiveram dispostos a ajudar
Ao amigo Nilton Reis companheiro de trabalho na Unidade Hospitalar para Equinos da PUCPR pelo apoio
Aos amigos do Regimento de Poliacutecia Montada Coronel Dulciacutedio pela amizade e apoio durante esta etapa Coronel Heraldo Reacutegis Boacuterio da Silva Major Lorival da
Cunha Sobrinho Major Maacutercio Luis Fonseca Capitatildeo Adilar Marcelo de Lima e agrave equipe do Centro Veterinaacuterio da PMPR Sargento Faacutetima Sd Manasseacutes e demais amigos
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS IX
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES XI
LISTA DE TABELAS XV
RESUMO XVI
ABSTRACT XVII
1 INTRODUCcedilAtildeO 18
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 18
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA) 18
13 PAF E VIAS AEacuteREAS 23
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 27
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO 29
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE) 34
2 OBJETIVOS 40
21 OBJETIVOS GERAIS 40
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS 41
31 REAGENTES E SEDATIVOS 41
32 ANIMAIS 41
33 ASPECTOS EacuteTICOS43
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA 43
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS 43
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) 45
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA46
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957) 47
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS 48
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE CA++
EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE ET AL 2001) 48
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)51
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR E MARLETTA 1985) 51
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA
(NOUROOZ-ZADEH ET AL 1994)52
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984) 53
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA ET AL 1998) 54
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA ET AL 1998) 54
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK E MIZEL 1981) 55
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN E GORDON 1987) 56
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 57
4 RESULTADOS 59
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO 59
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica59
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas 60
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT) 61
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA) 62
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem Diferencial de Ceacutelulas do LBA 62
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF 63
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF 65
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 67
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 68
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 69
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 70
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA 71
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 72
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar 73
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 74
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO 75
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA 75
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 76
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 77
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 78
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 79
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 80
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-) 80
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 81
5 DISCUSSAtildeO 83
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 96
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 97
LISTA DE ABREVIATURAS
ACVIM American College of Veterinary Internal Medicine
AT Aspirado traqueal
CN Grupo Condiccedilotildees Naturais
DA Grupo Desafio Ambiental
DIVA Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas
DIVAI Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
DPOC Doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica
EX Grupo Exerciacutecio
HAIE Hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio
HPIE Hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
HRPO Horse radish peroxidase
IFN-γ Interferon gama
IL-1 Interleucina-1
IL-4 Interleucina-4
IL-8 Interleucina-8
IL-9 Interleucina-9
IL-17 Interleucina-17
LBA Lavado broncoalveolar
L-NAME N-nitro-L-arginina metil ester
LTB4 Leucotrieno B4
LTE8 Leucotrieno E8
MLCP Myosin light chain phophatase
NO Oacutexido niacutetrico
NOS Oacutexido niacutetrico sintase
NTCN Nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas
ORVA Obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas
PAF Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PAF-AH Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria acetilhidrolase
PAF-R Receptor de fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PBS Soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada
PMA Phorbol myristate acetate
PMN Polimorfonuclear
PRS Phenol red solution
PSI Puro sangue inglecircs
RNS Espeacutecie reativa do nitrogecircnio
ROS Espeacutecie reativa do oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Th2 Linfoacutecitos T helper 2
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE 20
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO SN-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL 24
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM
RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS 25
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E
SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE 30
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA
ASMA 31
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS 32
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO
A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR
(BAC) 36
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO
DERSKEN et al (2009) 38
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA
FARINGE 44
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS
ARITENOacuteIDES DE I A IV 44
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME
ENDOSCOacutePICO 45
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO
DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO
REGISTRADA A 510 nm 50
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA
ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 57
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA
AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 63
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS
DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 64
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO
ANTAGONISTA DE PAF BN52021 64
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO
ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 65
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 66
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR
PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 66
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++
EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 67
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO
EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA
ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 68
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A
PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 69
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO
SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 70
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX
(n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA 71
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) 72
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) 73
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) 74
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) 75
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) HPIE NEG (n=5) e EX NORMAL (n=4) 76
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE
POS (n=13) HPIE NEG (n=12) E EX NORMAL (n=8) 77
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) HPIE NEG (n=10) E EX NORMAL (n=7) 79
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) HPIE NEG (n=8) E EX NORMAL (n=5) 80
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS
POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) HPIE NEG (n=5) E EX NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE
POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 81
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE
PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) HPIE NEG (n=6) E EX
NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2
ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 82
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS
TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE
INGLEcircS DE CORRIDA 59
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGIANOS
OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS
DE I A IV 60
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS
CARTILAGENS ARITENOacuteIDES 60
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA
ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO
SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE
AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 61
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS
CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN
(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS
DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN
(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM
PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO
LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX E DOS
SUBGRUPOS HPIE POS HPIE NEG E EX NORMAL 76
RESUMO
A doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas (DIVA) e a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) satildeo comuns em cavalos de corrida resultando em interrupccedilatildeo no treinamento A hipoacutetese do presente estudo foi de que o ambiente e o exerciacutecio
causam estresse oxidativo produccedilatildeo do fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF) e inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas de potros PSI de corrida e que haacute uma relaccedilatildeo entre a DIVA e a HPIE Estudou-se potros PSI em ambiente natural (NC n=45) estabulados
por 30 dias (DA n=40) e treinados (EX n=34) Apoacutes os potros do grupo EX foram divididos em trecircs subgrupos HPIE pos (presenccedila de hemossideroacutefagos no lavado broncoalveolar - LBA) HPIE neg (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA) e EX
normal (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA e menos de 5 de neutroacutefilos e menos de 1 de eosinoacutefilos no LBA) Avaliou-se perfil citoloacutegico e paracircmetros do LBA relacionados a estresse oxidativo bioatividade de PAF atividade da catalase e
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar (MA) Os percentuais de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no LBA do grupo EX foram maiores (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 e 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectivamente) que os limites superiores para cavalos normais
(5 para neutroacutefilos e 1 para eosinoacutefilos) juntamente com um maior nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 ceacutelulasmicroL de LBA P=0017) evidenciaram a ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo pulmonar A bioatividade de PAF e a
concentraccedilatildeo de proteiacutenas no LBA foram maiores no grupo EX (relaccedilatildeo 340380 nm 0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg de proteiacutenasmL de LBA Plt0001) A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos no LBA foi maior
no grupo DA (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg de proteiacutenas Plt0001) e a atividade da catalase foi maior no grupo EX (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg de proteiacutenas P=0002) A fagocitose de MA (P=0006) bem como a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido (Plt0001) e peroacutexido de hidrogecircnio (P=0006) foram
significativamente menores no grupo EX Vinte e trecircs (622) potros do grupo EX foram HPIE pos e o LBA desse subgrupo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutenas (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) bioatividade de
PAF (relaccedilatildeo 340380 nm 0180 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 P=0042) e concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) significativamente maiores que o subgrupo HPIE neg A concentraccedilatildeo de nitritos
(008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) e a atividade de MA foi menor em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg O ambiente e o exerciacutecio modificaram o fluido broncoalveolar confirmando a hipoacutetese do presente estudo
Houve aumento da resposta de MA induzida pelo ambiente enquanto o exerciacutecio fiacutesico resultou em HPIE inflamaccedilatildeo pulmonar e diminuiccedilatildeo na resposta imune inata relacionada aos macroacutefagos alveolares nos potros PSI jovens durante o treinamento
para corrida e o PAF esteve presente nesse processo Sugere-se a conduccedilatildeo de novas investigaccedilotildees para elucidar os mecanismos inflamatoacuterios da HPIE bem como o papel do PAF neste processo como um potencial alvo terapecircutico
Palavras-chave cavalo fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria hemorragia pulmonar inflamaccedilatildeo pulmonar fluido broncoalveolar
ABSTRACT
Inflammatory airway disease (IAD) and exercise-induced pulmonary hemorrhage (EIPH) are common in racehorses during training being important ailments interrupting training of thoroughbred racehorses The present study hypothesis was
that stabling and exercise cause oxidative stress release of platelet-activating factor (PAF) and inflammation in airways of Thoroughbred colts and that there is an association between IAD and EIPH The subjects were colts in breeding farms (NC
n=45) stabled for 30 days (EC n=40) and race trained (EX n=34) Colts of the EX group were subdivided into three subgroups EIPH pos (presence of hemosiderophages in BALF) EIPH neg (absence of hemosiderophages in BALF)
and Normal EX (absence of hemosiderophages and less than 5 neutrophils and 1 eosinophils in BALF) Cytological profile and parameters of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) related to oxidative stress bioactivity of the pro-inflammatory
mediator PAF catalase activity and alveolar macrophage (AM) activity were studied Percentages of neutrophils and eosinophils in the BALF of the EX group were higher (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 and 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectively)
than the upper limits for normal horses (5 of neutrophils and 1 of eosinophils) that associated with a significantly higher total nucleated cell count (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 cellsmicroL of BALF P=0017) displayed pulmonary inflammation PAF
bioactivity and the total protein concentration in the BALF were higher in the EX group (0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 340380nm ratio P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg of proteinsmL of BALF Plt0001) Concentration of BALF hydroperoxides
was higher in the EC group (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg of proteins Plt0001) and catalase activity was higher in the EX group (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg of proteins P=0002) AM phagocytosis (P=0006) as well as production of superoxide anion (Plt0001) and hydrogen peroxide (P=0006) were
significantly lower in EX group Twenty three (622) colts of the EX group were EIPH pos and the BALF of this subgroup presented a significantly higher protein concentration (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg of proteinsmL of BALF P=0031) PAF
bioactivity (018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 340380 nm ratio P=0042) and lipid hydroperoxide concentration (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg of proteins P=0009) as well as lower nitrite concentration (008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007
absorbance 550 nm P=0049) and AM activity than EIPH neg subgroup Environment and exercise modified the bronchoalveolar fluid confirming the hypothesis of the present study Environment increased AM response as exercise resulted in EIPH
pulmonary inflammation and decreased innate immune response of alveolar macrophages in young Thoroughbred horses during race training and PAF participated in this event Further studies should be conducted to better understand
the inflammatory mechanisms of EIPH and the role of PAF in this process as a potential therapeutic target
Keywords horse platelet-activating factor pulmonary hemorrhage pulmonary
inflammation bronchoalveolar fluid
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
As doenccedilas respiratoacuterias satildeo comuns nos cavalos e as condiccedilotildees a que
estatildeo sujeitos fazem com que a inflamaccedilatildeo seja uma manifestaccedilatildeo frequumlente dessas
afecccedilotildees O epiteacutelio das vias aeacutereas superiores e dos pulmotildees estatildeo expostos a
patoacutegenos invasores e fatores ambientais Portanto o conhecimento dos
mecanismos da resposta inflamatoacuteria nas vias aeacutereas se faz importante a fim de se
estabelecer estrateacutegias para reduzir o impacto e os danos causados (THACKER
2006)
A inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apresenta um agravante o papel dos pulmotildees
na troca gasosa Assim as quatro principais consequumlecircncias de um processo
inflamatoacuterio desencadeado nas vias aeacutereas incluem vasodilataccedilatildeo e a reduccedilatildeo no
fluxo sanguiacuteneo resultando em capilares ingurgitados o aumento da permeabilidade
capilar permitindo a passagem de fluiacutedo e ceacutelulas para os tecidos o influxo e
acuacutemulo de fagoacutecitos e ceacutelulas ativadas no local e a bronconstricccedilatildeo (LUNN et al
2007)
O estudo das doenccedilas respiratoacuterias em cavalos eacute relevante particularmente
nos cavalos jovens de corrida onde a taxa de inflamaccedilatildeo detectada nas vias aeacutereas
eacute significativa (CHRISTLEY e RUSH 2007)
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA)
Os termos ldquodoenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereasrdquo (DIVA) e ldquodoenccedila
inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferioresrdquo (DIVAI) tecircm sido usados para descrever uma
siacutendrome inflamatoacuteria do trato respiratoacuterio de cavalos de corrida (CHRISTLEY e
RUSH 2007)
Tem-se relatado que a DIVA ocorre em 11 a 50 dos cavalos de corrida em
treinamento chegando a afetar ateacute 80 dos cavalos de corrida de dois anos de
idade (CHRISTLEY e RUSH 2007) MALIKIDES (2003) estudou a prevalecircncia da
DIVA em cavalos de corrida na Austraacutelia evidenciando que 41 deles apresentaram
inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apoacutes duas semanas de iniciarem treinamento
19
A DIVA eacute considerada a segunda afecccedilatildeo mais comum a interromper o
treinamento para corridas (WILSHER et al 2006) podendo resultar em prejuiacutezos a
troca gasosa e diminuiccedilatildeo da capacidade atleacutetica (COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005)
Cavalos com DIVA ou com hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) apresentaram uma maior hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE)
(CHRISTLEY et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
(FIGURA 1)
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE EIPH HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO IAD DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS UAO OBSTRUCcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS SUPERIORES FONTE SAacuteNCHEZ et al (2005)
Cavalos trotadores de corrida diagnosticados com DIVA tiveram a mecacircnica
pulmonar (volume corrente frequumlecircncia respiratoacuteria ventilaccedilatildeo pulmonar duraccedilatildeo da
inspiraccedilatildeo e da expiraccedilatildeo complacecircncia dinacircmica) alterada apresentaram um
significativo aumento da carga ventilatoacuteria e da energia requerida para a respiraccedilatildeo
sofrendo restriccedilotildees em seu rendimento atleacutetico (PIRRONE et al 2007)
Contudo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas dos cavalos atletas natildeo eacute entendida
por completo especialmente pela falta de consistecircncia e precisatildeo na definiccedilatildeo
dessa siacutendrome (CHRISTLEY e RUSH 2007)
Recentemente um painel de discussatildeo promovido pelo American College of
Veterinary Internal Medicine (ACVIM) definiu que a DIVA pode ocorrer em cavalos
de qualquer idade e eacute caracterizada pelo seguinte fenoacutetipo (COUEumlTIL et al 2007)
20
- Baixo rendimento desportivo intoleracircncia ao exerciacutecio
- Tosse com ou sem quantidade excessiva de muco traqueal
- Inflamaccedilatildeo natildeo seacuteptica detectada pela avaliaccedilatildeo citoloacutegica do fluido do LBA
ou disfunccedilatildeo pulmonar baseada em evidecircncia de obstruccedilatildeo de vias aeacutereas
inferiores hiperresponsividade das vias aeacutereas ou prejuiacutezo a troca gasosa durante o
repouso ou exerciacutecio
Este painel formado por experts e pesquisadores da aacuterea propocircs tambeacutem
alguns fatores de exclusatildeo para a DIVA
- Evidecircncia de sinais sistecircmicos de infecccedilatildeo (febre alteraccedilotildees hematoloacutegicas
compatiacuteveis com infecccedilatildeo)
- Aumento do esforccedilo respiratoacuterio durante o repouso
A etiopatogenia da DIVA eacute pouco definida Acredita-se que uma variedade de
fatores de risco estejam envolvidos variando nas diferentes populaccedilotildees de cavalos
baseado na alimentaccedilatildeo manejo praacuteticas preventivas distribuiccedilatildeo de agentes
infecciosos e influecircncias geneacuteticas (COUEumlTIL et al 2007)
Alguns autores encontraram uma reduccedilatildeo da incidecircncia desta afecccedilatildeo em
cavalos mais velhos (BURRELL et al 1996 CHAPMAN et al 2000 CHRISTLEY et
al 2001 WOOD et al 2005) sendo que a idade natildeo provocou diferenccedila no estudo
de McKANE et al (1993)
O ambiente da cocheira representa um risco adicional para a DIVA nos
cavalos (BURRELL et al 1996 HOLCOMBE et al2001 CLEMENTS e PIRIE
2007 BERNDT et al 2008) bem como para a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas das
pessoas envolvidas no trabalho com os cavalos (ELFMAN et al 2009)
HOLCOMBE et al (2001) associaram o manejo de estabulaccedilatildeo com a
ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas inferiores Estudaram 14 potros aacuterabes
que foram transferidos da pastagem para cocheiras com cama de palha Apoacutes 90
dias de estabulados houve um aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no
lavado broncoalveolar (LBA) Cavalos estabulados em cama de palha tambeacutem
apresentaram maior chance de apresentar DIVA em outros estudos (BURRELL et
al 1996 WOODS et al 1993)
No entanto em cavalos de montaria no estado norte-americano de Michigan
foi a permanecircncia em piquetes durante o inverno que esteve associado com
aumento do acuacutemulo de muco traqueal com maior nuacutemero de neutroacutefilos Neste
21
estudo a alimentaccedilatildeo com feno tambeacutem representou risco para a ocorrecircncia de
inflamaccedilatildeo (ROBINSON et al 2006)
Contudo o ambiente de cocheiras em modelos convencionais de manejo aos
quais os cavalos em treinamento estatildeo submetidos reconhecidamente apresenta
riscos para as vias aeacutereas Nestes haacute aumento nas concentraccedilotildees de partiacuteculas
inalaacuteveis contendo partiacuteculas orgacircnicas e inorgacircnicas incluindo endotoxinas β-D-
glucan partiacuteculas ultra finas (lt100 nm de diacircmetro) microorganismos esporos de
fungos material vegetal poeira inorgacircnica e gases toacutexicos (COUEumlTIL et al 2007)
Recentemente no estudo de BERNDT et al (2008) se demonstrou que o ambiente
de cocheira apresenta uma concentraccedilatildeo de endotoxinas 8 vezes maior que nos
piquetes
Aleacutem disso haacute muito jaacute foi descrita a presenccedila de actinomicetos termofiacutelicos
como a Micropolyspora faeni nos fenos fornecidos aos cavalos capazes de serem
inalados atingindo as vias aeacutereas inferiores (McPHERSON e THOMSON 1983)
Assim a praacutetica de encharcar o feno antes da administraccedilatildeo para diminuir a
quantidade de poeira disponiacutevel resultou em benefiacutecio agraves vias aeacutereas dos cavalos
(CLEMENTS e PIRIE 2007)
Por outro lado a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA ainda
natildeo estaacute bem esclarecida Cavalos com sinais cliacutenicos de inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas apresentaram maior frequecircncia de isolados bacterianos nos estudos de
CHRISTLEY et al (2001) e WOOD et al (2005) apesar de o painel do ACVIM
entender que a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA precisa ser
melhor estudada (COUEumlTIL et al 2007)
O exerciacutecio tambeacutem tem sido associado agrave inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas
inferiores dos cavalos atletas (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) A prevalecircncia da DIVA eacute maior em cavalos em treinamento
que em cavalos do mesmo grupo mas sem treinamento talvez pela inalaccedilatildeo de
maiores quantidades de partiacuteculas pela exposiccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores ao ar
frio ou pela ocorrecircncia da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (DAVIS et
al 2006 CHRISTLEY e RUSH 2007)
O diagnoacutestico da DIVA inclui a histoacuteria e o exame fiacutesico detalhados para a
identificaccedilatildeo de potenciais fatores etioloacutegicos A tosse durante o exerciacutecio ou
durante a alimentaccedilatildeo constitui a queixa mais comum (CHRISTLEY e RUSH 2007)
esteve associada agrave presenccedila de quantidades aumentadas de secreccedilatildeo traqueal bem
22
como a um maior percentual de neutroacutefilos tanto na secreccedilatildeo traqueal (CHRISTLEY
et al 2001) como no LBA (BENEDICE et al 2008) mas sua ausecircncia natildeo descarta
o diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
A presenccedila de descarga nasal mucopurulenta eacute achado comum em cavalos
de corrida de dois anos de idade sendo menos comum em cavalos mais velhos
Sua relaccedilatildeo com a DIVA todavia natildeo eacute sabida (COUEumlTIL et al 2007)
A auscultaccedilatildeo toraacutecica durante o repouso raramente evidencia alteraccedilotildees em
cavalos atletas com inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores (MAZAN e HOFFMAN
2003 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007) sendo necessaacuteria a
utilizaccedilatildeo de uma sacola para o cavalo respirar no seu interior ampliando o esforccedilo
respiratoacuterio (bdquorebreathing bagrsquo) podendo tornar audiacuteveis alguns sons anormais em
certos casos (MAZAN e HOFFMAN 2003 COUEumlTIL et al 2007)
MAZAN e HOFFMAN (2003) relataram que os testes de funccedilatildeo pulmonar
como o pneumotacoacutegrafo e o teste de broncoprovocaccedilatildeo com histamina podem
auxiliar tornando o diagnoacutestico da DIVA definitivo Contudo o diagnoacutestico precoce
da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores deve enfatizar a avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA
e natildeo os testes de funccedilatildeo pulmonar (COUEumlTIL et al 2007)
A avaliaccedilatildeo citoloacutegica do AT tambeacutem tem contribuido ao diagnoacutestico dos
processos inflamatoacuterios das vias aeacutereas contudo natildeo eacute considerado suficiente para
o diagnoacutestico da DIVA Isto se deve a falta de concordacircncia entre os achados
citoloacutegicos do AT e do LBA e da falta de estudos associando os achados no AT e o
rendimento atleacutetico (HODGSON e HODGSON 2003 HUGHES et al 2003
COUEumlTIL et al 2007) Ainda um cuidado a ser levado em conta quando da
realizaccedilatildeo de AT eacute o tempo da colheita jaacute que a realizaccedilatildeo de exerciacutecio
esteneuante pode aumentar o percentual de neutroacutefilos na amostra obtida
(MALIKIDES et al 2007)
O LBA por sua vez eacute o meacutetodo para a obtenccedilatildeo de amostras de ceacutelulas
presentes nas vias aeacutereas mais distais e espaccedilo alveolar (HOFFMAN 1999
FERNANDES et al 2000 LESSA et al 2005) considerado como uma bioacutepsia
liacutequida (MAZAN e HOFFMAN 2003) sendo a teacutecnica de avaliaccedilatildeo citoloacutegica
preferida para o diangoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
Um aumento no percentual de ceacutelulas inflamatoacuterias no fluido do LBA eacute um dos
principais criteacuterios diagnoacutesticos para a DIVA Usualmente ocorre uma predominacircncia
de neutroacutefilos mas tambeacutem pode ocorrer aumento nos nuacutemeros percentuais de
23
eosinoacutefilos linfoacutecitos e mastoacutecitos normalmente associados com diminuiccedilatildeo no
rendimento desportivo e hiperresponsividade das vias aeacutereas (McKANE et al 1993
HARE e VIEL 1998 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007)
O perfil citoloacutegico de LBA mais comumente encontrado em cavalos com DIVA
eacute caracterizado por aumento no nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (NTCN) com
discreta neutrofilia (gt5) linfocitose e monocitose Tambeacutem pode ser encontrado
um aumento do nuacutemero percentual de eosinoacutefilos (gt01) e mastoacutecitos (gt2)
(HOFFMAN 1999 COUEumlTIL et al 2007)
O painel de estudo da DIVA promovido pelo ACVIM apontou direccedilotildees para as
pesquisas nesta aacuterea e dentre elas o estudo das citocinas e mediadores
inflamatoacuterios envolvidos no processo (COUEumlTIL et al 2007)
Sabe-se que ocorre um incremento da imunidade inata nas vias aeacutereas dos
cavalos estabulados com o envolvimento de IL-6 (RIIHIMAumlKI et al 2008a) Em
cavalos trotadores de corrida em treinamento ocorre uma eosinofilia transitoacuteria no
fluido broncoalveolar e um aumento da expressatildeo de IL-4 e IL-5 contudo natildeo foi
encontrada correlaccedilatildeo entre estes eventos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Dentre os mediadores quiacutemicos participantes do processo inflamatoacuter io nas
vias aeacutereas o PAF (platelet-activating factor) estaacute especialmente implicado na asma
sepse e injuacuteria pulmonar aguda (THACKER 2006) presente tambeacutem na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas em cavalos mais velhos
(FAIRBAIRN et al 1996) Contudo a participaccedilatildeo do PAF no processo inflamatoacuterio
nas vias aeacutereas de cavalos atletas ainda natildeo eacute conhecida
13 PAF E VIAS AEacuteREAS
O fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocoline)
eacute um potente mediador proacute inflamatoacuterio envolvido na angiogecircnese aterosclerose
anafilaxia cicatrizaccedilatildeo inflamaccedilatildeo apoptose e endotoxemia (MARATHE et al
2001 STAFFORINI et al 2003 OWEN et al 2005) O PAF eacute produzido por
eosinoacutefilos macroacutefagos alveolares neutroacutefilos plaquetas e ceacutelulas endoteliais
(BAKER et al 2002 STAFFORINI et al 2003 GAUDREAULT et al 2005 SUMITA
et al 2005) a partir de uma subclasse especiacutefica de fosfatidilcolina que conteacutem um
eacuteter ao inveacutes de um eacutester ligado a posiccedilatildeo sn-1 do esqueleto de glicerol (FIGURA
24
2) A fosfatidilcolina eacute o mais abundante fosfolipiacutedio presente nas membranas
bioloacutegicas (MARATHE et al 2001 OWEN et al 2005)
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO sn-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL FONTE MARATHE et al (2001)
O PAF tambeacutem estaacute envolvido numa variedade de funccedilotildees pulmonares como
por exemplo no tocircnus vascular e das vias aeacutereas na frequumlecircncia de movimentaccedilatildeo
dos ciacutelios e na permeabilidade endotelial causando um aumento da secreccedilatildeo de
fluido traqueal broncoconstricccedilatildeo edema e hiperresponsividade das vias aeacutereas
resultando em prejuiacutezos a troca gasosa (CLAVIJO et al 2001 GABRIJELCIC et al
2003 ISHII et al 2004 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008)
Os efeitos do PAF sobre a circulaccedilatildeo pulmonar foram descritos por diversos
autores CHEN et al (1992) demonstraram um aumento das pressotildees arterial e
microvascular pulmonares e edema apoacutes a injeccedilatildeo de PAF SHIBAMOTO et al
(1993) estudaram os efeitos do PAF na circulaccedilatildeo venosa em pulmatildeo de catildeo onde
o PAF causou venoconstricccedilatildeo e aumento da pressatildeo capilar sem aumento da
permeabilidade vascular OHAR et al (1994) tambeacutem demonstraram
venoconstricccedilatildeo em estudo com pulmatildeo de coelhos mas demostraram que a
reduccedilatildeo da complacecircncia e aumento da resistecircncia vascular deveu-se a alteraccedilatildeo
estrutural vascular por perda de colaacutegeno intersticial induzida por PAF
Contudo o papel do PAF como causador de aumento da permeabilidade
vascular e edema pulmonar estaacute bem estudado devido a sua participaccedilatildeo na
fisiopatologia da anafilaxia da endotoxemia e da asma (EVANS et al 1987
25
CLAVIJO et al 2001 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008
MUEHLMANN et al 2009)
Em estudo preacutevio o extravasamento microvascular ocorrido apoacutes a infusatildeo de
PAF natildeo foi acompanhado de aumento da pressatildeo arterial pulmonar assim os
autores concluiacuteram que o edema pulmonar mediado por PAF resulta de aumento da
permeabilidade microvascular pulmonar (CLAVIJO et al 2001)
De fato demonstrou-se que o aumento da permeabilidade capilar induzida
por PAF ocorre pela formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular devido a
desorganizaccedilatildeo das proteiacutenas juncionais VE-caderina e ocludina (ZHANG et al
2003 JIANG et al 2008) mediada por receptores especiacuteficos (EVANS et al 1987)
e atraveacutes da ativaccedilatildeo da via do insositol trisphosphato e influxo de caacutelcio (GOumlGGEL
e UHLIG 2005) (FIGURA 3)
PLC phopholipase C IP3 inositol 145-trisphosphato IP3R receptor de IP3
MLCK myosin light chain kinase ML-7 5-iodonaphthalene-1sulphonyl-
homopiperazine L108 edelfosina Inibiccedilatildeo ativaccedilatildeo
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS NO LADO ESQUERDO OBSERVA-SE O EFEITO DO PAF EM CEacuteLULAS ENDOTELIAIS NO LADO DIREITO OBSERVA-SE OS EFEITOS DO PAF EM CEacuteLULAS DA MUSCULATURA LISA VASCULAR E DAS VIAS AEacuteREAS A QUAL Eacute ALTAMENTE MEDIADA POR TROMBOXANO NESTE A VIA PRINCIPAL Eacute ATRAVEacuteS DA ATIVACcedilAtildeO DE RHO E PROTEIacuteNAS KINASES ASSOCIADAS Agrave RHO QUE ATENUAM A ATIVIDADE DA MLCP (MYOSIN LIGHT CHAIN PHOPHATASE) COM CONSEQUumlENTE AUMENTO DA FOSFORILACcedilAtildeO DA CADEIA LEVE DA MIOSINA E PORTANTO A CONTRACcedilAtildeO FONTE GOumlGGEL e UHLIG (2005)
26
Adicionalmente os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) (BELLAN et al 1992) O
aumento da produccedilatildeo de NO induzida por PAF via ativaccedilatildeo de receptor de PAF foi
demonstrado em ceacutelulas do endoteacutelio vascular humano considerado como um efeito
cardioprotetor (KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Contudo particularmente
na microcirculaccedilatildeo o NO contra-ataca muitos dos efeitos bioloacutegicos do PAF inibindo
a vasoconstricccedilatildeo arteriolar e o aumento da permeabilidade vascular aleacutem de inibir
a adesatildeo de plaquetas e de leucoacutecitos ao endoteacutelio (BRKOVIC e SIROIS 2007
KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Mas os mecanismos pelos quais o NO
modula a permeabilidade microvascular ainda natildeo satildeo bem entendidos podendo ser
confusos e dependentes do estado das ceacutelulas endoteliais (RAMIREZ et al 2006)
A inibiccedilatildeo da NO sintase (NOS) em ceacutelulas endoteliais atenuou o aumento da
permeabilidade microvascular induzida por PAF no estudo de ZHU et al (2004) Por
outro lado estudando a participaccedilatildeo de NO e PAF em lesotildees de intestino delgado
de ratos KWASNIEWSKI et al (2008) evidenciaram que a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de
NO endoacutegeno aumentou bastante as lesotildees hemorraacutegicas e a taxa de mortalidade
demonstrando o papel proacute inflamatoacuterio do PAF e o efeito protetor do NO na
microcirculaccedilatildeo Tal relaccedilatildeo tambeacutem foi descrita por BRKOVIC e SIROIS (2007)
estudando o papel do PAF e do NO nos efeitos proacute inflamatoacuterios resultantes da
participaccedilatildeo de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e concluindo que eacute
o PAF que diretamente aumenta a permeabilidade vascular sendo o NO um cofator
A atuaccedilatildeo do PAF como mediador inflamatoacuterio eacute bastante importante na
asma onde aleacutem de provocar aumento da permeabilidade vascular tambeacutem induz
uma neutropenia transitoacuteria seguida de neutrofilia resultando no recrutamento de
neutroacutefilos para o pulmatildeo evidenciado atraveacutes de estudo citoloacutegico do lavado
broncoalveolar (LEE et al 2002 GABRIJELCIC et al 2003)
No estudo de AU et al (2001) a ativaccedilatildeo de neutroacutefilos resultou em ativaccedilatildeo
dos receptores de PAF aumento da fagocitose de neutroacutefilos e subsequumlente
liberaccedilatildeo de interleucina-8 (IL-8) causando mais quimiotaxia de neutroacutefilos
Adicionalmente demonstrou-se que haacute envolvimento de receptor 1 de leucotrieno B4
(LTB4) nas atividades de neutroacutefilos humanos mediadas por PAF (GAUDREAULT et
al 2005)
Em indiviacuteduos asmaacuteticos e com doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC)
o influxo de neutroacutefilos mediado por PAF nas vias aeacutereas foi modulado pelo aumento
27
de LTB4 provavelmente pelo estiacutemulo de PAF para a liberaccedilatildeo de LTB4 dos
macroacutefagos alveolares (SHINDO et al 1998 GABRIJELCIC et al 2003 FINNEY-
HAYWARD et al 2009)
Nas vias aeacutereas dos cavalos se demonstrou a participaccedilatildeo do PAF na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas (ORVA) levando a um
aumento do recrutamento de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo resultando em
prejuiacutezos agrave funccedilatildeo pulmonar (FAIRBAIRN et al 1996)
O PAF tendo como uma de suas origens o macroacutefago alveolar eacute capaz de
modificar o comportamento de neutroacutefilos sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da
adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a
ORVA (MARR et al 2002)
A participaccedilatildeo do PAF na asma humana e em outras espeacutecies foi evidenciada
pela sua capacidade em reproduzir mecanismos fisiopatoloacutegicos tais como a
broncoconstricccedilatildeo hiperresponsividade das vias aeacutereas aumento da
permeabilidade na microcirculaccedilatildeo pulmonar e aumento na secreccedilatildeo de muco (LOU
et al 1998 ISHII et al 2004 MUEHLMANN et al 2009)
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
Os desafios indutores de alteraccedilotildees na funcionalidade dos macroacutefagos
alveolares resultando em quimiotaxia de neutroacutefilos para as vias aeacutereas levam a um
quadro inflamatoacuterio pulmonar acompanhado de hipersecreccedilatildeo de muco Por sua vez
o muco presente nas vias aeacutereas possui uma seacuterie de funccedilotildees essenciais que
coletivamente levam a proteccedilatildeo das vias aeacutereas Juntamente com as ceacutelulas
epiteliais forma o sistema mucociliar que associado agrave tosse eacute essencial para
manter as vias aeacutereas desobstruiacutedas (ADLER 2005)
Por outro lado a produccedilatildeo excessiva de muco representa um fator importante
de morbidade e mortalidade nas doenccedilas das vias aeacutereas (THORNTON e
SHEEHAN 2004) Assim a resposta imunoloacutegica do epiteacutelio das vias aeacutereas frente
a infecccedilotildees virais e bacterianas e endotoxinas inaladas eacute caracterizada pela
liberaccedilatildeo de citocinas e pela produccedilatildeo de mucinas para prover proteccedilatildeo adicional
(HODGSON et al 2003 GERBER et al 2004 LORA et al 2005) Entretanto nos
quadros inflamatoacuterios os danos teciduais substanciais podem levar a produccedilatildeo
28
excessiva de muco e comprometimento da funccedilatildeo respiratoacuteria (LORA et al 2005
ROBINSON 2005)
O muco eacute uma mistura de aacutegua (~95) eletroacutelitos (~1) lipiacutedios (~1)
proteiacutenas (2-3) enzimas proteiacutenas seacutericas e mucinas (GERBER 2001) As
mucinas glicoproteiacutenas oligomeacutericas representam um constituinte importante do
muco sendo o gene responsaacutevel pela produccedilatildeo de mucinas o MUC5 (THORNTON
e SHEEHAN 2004)
Nas vias aeacutereas a produccedilatildeo de mucinas ocorre predominantemente pelas
ceacutelulas caliciformes do epiteacutelio e em menor parte nas glacircndulas da submucosa
(GERBER et al 2004 THORNTON e SHEEHAN 2004) A produccedilatildeo de
quantidades excessivas de muco pode representar a causa direta de obstruccedilatildeo
bronquial podendo amplificar o efeito de estreitamento luminal da broncoconstricccedilatildeo
e estar associada ao comprometimento da funccedilatildeo pulmonar tosse e capacidade
reduzida para a corrida em atletas humanos (HALLSTRAND et al 2007) e em
cavalos de corrida (CHRISTLEY et al 2001 HOLCOMBE et al 2006)
Assim a quantidade de muco secretado apresenta uma correlaccedilatildeo estreita
com a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas (GERBER et al 2004 ROBINSON et al 2003
HOLCOMBE et al 2006 ROBINSON 2005) De fato haacute uma evidente associaccedilatildeo
entre a hipersecreccedilatildeo de muco e presenccedila de quantidades aumentadas de
neutroacutefilos nas secreccedilotildees respiratoacuterias em seres humanos e em cavalos
(HODGSON et al 2003 ROBINSON et al 2003 ADLER 2005) Contagens de
neutroacutefilos no LBA menores que 30 ceacutelulasμL correspondem a pequenas
quantidades de muco nas vias aeacutereas e os acuacutemulos de secreccedilatildeo aumentam
quando as quantidades de neutroacutefilos estatildeo entre 30 e 100 ceacutelulasμL Entre 100 e
1000 ceacutelulasμL ocorre obstruccedilatildeo mensuraacutevel das vias aeacutereas Possivelmente esse
mecanismo pode estar relacionado com a secreccedilatildeo de proteiacutenas pelos neutroacutefilos
(ROBINSON et al 2003) De fato jaacute foi demonstrado que o neutroacutefilo secreta
elastase a qual estaacute associada com um aumento nas secreccedilotildees relacionadas com a
expressatildeo do gene MUC5 (SHAO e NADEL 2005) e metaplasia de ceacutelulas
caliciformes (VOYNOW et al 2004)
A expressatildeo anormal de neutroacutefilos e de moleacuteculas de adesatildeo em indiviacuteduos
com asma e doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC) foi demonstrada por
GABRIJELCIC et al (2003) Aleacutem do aumento no nuacutemero de neutroacutefilos tambeacutem
foram observados diferentes padrotildees de ativaccedilatildeo e niacuteveis aumentados de elastase
29
neutrofiacutelica e IL-8 Estes uacuteltimos bem como a expressatildeo do gene MUC5 estatildeo
associados a um aumento no estresse oxidativo pulmonar (DROST et al 2005
SHAO e NADEL 2005)
A associaccedilatildeo entre a severidade da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas e o estresse
oxidativo em cavalos com ORVA foi relatada por KIRSCHVINK et al (2008) os
quais relacionaram a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas ao aumento da glutationa oxidada
do aacutecido uacuterico e de isoprostano (8-iso-PGF2α) no LBA
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO
Estresse oxidativo eacute o termo utilizado para descrever os danos causados
quando as espeacutecies reativas do oxigecircnio (ROS) superam a capacidade de defesa
antioxidante do indiviacuteduo (WOOD et al 2003)
Entretanto tanto as ROS como as espeacutecies reativas do nitrogecircnio (RNS)
ocorrendo em concentraccedilotildees pequenas a moderadas apresentam importante papel
na fisiologia celular incluindo a defesa contra invasores e atuando em diversas vias
de sinalizaccedilatildeo celular e na induccedilatildeo da resposta mitogecircnica O estresse oxidativo
propriamente dito ocorre quando o sistema redox sofre desequiliacutebrio pela produccedilatildeo
aumentada de ROS eou RNS ou produccedilatildeo reduzida de antioxidantes (VALKO et al
2007)
Os pulmotildees encontram-se sujeitos ao estresse oxidativo pois estatildeo
diretamente expostos a quantidades muito elevadas de oxigecircnio o que torna
imperativo que este oacutergatildeo possua um arsenal para a defesa contra possiacuteveis
ataques oxidativos Portanto os pulmotildees satildeo providos de um desenvolvido sistema
de defesa endoacutegeno constituiacutedo de agentes chamados antioxidantes Os
antioxidantes ajudam os pulmotildees a se livrarem dos efeitos de uma variedade de
oxidantes provenientes do oxigecircnio (ROS) como o acircnion superoacutexido radical
hidroxila peroacutexido de hidrogecircnio e do nitrogecircnio (RNS) como o oacutexido niacutetrico (NO)
peroxinitrito e nitritos endoacutegenos e do ambiente Os principais sistemas
antioxidantes natildeo enzimaacuteticos dos pulmotildees satildeo a glutationa a vitamina C a
vitamina E o beta-caroteno e o aacutecido uacuterico enquanto os antioxidantes enzimaacuteticos
satildeo as superoacutexido dismutases a catalase e as peroxidases (RAHMAN et al 2006)
(FIGURA 4)
30
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE O2- AcircNION SUPEROacuteXIDO NO OacuteXIDO NIacuteTRICO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO ONOO- PEROXINITRITO FE2+ IacuteON FERROSO GPX GLUTATIONA PEROXIDASE FONTE RAHMAN et al (2006)
O estresse oxidativo pode resultar em muitos prejuiacutezos agraves funccedilotildees das vias
aeacutereas incluindo a contraccedilatildeo da musculatura lisa das vias aeacutereas a induccedilatildeo de
hiperresponsividade das vias aeacutereas a hipersecreccedilatildeo de muco danos ao epiteacutelio
respiratoacuterio e aumento da permeabilidade capilar (WOOD et al 2003)
A fisiopatologia da asma e da DPOC caracteriza-se por inflamaccedilatildeo crocircnica
localizada e estresse oxidativo O estresse oxidativo ocorre pelo aumento de
agentes oxidantes que satildeo inalados bem como por grandes quantidades de ROS
liberadas das ceacutelulas inflamatoacuterias Niacuteveis aumentados de ROS aumentam a
resposta inflamatoacuteria diretamente ou via formaccedilatildeo de produtos da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica levando a um aumento na severidade da doenccedila (KIRKHAM e RAHMAN
2006)
A peroxidaccedilatildeo dos lipiacutedios da membrana celular leva a geraccedilatildeo de
isoprostanos (FIGURA 5) um composto bioativo semelhante agraves prostaglandinas Os
isoprostanos satildeo produzidos independentemente das enzimas ciclooxigenases via
peroxidaccedilatildeo do aacutecido aracdocircnico catalizada por ROS apresentando potente efeito
31
constritor na musculatura lisa respiratoacuteria hiperresponsividade e exsudaccedilatildeo de
plasma nas vias aeacutereas (WOOD et al 2003)
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA ASMA IL INTERLEUCINA TH2 CEacuteLULAS T-HELPER TIPO 2 ROS ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO O2
- AcircNION SUPEROacuteXIDO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO NADPH NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO REDUZIDA NADP NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO SOD SUPEROacuteXIDO DISMUTASE EPO PEROXIDASE EOSINOFIacuteLICA MPO MIELOPEROXIDASE NF FATOR DE TRANSCRICcedilAtildeO NUCLEAR FONTE WOOD et al (2003)
O oacutexido niacutetrico (NO) sintetizado enzimaticamente pela oxidaccedilatildeo do
aminoaacutecido L-arginina para L-citrulina apresenta diversas funccedilotildees fisioloacutegicas nas
vias aeacutereas como o relaxamento da musculatura lisa a regulaccedilatildeo da responsividade
e da permeabilidade das vias aeacutereas e na defesa contra invasores Contudo em
altas concentraccedilotildees o NO apresenta diversos efeitos proacute inflamatoacuterios participando
da infiltraccedilatildeo de ceacutelulas inflamatoacuterias e apresentando efeitos citotoacutexicos sobre
32
diversas ceacutelulas tal como a ceacutelula do epiteacutelio respiratoacuterio especialmente por
interagir com o acircnion superoacutexido formando o peroxinitrito (REDINGTON 2006)
As ceacutelulas inflamatoacuterias recrutadas agraves vias aeacutereas do indiviacuteduo asmaacutetico
apresentam excepcional capacidade de produccedilatildeo de oxidantes Eosinoacutefilos
neutroacutefilos e macroacutefagos bem como ceacutelulas do epiteacutelio respiratoacuterio podem gerar
oxidantes Inicialmente ocorre a formaccedilatildeo de acircnion superoacutexido no complexo
dependente de NADPH oxidase na membrana celular no sistema xantina oxidase
citosoacutelico e na cadeia respiratoacuteria mitocondrial (FIGURA 6) (CARAMORI e PAPI
2004) A seguir a interaccedilatildeo do acircnion superoacutexido com outros oxidantes e o ataque
oxidativo ao tecido pulmonar leva agrave peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e danos ao tecido pulmonar
(MILLS e HIGGINS 1997 KIRKHAM e RAHMAN 2006)
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS FONTE CARAMORI E PAPI (2004)
O estudo do estresse oxidativo na asma se utiliza de modelos que podem
envolver os murinos (MUEHLMANN et al 2009) ou mesmo os cavalos jaacute que estes
naturalmente desenvolvem a ORVA doenccedila respiratoacuteria com diversas similaridades
com a asma humana (DEATON 2006)
33
Nos cavalos com ORVA os marcadores de estresse oxidativo estatildeo
aumentados e diretamente relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e infiltrado
inflamatoacuterio neutrofiacutelico (KIRSCHVINK et al 2008) ao aumento da produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por neutroacutefilos sanguiacuteneos apoacutes a exposiccedilatildeo agrave poeira orgacircnica
ambiental (MARR et al 1997) e ao aumento da secreccedilatildeo de muco apresentando
tambeacutem concentraccedilotildees reduzidas de aacutecido ascoacuterbico no fluido do epiteacutelio respiratoacuterio
(DEATON 2006)
O exerciacutecio fiacutesico por sua vez tambeacutem pode causar estresse oxidativo nas
vias aeacutereas em atletas humanos e em cavalos pela geraccedilatildeo de ROS e RNS (MILLS
e HIGGINS 1997 ART e LEKEUX 2005 KIRSCHVINK et al 2008)
Os cavalos de corrida apresentam a habilidade de aumentar o consumo de
oxigecircnio em 60 vezes durante o esforccedilo maacuteximo o que representa um fator de risco
ao estresse oxidativo nesses animais (ART e LEKEUX 2005)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica eacute o marcador de dano oxidativo poacutes exerciacutecio mais
estudado (DEATON e MARLIN 2003) Em atletas humanos houve aumento da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes a realizaccedilatildeo de ultramaratona (MASTALOUDIS et al
2004) mas o treinamento produziu efeitos beneacuteficos e reduccedilatildeo dos marcadores de
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes um periacuteodo de treinamento (MIYAZAKI et al 2001
BALOG et al 2006) Em cavalos o exerciacutecio submaacuteximo induziu um aumento nos
hidroperoacutexidos lipiacutedicos plasmaacuteticos dentro de 5 minutos apoacutes o teacutermino (DEATON e
MARLIN 2003)
As ROS e seus produtos como os peroacutexidos lipiacutedicos podem diretamente
danificar o tecido pulmonar e causar um incremento da pressatildeo vascular pulmonar
pela liberaccedilatildeo aumentada de mediadores inflamatoacuterios vasoconstrictores (pex
PAF) interferindo na atividade do NO como vasodilatador podendo assim contribuir
na patogecircnese da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) nos cavalos
atletas (MILLS e HIGGINS 1997)
34
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE)
A HPIE eacute caracterizada por hipertensatildeo pulmonar edema nas regiotildees de
troca gasosa ruptura dos capilares pulmonares e a presenccedila de sangue nas vias
aeacutereas (ERICKSON e POOLE 2007) sendo extremamente comum em cavalos de
corrida (PEREZ-MORENO et al 2009)
Tem-se relatado que a HPIE ocorre essencialmente em todos os cavalos
PSI de corrida em treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007) mas
tambeacutem constitui um problema em outras raccedilas de cavalos que realizam exerciacutecio
intenso como os trotadores e os quarto de milha e em cavalos realizando exerciacutecio
de menor intensidade como os cavalos de salto e traccedilatildeo (LAPOINTE et al 1994
ERICKSON e POOLE 2007 VICINO 2007)
O comprometimento ao rendimento desportivo causado pela HPIE natildeo havia
sido comprovado ateacute o estudo de HINCHCLIFF et al (2005a) quando demonstraram
que cavalos de corrida com HPIE grau 1 apresentaram 4 vezes mais possibilidades
de vencer em relaccedilatildeo a graduaccedilotildees mais elevadas de hemorragia
Cavalos PSI de corrida estatildeo sob maior risco de apresentar HPIE porque
apresentam pressatildeo capilar pulmonar mais elevada que cavalos de outras raccedilas e
atividades durante o esforccedilo maacuteximo (HACKETT et al 2003)
Adicionalmente a criaccedilatildeo seletiva de cavalos de corrida visando que sejam
cada vez mais capazes de atingir altas velocidades associado a consumo bastante
alto de oxigecircnio resultou em deacutebito cardiacuteaco substancial (WEST e MATHIEU-
COSTELLO 1994) e barreira alveacuteolo-capilar (BAC) bastante fina (WEST e
MATHIEU-COSTELLO 1999) A espessura meacutedia em micrometros do interstiacutecio da
BAC eacute 0175 plusmn 0010 em coelhos 0318 plusmn 0081 em catildees e 0390 plusmn 002 em
cavalos evidenciando que proporcionalmente a BAC dos cavalos eacute mais fina que a
de outras espeacutecies (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1999) Portanto haacute um dilema
envolvendo a evoluccedilatildeo da BAC dos cavalos Por um lado a necessidade de ser
extremamente fina para uma troca gasosa eficiente enquanto de outro a
necessidade de ser resistente o suficiente para suportar o estresse extremamente
alto na parede dos capilares pulmonares quando a pressatildeo capilar se eleva durante
o exerciacutecio (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
A pressatildeo hidrostaacutetica maacutexima nos capilares pulmonares humanos durante o
exerciacutecio supera 30 mmHg Nos cavalos PSI de corrida a pressatildeo capilar ultrapassa
35
100 mmHg aproximando-se da forccedila necessaacuteria para ocorrer a ruptura do colaacutegeno
que suporta a parede capilar na BAC (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
Quando o estresse na parede capilar se eleva demasiadamente ocorrem
alteraccedilotildees ultra-estruturais na BAC uma condiccedilatildeo conhecida como falecircncia por
estresse descrita em atletas de elite humanos e em cavalos (WEST 2000)
BIRKS et al (1997) demonstraram a falecircncia por estresse e consequumlente
ruptura dos capilares pulmonares em cavalos exercitando a altas velocidades
havendo maior risco de ocorrecircncia da HPIE quando encontraram-se sob importante
aumento da pressatildeo arterial pulmonar (FIGURA 7)
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) A ULTRAESTRUTURA CAPILAR NORMAL B RUPTURA DO ENDOTEacuteLIO CAPILAR (SETAS) COM ERITROacuteCITOS ADJACENTES (ASTERISCO) NOTA-SE TAMBEacuteM ERITROacuteCITOS NO ESPACcedilO ALVEOLAR (PONTAS DE SETAS) C ERITROacuteCITO NO INTERSTIacuteCIO (ASTERISCO) D RUPTURA DO EPITEacuteLIO ALVEOLAR (SETAS) A ALVEacuteOLO C CAPILAR BAR 2 microm FONTE BIRKS et al (1997)
36
Portanto a falecircncia por estresse dos capilares pulmonares eacute a teoria aceita
para a ocorrecircncia da HPIE sendo causada pela elevada pressatildeo transmural nos
capilares pulmonares resultado do aumento da pressatildeo arterial pulmonar somada agrave
pressatildeo pleural inspiratoacuteria negativa (WEST 2000) (FIGURA 8)
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) TTMP TENSAtildeO CIRCUNFERENCIAL OU EM ARCO CAUSADA PELA PRESSAtildeO TRANSMURAL CAPILAR TEL Eacute A TENSAtildeO LONGITUDINAL NOS COMPONENTES DA PAREDE ALVEOLAR ASSOCIADA COM A INFLACcedilAtildeO PULMONAR PARTE DESTA Eacute TRASMITIDA Agrave BAC TST Eacute A TENSAtildeO DE SUPERFIacuteCIE DA CAMADA SUPERFICIAL ALVEOLAR ESTA APARENTEMENTE EXERCE UMA FORCcedilA DE ACcedilAtildeO INTERNA PARA SUPORTAR O CAPILAR QUANDO ESTE INTUMESCE PARA DENTRO DO ESPACcedilO ALVEOLAR A ALTAS PRESSOtildeES TRANSMURAL CAPILARES PALV PRESSAtildeO ALVEOLAR PCAP PRESSAtildeO CAPILAR FONTE WEST (2000)
Diversos estudos estiveram envolvidos em avaliar a participaccedilatildeo do NO no
aumento da pressatildeo arterial pulmonar no cavalo durante o exerciacutecio e na
fisiopatologia da HPIE Inicialmente evidenciou-se que cavalos realizando exerciacutecio
intenso apresentam hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE) (CHRISTLEY
et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 DEMPSEY e WAGNER 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) o que resulta na inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO abolindo o
relaxamento vascular dependente do endoteacutelio (MILLS e HIGGINS 1997)
Portanto acreditou-se que a reduccedilatildeo da produccedilatildeo do NO durante o exerciacutecio
intenso poderia contribuir para a alta incidecircncia de HPIE nos cavalos de corrida
Contudo a administraccedilatildeo do antagonista da oacutexido niacutetrico sintase (NOS) N-nitro-L-
arginina metil ester (L-NAME) mostrou que o NO endoacutegeno resulta numa maior
37
extraccedilatildeo de O2 no repouso e no exerciacutecio submaacuteximo mas natildeo causou alteraccedilatildeo no
exerciacutecio intenso (MANOHAR e GOETZ 1998 MANOHAR et al 2006) A
administraccedilatildeo de L-NAME por KINDIG et al (2000) resultou em agravamento da
HPIE nos cinco animais estudados contudo natildeo observou-se aumento da pressatildeo
arterial pulmonar
MANOHAR e GOETZ (1999) avaliaram os efeitos da infusatildeo intravenosa de
nitroglicerina em cavalos realizando exerciacutecio e natildeo observaram alteraccedilotildees sobre a
incidecircncia ou severidade da HPIE
Adicionalmente KINDIG et al (2001) estudaram os efeitos do exerciacutecio na
pressatildeo arterial pulmonar e na HPIE em cavalos inalando NO Comparados aos
controles o grupo que inalou o NO apresentou uma pequena mas consistente
reduccedilatildeo na pressatildeo arterial pulmonar maacutexima mas com um significativo aumento da
HPIE nesses animais avaliado pelo aumento na contagem do nuacutemero de eritroacutecitos
no LBA Os autores entenderam que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete em
parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou como agravou a HPIE
Portanto em face aos achados relacionados agrave participaccedilatildeo do NO e da NOS
no cavalo em exerciacutecio maacuteximo e na HPIE satildeo necessaacuterias outras investigaccedilotildees a
respeito dos efeitos da inibiccedilatildeo da NOS e da produccedilatildeo do NO na circulaccedilatildeo
pulmonar e na HPIE (KINDIG et al 2000)
Apesar da maior atenccedilatildeo aos efeitos da HPIE e da pressatildeo arterial pulmonar
em cavalos realizando exerciacutecios intensos a HPIE tambeacutem passou a ser
demonstrada em cavalos envolvidos em atividades de menor intensidade sugerindo
que outros mecanismos podem estar envolvidos na fisiopatologia (EPP et al 2006)
VICINO (2007) demonstrou a ocorrecircncia de HPIE em cavalos de salto sendo
que cavalos que participaram de provas na altura entre 130 m ndash 150 m
apresentaram maior incidecircncia que aqueles que saltaram provas entre 100 m ndash 120
m
Neste contexto a associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar jaacute foi
demonstrada anteriormente (McKANE et al 1993 SAacuteNCHEZ et al 2005) Em
concordacircncia o estudo epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) evidenciou
38
uma significativa associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos puro
sangue inglecircs (PSI) jovens durante treinamento para corrida
O processo de hemorragia pulmonar pode culminar em irritaccedilatildeo e inflamaccedilatildeo
das vias aeacutereas o que exacerbaria a doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
(ERICKSON e POOLE 2007) WEST e MATHIEU-COSTELLO (1999) sugerem que
alteraccedilotildees na BAC ativariam vias proacute inflamatoacuterias nas vias aeacutereas com a
participaccedilatildeo de LTB4 Possivelmente a membrana basal alveolar exposta apoacutes a
ruptura ativaria macroacutefagos alveolares sendo que estes satildeo ricos em LTB4
DERKSEN et al (2009) sugeriram uma hipoacutetese para a ocorrecircncia da HPIE
(FIGURA 9) onde a ocorrecircncia das altas pressotildees vasculares pulmonares levaria a
alteraccedilotildees venulares culminando na ruptura capilar sangramento inflamaccedilatildeo e
hemossiderose agravando o quadro da HPIE
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO DERSKEN et al (2009)
Contudo mediadores bem como os mecanismos inflamatoacuterios que estatildeo
envolvidos na fisiopatologia da HPIE ainda precisam ser esclarecidos
O diagnoacutestico da HPIE pode ser feito pela evidecircncia de sangue na traqueacuteia
visiacutevel atraveacutes de exame endoscoacutepico (HINCHCLIFF et al 2005b ERICKSON e
POOLE 2007) pela contagem de eritroacutecitos no LBA (MEYER et al 1998) ou pela
39
presenccedila de hemossideroacutefagos (macroacutefagos contendo hemossiderina ou eritroacutecitos)
no AT (EPPINGER 1990 MICHELOTTO JUacuteNIOR et al 2007) eou no LBA
(DOUCET e VIEL 2002 SAacuteNCHEZ et al 2005 BIAVA et al 2006) realizado uma
hora apoacutes o exerciacutecio A presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA eacute considerada a
forma mais sensiacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993)
Em resumo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas acompanhada de
hiperresponsividade e hipersecreccedilatildeo de muco denominada doenccedila inflamatoacuteria das
vias aeacutereas (DIVA) bem como a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) satildeo causas de enormes perdas econocircmicas e de queda de rendimento
desportivo interrupccedilatildeo nos treinamentos e de encerramento de campanha em
cavalos de corrida Apesar disso a maioria dos estudos sobre as doenccedilas
inflamatoacuterias das vias aeacutereas dos cavalos satildeo direcionados para a ORVA e a
fisiopatologia da DIVA ainda estaacute pouco esclarecida bem como os mecanismos
inflamatoacuterios da HPIE ainda precisam ser mais bem estudados
Tendo-se em vista estes aspectos a hipoacutetese levantada no presente estudo
foi de que o desafio ambiental e o exerciacutecio fiacutesico estejam acompanhados de
estresse oxidativo alterando o quadro inflamatoacuterio possivelmente por alterar a
produccedilatildeo de PAF no pulmatildeo com consequumlente alteraccedilatildeo da funcionalidade celular
e que a hemorragia pulmonar pode exercer influecircncia sobre essa situaccedilatildeo As
ceacutelulas estudadas foram os macroacutefagos alveolares os quais podem apresentar um
papel central na regulaccedilatildeo deste processo
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVOS GERAIS
Verificar alteraccedilotildees em paracircmetros cliacutenicos e inflamatoacuterios pulmonares em
cavalos puro sangue inglecircs (PSI) de corrida jovem submetidos ao desafio ambiental
e ao treinamento fiacutesico
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Avaliar os seguintes paracircmetros cliacutenicos e laboratoriais
- Avaliaccedilatildeo cliacutenica
- Avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas
- Avaliaccedilatildeo citoloacutegica das vias aeacutereas atraveacutes das teacutecnicas de aspirado
traqueal (AT) e de lavado broncoalveolar (LBA)
- Avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas
e a produccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos e nitritos no LBA
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por macroacutefagos alveolares
bem como a capacidade fagocitaacuteria e de adesatildeo
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por neutroacutefilos do sangue
perifeacuterico bem como a capacidade fagocitaacuteria
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 REAGENTES E SEDATIVOS
O BN52021 (Gingkolide B) foi obtido da Biomol (Plymouth Meeting PA USA)
Fura-2 AM (cat num F-0888) PAF (β-Acetyl-γ-O-hexadecyl-L-α-
phosphatidylcholine P-4904) foram obtidos da Sigma (St Louis MO USA) A
coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacuteticoreg) foi obtida da Laborclin (Pinhais PR Brasil) e
a acepromazina da Univet (Satildeo Paulo SP Brasil) A xylazina e o butorphanol foram
obtidos do laboratoacuterio Fort Dodge (Satildeo Paulo SP Brasil) Todos os demais
reagentes foram comprados da Sigma (St Louis MO USA)
32 ANIMAIS
Foram utilizados equinos machos adultos jovens (potros) da raccedila puro sangue
inglecircs (PSI) de cinco diferentes criatoacuterios (haras) da regiatildeo metropolitana de Curitiba
estado do Paranaacute (Haras Cifra e Haras dos Girassoacuteis em Piraquara Haras
Palmerini e Haras Belmont em Satildeo Joseacute dos Pinhais e Haras Santa Rita da Serra
em Tijucas do Sul e potros de quatro diferentes cocheiras no Jockey Club do
Paranaacute (Av Viacutector Ferreira do Amaral 2291 Tarumatilde Curitiba PR)
Inicialmente os potros foram divididos em trecircs grupos O primeiro grupo foi
denominado grupo condiccedilotildees naturais (CN n=45) compreendendo os potros dos
haras vivendo soltos em piquetes dia e noite alimentando-se de gramiacuteneas e
leguminosas da pastagem mais complemento peletizado fornecido no campo A
meacutedia de idade dos animais deste grupo foi de 145 plusmn 04 meses O segundo grupo
foi denominado grupo desafio ambiental (DA n=45) constituiacutedo por potros
estabulados por 30 dias com o propoacutesito de preparaacute-los para o iniacutecio de treinamento
Estes animais eram mantidos em grupos de 15 a 20 potros sendo que permaneciam
em baias individuais com dimensotildees de 35m x 35m x 35m em meacutedia em cama de
serragem e alimentados duas vezes ao dia com aveia mais raccedilatildeo peletizada e feno
de gramiacutenea e de alfafa A meacutedia de idade dos potros do grupo DA foi de 217 plusmn 29
meses O terceiro grupo foi denominado de grupo exerciacutecio (EX n=34) onde foram
incluiacutedos potros ineacuteditos (satildeo considerados ineacuteditos animais que ainda natildeo correram
42
em hipoacutedromos oficiais) mas que estavam em treinamento para corrida haacute
aproximadamente cinco meses e mantidos nas mesmas condiccedilotildees de estabulaccedilatildeo e
alimentaccedilatildeo que os potros do grupo DA Estes animais foram acompanhados
durante o periacuteodo de treinamento sendo que a avaliaccedilatildeo cliacutenica endoscoacutepica e a
colheita de LBA ocorreu 24 horas apoacutes seu primeiro exerciacutecio intenso (15 ms ndash 16
ms) em 800m ndash 1000m de distacircncia na pista de areia do Jockey Club do Paranaacute A
meacutedia de idade dos potros do grupo EX foi de 270 plusmn 03 meses
A obtenccedilatildeo de dados para o presente trabalho de pesquisa ocorreu durante
uma sequumlecircncia de experimentos independentes durante um periacuteodo de 18 meses
Durante este periacuteodo grupos de potros foram acompanhados ateacute se encontrarem
nas condiccedilotildees estabelecidas para cada grupo quando entatildeo foram avaliados As
amostras do grupo CN foram obtidas de oito diferentes experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois durante o inverno trecircs durante a primavera e um no outono
As amostras do grupo DA foram provenientes de seis experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois no inverno e dois no outono e para o grupo EX os resultados
advieram de amostras obtidas durante o veratildeo em cinco ocasiotildees e durante a
primavera em quatro totalizando nove experimentos independentes para este grupo
Os resultados apresentados para cada uma das anaacutelises provecircm de pelo menos
trecircs experimentos independentes
Todos os animais estudados eram pertencentes a estabelecimentos com
programa de desverminaccedilatildeo bimensal bem como foram todos vacinados
regularmente contra Influenza Equina e Herpes Viacuterus Equino tipos 1 e 4 A
alimentaccedilatildeo utilizada nos estabelecimentos que cederam os potros para o estudo
era similar bem como a anaacutelise da alimentaccedilatildeo utilizada para os potros dos trecircs
grupos natildeo diferiu no que se refere a constituintes essenciais que poderiam
influenciar nas avaliaccedilotildees realizadas no presente trabalho Os criteacuterios de inclusatildeo
para os potros dos trecircs grupos foram os estabelecidos e jaacute descritos previamente
nas caracteriacutesticas de cada grupo e a exclusatildeo do estudo ocorreu quando da
histoacuteria de doenccedila recente ou diferenccedilas em manejo
As comparaccedilotildees intergrupos foram feitas entre os grupos CN e DA (diferenccedila
ambiental) e entre os grupos DA e EX (diferenccedila no regime de exerciacutecio)
Na segunda etapa do trabalho dedicada ao estudo da hemorragia pulmonar
induzida pelo exerciacutecio (HPIE) avaliou-se somente os potros do grupo EX agora
com n=37 Este grupo foi dividido em subgrupos sendo o subgrupo HPIE pos (n=23
43
constituiacutedo por potros com qualquer percentual de hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo
citoloacutegica do LBA) e subgrupo HPIE neg (n=14 constituiacutedo por potros sem
hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA) Nesta etapa as comparaccedilotildees
realizadas foram entre os subgrupos HPIE pos e HPIE neg
33 ASPECTOS EacuteTICOS
Este trabalho de pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Experimentaccedilatildeo Animal (CEEA) do setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR sob o
nuacutemero de registro 168 e pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso de Animais (CEUA) da
Pontifiacutecia Universidade Catoacutelica do Paranaacute sob o nuacutemero de registro 129 e estaacute de
acordo com o Guiding Principles in the Care and Use of Animals
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA
Preacutevio agrave colheita de material procedeu-se a avaliaccedilatildeo cliacutenica de cada potro
iniciada pela histoacuteria incluindo possiacuteveis ocorrecircncias meacutedicas relevantes agrave sauacutede do
sistema respiratoacuterio manejo alimentaccedilatildeo desverminaccedilatildeo e vacinaccedilatildeo Na histoacuteria
incluiu-se tambeacutem a informaccedilatildeo sobre a ocorrecircncia de tosse espontacircnea quando em
piquetes na baia no momento da alimentaccedilatildeo ou durante o treinamento O exame
fiacutesico incluiu a observaccedilatildeo da presenccedila de secreccedilatildeo nasal estiacutemulo da tosse
palpaccedilatildeo de linfonodos submandibulares e retrofaringeanos auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e
auscultaccedilatildeo traqueal e pulmonar (McGORUM e DIXON 2007)
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS
A avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas foi realizada previamente a
realizaccedilatildeo do LBA com o animal tranquumlilizado atraveacutes da administraccedilatildeo de
acepromazina (acepran 1 Univet) (003 mgkg IM) e apoacutes 30 minutos seguindo-
se a administraccedilatildeo de xilazina (sedazine Fort Dodge) (03-05 mgkg IV) mais
butorfanol (torbugesic Fort Dodge) (005 mgkg IV) (HOFFMAN 1999 HEWSON e
VIEL 2002) Utilizou-se um fibroscoacutepio flexiacutevel Pentax de 170 cm de comprimento e
128 mm de diacircmetro para a avaliaccedilatildeo das vias aeacutereas superiores e inferiores ateacute a
bifurcaccedilatildeo da traqueacuteia
44
A presenccedila de foliacuteculos linfoacuteides na faringe foi graduada segundo RAKER e
BOWLES (1978) adotando-se a graduaccedilatildeo de I a IV (QUADRO 1) e graus III e IV
foram considerados como faringite
A movimentaccedilatildeo das cartilagens aritenoacuteides foi graduada de I a IV segundo
RACKESTRAW et al (1991) (QUADRO 2) e graus III e IV foram considerados como
anormais
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Faringe com poucos foliacuteculos claros na parede dorsal
Grau II Presenccedila de numerosos pequenos foliacuteculos juntamente a
hiperemia cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau III Presenccedila de grandes grupos de foliacuteculos hiperecircmicos
cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau IV Presenccedila de foliacuteculos grandes edematosos e hiperecircmicos
por toda a mucosa faringeana
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA FARINGE FONTE RAKER E BOWLES (1978)
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Movimentaccedilatildeo sincrocircnica e abduccedilatildeo completa das
cartilagens aritenoacuteides
Grau II Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo com abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) conseguida com a degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
Grau III Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo e a abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) natildeo eacute conseguida na degluticcedilatildeo nem na
oclusatildeo nasal
Grau IV
(Hemiplegia
Laringeana)
Cartilagem aritenoacuteide esquerda posicionada
medialmente na glote e natildeo apresenta movimento
quando da degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE I A IV FONTE RACKESTRAW et al (1991)
45
Especial interesse foi dado agrave presenccedila de muco no lume traqueal e sua
quantificaccedilatildeo atraveacutes de graduaccedilatildeo de 0 a 5 conforme GERBER et al (2004)
(FIGURA 10)
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME ENDOSCOacutePICO FONTE GERBER et al 2004
Quando da observaccedilatildeo de muco traqueal este foi aspirado atraveacutes de tubo
de silicone introduzido pelo canal de trabalho do endoscoacutepio sendo imediatamente
transferido para uma lacircmina de microscopia e deixado para secar ao ar As lacircminas
foram coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico Laborclin Pinhais PR
Brasil) e 500 ceacutelulas foram contadas em aumento de 1000X (HODGSON e
HODGSON 2003)
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o aspirado traqueal (AT)
contendo lt10 de linfoacutecitos lt1 de eosinoacutefilos e lt20 de neutroacutefilos (ROBINSON
2003 HODGSON e HODGSON 2007)
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)
Para a realizaccedilatildeo do LBA foi utilizado um cateter flexiacutevel de silicone
especiacutefico para a obtenccedilatildeo de LBA de equinos marca Cook (V-PBAL-300 Cook Vet
Products Hamburg Alemanha) de 300 cm de comprimento e 8 mm de diacircmetro
Este foi introduzido agraves cegas via nasotraqueal preferencialmente do lado direito ateacute
se alojar em um brocircnquio quando o cuff na extremidade distal era inflado com 5-10
mL de ar Utilizou-se 300 mL de soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada (PBS) esteacuteril e
com heparina soacutedica (5 UImL de PBS) preacute-aquecidos a 37oC (HOFFMAN 1999
PICKLES et al 2002abc MORI et al 2003 RIIHIMAumlKI et al 2008b) O PBS era
infundido em aliacutequotas de 120 mL (HEWSON e VIEL 2002) aspirando-se
46
gentilmente apoacutes cada aliacutequota e dispensando-se o LBA recolhido em frascos
plaacutesticos esteacutereis mantidos em isopor com gelo Este procedimento foi repetido ateacute
que o volume de 300 mL era totalmente empregado O material recolhido foi mantido
refrigerado em isopor com gelo ateacute a chegada ao Laboratoacuterio de Metabolismo
Celular no Departamento de Fisiologia do Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR
para o processamento em menos de 3 horas apoacutes a colheita (PICKLES et al 2002c
VIEL e HEWSON 2003)
No laboratoacuterio o LBA era centrifugado a 340g (1300 rpm) por seis minutos a
40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA) e o pellet obtido foi
ressuspendido em 2 mL de PBS para a contagem do nuacutemero total de ceacutelulas
nucleadas (NTCN)
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA
A contagem do NTCN foi realizada usando-se a cacircmara de Neubauer Uma
aliacutequota da suspensatildeo de ceacutelulas foi diluiacuteda 110 em PBS em um frasco de
centrifugaccedilatildeo de 15 mL de fundo cocircnico (Eppendorf) Desta uma aliacutequota de 50 microL
foi misturada a 50 microL do corante vital Azul de Tripan para a contagem das ceacutelulas
vivas A partir do nuacutemero de ceacutelulas vivas por mililitro da suspensatildeo de ceacutelulas a
concentraccedilatildeo da suspensatildeo de ceacutelulas foi ajustada para 5 x 106 ceacutelulasmL para as
avaliaccedilotildees da atividade de macroacutefago alveolar (fagocitose produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e adesatildeo ndash ver toacutepicos 315 316
317 e 318)
Para a avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA lacircminas para microscopia
foram preparadas a partir de 10 μL da suspensatildeo de ceacutelulas distribuiacutedos de forma
circular sobre a lacircmina secadas ao ar e coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski
(Panoacutetico Laborclin Pinhais PR Brasil) (HEWSON e VIEL 2002) e 500 ceacutelulas
foram contadas em aumento de 1000X
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o LBA contendo em meacutedia
60 de macroacutefagos 35 de linfoacutecitos lt5 de neutroacutefilos lt2 de mastoacutecitos lt1
de eosinoacutefilos (ROBINSON 2003 MAZAN e HOFFMAN 2003 RICHARD et al
2009)
47
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957)
Uma porccedilatildeo correspondente a 90 mg de pellet de ceacutelulas do LBA foi
ressuspendido em um solvente extrator (metanolclorofoacutermio12 volvol) na
quantidade de 18 mL e sonicado (6 ciclos de 4 segundos) Os tubos foram
deixados em gelo por 20 minutos
Na etapa seguinte mais metanol foi adicionado (324 microL o caacutelculo eacute a
quantidade de sovente extrator x 0180 resultando na quantidade de metanol em
mililitros) para reduzir a densidade do liacutequido e possibilitar assim a decantaccedilatildeo do
material particulado insoluacutevel no meio Apoacutes o material foi centrifugado a 5000g por
10 minutos a 40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
O sobrenadante foi transferido para tubos de vidro e clorofoacutermio foi
adicionado (648 microL ou seja o dobro da quantidade de metanol utilizada
anteriormente)
Na sequumlecircncia o extrato foi lavado uma vez com 19 mL de aacutegua ultra pura O
sistema bifaacutesico formado foi submetido a uma intensa agitaccedilatildeo ateacute natildeo serem mais
distinguiacuteveis as duas fases (forma-se momentaneamente uma emulsatildeo) Nesta
etapa substacircncias com maior afinidade agrave aacutegua do que ao solvente orgacircnico satildeo
solubilizadas no meio aquoso e portanto se separam dos lipiacutedios
Apoacutes a reconstituiccedilatildeo espontacircnea do sistema bifaacutesico o sobrenadante
(aquoso) foi removido com o auxiacutelio de uma micropipeta cuidando-se para natildeo
retirar o que se encontrava abaixo
Em seguida foi adicionado o FSP (CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM NaCl 497
mM clorofoacutermio 30 metanol 490 aacutegua ultra pura 480) lentamente (para
evitar a formaccedilatildeo de emulsatildeo) e de maneira que as paredes do tubo fossem lavadas
com esta soluccedilatildeo Apoacutes a remoccedilatildeo do sobrenadante este procedimento foi repetido
mais duas vezes
A mistura de clorofoacutermio e metanol na qual estavam dissolvidos os lipiacutedios
foi evaporada em banho-maria a 370C sob corrente de nitrogecircnio O extrato lipiacutedico
seco foi armazenado a -800C em atmosfera de nitrogecircnio Para a determinaccedilatildeo da
bioatividade de PAF (toacutepico 310) esses extratos foram solubilizados em 100 microL de
DMSO sob agitaccedilatildeo intensa
48
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS
O sangue de cavalo foi colhido em bolsas de transfusatildeo (CPDA-1 JP
Induacutestria Farmacecircutica SA Satildeo Paulo Brasil) atraveacutes de punccedilatildeo venosa jugular
O sangue foi diluiacutedo 11 (vv) em PBS e 40 mL do sangue diluiacutedo foram
adicionados a tubos para centriacutefuga esteacutereis (tubos Falcon de 50 mL) sobre 8 mL de
Ficoll Paque Plus e centrifugado (400g por 40 minutos a 40C) para o isolamento das
ceacutelulas PMN por gradiente
Apoacutes a centrifugaccedilatildeo a camada superior composta por plasma soluccedilatildeo de
Ficoll e ceacutelulas mononucleares foi descartada A camada inferior composta
principalmente por PMNs e eritroacutecitos foi dividida em duas aliacutequotas iguais as quais
foram separadas em dois tubos para centriacutefuga A cada aliacutequota foi adicionada
soluccedilatildeo hemoliacutetica (NH4Cl 077 tris[hydroxymethyl]aminomethane 021 pH 74
soluccedilatildeo aquosa) para completar 50 mL e incubadas por 20 minutos a 370C em
estufa
A seguir a suspensatildeo celular livre dos eritroacutecitos foi centrifugada (400g 6
min 4oC) O sobrenadante foi descartado e o pellet de ceacutelulas (basicamente PMNs)
foi ressuspendido em 5 mL de PBS contendo glucose 5 mM A densidade de ceacutelulas
foi determinada em cacircmara de Neubauer e ajustada para 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL
A viabilidade celular foi determinada atraveacutes do corante vital Azul de Tripan e
resultou aproximadamente 95 A percentagem de neutroacutefilos na suspensatildeo de
PMNs foi superior a 90 determinada pela coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico
Laborclin Pinhais PR Brasil)
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE Ca++ EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE et al 2001)
Agrave suspensatildeo de PMNs (toacutepico 39) na densidade de 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL foi adicionado FURA-2 AM (Sigma soluccedilatildeo estoque 1 nM em DMSO)
para concentraccedilatildeo final de 1 microM A suspensatildeo foi incubada em ambiente escuro a
37oC por 45 minutos
Nesta etapa os PMNs incorporaram o FURA-2 AM um indicador fluorescente
de caacutelcio Quando o FURA-2 AM estaacute ligado ao Ca++ haacute reduccedilatildeo da eficiecircncia de
49
excitaccedilatildeo a 380 nm e aumento da eficiecircncia de excitaccedilatildeo a 340 nm observados no
comprimento de onda de emissatildeo de 510 nm Com isso eacute possiacutevel quantificar a
concentraccedilatildeo de Ca++ intracelular nas ceacutelulas carregadas com FURA-2 AM atraveacutes
da relaccedilatildeo da intensidade de emissatildeo a 510 nm entre os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo de 340 nm e de 380 nm (relaccedilatildeo 340380 nm)
Apoacutes a incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram lavadas duas vezes com soluccedilatildeo de
Ringer (NaCl 1425 mM KCl 40 mM CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM 50 mM 4-(2-
hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid glicose 50 mM pH 74 soluccedilatildeo
aquosa) para a remoccedilatildeo do FURA-2 AM que natildeo foi incorporado agraves ceacutelulas
As ceacutelulas entatildeo foram ressuspendidas em soluccedilatildeo de Ringer para uma
concentraccedilatildeo final de 225 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL Esta foi a preparaccedilatildeo utilizada
na leitura de fluorescecircncia
A suspensatildeo de ceacutelulas foi mantida em gelo ateacute a sua utilizaccedilatildeo Aliacutequotas de
2 mL eram previamente incubadas em banho-maria por 4 minutos a 37oC no escuro
(tubo envolto em papel alumiacutenio) previamente a serem transferidas para uma cubeta
para a leitura da fluorescecircncia em espectrofluoriacutemetro acoplado a um
microcomputador (RF5301PC Shimadzu Kyoto Japatildeo) controlado pelo software
Super Ion Probe (Shimadzu Kyoto Japatildeo) Durante esta incubaccedilatildeo as ceacutelulas que
seriam utilizadas como controle negativo para PAF foram tratadas com antagonista
de receptor de PAF BN52021 (Biomol soluccedilatildeo 10 mM em DMSO)
Foi utilizada excitaccedilatildeo dual com comprimentos de onda 340 nm e 380 nm
(janela de leitura de 2 segundos) com emissatildeo registrada a 510 nm A temperatura
foi mantida em 37oC pelo sistema termostatisado do aparelho A leitura da
fluorescecircncia consistiu primeiramente da obtenccedilatildeo de uma linha de base nos
primeiros 50 segundos Apoacutes esta leitura inicial foram adicionados 10 microL do extrato
lipiacutedico (toacutepico 38) agrave suspensatildeo de ceacutelulas seguindo-se a agitaccedilatildeo (por 3
segundos) com uma barra magneacutetica presente dentro da cubeta A leitura foi feita
entatildeo por mais 100 segundos
Para cada amostra foram realizados os procedimentos descritos na presenccedila
e na ausecircncia de BN52021 A resposta maacutexima obtida pelo tratamento da
suspensatildeo de PMNs com extrato lipiacutedico na presenccedila de BN52021 foi subtraiacuteda da
resposta maacutexima obtida na ausecircncia deste antagonista O resultado desta subtraccedilatildeo
foi utilizado como indicador semiquantitativo da bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico e os resultados foram expressos como relaccedilatildeo 340380 nm
50
Antes de analisar as amostras de extrato lipiacutedico para a bioatividade de PAF
a cada experimento a suspensatildeo de PMNs tratada com FURA-2 AM foi testada com
PAF (1-0-palmitil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina soluccedilatildeo estoque de 3 mM em
DMSO da Sigma) nas concentraccedilotildees de 1 10 e 100 nM e com 100 nM na presenccedila
de 150 microM de BN52021 (concentraccedilatildeo suficiente para antagonizar 102 nM de PAF)
A resposta dos PMNs de equinos aos padrotildees de PAF eacute mostrada na FIGURA 11
sendo representativa dos dados obtidos em todos os experimentos
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO REGISTRADA A 510 nm () SUSPENSAtildeO DE PMN () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 1 nM (diams) SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 10 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 100 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + BN52021 150 microM + PAF 100 nM A EMISSAtildeO BASAL DAS CEacuteLULAS PMN FOI REGISTRADA POR 50 SEGUNDOS PREVIAMENTE Agrave ADICcedilAtildeO DE PAF
Os PMNs do sangue de equinos foram utilizados no presente estudo como
uma ferramenta para a avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF (pelo influxo de Ca++ nos
PMNs induzido por PAF) Para a determinaccedilatildeo da viabilidade desta ferramenta
estudou-se a resposta dos PMNs do sangue de equino a diferentes concentraccedilotildees
de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na ausecircncia do antagonista de
PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose de neutroacutefilos e a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio por neutroacutefilos pelas teacutecnicas descritas
51
abaixo (ver toacutepicos 315 ndash fagocitose de macroacutefago alveolar 316 ndash produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar e 317 ndash produccedilatildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio por macroacutefago alveolar) sendo que para cada ensaio foram realizadas
quatro repeticcedilotildees Igualmente estudou-se a resposta do macroacutefago alveolar a
diferentes concentraccedilotildees de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na
ausecircncia do antagonista de PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose e a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem realizando-se quatro
repeticcedilotildees para cada anaacutelise
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)
Em microplaca de 96 poccedilos 250microL de reagente de Bradford (100mg de
Coomassie Blue 50 mL de etanol 95 + 100 mL de aacutecido fosfoacuterico 85 completar
com aacutegua ultra pura para 1000 mL) foi adicionado a 10 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA) Nesta etapa o
corante Comassie eacute complexado por proteiacutenas presentes na amostra o que muda a
sua cor
Apoacutes 5 minutos em temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada a
595 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-Rad
Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) A concentraccedilatildeo de proteiacutenas foi determinada
interpolando-se os valores de absorbacircncia numa curva padratildeo resultante de
concentraccedilotildees conhecidas de albumina seacuterica bovina (Sigma) Os resultados foram
expressos como miligramas de proteiacutenas por mililitro de LBA
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR e MARLETTA 1985)
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA foi utilizada como indicador da produccedilatildeo de
oacutexido niacutetrico na regiatildeo broncoalveolar
Em micro placa de 96 poccedilos adicionou-se 100 microL de reagente de Griess
(mistura de cloreto de naftiletilenodiamina a 005 e por sulfanilamida a 05 em
meio aacutecido proporcionado por H3PO4 a 25) a 100 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA)
52
A sulfanilamida (um derivado de anilina) reage com o aacutecido nitroso e apoacutes
rearranjos intramoleculares forma o iacuteon diazocircnio Apoacutes o iacuteon diazocircnio reage com a
naftiletilenodiamina (um derivado de naftilamina) para formar pigmento roacuteseo
Depois de 5 minutos na temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada
a 550 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-
Rad Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) Os resultados foram expressos como
absorbacircncia a 550 nm
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO
LBA (NOUROOZ-ZADEH et al 1994)
Utilizou-se uma aliacutequota de suspensatildeo de ceacutelulas de LBA na densidade de
15 x 106 ceacutelulasmL de LBA Esta foi ultrasonicada (6 ciclos de 4 segundos) em 1mL
de metanol sendo centrifugada em seguida a 5000g por 5 minutos a 40C
(Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
Uma aliacutequota de 50 microL de sobrenadante foi armazenada para posterior
mensuraccedilatildeo da concentraccedilatildeo total de proteiacutenas
Para cada amostra aliacutequotas de 90 microL foram depositadas em seis frascos
para centriacutefuga (de 15 mL Eppendorf) foi agitada no voacutertex e incubada por 30
minutos a temperatura ambiente A trecircs desses tubos foram adicionados 10 microL de
soluccedilatildeo metanoacutelica de trifenilfosfina (TPP Sigma) 10 mM para ocorrer a reduccedilatildeo
seletiva de hidroperoacutexidos (os grupamentos hidroperoacutexido especificamente os
presentes em lipiacutedios satildeo convertidos a grupamentos hidroxila pela trifenilfosfina)
As amostras contidas nos trecircs tubos restantes receberam apenas 10 microL de metanol
Todos os tubos foram agitados vigorosamente e entatildeo incubados em temperatura
ambiente por 30 minutos
Apoacutes adicionou-se a todos os tubos 900 microL de reagente de FOX2 Este
reagente deve ser preparado no momento do uso consistindo de xilenol laranja 100
microM hidroxitolueno butilado (BHT) 400 mM aacutecido sulfuacuterico 25 mM e sulfato ferroso
de amocircnio 250 microM em metanol 90 (vv em aacutegua) Apoacutes agitaccedilatildeo o meio
reacional foi incubado por mais 30 minutos a temperatura ambiente
Nesta etapa os caacutetions ferrosos (Fe2+) do reativo de FOX2 satildeo oxidados por
hidroperoacutexidos presentes na amostra (tanto pelos hidroperoacutexidos lipiacutedicos quanto
por outros tipos de hidroperoacutexidos presentes na amostra) Como todos os
53
hidroperoacutexidos lipiacutedicos das amostras tratadas com TPP foram reduzidos a
produccedilatildeo de Fe3+ seraacute menor nestas do que nas amostras natildeo tratadas com TPP
O Fe3+ formado eacute entatildeo quelado pelo xilenol laranja o que faz a cor deste
indicador passar de laranja a azul-puacuterpura (passa a absorver luz em 560 nm)
Passado o tempo de incubaccedilatildeo a absorbacircncia foi mensurada a 560 nm
utilizando-se um espectrofotocircmetro (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil
Satildeo Paulo)
Subtraiu-se entatildeo o valor da absorbacircncia das amostras tratadas com TPP
(sem hidroperoacutexidos lipiacutedicos) do valor da absorbacircncia das amostras sem TPP O
valor obtido nessa subtraccedilatildeo (referente apenas agrave quantidade de ferro oxidado por
hidroperoacutexidos lipiacutedicos) foi utilizado na foacutermula da curva padratildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio obtida com soluccedilotildees padratildeo de diferentes concentraccedilotildees (1000 500
250 125 62 31 e 16 microM) submetidas aos mesmos procedimentos descritos
acima para a dosagem de hidroperoacutexidos (com exceccedilatildeo ao tratamento com TPP) O
resultado obtido foi referente agrave concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos
Dividiu-se o valor da concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos pela
concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais do extrato metanoacutelico Os resultados foram
expressos como nmolesmg de proteiacutenas
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984)
Utilizou-se 300 microL de uma suspensatildeo de ceacutelulas de LBA em PBS na
densidade de 5 x 106 ceacutelulasmL que foram centrifugados (10600g por 20min a
4oC) para remoccedilatildeo de partiacuteculas
Apoacutes foi colocada em banho com gelo Uma aliacutequota de 10 microL desse extrato
de ceacutelulas foi adicionada a 990 microL de meio reativo (soluccedilatildeo aquosa de H2O2 20 mM
tris[hidroximetil] aminometano 005M e EDTA 025 mM pH 74)
Imediatamente utilizando-se um espectrofotocircmetro acoplado a um
microcomputador (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil Satildeo Paulo)
monitorou-se a absorbacircncia a 220 nm por 90 segundos a 370C com intervalos de 2
segundos entre leituras consecutivas
A degradaccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio pela catalase causa uma diminuiccedilatildeo
gradual na absorbacircncia do meio reativo a 220 nm a qual indica a atividade da
catalase no extrato de ceacutelulas Os valores de atividade da catalase foram corrigidos
54
pela concentraccedilatildeo de proteiacutenas do extrato de ceacutelulas (realizado conforme descrito
no toacutepico 311) e foram expressos como micromoles de H2O2minmg proteiacutenas
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA et al 1998)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL (= 5 x 105
ceacutelulaspoccedilo) e os macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A
suspensatildeo de ceacutelulas na densidade descrita foi obtida durante o processamento do
LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS e foram adicionados
20microL de zymosan corado com vermelho neutro (67 mgmL) mais 100 microL de PBS
sendo deixados a temperatura ambiente por 30 minutos
Em seguida depois de descartado o sobrenadante as ceacutelulas foram fixadas
com soluccedilatildeo de Baker (4 formaldeiacutedo 2 cloreto de soacutedio 1 acetato de caacutelcio
soluccedilatildeo aquosa) por 30 minutos
Apoacutes os poccedilos foram lavados com PBS para que o zymosan corado com
vermelho neutro natildeo fagocitado por macroacutefagos alveolares fosse retirado
Em seguida o corante vermelho neutro foi solubilizado em cada poccedilo com
200microL de soluccedilatildeo aacutecido-aacutelcool (aacutecido aceacutetico 1 etanol 50 soluccedilatildeo aquosa) e
deixado por 30 minutos
Apoacutes este periacuteodo a absorbacircncia foi mensurada a 550 nm Os resultados
foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 -
Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA et al 1998)
Estimou-se a produccedilatildeo de acircnions pela da formaccedilatildeo de formazan produto da
reduccedilatildeo do NBT (nitroblue tetrazolium) pelo acircnion superoacutexido Avaliou-se a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA
(phorbol myristate acetate) O PMA estimula o complexo NADPH oxidase na
membrana dos fagoacutecitos a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
55
mimetizando o resultado da fagocitose de um microorganismo (DEKKER et al
2000)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para a retirada das
ceacutelulas natildeo aderentes Em seguida adicionou-se a cada poccedilo 100 microL de PBS com
NBT 02 ou com NBT 02 mais PMA 11microM sempre em triplicatas para cada
potro
Apoacutes a incubaccedilatildeo por 1 hora a 370C e em ambiente escuro (a placa deve
estar envolta em papel alumiacutenio) a placa foi centrifugada (800g por 5 minutos a
40C) Em seguida o sobrenadante foi descartado e 100 microL de PBS foram
adicionados a cada poccedilo e a placa foi novamente centrifugada
Apoacutes o sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram fixadas com metanol
por 10 minutos Em seguida a placa passou por nova centrifugaccedilatildeo o sobrenadante
foi descartado e a placa foi deixada secar ao ar em estufa
Em seguida a placa foi lavada duas vezes com metanol 50 e o formazan
(produto da reaccedilatildeo entre o NBT e o acircnion superoacutexido) foi solubilizado atraveacutes da
incubaccedilatildeo por 30 minutos com 120 microL soluccedilatildeo aquosa de hidroacutexido de potaacutessio 2M
e 140 microL de dimetilsulfoacutexido por poccedilo
A absorbacircncia foi lida a 595 nm e os resultados foram corrigidos pela adesatildeo
de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago
Alveolar)
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK e MIZEL 1981)
Mensurou-se a produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) por macroacutefago
alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA atraveacutes da oxidaccedilatildeo do vermelho
fenol pela peroxidase onde esta enzima utiliza nesta reaccedilatildeo o H2O2 O composto
oxidado absorve luz em pH baacutesico com maacutexima intensidade em 550 nm
56
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS observando-se a retirada
de grumos presentes nos poccedilos Em seguida 100 microL de soluccedilatildeo de vermelho fenol
(PRS phenol red solution 140 mM NaCl 10 mM fosfato de potaacutessio 55 mM
dextrose 056 mM vermelho fenol 19 UmL de HRPO horse radish peroxidase pH
70 soluccedilatildeo aquosa) ou soluccedilatildeo de vermelho fenol + PMA 110nM foram adicionados
a cada poccedilo em triplicatas e deixados incubar por 1 hora a 370C no escuro
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo adicionou-se 10 microL de NaOH 1N para
interromper a reaccedilatildeo alcalinizar o meio e permitir a absorbacircncia da soluccedilatildeo que foi
lida a 595 nm apoacutes 30 minutos
Os resultados foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada
potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN e GORDON 1987)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para se selecionar as
ceacutelulas aderentes que a seguir foram fixadas com metanol 50 por 10 minutos
Apoacutes este periacuteodo o sobrenadante foi descartado e 100 microL de corante de
Giemsa a 02 foram adicionados a cada poccedilo e deixados por 40 minutos em
temperatura ambiente
Os poccedilos foram novamente lavados com PBS por duas vezes observando-se
a retirada de grumos nos poccedilos e 200 microL de metanol 50 foram adicionados
Apoacutes 30 minutos a absorbacircncia da suspensatildeo foi lida a 550 nm
A adesatildeo resultou menor no grupo DA (n=17) em comparaccedilatildeo ao grupo CN
(n=36) (P=0010) sendo que o grupo EX (n=26) apresentou adesatildeo maior que o
grupo DA (P=0001) (FIGURA 12) indicando diferenccedilas na capacidade de adesatildeo
em placa acriacutelica possivelmente devido a diferenccedilas no estado funcional das ceacutelulas
57
de cada grupo Por esta razatildeo utilizou-se o ensaio de adesatildeo de macroacutefago
alveolar realizado concomitantemente aos ensaios de funccedilatildeo de macroacutefago
(fagocitose e produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) a cada
experimento realizado durante o estudo A correccedilatildeo dos valores obtidos de
macroacutefago em funccedilatildeo da adesatildeo foi feito atraveacutes da divisatildeo da meacutedia final obtida
para o ensaio de funccedilatildeo de macroacutefago dividido pela meacutedia obtida no ensaio de
adesatildeo para cada potro avaliado e a cada experimento realizado
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 (ROSEN e GORDON 1987) aP=0010 vs CN e bP=0001 vs DA
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
A normalidade na distribuiccedilatildeo dos dados foi avaliada pelo teste de D‟Agostino
e Pearson Valores considerados outliers pelo teste de Grubb foram excluiacutedos das
anaacutelises Para os dados que apresentaram distribuiccedilatildeo normal dos valores
(distribuiccedilatildeo Gaussiana) (contagem percentual de linfoacutecitos concentraccedilatildeo total de
proteiacutenas do LBA bioatividade de PAF catalase hidroperoacutexidos nitritos fagocitose
de macroacutefago alveolar produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio
por macroacutefago alveolar) foi utilizado o teste t natildeo pareado Os dados com
distribuiccedilatildeo natildeo Gaussiana dos valores (contagens percentuais de neutroacutefilos de
58
eosinoacutefilos e de macroacutefagos multinucleados contagem do NTCN do LBA e adesatildeo
de macroacutefago alveolar) foram analisados pelo teste de Mann-Whitney A
comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos de funccedilatildeo de macroacutefago alveolar
estimulado e natildeo estimulado por PMA foi feita por teste t de Student natildeo pareado
Os achados cliacutenicos e endoscoacutepicos foram analisados por meio de teste de Mann-
Whitney A correlaccedilatildeo entre o percentual de um mesmo tipo celular no aspirado
traqueal e no lavado broncoalveolar foi analisada atraveacutes do teste de Spearman
Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas utilizando-se o programa GraphPad
Prism versatildeo 500 para Windows (GraphPad Software San Diego CA EUA) e os
valores apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia (SEM) Valores de
Plt005 foram considerados como significativos
4 RESULTADOS
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica
Nenhum dos potros dos grupos CN e DA apresentou tosse segundo o
histoacuterico obtido Contudo oito potros (235) do grupo EX apresentaram tosse
espontacircnea na cocheira ou durante o treinamento o que resultou em diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0002) (TABELA 1)
A presenccedila de corrimento nasal seroso (coriza) observada nos trecircs grupos
estudados estaacute demonstrada na TABELA 1 Natildeo houve diferenccedila significativa entre
os grupos apesar de o percentual de potros com coriza no grupo DA ter reduzido
em relaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
Os linfonodos submandibulares eou retrofaringeanos estiveram aumentados
em 382 222 e 382 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
natildeo havendo diferenccedila entre os grupos (TABELA 1)
A auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e traqueal resultou normal em todos os potros
avaliados dos trecircs grupos estudados Contudo sons pulmonares crepitantes foram
audiacuteveis em 28 156 e 115 dos potros avaliados nos grupos CN DA e EX
respectivamente havendo um aumento do percentual de crepitaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo DA em ralaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DE CORRIDA
Grupos Tosse
Espontacircnea
Corrimento
Nasal
Linfonodos
Auscultaccedilatildeo
Pulmonar
CN 034
(0)
1534
(441)
1334
(382)
136
(28)
DA 045
(0)
1145
(244)
1045
(222)
745
(156)
EX 834
(235)a
1534
(441)
1334
(382)
326
(115)
aP=0002 vs DA
60
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas
No iniacutecio da avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas primeiramente
considerando os foliacuteculos linfoacuteides faringeanos ou hiperplasia folicular linfoacuteide (HFL)
a distribuiccedilatildeo das diferentes graduaccedilotildees pode ser vista na TABELA 2
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGEANOS OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS DE I A IV SEGUNDO RAKER E BOLES (1978)
Grupos HFL I HFL II HFL III HFL IV
CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)
DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)
EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)
Considerando as graduaccedilotildees de HFL III e IV como faringite esta
anormalidade foi observada em 546 286 e 539 dos potros dos grupos CN
DA e EX respectivamente Houve uma significativa reduccedilatildeo no percentual meacutedio de
observaccedilotildees de faringite para o grupo DA em comparaccedilatildeo ao grupo CN (P=0024)
enquanto no grupo EX o percentual de faringites foi significativamente maior em
relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0039)
Com relaccedilatildeo ao aspecto morfoloacutegico da epiglote um potro do grupo DA e um
potro do grupo EX evidenciaram epiglote com aspecto fraacutegil sendo que os demais
potros foram normais
Com relaccedilatildeo agrave avaliaccedilatildeo funcional da laringe todos os potros foram normais
apresentando graduaccedilotildees I ou II (TABELA 3)
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE ACORDO COM RAKESTRAW et al (1991)
Grupos NLP I NLP II NLP III NLP IV
CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)
DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)
EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)
61
A quantidade de secreccedilatildeo observada no lume traqueal estaacute demonstrada na
TABELA 4
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 SEGUNDO GERBER et al (2004)
Grupos 0 1 2 3 4 5
CN 233
(61)
933
(273)
933
(273)
1133
(332)
233
(61)
033
(0)
DA 742
(167)
1242
(286)
1242
(286)
742
(167)
342
(70)
142
(24)
EX 327
(111)
727
(259)
727
(259)
627
(223)
427
(148)
027
(0)
Quantidade de secreccedilatildeo traqueal acima de grau 2 considerada passiacutevel de
prejuiacutezo agrave troca gasosa e ao rendimento desportivo foi observada em 666 547
e 630 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT)
Os achados de anaacutelise citoloacutegica diferencial para os principais tipos celulares
do AT para os trecircs grupos de potros estudados estatildeo demonstrados na TABELA 5
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN (n=20) DA (n=19) E EX (n=15) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
Grupos Mac Lin Neut Eos Mast Calic Multi Epit Sid
CN 429plusmn63 75
plusmn19
76
plusmn29
12
plusmn07
002
plusmn02
05
plusmn02
02
plusmn01
201
plusmn56
0
DA 591
plusmn41
141
plusmn24
85
plusmn23
11
plusmn05
0 01
plusmn01
11
plusmn02a
161
plusmn48
0
EX 593
plusmn42
134
plusmn23
171
plusmn49
09
plusmn03
0 05
plusmn03
08
plusmn03
71
plusmn32
09
plusmn04
Mac macroacutefago alveolar Lin linfoacutecitos Neut neutroacutefilos Eos eosinoacutefilos Mast mastoacutecitos Calic ceacutelulas caliciformes Multi macroacutefagos multinucleados Epit ceacutelulas epiteliais Sid hemossideroacutefagos aPlt0001 vs CN
62
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA)
As quantidades de LBA recuperado estiveram entre 54 e 59 do volume
infundido para os grupos CN (n=16) DA (n=23) e EX (n=16)
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
A contagem do NTCN e a contagem diferencial de ceacutelulas do LBA estatildeo
demonstradas na TABELA 6
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN (n=45) DA (n=40) E EX (n=34) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
CTCN
(ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Macroacutef
Multi
Hemosid
CN 395
plusmn 38
673
plusmn 17
294
plusmn 15
23
plusmn 04
05
plusmn 03
005
plusmn 004
04
plusmn 01
0
DA 343
plusmn 24
698
plusmn 14
281
plusmn 13
09
plusmn 02
12
plusmn 01
002
plusmn 002
11
plusmn 01d
0
EX 456
plusmn 28a
676
plusmn 18
229
plusmn 15
54
plusmn 11b
15
plusmn 07c
02
plusmn 01
13
plusmn 02
22
plusmn 06
CTCN = contagem total de ceacutelulas nucleadas Macroacutef = macroacutefagos Linfoacutec = linfoacutecitos Neutroacutef = neutroacutefilos Eosino = eosinoacutefilos Masto = mastoacutecitos Macroacutef Multi = macroacutefagos multinucleados Hemosid = hemossideroacutefagos aPlt001 vs DA bPlt0001 vs DA cPlt005 vs DA dPlt0001 vs CN
Hemossideroacutefagos foram observados somente no LBA dos potros do grupo
EX mais especificamente em 23 (622) deles representando 22 do total de
ceacutelulas A quantidade observada de hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 da
contagem citoloacutegica diferencial do LBA
A correlaccedilatildeo entre as contagens percentuais de um mesmo tipo celular no AT
e no LBA foi analisada para os potros do grupo CN (n=11) DA (n=18) e EX (n=12)
que tiveram material colhido para as duas teacutecnicas citoloacutegicas natildeo tendo sido
63
encontrada correlaccedilatildeo entre ambas as teacutecnicas de avaliaccedilatildeo citoloacutegica para
nenhuma das ceacutelulas
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF
A resposta dos neutroacutefilos do sangue de equino frente ao PMA e frente ao
PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na ausecircncia e na presenccedila
do antagonista de PAF BN52021 estaacute demonstrado nas FIGURAS 13 a 15
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF aP=0028 vs controle bPlt0001 vs sem BN52021 cP=0028 vs PMA
64
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0007) 10nM (aP=0003) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA e PAF 1 e 10nM
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF EM TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA ePlt0001 vs PAF 1nM e fPlt0001 vs PAF 1nM e 10nM
65
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF
Tambeacutem se estudou a resposta dos macroacutefagos alveolares de equino frente
ao PMA e frente ao PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 demonstrado nas
FIGURAs 16 a 18
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0003) 10nM (aPlt0001) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0010 vs PMA dPlt0001 vs PAF 01nM e PAF 1nM
66
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0037) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA e PAF 01nM dPlt0001 vs PAF 1nM
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 01nM e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA dPlt001 vs PAF 1nM e 10nM
67
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos
foi mensurada pelo influxo de Ca++ em ceacutelulas PMN de equinos (FIGURA 19)
Registrou-se uma baixa relaccedilatildeo 340380 nm para os grupos CN (0005 plusmn 0002
relaccedilatildeo 340380 nm) e DA (0006 plusmn 0002 relaccedilatildeo 340380 nm) representando um
baixo niacutevel de bioatividade de PAF no LBA dos potros avaliados nestes grupos
Contudo a bioatividade de PAF do grupo EX (0068 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm) foi
significativamente maior em comparaccedilatildeo ao grupo DA (P=0017) Um graacutefico
representativo da bioatividade de PAF em uma das amostras do grupo EX na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 pode ser visto na FIGURA
20
CN DA EX000
002
004
006
008
010 a
Re
laccedil
atildeo
34
03
80
nm
Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedicodas Ceacutelulas do LBA
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE AO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0017 vs DA
68
0 50 100
150
200
0
1
2
3
4
Tempo (segundos)
Bioatividade de PAFR
ela
ccedilatildeo
3403
80n
m
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm A AMOSTRA Eacute ADICIONADA Agrave SUSPENSAtildeO DE CEacuteLULAS PMN APOacuteS 50 SEGUNDOS DE LEITURA BASAL (SETA)
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi maior no grupo DA em relaccedilatildeo
ao grupo CN (014 plusmn 003 vs 003 plusmn 001 mg de proteiacutenasmL de LBA) (P=0001) O
grupo EX apresentou concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA (036 plusmn 006 mg de
proteiacutenasmL de LBA) significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001)
(FIGURA 21)
69
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0001 vs CN bPlt0001 vs DA
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos foi maior no LBA do grupo DA (019 plusmn 001
absorbacircncia 550 nm) em relaccedilatildeo ao grupo CN (014 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm)
(P=0011) O grupo EX apresentou uma reduccedilatildeo significativa na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA (008 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm) significativamente menor em
comparaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001) (FIGURA 22)
70
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0011 vs CN bPlt0001 vs DA
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (1047 plusmn 241 vs 66
plusmn 35 nmolesmg de proteiacutenas) (Plt0001) No grupo EX a concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos nas ceacutelulas do LBA apresentou reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo
DA (352 plusmn 84 vs 1047 plusmn 241 nmolesmg de proteiacutenas) (P=0007) (FIGURA 23)
71
Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos no LBA
CN DA EX0
50
100
150a
b
nm
ole
s
mg
de
pro
teiacuten
as
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX (n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO APRESENTADOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNA DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aPlt0001 vs CN bP=0007 vs DA
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA
No grupo EX a atividade da catalase nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol
H2O2minmg de proteiacutenas) (P=0002) natildeo havendo diferenccedila entre os grupos CN e
DA (FIGURA 24)
72
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO microMOL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOMINUTOMILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0002 vs DA
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
A fagocitose de macroacutefago alveolar foi significativamente maior no grupo DA
em comparaccedilatildeo ao grupo CN (223 plusmn 043 vs 072 plusmn 018 absorbacircncia 550
nmadesatildeo) (P=0002) Observou-se uma diminuiccedilatildeo na fagocitose no grupo EX em
relaccedilatildeo ao grupo DA (104 plusmn 027 vs 223 plusmn 043 absorbacircncia 550 nmadesatildeo)
(P=0006) (FIGURA 25)
73
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A FAGOCITOSE PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (FAGOCITOSEADESAtildeO) aP=0002 vs CN e bP=0006 vs DA
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar
A utilizaccedilatildeo de PMA aumentou significativamente a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido pelos macroacutefagos alveolares dos grupos DA (219 plusmn 053 vs 392 plusmn 062
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0049) e EX (060 plusmn 011 vs 090 plusmn 014
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0031) A produccedilatildeo basal de acircnion superoacutexido foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (219 plusmn 053 vs 025
plusmn 007 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo DA (060 plusmn 011 vs 219 plusmn 053 absorbacircncia 595
nmadesatildeo) (P=0001) A produccedilatildeo de acircnion superoacutexido estimulada por PMA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (392 plusmn 062 vs 046
plusmn 016 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
74
diminuiccedilatildeo na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido em comparaccedilatildeo ao grupo DA (090 plusmn
014 vs 392 plusmn 062 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) (FIGURA 26)
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0049 vs DA bP=0031 vs EX cPlt0001 vs CN dP=0001 vs DA ePlt0001 vs CNe fPlt0001 vs DAe
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
O PMA aumentou a produccedilatildeo de H2O2 pelos macroacutefagos alveolares nos
grupos CN (041 plusmn 008 vs 099 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0004) DA
(035 plusmn 005 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0002) e EX (010 plusmn
001 vs 034 plusmn 008 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) A produccedilatildeo basal de
H2O2 para o grupo EX foi significativamente menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (010 plusmn
001 vs 035 plusmn 005 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) Aleacutem disso a produccedilatildeo
75
de H2O2 estimulada por PMA diminuiu no grupo EX tendo sido significativamente
menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (034 plusmn 008 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia
595nmadesatildeo) (P=0006) (FIGURA 27)
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0004 vs CN bP=0002 vs DA cPlt0001 vs EX dPlt0001 vs DA eP=0006 vs DAe
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
Hemossideroacutefagos foram observados no LBA de 23 potros (622) sendo
que estes foram considerados no subgrupo HPIE pos A quantidade observada de
76
hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 A ausecircncia de hemossideroacutefagos foi
evidenciada em 14 potros (378) sendo que estes foram considerados para o
subgrupo HPIE neg
Dentre os potros avaliados 15 (405) deles (10 potros do subgrupo HPIE
pos e 5 potros do subgrupo HPIE neg) apresentaram mais de 5 de neutroacutefilos eou
mais de 1 de eosinoacutefilos na contagem diferencial de ceacutelulas indicando um perfil
citoloacutegico de LBA compatiacutevel com inflamaccedilatildeo pulmonar
Os valores do NTCN bem como da contagem diferencial de ceacutelulas para o
grupo EX e para os subgrupos estaacute demonstrado na TABELA 7
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX (n=37) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=23) E HPIE NEG (n=14)
CTCN (ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Siderof
Grupo EX
456 plusmn 28
676 plusmn 18
229 plusmn 15
47 plusmn 10
13 plusmn 06
02 plusmn 01
22 plusmn 35
HPIE pos
571
plusmn 78a
645
plusmn 22b
240 plusmn 20
56 plusmn 12
09 plusmn 07
02 plusmn 02
34 plusmn 37
HPIE neg
348 plusmn 38
725 plusmn 30
207 plusmn 25
35 plusmn 18
19 plusmn 11
03 plusmn 01
00
CTCN contagem total de ceacutelulas nucleadas Macrof macoacutefagos Linfoc linfoacutecitos Neutrof
neutroacutefilos Eosinof eosinoacutefilos Mastoc mastoacutecitos Siderof hemossideroacutefagos aP=0005
vs HPIE neg bP=0020 vs HPIE neg
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg
(018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm P=0042) (FIGURA 28)
77
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) e HPIE NEG (n=5) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO RELACcedilAtildeO 340380nm aP=0042 vs HPIE neg
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi significativamente maior no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (039 plusmn 008 vs 019 plusmn
004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) (FIGURA 29)
78
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=13) E HPIE NEG (n=12) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS POR MILILITRO DE LBA aP=0031 vs HPIE neg
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos resultou
significativamente reduzida em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (008 plusmn 003 vs
012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) (FIGURA 30)
79
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) E HPIE NEG (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 550 nm aP=0049 vs HPIE neg
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA dos potros do
subgrupo HPIE pos resultou significativamente maior que no subgrupo HPIE neg
(367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) (FIGURA 31)
80
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) E HPIE NEG (n=8) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS aP=0009 vs HPIE neg
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
Natildeo houve diferenccedila na fagocitose de macroacutefago alveolar entre os grupos
estudados
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-)
A produccedilatildeo basal de O2- por macroacutefagos alveolares resultou similar entre os
grupos estudados A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0047) mas natildeo no subgrupo HPIE pos
(FIGURA 32)
A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA foi significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (081 plusmn 011 vs 124 plusmn
015 absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0042) (FIGURA 32)
81
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) E HPIE NEG (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0047 vs HPIE neg bP=0042 vs HPIE neg e
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
A produccedilatildeo basal de H2O2 por macroacutefago alveolar foi similar entre os grupos
avaliados no presente estudo A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0002) mas natildeo no subgrupo HPIE
neg (FIGURA 33)
A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA resultou significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (025 plusmn 003 vs 067 plusmn 014
absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0001)
82
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) E HPIE NEG (n=6) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2 ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0002 vs HPIE neg bP=001 vs HPIE neg e
5 DISCUSSAtildeO
O estudo da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas de cavalos de corrida adultos jovens
em trecircs diferentes situaccedilotildees em seu ambiente natural foi possiacutevel devido agrave
utilizaccedilatildeo de um grande nuacutemero de animais Assim permitiu-se detectar diferenccedilas
entre os grupos mesmo havendo variaccedilotildees ambientais tais como estaccedilotildees do ano
condiccedilotildees climaacuteticas e diferenccedilas sutis em manejo Como os potros dos trecircs grupos
encontravam-se na mesma faixa etaacuteria de risco para as doenccedilas respiratoacuterias virais
e os experimentos foram realizados durante um mesmo periacuteodo as diferenccedilas entre
os grupos CN e DA foram consideradas como sendo devido ao ambiente e as
diferenccedilas entre os grupos DA e EX foram consideradas como sendo devido ao
treinamento
O grupo CN evidenciou um percentual de observaccedilotildees de faringite na
avaliaccedilatildeo endoscoacutepica (TABELA 2) maior que os 37 relatado por HOBO et al
(1995) em cavalos PSI de corrida de dois anos de idade Os potros deste grupo
foram mantidos integralmente em piquetes e nesta situaccedilatildeo a hiperplasia dos
foliacuteculos linfoacuteides da faringe em cavalos jovens pode ser uma resposta normal a
inalaccedilatildeo de antiacutegenos ambientais ou agentes infecciosos (HOLCOMBE e
DUCHARME 2007)
De fato as vias aeacutereas dos potros desse grupo deram mostra de estarem
sendo desafiadas pelo nuacutemero percentual de corrimento nasal linfonodos
aumentados e quantidades elevadas de secreccedilatildeo traqueal iguais aos demais
grupos (TABELAS 1 e 4) Possivelmente isso tambeacutem se deva a fatores climaacuteticos
pois no estudo de ROBINSON et al (2006) com cavalos de montaria de vaacuterias
idades aqueles que permaneceram fora dos estaacutebulos durante o inverno
apresentaram quantidades elevadas de muco traqueal No entanto diferentemente
do nosso estudo os cavalos avaliados por ROBINSON et al (2006) tiveram nuacutemero
percentual de neutroacutefilos aumentado na secreccedilatildeo traqueal enquanto os potros do
grupo CN resultaram em avaliaccedilatildeo citoloacutegica tanto de AT (TABELA 5) como de LBA
(TABELA 6) normais (ROBINSON 2003 HODGSON e HODGSON 2007)
evidenciando vias aeacutereas especialmente as vias aeacutereas inferiores saudaacuteveis
Com relaccedilatildeo ao desafio ambiental no presente estudo adotou-se um sistema
convencional de estabulaccedilatildeo pois estudos anteriores em modelos semelhantes ao
84
nosso jaacute demonstraram a presenccedila de altas concentraccedilotildees de endotoxinas
(BERNDT et al 2008) bem como de poeira e de aeroalergenos (WOODS et al
1993)
Contudo o desafio ambiental de 30 dias utilizado em nosso estudo resultou
em quadro comparaacutevel ao do grupo CN isento de processo inflamatoacuterio das vias
aeacutereas Possivelmente um periacuteodo maior de desafio pudesse causar um processo
inflamatoacuterio tal como foi demonstrado previamente por HOLCOMBE et al (2001)
onde potros da raccedila puro sangue aacuterabe que sofreram desafio ambiental de 90 dias
apresentaram aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no LBA Contudo no
estudo citado o material utilizado para a cama dos potros foi a palha que tambeacutem
representou um maior risco de desenvolvimento de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas dos
cavalos em outros estudos quando comparada a serragem utilizada na cama dos
potros do grupo DA (BURRELL et al 1996 VANDEPUT et al 1998 GERBER et
al 2000 KLEIBER et al 2005 DEWACHI et al 2006)
Entretanto ateacute o momento os efeitos dos fatores ambientais das cocheiras
nas vias aeacutereas foram relatados em sua maioria em cavalos apresentando ORVA e
natildeo em indiviacuteduos jovens e saudaacuteveis como os potros avaliados em nosso estudo
Nos animais com ORVA um curto periacuteodo de exposiccedilatildeo ambiental (6 a 48 horas)
em baia e recebendo alimentaccedilatildeo composta principalmente por feno causou
aumento da expressatildeo de algumas citocinas (pex IL-4 e IL-5) em alguns estudos
mas nenhuma alteraccedilatildeo em outros (GERBER et al 2000 AINSWORTH et al 2003
CORDEAU et al 2004 KLEIBER et al 2005) sendo que um longo tempo de
exposiccedilatildeo ambiental (variando de cinco semanas a trecircs meses) causou aumento da
expressatildeo de IFN-γ e IL-8 (AINSWORTH et al 2003) IL-9 (DEWACHI et al 2006)
IL-17 (DEBRUE et al 2005) e o desenvolvimento dos sinais cliacutenicos da ORVA
acompanhados de alteraccedilotildees na funccedilatildeo pulmonar (VANDEPUT et al 1998)
Contudo nos potros do grupo DA se evidenciou no AT (TABELA 5) e no LBA
(TABELA 6) um aumento significativo do nuacutemero percentual de macroacutefagos
multinucleados em comparaccedilatildeo ao grupo CN bem como nuacutemero percentual de
eosinoacutefilos acima do valor considerado limite para cavalos normais (ROBINSON
2003) sugerindo que houve uma resposta por parte do sistema de defesa nas vias
aeacutereas dos potros deste grupo
Os macroacutefagos multinucleados ou ceacutelulas gigantes multinucleadas satildeo
formados a partir da fusatildeo de dois ou mais macroacutefagos na resposta imune pulmonar
85
(ANDERSON et al 1999) representando especificamente uma resposta imune do
tipo Th2 com a participaccedilatildeo da IL-4 (HELMING e GORDON 2007) Em pessoas os
macroacutefagos multinucleados satildeo considerados como um achado indicativo de
reaccedilotildees inflamatoacuterias crocircnicas nas vias aeacutereas como a tuberculose por exemplo
(LEMAIRE et al 2006 HELMING e GORDON 2007) Em equinos satildeo escassos os
estudos envolvendo a citologia respiratoacuteria que descrevam o nuacutemero percentual
normal deste tipo celular De qualquer forma eacute relatado que pode ser observado em
pequeno nuacutemero em cavalos sem evidecircncias de doenccedila pulmonar sendo que uma
quantidade aumentada jaacute foi descrita associada agrave inflamaccedilatildeo crocircnica (DECONTO
1983 HODGSON e HODGSON 2007) Estas informaccedilotildees parecem natildeo corroborar
com o aumento no nuacutemero percentual de macroacutefagos multinucleados no grupo DA
em se tratando de potros jovens considerados saudaacuteveis o que demonstra a
necessidade de mais estudos para se entender o papel do macroacutefago multinucleado
no pulmatildeo saudaacutevel e na inflamaccedilatildeo pulmonar dos cavalos
Entretanto o nuacutemero percentual de eosinoacutefilos acima do limite normal no
LBA dos potros do grupo DA pode ser considerado como uma resposta ao
ambiente assim como eacute considerado em humanos (DENGUEZLI-BOUZGARROU et
al 2007) e jaacute relatado em cavalos (COUEumlTIL et al 2007)
O periacuteodo de treinamento por sua vez induziu inflamaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo EX O nuacutemero significativamente aumentado de potros com tosse
(TABELA 1) constituiu a evidecircncia cliacutenica sugerindo inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas nos
potros desse grupo Cavalos saudaacuteveis raramente tossem (ROBINSON 2007)
sendo a tosse um sinal cliacutenico comprovadamente associado agrave inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas (BURRELL et al 1996 McGROUM e DIXON 2007) CHRISTLEY et al
(2001) correlacionaram a tosse com a presenccedila de faringite sendo que tal
associaccedilatildeo tambeacutem foi observada no grupo EX (TABELAS 1 e 2) Adicionalmente
BEDENICE et al (2008) estudaram a relaccedilatildeo entre a tosse e a inflamaccedilatildeo pulmonar
e descreveram que os cavalos avaliados por apresentarem tosse tiveram contagens
percentuais de neutroacutefilos no LBA maiores que 5
No presente estudo um aumento no NTCN e nas contagens percentuais de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos do LBA (TABELA 6) confirmaram a presenccedila de inflamaccedilatildeo
pulmonar no grupo EX (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
COUEumlTIL et al 2007) A neutrofilia no LBA de cavalos de corrida jaacute foi
correlacionada a um baixo rendimento desportivo e constitui sinal chave para o
86
diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007) A eosinofilia no LBA de cavalos de
corrida por sua vez pode ser um achado transitoacuterio (VIEL e HEWSON 2003)
apesar de tambeacutem ter sido associada a um baixo rendimento desportivo aleacutem de
hiperresponsividade das vias aeacutereas em cavalos de corrida jovens (HARE e VIEL
1998) Portanto tais evidecircncias podem ser consideradas como um risco ao futuro
potencial atleacutetico dos potros do grupo EX
No presente estudo natildeo houve correlaccedilatildeo entre os achados citoloacutegicos de AT
e LBA para nenhum dos trecircs grupos estudados e esta falta de correlaccedilatildeo entre AT
e LBA jaacute foi relatada anteriormente Portanto entende-se que os epiteacutelios traqueal e
broncoalveolar respondem diferentemente aos agentes agressores sendo que a
avaliaccedilatildeo de cavalos com tosse ou diminuiccedilatildeo de rendimento desportivo deve ser
realizada por ambas as teacutecnicas associadas (MALIKIDES et al 2003 CHRISTLEY
RUSH 2007 HODGSON e HODGSON 2007)
A ligaccedilatildeo entre o exerciacutecio e a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas provavelmente
envolve diversos mediadores proacute-inflamatoacuterios que uma vez identificados poderatildeo
ser alvo para abordagens terapecircuticas com o objetivo de minimizar os efeitos
deleteacuterios da inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos PSI de corrida jovens Neste
contexto um dos mais potentes e versaacuteteis mediadores proacute inflamatoacuterios envolvidos
na inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas eacute o PAF (UHLIG et al 2005)
PAF eacute quimiotaacutetico para bem como produzido por eosinoacutefilos macroacutefagos e
neutroacutefilos em resposta a estresse fiacutesico ou quiacutemico apresentando muitos dos
criteacuterios essenciais de um mediador proacute inflamatoacuterio (OWEN et al 2005)
De fato estudos realizados in vitro demonstraram que o PAF pode induzir a
migraccedilatildeo de neutroacutefilos e monoacutecitos do cavalo (DAWSON et al 1988) Aleacutem disso
demonstrou-se a quimiotaxia de eosinoacutefilos e neutroacutefilos no trato respiratoacuterio de
murinos e humanos induzida por PAF (LEE et al 2002 ISHII et al 2004) Em
cavalos com ORVA a administraccedilatildeo intravenosa de PAF promoveu uma reduccedilatildeo de
leucoacutecitos no sangue perifeacuterico e apoacutes alguns minutos houve um aumento de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo seguido de uma deterioraccedilatildeo cliacutenica e da funccedilatildeo
respiratoacuteria (FAIRBAIRN et al 1996) Portanto apoiado nestes estudos e nos
resultados de aumento do NTCN e de neutrofilia e eosinofilia no LBA do grupo EX
(TABELA 6) eacute razoaacutevel assumir que o PAF possa contribuir para a induccedilatildeo da
inflamaccedilatildeo pulmonar observada nos potros PSI jovens em treinamento avaliados no
presente estudo
87
A inflamaccedilatildeo pulmonar tambeacutem estaacute associada a um aumento nas
concentraccedilotildees de proteiacutenas no LBA principalmente devido ao extravasamento de
plasma (TSANGARIS et al 2003) que pode ser resultado da accedilatildeo de vaacuterios
mediadores proacute inflamatoacuterios tal como o PAF
Um aumento da permeabilidade microvascular induzida pelo PAF resultando
em extravasamento de plasma e edema foi demonstrado previamente no estudo de
CLAVIJO et al (2001) Aleacutem disso WEST et al (1997) demonstraram o acuacutemulo de
um fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar de cavalos exercitados a velocidades
entre 13 ms e 16 ms No presente estudo o significativo aumento da concentraccedilatildeo
de proteiacutenas no LBA dos potros do grupo EX em comparaccedilatildeo ao grupo DA (FIGURA
21) confirma que a permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) estava
aumentada nos potros do grupo EX e o PAF pode estar envolvido neste mecanismo
Diferentemente o significativo aumento de proteiacutenas no LBA do grupo DA em
comparaccedilatildeo ao grupo CN deve envolver outros mecanismos inflamatoacuterios pois natildeo
houve biotavidade de PAF significativa no LBA destes dois grupos (FIGURA 19)
Contudo os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da disponibilidade de oacutexido niacutetrico (NO) (KIKUCHI et al
2008) Houve uma produccedilatildeo limitada de NO nas vias aeacutereas dos potros do grupo
EX esperada em cavalos realizando exerciacutecio moderado ou proacuteximo do maacuteximo
(MILLS e HIGGINS 1997) Isto pode ser explicado pela hipoxemia arterial induzida
pelo exerciacutecio (HAIE) descrita em atletas humanos (HOPKINS 2005) e em cavalos
exercitando a altas intensidades (MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
DEMPSEY e WAGNER 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005) A produccedilatildeo de NO requer
normoxia (GRIMMINGER et al 1995) sendo que a anoxia abole o relaxamento
vascular dependente do endoteacutelio e a hipoxemia degrada o NO (De MEY e
VANHOUTTE 1980) Adicionalmente ocorre uma inibiccedilatildeo do NO pela hemoglobina
sendo que esta inibiccedilatildeo eacute inversamente proporcional a saturaccedilatildeo de oxigecircnio
(IWAMOTO e MORIN 1993)
A inibiccedilatildeo da siacutentese de NO resultou no aumento da permeabilidade vascular
no estudo de KIKUCHI et al (2008) concordando com os nossos achados
referentes agrave bioatividade de PAF aumentada associada ao aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas e agrave diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de nitritos no LBA
do grupo EX
88
De fato no estudo de BRKOVIC e SIROIS (2007) o PAF e natildeo o NO foi
considerado o mediador proacute inflamatoacuterio e causador do aumento da permeabilidade
vascular enquanto o NO foi considerado como um co-fator para as atividades
inflamatoacuterias do PAF Na relaccedilatildeo entre PAF e NO na microcirculaccedilatildeo parece que
NO apresenta um efeito protetor atenuando as atividades inflamatoacuterias de PAF
tendo inclusive reduzido a formaccedilatildeo de PAF em vecircnulas mesenteacutericas em ratos
(NEVIN e BROADLEY 2002)
Contudo o NO tambeacutem tem papel preponderante na defesa das vias aeacutereas
(NEVIN e BROADLEY 2002 XU et al 2006) e o aumento na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA do grupo DA pode ser considerado uma resposta aos poluentes
ambientais existentes nas cocheira dos cavalos (WOODS et al 1993 BERNDT et
al 2008) Aleacutem disso o NO reage com o acircnion superoacutexido (O -2) para formar
peroxinitrito (ONOO-) um forte oxidante capaz de provocar lesatildeo no tecido pulmonar
resultando em peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (XU et al 2006)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi investigada no presente estudo atraveacutes da
concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA que resultou
aumentada no grupo DA em comparaccedilatildeo com o grupo CN (FIGURA 23) A
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi associada ao acuacutemulo de neutroacutefilos e produccedilatildeo de ROS por
esses nas vias aeacutereas de crianccedilas (BUSS et al 2000) e de pessoas com DPOC
(SANTUS et al 2005) Natildeo houve aumento de neutroacutefilos no LBA dos potros do
grupo DA mas os macroacutefagos alveolares dos potros deste grupo apresentaram
maior produccedilatildeo de ROS (FIGURAS 26 e 27) Isso pode ter contribuiacutedo para o
aumento da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA neste grupo como resultado da
modificaccedilatildeo da funcionalidade dos macroacutefagos alveolares induzida por fatores
ambientais como descrito em estudos em humanos (LUNDBORG et al 2007) e em
cavalos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento resultou em reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos lipiacutedicos no LBA em comparaccedilatildeo com o grupo DA No estudo de
MASTALOUDIS et al (2004) corredores de ultramaratona apresentaram aumento
da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica avaliada por marcadores do sangue destes atletas
Contudo outros relataram a reduccedilatildeo dos marcadores de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes
exerciacutecio intenso em corredores e esquiadores (URSO e CLARKSON 2003) em
indiviacuteduos treinados (BALOG et al 2006) em pessoas apoacutes 6 meses de
89
treinamento e tambeacutem apoacutes um programa de treinamento de 3 semanas (ALDRED
2007) e em pacientes com DPOC apoacutes programa de exerciacutecios (PINHO et al 2007)
Provavelmente essa diminuiccedilatildeo na peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA dos potros do
grupo EX deveu-se a mecanismos protetores pois o treinamento influencia de forma
positiva a capacidade antioxidante do organismo em atletas humanos (URSO e
CLARKSON 2003 PARK et al 2005 BALOG et al 2006 ALDRED 2007 PINHO
et al 2007) e em cavalos (KIRSCHVINK et al 2008)
URSO e CLARKSON (2003) relataram um aumento significativo da atividade
da catalase uma enzima antioxidante nos eritroacutecitos de atletas humanos apoacutes um
exerciacutecio de corrida de longa distacircncia corroborando com os nossos achados de
aumento significativo da atividade da catalase no LBA dos potros do grupo EX em
comparaccedilatildeo com o grupo DA (FIGURA 24)
No presente estudo a atividade de macroacutefago alveolar foi investigada devido
ao papel inerente desta ceacutelula na defesa pulmonar O aumento na atividade dos
macroacutefagos alveolares no grupo DA foi discutida acima e provavelmente deveu-se agrave
presenccedila de aeroalergenos e endotoxinas presentes nas cocheiras dos cavalos
(RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento reduziu tanto a fagocitose de macroacutefago
alveolar (FIGURA 25) como a capacidade de produccedilatildeo de ROS (acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio) (FIGURAS 26 e 27)
O macroacutefago alveolar eacute a ceacutelula efetora do sistema imune predominante nos
espaccedilos alveolares e nas vias aeacutereas condutoras responsaacutevel por ativar as
respostas inflamatoacuterias de forma suficiente a eliminar agentes agressores (PETERS-
GOLDEN 2004) Os macroacutefagos alveolares satildeo essenciais agrave sobrevivecircncia
devendo estar em harmonia com o sistema nervoso e endoacutecrino para responder a
estiacutemulos fisioloacutegicos bem como patoloacutegicos (GORDON 2007) sem exagerar na
resposta a fim de natildeo comprometer a troca gasosa (PETERS-GOLDEN 2004)
Apesar de KIZAKI et al (2008) terem demonstrado que o macroacutefago pode
sofrer uma adaptaccedilatildeo ao exerciacutecio melhorando sua funcionalidade os potros PSI
jovens em treinamento para corrida do grupo EX apresentaram supressatildeo da
imunidade especificamente a relacionada agrave resposta imune inata dos macroacutefagos
alveolares corroborando com estudos anteriores (HUSTON et al 1987 RAIDAL et
al 2000 RAIDAL et al 2001) que avaliaram o LBA de cavalos apoacutes exerciacutecio
90
realizado em esteira de alta velocidade e obtiveram resultados semelhantes aos
nossos
Outro aspecto ainda natildeo relatado em equinos mas demonstrado em
pessoas eacute que a melhora na atividade antioxidante induzida pelo exerciacutecio pode
resultar em diminuiccedilatildeo da atividade da NADPH oxidase na membrana dos
macroacutefagos consequumlentemente reduzindo a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio por essas ceacutelulas (PARK et al 2005) como observado no
grupo EX
Portanto a influencia do exerciacutecio sobre a funcionalidade das ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico como a observada nos macroacutefagos alveolares do grupo EX no
presente estudo explicaria a maior suscetibilidade apresentada por potros de corrida
sob treinamento intenso a infecccedilotildees respiratoacuterias (HINES et al 1996) Em
humanos o exerciacutecio intenso reduziu a capacidade de apresentaccedilatildeo de antiacutegeno
(CEDDIA e WOODS 1999) bem como a resistecircncia antiviral (DAVIS et al 1997) por
macroacutefagos O PMA (phorbol myristate acetate) utilizado nas avaliaccedilotildees da
atividade de macroacutefago alveolar (ver toacutepicos 4114 e 4115) teve como funccedilatildeo
estimular a NADPH oxidase a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
(DEKKER et al 2000 NAKAJIMA et al 2000) mimetizando o estiacutemulo provocado
por agentes infecciosos (JI 2008) Isto de fato ocorreu no grupo EX jaacute que os
macroacutefagos estimulados apresentaram aumento significativo na atividade
comparando-se aos macroacutefagos natildeo estimulados (FIGURAS 26 e 27) entretanto a
atividade ainda foi significativamente menor que no grupo DA evidenciando a
reduccedilatildeo na atividade de macroacutefagos induzida pelo exerciacutecio
Os efeitos do PMA sobre os macroacutefagos alveolares e sobre os PMNs do
sangue de equino podem ser apreciados no experimento de validaccedilatildeo da teacutecnica
de estudo da bioatividade de PAF (FIGURAS 13 a 18) A teacutecnica utilizada para o
estudo da bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos potros
empregando-se PMNs de equinos como ferramenta para se avaliar o influxo de Ca++
induzido por PAF foi ineacutedita em estudos em cavalos Anteriormente a mesma
avaliaccedilatildeo foi realizada utilizando-se PMNs de humanos (GRYNKIEWICZ et al 1985
MARATHE et al 2001) Anteriormente os PMNs de equinos foram empregados
com ecircxito no estudo da bioatividade de PAF em extrato lipiacutedico obtido a partir de
amostras de pulmatildeo de ratos no estudo da asma (MUEHLMANN et al 2009)
91
Portanto a validaccedilatildeo desta teacutecnica se fez necessaacuteria e importante para o
reconhecimento dos resultados obtidos para a bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos investigados No presente estudo o PAF
ativou os PMNs do sangue do cavalo assim como os macroacutefagos alveolares de
forma concentraccedilatildeo dependente Portanto o PAF tendo como uma de suas origens
o macroacutefago alveolar eacute capaz de modificar o comportamento de neutroacutefilos
sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos
neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a ORVA (MARR et al 2002)
As influecircncias exercidas pelo PAF na circulaccedilatildeo pulmonar permeabilidade
capilar pulmonar e na agregaccedilatildeo plaquetaacuteria estimulou o estudo da HPIE nos potros
avaliados no grupo EX Para tal o hemossideroacutefago no LBA foi escolhido como o
marcador da HPIE porque a colheita do LBA 24 horas apoacutes o exerciacutecio resultou que
a observaccedilatildeo endoscoacutepica de sangue na traqueacuteia bem como a contagem do
nuacutemero de eritroacutecitos no LBA natildeo fossem teacutecnicas diagnoacutesticas indicadas nesse
momento
A observaccedilatildeo do hemossideroacutefago no LBA mesmo se constituindo numa
forma confiaacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993) poderia natildeo servir
aos nossos propoacutesitos de identificar diferenccedilas em marcadores inflamatoacuterios e de
estresse oxidativo bem como na funcionalidade de macroacutefagos alveolares dentro
de um mesmo grupo ateacute entatildeo considerado homogecircneo Contudo o
hemossideroacutefago presente no LBA foi confirmado no presente estudo natildeo soacute como
um marcador confiaacutevel da HPIE como tambeacutem foi capaz de diferenciar subgrupos
significativamente distintos dentro do grupo EX
Interessantemente observou-se um percentual de HPIE (determinado pela
presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA) maior que o de inflamaccedilatildeo pulmonar (gt5
de neutroacutefilos eou gt1 de eosinoacutefilos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA)
Isso nos leva a pensar que a HPIE precede a inflamaccedilatildeo no pulmatildeo dos cavalos de
corrida tal como foi sugerido por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) mas que
requer outras investigaccedilotildees para excluir que o contraacuterio estivesse acontecendo isto
eacute um processo inflamatoacuterio em periacuteodo anterior do treinamento que pudesse ter
deixado alguma fragilidade pulmonar Possivelmente o estudo de potros PSI de
corrida tatildeo jovens e em iniacutecio de treinamento permitiu tal discussatildeo visto que se
considera que a HPIE acometa praticamente a totalidade dos cavalos PSI em
treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007)
92
A associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo jaacute foi demonstrada anteriormente
(McKANE et al 1993) e foi considerada como sendo significativa no estudo
epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) apesar dos mecanismos pelos quais
esta associaccedilatildeo ocorre ainda serem apresentados de forma hipoteacutetica como no
recente estudo de DERKSEN et al (2009)
No estudo de COUEumlTIL e DENICOLA (1999) cavalos de corrida com HPIE
apresentaram na avaliaccedilatildeo do LBA um aumento no NTCN associado agrave neutrofilia
De fato isto ocorreu no subgrupo HPIE pos e esses achados de citologia
demonstram que a HPIE esteve associada agrave inflamaccedilatildeo pulmonar nos potros do
subgrupo HPIE pos
Outro achado comum entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar eacute o aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA como observado no subgrupo HPIE pos em
comparaccedilatildeo com o grupo HPIE neg (FIGURA 29) evidenciando um aumento na
permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) no subgrupo HPIE pos
O acuacutemulo de fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar associado agrave
inflamaccedilatildeo pulmonar como demonstrado por TSANGARIS et al (2003) foi discutido
acima Contudo cavalos com HPIE exercitados a altas velocidades tambeacutem
apresentaram aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas no espaccedilo alveolar (WEST e
MATTHIEU-COSTELLO 1999)
Possivelmente o aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas associado agrave HPIE
possa ser devido ao aumento da pressatildeo transmural nos capilares pulmonares
resultando em falecircncia por estresse dos capilares como demonstrado por BIRKS et
al (1997) em cavalos exercitados nas mesmas velocidades que os potros avaliados
no presente estudo
Adicionalmente parece que a HPIE deflagrou um mecanismo inflamatoacuterio
causador de extravasamento de plasma no espaccedilo alveolar nos potros do subgrupo
HPIE pos e a bioatividade de PAF significativamente aumentada no subgrupo HPIE
pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (FIGURA 28) indica a participaccedilatildeo desse
mediador proacute inflamatoacuterio nesse evento
O extravasamento de plasma na microcirculaccedilatildeo pulmonar e a formaccedilatildeo de
edema pulmonar induzidos por PAF foram demonstrados anteriormente e jaacute
discutidos acima (EVANS et al 1987 CLAVIJO et al 2001) No caso da HPIE
provavelmente o PAF induza a formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular
atraveacutes da desorganizaccedilatildeo de proteiacutenas juncionais (JIANG et al 2008) Estes dados
93
concordam com a proposta de WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) de que a
altas pressotildees em capilares pulmonares ocorra a formaccedilatildeo de fendas nas junccedilotildees
entre as ceacutelulas endoteliais Desta forma as evidecircncias indicam que associado ao
evento mecacircnico na etiopatogenia da HPIE um evento inflamatoacuterio tambeacutem estaacute
presente o que representa um fator de risco para o agravamento do quadro
Adicionalmente os eventos inflamatoacuterios presentes na HPIE se constituem em
potencial aacuterea para investigaccedilotildees terapecircuticas visto que ainda natildeo se tem um
tratamento efetivo para a hemorragia pulmonar em cavalos atletas Recentemente
evidecircncias de que a suplementaccedilatildeo de cavalos atletas com aacutecidos graxos ocircmega-3
melhora a fluidez da membrana dos eritroacutecitos (PORTIER et al 2006) sugeriu que a
influecircncia beneacutefica na resposta inflamatoacuteria pulmonar pode reduzir os iacutendices HPIE
(ERICKSON et al 2007)
Portanto eacute razoaacutevel assumir um papel para o PAF na fisiopatologia da HPIE
pelas suas propriedades angiogecircnicas aleacutem de seus efeitos proacute inflamatoacuterios
(APONTE et al 2008) concordando com a hipoacutetese da patogecircnese da HPIE
proposta por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) onde a ruptura dos capilares
pulmonares resultaria em inflamaccedilatildeo sangramento e hemosiderose e
consequumlentemente a ocorrecircncia de angiogecircnese na circulaccedilatildeo bronquial e fibrose
agravando o quadro da HPIE
Adicionalmente ZHANG et al (2003) demonstraram que o aumento da
permeabilidade capilar induzido por PAF envolve a participaccedilatildeo de estresse
oxidativo visto que a enzima antioxidante superoacutexido dismutase (SOD) atenuou os
efeitos do PAF sobre o endoteacutelio De fato o grupo HPIE pos apresentou a
concentraccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos significativamente aumentada em comparaccedilatildeo
ao subgrupo HPIE neg sendo uma evidecircncia de estresse oxidativo no LBA dos
potros deste grupo possivelmente exacerbada pela alta quantidade de ferro da
hemossiderina presente no espaccedilo alveolar (DERSEN et al 2009)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica induz alteraccedilotildees patoloacutegicas no tecido pulmonar
destruindo pneumoacutecitos e ceacutelulas endoteliais do epiteacutelio levando a um aumento da
permeabilidade microvascular inibe a siacutentese e a liberaccedilatildeo de surfactante e interfere
negativamente na atividade do NO O conjunto dessas accedilotildees dos peroacutexidos lipiacutedicos
no pulmatildeo resulta em dano da estrutura pulmonar e leva agrave hipertensatildeo
representando um fator adicional contribuindo para a patogenia da HPIE (MILLS e
HIGGINS 1997)
94
Os macroacutefagos alveolares como ceacutelulas orquestradoras da resposta imune
pulmonar (PETERS-GOLDEN 2004) devem possuir um importante papel na
patogenia da HPIE visto que a obtenccedilatildeo de subgrupos significativamente distintos
a partir do grupo EX no presente estudo se deu pela presenccedila ou ausecircncia de
hemossideroacutefagos THACKER (2006) descreveu que os macroacutefagos ativados
secretam interleucina-1 (IL-1) que atrai e ativa a proliferaccedilatildeo de fibroblastos e a
siacutentese de colaacutegeno para reparar o tecido danificado Em estudo histopatoloacutegico do
pulmatildeo de cavalos com HPIE as aacutereas de ocorrecircncia de hemorragia caracterizaram-
se por hemossiderose e fibrose (DERKSEN et al 2009)
Adicionalmente WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) sugeriram o
envolvimento de leucotrieno B4 (LTB4) no mecanismo inflamatoacuterio envolvido na
HPIE apesar deste mecanismo ainda requerer comprovaccedilatildeo Neste evento a
ruptura do epiteacutelio alveolar com a exposiccedilatildeo da membrana ativaria os macroacutefagos
alveolares os quais satildeo ricos em LTB4
O LTB4 por sua vez tambeacutem conecta o PAF agrave HPIE HOPKINS et al (1997)
estudaram a HPIE em humanos avaliando o LBA de seis ciclistas de elite apoacutes 4 km
de esforccedilo maacuteximo Comparados aos controles os ciclistas que realizaram o esforccedilo
apresentaram altas concentraccedilotildees de eritroacutecitos proteiacutenas e LTB4 no LBA No
estudo citado exceto pelo aumento da LTB4 natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
percentual de neutroacutefilos e nem nos niacuteveis de IL-8 e TNF-α entre os grupos
suportando a hipoacutetese do estresse mecacircnico alterando a BAC na HPIE segundo a
conclusatildeo dos autores Contudo a associaccedilatildeo entre LTB4 e PAF foi demonstrada
anteriormente onde o receptor de LTB4 esteve envolvido com a quimiotaxia
pulmonar e degranulaccedilatildeo de neutroacutefilos induzida por PAF (GAUDREAULT et al
2005) Todavia ateacute o momento este tipo de associaccedilatildeo natildeo foi demonstrada em
cavalos apesar de ter-se relatada a neutrofilia nas vias aeacutereas de cavalos com
ORVA mediada por LTB4 (LINDBERG et al 2004) Portanto reunindo as
informaccedilotildees acima pode-se assumir a hipoacutetese de que a neutrofilia no LBA e o
aumento da permeabilidade da BAC nos potros do subgrupo HPIE pos tenha sido
induzida por PAF e mediada por receptor de LTB4
Adicionalmente reforccedila-se a evidecircncia da importacircncia dos macroacutefagos
alveolares na HPIE e por sua vez como a hemorragia pulmonar pode influenciar a
funcionalidade dos macroacutefagos Na primeira etapa do presente estudo descrevemos
a reduccedilatildeo na fagocitose e na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de
95
hidrogecircnio pelos macroacutefagos alveolares do grupo EX (FIGURAS 25 a 27) Contudo
evidenciamos que a HPIE agravou ainda mais esta situaccedilatildeo (FIGURAS 32 e 33)
pois a resposta de macroacutefago alveolar esteve significativamente reduzida no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg
A reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no subgrupo HPIE pos pode ser
explicada novamente pela HAIE com consequumlente inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO
(MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
favorecendo o aumento da permeabilidade capilar (KIKUCHI et al 2008)
provavelmente agravado pela ocorrecircncia de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica neste grupo (MILLS
e HIGGINS 1997)
Os mecanismos pelos quais o NO modula a permeabilidade microvascular
natildeo satildeo bem conhecidos Em cavalos de PSI de corrida a inibiccedilatildeo da NOS pela
administraccedilatildeo de L-NAME agravou a HPIE enquanto natildeo alterou a pressatildeo arterial
pulmonar (KINDIG et al 2000) e a inalaccedilatildeo de NO durante o exerciacutecio reduziu
ligeiramente a pressatildeo arterial pulmonar enquanto tambeacutem causou agravamento da
HPIE (KINDIG et al 2001) Parece que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete
em parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou mas agravou a HPIE
Adicionalmente corroborando com o aumento da bioatividade de PAF e
reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos o estudo de
KWASNIEWSKI et al (2008) com um modelo de lesatildeo e hemorragia em intestino
delgado demonstrou que o preacute tratamento com antagonista de PAF reduziu as
lesotildees enquanto a inibiccedilatildeo do NO endoacutegeno aumentou consideravelmente as
lesotildees hemorraacutegicas e a mortalidade Portanto o estudo citado demonstrou a
existecircncia da relaccedilatildeo entre PAF e NO na hemorragia ocorrida na microcirculaccedilatildeo
assim como reafirma o papel protetor do NO para os efeitos proacute inflamatoacuterios do
PAF (NEVIN e BROADLEY 2002 BRKOVIC e SIROIS 2007)
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
A hipoacutetese do presente estudo foi confirmada pois tanto o desafio ambiental
como o exerciacutecio causaram alteraccedilotildees no fluido broncoalveolar e modificaram a
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar Potros PSI de corrida jovem em treinamento para
corrida apresentaram depressatildeo da resposta imune inata mais especificamente do
macroacutefago alveolar induzida pelo exerciacutecio e agravada pela ocorrecircncia da HPIE
PAF influencia os neutroacutefilos do sangue bem como os macroacutefagos alveolares
de equinos e no presente estudo esteve presente na inflamaccedilatildeo pulmonar induzida
pelo exerciacutecio nos potros PSI durante o treinamento para corrida
Os achados relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e ao aumento da
bioatividade de PAF no fluido broncoalveolar dos potros exercitados estiveram
relacionados agrave HPIE e agrave presenccedila dos hemossideroacutefagos no LBA o que resultou
numa resposta de macroacutefago alveolar ainda mais reduzida
Desta forma assume-se que os resultados obtidos para o grupo EX podem
ser extrapolados para as populaccedilotildees similares de cavalos PSI jovens em
treinamento para a corrida
Finalmente sugere-se a conduccedilatildeo de novos estudos para o entendimento
dos mecanismos inflamatoacuterios envolvidos na HPIE bem como o papel do PAF neste
processo
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SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS IX
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES XI
LISTA DE TABELAS XV
RESUMO XVI
ABSTRACT XVII
1 INTRODUCcedilAtildeO 18
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 18
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA) 18
13 PAF E VIAS AEacuteREAS 23
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 27
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO 29
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE) 34
2 OBJETIVOS 40
21 OBJETIVOS GERAIS 40
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS 41
31 REAGENTES E SEDATIVOS 41
32 ANIMAIS 41
33 ASPECTOS EacuteTICOS43
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA 43
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS 43
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) 45
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA46
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957) 47
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS 48
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE CA++
EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE ET AL 2001) 48
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)51
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR E MARLETTA 1985) 51
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA
(NOUROOZ-ZADEH ET AL 1994)52
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984) 53
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA ET AL 1998) 54
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA ET AL 1998) 54
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK E MIZEL 1981) 55
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN E GORDON 1987) 56
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 57
4 RESULTADOS 59
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO 59
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica59
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas 60
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT) 61
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA) 62
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem Diferencial de Ceacutelulas do LBA 62
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF 63
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF 65
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 67
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 68
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 69
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 70
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA 71
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 72
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar 73
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 74
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO 75
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA 75
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 76
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 77
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 78
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 79
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 80
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-) 80
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 81
5 DISCUSSAtildeO 83
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 96
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 97
LISTA DE ABREVIATURAS
ACVIM American College of Veterinary Internal Medicine
AT Aspirado traqueal
CN Grupo Condiccedilotildees Naturais
DA Grupo Desafio Ambiental
DIVA Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas
DIVAI Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
DPOC Doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica
EX Grupo Exerciacutecio
HAIE Hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio
HPIE Hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
HRPO Horse radish peroxidase
IFN-γ Interferon gama
IL-1 Interleucina-1
IL-4 Interleucina-4
IL-8 Interleucina-8
IL-9 Interleucina-9
IL-17 Interleucina-17
LBA Lavado broncoalveolar
L-NAME N-nitro-L-arginina metil ester
LTB4 Leucotrieno B4
LTE8 Leucotrieno E8
MLCP Myosin light chain phophatase
NO Oacutexido niacutetrico
NOS Oacutexido niacutetrico sintase
NTCN Nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas
ORVA Obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas
PAF Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PAF-AH Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria acetilhidrolase
PAF-R Receptor de fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PBS Soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada
PMA Phorbol myristate acetate
PMN Polimorfonuclear
PRS Phenol red solution
PSI Puro sangue inglecircs
RNS Espeacutecie reativa do nitrogecircnio
ROS Espeacutecie reativa do oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Th2 Linfoacutecitos T helper 2
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE 20
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO SN-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL 24
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM
RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS 25
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E
SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE 30
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA
ASMA 31
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS 32
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO
A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR
(BAC) 36
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO
DERSKEN et al (2009) 38
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA
FARINGE 44
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS
ARITENOacuteIDES DE I A IV 44
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME
ENDOSCOacutePICO 45
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO
DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO
REGISTRADA A 510 nm 50
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA
ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 57
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA
AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 63
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS
DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 64
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO
ANTAGONISTA DE PAF BN52021 64
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO
ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 65
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 66
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR
PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 66
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++
EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 67
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO
EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA
ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 68
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A
PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 69
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO
SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 70
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX
(n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA 71
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) 72
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) 73
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) 74
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) 75
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) HPIE NEG (n=5) e EX NORMAL (n=4) 76
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE
POS (n=13) HPIE NEG (n=12) E EX NORMAL (n=8) 77
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) HPIE NEG (n=10) E EX NORMAL (n=7) 79
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) HPIE NEG (n=8) E EX NORMAL (n=5) 80
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS
POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) HPIE NEG (n=5) E EX NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE
POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 81
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE
PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) HPIE NEG (n=6) E EX
NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2
ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 82
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS
TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE
INGLEcircS DE CORRIDA 59
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGIANOS
OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS
DE I A IV 60
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS
CARTILAGENS ARITENOacuteIDES 60
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA
ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO
SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE
AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 61
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS
CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN
(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS
DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN
(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM
PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO
LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX E DOS
SUBGRUPOS HPIE POS HPIE NEG E EX NORMAL 76
RESUMO
A doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas (DIVA) e a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) satildeo comuns em cavalos de corrida resultando em interrupccedilatildeo no treinamento A hipoacutetese do presente estudo foi de que o ambiente e o exerciacutecio
causam estresse oxidativo produccedilatildeo do fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF) e inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas de potros PSI de corrida e que haacute uma relaccedilatildeo entre a DIVA e a HPIE Estudou-se potros PSI em ambiente natural (NC n=45) estabulados
por 30 dias (DA n=40) e treinados (EX n=34) Apoacutes os potros do grupo EX foram divididos em trecircs subgrupos HPIE pos (presenccedila de hemossideroacutefagos no lavado broncoalveolar - LBA) HPIE neg (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA) e EX
normal (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA e menos de 5 de neutroacutefilos e menos de 1 de eosinoacutefilos no LBA) Avaliou-se perfil citoloacutegico e paracircmetros do LBA relacionados a estresse oxidativo bioatividade de PAF atividade da catalase e
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar (MA) Os percentuais de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no LBA do grupo EX foram maiores (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 e 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectivamente) que os limites superiores para cavalos normais
(5 para neutroacutefilos e 1 para eosinoacutefilos) juntamente com um maior nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 ceacutelulasmicroL de LBA P=0017) evidenciaram a ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo pulmonar A bioatividade de PAF e a
concentraccedilatildeo de proteiacutenas no LBA foram maiores no grupo EX (relaccedilatildeo 340380 nm 0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg de proteiacutenasmL de LBA Plt0001) A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos no LBA foi maior
no grupo DA (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg de proteiacutenas Plt0001) e a atividade da catalase foi maior no grupo EX (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg de proteiacutenas P=0002) A fagocitose de MA (P=0006) bem como a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido (Plt0001) e peroacutexido de hidrogecircnio (P=0006) foram
significativamente menores no grupo EX Vinte e trecircs (622) potros do grupo EX foram HPIE pos e o LBA desse subgrupo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutenas (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) bioatividade de
PAF (relaccedilatildeo 340380 nm 0180 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 P=0042) e concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) significativamente maiores que o subgrupo HPIE neg A concentraccedilatildeo de nitritos
(008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) e a atividade de MA foi menor em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg O ambiente e o exerciacutecio modificaram o fluido broncoalveolar confirmando a hipoacutetese do presente estudo
Houve aumento da resposta de MA induzida pelo ambiente enquanto o exerciacutecio fiacutesico resultou em HPIE inflamaccedilatildeo pulmonar e diminuiccedilatildeo na resposta imune inata relacionada aos macroacutefagos alveolares nos potros PSI jovens durante o treinamento
para corrida e o PAF esteve presente nesse processo Sugere-se a conduccedilatildeo de novas investigaccedilotildees para elucidar os mecanismos inflamatoacuterios da HPIE bem como o papel do PAF neste processo como um potencial alvo terapecircutico
Palavras-chave cavalo fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria hemorragia pulmonar inflamaccedilatildeo pulmonar fluido broncoalveolar
ABSTRACT
Inflammatory airway disease (IAD) and exercise-induced pulmonary hemorrhage (EIPH) are common in racehorses during training being important ailments interrupting training of thoroughbred racehorses The present study hypothesis was
that stabling and exercise cause oxidative stress release of platelet-activating factor (PAF) and inflammation in airways of Thoroughbred colts and that there is an association between IAD and EIPH The subjects were colts in breeding farms (NC
n=45) stabled for 30 days (EC n=40) and race trained (EX n=34) Colts of the EX group were subdivided into three subgroups EIPH pos (presence of hemosiderophages in BALF) EIPH neg (absence of hemosiderophages in BALF)
and Normal EX (absence of hemosiderophages and less than 5 neutrophils and 1 eosinophils in BALF) Cytological profile and parameters of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) related to oxidative stress bioactivity of the pro-inflammatory
mediator PAF catalase activity and alveolar macrophage (AM) activity were studied Percentages of neutrophils and eosinophils in the BALF of the EX group were higher (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 and 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectively)
than the upper limits for normal horses (5 of neutrophils and 1 of eosinophils) that associated with a significantly higher total nucleated cell count (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 cellsmicroL of BALF P=0017) displayed pulmonary inflammation PAF
bioactivity and the total protein concentration in the BALF were higher in the EX group (0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 340380nm ratio P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg of proteinsmL of BALF Plt0001) Concentration of BALF hydroperoxides
was higher in the EC group (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg of proteins Plt0001) and catalase activity was higher in the EX group (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg of proteins P=0002) AM phagocytosis (P=0006) as well as production of superoxide anion (Plt0001) and hydrogen peroxide (P=0006) were
significantly lower in EX group Twenty three (622) colts of the EX group were EIPH pos and the BALF of this subgroup presented a significantly higher protein concentration (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg of proteinsmL of BALF P=0031) PAF
bioactivity (018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 340380 nm ratio P=0042) and lipid hydroperoxide concentration (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg of proteins P=0009) as well as lower nitrite concentration (008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007
absorbance 550 nm P=0049) and AM activity than EIPH neg subgroup Environment and exercise modified the bronchoalveolar fluid confirming the hypothesis of the present study Environment increased AM response as exercise resulted in EIPH
pulmonary inflammation and decreased innate immune response of alveolar macrophages in young Thoroughbred horses during race training and PAF participated in this event Further studies should be conducted to better understand
the inflammatory mechanisms of EIPH and the role of PAF in this process as a potential therapeutic target
Keywords horse platelet-activating factor pulmonary hemorrhage pulmonary
inflammation bronchoalveolar fluid
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
As doenccedilas respiratoacuterias satildeo comuns nos cavalos e as condiccedilotildees a que
estatildeo sujeitos fazem com que a inflamaccedilatildeo seja uma manifestaccedilatildeo frequumlente dessas
afecccedilotildees O epiteacutelio das vias aeacutereas superiores e dos pulmotildees estatildeo expostos a
patoacutegenos invasores e fatores ambientais Portanto o conhecimento dos
mecanismos da resposta inflamatoacuteria nas vias aeacutereas se faz importante a fim de se
estabelecer estrateacutegias para reduzir o impacto e os danos causados (THACKER
2006)
A inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apresenta um agravante o papel dos pulmotildees
na troca gasosa Assim as quatro principais consequumlecircncias de um processo
inflamatoacuterio desencadeado nas vias aeacutereas incluem vasodilataccedilatildeo e a reduccedilatildeo no
fluxo sanguiacuteneo resultando em capilares ingurgitados o aumento da permeabilidade
capilar permitindo a passagem de fluiacutedo e ceacutelulas para os tecidos o influxo e
acuacutemulo de fagoacutecitos e ceacutelulas ativadas no local e a bronconstricccedilatildeo (LUNN et al
2007)
O estudo das doenccedilas respiratoacuterias em cavalos eacute relevante particularmente
nos cavalos jovens de corrida onde a taxa de inflamaccedilatildeo detectada nas vias aeacutereas
eacute significativa (CHRISTLEY e RUSH 2007)
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA)
Os termos ldquodoenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereasrdquo (DIVA) e ldquodoenccedila
inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferioresrdquo (DIVAI) tecircm sido usados para descrever uma
siacutendrome inflamatoacuteria do trato respiratoacuterio de cavalos de corrida (CHRISTLEY e
RUSH 2007)
Tem-se relatado que a DIVA ocorre em 11 a 50 dos cavalos de corrida em
treinamento chegando a afetar ateacute 80 dos cavalos de corrida de dois anos de
idade (CHRISTLEY e RUSH 2007) MALIKIDES (2003) estudou a prevalecircncia da
DIVA em cavalos de corrida na Austraacutelia evidenciando que 41 deles apresentaram
inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apoacutes duas semanas de iniciarem treinamento
19
A DIVA eacute considerada a segunda afecccedilatildeo mais comum a interromper o
treinamento para corridas (WILSHER et al 2006) podendo resultar em prejuiacutezos a
troca gasosa e diminuiccedilatildeo da capacidade atleacutetica (COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005)
Cavalos com DIVA ou com hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) apresentaram uma maior hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE)
(CHRISTLEY et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
(FIGURA 1)
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE EIPH HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO IAD DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS UAO OBSTRUCcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS SUPERIORES FONTE SAacuteNCHEZ et al (2005)
Cavalos trotadores de corrida diagnosticados com DIVA tiveram a mecacircnica
pulmonar (volume corrente frequumlecircncia respiratoacuteria ventilaccedilatildeo pulmonar duraccedilatildeo da
inspiraccedilatildeo e da expiraccedilatildeo complacecircncia dinacircmica) alterada apresentaram um
significativo aumento da carga ventilatoacuteria e da energia requerida para a respiraccedilatildeo
sofrendo restriccedilotildees em seu rendimento atleacutetico (PIRRONE et al 2007)
Contudo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas dos cavalos atletas natildeo eacute entendida
por completo especialmente pela falta de consistecircncia e precisatildeo na definiccedilatildeo
dessa siacutendrome (CHRISTLEY e RUSH 2007)
Recentemente um painel de discussatildeo promovido pelo American College of
Veterinary Internal Medicine (ACVIM) definiu que a DIVA pode ocorrer em cavalos
de qualquer idade e eacute caracterizada pelo seguinte fenoacutetipo (COUEumlTIL et al 2007)
20
- Baixo rendimento desportivo intoleracircncia ao exerciacutecio
- Tosse com ou sem quantidade excessiva de muco traqueal
- Inflamaccedilatildeo natildeo seacuteptica detectada pela avaliaccedilatildeo citoloacutegica do fluido do LBA
ou disfunccedilatildeo pulmonar baseada em evidecircncia de obstruccedilatildeo de vias aeacutereas
inferiores hiperresponsividade das vias aeacutereas ou prejuiacutezo a troca gasosa durante o
repouso ou exerciacutecio
Este painel formado por experts e pesquisadores da aacuterea propocircs tambeacutem
alguns fatores de exclusatildeo para a DIVA
- Evidecircncia de sinais sistecircmicos de infecccedilatildeo (febre alteraccedilotildees hematoloacutegicas
compatiacuteveis com infecccedilatildeo)
- Aumento do esforccedilo respiratoacuterio durante o repouso
A etiopatogenia da DIVA eacute pouco definida Acredita-se que uma variedade de
fatores de risco estejam envolvidos variando nas diferentes populaccedilotildees de cavalos
baseado na alimentaccedilatildeo manejo praacuteticas preventivas distribuiccedilatildeo de agentes
infecciosos e influecircncias geneacuteticas (COUEumlTIL et al 2007)
Alguns autores encontraram uma reduccedilatildeo da incidecircncia desta afecccedilatildeo em
cavalos mais velhos (BURRELL et al 1996 CHAPMAN et al 2000 CHRISTLEY et
al 2001 WOOD et al 2005) sendo que a idade natildeo provocou diferenccedila no estudo
de McKANE et al (1993)
O ambiente da cocheira representa um risco adicional para a DIVA nos
cavalos (BURRELL et al 1996 HOLCOMBE et al2001 CLEMENTS e PIRIE
2007 BERNDT et al 2008) bem como para a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas das
pessoas envolvidas no trabalho com os cavalos (ELFMAN et al 2009)
HOLCOMBE et al (2001) associaram o manejo de estabulaccedilatildeo com a
ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas inferiores Estudaram 14 potros aacuterabes
que foram transferidos da pastagem para cocheiras com cama de palha Apoacutes 90
dias de estabulados houve um aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no
lavado broncoalveolar (LBA) Cavalos estabulados em cama de palha tambeacutem
apresentaram maior chance de apresentar DIVA em outros estudos (BURRELL et
al 1996 WOODS et al 1993)
No entanto em cavalos de montaria no estado norte-americano de Michigan
foi a permanecircncia em piquetes durante o inverno que esteve associado com
aumento do acuacutemulo de muco traqueal com maior nuacutemero de neutroacutefilos Neste
21
estudo a alimentaccedilatildeo com feno tambeacutem representou risco para a ocorrecircncia de
inflamaccedilatildeo (ROBINSON et al 2006)
Contudo o ambiente de cocheiras em modelos convencionais de manejo aos
quais os cavalos em treinamento estatildeo submetidos reconhecidamente apresenta
riscos para as vias aeacutereas Nestes haacute aumento nas concentraccedilotildees de partiacuteculas
inalaacuteveis contendo partiacuteculas orgacircnicas e inorgacircnicas incluindo endotoxinas β-D-
glucan partiacuteculas ultra finas (lt100 nm de diacircmetro) microorganismos esporos de
fungos material vegetal poeira inorgacircnica e gases toacutexicos (COUEumlTIL et al 2007)
Recentemente no estudo de BERNDT et al (2008) se demonstrou que o ambiente
de cocheira apresenta uma concentraccedilatildeo de endotoxinas 8 vezes maior que nos
piquetes
Aleacutem disso haacute muito jaacute foi descrita a presenccedila de actinomicetos termofiacutelicos
como a Micropolyspora faeni nos fenos fornecidos aos cavalos capazes de serem
inalados atingindo as vias aeacutereas inferiores (McPHERSON e THOMSON 1983)
Assim a praacutetica de encharcar o feno antes da administraccedilatildeo para diminuir a
quantidade de poeira disponiacutevel resultou em benefiacutecio agraves vias aeacutereas dos cavalos
(CLEMENTS e PIRIE 2007)
Por outro lado a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA ainda
natildeo estaacute bem esclarecida Cavalos com sinais cliacutenicos de inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas apresentaram maior frequecircncia de isolados bacterianos nos estudos de
CHRISTLEY et al (2001) e WOOD et al (2005) apesar de o painel do ACVIM
entender que a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA precisa ser
melhor estudada (COUEumlTIL et al 2007)
O exerciacutecio tambeacutem tem sido associado agrave inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas
inferiores dos cavalos atletas (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) A prevalecircncia da DIVA eacute maior em cavalos em treinamento
que em cavalos do mesmo grupo mas sem treinamento talvez pela inalaccedilatildeo de
maiores quantidades de partiacuteculas pela exposiccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores ao ar
frio ou pela ocorrecircncia da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (DAVIS et
al 2006 CHRISTLEY e RUSH 2007)
O diagnoacutestico da DIVA inclui a histoacuteria e o exame fiacutesico detalhados para a
identificaccedilatildeo de potenciais fatores etioloacutegicos A tosse durante o exerciacutecio ou
durante a alimentaccedilatildeo constitui a queixa mais comum (CHRISTLEY e RUSH 2007)
esteve associada agrave presenccedila de quantidades aumentadas de secreccedilatildeo traqueal bem
22
como a um maior percentual de neutroacutefilos tanto na secreccedilatildeo traqueal (CHRISTLEY
et al 2001) como no LBA (BENEDICE et al 2008) mas sua ausecircncia natildeo descarta
o diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
A presenccedila de descarga nasal mucopurulenta eacute achado comum em cavalos
de corrida de dois anos de idade sendo menos comum em cavalos mais velhos
Sua relaccedilatildeo com a DIVA todavia natildeo eacute sabida (COUEumlTIL et al 2007)
A auscultaccedilatildeo toraacutecica durante o repouso raramente evidencia alteraccedilotildees em
cavalos atletas com inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores (MAZAN e HOFFMAN
2003 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007) sendo necessaacuteria a
utilizaccedilatildeo de uma sacola para o cavalo respirar no seu interior ampliando o esforccedilo
respiratoacuterio (bdquorebreathing bagrsquo) podendo tornar audiacuteveis alguns sons anormais em
certos casos (MAZAN e HOFFMAN 2003 COUEumlTIL et al 2007)
MAZAN e HOFFMAN (2003) relataram que os testes de funccedilatildeo pulmonar
como o pneumotacoacutegrafo e o teste de broncoprovocaccedilatildeo com histamina podem
auxiliar tornando o diagnoacutestico da DIVA definitivo Contudo o diagnoacutestico precoce
da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores deve enfatizar a avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA
e natildeo os testes de funccedilatildeo pulmonar (COUEumlTIL et al 2007)
A avaliaccedilatildeo citoloacutegica do AT tambeacutem tem contribuido ao diagnoacutestico dos
processos inflamatoacuterios das vias aeacutereas contudo natildeo eacute considerado suficiente para
o diagnoacutestico da DIVA Isto se deve a falta de concordacircncia entre os achados
citoloacutegicos do AT e do LBA e da falta de estudos associando os achados no AT e o
rendimento atleacutetico (HODGSON e HODGSON 2003 HUGHES et al 2003
COUEumlTIL et al 2007) Ainda um cuidado a ser levado em conta quando da
realizaccedilatildeo de AT eacute o tempo da colheita jaacute que a realizaccedilatildeo de exerciacutecio
esteneuante pode aumentar o percentual de neutroacutefilos na amostra obtida
(MALIKIDES et al 2007)
O LBA por sua vez eacute o meacutetodo para a obtenccedilatildeo de amostras de ceacutelulas
presentes nas vias aeacutereas mais distais e espaccedilo alveolar (HOFFMAN 1999
FERNANDES et al 2000 LESSA et al 2005) considerado como uma bioacutepsia
liacutequida (MAZAN e HOFFMAN 2003) sendo a teacutecnica de avaliaccedilatildeo citoloacutegica
preferida para o diangoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
Um aumento no percentual de ceacutelulas inflamatoacuterias no fluido do LBA eacute um dos
principais criteacuterios diagnoacutesticos para a DIVA Usualmente ocorre uma predominacircncia
de neutroacutefilos mas tambeacutem pode ocorrer aumento nos nuacutemeros percentuais de
23
eosinoacutefilos linfoacutecitos e mastoacutecitos normalmente associados com diminuiccedilatildeo no
rendimento desportivo e hiperresponsividade das vias aeacutereas (McKANE et al 1993
HARE e VIEL 1998 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007)
O perfil citoloacutegico de LBA mais comumente encontrado em cavalos com DIVA
eacute caracterizado por aumento no nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (NTCN) com
discreta neutrofilia (gt5) linfocitose e monocitose Tambeacutem pode ser encontrado
um aumento do nuacutemero percentual de eosinoacutefilos (gt01) e mastoacutecitos (gt2)
(HOFFMAN 1999 COUEumlTIL et al 2007)
O painel de estudo da DIVA promovido pelo ACVIM apontou direccedilotildees para as
pesquisas nesta aacuterea e dentre elas o estudo das citocinas e mediadores
inflamatoacuterios envolvidos no processo (COUEumlTIL et al 2007)
Sabe-se que ocorre um incremento da imunidade inata nas vias aeacutereas dos
cavalos estabulados com o envolvimento de IL-6 (RIIHIMAumlKI et al 2008a) Em
cavalos trotadores de corrida em treinamento ocorre uma eosinofilia transitoacuteria no
fluido broncoalveolar e um aumento da expressatildeo de IL-4 e IL-5 contudo natildeo foi
encontrada correlaccedilatildeo entre estes eventos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Dentre os mediadores quiacutemicos participantes do processo inflamatoacuter io nas
vias aeacutereas o PAF (platelet-activating factor) estaacute especialmente implicado na asma
sepse e injuacuteria pulmonar aguda (THACKER 2006) presente tambeacutem na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas em cavalos mais velhos
(FAIRBAIRN et al 1996) Contudo a participaccedilatildeo do PAF no processo inflamatoacuterio
nas vias aeacutereas de cavalos atletas ainda natildeo eacute conhecida
13 PAF E VIAS AEacuteREAS
O fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocoline)
eacute um potente mediador proacute inflamatoacuterio envolvido na angiogecircnese aterosclerose
anafilaxia cicatrizaccedilatildeo inflamaccedilatildeo apoptose e endotoxemia (MARATHE et al
2001 STAFFORINI et al 2003 OWEN et al 2005) O PAF eacute produzido por
eosinoacutefilos macroacutefagos alveolares neutroacutefilos plaquetas e ceacutelulas endoteliais
(BAKER et al 2002 STAFFORINI et al 2003 GAUDREAULT et al 2005 SUMITA
et al 2005) a partir de uma subclasse especiacutefica de fosfatidilcolina que conteacutem um
eacuteter ao inveacutes de um eacutester ligado a posiccedilatildeo sn-1 do esqueleto de glicerol (FIGURA
24
2) A fosfatidilcolina eacute o mais abundante fosfolipiacutedio presente nas membranas
bioloacutegicas (MARATHE et al 2001 OWEN et al 2005)
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO sn-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL FONTE MARATHE et al (2001)
O PAF tambeacutem estaacute envolvido numa variedade de funccedilotildees pulmonares como
por exemplo no tocircnus vascular e das vias aeacutereas na frequumlecircncia de movimentaccedilatildeo
dos ciacutelios e na permeabilidade endotelial causando um aumento da secreccedilatildeo de
fluido traqueal broncoconstricccedilatildeo edema e hiperresponsividade das vias aeacutereas
resultando em prejuiacutezos a troca gasosa (CLAVIJO et al 2001 GABRIJELCIC et al
2003 ISHII et al 2004 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008)
Os efeitos do PAF sobre a circulaccedilatildeo pulmonar foram descritos por diversos
autores CHEN et al (1992) demonstraram um aumento das pressotildees arterial e
microvascular pulmonares e edema apoacutes a injeccedilatildeo de PAF SHIBAMOTO et al
(1993) estudaram os efeitos do PAF na circulaccedilatildeo venosa em pulmatildeo de catildeo onde
o PAF causou venoconstricccedilatildeo e aumento da pressatildeo capilar sem aumento da
permeabilidade vascular OHAR et al (1994) tambeacutem demonstraram
venoconstricccedilatildeo em estudo com pulmatildeo de coelhos mas demostraram que a
reduccedilatildeo da complacecircncia e aumento da resistecircncia vascular deveu-se a alteraccedilatildeo
estrutural vascular por perda de colaacutegeno intersticial induzida por PAF
Contudo o papel do PAF como causador de aumento da permeabilidade
vascular e edema pulmonar estaacute bem estudado devido a sua participaccedilatildeo na
fisiopatologia da anafilaxia da endotoxemia e da asma (EVANS et al 1987
25
CLAVIJO et al 2001 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008
MUEHLMANN et al 2009)
Em estudo preacutevio o extravasamento microvascular ocorrido apoacutes a infusatildeo de
PAF natildeo foi acompanhado de aumento da pressatildeo arterial pulmonar assim os
autores concluiacuteram que o edema pulmonar mediado por PAF resulta de aumento da
permeabilidade microvascular pulmonar (CLAVIJO et al 2001)
De fato demonstrou-se que o aumento da permeabilidade capilar induzida
por PAF ocorre pela formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular devido a
desorganizaccedilatildeo das proteiacutenas juncionais VE-caderina e ocludina (ZHANG et al
2003 JIANG et al 2008) mediada por receptores especiacuteficos (EVANS et al 1987)
e atraveacutes da ativaccedilatildeo da via do insositol trisphosphato e influxo de caacutelcio (GOumlGGEL
e UHLIG 2005) (FIGURA 3)
PLC phopholipase C IP3 inositol 145-trisphosphato IP3R receptor de IP3
MLCK myosin light chain kinase ML-7 5-iodonaphthalene-1sulphonyl-
homopiperazine L108 edelfosina Inibiccedilatildeo ativaccedilatildeo
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS NO LADO ESQUERDO OBSERVA-SE O EFEITO DO PAF EM CEacuteLULAS ENDOTELIAIS NO LADO DIREITO OBSERVA-SE OS EFEITOS DO PAF EM CEacuteLULAS DA MUSCULATURA LISA VASCULAR E DAS VIAS AEacuteREAS A QUAL Eacute ALTAMENTE MEDIADA POR TROMBOXANO NESTE A VIA PRINCIPAL Eacute ATRAVEacuteS DA ATIVACcedilAtildeO DE RHO E PROTEIacuteNAS KINASES ASSOCIADAS Agrave RHO QUE ATENUAM A ATIVIDADE DA MLCP (MYOSIN LIGHT CHAIN PHOPHATASE) COM CONSEQUumlENTE AUMENTO DA FOSFORILACcedilAtildeO DA CADEIA LEVE DA MIOSINA E PORTANTO A CONTRACcedilAtildeO FONTE GOumlGGEL e UHLIG (2005)
26
Adicionalmente os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) (BELLAN et al 1992) O
aumento da produccedilatildeo de NO induzida por PAF via ativaccedilatildeo de receptor de PAF foi
demonstrado em ceacutelulas do endoteacutelio vascular humano considerado como um efeito
cardioprotetor (KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Contudo particularmente
na microcirculaccedilatildeo o NO contra-ataca muitos dos efeitos bioloacutegicos do PAF inibindo
a vasoconstricccedilatildeo arteriolar e o aumento da permeabilidade vascular aleacutem de inibir
a adesatildeo de plaquetas e de leucoacutecitos ao endoteacutelio (BRKOVIC e SIROIS 2007
KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Mas os mecanismos pelos quais o NO
modula a permeabilidade microvascular ainda natildeo satildeo bem entendidos podendo ser
confusos e dependentes do estado das ceacutelulas endoteliais (RAMIREZ et al 2006)
A inibiccedilatildeo da NO sintase (NOS) em ceacutelulas endoteliais atenuou o aumento da
permeabilidade microvascular induzida por PAF no estudo de ZHU et al (2004) Por
outro lado estudando a participaccedilatildeo de NO e PAF em lesotildees de intestino delgado
de ratos KWASNIEWSKI et al (2008) evidenciaram que a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de
NO endoacutegeno aumentou bastante as lesotildees hemorraacutegicas e a taxa de mortalidade
demonstrando o papel proacute inflamatoacuterio do PAF e o efeito protetor do NO na
microcirculaccedilatildeo Tal relaccedilatildeo tambeacutem foi descrita por BRKOVIC e SIROIS (2007)
estudando o papel do PAF e do NO nos efeitos proacute inflamatoacuterios resultantes da
participaccedilatildeo de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e concluindo que eacute
o PAF que diretamente aumenta a permeabilidade vascular sendo o NO um cofator
A atuaccedilatildeo do PAF como mediador inflamatoacuterio eacute bastante importante na
asma onde aleacutem de provocar aumento da permeabilidade vascular tambeacutem induz
uma neutropenia transitoacuteria seguida de neutrofilia resultando no recrutamento de
neutroacutefilos para o pulmatildeo evidenciado atraveacutes de estudo citoloacutegico do lavado
broncoalveolar (LEE et al 2002 GABRIJELCIC et al 2003)
No estudo de AU et al (2001) a ativaccedilatildeo de neutroacutefilos resultou em ativaccedilatildeo
dos receptores de PAF aumento da fagocitose de neutroacutefilos e subsequumlente
liberaccedilatildeo de interleucina-8 (IL-8) causando mais quimiotaxia de neutroacutefilos
Adicionalmente demonstrou-se que haacute envolvimento de receptor 1 de leucotrieno B4
(LTB4) nas atividades de neutroacutefilos humanos mediadas por PAF (GAUDREAULT et
al 2005)
Em indiviacuteduos asmaacuteticos e com doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC)
o influxo de neutroacutefilos mediado por PAF nas vias aeacutereas foi modulado pelo aumento
27
de LTB4 provavelmente pelo estiacutemulo de PAF para a liberaccedilatildeo de LTB4 dos
macroacutefagos alveolares (SHINDO et al 1998 GABRIJELCIC et al 2003 FINNEY-
HAYWARD et al 2009)
Nas vias aeacutereas dos cavalos se demonstrou a participaccedilatildeo do PAF na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas (ORVA) levando a um
aumento do recrutamento de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo resultando em
prejuiacutezos agrave funccedilatildeo pulmonar (FAIRBAIRN et al 1996)
O PAF tendo como uma de suas origens o macroacutefago alveolar eacute capaz de
modificar o comportamento de neutroacutefilos sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da
adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a
ORVA (MARR et al 2002)
A participaccedilatildeo do PAF na asma humana e em outras espeacutecies foi evidenciada
pela sua capacidade em reproduzir mecanismos fisiopatoloacutegicos tais como a
broncoconstricccedilatildeo hiperresponsividade das vias aeacutereas aumento da
permeabilidade na microcirculaccedilatildeo pulmonar e aumento na secreccedilatildeo de muco (LOU
et al 1998 ISHII et al 2004 MUEHLMANN et al 2009)
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
Os desafios indutores de alteraccedilotildees na funcionalidade dos macroacutefagos
alveolares resultando em quimiotaxia de neutroacutefilos para as vias aeacutereas levam a um
quadro inflamatoacuterio pulmonar acompanhado de hipersecreccedilatildeo de muco Por sua vez
o muco presente nas vias aeacutereas possui uma seacuterie de funccedilotildees essenciais que
coletivamente levam a proteccedilatildeo das vias aeacutereas Juntamente com as ceacutelulas
epiteliais forma o sistema mucociliar que associado agrave tosse eacute essencial para
manter as vias aeacutereas desobstruiacutedas (ADLER 2005)
Por outro lado a produccedilatildeo excessiva de muco representa um fator importante
de morbidade e mortalidade nas doenccedilas das vias aeacutereas (THORNTON e
SHEEHAN 2004) Assim a resposta imunoloacutegica do epiteacutelio das vias aeacutereas frente
a infecccedilotildees virais e bacterianas e endotoxinas inaladas eacute caracterizada pela
liberaccedilatildeo de citocinas e pela produccedilatildeo de mucinas para prover proteccedilatildeo adicional
(HODGSON et al 2003 GERBER et al 2004 LORA et al 2005) Entretanto nos
quadros inflamatoacuterios os danos teciduais substanciais podem levar a produccedilatildeo
28
excessiva de muco e comprometimento da funccedilatildeo respiratoacuteria (LORA et al 2005
ROBINSON 2005)
O muco eacute uma mistura de aacutegua (~95) eletroacutelitos (~1) lipiacutedios (~1)
proteiacutenas (2-3) enzimas proteiacutenas seacutericas e mucinas (GERBER 2001) As
mucinas glicoproteiacutenas oligomeacutericas representam um constituinte importante do
muco sendo o gene responsaacutevel pela produccedilatildeo de mucinas o MUC5 (THORNTON
e SHEEHAN 2004)
Nas vias aeacutereas a produccedilatildeo de mucinas ocorre predominantemente pelas
ceacutelulas caliciformes do epiteacutelio e em menor parte nas glacircndulas da submucosa
(GERBER et al 2004 THORNTON e SHEEHAN 2004) A produccedilatildeo de
quantidades excessivas de muco pode representar a causa direta de obstruccedilatildeo
bronquial podendo amplificar o efeito de estreitamento luminal da broncoconstricccedilatildeo
e estar associada ao comprometimento da funccedilatildeo pulmonar tosse e capacidade
reduzida para a corrida em atletas humanos (HALLSTRAND et al 2007) e em
cavalos de corrida (CHRISTLEY et al 2001 HOLCOMBE et al 2006)
Assim a quantidade de muco secretado apresenta uma correlaccedilatildeo estreita
com a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas (GERBER et al 2004 ROBINSON et al 2003
HOLCOMBE et al 2006 ROBINSON 2005) De fato haacute uma evidente associaccedilatildeo
entre a hipersecreccedilatildeo de muco e presenccedila de quantidades aumentadas de
neutroacutefilos nas secreccedilotildees respiratoacuterias em seres humanos e em cavalos
(HODGSON et al 2003 ROBINSON et al 2003 ADLER 2005) Contagens de
neutroacutefilos no LBA menores que 30 ceacutelulasμL correspondem a pequenas
quantidades de muco nas vias aeacutereas e os acuacutemulos de secreccedilatildeo aumentam
quando as quantidades de neutroacutefilos estatildeo entre 30 e 100 ceacutelulasμL Entre 100 e
1000 ceacutelulasμL ocorre obstruccedilatildeo mensuraacutevel das vias aeacutereas Possivelmente esse
mecanismo pode estar relacionado com a secreccedilatildeo de proteiacutenas pelos neutroacutefilos
(ROBINSON et al 2003) De fato jaacute foi demonstrado que o neutroacutefilo secreta
elastase a qual estaacute associada com um aumento nas secreccedilotildees relacionadas com a
expressatildeo do gene MUC5 (SHAO e NADEL 2005) e metaplasia de ceacutelulas
caliciformes (VOYNOW et al 2004)
A expressatildeo anormal de neutroacutefilos e de moleacuteculas de adesatildeo em indiviacuteduos
com asma e doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC) foi demonstrada por
GABRIJELCIC et al (2003) Aleacutem do aumento no nuacutemero de neutroacutefilos tambeacutem
foram observados diferentes padrotildees de ativaccedilatildeo e niacuteveis aumentados de elastase
29
neutrofiacutelica e IL-8 Estes uacuteltimos bem como a expressatildeo do gene MUC5 estatildeo
associados a um aumento no estresse oxidativo pulmonar (DROST et al 2005
SHAO e NADEL 2005)
A associaccedilatildeo entre a severidade da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas e o estresse
oxidativo em cavalos com ORVA foi relatada por KIRSCHVINK et al (2008) os
quais relacionaram a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas ao aumento da glutationa oxidada
do aacutecido uacuterico e de isoprostano (8-iso-PGF2α) no LBA
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO
Estresse oxidativo eacute o termo utilizado para descrever os danos causados
quando as espeacutecies reativas do oxigecircnio (ROS) superam a capacidade de defesa
antioxidante do indiviacuteduo (WOOD et al 2003)
Entretanto tanto as ROS como as espeacutecies reativas do nitrogecircnio (RNS)
ocorrendo em concentraccedilotildees pequenas a moderadas apresentam importante papel
na fisiologia celular incluindo a defesa contra invasores e atuando em diversas vias
de sinalizaccedilatildeo celular e na induccedilatildeo da resposta mitogecircnica O estresse oxidativo
propriamente dito ocorre quando o sistema redox sofre desequiliacutebrio pela produccedilatildeo
aumentada de ROS eou RNS ou produccedilatildeo reduzida de antioxidantes (VALKO et al
2007)
Os pulmotildees encontram-se sujeitos ao estresse oxidativo pois estatildeo
diretamente expostos a quantidades muito elevadas de oxigecircnio o que torna
imperativo que este oacutergatildeo possua um arsenal para a defesa contra possiacuteveis
ataques oxidativos Portanto os pulmotildees satildeo providos de um desenvolvido sistema
de defesa endoacutegeno constituiacutedo de agentes chamados antioxidantes Os
antioxidantes ajudam os pulmotildees a se livrarem dos efeitos de uma variedade de
oxidantes provenientes do oxigecircnio (ROS) como o acircnion superoacutexido radical
hidroxila peroacutexido de hidrogecircnio e do nitrogecircnio (RNS) como o oacutexido niacutetrico (NO)
peroxinitrito e nitritos endoacutegenos e do ambiente Os principais sistemas
antioxidantes natildeo enzimaacuteticos dos pulmotildees satildeo a glutationa a vitamina C a
vitamina E o beta-caroteno e o aacutecido uacuterico enquanto os antioxidantes enzimaacuteticos
satildeo as superoacutexido dismutases a catalase e as peroxidases (RAHMAN et al 2006)
(FIGURA 4)
30
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE O2- AcircNION SUPEROacuteXIDO NO OacuteXIDO NIacuteTRICO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO ONOO- PEROXINITRITO FE2+ IacuteON FERROSO GPX GLUTATIONA PEROXIDASE FONTE RAHMAN et al (2006)
O estresse oxidativo pode resultar em muitos prejuiacutezos agraves funccedilotildees das vias
aeacutereas incluindo a contraccedilatildeo da musculatura lisa das vias aeacutereas a induccedilatildeo de
hiperresponsividade das vias aeacutereas a hipersecreccedilatildeo de muco danos ao epiteacutelio
respiratoacuterio e aumento da permeabilidade capilar (WOOD et al 2003)
A fisiopatologia da asma e da DPOC caracteriza-se por inflamaccedilatildeo crocircnica
localizada e estresse oxidativo O estresse oxidativo ocorre pelo aumento de
agentes oxidantes que satildeo inalados bem como por grandes quantidades de ROS
liberadas das ceacutelulas inflamatoacuterias Niacuteveis aumentados de ROS aumentam a
resposta inflamatoacuteria diretamente ou via formaccedilatildeo de produtos da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica levando a um aumento na severidade da doenccedila (KIRKHAM e RAHMAN
2006)
A peroxidaccedilatildeo dos lipiacutedios da membrana celular leva a geraccedilatildeo de
isoprostanos (FIGURA 5) um composto bioativo semelhante agraves prostaglandinas Os
isoprostanos satildeo produzidos independentemente das enzimas ciclooxigenases via
peroxidaccedilatildeo do aacutecido aracdocircnico catalizada por ROS apresentando potente efeito
31
constritor na musculatura lisa respiratoacuteria hiperresponsividade e exsudaccedilatildeo de
plasma nas vias aeacutereas (WOOD et al 2003)
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA ASMA IL INTERLEUCINA TH2 CEacuteLULAS T-HELPER TIPO 2 ROS ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO O2
- AcircNION SUPEROacuteXIDO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO NADPH NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO REDUZIDA NADP NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO SOD SUPEROacuteXIDO DISMUTASE EPO PEROXIDASE EOSINOFIacuteLICA MPO MIELOPEROXIDASE NF FATOR DE TRANSCRICcedilAtildeO NUCLEAR FONTE WOOD et al (2003)
O oacutexido niacutetrico (NO) sintetizado enzimaticamente pela oxidaccedilatildeo do
aminoaacutecido L-arginina para L-citrulina apresenta diversas funccedilotildees fisioloacutegicas nas
vias aeacutereas como o relaxamento da musculatura lisa a regulaccedilatildeo da responsividade
e da permeabilidade das vias aeacutereas e na defesa contra invasores Contudo em
altas concentraccedilotildees o NO apresenta diversos efeitos proacute inflamatoacuterios participando
da infiltraccedilatildeo de ceacutelulas inflamatoacuterias e apresentando efeitos citotoacutexicos sobre
32
diversas ceacutelulas tal como a ceacutelula do epiteacutelio respiratoacuterio especialmente por
interagir com o acircnion superoacutexido formando o peroxinitrito (REDINGTON 2006)
As ceacutelulas inflamatoacuterias recrutadas agraves vias aeacutereas do indiviacuteduo asmaacutetico
apresentam excepcional capacidade de produccedilatildeo de oxidantes Eosinoacutefilos
neutroacutefilos e macroacutefagos bem como ceacutelulas do epiteacutelio respiratoacuterio podem gerar
oxidantes Inicialmente ocorre a formaccedilatildeo de acircnion superoacutexido no complexo
dependente de NADPH oxidase na membrana celular no sistema xantina oxidase
citosoacutelico e na cadeia respiratoacuteria mitocondrial (FIGURA 6) (CARAMORI e PAPI
2004) A seguir a interaccedilatildeo do acircnion superoacutexido com outros oxidantes e o ataque
oxidativo ao tecido pulmonar leva agrave peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e danos ao tecido pulmonar
(MILLS e HIGGINS 1997 KIRKHAM e RAHMAN 2006)
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS FONTE CARAMORI E PAPI (2004)
O estudo do estresse oxidativo na asma se utiliza de modelos que podem
envolver os murinos (MUEHLMANN et al 2009) ou mesmo os cavalos jaacute que estes
naturalmente desenvolvem a ORVA doenccedila respiratoacuteria com diversas similaridades
com a asma humana (DEATON 2006)
33
Nos cavalos com ORVA os marcadores de estresse oxidativo estatildeo
aumentados e diretamente relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e infiltrado
inflamatoacuterio neutrofiacutelico (KIRSCHVINK et al 2008) ao aumento da produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por neutroacutefilos sanguiacuteneos apoacutes a exposiccedilatildeo agrave poeira orgacircnica
ambiental (MARR et al 1997) e ao aumento da secreccedilatildeo de muco apresentando
tambeacutem concentraccedilotildees reduzidas de aacutecido ascoacuterbico no fluido do epiteacutelio respiratoacuterio
(DEATON 2006)
O exerciacutecio fiacutesico por sua vez tambeacutem pode causar estresse oxidativo nas
vias aeacutereas em atletas humanos e em cavalos pela geraccedilatildeo de ROS e RNS (MILLS
e HIGGINS 1997 ART e LEKEUX 2005 KIRSCHVINK et al 2008)
Os cavalos de corrida apresentam a habilidade de aumentar o consumo de
oxigecircnio em 60 vezes durante o esforccedilo maacuteximo o que representa um fator de risco
ao estresse oxidativo nesses animais (ART e LEKEUX 2005)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica eacute o marcador de dano oxidativo poacutes exerciacutecio mais
estudado (DEATON e MARLIN 2003) Em atletas humanos houve aumento da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes a realizaccedilatildeo de ultramaratona (MASTALOUDIS et al
2004) mas o treinamento produziu efeitos beneacuteficos e reduccedilatildeo dos marcadores de
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes um periacuteodo de treinamento (MIYAZAKI et al 2001
BALOG et al 2006) Em cavalos o exerciacutecio submaacuteximo induziu um aumento nos
hidroperoacutexidos lipiacutedicos plasmaacuteticos dentro de 5 minutos apoacutes o teacutermino (DEATON e
MARLIN 2003)
As ROS e seus produtos como os peroacutexidos lipiacutedicos podem diretamente
danificar o tecido pulmonar e causar um incremento da pressatildeo vascular pulmonar
pela liberaccedilatildeo aumentada de mediadores inflamatoacuterios vasoconstrictores (pex
PAF) interferindo na atividade do NO como vasodilatador podendo assim contribuir
na patogecircnese da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) nos cavalos
atletas (MILLS e HIGGINS 1997)
34
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE)
A HPIE eacute caracterizada por hipertensatildeo pulmonar edema nas regiotildees de
troca gasosa ruptura dos capilares pulmonares e a presenccedila de sangue nas vias
aeacutereas (ERICKSON e POOLE 2007) sendo extremamente comum em cavalos de
corrida (PEREZ-MORENO et al 2009)
Tem-se relatado que a HPIE ocorre essencialmente em todos os cavalos
PSI de corrida em treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007) mas
tambeacutem constitui um problema em outras raccedilas de cavalos que realizam exerciacutecio
intenso como os trotadores e os quarto de milha e em cavalos realizando exerciacutecio
de menor intensidade como os cavalos de salto e traccedilatildeo (LAPOINTE et al 1994
ERICKSON e POOLE 2007 VICINO 2007)
O comprometimento ao rendimento desportivo causado pela HPIE natildeo havia
sido comprovado ateacute o estudo de HINCHCLIFF et al (2005a) quando demonstraram
que cavalos de corrida com HPIE grau 1 apresentaram 4 vezes mais possibilidades
de vencer em relaccedilatildeo a graduaccedilotildees mais elevadas de hemorragia
Cavalos PSI de corrida estatildeo sob maior risco de apresentar HPIE porque
apresentam pressatildeo capilar pulmonar mais elevada que cavalos de outras raccedilas e
atividades durante o esforccedilo maacuteximo (HACKETT et al 2003)
Adicionalmente a criaccedilatildeo seletiva de cavalos de corrida visando que sejam
cada vez mais capazes de atingir altas velocidades associado a consumo bastante
alto de oxigecircnio resultou em deacutebito cardiacuteaco substancial (WEST e MATHIEU-
COSTELLO 1994) e barreira alveacuteolo-capilar (BAC) bastante fina (WEST e
MATHIEU-COSTELLO 1999) A espessura meacutedia em micrometros do interstiacutecio da
BAC eacute 0175 plusmn 0010 em coelhos 0318 plusmn 0081 em catildees e 0390 plusmn 002 em
cavalos evidenciando que proporcionalmente a BAC dos cavalos eacute mais fina que a
de outras espeacutecies (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1999) Portanto haacute um dilema
envolvendo a evoluccedilatildeo da BAC dos cavalos Por um lado a necessidade de ser
extremamente fina para uma troca gasosa eficiente enquanto de outro a
necessidade de ser resistente o suficiente para suportar o estresse extremamente
alto na parede dos capilares pulmonares quando a pressatildeo capilar se eleva durante
o exerciacutecio (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
A pressatildeo hidrostaacutetica maacutexima nos capilares pulmonares humanos durante o
exerciacutecio supera 30 mmHg Nos cavalos PSI de corrida a pressatildeo capilar ultrapassa
35
100 mmHg aproximando-se da forccedila necessaacuteria para ocorrer a ruptura do colaacutegeno
que suporta a parede capilar na BAC (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
Quando o estresse na parede capilar se eleva demasiadamente ocorrem
alteraccedilotildees ultra-estruturais na BAC uma condiccedilatildeo conhecida como falecircncia por
estresse descrita em atletas de elite humanos e em cavalos (WEST 2000)
BIRKS et al (1997) demonstraram a falecircncia por estresse e consequumlente
ruptura dos capilares pulmonares em cavalos exercitando a altas velocidades
havendo maior risco de ocorrecircncia da HPIE quando encontraram-se sob importante
aumento da pressatildeo arterial pulmonar (FIGURA 7)
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) A ULTRAESTRUTURA CAPILAR NORMAL B RUPTURA DO ENDOTEacuteLIO CAPILAR (SETAS) COM ERITROacuteCITOS ADJACENTES (ASTERISCO) NOTA-SE TAMBEacuteM ERITROacuteCITOS NO ESPACcedilO ALVEOLAR (PONTAS DE SETAS) C ERITROacuteCITO NO INTERSTIacuteCIO (ASTERISCO) D RUPTURA DO EPITEacuteLIO ALVEOLAR (SETAS) A ALVEacuteOLO C CAPILAR BAR 2 microm FONTE BIRKS et al (1997)
36
Portanto a falecircncia por estresse dos capilares pulmonares eacute a teoria aceita
para a ocorrecircncia da HPIE sendo causada pela elevada pressatildeo transmural nos
capilares pulmonares resultado do aumento da pressatildeo arterial pulmonar somada agrave
pressatildeo pleural inspiratoacuteria negativa (WEST 2000) (FIGURA 8)
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) TTMP TENSAtildeO CIRCUNFERENCIAL OU EM ARCO CAUSADA PELA PRESSAtildeO TRANSMURAL CAPILAR TEL Eacute A TENSAtildeO LONGITUDINAL NOS COMPONENTES DA PAREDE ALVEOLAR ASSOCIADA COM A INFLACcedilAtildeO PULMONAR PARTE DESTA Eacute TRASMITIDA Agrave BAC TST Eacute A TENSAtildeO DE SUPERFIacuteCIE DA CAMADA SUPERFICIAL ALVEOLAR ESTA APARENTEMENTE EXERCE UMA FORCcedilA DE ACcedilAtildeO INTERNA PARA SUPORTAR O CAPILAR QUANDO ESTE INTUMESCE PARA DENTRO DO ESPACcedilO ALVEOLAR A ALTAS PRESSOtildeES TRANSMURAL CAPILARES PALV PRESSAtildeO ALVEOLAR PCAP PRESSAtildeO CAPILAR FONTE WEST (2000)
Diversos estudos estiveram envolvidos em avaliar a participaccedilatildeo do NO no
aumento da pressatildeo arterial pulmonar no cavalo durante o exerciacutecio e na
fisiopatologia da HPIE Inicialmente evidenciou-se que cavalos realizando exerciacutecio
intenso apresentam hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE) (CHRISTLEY
et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 DEMPSEY e WAGNER 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) o que resulta na inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO abolindo o
relaxamento vascular dependente do endoteacutelio (MILLS e HIGGINS 1997)
Portanto acreditou-se que a reduccedilatildeo da produccedilatildeo do NO durante o exerciacutecio
intenso poderia contribuir para a alta incidecircncia de HPIE nos cavalos de corrida
Contudo a administraccedilatildeo do antagonista da oacutexido niacutetrico sintase (NOS) N-nitro-L-
arginina metil ester (L-NAME) mostrou que o NO endoacutegeno resulta numa maior
37
extraccedilatildeo de O2 no repouso e no exerciacutecio submaacuteximo mas natildeo causou alteraccedilatildeo no
exerciacutecio intenso (MANOHAR e GOETZ 1998 MANOHAR et al 2006) A
administraccedilatildeo de L-NAME por KINDIG et al (2000) resultou em agravamento da
HPIE nos cinco animais estudados contudo natildeo observou-se aumento da pressatildeo
arterial pulmonar
MANOHAR e GOETZ (1999) avaliaram os efeitos da infusatildeo intravenosa de
nitroglicerina em cavalos realizando exerciacutecio e natildeo observaram alteraccedilotildees sobre a
incidecircncia ou severidade da HPIE
Adicionalmente KINDIG et al (2001) estudaram os efeitos do exerciacutecio na
pressatildeo arterial pulmonar e na HPIE em cavalos inalando NO Comparados aos
controles o grupo que inalou o NO apresentou uma pequena mas consistente
reduccedilatildeo na pressatildeo arterial pulmonar maacutexima mas com um significativo aumento da
HPIE nesses animais avaliado pelo aumento na contagem do nuacutemero de eritroacutecitos
no LBA Os autores entenderam que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete em
parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou como agravou a HPIE
Portanto em face aos achados relacionados agrave participaccedilatildeo do NO e da NOS
no cavalo em exerciacutecio maacuteximo e na HPIE satildeo necessaacuterias outras investigaccedilotildees a
respeito dos efeitos da inibiccedilatildeo da NOS e da produccedilatildeo do NO na circulaccedilatildeo
pulmonar e na HPIE (KINDIG et al 2000)
Apesar da maior atenccedilatildeo aos efeitos da HPIE e da pressatildeo arterial pulmonar
em cavalos realizando exerciacutecios intensos a HPIE tambeacutem passou a ser
demonstrada em cavalos envolvidos em atividades de menor intensidade sugerindo
que outros mecanismos podem estar envolvidos na fisiopatologia (EPP et al 2006)
VICINO (2007) demonstrou a ocorrecircncia de HPIE em cavalos de salto sendo
que cavalos que participaram de provas na altura entre 130 m ndash 150 m
apresentaram maior incidecircncia que aqueles que saltaram provas entre 100 m ndash 120
m
Neste contexto a associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar jaacute foi
demonstrada anteriormente (McKANE et al 1993 SAacuteNCHEZ et al 2005) Em
concordacircncia o estudo epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) evidenciou
38
uma significativa associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos puro
sangue inglecircs (PSI) jovens durante treinamento para corrida
O processo de hemorragia pulmonar pode culminar em irritaccedilatildeo e inflamaccedilatildeo
das vias aeacutereas o que exacerbaria a doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
(ERICKSON e POOLE 2007) WEST e MATHIEU-COSTELLO (1999) sugerem que
alteraccedilotildees na BAC ativariam vias proacute inflamatoacuterias nas vias aeacutereas com a
participaccedilatildeo de LTB4 Possivelmente a membrana basal alveolar exposta apoacutes a
ruptura ativaria macroacutefagos alveolares sendo que estes satildeo ricos em LTB4
DERKSEN et al (2009) sugeriram uma hipoacutetese para a ocorrecircncia da HPIE
(FIGURA 9) onde a ocorrecircncia das altas pressotildees vasculares pulmonares levaria a
alteraccedilotildees venulares culminando na ruptura capilar sangramento inflamaccedilatildeo e
hemossiderose agravando o quadro da HPIE
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO DERSKEN et al (2009)
Contudo mediadores bem como os mecanismos inflamatoacuterios que estatildeo
envolvidos na fisiopatologia da HPIE ainda precisam ser esclarecidos
O diagnoacutestico da HPIE pode ser feito pela evidecircncia de sangue na traqueacuteia
visiacutevel atraveacutes de exame endoscoacutepico (HINCHCLIFF et al 2005b ERICKSON e
POOLE 2007) pela contagem de eritroacutecitos no LBA (MEYER et al 1998) ou pela
39
presenccedila de hemossideroacutefagos (macroacutefagos contendo hemossiderina ou eritroacutecitos)
no AT (EPPINGER 1990 MICHELOTTO JUacuteNIOR et al 2007) eou no LBA
(DOUCET e VIEL 2002 SAacuteNCHEZ et al 2005 BIAVA et al 2006) realizado uma
hora apoacutes o exerciacutecio A presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA eacute considerada a
forma mais sensiacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993)
Em resumo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas acompanhada de
hiperresponsividade e hipersecreccedilatildeo de muco denominada doenccedila inflamatoacuteria das
vias aeacutereas (DIVA) bem como a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) satildeo causas de enormes perdas econocircmicas e de queda de rendimento
desportivo interrupccedilatildeo nos treinamentos e de encerramento de campanha em
cavalos de corrida Apesar disso a maioria dos estudos sobre as doenccedilas
inflamatoacuterias das vias aeacutereas dos cavalos satildeo direcionados para a ORVA e a
fisiopatologia da DIVA ainda estaacute pouco esclarecida bem como os mecanismos
inflamatoacuterios da HPIE ainda precisam ser mais bem estudados
Tendo-se em vista estes aspectos a hipoacutetese levantada no presente estudo
foi de que o desafio ambiental e o exerciacutecio fiacutesico estejam acompanhados de
estresse oxidativo alterando o quadro inflamatoacuterio possivelmente por alterar a
produccedilatildeo de PAF no pulmatildeo com consequumlente alteraccedilatildeo da funcionalidade celular
e que a hemorragia pulmonar pode exercer influecircncia sobre essa situaccedilatildeo As
ceacutelulas estudadas foram os macroacutefagos alveolares os quais podem apresentar um
papel central na regulaccedilatildeo deste processo
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVOS GERAIS
Verificar alteraccedilotildees em paracircmetros cliacutenicos e inflamatoacuterios pulmonares em
cavalos puro sangue inglecircs (PSI) de corrida jovem submetidos ao desafio ambiental
e ao treinamento fiacutesico
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Avaliar os seguintes paracircmetros cliacutenicos e laboratoriais
- Avaliaccedilatildeo cliacutenica
- Avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas
- Avaliaccedilatildeo citoloacutegica das vias aeacutereas atraveacutes das teacutecnicas de aspirado
traqueal (AT) e de lavado broncoalveolar (LBA)
- Avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas
e a produccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos e nitritos no LBA
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por macroacutefagos alveolares
bem como a capacidade fagocitaacuteria e de adesatildeo
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por neutroacutefilos do sangue
perifeacuterico bem como a capacidade fagocitaacuteria
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 REAGENTES E SEDATIVOS
O BN52021 (Gingkolide B) foi obtido da Biomol (Plymouth Meeting PA USA)
Fura-2 AM (cat num F-0888) PAF (β-Acetyl-γ-O-hexadecyl-L-α-
phosphatidylcholine P-4904) foram obtidos da Sigma (St Louis MO USA) A
coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacuteticoreg) foi obtida da Laborclin (Pinhais PR Brasil) e
a acepromazina da Univet (Satildeo Paulo SP Brasil) A xylazina e o butorphanol foram
obtidos do laboratoacuterio Fort Dodge (Satildeo Paulo SP Brasil) Todos os demais
reagentes foram comprados da Sigma (St Louis MO USA)
32 ANIMAIS
Foram utilizados equinos machos adultos jovens (potros) da raccedila puro sangue
inglecircs (PSI) de cinco diferentes criatoacuterios (haras) da regiatildeo metropolitana de Curitiba
estado do Paranaacute (Haras Cifra e Haras dos Girassoacuteis em Piraquara Haras
Palmerini e Haras Belmont em Satildeo Joseacute dos Pinhais e Haras Santa Rita da Serra
em Tijucas do Sul e potros de quatro diferentes cocheiras no Jockey Club do
Paranaacute (Av Viacutector Ferreira do Amaral 2291 Tarumatilde Curitiba PR)
Inicialmente os potros foram divididos em trecircs grupos O primeiro grupo foi
denominado grupo condiccedilotildees naturais (CN n=45) compreendendo os potros dos
haras vivendo soltos em piquetes dia e noite alimentando-se de gramiacuteneas e
leguminosas da pastagem mais complemento peletizado fornecido no campo A
meacutedia de idade dos animais deste grupo foi de 145 plusmn 04 meses O segundo grupo
foi denominado grupo desafio ambiental (DA n=45) constituiacutedo por potros
estabulados por 30 dias com o propoacutesito de preparaacute-los para o iniacutecio de treinamento
Estes animais eram mantidos em grupos de 15 a 20 potros sendo que permaneciam
em baias individuais com dimensotildees de 35m x 35m x 35m em meacutedia em cama de
serragem e alimentados duas vezes ao dia com aveia mais raccedilatildeo peletizada e feno
de gramiacutenea e de alfafa A meacutedia de idade dos potros do grupo DA foi de 217 plusmn 29
meses O terceiro grupo foi denominado de grupo exerciacutecio (EX n=34) onde foram
incluiacutedos potros ineacuteditos (satildeo considerados ineacuteditos animais que ainda natildeo correram
42
em hipoacutedromos oficiais) mas que estavam em treinamento para corrida haacute
aproximadamente cinco meses e mantidos nas mesmas condiccedilotildees de estabulaccedilatildeo e
alimentaccedilatildeo que os potros do grupo DA Estes animais foram acompanhados
durante o periacuteodo de treinamento sendo que a avaliaccedilatildeo cliacutenica endoscoacutepica e a
colheita de LBA ocorreu 24 horas apoacutes seu primeiro exerciacutecio intenso (15 ms ndash 16
ms) em 800m ndash 1000m de distacircncia na pista de areia do Jockey Club do Paranaacute A
meacutedia de idade dos potros do grupo EX foi de 270 plusmn 03 meses
A obtenccedilatildeo de dados para o presente trabalho de pesquisa ocorreu durante
uma sequumlecircncia de experimentos independentes durante um periacuteodo de 18 meses
Durante este periacuteodo grupos de potros foram acompanhados ateacute se encontrarem
nas condiccedilotildees estabelecidas para cada grupo quando entatildeo foram avaliados As
amostras do grupo CN foram obtidas de oito diferentes experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois durante o inverno trecircs durante a primavera e um no outono
As amostras do grupo DA foram provenientes de seis experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois no inverno e dois no outono e para o grupo EX os resultados
advieram de amostras obtidas durante o veratildeo em cinco ocasiotildees e durante a
primavera em quatro totalizando nove experimentos independentes para este grupo
Os resultados apresentados para cada uma das anaacutelises provecircm de pelo menos
trecircs experimentos independentes
Todos os animais estudados eram pertencentes a estabelecimentos com
programa de desverminaccedilatildeo bimensal bem como foram todos vacinados
regularmente contra Influenza Equina e Herpes Viacuterus Equino tipos 1 e 4 A
alimentaccedilatildeo utilizada nos estabelecimentos que cederam os potros para o estudo
era similar bem como a anaacutelise da alimentaccedilatildeo utilizada para os potros dos trecircs
grupos natildeo diferiu no que se refere a constituintes essenciais que poderiam
influenciar nas avaliaccedilotildees realizadas no presente trabalho Os criteacuterios de inclusatildeo
para os potros dos trecircs grupos foram os estabelecidos e jaacute descritos previamente
nas caracteriacutesticas de cada grupo e a exclusatildeo do estudo ocorreu quando da
histoacuteria de doenccedila recente ou diferenccedilas em manejo
As comparaccedilotildees intergrupos foram feitas entre os grupos CN e DA (diferenccedila
ambiental) e entre os grupos DA e EX (diferenccedila no regime de exerciacutecio)
Na segunda etapa do trabalho dedicada ao estudo da hemorragia pulmonar
induzida pelo exerciacutecio (HPIE) avaliou-se somente os potros do grupo EX agora
com n=37 Este grupo foi dividido em subgrupos sendo o subgrupo HPIE pos (n=23
43
constituiacutedo por potros com qualquer percentual de hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo
citoloacutegica do LBA) e subgrupo HPIE neg (n=14 constituiacutedo por potros sem
hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA) Nesta etapa as comparaccedilotildees
realizadas foram entre os subgrupos HPIE pos e HPIE neg
33 ASPECTOS EacuteTICOS
Este trabalho de pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Experimentaccedilatildeo Animal (CEEA) do setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR sob o
nuacutemero de registro 168 e pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso de Animais (CEUA) da
Pontifiacutecia Universidade Catoacutelica do Paranaacute sob o nuacutemero de registro 129 e estaacute de
acordo com o Guiding Principles in the Care and Use of Animals
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA
Preacutevio agrave colheita de material procedeu-se a avaliaccedilatildeo cliacutenica de cada potro
iniciada pela histoacuteria incluindo possiacuteveis ocorrecircncias meacutedicas relevantes agrave sauacutede do
sistema respiratoacuterio manejo alimentaccedilatildeo desverminaccedilatildeo e vacinaccedilatildeo Na histoacuteria
incluiu-se tambeacutem a informaccedilatildeo sobre a ocorrecircncia de tosse espontacircnea quando em
piquetes na baia no momento da alimentaccedilatildeo ou durante o treinamento O exame
fiacutesico incluiu a observaccedilatildeo da presenccedila de secreccedilatildeo nasal estiacutemulo da tosse
palpaccedilatildeo de linfonodos submandibulares e retrofaringeanos auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e
auscultaccedilatildeo traqueal e pulmonar (McGORUM e DIXON 2007)
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS
A avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas foi realizada previamente a
realizaccedilatildeo do LBA com o animal tranquumlilizado atraveacutes da administraccedilatildeo de
acepromazina (acepran 1 Univet) (003 mgkg IM) e apoacutes 30 minutos seguindo-
se a administraccedilatildeo de xilazina (sedazine Fort Dodge) (03-05 mgkg IV) mais
butorfanol (torbugesic Fort Dodge) (005 mgkg IV) (HOFFMAN 1999 HEWSON e
VIEL 2002) Utilizou-se um fibroscoacutepio flexiacutevel Pentax de 170 cm de comprimento e
128 mm de diacircmetro para a avaliaccedilatildeo das vias aeacutereas superiores e inferiores ateacute a
bifurcaccedilatildeo da traqueacuteia
44
A presenccedila de foliacuteculos linfoacuteides na faringe foi graduada segundo RAKER e
BOWLES (1978) adotando-se a graduaccedilatildeo de I a IV (QUADRO 1) e graus III e IV
foram considerados como faringite
A movimentaccedilatildeo das cartilagens aritenoacuteides foi graduada de I a IV segundo
RACKESTRAW et al (1991) (QUADRO 2) e graus III e IV foram considerados como
anormais
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Faringe com poucos foliacuteculos claros na parede dorsal
Grau II Presenccedila de numerosos pequenos foliacuteculos juntamente a
hiperemia cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau III Presenccedila de grandes grupos de foliacuteculos hiperecircmicos
cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau IV Presenccedila de foliacuteculos grandes edematosos e hiperecircmicos
por toda a mucosa faringeana
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA FARINGE FONTE RAKER E BOWLES (1978)
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Movimentaccedilatildeo sincrocircnica e abduccedilatildeo completa das
cartilagens aritenoacuteides
Grau II Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo com abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) conseguida com a degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
Grau III Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo e a abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) natildeo eacute conseguida na degluticcedilatildeo nem na
oclusatildeo nasal
Grau IV
(Hemiplegia
Laringeana)
Cartilagem aritenoacuteide esquerda posicionada
medialmente na glote e natildeo apresenta movimento
quando da degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE I A IV FONTE RACKESTRAW et al (1991)
45
Especial interesse foi dado agrave presenccedila de muco no lume traqueal e sua
quantificaccedilatildeo atraveacutes de graduaccedilatildeo de 0 a 5 conforme GERBER et al (2004)
(FIGURA 10)
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME ENDOSCOacutePICO FONTE GERBER et al 2004
Quando da observaccedilatildeo de muco traqueal este foi aspirado atraveacutes de tubo
de silicone introduzido pelo canal de trabalho do endoscoacutepio sendo imediatamente
transferido para uma lacircmina de microscopia e deixado para secar ao ar As lacircminas
foram coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico Laborclin Pinhais PR
Brasil) e 500 ceacutelulas foram contadas em aumento de 1000X (HODGSON e
HODGSON 2003)
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o aspirado traqueal (AT)
contendo lt10 de linfoacutecitos lt1 de eosinoacutefilos e lt20 de neutroacutefilos (ROBINSON
2003 HODGSON e HODGSON 2007)
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)
Para a realizaccedilatildeo do LBA foi utilizado um cateter flexiacutevel de silicone
especiacutefico para a obtenccedilatildeo de LBA de equinos marca Cook (V-PBAL-300 Cook Vet
Products Hamburg Alemanha) de 300 cm de comprimento e 8 mm de diacircmetro
Este foi introduzido agraves cegas via nasotraqueal preferencialmente do lado direito ateacute
se alojar em um brocircnquio quando o cuff na extremidade distal era inflado com 5-10
mL de ar Utilizou-se 300 mL de soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada (PBS) esteacuteril e
com heparina soacutedica (5 UImL de PBS) preacute-aquecidos a 37oC (HOFFMAN 1999
PICKLES et al 2002abc MORI et al 2003 RIIHIMAumlKI et al 2008b) O PBS era
infundido em aliacutequotas de 120 mL (HEWSON e VIEL 2002) aspirando-se
46
gentilmente apoacutes cada aliacutequota e dispensando-se o LBA recolhido em frascos
plaacutesticos esteacutereis mantidos em isopor com gelo Este procedimento foi repetido ateacute
que o volume de 300 mL era totalmente empregado O material recolhido foi mantido
refrigerado em isopor com gelo ateacute a chegada ao Laboratoacuterio de Metabolismo
Celular no Departamento de Fisiologia do Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR
para o processamento em menos de 3 horas apoacutes a colheita (PICKLES et al 2002c
VIEL e HEWSON 2003)
No laboratoacuterio o LBA era centrifugado a 340g (1300 rpm) por seis minutos a
40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA) e o pellet obtido foi
ressuspendido em 2 mL de PBS para a contagem do nuacutemero total de ceacutelulas
nucleadas (NTCN)
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA
A contagem do NTCN foi realizada usando-se a cacircmara de Neubauer Uma
aliacutequota da suspensatildeo de ceacutelulas foi diluiacuteda 110 em PBS em um frasco de
centrifugaccedilatildeo de 15 mL de fundo cocircnico (Eppendorf) Desta uma aliacutequota de 50 microL
foi misturada a 50 microL do corante vital Azul de Tripan para a contagem das ceacutelulas
vivas A partir do nuacutemero de ceacutelulas vivas por mililitro da suspensatildeo de ceacutelulas a
concentraccedilatildeo da suspensatildeo de ceacutelulas foi ajustada para 5 x 106 ceacutelulasmL para as
avaliaccedilotildees da atividade de macroacutefago alveolar (fagocitose produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e adesatildeo ndash ver toacutepicos 315 316
317 e 318)
Para a avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA lacircminas para microscopia
foram preparadas a partir de 10 μL da suspensatildeo de ceacutelulas distribuiacutedos de forma
circular sobre a lacircmina secadas ao ar e coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski
(Panoacutetico Laborclin Pinhais PR Brasil) (HEWSON e VIEL 2002) e 500 ceacutelulas
foram contadas em aumento de 1000X
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o LBA contendo em meacutedia
60 de macroacutefagos 35 de linfoacutecitos lt5 de neutroacutefilos lt2 de mastoacutecitos lt1
de eosinoacutefilos (ROBINSON 2003 MAZAN e HOFFMAN 2003 RICHARD et al
2009)
47
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957)
Uma porccedilatildeo correspondente a 90 mg de pellet de ceacutelulas do LBA foi
ressuspendido em um solvente extrator (metanolclorofoacutermio12 volvol) na
quantidade de 18 mL e sonicado (6 ciclos de 4 segundos) Os tubos foram
deixados em gelo por 20 minutos
Na etapa seguinte mais metanol foi adicionado (324 microL o caacutelculo eacute a
quantidade de sovente extrator x 0180 resultando na quantidade de metanol em
mililitros) para reduzir a densidade do liacutequido e possibilitar assim a decantaccedilatildeo do
material particulado insoluacutevel no meio Apoacutes o material foi centrifugado a 5000g por
10 minutos a 40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
O sobrenadante foi transferido para tubos de vidro e clorofoacutermio foi
adicionado (648 microL ou seja o dobro da quantidade de metanol utilizada
anteriormente)
Na sequumlecircncia o extrato foi lavado uma vez com 19 mL de aacutegua ultra pura O
sistema bifaacutesico formado foi submetido a uma intensa agitaccedilatildeo ateacute natildeo serem mais
distinguiacuteveis as duas fases (forma-se momentaneamente uma emulsatildeo) Nesta
etapa substacircncias com maior afinidade agrave aacutegua do que ao solvente orgacircnico satildeo
solubilizadas no meio aquoso e portanto se separam dos lipiacutedios
Apoacutes a reconstituiccedilatildeo espontacircnea do sistema bifaacutesico o sobrenadante
(aquoso) foi removido com o auxiacutelio de uma micropipeta cuidando-se para natildeo
retirar o que se encontrava abaixo
Em seguida foi adicionado o FSP (CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM NaCl 497
mM clorofoacutermio 30 metanol 490 aacutegua ultra pura 480) lentamente (para
evitar a formaccedilatildeo de emulsatildeo) e de maneira que as paredes do tubo fossem lavadas
com esta soluccedilatildeo Apoacutes a remoccedilatildeo do sobrenadante este procedimento foi repetido
mais duas vezes
A mistura de clorofoacutermio e metanol na qual estavam dissolvidos os lipiacutedios
foi evaporada em banho-maria a 370C sob corrente de nitrogecircnio O extrato lipiacutedico
seco foi armazenado a -800C em atmosfera de nitrogecircnio Para a determinaccedilatildeo da
bioatividade de PAF (toacutepico 310) esses extratos foram solubilizados em 100 microL de
DMSO sob agitaccedilatildeo intensa
48
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS
O sangue de cavalo foi colhido em bolsas de transfusatildeo (CPDA-1 JP
Induacutestria Farmacecircutica SA Satildeo Paulo Brasil) atraveacutes de punccedilatildeo venosa jugular
O sangue foi diluiacutedo 11 (vv) em PBS e 40 mL do sangue diluiacutedo foram
adicionados a tubos para centriacutefuga esteacutereis (tubos Falcon de 50 mL) sobre 8 mL de
Ficoll Paque Plus e centrifugado (400g por 40 minutos a 40C) para o isolamento das
ceacutelulas PMN por gradiente
Apoacutes a centrifugaccedilatildeo a camada superior composta por plasma soluccedilatildeo de
Ficoll e ceacutelulas mononucleares foi descartada A camada inferior composta
principalmente por PMNs e eritroacutecitos foi dividida em duas aliacutequotas iguais as quais
foram separadas em dois tubos para centriacutefuga A cada aliacutequota foi adicionada
soluccedilatildeo hemoliacutetica (NH4Cl 077 tris[hydroxymethyl]aminomethane 021 pH 74
soluccedilatildeo aquosa) para completar 50 mL e incubadas por 20 minutos a 370C em
estufa
A seguir a suspensatildeo celular livre dos eritroacutecitos foi centrifugada (400g 6
min 4oC) O sobrenadante foi descartado e o pellet de ceacutelulas (basicamente PMNs)
foi ressuspendido em 5 mL de PBS contendo glucose 5 mM A densidade de ceacutelulas
foi determinada em cacircmara de Neubauer e ajustada para 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL
A viabilidade celular foi determinada atraveacutes do corante vital Azul de Tripan e
resultou aproximadamente 95 A percentagem de neutroacutefilos na suspensatildeo de
PMNs foi superior a 90 determinada pela coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico
Laborclin Pinhais PR Brasil)
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE Ca++ EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE et al 2001)
Agrave suspensatildeo de PMNs (toacutepico 39) na densidade de 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL foi adicionado FURA-2 AM (Sigma soluccedilatildeo estoque 1 nM em DMSO)
para concentraccedilatildeo final de 1 microM A suspensatildeo foi incubada em ambiente escuro a
37oC por 45 minutos
Nesta etapa os PMNs incorporaram o FURA-2 AM um indicador fluorescente
de caacutelcio Quando o FURA-2 AM estaacute ligado ao Ca++ haacute reduccedilatildeo da eficiecircncia de
49
excitaccedilatildeo a 380 nm e aumento da eficiecircncia de excitaccedilatildeo a 340 nm observados no
comprimento de onda de emissatildeo de 510 nm Com isso eacute possiacutevel quantificar a
concentraccedilatildeo de Ca++ intracelular nas ceacutelulas carregadas com FURA-2 AM atraveacutes
da relaccedilatildeo da intensidade de emissatildeo a 510 nm entre os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo de 340 nm e de 380 nm (relaccedilatildeo 340380 nm)
Apoacutes a incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram lavadas duas vezes com soluccedilatildeo de
Ringer (NaCl 1425 mM KCl 40 mM CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM 50 mM 4-(2-
hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid glicose 50 mM pH 74 soluccedilatildeo
aquosa) para a remoccedilatildeo do FURA-2 AM que natildeo foi incorporado agraves ceacutelulas
As ceacutelulas entatildeo foram ressuspendidas em soluccedilatildeo de Ringer para uma
concentraccedilatildeo final de 225 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL Esta foi a preparaccedilatildeo utilizada
na leitura de fluorescecircncia
A suspensatildeo de ceacutelulas foi mantida em gelo ateacute a sua utilizaccedilatildeo Aliacutequotas de
2 mL eram previamente incubadas em banho-maria por 4 minutos a 37oC no escuro
(tubo envolto em papel alumiacutenio) previamente a serem transferidas para uma cubeta
para a leitura da fluorescecircncia em espectrofluoriacutemetro acoplado a um
microcomputador (RF5301PC Shimadzu Kyoto Japatildeo) controlado pelo software
Super Ion Probe (Shimadzu Kyoto Japatildeo) Durante esta incubaccedilatildeo as ceacutelulas que
seriam utilizadas como controle negativo para PAF foram tratadas com antagonista
de receptor de PAF BN52021 (Biomol soluccedilatildeo 10 mM em DMSO)
Foi utilizada excitaccedilatildeo dual com comprimentos de onda 340 nm e 380 nm
(janela de leitura de 2 segundos) com emissatildeo registrada a 510 nm A temperatura
foi mantida em 37oC pelo sistema termostatisado do aparelho A leitura da
fluorescecircncia consistiu primeiramente da obtenccedilatildeo de uma linha de base nos
primeiros 50 segundos Apoacutes esta leitura inicial foram adicionados 10 microL do extrato
lipiacutedico (toacutepico 38) agrave suspensatildeo de ceacutelulas seguindo-se a agitaccedilatildeo (por 3
segundos) com uma barra magneacutetica presente dentro da cubeta A leitura foi feita
entatildeo por mais 100 segundos
Para cada amostra foram realizados os procedimentos descritos na presenccedila
e na ausecircncia de BN52021 A resposta maacutexima obtida pelo tratamento da
suspensatildeo de PMNs com extrato lipiacutedico na presenccedila de BN52021 foi subtraiacuteda da
resposta maacutexima obtida na ausecircncia deste antagonista O resultado desta subtraccedilatildeo
foi utilizado como indicador semiquantitativo da bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico e os resultados foram expressos como relaccedilatildeo 340380 nm
50
Antes de analisar as amostras de extrato lipiacutedico para a bioatividade de PAF
a cada experimento a suspensatildeo de PMNs tratada com FURA-2 AM foi testada com
PAF (1-0-palmitil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina soluccedilatildeo estoque de 3 mM em
DMSO da Sigma) nas concentraccedilotildees de 1 10 e 100 nM e com 100 nM na presenccedila
de 150 microM de BN52021 (concentraccedilatildeo suficiente para antagonizar 102 nM de PAF)
A resposta dos PMNs de equinos aos padrotildees de PAF eacute mostrada na FIGURA 11
sendo representativa dos dados obtidos em todos os experimentos
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO REGISTRADA A 510 nm () SUSPENSAtildeO DE PMN () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 1 nM (diams) SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 10 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 100 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + BN52021 150 microM + PAF 100 nM A EMISSAtildeO BASAL DAS CEacuteLULAS PMN FOI REGISTRADA POR 50 SEGUNDOS PREVIAMENTE Agrave ADICcedilAtildeO DE PAF
Os PMNs do sangue de equinos foram utilizados no presente estudo como
uma ferramenta para a avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF (pelo influxo de Ca++ nos
PMNs induzido por PAF) Para a determinaccedilatildeo da viabilidade desta ferramenta
estudou-se a resposta dos PMNs do sangue de equino a diferentes concentraccedilotildees
de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na ausecircncia do antagonista de
PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose de neutroacutefilos e a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio por neutroacutefilos pelas teacutecnicas descritas
51
abaixo (ver toacutepicos 315 ndash fagocitose de macroacutefago alveolar 316 ndash produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar e 317 ndash produccedilatildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio por macroacutefago alveolar) sendo que para cada ensaio foram realizadas
quatro repeticcedilotildees Igualmente estudou-se a resposta do macroacutefago alveolar a
diferentes concentraccedilotildees de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na
ausecircncia do antagonista de PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose e a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem realizando-se quatro
repeticcedilotildees para cada anaacutelise
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)
Em microplaca de 96 poccedilos 250microL de reagente de Bradford (100mg de
Coomassie Blue 50 mL de etanol 95 + 100 mL de aacutecido fosfoacuterico 85 completar
com aacutegua ultra pura para 1000 mL) foi adicionado a 10 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA) Nesta etapa o
corante Comassie eacute complexado por proteiacutenas presentes na amostra o que muda a
sua cor
Apoacutes 5 minutos em temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada a
595 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-Rad
Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) A concentraccedilatildeo de proteiacutenas foi determinada
interpolando-se os valores de absorbacircncia numa curva padratildeo resultante de
concentraccedilotildees conhecidas de albumina seacuterica bovina (Sigma) Os resultados foram
expressos como miligramas de proteiacutenas por mililitro de LBA
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR e MARLETTA 1985)
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA foi utilizada como indicador da produccedilatildeo de
oacutexido niacutetrico na regiatildeo broncoalveolar
Em micro placa de 96 poccedilos adicionou-se 100 microL de reagente de Griess
(mistura de cloreto de naftiletilenodiamina a 005 e por sulfanilamida a 05 em
meio aacutecido proporcionado por H3PO4 a 25) a 100 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA)
52
A sulfanilamida (um derivado de anilina) reage com o aacutecido nitroso e apoacutes
rearranjos intramoleculares forma o iacuteon diazocircnio Apoacutes o iacuteon diazocircnio reage com a
naftiletilenodiamina (um derivado de naftilamina) para formar pigmento roacuteseo
Depois de 5 minutos na temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada
a 550 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-
Rad Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) Os resultados foram expressos como
absorbacircncia a 550 nm
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO
LBA (NOUROOZ-ZADEH et al 1994)
Utilizou-se uma aliacutequota de suspensatildeo de ceacutelulas de LBA na densidade de
15 x 106 ceacutelulasmL de LBA Esta foi ultrasonicada (6 ciclos de 4 segundos) em 1mL
de metanol sendo centrifugada em seguida a 5000g por 5 minutos a 40C
(Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
Uma aliacutequota de 50 microL de sobrenadante foi armazenada para posterior
mensuraccedilatildeo da concentraccedilatildeo total de proteiacutenas
Para cada amostra aliacutequotas de 90 microL foram depositadas em seis frascos
para centriacutefuga (de 15 mL Eppendorf) foi agitada no voacutertex e incubada por 30
minutos a temperatura ambiente A trecircs desses tubos foram adicionados 10 microL de
soluccedilatildeo metanoacutelica de trifenilfosfina (TPP Sigma) 10 mM para ocorrer a reduccedilatildeo
seletiva de hidroperoacutexidos (os grupamentos hidroperoacutexido especificamente os
presentes em lipiacutedios satildeo convertidos a grupamentos hidroxila pela trifenilfosfina)
As amostras contidas nos trecircs tubos restantes receberam apenas 10 microL de metanol
Todos os tubos foram agitados vigorosamente e entatildeo incubados em temperatura
ambiente por 30 minutos
Apoacutes adicionou-se a todos os tubos 900 microL de reagente de FOX2 Este
reagente deve ser preparado no momento do uso consistindo de xilenol laranja 100
microM hidroxitolueno butilado (BHT) 400 mM aacutecido sulfuacuterico 25 mM e sulfato ferroso
de amocircnio 250 microM em metanol 90 (vv em aacutegua) Apoacutes agitaccedilatildeo o meio
reacional foi incubado por mais 30 minutos a temperatura ambiente
Nesta etapa os caacutetions ferrosos (Fe2+) do reativo de FOX2 satildeo oxidados por
hidroperoacutexidos presentes na amostra (tanto pelos hidroperoacutexidos lipiacutedicos quanto
por outros tipos de hidroperoacutexidos presentes na amostra) Como todos os
53
hidroperoacutexidos lipiacutedicos das amostras tratadas com TPP foram reduzidos a
produccedilatildeo de Fe3+ seraacute menor nestas do que nas amostras natildeo tratadas com TPP
O Fe3+ formado eacute entatildeo quelado pelo xilenol laranja o que faz a cor deste
indicador passar de laranja a azul-puacuterpura (passa a absorver luz em 560 nm)
Passado o tempo de incubaccedilatildeo a absorbacircncia foi mensurada a 560 nm
utilizando-se um espectrofotocircmetro (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil
Satildeo Paulo)
Subtraiu-se entatildeo o valor da absorbacircncia das amostras tratadas com TPP
(sem hidroperoacutexidos lipiacutedicos) do valor da absorbacircncia das amostras sem TPP O
valor obtido nessa subtraccedilatildeo (referente apenas agrave quantidade de ferro oxidado por
hidroperoacutexidos lipiacutedicos) foi utilizado na foacutermula da curva padratildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio obtida com soluccedilotildees padratildeo de diferentes concentraccedilotildees (1000 500
250 125 62 31 e 16 microM) submetidas aos mesmos procedimentos descritos
acima para a dosagem de hidroperoacutexidos (com exceccedilatildeo ao tratamento com TPP) O
resultado obtido foi referente agrave concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos
Dividiu-se o valor da concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos pela
concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais do extrato metanoacutelico Os resultados foram
expressos como nmolesmg de proteiacutenas
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984)
Utilizou-se 300 microL de uma suspensatildeo de ceacutelulas de LBA em PBS na
densidade de 5 x 106 ceacutelulasmL que foram centrifugados (10600g por 20min a
4oC) para remoccedilatildeo de partiacuteculas
Apoacutes foi colocada em banho com gelo Uma aliacutequota de 10 microL desse extrato
de ceacutelulas foi adicionada a 990 microL de meio reativo (soluccedilatildeo aquosa de H2O2 20 mM
tris[hidroximetil] aminometano 005M e EDTA 025 mM pH 74)
Imediatamente utilizando-se um espectrofotocircmetro acoplado a um
microcomputador (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil Satildeo Paulo)
monitorou-se a absorbacircncia a 220 nm por 90 segundos a 370C com intervalos de 2
segundos entre leituras consecutivas
A degradaccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio pela catalase causa uma diminuiccedilatildeo
gradual na absorbacircncia do meio reativo a 220 nm a qual indica a atividade da
catalase no extrato de ceacutelulas Os valores de atividade da catalase foram corrigidos
54
pela concentraccedilatildeo de proteiacutenas do extrato de ceacutelulas (realizado conforme descrito
no toacutepico 311) e foram expressos como micromoles de H2O2minmg proteiacutenas
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA et al 1998)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL (= 5 x 105
ceacutelulaspoccedilo) e os macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A
suspensatildeo de ceacutelulas na densidade descrita foi obtida durante o processamento do
LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS e foram adicionados
20microL de zymosan corado com vermelho neutro (67 mgmL) mais 100 microL de PBS
sendo deixados a temperatura ambiente por 30 minutos
Em seguida depois de descartado o sobrenadante as ceacutelulas foram fixadas
com soluccedilatildeo de Baker (4 formaldeiacutedo 2 cloreto de soacutedio 1 acetato de caacutelcio
soluccedilatildeo aquosa) por 30 minutos
Apoacutes os poccedilos foram lavados com PBS para que o zymosan corado com
vermelho neutro natildeo fagocitado por macroacutefagos alveolares fosse retirado
Em seguida o corante vermelho neutro foi solubilizado em cada poccedilo com
200microL de soluccedilatildeo aacutecido-aacutelcool (aacutecido aceacutetico 1 etanol 50 soluccedilatildeo aquosa) e
deixado por 30 minutos
Apoacutes este periacuteodo a absorbacircncia foi mensurada a 550 nm Os resultados
foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 -
Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA et al 1998)
Estimou-se a produccedilatildeo de acircnions pela da formaccedilatildeo de formazan produto da
reduccedilatildeo do NBT (nitroblue tetrazolium) pelo acircnion superoacutexido Avaliou-se a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA
(phorbol myristate acetate) O PMA estimula o complexo NADPH oxidase na
membrana dos fagoacutecitos a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
55
mimetizando o resultado da fagocitose de um microorganismo (DEKKER et al
2000)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para a retirada das
ceacutelulas natildeo aderentes Em seguida adicionou-se a cada poccedilo 100 microL de PBS com
NBT 02 ou com NBT 02 mais PMA 11microM sempre em triplicatas para cada
potro
Apoacutes a incubaccedilatildeo por 1 hora a 370C e em ambiente escuro (a placa deve
estar envolta em papel alumiacutenio) a placa foi centrifugada (800g por 5 minutos a
40C) Em seguida o sobrenadante foi descartado e 100 microL de PBS foram
adicionados a cada poccedilo e a placa foi novamente centrifugada
Apoacutes o sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram fixadas com metanol
por 10 minutos Em seguida a placa passou por nova centrifugaccedilatildeo o sobrenadante
foi descartado e a placa foi deixada secar ao ar em estufa
Em seguida a placa foi lavada duas vezes com metanol 50 e o formazan
(produto da reaccedilatildeo entre o NBT e o acircnion superoacutexido) foi solubilizado atraveacutes da
incubaccedilatildeo por 30 minutos com 120 microL soluccedilatildeo aquosa de hidroacutexido de potaacutessio 2M
e 140 microL de dimetilsulfoacutexido por poccedilo
A absorbacircncia foi lida a 595 nm e os resultados foram corrigidos pela adesatildeo
de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago
Alveolar)
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK e MIZEL 1981)
Mensurou-se a produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) por macroacutefago
alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA atraveacutes da oxidaccedilatildeo do vermelho
fenol pela peroxidase onde esta enzima utiliza nesta reaccedilatildeo o H2O2 O composto
oxidado absorve luz em pH baacutesico com maacutexima intensidade em 550 nm
56
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS observando-se a retirada
de grumos presentes nos poccedilos Em seguida 100 microL de soluccedilatildeo de vermelho fenol
(PRS phenol red solution 140 mM NaCl 10 mM fosfato de potaacutessio 55 mM
dextrose 056 mM vermelho fenol 19 UmL de HRPO horse radish peroxidase pH
70 soluccedilatildeo aquosa) ou soluccedilatildeo de vermelho fenol + PMA 110nM foram adicionados
a cada poccedilo em triplicatas e deixados incubar por 1 hora a 370C no escuro
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo adicionou-se 10 microL de NaOH 1N para
interromper a reaccedilatildeo alcalinizar o meio e permitir a absorbacircncia da soluccedilatildeo que foi
lida a 595 nm apoacutes 30 minutos
Os resultados foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada
potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN e GORDON 1987)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para se selecionar as
ceacutelulas aderentes que a seguir foram fixadas com metanol 50 por 10 minutos
Apoacutes este periacuteodo o sobrenadante foi descartado e 100 microL de corante de
Giemsa a 02 foram adicionados a cada poccedilo e deixados por 40 minutos em
temperatura ambiente
Os poccedilos foram novamente lavados com PBS por duas vezes observando-se
a retirada de grumos nos poccedilos e 200 microL de metanol 50 foram adicionados
Apoacutes 30 minutos a absorbacircncia da suspensatildeo foi lida a 550 nm
A adesatildeo resultou menor no grupo DA (n=17) em comparaccedilatildeo ao grupo CN
(n=36) (P=0010) sendo que o grupo EX (n=26) apresentou adesatildeo maior que o
grupo DA (P=0001) (FIGURA 12) indicando diferenccedilas na capacidade de adesatildeo
em placa acriacutelica possivelmente devido a diferenccedilas no estado funcional das ceacutelulas
57
de cada grupo Por esta razatildeo utilizou-se o ensaio de adesatildeo de macroacutefago
alveolar realizado concomitantemente aos ensaios de funccedilatildeo de macroacutefago
(fagocitose e produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) a cada
experimento realizado durante o estudo A correccedilatildeo dos valores obtidos de
macroacutefago em funccedilatildeo da adesatildeo foi feito atraveacutes da divisatildeo da meacutedia final obtida
para o ensaio de funccedilatildeo de macroacutefago dividido pela meacutedia obtida no ensaio de
adesatildeo para cada potro avaliado e a cada experimento realizado
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 (ROSEN e GORDON 1987) aP=0010 vs CN e bP=0001 vs DA
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
A normalidade na distribuiccedilatildeo dos dados foi avaliada pelo teste de D‟Agostino
e Pearson Valores considerados outliers pelo teste de Grubb foram excluiacutedos das
anaacutelises Para os dados que apresentaram distribuiccedilatildeo normal dos valores
(distribuiccedilatildeo Gaussiana) (contagem percentual de linfoacutecitos concentraccedilatildeo total de
proteiacutenas do LBA bioatividade de PAF catalase hidroperoacutexidos nitritos fagocitose
de macroacutefago alveolar produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio
por macroacutefago alveolar) foi utilizado o teste t natildeo pareado Os dados com
distribuiccedilatildeo natildeo Gaussiana dos valores (contagens percentuais de neutroacutefilos de
58
eosinoacutefilos e de macroacutefagos multinucleados contagem do NTCN do LBA e adesatildeo
de macroacutefago alveolar) foram analisados pelo teste de Mann-Whitney A
comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos de funccedilatildeo de macroacutefago alveolar
estimulado e natildeo estimulado por PMA foi feita por teste t de Student natildeo pareado
Os achados cliacutenicos e endoscoacutepicos foram analisados por meio de teste de Mann-
Whitney A correlaccedilatildeo entre o percentual de um mesmo tipo celular no aspirado
traqueal e no lavado broncoalveolar foi analisada atraveacutes do teste de Spearman
Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas utilizando-se o programa GraphPad
Prism versatildeo 500 para Windows (GraphPad Software San Diego CA EUA) e os
valores apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia (SEM) Valores de
Plt005 foram considerados como significativos
4 RESULTADOS
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica
Nenhum dos potros dos grupos CN e DA apresentou tosse segundo o
histoacuterico obtido Contudo oito potros (235) do grupo EX apresentaram tosse
espontacircnea na cocheira ou durante o treinamento o que resultou em diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0002) (TABELA 1)
A presenccedila de corrimento nasal seroso (coriza) observada nos trecircs grupos
estudados estaacute demonstrada na TABELA 1 Natildeo houve diferenccedila significativa entre
os grupos apesar de o percentual de potros com coriza no grupo DA ter reduzido
em relaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
Os linfonodos submandibulares eou retrofaringeanos estiveram aumentados
em 382 222 e 382 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
natildeo havendo diferenccedila entre os grupos (TABELA 1)
A auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e traqueal resultou normal em todos os potros
avaliados dos trecircs grupos estudados Contudo sons pulmonares crepitantes foram
audiacuteveis em 28 156 e 115 dos potros avaliados nos grupos CN DA e EX
respectivamente havendo um aumento do percentual de crepitaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo DA em ralaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DE CORRIDA
Grupos Tosse
Espontacircnea
Corrimento
Nasal
Linfonodos
Auscultaccedilatildeo
Pulmonar
CN 034
(0)
1534
(441)
1334
(382)
136
(28)
DA 045
(0)
1145
(244)
1045
(222)
745
(156)
EX 834
(235)a
1534
(441)
1334
(382)
326
(115)
aP=0002 vs DA
60
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas
No iniacutecio da avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas primeiramente
considerando os foliacuteculos linfoacuteides faringeanos ou hiperplasia folicular linfoacuteide (HFL)
a distribuiccedilatildeo das diferentes graduaccedilotildees pode ser vista na TABELA 2
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGEANOS OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS DE I A IV SEGUNDO RAKER E BOLES (1978)
Grupos HFL I HFL II HFL III HFL IV
CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)
DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)
EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)
Considerando as graduaccedilotildees de HFL III e IV como faringite esta
anormalidade foi observada em 546 286 e 539 dos potros dos grupos CN
DA e EX respectivamente Houve uma significativa reduccedilatildeo no percentual meacutedio de
observaccedilotildees de faringite para o grupo DA em comparaccedilatildeo ao grupo CN (P=0024)
enquanto no grupo EX o percentual de faringites foi significativamente maior em
relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0039)
Com relaccedilatildeo ao aspecto morfoloacutegico da epiglote um potro do grupo DA e um
potro do grupo EX evidenciaram epiglote com aspecto fraacutegil sendo que os demais
potros foram normais
Com relaccedilatildeo agrave avaliaccedilatildeo funcional da laringe todos os potros foram normais
apresentando graduaccedilotildees I ou II (TABELA 3)
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE ACORDO COM RAKESTRAW et al (1991)
Grupos NLP I NLP II NLP III NLP IV
CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)
DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)
EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)
61
A quantidade de secreccedilatildeo observada no lume traqueal estaacute demonstrada na
TABELA 4
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 SEGUNDO GERBER et al (2004)
Grupos 0 1 2 3 4 5
CN 233
(61)
933
(273)
933
(273)
1133
(332)
233
(61)
033
(0)
DA 742
(167)
1242
(286)
1242
(286)
742
(167)
342
(70)
142
(24)
EX 327
(111)
727
(259)
727
(259)
627
(223)
427
(148)
027
(0)
Quantidade de secreccedilatildeo traqueal acima de grau 2 considerada passiacutevel de
prejuiacutezo agrave troca gasosa e ao rendimento desportivo foi observada em 666 547
e 630 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT)
Os achados de anaacutelise citoloacutegica diferencial para os principais tipos celulares
do AT para os trecircs grupos de potros estudados estatildeo demonstrados na TABELA 5
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN (n=20) DA (n=19) E EX (n=15) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
Grupos Mac Lin Neut Eos Mast Calic Multi Epit Sid
CN 429plusmn63 75
plusmn19
76
plusmn29
12
plusmn07
002
plusmn02
05
plusmn02
02
plusmn01
201
plusmn56
0
DA 591
plusmn41
141
plusmn24
85
plusmn23
11
plusmn05
0 01
plusmn01
11
plusmn02a
161
plusmn48
0
EX 593
plusmn42
134
plusmn23
171
plusmn49
09
plusmn03
0 05
plusmn03
08
plusmn03
71
plusmn32
09
plusmn04
Mac macroacutefago alveolar Lin linfoacutecitos Neut neutroacutefilos Eos eosinoacutefilos Mast mastoacutecitos Calic ceacutelulas caliciformes Multi macroacutefagos multinucleados Epit ceacutelulas epiteliais Sid hemossideroacutefagos aPlt0001 vs CN
62
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA)
As quantidades de LBA recuperado estiveram entre 54 e 59 do volume
infundido para os grupos CN (n=16) DA (n=23) e EX (n=16)
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
A contagem do NTCN e a contagem diferencial de ceacutelulas do LBA estatildeo
demonstradas na TABELA 6
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN (n=45) DA (n=40) E EX (n=34) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
CTCN
(ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Macroacutef
Multi
Hemosid
CN 395
plusmn 38
673
plusmn 17
294
plusmn 15
23
plusmn 04
05
plusmn 03
005
plusmn 004
04
plusmn 01
0
DA 343
plusmn 24
698
plusmn 14
281
plusmn 13
09
plusmn 02
12
plusmn 01
002
plusmn 002
11
plusmn 01d
0
EX 456
plusmn 28a
676
plusmn 18
229
plusmn 15
54
plusmn 11b
15
plusmn 07c
02
plusmn 01
13
plusmn 02
22
plusmn 06
CTCN = contagem total de ceacutelulas nucleadas Macroacutef = macroacutefagos Linfoacutec = linfoacutecitos Neutroacutef = neutroacutefilos Eosino = eosinoacutefilos Masto = mastoacutecitos Macroacutef Multi = macroacutefagos multinucleados Hemosid = hemossideroacutefagos aPlt001 vs DA bPlt0001 vs DA cPlt005 vs DA dPlt0001 vs CN
Hemossideroacutefagos foram observados somente no LBA dos potros do grupo
EX mais especificamente em 23 (622) deles representando 22 do total de
ceacutelulas A quantidade observada de hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 da
contagem citoloacutegica diferencial do LBA
A correlaccedilatildeo entre as contagens percentuais de um mesmo tipo celular no AT
e no LBA foi analisada para os potros do grupo CN (n=11) DA (n=18) e EX (n=12)
que tiveram material colhido para as duas teacutecnicas citoloacutegicas natildeo tendo sido
63
encontrada correlaccedilatildeo entre ambas as teacutecnicas de avaliaccedilatildeo citoloacutegica para
nenhuma das ceacutelulas
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF
A resposta dos neutroacutefilos do sangue de equino frente ao PMA e frente ao
PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na ausecircncia e na presenccedila
do antagonista de PAF BN52021 estaacute demonstrado nas FIGURAS 13 a 15
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF aP=0028 vs controle bPlt0001 vs sem BN52021 cP=0028 vs PMA
64
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0007) 10nM (aP=0003) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA e PAF 1 e 10nM
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF EM TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA ePlt0001 vs PAF 1nM e fPlt0001 vs PAF 1nM e 10nM
65
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF
Tambeacutem se estudou a resposta dos macroacutefagos alveolares de equino frente
ao PMA e frente ao PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 demonstrado nas
FIGURAs 16 a 18
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0003) 10nM (aPlt0001) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0010 vs PMA dPlt0001 vs PAF 01nM e PAF 1nM
66
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0037) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA e PAF 01nM dPlt0001 vs PAF 1nM
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 01nM e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA dPlt001 vs PAF 1nM e 10nM
67
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos
foi mensurada pelo influxo de Ca++ em ceacutelulas PMN de equinos (FIGURA 19)
Registrou-se uma baixa relaccedilatildeo 340380 nm para os grupos CN (0005 plusmn 0002
relaccedilatildeo 340380 nm) e DA (0006 plusmn 0002 relaccedilatildeo 340380 nm) representando um
baixo niacutevel de bioatividade de PAF no LBA dos potros avaliados nestes grupos
Contudo a bioatividade de PAF do grupo EX (0068 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm) foi
significativamente maior em comparaccedilatildeo ao grupo DA (P=0017) Um graacutefico
representativo da bioatividade de PAF em uma das amostras do grupo EX na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 pode ser visto na FIGURA
20
CN DA EX000
002
004
006
008
010 a
Re
laccedil
atildeo
34
03
80
nm
Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedicodas Ceacutelulas do LBA
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE AO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0017 vs DA
68
0 50 100
150
200
0
1
2
3
4
Tempo (segundos)
Bioatividade de PAFR
ela
ccedilatildeo
3403
80n
m
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm A AMOSTRA Eacute ADICIONADA Agrave SUSPENSAtildeO DE CEacuteLULAS PMN APOacuteS 50 SEGUNDOS DE LEITURA BASAL (SETA)
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi maior no grupo DA em relaccedilatildeo
ao grupo CN (014 plusmn 003 vs 003 plusmn 001 mg de proteiacutenasmL de LBA) (P=0001) O
grupo EX apresentou concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA (036 plusmn 006 mg de
proteiacutenasmL de LBA) significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001)
(FIGURA 21)
69
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0001 vs CN bPlt0001 vs DA
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos foi maior no LBA do grupo DA (019 plusmn 001
absorbacircncia 550 nm) em relaccedilatildeo ao grupo CN (014 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm)
(P=0011) O grupo EX apresentou uma reduccedilatildeo significativa na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA (008 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm) significativamente menor em
comparaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001) (FIGURA 22)
70
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0011 vs CN bPlt0001 vs DA
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (1047 plusmn 241 vs 66
plusmn 35 nmolesmg de proteiacutenas) (Plt0001) No grupo EX a concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos nas ceacutelulas do LBA apresentou reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo
DA (352 plusmn 84 vs 1047 plusmn 241 nmolesmg de proteiacutenas) (P=0007) (FIGURA 23)
71
Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos no LBA
CN DA EX0
50
100
150a
b
nm
ole
s
mg
de
pro
teiacuten
as
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX (n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO APRESENTADOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNA DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aPlt0001 vs CN bP=0007 vs DA
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA
No grupo EX a atividade da catalase nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol
H2O2minmg de proteiacutenas) (P=0002) natildeo havendo diferenccedila entre os grupos CN e
DA (FIGURA 24)
72
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO microMOL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOMINUTOMILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0002 vs DA
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
A fagocitose de macroacutefago alveolar foi significativamente maior no grupo DA
em comparaccedilatildeo ao grupo CN (223 plusmn 043 vs 072 plusmn 018 absorbacircncia 550
nmadesatildeo) (P=0002) Observou-se uma diminuiccedilatildeo na fagocitose no grupo EX em
relaccedilatildeo ao grupo DA (104 plusmn 027 vs 223 plusmn 043 absorbacircncia 550 nmadesatildeo)
(P=0006) (FIGURA 25)
73
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A FAGOCITOSE PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (FAGOCITOSEADESAtildeO) aP=0002 vs CN e bP=0006 vs DA
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar
A utilizaccedilatildeo de PMA aumentou significativamente a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido pelos macroacutefagos alveolares dos grupos DA (219 plusmn 053 vs 392 plusmn 062
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0049) e EX (060 plusmn 011 vs 090 plusmn 014
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0031) A produccedilatildeo basal de acircnion superoacutexido foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (219 plusmn 053 vs 025
plusmn 007 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo DA (060 plusmn 011 vs 219 plusmn 053 absorbacircncia 595
nmadesatildeo) (P=0001) A produccedilatildeo de acircnion superoacutexido estimulada por PMA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (392 plusmn 062 vs 046
plusmn 016 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
74
diminuiccedilatildeo na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido em comparaccedilatildeo ao grupo DA (090 plusmn
014 vs 392 plusmn 062 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) (FIGURA 26)
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0049 vs DA bP=0031 vs EX cPlt0001 vs CN dP=0001 vs DA ePlt0001 vs CNe fPlt0001 vs DAe
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
O PMA aumentou a produccedilatildeo de H2O2 pelos macroacutefagos alveolares nos
grupos CN (041 plusmn 008 vs 099 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0004) DA
(035 plusmn 005 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0002) e EX (010 plusmn
001 vs 034 plusmn 008 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) A produccedilatildeo basal de
H2O2 para o grupo EX foi significativamente menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (010 plusmn
001 vs 035 plusmn 005 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) Aleacutem disso a produccedilatildeo
75
de H2O2 estimulada por PMA diminuiu no grupo EX tendo sido significativamente
menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (034 plusmn 008 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia
595nmadesatildeo) (P=0006) (FIGURA 27)
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0004 vs CN bP=0002 vs DA cPlt0001 vs EX dPlt0001 vs DA eP=0006 vs DAe
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
Hemossideroacutefagos foram observados no LBA de 23 potros (622) sendo
que estes foram considerados no subgrupo HPIE pos A quantidade observada de
76
hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 A ausecircncia de hemossideroacutefagos foi
evidenciada em 14 potros (378) sendo que estes foram considerados para o
subgrupo HPIE neg
Dentre os potros avaliados 15 (405) deles (10 potros do subgrupo HPIE
pos e 5 potros do subgrupo HPIE neg) apresentaram mais de 5 de neutroacutefilos eou
mais de 1 de eosinoacutefilos na contagem diferencial de ceacutelulas indicando um perfil
citoloacutegico de LBA compatiacutevel com inflamaccedilatildeo pulmonar
Os valores do NTCN bem como da contagem diferencial de ceacutelulas para o
grupo EX e para os subgrupos estaacute demonstrado na TABELA 7
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX (n=37) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=23) E HPIE NEG (n=14)
CTCN (ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Siderof
Grupo EX
456 plusmn 28
676 plusmn 18
229 plusmn 15
47 plusmn 10
13 plusmn 06
02 plusmn 01
22 plusmn 35
HPIE pos
571
plusmn 78a
645
plusmn 22b
240 plusmn 20
56 plusmn 12
09 plusmn 07
02 plusmn 02
34 plusmn 37
HPIE neg
348 plusmn 38
725 plusmn 30
207 plusmn 25
35 plusmn 18
19 plusmn 11
03 plusmn 01
00
CTCN contagem total de ceacutelulas nucleadas Macrof macoacutefagos Linfoc linfoacutecitos Neutrof
neutroacutefilos Eosinof eosinoacutefilos Mastoc mastoacutecitos Siderof hemossideroacutefagos aP=0005
vs HPIE neg bP=0020 vs HPIE neg
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg
(018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm P=0042) (FIGURA 28)
77
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) e HPIE NEG (n=5) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO RELACcedilAtildeO 340380nm aP=0042 vs HPIE neg
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi significativamente maior no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (039 plusmn 008 vs 019 plusmn
004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) (FIGURA 29)
78
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=13) E HPIE NEG (n=12) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS POR MILILITRO DE LBA aP=0031 vs HPIE neg
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos resultou
significativamente reduzida em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (008 plusmn 003 vs
012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) (FIGURA 30)
79
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) E HPIE NEG (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 550 nm aP=0049 vs HPIE neg
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA dos potros do
subgrupo HPIE pos resultou significativamente maior que no subgrupo HPIE neg
(367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) (FIGURA 31)
80
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) E HPIE NEG (n=8) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS aP=0009 vs HPIE neg
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
Natildeo houve diferenccedila na fagocitose de macroacutefago alveolar entre os grupos
estudados
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-)
A produccedilatildeo basal de O2- por macroacutefagos alveolares resultou similar entre os
grupos estudados A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0047) mas natildeo no subgrupo HPIE pos
(FIGURA 32)
A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA foi significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (081 plusmn 011 vs 124 plusmn
015 absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0042) (FIGURA 32)
81
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) E HPIE NEG (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0047 vs HPIE neg bP=0042 vs HPIE neg e
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
A produccedilatildeo basal de H2O2 por macroacutefago alveolar foi similar entre os grupos
avaliados no presente estudo A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0002) mas natildeo no subgrupo HPIE
neg (FIGURA 33)
A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA resultou significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (025 plusmn 003 vs 067 plusmn 014
absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0001)
82
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) E HPIE NEG (n=6) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2 ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0002 vs HPIE neg bP=001 vs HPIE neg e
5 DISCUSSAtildeO
O estudo da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas de cavalos de corrida adultos jovens
em trecircs diferentes situaccedilotildees em seu ambiente natural foi possiacutevel devido agrave
utilizaccedilatildeo de um grande nuacutemero de animais Assim permitiu-se detectar diferenccedilas
entre os grupos mesmo havendo variaccedilotildees ambientais tais como estaccedilotildees do ano
condiccedilotildees climaacuteticas e diferenccedilas sutis em manejo Como os potros dos trecircs grupos
encontravam-se na mesma faixa etaacuteria de risco para as doenccedilas respiratoacuterias virais
e os experimentos foram realizados durante um mesmo periacuteodo as diferenccedilas entre
os grupos CN e DA foram consideradas como sendo devido ao ambiente e as
diferenccedilas entre os grupos DA e EX foram consideradas como sendo devido ao
treinamento
O grupo CN evidenciou um percentual de observaccedilotildees de faringite na
avaliaccedilatildeo endoscoacutepica (TABELA 2) maior que os 37 relatado por HOBO et al
(1995) em cavalos PSI de corrida de dois anos de idade Os potros deste grupo
foram mantidos integralmente em piquetes e nesta situaccedilatildeo a hiperplasia dos
foliacuteculos linfoacuteides da faringe em cavalos jovens pode ser uma resposta normal a
inalaccedilatildeo de antiacutegenos ambientais ou agentes infecciosos (HOLCOMBE e
DUCHARME 2007)
De fato as vias aeacutereas dos potros desse grupo deram mostra de estarem
sendo desafiadas pelo nuacutemero percentual de corrimento nasal linfonodos
aumentados e quantidades elevadas de secreccedilatildeo traqueal iguais aos demais
grupos (TABELAS 1 e 4) Possivelmente isso tambeacutem se deva a fatores climaacuteticos
pois no estudo de ROBINSON et al (2006) com cavalos de montaria de vaacuterias
idades aqueles que permaneceram fora dos estaacutebulos durante o inverno
apresentaram quantidades elevadas de muco traqueal No entanto diferentemente
do nosso estudo os cavalos avaliados por ROBINSON et al (2006) tiveram nuacutemero
percentual de neutroacutefilos aumentado na secreccedilatildeo traqueal enquanto os potros do
grupo CN resultaram em avaliaccedilatildeo citoloacutegica tanto de AT (TABELA 5) como de LBA
(TABELA 6) normais (ROBINSON 2003 HODGSON e HODGSON 2007)
evidenciando vias aeacutereas especialmente as vias aeacutereas inferiores saudaacuteveis
Com relaccedilatildeo ao desafio ambiental no presente estudo adotou-se um sistema
convencional de estabulaccedilatildeo pois estudos anteriores em modelos semelhantes ao
84
nosso jaacute demonstraram a presenccedila de altas concentraccedilotildees de endotoxinas
(BERNDT et al 2008) bem como de poeira e de aeroalergenos (WOODS et al
1993)
Contudo o desafio ambiental de 30 dias utilizado em nosso estudo resultou
em quadro comparaacutevel ao do grupo CN isento de processo inflamatoacuterio das vias
aeacutereas Possivelmente um periacuteodo maior de desafio pudesse causar um processo
inflamatoacuterio tal como foi demonstrado previamente por HOLCOMBE et al (2001)
onde potros da raccedila puro sangue aacuterabe que sofreram desafio ambiental de 90 dias
apresentaram aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no LBA Contudo no
estudo citado o material utilizado para a cama dos potros foi a palha que tambeacutem
representou um maior risco de desenvolvimento de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas dos
cavalos em outros estudos quando comparada a serragem utilizada na cama dos
potros do grupo DA (BURRELL et al 1996 VANDEPUT et al 1998 GERBER et
al 2000 KLEIBER et al 2005 DEWACHI et al 2006)
Entretanto ateacute o momento os efeitos dos fatores ambientais das cocheiras
nas vias aeacutereas foram relatados em sua maioria em cavalos apresentando ORVA e
natildeo em indiviacuteduos jovens e saudaacuteveis como os potros avaliados em nosso estudo
Nos animais com ORVA um curto periacuteodo de exposiccedilatildeo ambiental (6 a 48 horas)
em baia e recebendo alimentaccedilatildeo composta principalmente por feno causou
aumento da expressatildeo de algumas citocinas (pex IL-4 e IL-5) em alguns estudos
mas nenhuma alteraccedilatildeo em outros (GERBER et al 2000 AINSWORTH et al 2003
CORDEAU et al 2004 KLEIBER et al 2005) sendo que um longo tempo de
exposiccedilatildeo ambiental (variando de cinco semanas a trecircs meses) causou aumento da
expressatildeo de IFN-γ e IL-8 (AINSWORTH et al 2003) IL-9 (DEWACHI et al 2006)
IL-17 (DEBRUE et al 2005) e o desenvolvimento dos sinais cliacutenicos da ORVA
acompanhados de alteraccedilotildees na funccedilatildeo pulmonar (VANDEPUT et al 1998)
Contudo nos potros do grupo DA se evidenciou no AT (TABELA 5) e no LBA
(TABELA 6) um aumento significativo do nuacutemero percentual de macroacutefagos
multinucleados em comparaccedilatildeo ao grupo CN bem como nuacutemero percentual de
eosinoacutefilos acima do valor considerado limite para cavalos normais (ROBINSON
2003) sugerindo que houve uma resposta por parte do sistema de defesa nas vias
aeacutereas dos potros deste grupo
Os macroacutefagos multinucleados ou ceacutelulas gigantes multinucleadas satildeo
formados a partir da fusatildeo de dois ou mais macroacutefagos na resposta imune pulmonar
85
(ANDERSON et al 1999) representando especificamente uma resposta imune do
tipo Th2 com a participaccedilatildeo da IL-4 (HELMING e GORDON 2007) Em pessoas os
macroacutefagos multinucleados satildeo considerados como um achado indicativo de
reaccedilotildees inflamatoacuterias crocircnicas nas vias aeacutereas como a tuberculose por exemplo
(LEMAIRE et al 2006 HELMING e GORDON 2007) Em equinos satildeo escassos os
estudos envolvendo a citologia respiratoacuteria que descrevam o nuacutemero percentual
normal deste tipo celular De qualquer forma eacute relatado que pode ser observado em
pequeno nuacutemero em cavalos sem evidecircncias de doenccedila pulmonar sendo que uma
quantidade aumentada jaacute foi descrita associada agrave inflamaccedilatildeo crocircnica (DECONTO
1983 HODGSON e HODGSON 2007) Estas informaccedilotildees parecem natildeo corroborar
com o aumento no nuacutemero percentual de macroacutefagos multinucleados no grupo DA
em se tratando de potros jovens considerados saudaacuteveis o que demonstra a
necessidade de mais estudos para se entender o papel do macroacutefago multinucleado
no pulmatildeo saudaacutevel e na inflamaccedilatildeo pulmonar dos cavalos
Entretanto o nuacutemero percentual de eosinoacutefilos acima do limite normal no
LBA dos potros do grupo DA pode ser considerado como uma resposta ao
ambiente assim como eacute considerado em humanos (DENGUEZLI-BOUZGARROU et
al 2007) e jaacute relatado em cavalos (COUEumlTIL et al 2007)
O periacuteodo de treinamento por sua vez induziu inflamaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo EX O nuacutemero significativamente aumentado de potros com tosse
(TABELA 1) constituiu a evidecircncia cliacutenica sugerindo inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas nos
potros desse grupo Cavalos saudaacuteveis raramente tossem (ROBINSON 2007)
sendo a tosse um sinal cliacutenico comprovadamente associado agrave inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas (BURRELL et al 1996 McGROUM e DIXON 2007) CHRISTLEY et al
(2001) correlacionaram a tosse com a presenccedila de faringite sendo que tal
associaccedilatildeo tambeacutem foi observada no grupo EX (TABELAS 1 e 2) Adicionalmente
BEDENICE et al (2008) estudaram a relaccedilatildeo entre a tosse e a inflamaccedilatildeo pulmonar
e descreveram que os cavalos avaliados por apresentarem tosse tiveram contagens
percentuais de neutroacutefilos no LBA maiores que 5
No presente estudo um aumento no NTCN e nas contagens percentuais de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos do LBA (TABELA 6) confirmaram a presenccedila de inflamaccedilatildeo
pulmonar no grupo EX (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
COUEumlTIL et al 2007) A neutrofilia no LBA de cavalos de corrida jaacute foi
correlacionada a um baixo rendimento desportivo e constitui sinal chave para o
86
diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007) A eosinofilia no LBA de cavalos de
corrida por sua vez pode ser um achado transitoacuterio (VIEL e HEWSON 2003)
apesar de tambeacutem ter sido associada a um baixo rendimento desportivo aleacutem de
hiperresponsividade das vias aeacutereas em cavalos de corrida jovens (HARE e VIEL
1998) Portanto tais evidecircncias podem ser consideradas como um risco ao futuro
potencial atleacutetico dos potros do grupo EX
No presente estudo natildeo houve correlaccedilatildeo entre os achados citoloacutegicos de AT
e LBA para nenhum dos trecircs grupos estudados e esta falta de correlaccedilatildeo entre AT
e LBA jaacute foi relatada anteriormente Portanto entende-se que os epiteacutelios traqueal e
broncoalveolar respondem diferentemente aos agentes agressores sendo que a
avaliaccedilatildeo de cavalos com tosse ou diminuiccedilatildeo de rendimento desportivo deve ser
realizada por ambas as teacutecnicas associadas (MALIKIDES et al 2003 CHRISTLEY
RUSH 2007 HODGSON e HODGSON 2007)
A ligaccedilatildeo entre o exerciacutecio e a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas provavelmente
envolve diversos mediadores proacute-inflamatoacuterios que uma vez identificados poderatildeo
ser alvo para abordagens terapecircuticas com o objetivo de minimizar os efeitos
deleteacuterios da inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos PSI de corrida jovens Neste
contexto um dos mais potentes e versaacuteteis mediadores proacute inflamatoacuterios envolvidos
na inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas eacute o PAF (UHLIG et al 2005)
PAF eacute quimiotaacutetico para bem como produzido por eosinoacutefilos macroacutefagos e
neutroacutefilos em resposta a estresse fiacutesico ou quiacutemico apresentando muitos dos
criteacuterios essenciais de um mediador proacute inflamatoacuterio (OWEN et al 2005)
De fato estudos realizados in vitro demonstraram que o PAF pode induzir a
migraccedilatildeo de neutroacutefilos e monoacutecitos do cavalo (DAWSON et al 1988) Aleacutem disso
demonstrou-se a quimiotaxia de eosinoacutefilos e neutroacutefilos no trato respiratoacuterio de
murinos e humanos induzida por PAF (LEE et al 2002 ISHII et al 2004) Em
cavalos com ORVA a administraccedilatildeo intravenosa de PAF promoveu uma reduccedilatildeo de
leucoacutecitos no sangue perifeacuterico e apoacutes alguns minutos houve um aumento de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo seguido de uma deterioraccedilatildeo cliacutenica e da funccedilatildeo
respiratoacuteria (FAIRBAIRN et al 1996) Portanto apoiado nestes estudos e nos
resultados de aumento do NTCN e de neutrofilia e eosinofilia no LBA do grupo EX
(TABELA 6) eacute razoaacutevel assumir que o PAF possa contribuir para a induccedilatildeo da
inflamaccedilatildeo pulmonar observada nos potros PSI jovens em treinamento avaliados no
presente estudo
87
A inflamaccedilatildeo pulmonar tambeacutem estaacute associada a um aumento nas
concentraccedilotildees de proteiacutenas no LBA principalmente devido ao extravasamento de
plasma (TSANGARIS et al 2003) que pode ser resultado da accedilatildeo de vaacuterios
mediadores proacute inflamatoacuterios tal como o PAF
Um aumento da permeabilidade microvascular induzida pelo PAF resultando
em extravasamento de plasma e edema foi demonstrado previamente no estudo de
CLAVIJO et al (2001) Aleacutem disso WEST et al (1997) demonstraram o acuacutemulo de
um fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar de cavalos exercitados a velocidades
entre 13 ms e 16 ms No presente estudo o significativo aumento da concentraccedilatildeo
de proteiacutenas no LBA dos potros do grupo EX em comparaccedilatildeo ao grupo DA (FIGURA
21) confirma que a permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) estava
aumentada nos potros do grupo EX e o PAF pode estar envolvido neste mecanismo
Diferentemente o significativo aumento de proteiacutenas no LBA do grupo DA em
comparaccedilatildeo ao grupo CN deve envolver outros mecanismos inflamatoacuterios pois natildeo
houve biotavidade de PAF significativa no LBA destes dois grupos (FIGURA 19)
Contudo os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da disponibilidade de oacutexido niacutetrico (NO) (KIKUCHI et al
2008) Houve uma produccedilatildeo limitada de NO nas vias aeacutereas dos potros do grupo
EX esperada em cavalos realizando exerciacutecio moderado ou proacuteximo do maacuteximo
(MILLS e HIGGINS 1997) Isto pode ser explicado pela hipoxemia arterial induzida
pelo exerciacutecio (HAIE) descrita em atletas humanos (HOPKINS 2005) e em cavalos
exercitando a altas intensidades (MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
DEMPSEY e WAGNER 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005) A produccedilatildeo de NO requer
normoxia (GRIMMINGER et al 1995) sendo que a anoxia abole o relaxamento
vascular dependente do endoteacutelio e a hipoxemia degrada o NO (De MEY e
VANHOUTTE 1980) Adicionalmente ocorre uma inibiccedilatildeo do NO pela hemoglobina
sendo que esta inibiccedilatildeo eacute inversamente proporcional a saturaccedilatildeo de oxigecircnio
(IWAMOTO e MORIN 1993)
A inibiccedilatildeo da siacutentese de NO resultou no aumento da permeabilidade vascular
no estudo de KIKUCHI et al (2008) concordando com os nossos achados
referentes agrave bioatividade de PAF aumentada associada ao aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas e agrave diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de nitritos no LBA
do grupo EX
88
De fato no estudo de BRKOVIC e SIROIS (2007) o PAF e natildeo o NO foi
considerado o mediador proacute inflamatoacuterio e causador do aumento da permeabilidade
vascular enquanto o NO foi considerado como um co-fator para as atividades
inflamatoacuterias do PAF Na relaccedilatildeo entre PAF e NO na microcirculaccedilatildeo parece que
NO apresenta um efeito protetor atenuando as atividades inflamatoacuterias de PAF
tendo inclusive reduzido a formaccedilatildeo de PAF em vecircnulas mesenteacutericas em ratos
(NEVIN e BROADLEY 2002)
Contudo o NO tambeacutem tem papel preponderante na defesa das vias aeacutereas
(NEVIN e BROADLEY 2002 XU et al 2006) e o aumento na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA do grupo DA pode ser considerado uma resposta aos poluentes
ambientais existentes nas cocheira dos cavalos (WOODS et al 1993 BERNDT et
al 2008) Aleacutem disso o NO reage com o acircnion superoacutexido (O -2) para formar
peroxinitrito (ONOO-) um forte oxidante capaz de provocar lesatildeo no tecido pulmonar
resultando em peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (XU et al 2006)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi investigada no presente estudo atraveacutes da
concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA que resultou
aumentada no grupo DA em comparaccedilatildeo com o grupo CN (FIGURA 23) A
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi associada ao acuacutemulo de neutroacutefilos e produccedilatildeo de ROS por
esses nas vias aeacutereas de crianccedilas (BUSS et al 2000) e de pessoas com DPOC
(SANTUS et al 2005) Natildeo houve aumento de neutroacutefilos no LBA dos potros do
grupo DA mas os macroacutefagos alveolares dos potros deste grupo apresentaram
maior produccedilatildeo de ROS (FIGURAS 26 e 27) Isso pode ter contribuiacutedo para o
aumento da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA neste grupo como resultado da
modificaccedilatildeo da funcionalidade dos macroacutefagos alveolares induzida por fatores
ambientais como descrito em estudos em humanos (LUNDBORG et al 2007) e em
cavalos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento resultou em reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos lipiacutedicos no LBA em comparaccedilatildeo com o grupo DA No estudo de
MASTALOUDIS et al (2004) corredores de ultramaratona apresentaram aumento
da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica avaliada por marcadores do sangue destes atletas
Contudo outros relataram a reduccedilatildeo dos marcadores de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes
exerciacutecio intenso em corredores e esquiadores (URSO e CLARKSON 2003) em
indiviacuteduos treinados (BALOG et al 2006) em pessoas apoacutes 6 meses de
89
treinamento e tambeacutem apoacutes um programa de treinamento de 3 semanas (ALDRED
2007) e em pacientes com DPOC apoacutes programa de exerciacutecios (PINHO et al 2007)
Provavelmente essa diminuiccedilatildeo na peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA dos potros do
grupo EX deveu-se a mecanismos protetores pois o treinamento influencia de forma
positiva a capacidade antioxidante do organismo em atletas humanos (URSO e
CLARKSON 2003 PARK et al 2005 BALOG et al 2006 ALDRED 2007 PINHO
et al 2007) e em cavalos (KIRSCHVINK et al 2008)
URSO e CLARKSON (2003) relataram um aumento significativo da atividade
da catalase uma enzima antioxidante nos eritroacutecitos de atletas humanos apoacutes um
exerciacutecio de corrida de longa distacircncia corroborando com os nossos achados de
aumento significativo da atividade da catalase no LBA dos potros do grupo EX em
comparaccedilatildeo com o grupo DA (FIGURA 24)
No presente estudo a atividade de macroacutefago alveolar foi investigada devido
ao papel inerente desta ceacutelula na defesa pulmonar O aumento na atividade dos
macroacutefagos alveolares no grupo DA foi discutida acima e provavelmente deveu-se agrave
presenccedila de aeroalergenos e endotoxinas presentes nas cocheiras dos cavalos
(RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento reduziu tanto a fagocitose de macroacutefago
alveolar (FIGURA 25) como a capacidade de produccedilatildeo de ROS (acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio) (FIGURAS 26 e 27)
O macroacutefago alveolar eacute a ceacutelula efetora do sistema imune predominante nos
espaccedilos alveolares e nas vias aeacutereas condutoras responsaacutevel por ativar as
respostas inflamatoacuterias de forma suficiente a eliminar agentes agressores (PETERS-
GOLDEN 2004) Os macroacutefagos alveolares satildeo essenciais agrave sobrevivecircncia
devendo estar em harmonia com o sistema nervoso e endoacutecrino para responder a
estiacutemulos fisioloacutegicos bem como patoloacutegicos (GORDON 2007) sem exagerar na
resposta a fim de natildeo comprometer a troca gasosa (PETERS-GOLDEN 2004)
Apesar de KIZAKI et al (2008) terem demonstrado que o macroacutefago pode
sofrer uma adaptaccedilatildeo ao exerciacutecio melhorando sua funcionalidade os potros PSI
jovens em treinamento para corrida do grupo EX apresentaram supressatildeo da
imunidade especificamente a relacionada agrave resposta imune inata dos macroacutefagos
alveolares corroborando com estudos anteriores (HUSTON et al 1987 RAIDAL et
al 2000 RAIDAL et al 2001) que avaliaram o LBA de cavalos apoacutes exerciacutecio
90
realizado em esteira de alta velocidade e obtiveram resultados semelhantes aos
nossos
Outro aspecto ainda natildeo relatado em equinos mas demonstrado em
pessoas eacute que a melhora na atividade antioxidante induzida pelo exerciacutecio pode
resultar em diminuiccedilatildeo da atividade da NADPH oxidase na membrana dos
macroacutefagos consequumlentemente reduzindo a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio por essas ceacutelulas (PARK et al 2005) como observado no
grupo EX
Portanto a influencia do exerciacutecio sobre a funcionalidade das ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico como a observada nos macroacutefagos alveolares do grupo EX no
presente estudo explicaria a maior suscetibilidade apresentada por potros de corrida
sob treinamento intenso a infecccedilotildees respiratoacuterias (HINES et al 1996) Em
humanos o exerciacutecio intenso reduziu a capacidade de apresentaccedilatildeo de antiacutegeno
(CEDDIA e WOODS 1999) bem como a resistecircncia antiviral (DAVIS et al 1997) por
macroacutefagos O PMA (phorbol myristate acetate) utilizado nas avaliaccedilotildees da
atividade de macroacutefago alveolar (ver toacutepicos 4114 e 4115) teve como funccedilatildeo
estimular a NADPH oxidase a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
(DEKKER et al 2000 NAKAJIMA et al 2000) mimetizando o estiacutemulo provocado
por agentes infecciosos (JI 2008) Isto de fato ocorreu no grupo EX jaacute que os
macroacutefagos estimulados apresentaram aumento significativo na atividade
comparando-se aos macroacutefagos natildeo estimulados (FIGURAS 26 e 27) entretanto a
atividade ainda foi significativamente menor que no grupo DA evidenciando a
reduccedilatildeo na atividade de macroacutefagos induzida pelo exerciacutecio
Os efeitos do PMA sobre os macroacutefagos alveolares e sobre os PMNs do
sangue de equino podem ser apreciados no experimento de validaccedilatildeo da teacutecnica
de estudo da bioatividade de PAF (FIGURAS 13 a 18) A teacutecnica utilizada para o
estudo da bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos potros
empregando-se PMNs de equinos como ferramenta para se avaliar o influxo de Ca++
induzido por PAF foi ineacutedita em estudos em cavalos Anteriormente a mesma
avaliaccedilatildeo foi realizada utilizando-se PMNs de humanos (GRYNKIEWICZ et al 1985
MARATHE et al 2001) Anteriormente os PMNs de equinos foram empregados
com ecircxito no estudo da bioatividade de PAF em extrato lipiacutedico obtido a partir de
amostras de pulmatildeo de ratos no estudo da asma (MUEHLMANN et al 2009)
91
Portanto a validaccedilatildeo desta teacutecnica se fez necessaacuteria e importante para o
reconhecimento dos resultados obtidos para a bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos investigados No presente estudo o PAF
ativou os PMNs do sangue do cavalo assim como os macroacutefagos alveolares de
forma concentraccedilatildeo dependente Portanto o PAF tendo como uma de suas origens
o macroacutefago alveolar eacute capaz de modificar o comportamento de neutroacutefilos
sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos
neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a ORVA (MARR et al 2002)
As influecircncias exercidas pelo PAF na circulaccedilatildeo pulmonar permeabilidade
capilar pulmonar e na agregaccedilatildeo plaquetaacuteria estimulou o estudo da HPIE nos potros
avaliados no grupo EX Para tal o hemossideroacutefago no LBA foi escolhido como o
marcador da HPIE porque a colheita do LBA 24 horas apoacutes o exerciacutecio resultou que
a observaccedilatildeo endoscoacutepica de sangue na traqueacuteia bem como a contagem do
nuacutemero de eritroacutecitos no LBA natildeo fossem teacutecnicas diagnoacutesticas indicadas nesse
momento
A observaccedilatildeo do hemossideroacutefago no LBA mesmo se constituindo numa
forma confiaacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993) poderia natildeo servir
aos nossos propoacutesitos de identificar diferenccedilas em marcadores inflamatoacuterios e de
estresse oxidativo bem como na funcionalidade de macroacutefagos alveolares dentro
de um mesmo grupo ateacute entatildeo considerado homogecircneo Contudo o
hemossideroacutefago presente no LBA foi confirmado no presente estudo natildeo soacute como
um marcador confiaacutevel da HPIE como tambeacutem foi capaz de diferenciar subgrupos
significativamente distintos dentro do grupo EX
Interessantemente observou-se um percentual de HPIE (determinado pela
presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA) maior que o de inflamaccedilatildeo pulmonar (gt5
de neutroacutefilos eou gt1 de eosinoacutefilos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA)
Isso nos leva a pensar que a HPIE precede a inflamaccedilatildeo no pulmatildeo dos cavalos de
corrida tal como foi sugerido por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) mas que
requer outras investigaccedilotildees para excluir que o contraacuterio estivesse acontecendo isto
eacute um processo inflamatoacuterio em periacuteodo anterior do treinamento que pudesse ter
deixado alguma fragilidade pulmonar Possivelmente o estudo de potros PSI de
corrida tatildeo jovens e em iniacutecio de treinamento permitiu tal discussatildeo visto que se
considera que a HPIE acometa praticamente a totalidade dos cavalos PSI em
treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007)
92
A associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo jaacute foi demonstrada anteriormente
(McKANE et al 1993) e foi considerada como sendo significativa no estudo
epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) apesar dos mecanismos pelos quais
esta associaccedilatildeo ocorre ainda serem apresentados de forma hipoteacutetica como no
recente estudo de DERKSEN et al (2009)
No estudo de COUEumlTIL e DENICOLA (1999) cavalos de corrida com HPIE
apresentaram na avaliaccedilatildeo do LBA um aumento no NTCN associado agrave neutrofilia
De fato isto ocorreu no subgrupo HPIE pos e esses achados de citologia
demonstram que a HPIE esteve associada agrave inflamaccedilatildeo pulmonar nos potros do
subgrupo HPIE pos
Outro achado comum entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar eacute o aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA como observado no subgrupo HPIE pos em
comparaccedilatildeo com o grupo HPIE neg (FIGURA 29) evidenciando um aumento na
permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) no subgrupo HPIE pos
O acuacutemulo de fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar associado agrave
inflamaccedilatildeo pulmonar como demonstrado por TSANGARIS et al (2003) foi discutido
acima Contudo cavalos com HPIE exercitados a altas velocidades tambeacutem
apresentaram aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas no espaccedilo alveolar (WEST e
MATTHIEU-COSTELLO 1999)
Possivelmente o aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas associado agrave HPIE
possa ser devido ao aumento da pressatildeo transmural nos capilares pulmonares
resultando em falecircncia por estresse dos capilares como demonstrado por BIRKS et
al (1997) em cavalos exercitados nas mesmas velocidades que os potros avaliados
no presente estudo
Adicionalmente parece que a HPIE deflagrou um mecanismo inflamatoacuterio
causador de extravasamento de plasma no espaccedilo alveolar nos potros do subgrupo
HPIE pos e a bioatividade de PAF significativamente aumentada no subgrupo HPIE
pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (FIGURA 28) indica a participaccedilatildeo desse
mediador proacute inflamatoacuterio nesse evento
O extravasamento de plasma na microcirculaccedilatildeo pulmonar e a formaccedilatildeo de
edema pulmonar induzidos por PAF foram demonstrados anteriormente e jaacute
discutidos acima (EVANS et al 1987 CLAVIJO et al 2001) No caso da HPIE
provavelmente o PAF induza a formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular
atraveacutes da desorganizaccedilatildeo de proteiacutenas juncionais (JIANG et al 2008) Estes dados
93
concordam com a proposta de WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) de que a
altas pressotildees em capilares pulmonares ocorra a formaccedilatildeo de fendas nas junccedilotildees
entre as ceacutelulas endoteliais Desta forma as evidecircncias indicam que associado ao
evento mecacircnico na etiopatogenia da HPIE um evento inflamatoacuterio tambeacutem estaacute
presente o que representa um fator de risco para o agravamento do quadro
Adicionalmente os eventos inflamatoacuterios presentes na HPIE se constituem em
potencial aacuterea para investigaccedilotildees terapecircuticas visto que ainda natildeo se tem um
tratamento efetivo para a hemorragia pulmonar em cavalos atletas Recentemente
evidecircncias de que a suplementaccedilatildeo de cavalos atletas com aacutecidos graxos ocircmega-3
melhora a fluidez da membrana dos eritroacutecitos (PORTIER et al 2006) sugeriu que a
influecircncia beneacutefica na resposta inflamatoacuteria pulmonar pode reduzir os iacutendices HPIE
(ERICKSON et al 2007)
Portanto eacute razoaacutevel assumir um papel para o PAF na fisiopatologia da HPIE
pelas suas propriedades angiogecircnicas aleacutem de seus efeitos proacute inflamatoacuterios
(APONTE et al 2008) concordando com a hipoacutetese da patogecircnese da HPIE
proposta por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) onde a ruptura dos capilares
pulmonares resultaria em inflamaccedilatildeo sangramento e hemosiderose e
consequumlentemente a ocorrecircncia de angiogecircnese na circulaccedilatildeo bronquial e fibrose
agravando o quadro da HPIE
Adicionalmente ZHANG et al (2003) demonstraram que o aumento da
permeabilidade capilar induzido por PAF envolve a participaccedilatildeo de estresse
oxidativo visto que a enzima antioxidante superoacutexido dismutase (SOD) atenuou os
efeitos do PAF sobre o endoteacutelio De fato o grupo HPIE pos apresentou a
concentraccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos significativamente aumentada em comparaccedilatildeo
ao subgrupo HPIE neg sendo uma evidecircncia de estresse oxidativo no LBA dos
potros deste grupo possivelmente exacerbada pela alta quantidade de ferro da
hemossiderina presente no espaccedilo alveolar (DERSEN et al 2009)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica induz alteraccedilotildees patoloacutegicas no tecido pulmonar
destruindo pneumoacutecitos e ceacutelulas endoteliais do epiteacutelio levando a um aumento da
permeabilidade microvascular inibe a siacutentese e a liberaccedilatildeo de surfactante e interfere
negativamente na atividade do NO O conjunto dessas accedilotildees dos peroacutexidos lipiacutedicos
no pulmatildeo resulta em dano da estrutura pulmonar e leva agrave hipertensatildeo
representando um fator adicional contribuindo para a patogenia da HPIE (MILLS e
HIGGINS 1997)
94
Os macroacutefagos alveolares como ceacutelulas orquestradoras da resposta imune
pulmonar (PETERS-GOLDEN 2004) devem possuir um importante papel na
patogenia da HPIE visto que a obtenccedilatildeo de subgrupos significativamente distintos
a partir do grupo EX no presente estudo se deu pela presenccedila ou ausecircncia de
hemossideroacutefagos THACKER (2006) descreveu que os macroacutefagos ativados
secretam interleucina-1 (IL-1) que atrai e ativa a proliferaccedilatildeo de fibroblastos e a
siacutentese de colaacutegeno para reparar o tecido danificado Em estudo histopatoloacutegico do
pulmatildeo de cavalos com HPIE as aacutereas de ocorrecircncia de hemorragia caracterizaram-
se por hemossiderose e fibrose (DERKSEN et al 2009)
Adicionalmente WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) sugeriram o
envolvimento de leucotrieno B4 (LTB4) no mecanismo inflamatoacuterio envolvido na
HPIE apesar deste mecanismo ainda requerer comprovaccedilatildeo Neste evento a
ruptura do epiteacutelio alveolar com a exposiccedilatildeo da membrana ativaria os macroacutefagos
alveolares os quais satildeo ricos em LTB4
O LTB4 por sua vez tambeacutem conecta o PAF agrave HPIE HOPKINS et al (1997)
estudaram a HPIE em humanos avaliando o LBA de seis ciclistas de elite apoacutes 4 km
de esforccedilo maacuteximo Comparados aos controles os ciclistas que realizaram o esforccedilo
apresentaram altas concentraccedilotildees de eritroacutecitos proteiacutenas e LTB4 no LBA No
estudo citado exceto pelo aumento da LTB4 natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
percentual de neutroacutefilos e nem nos niacuteveis de IL-8 e TNF-α entre os grupos
suportando a hipoacutetese do estresse mecacircnico alterando a BAC na HPIE segundo a
conclusatildeo dos autores Contudo a associaccedilatildeo entre LTB4 e PAF foi demonstrada
anteriormente onde o receptor de LTB4 esteve envolvido com a quimiotaxia
pulmonar e degranulaccedilatildeo de neutroacutefilos induzida por PAF (GAUDREAULT et al
2005) Todavia ateacute o momento este tipo de associaccedilatildeo natildeo foi demonstrada em
cavalos apesar de ter-se relatada a neutrofilia nas vias aeacutereas de cavalos com
ORVA mediada por LTB4 (LINDBERG et al 2004) Portanto reunindo as
informaccedilotildees acima pode-se assumir a hipoacutetese de que a neutrofilia no LBA e o
aumento da permeabilidade da BAC nos potros do subgrupo HPIE pos tenha sido
induzida por PAF e mediada por receptor de LTB4
Adicionalmente reforccedila-se a evidecircncia da importacircncia dos macroacutefagos
alveolares na HPIE e por sua vez como a hemorragia pulmonar pode influenciar a
funcionalidade dos macroacutefagos Na primeira etapa do presente estudo descrevemos
a reduccedilatildeo na fagocitose e na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de
95
hidrogecircnio pelos macroacutefagos alveolares do grupo EX (FIGURAS 25 a 27) Contudo
evidenciamos que a HPIE agravou ainda mais esta situaccedilatildeo (FIGURAS 32 e 33)
pois a resposta de macroacutefago alveolar esteve significativamente reduzida no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg
A reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no subgrupo HPIE pos pode ser
explicada novamente pela HAIE com consequumlente inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO
(MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
favorecendo o aumento da permeabilidade capilar (KIKUCHI et al 2008)
provavelmente agravado pela ocorrecircncia de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica neste grupo (MILLS
e HIGGINS 1997)
Os mecanismos pelos quais o NO modula a permeabilidade microvascular
natildeo satildeo bem conhecidos Em cavalos de PSI de corrida a inibiccedilatildeo da NOS pela
administraccedilatildeo de L-NAME agravou a HPIE enquanto natildeo alterou a pressatildeo arterial
pulmonar (KINDIG et al 2000) e a inalaccedilatildeo de NO durante o exerciacutecio reduziu
ligeiramente a pressatildeo arterial pulmonar enquanto tambeacutem causou agravamento da
HPIE (KINDIG et al 2001) Parece que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete
em parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou mas agravou a HPIE
Adicionalmente corroborando com o aumento da bioatividade de PAF e
reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos o estudo de
KWASNIEWSKI et al (2008) com um modelo de lesatildeo e hemorragia em intestino
delgado demonstrou que o preacute tratamento com antagonista de PAF reduziu as
lesotildees enquanto a inibiccedilatildeo do NO endoacutegeno aumentou consideravelmente as
lesotildees hemorraacutegicas e a mortalidade Portanto o estudo citado demonstrou a
existecircncia da relaccedilatildeo entre PAF e NO na hemorragia ocorrida na microcirculaccedilatildeo
assim como reafirma o papel protetor do NO para os efeitos proacute inflamatoacuterios do
PAF (NEVIN e BROADLEY 2002 BRKOVIC e SIROIS 2007)
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
A hipoacutetese do presente estudo foi confirmada pois tanto o desafio ambiental
como o exerciacutecio causaram alteraccedilotildees no fluido broncoalveolar e modificaram a
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar Potros PSI de corrida jovem em treinamento para
corrida apresentaram depressatildeo da resposta imune inata mais especificamente do
macroacutefago alveolar induzida pelo exerciacutecio e agravada pela ocorrecircncia da HPIE
PAF influencia os neutroacutefilos do sangue bem como os macroacutefagos alveolares
de equinos e no presente estudo esteve presente na inflamaccedilatildeo pulmonar induzida
pelo exerciacutecio nos potros PSI durante o treinamento para corrida
Os achados relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e ao aumento da
bioatividade de PAF no fluido broncoalveolar dos potros exercitados estiveram
relacionados agrave HPIE e agrave presenccedila dos hemossideroacutefagos no LBA o que resultou
numa resposta de macroacutefago alveolar ainda mais reduzida
Desta forma assume-se que os resultados obtidos para o grupo EX podem
ser extrapolados para as populaccedilotildees similares de cavalos PSI jovens em
treinamento para a corrida
Finalmente sugere-se a conduccedilatildeo de novos estudos para o entendimento
dos mecanismos inflamatoacuterios envolvidos na HPIE bem como o papel do PAF neste
processo
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315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA ET AL 1998) 54
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA ET AL 1998) 54
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK E MIZEL 1981) 55
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN E GORDON 1987) 56
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 57
4 RESULTADOS 59
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO 59
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica59
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas 60
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT) 61
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA) 62
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem Diferencial de Ceacutelulas do LBA 62
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF 63
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF 65
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 67
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 68
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 69
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 70
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA 71
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 72
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar 73
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 74
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO 75
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA 75
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 76
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 77
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 78
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 79
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 80
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-) 80
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 81
5 DISCUSSAtildeO 83
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 96
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 97
LISTA DE ABREVIATURAS
ACVIM American College of Veterinary Internal Medicine
AT Aspirado traqueal
CN Grupo Condiccedilotildees Naturais
DA Grupo Desafio Ambiental
DIVA Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas
DIVAI Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
DPOC Doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica
EX Grupo Exerciacutecio
HAIE Hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio
HPIE Hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
HRPO Horse radish peroxidase
IFN-γ Interferon gama
IL-1 Interleucina-1
IL-4 Interleucina-4
IL-8 Interleucina-8
IL-9 Interleucina-9
IL-17 Interleucina-17
LBA Lavado broncoalveolar
L-NAME N-nitro-L-arginina metil ester
LTB4 Leucotrieno B4
LTE8 Leucotrieno E8
MLCP Myosin light chain phophatase
NO Oacutexido niacutetrico
NOS Oacutexido niacutetrico sintase
NTCN Nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas
ORVA Obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas
PAF Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PAF-AH Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria acetilhidrolase
PAF-R Receptor de fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PBS Soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada
PMA Phorbol myristate acetate
PMN Polimorfonuclear
PRS Phenol red solution
PSI Puro sangue inglecircs
RNS Espeacutecie reativa do nitrogecircnio
ROS Espeacutecie reativa do oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Th2 Linfoacutecitos T helper 2
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE 20
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO SN-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL 24
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM
RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS 25
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E
SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE 30
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA
ASMA 31
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS 32
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO
A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR
(BAC) 36
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO
DERSKEN et al (2009) 38
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA
FARINGE 44
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS
ARITENOacuteIDES DE I A IV 44
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME
ENDOSCOacutePICO 45
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO
DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO
REGISTRADA A 510 nm 50
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA
ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 57
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA
AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 63
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS
DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 64
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO
ANTAGONISTA DE PAF BN52021 64
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO
ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 65
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 66
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR
PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 66
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++
EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 67
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO
EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA
ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 68
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A
PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 69
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO
SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 70
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX
(n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA 71
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) 72
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) 73
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) 74
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) 75
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) HPIE NEG (n=5) e EX NORMAL (n=4) 76
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE
POS (n=13) HPIE NEG (n=12) E EX NORMAL (n=8) 77
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) HPIE NEG (n=10) E EX NORMAL (n=7) 79
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) HPIE NEG (n=8) E EX NORMAL (n=5) 80
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS
POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) HPIE NEG (n=5) E EX NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE
POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 81
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE
PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) HPIE NEG (n=6) E EX
NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2
ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 82
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS
TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE
INGLEcircS DE CORRIDA 59
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGIANOS
OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS
DE I A IV 60
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS
CARTILAGENS ARITENOacuteIDES 60
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA
ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO
SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE
AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 61
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS
CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN
(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS
DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN
(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM
PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO
LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX E DOS
SUBGRUPOS HPIE POS HPIE NEG E EX NORMAL 76
RESUMO
A doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas (DIVA) e a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) satildeo comuns em cavalos de corrida resultando em interrupccedilatildeo no treinamento A hipoacutetese do presente estudo foi de que o ambiente e o exerciacutecio
causam estresse oxidativo produccedilatildeo do fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF) e inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas de potros PSI de corrida e que haacute uma relaccedilatildeo entre a DIVA e a HPIE Estudou-se potros PSI em ambiente natural (NC n=45) estabulados
por 30 dias (DA n=40) e treinados (EX n=34) Apoacutes os potros do grupo EX foram divididos em trecircs subgrupos HPIE pos (presenccedila de hemossideroacutefagos no lavado broncoalveolar - LBA) HPIE neg (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA) e EX
normal (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA e menos de 5 de neutroacutefilos e menos de 1 de eosinoacutefilos no LBA) Avaliou-se perfil citoloacutegico e paracircmetros do LBA relacionados a estresse oxidativo bioatividade de PAF atividade da catalase e
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar (MA) Os percentuais de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no LBA do grupo EX foram maiores (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 e 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectivamente) que os limites superiores para cavalos normais
(5 para neutroacutefilos e 1 para eosinoacutefilos) juntamente com um maior nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 ceacutelulasmicroL de LBA P=0017) evidenciaram a ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo pulmonar A bioatividade de PAF e a
concentraccedilatildeo de proteiacutenas no LBA foram maiores no grupo EX (relaccedilatildeo 340380 nm 0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg de proteiacutenasmL de LBA Plt0001) A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos no LBA foi maior
no grupo DA (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg de proteiacutenas Plt0001) e a atividade da catalase foi maior no grupo EX (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg de proteiacutenas P=0002) A fagocitose de MA (P=0006) bem como a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido (Plt0001) e peroacutexido de hidrogecircnio (P=0006) foram
significativamente menores no grupo EX Vinte e trecircs (622) potros do grupo EX foram HPIE pos e o LBA desse subgrupo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutenas (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) bioatividade de
PAF (relaccedilatildeo 340380 nm 0180 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 P=0042) e concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) significativamente maiores que o subgrupo HPIE neg A concentraccedilatildeo de nitritos
(008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) e a atividade de MA foi menor em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg O ambiente e o exerciacutecio modificaram o fluido broncoalveolar confirmando a hipoacutetese do presente estudo
Houve aumento da resposta de MA induzida pelo ambiente enquanto o exerciacutecio fiacutesico resultou em HPIE inflamaccedilatildeo pulmonar e diminuiccedilatildeo na resposta imune inata relacionada aos macroacutefagos alveolares nos potros PSI jovens durante o treinamento
para corrida e o PAF esteve presente nesse processo Sugere-se a conduccedilatildeo de novas investigaccedilotildees para elucidar os mecanismos inflamatoacuterios da HPIE bem como o papel do PAF neste processo como um potencial alvo terapecircutico
Palavras-chave cavalo fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria hemorragia pulmonar inflamaccedilatildeo pulmonar fluido broncoalveolar
ABSTRACT
Inflammatory airway disease (IAD) and exercise-induced pulmonary hemorrhage (EIPH) are common in racehorses during training being important ailments interrupting training of thoroughbred racehorses The present study hypothesis was
that stabling and exercise cause oxidative stress release of platelet-activating factor (PAF) and inflammation in airways of Thoroughbred colts and that there is an association between IAD and EIPH The subjects were colts in breeding farms (NC
n=45) stabled for 30 days (EC n=40) and race trained (EX n=34) Colts of the EX group were subdivided into three subgroups EIPH pos (presence of hemosiderophages in BALF) EIPH neg (absence of hemosiderophages in BALF)
and Normal EX (absence of hemosiderophages and less than 5 neutrophils and 1 eosinophils in BALF) Cytological profile and parameters of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) related to oxidative stress bioactivity of the pro-inflammatory
mediator PAF catalase activity and alveolar macrophage (AM) activity were studied Percentages of neutrophils and eosinophils in the BALF of the EX group were higher (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 and 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectively)
than the upper limits for normal horses (5 of neutrophils and 1 of eosinophils) that associated with a significantly higher total nucleated cell count (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 cellsmicroL of BALF P=0017) displayed pulmonary inflammation PAF
bioactivity and the total protein concentration in the BALF were higher in the EX group (0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 340380nm ratio P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg of proteinsmL of BALF Plt0001) Concentration of BALF hydroperoxides
was higher in the EC group (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg of proteins Plt0001) and catalase activity was higher in the EX group (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg of proteins P=0002) AM phagocytosis (P=0006) as well as production of superoxide anion (Plt0001) and hydrogen peroxide (P=0006) were
significantly lower in EX group Twenty three (622) colts of the EX group were EIPH pos and the BALF of this subgroup presented a significantly higher protein concentration (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg of proteinsmL of BALF P=0031) PAF
bioactivity (018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 340380 nm ratio P=0042) and lipid hydroperoxide concentration (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg of proteins P=0009) as well as lower nitrite concentration (008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007
absorbance 550 nm P=0049) and AM activity than EIPH neg subgroup Environment and exercise modified the bronchoalveolar fluid confirming the hypothesis of the present study Environment increased AM response as exercise resulted in EIPH
pulmonary inflammation and decreased innate immune response of alveolar macrophages in young Thoroughbred horses during race training and PAF participated in this event Further studies should be conducted to better understand
the inflammatory mechanisms of EIPH and the role of PAF in this process as a potential therapeutic target
Keywords horse platelet-activating factor pulmonary hemorrhage pulmonary
inflammation bronchoalveolar fluid
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
As doenccedilas respiratoacuterias satildeo comuns nos cavalos e as condiccedilotildees a que
estatildeo sujeitos fazem com que a inflamaccedilatildeo seja uma manifestaccedilatildeo frequumlente dessas
afecccedilotildees O epiteacutelio das vias aeacutereas superiores e dos pulmotildees estatildeo expostos a
patoacutegenos invasores e fatores ambientais Portanto o conhecimento dos
mecanismos da resposta inflamatoacuteria nas vias aeacutereas se faz importante a fim de se
estabelecer estrateacutegias para reduzir o impacto e os danos causados (THACKER
2006)
A inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apresenta um agravante o papel dos pulmotildees
na troca gasosa Assim as quatro principais consequumlecircncias de um processo
inflamatoacuterio desencadeado nas vias aeacutereas incluem vasodilataccedilatildeo e a reduccedilatildeo no
fluxo sanguiacuteneo resultando em capilares ingurgitados o aumento da permeabilidade
capilar permitindo a passagem de fluiacutedo e ceacutelulas para os tecidos o influxo e
acuacutemulo de fagoacutecitos e ceacutelulas ativadas no local e a bronconstricccedilatildeo (LUNN et al
2007)
O estudo das doenccedilas respiratoacuterias em cavalos eacute relevante particularmente
nos cavalos jovens de corrida onde a taxa de inflamaccedilatildeo detectada nas vias aeacutereas
eacute significativa (CHRISTLEY e RUSH 2007)
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA)
Os termos ldquodoenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereasrdquo (DIVA) e ldquodoenccedila
inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferioresrdquo (DIVAI) tecircm sido usados para descrever uma
siacutendrome inflamatoacuteria do trato respiratoacuterio de cavalos de corrida (CHRISTLEY e
RUSH 2007)
Tem-se relatado que a DIVA ocorre em 11 a 50 dos cavalos de corrida em
treinamento chegando a afetar ateacute 80 dos cavalos de corrida de dois anos de
idade (CHRISTLEY e RUSH 2007) MALIKIDES (2003) estudou a prevalecircncia da
DIVA em cavalos de corrida na Austraacutelia evidenciando que 41 deles apresentaram
inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apoacutes duas semanas de iniciarem treinamento
19
A DIVA eacute considerada a segunda afecccedilatildeo mais comum a interromper o
treinamento para corridas (WILSHER et al 2006) podendo resultar em prejuiacutezos a
troca gasosa e diminuiccedilatildeo da capacidade atleacutetica (COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005)
Cavalos com DIVA ou com hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) apresentaram uma maior hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE)
(CHRISTLEY et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
(FIGURA 1)
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE EIPH HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO IAD DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS UAO OBSTRUCcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS SUPERIORES FONTE SAacuteNCHEZ et al (2005)
Cavalos trotadores de corrida diagnosticados com DIVA tiveram a mecacircnica
pulmonar (volume corrente frequumlecircncia respiratoacuteria ventilaccedilatildeo pulmonar duraccedilatildeo da
inspiraccedilatildeo e da expiraccedilatildeo complacecircncia dinacircmica) alterada apresentaram um
significativo aumento da carga ventilatoacuteria e da energia requerida para a respiraccedilatildeo
sofrendo restriccedilotildees em seu rendimento atleacutetico (PIRRONE et al 2007)
Contudo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas dos cavalos atletas natildeo eacute entendida
por completo especialmente pela falta de consistecircncia e precisatildeo na definiccedilatildeo
dessa siacutendrome (CHRISTLEY e RUSH 2007)
Recentemente um painel de discussatildeo promovido pelo American College of
Veterinary Internal Medicine (ACVIM) definiu que a DIVA pode ocorrer em cavalos
de qualquer idade e eacute caracterizada pelo seguinte fenoacutetipo (COUEumlTIL et al 2007)
20
- Baixo rendimento desportivo intoleracircncia ao exerciacutecio
- Tosse com ou sem quantidade excessiva de muco traqueal
- Inflamaccedilatildeo natildeo seacuteptica detectada pela avaliaccedilatildeo citoloacutegica do fluido do LBA
ou disfunccedilatildeo pulmonar baseada em evidecircncia de obstruccedilatildeo de vias aeacutereas
inferiores hiperresponsividade das vias aeacutereas ou prejuiacutezo a troca gasosa durante o
repouso ou exerciacutecio
Este painel formado por experts e pesquisadores da aacuterea propocircs tambeacutem
alguns fatores de exclusatildeo para a DIVA
- Evidecircncia de sinais sistecircmicos de infecccedilatildeo (febre alteraccedilotildees hematoloacutegicas
compatiacuteveis com infecccedilatildeo)
- Aumento do esforccedilo respiratoacuterio durante o repouso
A etiopatogenia da DIVA eacute pouco definida Acredita-se que uma variedade de
fatores de risco estejam envolvidos variando nas diferentes populaccedilotildees de cavalos
baseado na alimentaccedilatildeo manejo praacuteticas preventivas distribuiccedilatildeo de agentes
infecciosos e influecircncias geneacuteticas (COUEumlTIL et al 2007)
Alguns autores encontraram uma reduccedilatildeo da incidecircncia desta afecccedilatildeo em
cavalos mais velhos (BURRELL et al 1996 CHAPMAN et al 2000 CHRISTLEY et
al 2001 WOOD et al 2005) sendo que a idade natildeo provocou diferenccedila no estudo
de McKANE et al (1993)
O ambiente da cocheira representa um risco adicional para a DIVA nos
cavalos (BURRELL et al 1996 HOLCOMBE et al2001 CLEMENTS e PIRIE
2007 BERNDT et al 2008) bem como para a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas das
pessoas envolvidas no trabalho com os cavalos (ELFMAN et al 2009)
HOLCOMBE et al (2001) associaram o manejo de estabulaccedilatildeo com a
ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas inferiores Estudaram 14 potros aacuterabes
que foram transferidos da pastagem para cocheiras com cama de palha Apoacutes 90
dias de estabulados houve um aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no
lavado broncoalveolar (LBA) Cavalos estabulados em cama de palha tambeacutem
apresentaram maior chance de apresentar DIVA em outros estudos (BURRELL et
al 1996 WOODS et al 1993)
No entanto em cavalos de montaria no estado norte-americano de Michigan
foi a permanecircncia em piquetes durante o inverno que esteve associado com
aumento do acuacutemulo de muco traqueal com maior nuacutemero de neutroacutefilos Neste
21
estudo a alimentaccedilatildeo com feno tambeacutem representou risco para a ocorrecircncia de
inflamaccedilatildeo (ROBINSON et al 2006)
Contudo o ambiente de cocheiras em modelos convencionais de manejo aos
quais os cavalos em treinamento estatildeo submetidos reconhecidamente apresenta
riscos para as vias aeacutereas Nestes haacute aumento nas concentraccedilotildees de partiacuteculas
inalaacuteveis contendo partiacuteculas orgacircnicas e inorgacircnicas incluindo endotoxinas β-D-
glucan partiacuteculas ultra finas (lt100 nm de diacircmetro) microorganismos esporos de
fungos material vegetal poeira inorgacircnica e gases toacutexicos (COUEumlTIL et al 2007)
Recentemente no estudo de BERNDT et al (2008) se demonstrou que o ambiente
de cocheira apresenta uma concentraccedilatildeo de endotoxinas 8 vezes maior que nos
piquetes
Aleacutem disso haacute muito jaacute foi descrita a presenccedila de actinomicetos termofiacutelicos
como a Micropolyspora faeni nos fenos fornecidos aos cavalos capazes de serem
inalados atingindo as vias aeacutereas inferiores (McPHERSON e THOMSON 1983)
Assim a praacutetica de encharcar o feno antes da administraccedilatildeo para diminuir a
quantidade de poeira disponiacutevel resultou em benefiacutecio agraves vias aeacutereas dos cavalos
(CLEMENTS e PIRIE 2007)
Por outro lado a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA ainda
natildeo estaacute bem esclarecida Cavalos com sinais cliacutenicos de inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas apresentaram maior frequecircncia de isolados bacterianos nos estudos de
CHRISTLEY et al (2001) e WOOD et al (2005) apesar de o painel do ACVIM
entender que a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA precisa ser
melhor estudada (COUEumlTIL et al 2007)
O exerciacutecio tambeacutem tem sido associado agrave inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas
inferiores dos cavalos atletas (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) A prevalecircncia da DIVA eacute maior em cavalos em treinamento
que em cavalos do mesmo grupo mas sem treinamento talvez pela inalaccedilatildeo de
maiores quantidades de partiacuteculas pela exposiccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores ao ar
frio ou pela ocorrecircncia da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (DAVIS et
al 2006 CHRISTLEY e RUSH 2007)
O diagnoacutestico da DIVA inclui a histoacuteria e o exame fiacutesico detalhados para a
identificaccedilatildeo de potenciais fatores etioloacutegicos A tosse durante o exerciacutecio ou
durante a alimentaccedilatildeo constitui a queixa mais comum (CHRISTLEY e RUSH 2007)
esteve associada agrave presenccedila de quantidades aumentadas de secreccedilatildeo traqueal bem
22
como a um maior percentual de neutroacutefilos tanto na secreccedilatildeo traqueal (CHRISTLEY
et al 2001) como no LBA (BENEDICE et al 2008) mas sua ausecircncia natildeo descarta
o diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
A presenccedila de descarga nasal mucopurulenta eacute achado comum em cavalos
de corrida de dois anos de idade sendo menos comum em cavalos mais velhos
Sua relaccedilatildeo com a DIVA todavia natildeo eacute sabida (COUEumlTIL et al 2007)
A auscultaccedilatildeo toraacutecica durante o repouso raramente evidencia alteraccedilotildees em
cavalos atletas com inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores (MAZAN e HOFFMAN
2003 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007) sendo necessaacuteria a
utilizaccedilatildeo de uma sacola para o cavalo respirar no seu interior ampliando o esforccedilo
respiratoacuterio (bdquorebreathing bagrsquo) podendo tornar audiacuteveis alguns sons anormais em
certos casos (MAZAN e HOFFMAN 2003 COUEumlTIL et al 2007)
MAZAN e HOFFMAN (2003) relataram que os testes de funccedilatildeo pulmonar
como o pneumotacoacutegrafo e o teste de broncoprovocaccedilatildeo com histamina podem
auxiliar tornando o diagnoacutestico da DIVA definitivo Contudo o diagnoacutestico precoce
da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores deve enfatizar a avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA
e natildeo os testes de funccedilatildeo pulmonar (COUEumlTIL et al 2007)
A avaliaccedilatildeo citoloacutegica do AT tambeacutem tem contribuido ao diagnoacutestico dos
processos inflamatoacuterios das vias aeacutereas contudo natildeo eacute considerado suficiente para
o diagnoacutestico da DIVA Isto se deve a falta de concordacircncia entre os achados
citoloacutegicos do AT e do LBA e da falta de estudos associando os achados no AT e o
rendimento atleacutetico (HODGSON e HODGSON 2003 HUGHES et al 2003
COUEumlTIL et al 2007) Ainda um cuidado a ser levado em conta quando da
realizaccedilatildeo de AT eacute o tempo da colheita jaacute que a realizaccedilatildeo de exerciacutecio
esteneuante pode aumentar o percentual de neutroacutefilos na amostra obtida
(MALIKIDES et al 2007)
O LBA por sua vez eacute o meacutetodo para a obtenccedilatildeo de amostras de ceacutelulas
presentes nas vias aeacutereas mais distais e espaccedilo alveolar (HOFFMAN 1999
FERNANDES et al 2000 LESSA et al 2005) considerado como uma bioacutepsia
liacutequida (MAZAN e HOFFMAN 2003) sendo a teacutecnica de avaliaccedilatildeo citoloacutegica
preferida para o diangoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
Um aumento no percentual de ceacutelulas inflamatoacuterias no fluido do LBA eacute um dos
principais criteacuterios diagnoacutesticos para a DIVA Usualmente ocorre uma predominacircncia
de neutroacutefilos mas tambeacutem pode ocorrer aumento nos nuacutemeros percentuais de
23
eosinoacutefilos linfoacutecitos e mastoacutecitos normalmente associados com diminuiccedilatildeo no
rendimento desportivo e hiperresponsividade das vias aeacutereas (McKANE et al 1993
HARE e VIEL 1998 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007)
O perfil citoloacutegico de LBA mais comumente encontrado em cavalos com DIVA
eacute caracterizado por aumento no nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (NTCN) com
discreta neutrofilia (gt5) linfocitose e monocitose Tambeacutem pode ser encontrado
um aumento do nuacutemero percentual de eosinoacutefilos (gt01) e mastoacutecitos (gt2)
(HOFFMAN 1999 COUEumlTIL et al 2007)
O painel de estudo da DIVA promovido pelo ACVIM apontou direccedilotildees para as
pesquisas nesta aacuterea e dentre elas o estudo das citocinas e mediadores
inflamatoacuterios envolvidos no processo (COUEumlTIL et al 2007)
Sabe-se que ocorre um incremento da imunidade inata nas vias aeacutereas dos
cavalos estabulados com o envolvimento de IL-6 (RIIHIMAumlKI et al 2008a) Em
cavalos trotadores de corrida em treinamento ocorre uma eosinofilia transitoacuteria no
fluido broncoalveolar e um aumento da expressatildeo de IL-4 e IL-5 contudo natildeo foi
encontrada correlaccedilatildeo entre estes eventos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Dentre os mediadores quiacutemicos participantes do processo inflamatoacuter io nas
vias aeacutereas o PAF (platelet-activating factor) estaacute especialmente implicado na asma
sepse e injuacuteria pulmonar aguda (THACKER 2006) presente tambeacutem na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas em cavalos mais velhos
(FAIRBAIRN et al 1996) Contudo a participaccedilatildeo do PAF no processo inflamatoacuterio
nas vias aeacutereas de cavalos atletas ainda natildeo eacute conhecida
13 PAF E VIAS AEacuteREAS
O fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocoline)
eacute um potente mediador proacute inflamatoacuterio envolvido na angiogecircnese aterosclerose
anafilaxia cicatrizaccedilatildeo inflamaccedilatildeo apoptose e endotoxemia (MARATHE et al
2001 STAFFORINI et al 2003 OWEN et al 2005) O PAF eacute produzido por
eosinoacutefilos macroacutefagos alveolares neutroacutefilos plaquetas e ceacutelulas endoteliais
(BAKER et al 2002 STAFFORINI et al 2003 GAUDREAULT et al 2005 SUMITA
et al 2005) a partir de uma subclasse especiacutefica de fosfatidilcolina que conteacutem um
eacuteter ao inveacutes de um eacutester ligado a posiccedilatildeo sn-1 do esqueleto de glicerol (FIGURA
24
2) A fosfatidilcolina eacute o mais abundante fosfolipiacutedio presente nas membranas
bioloacutegicas (MARATHE et al 2001 OWEN et al 2005)
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO sn-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL FONTE MARATHE et al (2001)
O PAF tambeacutem estaacute envolvido numa variedade de funccedilotildees pulmonares como
por exemplo no tocircnus vascular e das vias aeacutereas na frequumlecircncia de movimentaccedilatildeo
dos ciacutelios e na permeabilidade endotelial causando um aumento da secreccedilatildeo de
fluido traqueal broncoconstricccedilatildeo edema e hiperresponsividade das vias aeacutereas
resultando em prejuiacutezos a troca gasosa (CLAVIJO et al 2001 GABRIJELCIC et al
2003 ISHII et al 2004 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008)
Os efeitos do PAF sobre a circulaccedilatildeo pulmonar foram descritos por diversos
autores CHEN et al (1992) demonstraram um aumento das pressotildees arterial e
microvascular pulmonares e edema apoacutes a injeccedilatildeo de PAF SHIBAMOTO et al
(1993) estudaram os efeitos do PAF na circulaccedilatildeo venosa em pulmatildeo de catildeo onde
o PAF causou venoconstricccedilatildeo e aumento da pressatildeo capilar sem aumento da
permeabilidade vascular OHAR et al (1994) tambeacutem demonstraram
venoconstricccedilatildeo em estudo com pulmatildeo de coelhos mas demostraram que a
reduccedilatildeo da complacecircncia e aumento da resistecircncia vascular deveu-se a alteraccedilatildeo
estrutural vascular por perda de colaacutegeno intersticial induzida por PAF
Contudo o papel do PAF como causador de aumento da permeabilidade
vascular e edema pulmonar estaacute bem estudado devido a sua participaccedilatildeo na
fisiopatologia da anafilaxia da endotoxemia e da asma (EVANS et al 1987
25
CLAVIJO et al 2001 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008
MUEHLMANN et al 2009)
Em estudo preacutevio o extravasamento microvascular ocorrido apoacutes a infusatildeo de
PAF natildeo foi acompanhado de aumento da pressatildeo arterial pulmonar assim os
autores concluiacuteram que o edema pulmonar mediado por PAF resulta de aumento da
permeabilidade microvascular pulmonar (CLAVIJO et al 2001)
De fato demonstrou-se que o aumento da permeabilidade capilar induzida
por PAF ocorre pela formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular devido a
desorganizaccedilatildeo das proteiacutenas juncionais VE-caderina e ocludina (ZHANG et al
2003 JIANG et al 2008) mediada por receptores especiacuteficos (EVANS et al 1987)
e atraveacutes da ativaccedilatildeo da via do insositol trisphosphato e influxo de caacutelcio (GOumlGGEL
e UHLIG 2005) (FIGURA 3)
PLC phopholipase C IP3 inositol 145-trisphosphato IP3R receptor de IP3
MLCK myosin light chain kinase ML-7 5-iodonaphthalene-1sulphonyl-
homopiperazine L108 edelfosina Inibiccedilatildeo ativaccedilatildeo
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS NO LADO ESQUERDO OBSERVA-SE O EFEITO DO PAF EM CEacuteLULAS ENDOTELIAIS NO LADO DIREITO OBSERVA-SE OS EFEITOS DO PAF EM CEacuteLULAS DA MUSCULATURA LISA VASCULAR E DAS VIAS AEacuteREAS A QUAL Eacute ALTAMENTE MEDIADA POR TROMBOXANO NESTE A VIA PRINCIPAL Eacute ATRAVEacuteS DA ATIVACcedilAtildeO DE RHO E PROTEIacuteNAS KINASES ASSOCIADAS Agrave RHO QUE ATENUAM A ATIVIDADE DA MLCP (MYOSIN LIGHT CHAIN PHOPHATASE) COM CONSEQUumlENTE AUMENTO DA FOSFORILACcedilAtildeO DA CADEIA LEVE DA MIOSINA E PORTANTO A CONTRACcedilAtildeO FONTE GOumlGGEL e UHLIG (2005)
26
Adicionalmente os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) (BELLAN et al 1992) O
aumento da produccedilatildeo de NO induzida por PAF via ativaccedilatildeo de receptor de PAF foi
demonstrado em ceacutelulas do endoteacutelio vascular humano considerado como um efeito
cardioprotetor (KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Contudo particularmente
na microcirculaccedilatildeo o NO contra-ataca muitos dos efeitos bioloacutegicos do PAF inibindo
a vasoconstricccedilatildeo arteriolar e o aumento da permeabilidade vascular aleacutem de inibir
a adesatildeo de plaquetas e de leucoacutecitos ao endoteacutelio (BRKOVIC e SIROIS 2007
KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Mas os mecanismos pelos quais o NO
modula a permeabilidade microvascular ainda natildeo satildeo bem entendidos podendo ser
confusos e dependentes do estado das ceacutelulas endoteliais (RAMIREZ et al 2006)
A inibiccedilatildeo da NO sintase (NOS) em ceacutelulas endoteliais atenuou o aumento da
permeabilidade microvascular induzida por PAF no estudo de ZHU et al (2004) Por
outro lado estudando a participaccedilatildeo de NO e PAF em lesotildees de intestino delgado
de ratos KWASNIEWSKI et al (2008) evidenciaram que a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de
NO endoacutegeno aumentou bastante as lesotildees hemorraacutegicas e a taxa de mortalidade
demonstrando o papel proacute inflamatoacuterio do PAF e o efeito protetor do NO na
microcirculaccedilatildeo Tal relaccedilatildeo tambeacutem foi descrita por BRKOVIC e SIROIS (2007)
estudando o papel do PAF e do NO nos efeitos proacute inflamatoacuterios resultantes da
participaccedilatildeo de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e concluindo que eacute
o PAF que diretamente aumenta a permeabilidade vascular sendo o NO um cofator
A atuaccedilatildeo do PAF como mediador inflamatoacuterio eacute bastante importante na
asma onde aleacutem de provocar aumento da permeabilidade vascular tambeacutem induz
uma neutropenia transitoacuteria seguida de neutrofilia resultando no recrutamento de
neutroacutefilos para o pulmatildeo evidenciado atraveacutes de estudo citoloacutegico do lavado
broncoalveolar (LEE et al 2002 GABRIJELCIC et al 2003)
No estudo de AU et al (2001) a ativaccedilatildeo de neutroacutefilos resultou em ativaccedilatildeo
dos receptores de PAF aumento da fagocitose de neutroacutefilos e subsequumlente
liberaccedilatildeo de interleucina-8 (IL-8) causando mais quimiotaxia de neutroacutefilos
Adicionalmente demonstrou-se que haacute envolvimento de receptor 1 de leucotrieno B4
(LTB4) nas atividades de neutroacutefilos humanos mediadas por PAF (GAUDREAULT et
al 2005)
Em indiviacuteduos asmaacuteticos e com doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC)
o influxo de neutroacutefilos mediado por PAF nas vias aeacutereas foi modulado pelo aumento
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de LTB4 provavelmente pelo estiacutemulo de PAF para a liberaccedilatildeo de LTB4 dos
macroacutefagos alveolares (SHINDO et al 1998 GABRIJELCIC et al 2003 FINNEY-
HAYWARD et al 2009)
Nas vias aeacutereas dos cavalos se demonstrou a participaccedilatildeo do PAF na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas (ORVA) levando a um
aumento do recrutamento de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo resultando em
prejuiacutezos agrave funccedilatildeo pulmonar (FAIRBAIRN et al 1996)
O PAF tendo como uma de suas origens o macroacutefago alveolar eacute capaz de
modificar o comportamento de neutroacutefilos sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da
adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a
ORVA (MARR et al 2002)
A participaccedilatildeo do PAF na asma humana e em outras espeacutecies foi evidenciada
pela sua capacidade em reproduzir mecanismos fisiopatoloacutegicos tais como a
broncoconstricccedilatildeo hiperresponsividade das vias aeacutereas aumento da
permeabilidade na microcirculaccedilatildeo pulmonar e aumento na secreccedilatildeo de muco (LOU
et al 1998 ISHII et al 2004 MUEHLMANN et al 2009)
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
Os desafios indutores de alteraccedilotildees na funcionalidade dos macroacutefagos
alveolares resultando em quimiotaxia de neutroacutefilos para as vias aeacutereas levam a um
quadro inflamatoacuterio pulmonar acompanhado de hipersecreccedilatildeo de muco Por sua vez
o muco presente nas vias aeacutereas possui uma seacuterie de funccedilotildees essenciais que
coletivamente levam a proteccedilatildeo das vias aeacutereas Juntamente com as ceacutelulas
epiteliais forma o sistema mucociliar que associado agrave tosse eacute essencial para
manter as vias aeacutereas desobstruiacutedas (ADLER 2005)
Por outro lado a produccedilatildeo excessiva de muco representa um fator importante
de morbidade e mortalidade nas doenccedilas das vias aeacutereas (THORNTON e
SHEEHAN 2004) Assim a resposta imunoloacutegica do epiteacutelio das vias aeacutereas frente
a infecccedilotildees virais e bacterianas e endotoxinas inaladas eacute caracterizada pela
liberaccedilatildeo de citocinas e pela produccedilatildeo de mucinas para prover proteccedilatildeo adicional
(HODGSON et al 2003 GERBER et al 2004 LORA et al 2005) Entretanto nos
quadros inflamatoacuterios os danos teciduais substanciais podem levar a produccedilatildeo
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excessiva de muco e comprometimento da funccedilatildeo respiratoacuteria (LORA et al 2005
ROBINSON 2005)
O muco eacute uma mistura de aacutegua (~95) eletroacutelitos (~1) lipiacutedios (~1)
proteiacutenas (2-3) enzimas proteiacutenas seacutericas e mucinas (GERBER 2001) As
mucinas glicoproteiacutenas oligomeacutericas representam um constituinte importante do
muco sendo o gene responsaacutevel pela produccedilatildeo de mucinas o MUC5 (THORNTON
e SHEEHAN 2004)
Nas vias aeacutereas a produccedilatildeo de mucinas ocorre predominantemente pelas
ceacutelulas caliciformes do epiteacutelio e em menor parte nas glacircndulas da submucosa
(GERBER et al 2004 THORNTON e SHEEHAN 2004) A produccedilatildeo de
quantidades excessivas de muco pode representar a causa direta de obstruccedilatildeo
bronquial podendo amplificar o efeito de estreitamento luminal da broncoconstricccedilatildeo
e estar associada ao comprometimento da funccedilatildeo pulmonar tosse e capacidade
reduzida para a corrida em atletas humanos (HALLSTRAND et al 2007) e em
cavalos de corrida (CHRISTLEY et al 2001 HOLCOMBE et al 2006)
Assim a quantidade de muco secretado apresenta uma correlaccedilatildeo estreita
com a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas (GERBER et al 2004 ROBINSON et al 2003
HOLCOMBE et al 2006 ROBINSON 2005) De fato haacute uma evidente associaccedilatildeo
entre a hipersecreccedilatildeo de muco e presenccedila de quantidades aumentadas de
neutroacutefilos nas secreccedilotildees respiratoacuterias em seres humanos e em cavalos
(HODGSON et al 2003 ROBINSON et al 2003 ADLER 2005) Contagens de
neutroacutefilos no LBA menores que 30 ceacutelulasμL correspondem a pequenas
quantidades de muco nas vias aeacutereas e os acuacutemulos de secreccedilatildeo aumentam
quando as quantidades de neutroacutefilos estatildeo entre 30 e 100 ceacutelulasμL Entre 100 e
1000 ceacutelulasμL ocorre obstruccedilatildeo mensuraacutevel das vias aeacutereas Possivelmente esse
mecanismo pode estar relacionado com a secreccedilatildeo de proteiacutenas pelos neutroacutefilos
(ROBINSON et al 2003) De fato jaacute foi demonstrado que o neutroacutefilo secreta
elastase a qual estaacute associada com um aumento nas secreccedilotildees relacionadas com a
expressatildeo do gene MUC5 (SHAO e NADEL 2005) e metaplasia de ceacutelulas
caliciformes (VOYNOW et al 2004)
A expressatildeo anormal de neutroacutefilos e de moleacuteculas de adesatildeo em indiviacuteduos
com asma e doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC) foi demonstrada por
GABRIJELCIC et al (2003) Aleacutem do aumento no nuacutemero de neutroacutefilos tambeacutem
foram observados diferentes padrotildees de ativaccedilatildeo e niacuteveis aumentados de elastase
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neutrofiacutelica e IL-8 Estes uacuteltimos bem como a expressatildeo do gene MUC5 estatildeo
associados a um aumento no estresse oxidativo pulmonar (DROST et al 2005
SHAO e NADEL 2005)
A associaccedilatildeo entre a severidade da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas e o estresse
oxidativo em cavalos com ORVA foi relatada por KIRSCHVINK et al (2008) os
quais relacionaram a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas ao aumento da glutationa oxidada
do aacutecido uacuterico e de isoprostano (8-iso-PGF2α) no LBA
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO
Estresse oxidativo eacute o termo utilizado para descrever os danos causados
quando as espeacutecies reativas do oxigecircnio (ROS) superam a capacidade de defesa
antioxidante do indiviacuteduo (WOOD et al 2003)
Entretanto tanto as ROS como as espeacutecies reativas do nitrogecircnio (RNS)
ocorrendo em concentraccedilotildees pequenas a moderadas apresentam importante papel
na fisiologia celular incluindo a defesa contra invasores e atuando em diversas vias
de sinalizaccedilatildeo celular e na induccedilatildeo da resposta mitogecircnica O estresse oxidativo
propriamente dito ocorre quando o sistema redox sofre desequiliacutebrio pela produccedilatildeo
aumentada de ROS eou RNS ou produccedilatildeo reduzida de antioxidantes (VALKO et al
2007)
Os pulmotildees encontram-se sujeitos ao estresse oxidativo pois estatildeo
diretamente expostos a quantidades muito elevadas de oxigecircnio o que torna
imperativo que este oacutergatildeo possua um arsenal para a defesa contra possiacuteveis
ataques oxidativos Portanto os pulmotildees satildeo providos de um desenvolvido sistema
de defesa endoacutegeno constituiacutedo de agentes chamados antioxidantes Os
antioxidantes ajudam os pulmotildees a se livrarem dos efeitos de uma variedade de
oxidantes provenientes do oxigecircnio (ROS) como o acircnion superoacutexido radical
hidroxila peroacutexido de hidrogecircnio e do nitrogecircnio (RNS) como o oacutexido niacutetrico (NO)
peroxinitrito e nitritos endoacutegenos e do ambiente Os principais sistemas
antioxidantes natildeo enzimaacuteticos dos pulmotildees satildeo a glutationa a vitamina C a
vitamina E o beta-caroteno e o aacutecido uacuterico enquanto os antioxidantes enzimaacuteticos
satildeo as superoacutexido dismutases a catalase e as peroxidases (RAHMAN et al 2006)
(FIGURA 4)
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FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE O2- AcircNION SUPEROacuteXIDO NO OacuteXIDO NIacuteTRICO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO ONOO- PEROXINITRITO FE2+ IacuteON FERROSO GPX GLUTATIONA PEROXIDASE FONTE RAHMAN et al (2006)
O estresse oxidativo pode resultar em muitos prejuiacutezos agraves funccedilotildees das vias
aeacutereas incluindo a contraccedilatildeo da musculatura lisa das vias aeacutereas a induccedilatildeo de
hiperresponsividade das vias aeacutereas a hipersecreccedilatildeo de muco danos ao epiteacutelio
respiratoacuterio e aumento da permeabilidade capilar (WOOD et al 2003)
A fisiopatologia da asma e da DPOC caracteriza-se por inflamaccedilatildeo crocircnica
localizada e estresse oxidativo O estresse oxidativo ocorre pelo aumento de
agentes oxidantes que satildeo inalados bem como por grandes quantidades de ROS
liberadas das ceacutelulas inflamatoacuterias Niacuteveis aumentados de ROS aumentam a
resposta inflamatoacuteria diretamente ou via formaccedilatildeo de produtos da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica levando a um aumento na severidade da doenccedila (KIRKHAM e RAHMAN
2006)
A peroxidaccedilatildeo dos lipiacutedios da membrana celular leva a geraccedilatildeo de
isoprostanos (FIGURA 5) um composto bioativo semelhante agraves prostaglandinas Os
isoprostanos satildeo produzidos independentemente das enzimas ciclooxigenases via
peroxidaccedilatildeo do aacutecido aracdocircnico catalizada por ROS apresentando potente efeito
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constritor na musculatura lisa respiratoacuteria hiperresponsividade e exsudaccedilatildeo de
plasma nas vias aeacutereas (WOOD et al 2003)
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA ASMA IL INTERLEUCINA TH2 CEacuteLULAS T-HELPER TIPO 2 ROS ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO O2
- AcircNION SUPEROacuteXIDO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO NADPH NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO REDUZIDA NADP NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO SOD SUPEROacuteXIDO DISMUTASE EPO PEROXIDASE EOSINOFIacuteLICA MPO MIELOPEROXIDASE NF FATOR DE TRANSCRICcedilAtildeO NUCLEAR FONTE WOOD et al (2003)
O oacutexido niacutetrico (NO) sintetizado enzimaticamente pela oxidaccedilatildeo do
aminoaacutecido L-arginina para L-citrulina apresenta diversas funccedilotildees fisioloacutegicas nas
vias aeacutereas como o relaxamento da musculatura lisa a regulaccedilatildeo da responsividade
e da permeabilidade das vias aeacutereas e na defesa contra invasores Contudo em
altas concentraccedilotildees o NO apresenta diversos efeitos proacute inflamatoacuterios participando
da infiltraccedilatildeo de ceacutelulas inflamatoacuterias e apresentando efeitos citotoacutexicos sobre
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diversas ceacutelulas tal como a ceacutelula do epiteacutelio respiratoacuterio especialmente por
interagir com o acircnion superoacutexido formando o peroxinitrito (REDINGTON 2006)
As ceacutelulas inflamatoacuterias recrutadas agraves vias aeacutereas do indiviacuteduo asmaacutetico
apresentam excepcional capacidade de produccedilatildeo de oxidantes Eosinoacutefilos
neutroacutefilos e macroacutefagos bem como ceacutelulas do epiteacutelio respiratoacuterio podem gerar
oxidantes Inicialmente ocorre a formaccedilatildeo de acircnion superoacutexido no complexo
dependente de NADPH oxidase na membrana celular no sistema xantina oxidase
citosoacutelico e na cadeia respiratoacuteria mitocondrial (FIGURA 6) (CARAMORI e PAPI
2004) A seguir a interaccedilatildeo do acircnion superoacutexido com outros oxidantes e o ataque
oxidativo ao tecido pulmonar leva agrave peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e danos ao tecido pulmonar
(MILLS e HIGGINS 1997 KIRKHAM e RAHMAN 2006)
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS FONTE CARAMORI E PAPI (2004)
O estudo do estresse oxidativo na asma se utiliza de modelos que podem
envolver os murinos (MUEHLMANN et al 2009) ou mesmo os cavalos jaacute que estes
naturalmente desenvolvem a ORVA doenccedila respiratoacuteria com diversas similaridades
com a asma humana (DEATON 2006)
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Nos cavalos com ORVA os marcadores de estresse oxidativo estatildeo
aumentados e diretamente relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e infiltrado
inflamatoacuterio neutrofiacutelico (KIRSCHVINK et al 2008) ao aumento da produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por neutroacutefilos sanguiacuteneos apoacutes a exposiccedilatildeo agrave poeira orgacircnica
ambiental (MARR et al 1997) e ao aumento da secreccedilatildeo de muco apresentando
tambeacutem concentraccedilotildees reduzidas de aacutecido ascoacuterbico no fluido do epiteacutelio respiratoacuterio
(DEATON 2006)
O exerciacutecio fiacutesico por sua vez tambeacutem pode causar estresse oxidativo nas
vias aeacutereas em atletas humanos e em cavalos pela geraccedilatildeo de ROS e RNS (MILLS
e HIGGINS 1997 ART e LEKEUX 2005 KIRSCHVINK et al 2008)
Os cavalos de corrida apresentam a habilidade de aumentar o consumo de
oxigecircnio em 60 vezes durante o esforccedilo maacuteximo o que representa um fator de risco
ao estresse oxidativo nesses animais (ART e LEKEUX 2005)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica eacute o marcador de dano oxidativo poacutes exerciacutecio mais
estudado (DEATON e MARLIN 2003) Em atletas humanos houve aumento da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes a realizaccedilatildeo de ultramaratona (MASTALOUDIS et al
2004) mas o treinamento produziu efeitos beneacuteficos e reduccedilatildeo dos marcadores de
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes um periacuteodo de treinamento (MIYAZAKI et al 2001
BALOG et al 2006) Em cavalos o exerciacutecio submaacuteximo induziu um aumento nos
hidroperoacutexidos lipiacutedicos plasmaacuteticos dentro de 5 minutos apoacutes o teacutermino (DEATON e
MARLIN 2003)
As ROS e seus produtos como os peroacutexidos lipiacutedicos podem diretamente
danificar o tecido pulmonar e causar um incremento da pressatildeo vascular pulmonar
pela liberaccedilatildeo aumentada de mediadores inflamatoacuterios vasoconstrictores (pex
PAF) interferindo na atividade do NO como vasodilatador podendo assim contribuir
na patogecircnese da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) nos cavalos
atletas (MILLS e HIGGINS 1997)
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16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE)
A HPIE eacute caracterizada por hipertensatildeo pulmonar edema nas regiotildees de
troca gasosa ruptura dos capilares pulmonares e a presenccedila de sangue nas vias
aeacutereas (ERICKSON e POOLE 2007) sendo extremamente comum em cavalos de
corrida (PEREZ-MORENO et al 2009)
Tem-se relatado que a HPIE ocorre essencialmente em todos os cavalos
PSI de corrida em treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007) mas
tambeacutem constitui um problema em outras raccedilas de cavalos que realizam exerciacutecio
intenso como os trotadores e os quarto de milha e em cavalos realizando exerciacutecio
de menor intensidade como os cavalos de salto e traccedilatildeo (LAPOINTE et al 1994
ERICKSON e POOLE 2007 VICINO 2007)
O comprometimento ao rendimento desportivo causado pela HPIE natildeo havia
sido comprovado ateacute o estudo de HINCHCLIFF et al (2005a) quando demonstraram
que cavalos de corrida com HPIE grau 1 apresentaram 4 vezes mais possibilidades
de vencer em relaccedilatildeo a graduaccedilotildees mais elevadas de hemorragia
Cavalos PSI de corrida estatildeo sob maior risco de apresentar HPIE porque
apresentam pressatildeo capilar pulmonar mais elevada que cavalos de outras raccedilas e
atividades durante o esforccedilo maacuteximo (HACKETT et al 2003)
Adicionalmente a criaccedilatildeo seletiva de cavalos de corrida visando que sejam
cada vez mais capazes de atingir altas velocidades associado a consumo bastante
alto de oxigecircnio resultou em deacutebito cardiacuteaco substancial (WEST e MATHIEU-
COSTELLO 1994) e barreira alveacuteolo-capilar (BAC) bastante fina (WEST e
MATHIEU-COSTELLO 1999) A espessura meacutedia em micrometros do interstiacutecio da
BAC eacute 0175 plusmn 0010 em coelhos 0318 plusmn 0081 em catildees e 0390 plusmn 002 em
cavalos evidenciando que proporcionalmente a BAC dos cavalos eacute mais fina que a
de outras espeacutecies (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1999) Portanto haacute um dilema
envolvendo a evoluccedilatildeo da BAC dos cavalos Por um lado a necessidade de ser
extremamente fina para uma troca gasosa eficiente enquanto de outro a
necessidade de ser resistente o suficiente para suportar o estresse extremamente
alto na parede dos capilares pulmonares quando a pressatildeo capilar se eleva durante
o exerciacutecio (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
A pressatildeo hidrostaacutetica maacutexima nos capilares pulmonares humanos durante o
exerciacutecio supera 30 mmHg Nos cavalos PSI de corrida a pressatildeo capilar ultrapassa
35
100 mmHg aproximando-se da forccedila necessaacuteria para ocorrer a ruptura do colaacutegeno
que suporta a parede capilar na BAC (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
Quando o estresse na parede capilar se eleva demasiadamente ocorrem
alteraccedilotildees ultra-estruturais na BAC uma condiccedilatildeo conhecida como falecircncia por
estresse descrita em atletas de elite humanos e em cavalos (WEST 2000)
BIRKS et al (1997) demonstraram a falecircncia por estresse e consequumlente
ruptura dos capilares pulmonares em cavalos exercitando a altas velocidades
havendo maior risco de ocorrecircncia da HPIE quando encontraram-se sob importante
aumento da pressatildeo arterial pulmonar (FIGURA 7)
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) A ULTRAESTRUTURA CAPILAR NORMAL B RUPTURA DO ENDOTEacuteLIO CAPILAR (SETAS) COM ERITROacuteCITOS ADJACENTES (ASTERISCO) NOTA-SE TAMBEacuteM ERITROacuteCITOS NO ESPACcedilO ALVEOLAR (PONTAS DE SETAS) C ERITROacuteCITO NO INTERSTIacuteCIO (ASTERISCO) D RUPTURA DO EPITEacuteLIO ALVEOLAR (SETAS) A ALVEacuteOLO C CAPILAR BAR 2 microm FONTE BIRKS et al (1997)
36
Portanto a falecircncia por estresse dos capilares pulmonares eacute a teoria aceita
para a ocorrecircncia da HPIE sendo causada pela elevada pressatildeo transmural nos
capilares pulmonares resultado do aumento da pressatildeo arterial pulmonar somada agrave
pressatildeo pleural inspiratoacuteria negativa (WEST 2000) (FIGURA 8)
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) TTMP TENSAtildeO CIRCUNFERENCIAL OU EM ARCO CAUSADA PELA PRESSAtildeO TRANSMURAL CAPILAR TEL Eacute A TENSAtildeO LONGITUDINAL NOS COMPONENTES DA PAREDE ALVEOLAR ASSOCIADA COM A INFLACcedilAtildeO PULMONAR PARTE DESTA Eacute TRASMITIDA Agrave BAC TST Eacute A TENSAtildeO DE SUPERFIacuteCIE DA CAMADA SUPERFICIAL ALVEOLAR ESTA APARENTEMENTE EXERCE UMA FORCcedilA DE ACcedilAtildeO INTERNA PARA SUPORTAR O CAPILAR QUANDO ESTE INTUMESCE PARA DENTRO DO ESPACcedilO ALVEOLAR A ALTAS PRESSOtildeES TRANSMURAL CAPILARES PALV PRESSAtildeO ALVEOLAR PCAP PRESSAtildeO CAPILAR FONTE WEST (2000)
Diversos estudos estiveram envolvidos em avaliar a participaccedilatildeo do NO no
aumento da pressatildeo arterial pulmonar no cavalo durante o exerciacutecio e na
fisiopatologia da HPIE Inicialmente evidenciou-se que cavalos realizando exerciacutecio
intenso apresentam hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE) (CHRISTLEY
et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 DEMPSEY e WAGNER 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) o que resulta na inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO abolindo o
relaxamento vascular dependente do endoteacutelio (MILLS e HIGGINS 1997)
Portanto acreditou-se que a reduccedilatildeo da produccedilatildeo do NO durante o exerciacutecio
intenso poderia contribuir para a alta incidecircncia de HPIE nos cavalos de corrida
Contudo a administraccedilatildeo do antagonista da oacutexido niacutetrico sintase (NOS) N-nitro-L-
arginina metil ester (L-NAME) mostrou que o NO endoacutegeno resulta numa maior
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extraccedilatildeo de O2 no repouso e no exerciacutecio submaacuteximo mas natildeo causou alteraccedilatildeo no
exerciacutecio intenso (MANOHAR e GOETZ 1998 MANOHAR et al 2006) A
administraccedilatildeo de L-NAME por KINDIG et al (2000) resultou em agravamento da
HPIE nos cinco animais estudados contudo natildeo observou-se aumento da pressatildeo
arterial pulmonar
MANOHAR e GOETZ (1999) avaliaram os efeitos da infusatildeo intravenosa de
nitroglicerina em cavalos realizando exerciacutecio e natildeo observaram alteraccedilotildees sobre a
incidecircncia ou severidade da HPIE
Adicionalmente KINDIG et al (2001) estudaram os efeitos do exerciacutecio na
pressatildeo arterial pulmonar e na HPIE em cavalos inalando NO Comparados aos
controles o grupo que inalou o NO apresentou uma pequena mas consistente
reduccedilatildeo na pressatildeo arterial pulmonar maacutexima mas com um significativo aumento da
HPIE nesses animais avaliado pelo aumento na contagem do nuacutemero de eritroacutecitos
no LBA Os autores entenderam que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete em
parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou como agravou a HPIE
Portanto em face aos achados relacionados agrave participaccedilatildeo do NO e da NOS
no cavalo em exerciacutecio maacuteximo e na HPIE satildeo necessaacuterias outras investigaccedilotildees a
respeito dos efeitos da inibiccedilatildeo da NOS e da produccedilatildeo do NO na circulaccedilatildeo
pulmonar e na HPIE (KINDIG et al 2000)
Apesar da maior atenccedilatildeo aos efeitos da HPIE e da pressatildeo arterial pulmonar
em cavalos realizando exerciacutecios intensos a HPIE tambeacutem passou a ser
demonstrada em cavalos envolvidos em atividades de menor intensidade sugerindo
que outros mecanismos podem estar envolvidos na fisiopatologia (EPP et al 2006)
VICINO (2007) demonstrou a ocorrecircncia de HPIE em cavalos de salto sendo
que cavalos que participaram de provas na altura entre 130 m ndash 150 m
apresentaram maior incidecircncia que aqueles que saltaram provas entre 100 m ndash 120
m
Neste contexto a associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar jaacute foi
demonstrada anteriormente (McKANE et al 1993 SAacuteNCHEZ et al 2005) Em
concordacircncia o estudo epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) evidenciou
38
uma significativa associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos puro
sangue inglecircs (PSI) jovens durante treinamento para corrida
O processo de hemorragia pulmonar pode culminar em irritaccedilatildeo e inflamaccedilatildeo
das vias aeacutereas o que exacerbaria a doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
(ERICKSON e POOLE 2007) WEST e MATHIEU-COSTELLO (1999) sugerem que
alteraccedilotildees na BAC ativariam vias proacute inflamatoacuterias nas vias aeacutereas com a
participaccedilatildeo de LTB4 Possivelmente a membrana basal alveolar exposta apoacutes a
ruptura ativaria macroacutefagos alveolares sendo que estes satildeo ricos em LTB4
DERKSEN et al (2009) sugeriram uma hipoacutetese para a ocorrecircncia da HPIE
(FIGURA 9) onde a ocorrecircncia das altas pressotildees vasculares pulmonares levaria a
alteraccedilotildees venulares culminando na ruptura capilar sangramento inflamaccedilatildeo e
hemossiderose agravando o quadro da HPIE
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO DERSKEN et al (2009)
Contudo mediadores bem como os mecanismos inflamatoacuterios que estatildeo
envolvidos na fisiopatologia da HPIE ainda precisam ser esclarecidos
O diagnoacutestico da HPIE pode ser feito pela evidecircncia de sangue na traqueacuteia
visiacutevel atraveacutes de exame endoscoacutepico (HINCHCLIFF et al 2005b ERICKSON e
POOLE 2007) pela contagem de eritroacutecitos no LBA (MEYER et al 1998) ou pela
39
presenccedila de hemossideroacutefagos (macroacutefagos contendo hemossiderina ou eritroacutecitos)
no AT (EPPINGER 1990 MICHELOTTO JUacuteNIOR et al 2007) eou no LBA
(DOUCET e VIEL 2002 SAacuteNCHEZ et al 2005 BIAVA et al 2006) realizado uma
hora apoacutes o exerciacutecio A presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA eacute considerada a
forma mais sensiacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993)
Em resumo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas acompanhada de
hiperresponsividade e hipersecreccedilatildeo de muco denominada doenccedila inflamatoacuteria das
vias aeacutereas (DIVA) bem como a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) satildeo causas de enormes perdas econocircmicas e de queda de rendimento
desportivo interrupccedilatildeo nos treinamentos e de encerramento de campanha em
cavalos de corrida Apesar disso a maioria dos estudos sobre as doenccedilas
inflamatoacuterias das vias aeacutereas dos cavalos satildeo direcionados para a ORVA e a
fisiopatologia da DIVA ainda estaacute pouco esclarecida bem como os mecanismos
inflamatoacuterios da HPIE ainda precisam ser mais bem estudados
Tendo-se em vista estes aspectos a hipoacutetese levantada no presente estudo
foi de que o desafio ambiental e o exerciacutecio fiacutesico estejam acompanhados de
estresse oxidativo alterando o quadro inflamatoacuterio possivelmente por alterar a
produccedilatildeo de PAF no pulmatildeo com consequumlente alteraccedilatildeo da funcionalidade celular
e que a hemorragia pulmonar pode exercer influecircncia sobre essa situaccedilatildeo As
ceacutelulas estudadas foram os macroacutefagos alveolares os quais podem apresentar um
papel central na regulaccedilatildeo deste processo
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVOS GERAIS
Verificar alteraccedilotildees em paracircmetros cliacutenicos e inflamatoacuterios pulmonares em
cavalos puro sangue inglecircs (PSI) de corrida jovem submetidos ao desafio ambiental
e ao treinamento fiacutesico
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Avaliar os seguintes paracircmetros cliacutenicos e laboratoriais
- Avaliaccedilatildeo cliacutenica
- Avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas
- Avaliaccedilatildeo citoloacutegica das vias aeacutereas atraveacutes das teacutecnicas de aspirado
traqueal (AT) e de lavado broncoalveolar (LBA)
- Avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas
e a produccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos e nitritos no LBA
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por macroacutefagos alveolares
bem como a capacidade fagocitaacuteria e de adesatildeo
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por neutroacutefilos do sangue
perifeacuterico bem como a capacidade fagocitaacuteria
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 REAGENTES E SEDATIVOS
O BN52021 (Gingkolide B) foi obtido da Biomol (Plymouth Meeting PA USA)
Fura-2 AM (cat num F-0888) PAF (β-Acetyl-γ-O-hexadecyl-L-α-
phosphatidylcholine P-4904) foram obtidos da Sigma (St Louis MO USA) A
coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacuteticoreg) foi obtida da Laborclin (Pinhais PR Brasil) e
a acepromazina da Univet (Satildeo Paulo SP Brasil) A xylazina e o butorphanol foram
obtidos do laboratoacuterio Fort Dodge (Satildeo Paulo SP Brasil) Todos os demais
reagentes foram comprados da Sigma (St Louis MO USA)
32 ANIMAIS
Foram utilizados equinos machos adultos jovens (potros) da raccedila puro sangue
inglecircs (PSI) de cinco diferentes criatoacuterios (haras) da regiatildeo metropolitana de Curitiba
estado do Paranaacute (Haras Cifra e Haras dos Girassoacuteis em Piraquara Haras
Palmerini e Haras Belmont em Satildeo Joseacute dos Pinhais e Haras Santa Rita da Serra
em Tijucas do Sul e potros de quatro diferentes cocheiras no Jockey Club do
Paranaacute (Av Viacutector Ferreira do Amaral 2291 Tarumatilde Curitiba PR)
Inicialmente os potros foram divididos em trecircs grupos O primeiro grupo foi
denominado grupo condiccedilotildees naturais (CN n=45) compreendendo os potros dos
haras vivendo soltos em piquetes dia e noite alimentando-se de gramiacuteneas e
leguminosas da pastagem mais complemento peletizado fornecido no campo A
meacutedia de idade dos animais deste grupo foi de 145 plusmn 04 meses O segundo grupo
foi denominado grupo desafio ambiental (DA n=45) constituiacutedo por potros
estabulados por 30 dias com o propoacutesito de preparaacute-los para o iniacutecio de treinamento
Estes animais eram mantidos em grupos de 15 a 20 potros sendo que permaneciam
em baias individuais com dimensotildees de 35m x 35m x 35m em meacutedia em cama de
serragem e alimentados duas vezes ao dia com aveia mais raccedilatildeo peletizada e feno
de gramiacutenea e de alfafa A meacutedia de idade dos potros do grupo DA foi de 217 plusmn 29
meses O terceiro grupo foi denominado de grupo exerciacutecio (EX n=34) onde foram
incluiacutedos potros ineacuteditos (satildeo considerados ineacuteditos animais que ainda natildeo correram
42
em hipoacutedromos oficiais) mas que estavam em treinamento para corrida haacute
aproximadamente cinco meses e mantidos nas mesmas condiccedilotildees de estabulaccedilatildeo e
alimentaccedilatildeo que os potros do grupo DA Estes animais foram acompanhados
durante o periacuteodo de treinamento sendo que a avaliaccedilatildeo cliacutenica endoscoacutepica e a
colheita de LBA ocorreu 24 horas apoacutes seu primeiro exerciacutecio intenso (15 ms ndash 16
ms) em 800m ndash 1000m de distacircncia na pista de areia do Jockey Club do Paranaacute A
meacutedia de idade dos potros do grupo EX foi de 270 plusmn 03 meses
A obtenccedilatildeo de dados para o presente trabalho de pesquisa ocorreu durante
uma sequumlecircncia de experimentos independentes durante um periacuteodo de 18 meses
Durante este periacuteodo grupos de potros foram acompanhados ateacute se encontrarem
nas condiccedilotildees estabelecidas para cada grupo quando entatildeo foram avaliados As
amostras do grupo CN foram obtidas de oito diferentes experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois durante o inverno trecircs durante a primavera e um no outono
As amostras do grupo DA foram provenientes de seis experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois no inverno e dois no outono e para o grupo EX os resultados
advieram de amostras obtidas durante o veratildeo em cinco ocasiotildees e durante a
primavera em quatro totalizando nove experimentos independentes para este grupo
Os resultados apresentados para cada uma das anaacutelises provecircm de pelo menos
trecircs experimentos independentes
Todos os animais estudados eram pertencentes a estabelecimentos com
programa de desverminaccedilatildeo bimensal bem como foram todos vacinados
regularmente contra Influenza Equina e Herpes Viacuterus Equino tipos 1 e 4 A
alimentaccedilatildeo utilizada nos estabelecimentos que cederam os potros para o estudo
era similar bem como a anaacutelise da alimentaccedilatildeo utilizada para os potros dos trecircs
grupos natildeo diferiu no que se refere a constituintes essenciais que poderiam
influenciar nas avaliaccedilotildees realizadas no presente trabalho Os criteacuterios de inclusatildeo
para os potros dos trecircs grupos foram os estabelecidos e jaacute descritos previamente
nas caracteriacutesticas de cada grupo e a exclusatildeo do estudo ocorreu quando da
histoacuteria de doenccedila recente ou diferenccedilas em manejo
As comparaccedilotildees intergrupos foram feitas entre os grupos CN e DA (diferenccedila
ambiental) e entre os grupos DA e EX (diferenccedila no regime de exerciacutecio)
Na segunda etapa do trabalho dedicada ao estudo da hemorragia pulmonar
induzida pelo exerciacutecio (HPIE) avaliou-se somente os potros do grupo EX agora
com n=37 Este grupo foi dividido em subgrupos sendo o subgrupo HPIE pos (n=23
43
constituiacutedo por potros com qualquer percentual de hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo
citoloacutegica do LBA) e subgrupo HPIE neg (n=14 constituiacutedo por potros sem
hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA) Nesta etapa as comparaccedilotildees
realizadas foram entre os subgrupos HPIE pos e HPIE neg
33 ASPECTOS EacuteTICOS
Este trabalho de pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Experimentaccedilatildeo Animal (CEEA) do setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR sob o
nuacutemero de registro 168 e pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso de Animais (CEUA) da
Pontifiacutecia Universidade Catoacutelica do Paranaacute sob o nuacutemero de registro 129 e estaacute de
acordo com o Guiding Principles in the Care and Use of Animals
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA
Preacutevio agrave colheita de material procedeu-se a avaliaccedilatildeo cliacutenica de cada potro
iniciada pela histoacuteria incluindo possiacuteveis ocorrecircncias meacutedicas relevantes agrave sauacutede do
sistema respiratoacuterio manejo alimentaccedilatildeo desverminaccedilatildeo e vacinaccedilatildeo Na histoacuteria
incluiu-se tambeacutem a informaccedilatildeo sobre a ocorrecircncia de tosse espontacircnea quando em
piquetes na baia no momento da alimentaccedilatildeo ou durante o treinamento O exame
fiacutesico incluiu a observaccedilatildeo da presenccedila de secreccedilatildeo nasal estiacutemulo da tosse
palpaccedilatildeo de linfonodos submandibulares e retrofaringeanos auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e
auscultaccedilatildeo traqueal e pulmonar (McGORUM e DIXON 2007)
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS
A avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas foi realizada previamente a
realizaccedilatildeo do LBA com o animal tranquumlilizado atraveacutes da administraccedilatildeo de
acepromazina (acepran 1 Univet) (003 mgkg IM) e apoacutes 30 minutos seguindo-
se a administraccedilatildeo de xilazina (sedazine Fort Dodge) (03-05 mgkg IV) mais
butorfanol (torbugesic Fort Dodge) (005 mgkg IV) (HOFFMAN 1999 HEWSON e
VIEL 2002) Utilizou-se um fibroscoacutepio flexiacutevel Pentax de 170 cm de comprimento e
128 mm de diacircmetro para a avaliaccedilatildeo das vias aeacutereas superiores e inferiores ateacute a
bifurcaccedilatildeo da traqueacuteia
44
A presenccedila de foliacuteculos linfoacuteides na faringe foi graduada segundo RAKER e
BOWLES (1978) adotando-se a graduaccedilatildeo de I a IV (QUADRO 1) e graus III e IV
foram considerados como faringite
A movimentaccedilatildeo das cartilagens aritenoacuteides foi graduada de I a IV segundo
RACKESTRAW et al (1991) (QUADRO 2) e graus III e IV foram considerados como
anormais
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Faringe com poucos foliacuteculos claros na parede dorsal
Grau II Presenccedila de numerosos pequenos foliacuteculos juntamente a
hiperemia cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau III Presenccedila de grandes grupos de foliacuteculos hiperecircmicos
cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau IV Presenccedila de foliacuteculos grandes edematosos e hiperecircmicos
por toda a mucosa faringeana
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA FARINGE FONTE RAKER E BOWLES (1978)
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Movimentaccedilatildeo sincrocircnica e abduccedilatildeo completa das
cartilagens aritenoacuteides
Grau II Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo com abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) conseguida com a degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
Grau III Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo e a abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) natildeo eacute conseguida na degluticcedilatildeo nem na
oclusatildeo nasal
Grau IV
(Hemiplegia
Laringeana)
Cartilagem aritenoacuteide esquerda posicionada
medialmente na glote e natildeo apresenta movimento
quando da degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE I A IV FONTE RACKESTRAW et al (1991)
45
Especial interesse foi dado agrave presenccedila de muco no lume traqueal e sua
quantificaccedilatildeo atraveacutes de graduaccedilatildeo de 0 a 5 conforme GERBER et al (2004)
(FIGURA 10)
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME ENDOSCOacutePICO FONTE GERBER et al 2004
Quando da observaccedilatildeo de muco traqueal este foi aspirado atraveacutes de tubo
de silicone introduzido pelo canal de trabalho do endoscoacutepio sendo imediatamente
transferido para uma lacircmina de microscopia e deixado para secar ao ar As lacircminas
foram coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico Laborclin Pinhais PR
Brasil) e 500 ceacutelulas foram contadas em aumento de 1000X (HODGSON e
HODGSON 2003)
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o aspirado traqueal (AT)
contendo lt10 de linfoacutecitos lt1 de eosinoacutefilos e lt20 de neutroacutefilos (ROBINSON
2003 HODGSON e HODGSON 2007)
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)
Para a realizaccedilatildeo do LBA foi utilizado um cateter flexiacutevel de silicone
especiacutefico para a obtenccedilatildeo de LBA de equinos marca Cook (V-PBAL-300 Cook Vet
Products Hamburg Alemanha) de 300 cm de comprimento e 8 mm de diacircmetro
Este foi introduzido agraves cegas via nasotraqueal preferencialmente do lado direito ateacute
se alojar em um brocircnquio quando o cuff na extremidade distal era inflado com 5-10
mL de ar Utilizou-se 300 mL de soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada (PBS) esteacuteril e
com heparina soacutedica (5 UImL de PBS) preacute-aquecidos a 37oC (HOFFMAN 1999
PICKLES et al 2002abc MORI et al 2003 RIIHIMAumlKI et al 2008b) O PBS era
infundido em aliacutequotas de 120 mL (HEWSON e VIEL 2002) aspirando-se
46
gentilmente apoacutes cada aliacutequota e dispensando-se o LBA recolhido em frascos
plaacutesticos esteacutereis mantidos em isopor com gelo Este procedimento foi repetido ateacute
que o volume de 300 mL era totalmente empregado O material recolhido foi mantido
refrigerado em isopor com gelo ateacute a chegada ao Laboratoacuterio de Metabolismo
Celular no Departamento de Fisiologia do Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR
para o processamento em menos de 3 horas apoacutes a colheita (PICKLES et al 2002c
VIEL e HEWSON 2003)
No laboratoacuterio o LBA era centrifugado a 340g (1300 rpm) por seis minutos a
40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA) e o pellet obtido foi
ressuspendido em 2 mL de PBS para a contagem do nuacutemero total de ceacutelulas
nucleadas (NTCN)
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA
A contagem do NTCN foi realizada usando-se a cacircmara de Neubauer Uma
aliacutequota da suspensatildeo de ceacutelulas foi diluiacuteda 110 em PBS em um frasco de
centrifugaccedilatildeo de 15 mL de fundo cocircnico (Eppendorf) Desta uma aliacutequota de 50 microL
foi misturada a 50 microL do corante vital Azul de Tripan para a contagem das ceacutelulas
vivas A partir do nuacutemero de ceacutelulas vivas por mililitro da suspensatildeo de ceacutelulas a
concentraccedilatildeo da suspensatildeo de ceacutelulas foi ajustada para 5 x 106 ceacutelulasmL para as
avaliaccedilotildees da atividade de macroacutefago alveolar (fagocitose produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e adesatildeo ndash ver toacutepicos 315 316
317 e 318)
Para a avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA lacircminas para microscopia
foram preparadas a partir de 10 μL da suspensatildeo de ceacutelulas distribuiacutedos de forma
circular sobre a lacircmina secadas ao ar e coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski
(Panoacutetico Laborclin Pinhais PR Brasil) (HEWSON e VIEL 2002) e 500 ceacutelulas
foram contadas em aumento de 1000X
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o LBA contendo em meacutedia
60 de macroacutefagos 35 de linfoacutecitos lt5 de neutroacutefilos lt2 de mastoacutecitos lt1
de eosinoacutefilos (ROBINSON 2003 MAZAN e HOFFMAN 2003 RICHARD et al
2009)
47
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957)
Uma porccedilatildeo correspondente a 90 mg de pellet de ceacutelulas do LBA foi
ressuspendido em um solvente extrator (metanolclorofoacutermio12 volvol) na
quantidade de 18 mL e sonicado (6 ciclos de 4 segundos) Os tubos foram
deixados em gelo por 20 minutos
Na etapa seguinte mais metanol foi adicionado (324 microL o caacutelculo eacute a
quantidade de sovente extrator x 0180 resultando na quantidade de metanol em
mililitros) para reduzir a densidade do liacutequido e possibilitar assim a decantaccedilatildeo do
material particulado insoluacutevel no meio Apoacutes o material foi centrifugado a 5000g por
10 minutos a 40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
O sobrenadante foi transferido para tubos de vidro e clorofoacutermio foi
adicionado (648 microL ou seja o dobro da quantidade de metanol utilizada
anteriormente)
Na sequumlecircncia o extrato foi lavado uma vez com 19 mL de aacutegua ultra pura O
sistema bifaacutesico formado foi submetido a uma intensa agitaccedilatildeo ateacute natildeo serem mais
distinguiacuteveis as duas fases (forma-se momentaneamente uma emulsatildeo) Nesta
etapa substacircncias com maior afinidade agrave aacutegua do que ao solvente orgacircnico satildeo
solubilizadas no meio aquoso e portanto se separam dos lipiacutedios
Apoacutes a reconstituiccedilatildeo espontacircnea do sistema bifaacutesico o sobrenadante
(aquoso) foi removido com o auxiacutelio de uma micropipeta cuidando-se para natildeo
retirar o que se encontrava abaixo
Em seguida foi adicionado o FSP (CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM NaCl 497
mM clorofoacutermio 30 metanol 490 aacutegua ultra pura 480) lentamente (para
evitar a formaccedilatildeo de emulsatildeo) e de maneira que as paredes do tubo fossem lavadas
com esta soluccedilatildeo Apoacutes a remoccedilatildeo do sobrenadante este procedimento foi repetido
mais duas vezes
A mistura de clorofoacutermio e metanol na qual estavam dissolvidos os lipiacutedios
foi evaporada em banho-maria a 370C sob corrente de nitrogecircnio O extrato lipiacutedico
seco foi armazenado a -800C em atmosfera de nitrogecircnio Para a determinaccedilatildeo da
bioatividade de PAF (toacutepico 310) esses extratos foram solubilizados em 100 microL de
DMSO sob agitaccedilatildeo intensa
48
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS
O sangue de cavalo foi colhido em bolsas de transfusatildeo (CPDA-1 JP
Induacutestria Farmacecircutica SA Satildeo Paulo Brasil) atraveacutes de punccedilatildeo venosa jugular
O sangue foi diluiacutedo 11 (vv) em PBS e 40 mL do sangue diluiacutedo foram
adicionados a tubos para centriacutefuga esteacutereis (tubos Falcon de 50 mL) sobre 8 mL de
Ficoll Paque Plus e centrifugado (400g por 40 minutos a 40C) para o isolamento das
ceacutelulas PMN por gradiente
Apoacutes a centrifugaccedilatildeo a camada superior composta por plasma soluccedilatildeo de
Ficoll e ceacutelulas mononucleares foi descartada A camada inferior composta
principalmente por PMNs e eritroacutecitos foi dividida em duas aliacutequotas iguais as quais
foram separadas em dois tubos para centriacutefuga A cada aliacutequota foi adicionada
soluccedilatildeo hemoliacutetica (NH4Cl 077 tris[hydroxymethyl]aminomethane 021 pH 74
soluccedilatildeo aquosa) para completar 50 mL e incubadas por 20 minutos a 370C em
estufa
A seguir a suspensatildeo celular livre dos eritroacutecitos foi centrifugada (400g 6
min 4oC) O sobrenadante foi descartado e o pellet de ceacutelulas (basicamente PMNs)
foi ressuspendido em 5 mL de PBS contendo glucose 5 mM A densidade de ceacutelulas
foi determinada em cacircmara de Neubauer e ajustada para 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL
A viabilidade celular foi determinada atraveacutes do corante vital Azul de Tripan e
resultou aproximadamente 95 A percentagem de neutroacutefilos na suspensatildeo de
PMNs foi superior a 90 determinada pela coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico
Laborclin Pinhais PR Brasil)
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE Ca++ EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE et al 2001)
Agrave suspensatildeo de PMNs (toacutepico 39) na densidade de 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL foi adicionado FURA-2 AM (Sigma soluccedilatildeo estoque 1 nM em DMSO)
para concentraccedilatildeo final de 1 microM A suspensatildeo foi incubada em ambiente escuro a
37oC por 45 minutos
Nesta etapa os PMNs incorporaram o FURA-2 AM um indicador fluorescente
de caacutelcio Quando o FURA-2 AM estaacute ligado ao Ca++ haacute reduccedilatildeo da eficiecircncia de
49
excitaccedilatildeo a 380 nm e aumento da eficiecircncia de excitaccedilatildeo a 340 nm observados no
comprimento de onda de emissatildeo de 510 nm Com isso eacute possiacutevel quantificar a
concentraccedilatildeo de Ca++ intracelular nas ceacutelulas carregadas com FURA-2 AM atraveacutes
da relaccedilatildeo da intensidade de emissatildeo a 510 nm entre os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo de 340 nm e de 380 nm (relaccedilatildeo 340380 nm)
Apoacutes a incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram lavadas duas vezes com soluccedilatildeo de
Ringer (NaCl 1425 mM KCl 40 mM CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM 50 mM 4-(2-
hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid glicose 50 mM pH 74 soluccedilatildeo
aquosa) para a remoccedilatildeo do FURA-2 AM que natildeo foi incorporado agraves ceacutelulas
As ceacutelulas entatildeo foram ressuspendidas em soluccedilatildeo de Ringer para uma
concentraccedilatildeo final de 225 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL Esta foi a preparaccedilatildeo utilizada
na leitura de fluorescecircncia
A suspensatildeo de ceacutelulas foi mantida em gelo ateacute a sua utilizaccedilatildeo Aliacutequotas de
2 mL eram previamente incubadas em banho-maria por 4 minutos a 37oC no escuro
(tubo envolto em papel alumiacutenio) previamente a serem transferidas para uma cubeta
para a leitura da fluorescecircncia em espectrofluoriacutemetro acoplado a um
microcomputador (RF5301PC Shimadzu Kyoto Japatildeo) controlado pelo software
Super Ion Probe (Shimadzu Kyoto Japatildeo) Durante esta incubaccedilatildeo as ceacutelulas que
seriam utilizadas como controle negativo para PAF foram tratadas com antagonista
de receptor de PAF BN52021 (Biomol soluccedilatildeo 10 mM em DMSO)
Foi utilizada excitaccedilatildeo dual com comprimentos de onda 340 nm e 380 nm
(janela de leitura de 2 segundos) com emissatildeo registrada a 510 nm A temperatura
foi mantida em 37oC pelo sistema termostatisado do aparelho A leitura da
fluorescecircncia consistiu primeiramente da obtenccedilatildeo de uma linha de base nos
primeiros 50 segundos Apoacutes esta leitura inicial foram adicionados 10 microL do extrato
lipiacutedico (toacutepico 38) agrave suspensatildeo de ceacutelulas seguindo-se a agitaccedilatildeo (por 3
segundos) com uma barra magneacutetica presente dentro da cubeta A leitura foi feita
entatildeo por mais 100 segundos
Para cada amostra foram realizados os procedimentos descritos na presenccedila
e na ausecircncia de BN52021 A resposta maacutexima obtida pelo tratamento da
suspensatildeo de PMNs com extrato lipiacutedico na presenccedila de BN52021 foi subtraiacuteda da
resposta maacutexima obtida na ausecircncia deste antagonista O resultado desta subtraccedilatildeo
foi utilizado como indicador semiquantitativo da bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico e os resultados foram expressos como relaccedilatildeo 340380 nm
50
Antes de analisar as amostras de extrato lipiacutedico para a bioatividade de PAF
a cada experimento a suspensatildeo de PMNs tratada com FURA-2 AM foi testada com
PAF (1-0-palmitil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina soluccedilatildeo estoque de 3 mM em
DMSO da Sigma) nas concentraccedilotildees de 1 10 e 100 nM e com 100 nM na presenccedila
de 150 microM de BN52021 (concentraccedilatildeo suficiente para antagonizar 102 nM de PAF)
A resposta dos PMNs de equinos aos padrotildees de PAF eacute mostrada na FIGURA 11
sendo representativa dos dados obtidos em todos os experimentos
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO REGISTRADA A 510 nm () SUSPENSAtildeO DE PMN () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 1 nM (diams) SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 10 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 100 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + BN52021 150 microM + PAF 100 nM A EMISSAtildeO BASAL DAS CEacuteLULAS PMN FOI REGISTRADA POR 50 SEGUNDOS PREVIAMENTE Agrave ADICcedilAtildeO DE PAF
Os PMNs do sangue de equinos foram utilizados no presente estudo como
uma ferramenta para a avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF (pelo influxo de Ca++ nos
PMNs induzido por PAF) Para a determinaccedilatildeo da viabilidade desta ferramenta
estudou-se a resposta dos PMNs do sangue de equino a diferentes concentraccedilotildees
de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na ausecircncia do antagonista de
PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose de neutroacutefilos e a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio por neutroacutefilos pelas teacutecnicas descritas
51
abaixo (ver toacutepicos 315 ndash fagocitose de macroacutefago alveolar 316 ndash produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar e 317 ndash produccedilatildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio por macroacutefago alveolar) sendo que para cada ensaio foram realizadas
quatro repeticcedilotildees Igualmente estudou-se a resposta do macroacutefago alveolar a
diferentes concentraccedilotildees de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na
ausecircncia do antagonista de PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose e a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem realizando-se quatro
repeticcedilotildees para cada anaacutelise
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)
Em microplaca de 96 poccedilos 250microL de reagente de Bradford (100mg de
Coomassie Blue 50 mL de etanol 95 + 100 mL de aacutecido fosfoacuterico 85 completar
com aacutegua ultra pura para 1000 mL) foi adicionado a 10 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA) Nesta etapa o
corante Comassie eacute complexado por proteiacutenas presentes na amostra o que muda a
sua cor
Apoacutes 5 minutos em temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada a
595 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-Rad
Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) A concentraccedilatildeo de proteiacutenas foi determinada
interpolando-se os valores de absorbacircncia numa curva padratildeo resultante de
concentraccedilotildees conhecidas de albumina seacuterica bovina (Sigma) Os resultados foram
expressos como miligramas de proteiacutenas por mililitro de LBA
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR e MARLETTA 1985)
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA foi utilizada como indicador da produccedilatildeo de
oacutexido niacutetrico na regiatildeo broncoalveolar
Em micro placa de 96 poccedilos adicionou-se 100 microL de reagente de Griess
(mistura de cloreto de naftiletilenodiamina a 005 e por sulfanilamida a 05 em
meio aacutecido proporcionado por H3PO4 a 25) a 100 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA)
52
A sulfanilamida (um derivado de anilina) reage com o aacutecido nitroso e apoacutes
rearranjos intramoleculares forma o iacuteon diazocircnio Apoacutes o iacuteon diazocircnio reage com a
naftiletilenodiamina (um derivado de naftilamina) para formar pigmento roacuteseo
Depois de 5 minutos na temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada
a 550 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-
Rad Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) Os resultados foram expressos como
absorbacircncia a 550 nm
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO
LBA (NOUROOZ-ZADEH et al 1994)
Utilizou-se uma aliacutequota de suspensatildeo de ceacutelulas de LBA na densidade de
15 x 106 ceacutelulasmL de LBA Esta foi ultrasonicada (6 ciclos de 4 segundos) em 1mL
de metanol sendo centrifugada em seguida a 5000g por 5 minutos a 40C
(Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
Uma aliacutequota de 50 microL de sobrenadante foi armazenada para posterior
mensuraccedilatildeo da concentraccedilatildeo total de proteiacutenas
Para cada amostra aliacutequotas de 90 microL foram depositadas em seis frascos
para centriacutefuga (de 15 mL Eppendorf) foi agitada no voacutertex e incubada por 30
minutos a temperatura ambiente A trecircs desses tubos foram adicionados 10 microL de
soluccedilatildeo metanoacutelica de trifenilfosfina (TPP Sigma) 10 mM para ocorrer a reduccedilatildeo
seletiva de hidroperoacutexidos (os grupamentos hidroperoacutexido especificamente os
presentes em lipiacutedios satildeo convertidos a grupamentos hidroxila pela trifenilfosfina)
As amostras contidas nos trecircs tubos restantes receberam apenas 10 microL de metanol
Todos os tubos foram agitados vigorosamente e entatildeo incubados em temperatura
ambiente por 30 minutos
Apoacutes adicionou-se a todos os tubos 900 microL de reagente de FOX2 Este
reagente deve ser preparado no momento do uso consistindo de xilenol laranja 100
microM hidroxitolueno butilado (BHT) 400 mM aacutecido sulfuacuterico 25 mM e sulfato ferroso
de amocircnio 250 microM em metanol 90 (vv em aacutegua) Apoacutes agitaccedilatildeo o meio
reacional foi incubado por mais 30 minutos a temperatura ambiente
Nesta etapa os caacutetions ferrosos (Fe2+) do reativo de FOX2 satildeo oxidados por
hidroperoacutexidos presentes na amostra (tanto pelos hidroperoacutexidos lipiacutedicos quanto
por outros tipos de hidroperoacutexidos presentes na amostra) Como todos os
53
hidroperoacutexidos lipiacutedicos das amostras tratadas com TPP foram reduzidos a
produccedilatildeo de Fe3+ seraacute menor nestas do que nas amostras natildeo tratadas com TPP
O Fe3+ formado eacute entatildeo quelado pelo xilenol laranja o que faz a cor deste
indicador passar de laranja a azul-puacuterpura (passa a absorver luz em 560 nm)
Passado o tempo de incubaccedilatildeo a absorbacircncia foi mensurada a 560 nm
utilizando-se um espectrofotocircmetro (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil
Satildeo Paulo)
Subtraiu-se entatildeo o valor da absorbacircncia das amostras tratadas com TPP
(sem hidroperoacutexidos lipiacutedicos) do valor da absorbacircncia das amostras sem TPP O
valor obtido nessa subtraccedilatildeo (referente apenas agrave quantidade de ferro oxidado por
hidroperoacutexidos lipiacutedicos) foi utilizado na foacutermula da curva padratildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio obtida com soluccedilotildees padratildeo de diferentes concentraccedilotildees (1000 500
250 125 62 31 e 16 microM) submetidas aos mesmos procedimentos descritos
acima para a dosagem de hidroperoacutexidos (com exceccedilatildeo ao tratamento com TPP) O
resultado obtido foi referente agrave concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos
Dividiu-se o valor da concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos pela
concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais do extrato metanoacutelico Os resultados foram
expressos como nmolesmg de proteiacutenas
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984)
Utilizou-se 300 microL de uma suspensatildeo de ceacutelulas de LBA em PBS na
densidade de 5 x 106 ceacutelulasmL que foram centrifugados (10600g por 20min a
4oC) para remoccedilatildeo de partiacuteculas
Apoacutes foi colocada em banho com gelo Uma aliacutequota de 10 microL desse extrato
de ceacutelulas foi adicionada a 990 microL de meio reativo (soluccedilatildeo aquosa de H2O2 20 mM
tris[hidroximetil] aminometano 005M e EDTA 025 mM pH 74)
Imediatamente utilizando-se um espectrofotocircmetro acoplado a um
microcomputador (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil Satildeo Paulo)
monitorou-se a absorbacircncia a 220 nm por 90 segundos a 370C com intervalos de 2
segundos entre leituras consecutivas
A degradaccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio pela catalase causa uma diminuiccedilatildeo
gradual na absorbacircncia do meio reativo a 220 nm a qual indica a atividade da
catalase no extrato de ceacutelulas Os valores de atividade da catalase foram corrigidos
54
pela concentraccedilatildeo de proteiacutenas do extrato de ceacutelulas (realizado conforme descrito
no toacutepico 311) e foram expressos como micromoles de H2O2minmg proteiacutenas
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA et al 1998)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL (= 5 x 105
ceacutelulaspoccedilo) e os macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A
suspensatildeo de ceacutelulas na densidade descrita foi obtida durante o processamento do
LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS e foram adicionados
20microL de zymosan corado com vermelho neutro (67 mgmL) mais 100 microL de PBS
sendo deixados a temperatura ambiente por 30 minutos
Em seguida depois de descartado o sobrenadante as ceacutelulas foram fixadas
com soluccedilatildeo de Baker (4 formaldeiacutedo 2 cloreto de soacutedio 1 acetato de caacutelcio
soluccedilatildeo aquosa) por 30 minutos
Apoacutes os poccedilos foram lavados com PBS para que o zymosan corado com
vermelho neutro natildeo fagocitado por macroacutefagos alveolares fosse retirado
Em seguida o corante vermelho neutro foi solubilizado em cada poccedilo com
200microL de soluccedilatildeo aacutecido-aacutelcool (aacutecido aceacutetico 1 etanol 50 soluccedilatildeo aquosa) e
deixado por 30 minutos
Apoacutes este periacuteodo a absorbacircncia foi mensurada a 550 nm Os resultados
foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 -
Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA et al 1998)
Estimou-se a produccedilatildeo de acircnions pela da formaccedilatildeo de formazan produto da
reduccedilatildeo do NBT (nitroblue tetrazolium) pelo acircnion superoacutexido Avaliou-se a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA
(phorbol myristate acetate) O PMA estimula o complexo NADPH oxidase na
membrana dos fagoacutecitos a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
55
mimetizando o resultado da fagocitose de um microorganismo (DEKKER et al
2000)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para a retirada das
ceacutelulas natildeo aderentes Em seguida adicionou-se a cada poccedilo 100 microL de PBS com
NBT 02 ou com NBT 02 mais PMA 11microM sempre em triplicatas para cada
potro
Apoacutes a incubaccedilatildeo por 1 hora a 370C e em ambiente escuro (a placa deve
estar envolta em papel alumiacutenio) a placa foi centrifugada (800g por 5 minutos a
40C) Em seguida o sobrenadante foi descartado e 100 microL de PBS foram
adicionados a cada poccedilo e a placa foi novamente centrifugada
Apoacutes o sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram fixadas com metanol
por 10 minutos Em seguida a placa passou por nova centrifugaccedilatildeo o sobrenadante
foi descartado e a placa foi deixada secar ao ar em estufa
Em seguida a placa foi lavada duas vezes com metanol 50 e o formazan
(produto da reaccedilatildeo entre o NBT e o acircnion superoacutexido) foi solubilizado atraveacutes da
incubaccedilatildeo por 30 minutos com 120 microL soluccedilatildeo aquosa de hidroacutexido de potaacutessio 2M
e 140 microL de dimetilsulfoacutexido por poccedilo
A absorbacircncia foi lida a 595 nm e os resultados foram corrigidos pela adesatildeo
de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago
Alveolar)
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK e MIZEL 1981)
Mensurou-se a produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) por macroacutefago
alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA atraveacutes da oxidaccedilatildeo do vermelho
fenol pela peroxidase onde esta enzima utiliza nesta reaccedilatildeo o H2O2 O composto
oxidado absorve luz em pH baacutesico com maacutexima intensidade em 550 nm
56
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS observando-se a retirada
de grumos presentes nos poccedilos Em seguida 100 microL de soluccedilatildeo de vermelho fenol
(PRS phenol red solution 140 mM NaCl 10 mM fosfato de potaacutessio 55 mM
dextrose 056 mM vermelho fenol 19 UmL de HRPO horse radish peroxidase pH
70 soluccedilatildeo aquosa) ou soluccedilatildeo de vermelho fenol + PMA 110nM foram adicionados
a cada poccedilo em triplicatas e deixados incubar por 1 hora a 370C no escuro
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo adicionou-se 10 microL de NaOH 1N para
interromper a reaccedilatildeo alcalinizar o meio e permitir a absorbacircncia da soluccedilatildeo que foi
lida a 595 nm apoacutes 30 minutos
Os resultados foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada
potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN e GORDON 1987)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para se selecionar as
ceacutelulas aderentes que a seguir foram fixadas com metanol 50 por 10 minutos
Apoacutes este periacuteodo o sobrenadante foi descartado e 100 microL de corante de
Giemsa a 02 foram adicionados a cada poccedilo e deixados por 40 minutos em
temperatura ambiente
Os poccedilos foram novamente lavados com PBS por duas vezes observando-se
a retirada de grumos nos poccedilos e 200 microL de metanol 50 foram adicionados
Apoacutes 30 minutos a absorbacircncia da suspensatildeo foi lida a 550 nm
A adesatildeo resultou menor no grupo DA (n=17) em comparaccedilatildeo ao grupo CN
(n=36) (P=0010) sendo que o grupo EX (n=26) apresentou adesatildeo maior que o
grupo DA (P=0001) (FIGURA 12) indicando diferenccedilas na capacidade de adesatildeo
em placa acriacutelica possivelmente devido a diferenccedilas no estado funcional das ceacutelulas
57
de cada grupo Por esta razatildeo utilizou-se o ensaio de adesatildeo de macroacutefago
alveolar realizado concomitantemente aos ensaios de funccedilatildeo de macroacutefago
(fagocitose e produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) a cada
experimento realizado durante o estudo A correccedilatildeo dos valores obtidos de
macroacutefago em funccedilatildeo da adesatildeo foi feito atraveacutes da divisatildeo da meacutedia final obtida
para o ensaio de funccedilatildeo de macroacutefago dividido pela meacutedia obtida no ensaio de
adesatildeo para cada potro avaliado e a cada experimento realizado
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 (ROSEN e GORDON 1987) aP=0010 vs CN e bP=0001 vs DA
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
A normalidade na distribuiccedilatildeo dos dados foi avaliada pelo teste de D‟Agostino
e Pearson Valores considerados outliers pelo teste de Grubb foram excluiacutedos das
anaacutelises Para os dados que apresentaram distribuiccedilatildeo normal dos valores
(distribuiccedilatildeo Gaussiana) (contagem percentual de linfoacutecitos concentraccedilatildeo total de
proteiacutenas do LBA bioatividade de PAF catalase hidroperoacutexidos nitritos fagocitose
de macroacutefago alveolar produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio
por macroacutefago alveolar) foi utilizado o teste t natildeo pareado Os dados com
distribuiccedilatildeo natildeo Gaussiana dos valores (contagens percentuais de neutroacutefilos de
58
eosinoacutefilos e de macroacutefagos multinucleados contagem do NTCN do LBA e adesatildeo
de macroacutefago alveolar) foram analisados pelo teste de Mann-Whitney A
comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos de funccedilatildeo de macroacutefago alveolar
estimulado e natildeo estimulado por PMA foi feita por teste t de Student natildeo pareado
Os achados cliacutenicos e endoscoacutepicos foram analisados por meio de teste de Mann-
Whitney A correlaccedilatildeo entre o percentual de um mesmo tipo celular no aspirado
traqueal e no lavado broncoalveolar foi analisada atraveacutes do teste de Spearman
Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas utilizando-se o programa GraphPad
Prism versatildeo 500 para Windows (GraphPad Software San Diego CA EUA) e os
valores apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia (SEM) Valores de
Plt005 foram considerados como significativos
4 RESULTADOS
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica
Nenhum dos potros dos grupos CN e DA apresentou tosse segundo o
histoacuterico obtido Contudo oito potros (235) do grupo EX apresentaram tosse
espontacircnea na cocheira ou durante o treinamento o que resultou em diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0002) (TABELA 1)
A presenccedila de corrimento nasal seroso (coriza) observada nos trecircs grupos
estudados estaacute demonstrada na TABELA 1 Natildeo houve diferenccedila significativa entre
os grupos apesar de o percentual de potros com coriza no grupo DA ter reduzido
em relaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
Os linfonodos submandibulares eou retrofaringeanos estiveram aumentados
em 382 222 e 382 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
natildeo havendo diferenccedila entre os grupos (TABELA 1)
A auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e traqueal resultou normal em todos os potros
avaliados dos trecircs grupos estudados Contudo sons pulmonares crepitantes foram
audiacuteveis em 28 156 e 115 dos potros avaliados nos grupos CN DA e EX
respectivamente havendo um aumento do percentual de crepitaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo DA em ralaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DE CORRIDA
Grupos Tosse
Espontacircnea
Corrimento
Nasal
Linfonodos
Auscultaccedilatildeo
Pulmonar
CN 034
(0)
1534
(441)
1334
(382)
136
(28)
DA 045
(0)
1145
(244)
1045
(222)
745
(156)
EX 834
(235)a
1534
(441)
1334
(382)
326
(115)
aP=0002 vs DA
60
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas
No iniacutecio da avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas primeiramente
considerando os foliacuteculos linfoacuteides faringeanos ou hiperplasia folicular linfoacuteide (HFL)
a distribuiccedilatildeo das diferentes graduaccedilotildees pode ser vista na TABELA 2
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGEANOS OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS DE I A IV SEGUNDO RAKER E BOLES (1978)
Grupos HFL I HFL II HFL III HFL IV
CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)
DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)
EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)
Considerando as graduaccedilotildees de HFL III e IV como faringite esta
anormalidade foi observada em 546 286 e 539 dos potros dos grupos CN
DA e EX respectivamente Houve uma significativa reduccedilatildeo no percentual meacutedio de
observaccedilotildees de faringite para o grupo DA em comparaccedilatildeo ao grupo CN (P=0024)
enquanto no grupo EX o percentual de faringites foi significativamente maior em
relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0039)
Com relaccedilatildeo ao aspecto morfoloacutegico da epiglote um potro do grupo DA e um
potro do grupo EX evidenciaram epiglote com aspecto fraacutegil sendo que os demais
potros foram normais
Com relaccedilatildeo agrave avaliaccedilatildeo funcional da laringe todos os potros foram normais
apresentando graduaccedilotildees I ou II (TABELA 3)
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE ACORDO COM RAKESTRAW et al (1991)
Grupos NLP I NLP II NLP III NLP IV
CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)
DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)
EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)
61
A quantidade de secreccedilatildeo observada no lume traqueal estaacute demonstrada na
TABELA 4
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 SEGUNDO GERBER et al (2004)
Grupos 0 1 2 3 4 5
CN 233
(61)
933
(273)
933
(273)
1133
(332)
233
(61)
033
(0)
DA 742
(167)
1242
(286)
1242
(286)
742
(167)
342
(70)
142
(24)
EX 327
(111)
727
(259)
727
(259)
627
(223)
427
(148)
027
(0)
Quantidade de secreccedilatildeo traqueal acima de grau 2 considerada passiacutevel de
prejuiacutezo agrave troca gasosa e ao rendimento desportivo foi observada em 666 547
e 630 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT)
Os achados de anaacutelise citoloacutegica diferencial para os principais tipos celulares
do AT para os trecircs grupos de potros estudados estatildeo demonstrados na TABELA 5
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN (n=20) DA (n=19) E EX (n=15) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
Grupos Mac Lin Neut Eos Mast Calic Multi Epit Sid
CN 429plusmn63 75
plusmn19
76
plusmn29
12
plusmn07
002
plusmn02
05
plusmn02
02
plusmn01
201
plusmn56
0
DA 591
plusmn41
141
plusmn24
85
plusmn23
11
plusmn05
0 01
plusmn01
11
plusmn02a
161
plusmn48
0
EX 593
plusmn42
134
plusmn23
171
plusmn49
09
plusmn03
0 05
plusmn03
08
plusmn03
71
plusmn32
09
plusmn04
Mac macroacutefago alveolar Lin linfoacutecitos Neut neutroacutefilos Eos eosinoacutefilos Mast mastoacutecitos Calic ceacutelulas caliciformes Multi macroacutefagos multinucleados Epit ceacutelulas epiteliais Sid hemossideroacutefagos aPlt0001 vs CN
62
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA)
As quantidades de LBA recuperado estiveram entre 54 e 59 do volume
infundido para os grupos CN (n=16) DA (n=23) e EX (n=16)
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
A contagem do NTCN e a contagem diferencial de ceacutelulas do LBA estatildeo
demonstradas na TABELA 6
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN (n=45) DA (n=40) E EX (n=34) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
CTCN
(ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Macroacutef
Multi
Hemosid
CN 395
plusmn 38
673
plusmn 17
294
plusmn 15
23
plusmn 04
05
plusmn 03
005
plusmn 004
04
plusmn 01
0
DA 343
plusmn 24
698
plusmn 14
281
plusmn 13
09
plusmn 02
12
plusmn 01
002
plusmn 002
11
plusmn 01d
0
EX 456
plusmn 28a
676
plusmn 18
229
plusmn 15
54
plusmn 11b
15
plusmn 07c
02
plusmn 01
13
plusmn 02
22
plusmn 06
CTCN = contagem total de ceacutelulas nucleadas Macroacutef = macroacutefagos Linfoacutec = linfoacutecitos Neutroacutef = neutroacutefilos Eosino = eosinoacutefilos Masto = mastoacutecitos Macroacutef Multi = macroacutefagos multinucleados Hemosid = hemossideroacutefagos aPlt001 vs DA bPlt0001 vs DA cPlt005 vs DA dPlt0001 vs CN
Hemossideroacutefagos foram observados somente no LBA dos potros do grupo
EX mais especificamente em 23 (622) deles representando 22 do total de
ceacutelulas A quantidade observada de hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 da
contagem citoloacutegica diferencial do LBA
A correlaccedilatildeo entre as contagens percentuais de um mesmo tipo celular no AT
e no LBA foi analisada para os potros do grupo CN (n=11) DA (n=18) e EX (n=12)
que tiveram material colhido para as duas teacutecnicas citoloacutegicas natildeo tendo sido
63
encontrada correlaccedilatildeo entre ambas as teacutecnicas de avaliaccedilatildeo citoloacutegica para
nenhuma das ceacutelulas
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF
A resposta dos neutroacutefilos do sangue de equino frente ao PMA e frente ao
PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na ausecircncia e na presenccedila
do antagonista de PAF BN52021 estaacute demonstrado nas FIGURAS 13 a 15
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF aP=0028 vs controle bPlt0001 vs sem BN52021 cP=0028 vs PMA
64
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0007) 10nM (aP=0003) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA e PAF 1 e 10nM
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF EM TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA ePlt0001 vs PAF 1nM e fPlt0001 vs PAF 1nM e 10nM
65
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF
Tambeacutem se estudou a resposta dos macroacutefagos alveolares de equino frente
ao PMA e frente ao PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 demonstrado nas
FIGURAs 16 a 18
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0003) 10nM (aPlt0001) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0010 vs PMA dPlt0001 vs PAF 01nM e PAF 1nM
66
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0037) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA e PAF 01nM dPlt0001 vs PAF 1nM
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 01nM e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA dPlt001 vs PAF 1nM e 10nM
67
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos
foi mensurada pelo influxo de Ca++ em ceacutelulas PMN de equinos (FIGURA 19)
Registrou-se uma baixa relaccedilatildeo 340380 nm para os grupos CN (0005 plusmn 0002
relaccedilatildeo 340380 nm) e DA (0006 plusmn 0002 relaccedilatildeo 340380 nm) representando um
baixo niacutevel de bioatividade de PAF no LBA dos potros avaliados nestes grupos
Contudo a bioatividade de PAF do grupo EX (0068 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm) foi
significativamente maior em comparaccedilatildeo ao grupo DA (P=0017) Um graacutefico
representativo da bioatividade de PAF em uma das amostras do grupo EX na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 pode ser visto na FIGURA
20
CN DA EX000
002
004
006
008
010 a
Re
laccedil
atildeo
34
03
80
nm
Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedicodas Ceacutelulas do LBA
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE AO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0017 vs DA
68
0 50 100
150
200
0
1
2
3
4
Tempo (segundos)
Bioatividade de PAFR
ela
ccedilatildeo
3403
80n
m
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm A AMOSTRA Eacute ADICIONADA Agrave SUSPENSAtildeO DE CEacuteLULAS PMN APOacuteS 50 SEGUNDOS DE LEITURA BASAL (SETA)
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi maior no grupo DA em relaccedilatildeo
ao grupo CN (014 plusmn 003 vs 003 plusmn 001 mg de proteiacutenasmL de LBA) (P=0001) O
grupo EX apresentou concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA (036 plusmn 006 mg de
proteiacutenasmL de LBA) significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001)
(FIGURA 21)
69
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0001 vs CN bPlt0001 vs DA
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos foi maior no LBA do grupo DA (019 plusmn 001
absorbacircncia 550 nm) em relaccedilatildeo ao grupo CN (014 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm)
(P=0011) O grupo EX apresentou uma reduccedilatildeo significativa na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA (008 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm) significativamente menor em
comparaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001) (FIGURA 22)
70
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0011 vs CN bPlt0001 vs DA
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (1047 plusmn 241 vs 66
plusmn 35 nmolesmg de proteiacutenas) (Plt0001) No grupo EX a concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos nas ceacutelulas do LBA apresentou reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo
DA (352 plusmn 84 vs 1047 plusmn 241 nmolesmg de proteiacutenas) (P=0007) (FIGURA 23)
71
Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos no LBA
CN DA EX0
50
100
150a
b
nm
ole
s
mg
de
pro
teiacuten
as
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX (n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO APRESENTADOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNA DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aPlt0001 vs CN bP=0007 vs DA
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA
No grupo EX a atividade da catalase nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol
H2O2minmg de proteiacutenas) (P=0002) natildeo havendo diferenccedila entre os grupos CN e
DA (FIGURA 24)
72
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO microMOL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOMINUTOMILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0002 vs DA
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
A fagocitose de macroacutefago alveolar foi significativamente maior no grupo DA
em comparaccedilatildeo ao grupo CN (223 plusmn 043 vs 072 plusmn 018 absorbacircncia 550
nmadesatildeo) (P=0002) Observou-se uma diminuiccedilatildeo na fagocitose no grupo EX em
relaccedilatildeo ao grupo DA (104 plusmn 027 vs 223 plusmn 043 absorbacircncia 550 nmadesatildeo)
(P=0006) (FIGURA 25)
73
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A FAGOCITOSE PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (FAGOCITOSEADESAtildeO) aP=0002 vs CN e bP=0006 vs DA
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar
A utilizaccedilatildeo de PMA aumentou significativamente a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido pelos macroacutefagos alveolares dos grupos DA (219 plusmn 053 vs 392 plusmn 062
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0049) e EX (060 plusmn 011 vs 090 plusmn 014
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0031) A produccedilatildeo basal de acircnion superoacutexido foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (219 plusmn 053 vs 025
plusmn 007 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo DA (060 plusmn 011 vs 219 plusmn 053 absorbacircncia 595
nmadesatildeo) (P=0001) A produccedilatildeo de acircnion superoacutexido estimulada por PMA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (392 plusmn 062 vs 046
plusmn 016 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
74
diminuiccedilatildeo na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido em comparaccedilatildeo ao grupo DA (090 plusmn
014 vs 392 plusmn 062 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) (FIGURA 26)
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0049 vs DA bP=0031 vs EX cPlt0001 vs CN dP=0001 vs DA ePlt0001 vs CNe fPlt0001 vs DAe
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
O PMA aumentou a produccedilatildeo de H2O2 pelos macroacutefagos alveolares nos
grupos CN (041 plusmn 008 vs 099 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0004) DA
(035 plusmn 005 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0002) e EX (010 plusmn
001 vs 034 plusmn 008 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) A produccedilatildeo basal de
H2O2 para o grupo EX foi significativamente menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (010 plusmn
001 vs 035 plusmn 005 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) Aleacutem disso a produccedilatildeo
75
de H2O2 estimulada por PMA diminuiu no grupo EX tendo sido significativamente
menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (034 plusmn 008 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia
595nmadesatildeo) (P=0006) (FIGURA 27)
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0004 vs CN bP=0002 vs DA cPlt0001 vs EX dPlt0001 vs DA eP=0006 vs DAe
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
Hemossideroacutefagos foram observados no LBA de 23 potros (622) sendo
que estes foram considerados no subgrupo HPIE pos A quantidade observada de
76
hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 A ausecircncia de hemossideroacutefagos foi
evidenciada em 14 potros (378) sendo que estes foram considerados para o
subgrupo HPIE neg
Dentre os potros avaliados 15 (405) deles (10 potros do subgrupo HPIE
pos e 5 potros do subgrupo HPIE neg) apresentaram mais de 5 de neutroacutefilos eou
mais de 1 de eosinoacutefilos na contagem diferencial de ceacutelulas indicando um perfil
citoloacutegico de LBA compatiacutevel com inflamaccedilatildeo pulmonar
Os valores do NTCN bem como da contagem diferencial de ceacutelulas para o
grupo EX e para os subgrupos estaacute demonstrado na TABELA 7
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX (n=37) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=23) E HPIE NEG (n=14)
CTCN (ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Siderof
Grupo EX
456 plusmn 28
676 plusmn 18
229 plusmn 15
47 plusmn 10
13 plusmn 06
02 plusmn 01
22 plusmn 35
HPIE pos
571
plusmn 78a
645
plusmn 22b
240 plusmn 20
56 plusmn 12
09 plusmn 07
02 plusmn 02
34 plusmn 37
HPIE neg
348 plusmn 38
725 plusmn 30
207 plusmn 25
35 plusmn 18
19 plusmn 11
03 plusmn 01
00
CTCN contagem total de ceacutelulas nucleadas Macrof macoacutefagos Linfoc linfoacutecitos Neutrof
neutroacutefilos Eosinof eosinoacutefilos Mastoc mastoacutecitos Siderof hemossideroacutefagos aP=0005
vs HPIE neg bP=0020 vs HPIE neg
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg
(018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm P=0042) (FIGURA 28)
77
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) e HPIE NEG (n=5) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO RELACcedilAtildeO 340380nm aP=0042 vs HPIE neg
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi significativamente maior no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (039 plusmn 008 vs 019 plusmn
004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) (FIGURA 29)
78
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=13) E HPIE NEG (n=12) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS POR MILILITRO DE LBA aP=0031 vs HPIE neg
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos resultou
significativamente reduzida em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (008 plusmn 003 vs
012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) (FIGURA 30)
79
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) E HPIE NEG (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 550 nm aP=0049 vs HPIE neg
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA dos potros do
subgrupo HPIE pos resultou significativamente maior que no subgrupo HPIE neg
(367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) (FIGURA 31)
80
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) E HPIE NEG (n=8) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS aP=0009 vs HPIE neg
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
Natildeo houve diferenccedila na fagocitose de macroacutefago alveolar entre os grupos
estudados
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-)
A produccedilatildeo basal de O2- por macroacutefagos alveolares resultou similar entre os
grupos estudados A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0047) mas natildeo no subgrupo HPIE pos
(FIGURA 32)
A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA foi significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (081 plusmn 011 vs 124 plusmn
015 absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0042) (FIGURA 32)
81
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) E HPIE NEG (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0047 vs HPIE neg bP=0042 vs HPIE neg e
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
A produccedilatildeo basal de H2O2 por macroacutefago alveolar foi similar entre os grupos
avaliados no presente estudo A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0002) mas natildeo no subgrupo HPIE
neg (FIGURA 33)
A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA resultou significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (025 plusmn 003 vs 067 plusmn 014
absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0001)
82
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) E HPIE NEG (n=6) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2 ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0002 vs HPIE neg bP=001 vs HPIE neg e
5 DISCUSSAtildeO
O estudo da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas de cavalos de corrida adultos jovens
em trecircs diferentes situaccedilotildees em seu ambiente natural foi possiacutevel devido agrave
utilizaccedilatildeo de um grande nuacutemero de animais Assim permitiu-se detectar diferenccedilas
entre os grupos mesmo havendo variaccedilotildees ambientais tais como estaccedilotildees do ano
condiccedilotildees climaacuteticas e diferenccedilas sutis em manejo Como os potros dos trecircs grupos
encontravam-se na mesma faixa etaacuteria de risco para as doenccedilas respiratoacuterias virais
e os experimentos foram realizados durante um mesmo periacuteodo as diferenccedilas entre
os grupos CN e DA foram consideradas como sendo devido ao ambiente e as
diferenccedilas entre os grupos DA e EX foram consideradas como sendo devido ao
treinamento
O grupo CN evidenciou um percentual de observaccedilotildees de faringite na
avaliaccedilatildeo endoscoacutepica (TABELA 2) maior que os 37 relatado por HOBO et al
(1995) em cavalos PSI de corrida de dois anos de idade Os potros deste grupo
foram mantidos integralmente em piquetes e nesta situaccedilatildeo a hiperplasia dos
foliacuteculos linfoacuteides da faringe em cavalos jovens pode ser uma resposta normal a
inalaccedilatildeo de antiacutegenos ambientais ou agentes infecciosos (HOLCOMBE e
DUCHARME 2007)
De fato as vias aeacutereas dos potros desse grupo deram mostra de estarem
sendo desafiadas pelo nuacutemero percentual de corrimento nasal linfonodos
aumentados e quantidades elevadas de secreccedilatildeo traqueal iguais aos demais
grupos (TABELAS 1 e 4) Possivelmente isso tambeacutem se deva a fatores climaacuteticos
pois no estudo de ROBINSON et al (2006) com cavalos de montaria de vaacuterias
idades aqueles que permaneceram fora dos estaacutebulos durante o inverno
apresentaram quantidades elevadas de muco traqueal No entanto diferentemente
do nosso estudo os cavalos avaliados por ROBINSON et al (2006) tiveram nuacutemero
percentual de neutroacutefilos aumentado na secreccedilatildeo traqueal enquanto os potros do
grupo CN resultaram em avaliaccedilatildeo citoloacutegica tanto de AT (TABELA 5) como de LBA
(TABELA 6) normais (ROBINSON 2003 HODGSON e HODGSON 2007)
evidenciando vias aeacutereas especialmente as vias aeacutereas inferiores saudaacuteveis
Com relaccedilatildeo ao desafio ambiental no presente estudo adotou-se um sistema
convencional de estabulaccedilatildeo pois estudos anteriores em modelos semelhantes ao
84
nosso jaacute demonstraram a presenccedila de altas concentraccedilotildees de endotoxinas
(BERNDT et al 2008) bem como de poeira e de aeroalergenos (WOODS et al
1993)
Contudo o desafio ambiental de 30 dias utilizado em nosso estudo resultou
em quadro comparaacutevel ao do grupo CN isento de processo inflamatoacuterio das vias
aeacutereas Possivelmente um periacuteodo maior de desafio pudesse causar um processo
inflamatoacuterio tal como foi demonstrado previamente por HOLCOMBE et al (2001)
onde potros da raccedila puro sangue aacuterabe que sofreram desafio ambiental de 90 dias
apresentaram aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no LBA Contudo no
estudo citado o material utilizado para a cama dos potros foi a palha que tambeacutem
representou um maior risco de desenvolvimento de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas dos
cavalos em outros estudos quando comparada a serragem utilizada na cama dos
potros do grupo DA (BURRELL et al 1996 VANDEPUT et al 1998 GERBER et
al 2000 KLEIBER et al 2005 DEWACHI et al 2006)
Entretanto ateacute o momento os efeitos dos fatores ambientais das cocheiras
nas vias aeacutereas foram relatados em sua maioria em cavalos apresentando ORVA e
natildeo em indiviacuteduos jovens e saudaacuteveis como os potros avaliados em nosso estudo
Nos animais com ORVA um curto periacuteodo de exposiccedilatildeo ambiental (6 a 48 horas)
em baia e recebendo alimentaccedilatildeo composta principalmente por feno causou
aumento da expressatildeo de algumas citocinas (pex IL-4 e IL-5) em alguns estudos
mas nenhuma alteraccedilatildeo em outros (GERBER et al 2000 AINSWORTH et al 2003
CORDEAU et al 2004 KLEIBER et al 2005) sendo que um longo tempo de
exposiccedilatildeo ambiental (variando de cinco semanas a trecircs meses) causou aumento da
expressatildeo de IFN-γ e IL-8 (AINSWORTH et al 2003) IL-9 (DEWACHI et al 2006)
IL-17 (DEBRUE et al 2005) e o desenvolvimento dos sinais cliacutenicos da ORVA
acompanhados de alteraccedilotildees na funccedilatildeo pulmonar (VANDEPUT et al 1998)
Contudo nos potros do grupo DA se evidenciou no AT (TABELA 5) e no LBA
(TABELA 6) um aumento significativo do nuacutemero percentual de macroacutefagos
multinucleados em comparaccedilatildeo ao grupo CN bem como nuacutemero percentual de
eosinoacutefilos acima do valor considerado limite para cavalos normais (ROBINSON
2003) sugerindo que houve uma resposta por parte do sistema de defesa nas vias
aeacutereas dos potros deste grupo
Os macroacutefagos multinucleados ou ceacutelulas gigantes multinucleadas satildeo
formados a partir da fusatildeo de dois ou mais macroacutefagos na resposta imune pulmonar
85
(ANDERSON et al 1999) representando especificamente uma resposta imune do
tipo Th2 com a participaccedilatildeo da IL-4 (HELMING e GORDON 2007) Em pessoas os
macroacutefagos multinucleados satildeo considerados como um achado indicativo de
reaccedilotildees inflamatoacuterias crocircnicas nas vias aeacutereas como a tuberculose por exemplo
(LEMAIRE et al 2006 HELMING e GORDON 2007) Em equinos satildeo escassos os
estudos envolvendo a citologia respiratoacuteria que descrevam o nuacutemero percentual
normal deste tipo celular De qualquer forma eacute relatado que pode ser observado em
pequeno nuacutemero em cavalos sem evidecircncias de doenccedila pulmonar sendo que uma
quantidade aumentada jaacute foi descrita associada agrave inflamaccedilatildeo crocircnica (DECONTO
1983 HODGSON e HODGSON 2007) Estas informaccedilotildees parecem natildeo corroborar
com o aumento no nuacutemero percentual de macroacutefagos multinucleados no grupo DA
em se tratando de potros jovens considerados saudaacuteveis o que demonstra a
necessidade de mais estudos para se entender o papel do macroacutefago multinucleado
no pulmatildeo saudaacutevel e na inflamaccedilatildeo pulmonar dos cavalos
Entretanto o nuacutemero percentual de eosinoacutefilos acima do limite normal no
LBA dos potros do grupo DA pode ser considerado como uma resposta ao
ambiente assim como eacute considerado em humanos (DENGUEZLI-BOUZGARROU et
al 2007) e jaacute relatado em cavalos (COUEumlTIL et al 2007)
O periacuteodo de treinamento por sua vez induziu inflamaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo EX O nuacutemero significativamente aumentado de potros com tosse
(TABELA 1) constituiu a evidecircncia cliacutenica sugerindo inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas nos
potros desse grupo Cavalos saudaacuteveis raramente tossem (ROBINSON 2007)
sendo a tosse um sinal cliacutenico comprovadamente associado agrave inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas (BURRELL et al 1996 McGROUM e DIXON 2007) CHRISTLEY et al
(2001) correlacionaram a tosse com a presenccedila de faringite sendo que tal
associaccedilatildeo tambeacutem foi observada no grupo EX (TABELAS 1 e 2) Adicionalmente
BEDENICE et al (2008) estudaram a relaccedilatildeo entre a tosse e a inflamaccedilatildeo pulmonar
e descreveram que os cavalos avaliados por apresentarem tosse tiveram contagens
percentuais de neutroacutefilos no LBA maiores que 5
No presente estudo um aumento no NTCN e nas contagens percentuais de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos do LBA (TABELA 6) confirmaram a presenccedila de inflamaccedilatildeo
pulmonar no grupo EX (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
COUEumlTIL et al 2007) A neutrofilia no LBA de cavalos de corrida jaacute foi
correlacionada a um baixo rendimento desportivo e constitui sinal chave para o
86
diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007) A eosinofilia no LBA de cavalos de
corrida por sua vez pode ser um achado transitoacuterio (VIEL e HEWSON 2003)
apesar de tambeacutem ter sido associada a um baixo rendimento desportivo aleacutem de
hiperresponsividade das vias aeacutereas em cavalos de corrida jovens (HARE e VIEL
1998) Portanto tais evidecircncias podem ser consideradas como um risco ao futuro
potencial atleacutetico dos potros do grupo EX
No presente estudo natildeo houve correlaccedilatildeo entre os achados citoloacutegicos de AT
e LBA para nenhum dos trecircs grupos estudados e esta falta de correlaccedilatildeo entre AT
e LBA jaacute foi relatada anteriormente Portanto entende-se que os epiteacutelios traqueal e
broncoalveolar respondem diferentemente aos agentes agressores sendo que a
avaliaccedilatildeo de cavalos com tosse ou diminuiccedilatildeo de rendimento desportivo deve ser
realizada por ambas as teacutecnicas associadas (MALIKIDES et al 2003 CHRISTLEY
RUSH 2007 HODGSON e HODGSON 2007)
A ligaccedilatildeo entre o exerciacutecio e a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas provavelmente
envolve diversos mediadores proacute-inflamatoacuterios que uma vez identificados poderatildeo
ser alvo para abordagens terapecircuticas com o objetivo de minimizar os efeitos
deleteacuterios da inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos PSI de corrida jovens Neste
contexto um dos mais potentes e versaacuteteis mediadores proacute inflamatoacuterios envolvidos
na inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas eacute o PAF (UHLIG et al 2005)
PAF eacute quimiotaacutetico para bem como produzido por eosinoacutefilos macroacutefagos e
neutroacutefilos em resposta a estresse fiacutesico ou quiacutemico apresentando muitos dos
criteacuterios essenciais de um mediador proacute inflamatoacuterio (OWEN et al 2005)
De fato estudos realizados in vitro demonstraram que o PAF pode induzir a
migraccedilatildeo de neutroacutefilos e monoacutecitos do cavalo (DAWSON et al 1988) Aleacutem disso
demonstrou-se a quimiotaxia de eosinoacutefilos e neutroacutefilos no trato respiratoacuterio de
murinos e humanos induzida por PAF (LEE et al 2002 ISHII et al 2004) Em
cavalos com ORVA a administraccedilatildeo intravenosa de PAF promoveu uma reduccedilatildeo de
leucoacutecitos no sangue perifeacuterico e apoacutes alguns minutos houve um aumento de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo seguido de uma deterioraccedilatildeo cliacutenica e da funccedilatildeo
respiratoacuteria (FAIRBAIRN et al 1996) Portanto apoiado nestes estudos e nos
resultados de aumento do NTCN e de neutrofilia e eosinofilia no LBA do grupo EX
(TABELA 6) eacute razoaacutevel assumir que o PAF possa contribuir para a induccedilatildeo da
inflamaccedilatildeo pulmonar observada nos potros PSI jovens em treinamento avaliados no
presente estudo
87
A inflamaccedilatildeo pulmonar tambeacutem estaacute associada a um aumento nas
concentraccedilotildees de proteiacutenas no LBA principalmente devido ao extravasamento de
plasma (TSANGARIS et al 2003) que pode ser resultado da accedilatildeo de vaacuterios
mediadores proacute inflamatoacuterios tal como o PAF
Um aumento da permeabilidade microvascular induzida pelo PAF resultando
em extravasamento de plasma e edema foi demonstrado previamente no estudo de
CLAVIJO et al (2001) Aleacutem disso WEST et al (1997) demonstraram o acuacutemulo de
um fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar de cavalos exercitados a velocidades
entre 13 ms e 16 ms No presente estudo o significativo aumento da concentraccedilatildeo
de proteiacutenas no LBA dos potros do grupo EX em comparaccedilatildeo ao grupo DA (FIGURA
21) confirma que a permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) estava
aumentada nos potros do grupo EX e o PAF pode estar envolvido neste mecanismo
Diferentemente o significativo aumento de proteiacutenas no LBA do grupo DA em
comparaccedilatildeo ao grupo CN deve envolver outros mecanismos inflamatoacuterios pois natildeo
houve biotavidade de PAF significativa no LBA destes dois grupos (FIGURA 19)
Contudo os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da disponibilidade de oacutexido niacutetrico (NO) (KIKUCHI et al
2008) Houve uma produccedilatildeo limitada de NO nas vias aeacutereas dos potros do grupo
EX esperada em cavalos realizando exerciacutecio moderado ou proacuteximo do maacuteximo
(MILLS e HIGGINS 1997) Isto pode ser explicado pela hipoxemia arterial induzida
pelo exerciacutecio (HAIE) descrita em atletas humanos (HOPKINS 2005) e em cavalos
exercitando a altas intensidades (MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
DEMPSEY e WAGNER 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005) A produccedilatildeo de NO requer
normoxia (GRIMMINGER et al 1995) sendo que a anoxia abole o relaxamento
vascular dependente do endoteacutelio e a hipoxemia degrada o NO (De MEY e
VANHOUTTE 1980) Adicionalmente ocorre uma inibiccedilatildeo do NO pela hemoglobina
sendo que esta inibiccedilatildeo eacute inversamente proporcional a saturaccedilatildeo de oxigecircnio
(IWAMOTO e MORIN 1993)
A inibiccedilatildeo da siacutentese de NO resultou no aumento da permeabilidade vascular
no estudo de KIKUCHI et al (2008) concordando com os nossos achados
referentes agrave bioatividade de PAF aumentada associada ao aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas e agrave diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de nitritos no LBA
do grupo EX
88
De fato no estudo de BRKOVIC e SIROIS (2007) o PAF e natildeo o NO foi
considerado o mediador proacute inflamatoacuterio e causador do aumento da permeabilidade
vascular enquanto o NO foi considerado como um co-fator para as atividades
inflamatoacuterias do PAF Na relaccedilatildeo entre PAF e NO na microcirculaccedilatildeo parece que
NO apresenta um efeito protetor atenuando as atividades inflamatoacuterias de PAF
tendo inclusive reduzido a formaccedilatildeo de PAF em vecircnulas mesenteacutericas em ratos
(NEVIN e BROADLEY 2002)
Contudo o NO tambeacutem tem papel preponderante na defesa das vias aeacutereas
(NEVIN e BROADLEY 2002 XU et al 2006) e o aumento na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA do grupo DA pode ser considerado uma resposta aos poluentes
ambientais existentes nas cocheira dos cavalos (WOODS et al 1993 BERNDT et
al 2008) Aleacutem disso o NO reage com o acircnion superoacutexido (O -2) para formar
peroxinitrito (ONOO-) um forte oxidante capaz de provocar lesatildeo no tecido pulmonar
resultando em peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (XU et al 2006)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi investigada no presente estudo atraveacutes da
concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA que resultou
aumentada no grupo DA em comparaccedilatildeo com o grupo CN (FIGURA 23) A
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi associada ao acuacutemulo de neutroacutefilos e produccedilatildeo de ROS por
esses nas vias aeacutereas de crianccedilas (BUSS et al 2000) e de pessoas com DPOC
(SANTUS et al 2005) Natildeo houve aumento de neutroacutefilos no LBA dos potros do
grupo DA mas os macroacutefagos alveolares dos potros deste grupo apresentaram
maior produccedilatildeo de ROS (FIGURAS 26 e 27) Isso pode ter contribuiacutedo para o
aumento da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA neste grupo como resultado da
modificaccedilatildeo da funcionalidade dos macroacutefagos alveolares induzida por fatores
ambientais como descrito em estudos em humanos (LUNDBORG et al 2007) e em
cavalos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento resultou em reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos lipiacutedicos no LBA em comparaccedilatildeo com o grupo DA No estudo de
MASTALOUDIS et al (2004) corredores de ultramaratona apresentaram aumento
da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica avaliada por marcadores do sangue destes atletas
Contudo outros relataram a reduccedilatildeo dos marcadores de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes
exerciacutecio intenso em corredores e esquiadores (URSO e CLARKSON 2003) em
indiviacuteduos treinados (BALOG et al 2006) em pessoas apoacutes 6 meses de
89
treinamento e tambeacutem apoacutes um programa de treinamento de 3 semanas (ALDRED
2007) e em pacientes com DPOC apoacutes programa de exerciacutecios (PINHO et al 2007)
Provavelmente essa diminuiccedilatildeo na peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA dos potros do
grupo EX deveu-se a mecanismos protetores pois o treinamento influencia de forma
positiva a capacidade antioxidante do organismo em atletas humanos (URSO e
CLARKSON 2003 PARK et al 2005 BALOG et al 2006 ALDRED 2007 PINHO
et al 2007) e em cavalos (KIRSCHVINK et al 2008)
URSO e CLARKSON (2003) relataram um aumento significativo da atividade
da catalase uma enzima antioxidante nos eritroacutecitos de atletas humanos apoacutes um
exerciacutecio de corrida de longa distacircncia corroborando com os nossos achados de
aumento significativo da atividade da catalase no LBA dos potros do grupo EX em
comparaccedilatildeo com o grupo DA (FIGURA 24)
No presente estudo a atividade de macroacutefago alveolar foi investigada devido
ao papel inerente desta ceacutelula na defesa pulmonar O aumento na atividade dos
macroacutefagos alveolares no grupo DA foi discutida acima e provavelmente deveu-se agrave
presenccedila de aeroalergenos e endotoxinas presentes nas cocheiras dos cavalos
(RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento reduziu tanto a fagocitose de macroacutefago
alveolar (FIGURA 25) como a capacidade de produccedilatildeo de ROS (acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio) (FIGURAS 26 e 27)
O macroacutefago alveolar eacute a ceacutelula efetora do sistema imune predominante nos
espaccedilos alveolares e nas vias aeacutereas condutoras responsaacutevel por ativar as
respostas inflamatoacuterias de forma suficiente a eliminar agentes agressores (PETERS-
GOLDEN 2004) Os macroacutefagos alveolares satildeo essenciais agrave sobrevivecircncia
devendo estar em harmonia com o sistema nervoso e endoacutecrino para responder a
estiacutemulos fisioloacutegicos bem como patoloacutegicos (GORDON 2007) sem exagerar na
resposta a fim de natildeo comprometer a troca gasosa (PETERS-GOLDEN 2004)
Apesar de KIZAKI et al (2008) terem demonstrado que o macroacutefago pode
sofrer uma adaptaccedilatildeo ao exerciacutecio melhorando sua funcionalidade os potros PSI
jovens em treinamento para corrida do grupo EX apresentaram supressatildeo da
imunidade especificamente a relacionada agrave resposta imune inata dos macroacutefagos
alveolares corroborando com estudos anteriores (HUSTON et al 1987 RAIDAL et
al 2000 RAIDAL et al 2001) que avaliaram o LBA de cavalos apoacutes exerciacutecio
90
realizado em esteira de alta velocidade e obtiveram resultados semelhantes aos
nossos
Outro aspecto ainda natildeo relatado em equinos mas demonstrado em
pessoas eacute que a melhora na atividade antioxidante induzida pelo exerciacutecio pode
resultar em diminuiccedilatildeo da atividade da NADPH oxidase na membrana dos
macroacutefagos consequumlentemente reduzindo a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio por essas ceacutelulas (PARK et al 2005) como observado no
grupo EX
Portanto a influencia do exerciacutecio sobre a funcionalidade das ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico como a observada nos macroacutefagos alveolares do grupo EX no
presente estudo explicaria a maior suscetibilidade apresentada por potros de corrida
sob treinamento intenso a infecccedilotildees respiratoacuterias (HINES et al 1996) Em
humanos o exerciacutecio intenso reduziu a capacidade de apresentaccedilatildeo de antiacutegeno
(CEDDIA e WOODS 1999) bem como a resistecircncia antiviral (DAVIS et al 1997) por
macroacutefagos O PMA (phorbol myristate acetate) utilizado nas avaliaccedilotildees da
atividade de macroacutefago alveolar (ver toacutepicos 4114 e 4115) teve como funccedilatildeo
estimular a NADPH oxidase a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
(DEKKER et al 2000 NAKAJIMA et al 2000) mimetizando o estiacutemulo provocado
por agentes infecciosos (JI 2008) Isto de fato ocorreu no grupo EX jaacute que os
macroacutefagos estimulados apresentaram aumento significativo na atividade
comparando-se aos macroacutefagos natildeo estimulados (FIGURAS 26 e 27) entretanto a
atividade ainda foi significativamente menor que no grupo DA evidenciando a
reduccedilatildeo na atividade de macroacutefagos induzida pelo exerciacutecio
Os efeitos do PMA sobre os macroacutefagos alveolares e sobre os PMNs do
sangue de equino podem ser apreciados no experimento de validaccedilatildeo da teacutecnica
de estudo da bioatividade de PAF (FIGURAS 13 a 18) A teacutecnica utilizada para o
estudo da bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos potros
empregando-se PMNs de equinos como ferramenta para se avaliar o influxo de Ca++
induzido por PAF foi ineacutedita em estudos em cavalos Anteriormente a mesma
avaliaccedilatildeo foi realizada utilizando-se PMNs de humanos (GRYNKIEWICZ et al 1985
MARATHE et al 2001) Anteriormente os PMNs de equinos foram empregados
com ecircxito no estudo da bioatividade de PAF em extrato lipiacutedico obtido a partir de
amostras de pulmatildeo de ratos no estudo da asma (MUEHLMANN et al 2009)
91
Portanto a validaccedilatildeo desta teacutecnica se fez necessaacuteria e importante para o
reconhecimento dos resultados obtidos para a bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos investigados No presente estudo o PAF
ativou os PMNs do sangue do cavalo assim como os macroacutefagos alveolares de
forma concentraccedilatildeo dependente Portanto o PAF tendo como uma de suas origens
o macroacutefago alveolar eacute capaz de modificar o comportamento de neutroacutefilos
sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos
neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a ORVA (MARR et al 2002)
As influecircncias exercidas pelo PAF na circulaccedilatildeo pulmonar permeabilidade
capilar pulmonar e na agregaccedilatildeo plaquetaacuteria estimulou o estudo da HPIE nos potros
avaliados no grupo EX Para tal o hemossideroacutefago no LBA foi escolhido como o
marcador da HPIE porque a colheita do LBA 24 horas apoacutes o exerciacutecio resultou que
a observaccedilatildeo endoscoacutepica de sangue na traqueacuteia bem como a contagem do
nuacutemero de eritroacutecitos no LBA natildeo fossem teacutecnicas diagnoacutesticas indicadas nesse
momento
A observaccedilatildeo do hemossideroacutefago no LBA mesmo se constituindo numa
forma confiaacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993) poderia natildeo servir
aos nossos propoacutesitos de identificar diferenccedilas em marcadores inflamatoacuterios e de
estresse oxidativo bem como na funcionalidade de macroacutefagos alveolares dentro
de um mesmo grupo ateacute entatildeo considerado homogecircneo Contudo o
hemossideroacutefago presente no LBA foi confirmado no presente estudo natildeo soacute como
um marcador confiaacutevel da HPIE como tambeacutem foi capaz de diferenciar subgrupos
significativamente distintos dentro do grupo EX
Interessantemente observou-se um percentual de HPIE (determinado pela
presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA) maior que o de inflamaccedilatildeo pulmonar (gt5
de neutroacutefilos eou gt1 de eosinoacutefilos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA)
Isso nos leva a pensar que a HPIE precede a inflamaccedilatildeo no pulmatildeo dos cavalos de
corrida tal como foi sugerido por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) mas que
requer outras investigaccedilotildees para excluir que o contraacuterio estivesse acontecendo isto
eacute um processo inflamatoacuterio em periacuteodo anterior do treinamento que pudesse ter
deixado alguma fragilidade pulmonar Possivelmente o estudo de potros PSI de
corrida tatildeo jovens e em iniacutecio de treinamento permitiu tal discussatildeo visto que se
considera que a HPIE acometa praticamente a totalidade dos cavalos PSI em
treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007)
92
A associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo jaacute foi demonstrada anteriormente
(McKANE et al 1993) e foi considerada como sendo significativa no estudo
epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) apesar dos mecanismos pelos quais
esta associaccedilatildeo ocorre ainda serem apresentados de forma hipoteacutetica como no
recente estudo de DERKSEN et al (2009)
No estudo de COUEumlTIL e DENICOLA (1999) cavalos de corrida com HPIE
apresentaram na avaliaccedilatildeo do LBA um aumento no NTCN associado agrave neutrofilia
De fato isto ocorreu no subgrupo HPIE pos e esses achados de citologia
demonstram que a HPIE esteve associada agrave inflamaccedilatildeo pulmonar nos potros do
subgrupo HPIE pos
Outro achado comum entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar eacute o aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA como observado no subgrupo HPIE pos em
comparaccedilatildeo com o grupo HPIE neg (FIGURA 29) evidenciando um aumento na
permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) no subgrupo HPIE pos
O acuacutemulo de fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar associado agrave
inflamaccedilatildeo pulmonar como demonstrado por TSANGARIS et al (2003) foi discutido
acima Contudo cavalos com HPIE exercitados a altas velocidades tambeacutem
apresentaram aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas no espaccedilo alveolar (WEST e
MATTHIEU-COSTELLO 1999)
Possivelmente o aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas associado agrave HPIE
possa ser devido ao aumento da pressatildeo transmural nos capilares pulmonares
resultando em falecircncia por estresse dos capilares como demonstrado por BIRKS et
al (1997) em cavalos exercitados nas mesmas velocidades que os potros avaliados
no presente estudo
Adicionalmente parece que a HPIE deflagrou um mecanismo inflamatoacuterio
causador de extravasamento de plasma no espaccedilo alveolar nos potros do subgrupo
HPIE pos e a bioatividade de PAF significativamente aumentada no subgrupo HPIE
pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (FIGURA 28) indica a participaccedilatildeo desse
mediador proacute inflamatoacuterio nesse evento
O extravasamento de plasma na microcirculaccedilatildeo pulmonar e a formaccedilatildeo de
edema pulmonar induzidos por PAF foram demonstrados anteriormente e jaacute
discutidos acima (EVANS et al 1987 CLAVIJO et al 2001) No caso da HPIE
provavelmente o PAF induza a formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular
atraveacutes da desorganizaccedilatildeo de proteiacutenas juncionais (JIANG et al 2008) Estes dados
93
concordam com a proposta de WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) de que a
altas pressotildees em capilares pulmonares ocorra a formaccedilatildeo de fendas nas junccedilotildees
entre as ceacutelulas endoteliais Desta forma as evidecircncias indicam que associado ao
evento mecacircnico na etiopatogenia da HPIE um evento inflamatoacuterio tambeacutem estaacute
presente o que representa um fator de risco para o agravamento do quadro
Adicionalmente os eventos inflamatoacuterios presentes na HPIE se constituem em
potencial aacuterea para investigaccedilotildees terapecircuticas visto que ainda natildeo se tem um
tratamento efetivo para a hemorragia pulmonar em cavalos atletas Recentemente
evidecircncias de que a suplementaccedilatildeo de cavalos atletas com aacutecidos graxos ocircmega-3
melhora a fluidez da membrana dos eritroacutecitos (PORTIER et al 2006) sugeriu que a
influecircncia beneacutefica na resposta inflamatoacuteria pulmonar pode reduzir os iacutendices HPIE
(ERICKSON et al 2007)
Portanto eacute razoaacutevel assumir um papel para o PAF na fisiopatologia da HPIE
pelas suas propriedades angiogecircnicas aleacutem de seus efeitos proacute inflamatoacuterios
(APONTE et al 2008) concordando com a hipoacutetese da patogecircnese da HPIE
proposta por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) onde a ruptura dos capilares
pulmonares resultaria em inflamaccedilatildeo sangramento e hemosiderose e
consequumlentemente a ocorrecircncia de angiogecircnese na circulaccedilatildeo bronquial e fibrose
agravando o quadro da HPIE
Adicionalmente ZHANG et al (2003) demonstraram que o aumento da
permeabilidade capilar induzido por PAF envolve a participaccedilatildeo de estresse
oxidativo visto que a enzima antioxidante superoacutexido dismutase (SOD) atenuou os
efeitos do PAF sobre o endoteacutelio De fato o grupo HPIE pos apresentou a
concentraccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos significativamente aumentada em comparaccedilatildeo
ao subgrupo HPIE neg sendo uma evidecircncia de estresse oxidativo no LBA dos
potros deste grupo possivelmente exacerbada pela alta quantidade de ferro da
hemossiderina presente no espaccedilo alveolar (DERSEN et al 2009)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica induz alteraccedilotildees patoloacutegicas no tecido pulmonar
destruindo pneumoacutecitos e ceacutelulas endoteliais do epiteacutelio levando a um aumento da
permeabilidade microvascular inibe a siacutentese e a liberaccedilatildeo de surfactante e interfere
negativamente na atividade do NO O conjunto dessas accedilotildees dos peroacutexidos lipiacutedicos
no pulmatildeo resulta em dano da estrutura pulmonar e leva agrave hipertensatildeo
representando um fator adicional contribuindo para a patogenia da HPIE (MILLS e
HIGGINS 1997)
94
Os macroacutefagos alveolares como ceacutelulas orquestradoras da resposta imune
pulmonar (PETERS-GOLDEN 2004) devem possuir um importante papel na
patogenia da HPIE visto que a obtenccedilatildeo de subgrupos significativamente distintos
a partir do grupo EX no presente estudo se deu pela presenccedila ou ausecircncia de
hemossideroacutefagos THACKER (2006) descreveu que os macroacutefagos ativados
secretam interleucina-1 (IL-1) que atrai e ativa a proliferaccedilatildeo de fibroblastos e a
siacutentese de colaacutegeno para reparar o tecido danificado Em estudo histopatoloacutegico do
pulmatildeo de cavalos com HPIE as aacutereas de ocorrecircncia de hemorragia caracterizaram-
se por hemossiderose e fibrose (DERKSEN et al 2009)
Adicionalmente WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) sugeriram o
envolvimento de leucotrieno B4 (LTB4) no mecanismo inflamatoacuterio envolvido na
HPIE apesar deste mecanismo ainda requerer comprovaccedilatildeo Neste evento a
ruptura do epiteacutelio alveolar com a exposiccedilatildeo da membrana ativaria os macroacutefagos
alveolares os quais satildeo ricos em LTB4
O LTB4 por sua vez tambeacutem conecta o PAF agrave HPIE HOPKINS et al (1997)
estudaram a HPIE em humanos avaliando o LBA de seis ciclistas de elite apoacutes 4 km
de esforccedilo maacuteximo Comparados aos controles os ciclistas que realizaram o esforccedilo
apresentaram altas concentraccedilotildees de eritroacutecitos proteiacutenas e LTB4 no LBA No
estudo citado exceto pelo aumento da LTB4 natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
percentual de neutroacutefilos e nem nos niacuteveis de IL-8 e TNF-α entre os grupos
suportando a hipoacutetese do estresse mecacircnico alterando a BAC na HPIE segundo a
conclusatildeo dos autores Contudo a associaccedilatildeo entre LTB4 e PAF foi demonstrada
anteriormente onde o receptor de LTB4 esteve envolvido com a quimiotaxia
pulmonar e degranulaccedilatildeo de neutroacutefilos induzida por PAF (GAUDREAULT et al
2005) Todavia ateacute o momento este tipo de associaccedilatildeo natildeo foi demonstrada em
cavalos apesar de ter-se relatada a neutrofilia nas vias aeacutereas de cavalos com
ORVA mediada por LTB4 (LINDBERG et al 2004) Portanto reunindo as
informaccedilotildees acima pode-se assumir a hipoacutetese de que a neutrofilia no LBA e o
aumento da permeabilidade da BAC nos potros do subgrupo HPIE pos tenha sido
induzida por PAF e mediada por receptor de LTB4
Adicionalmente reforccedila-se a evidecircncia da importacircncia dos macroacutefagos
alveolares na HPIE e por sua vez como a hemorragia pulmonar pode influenciar a
funcionalidade dos macroacutefagos Na primeira etapa do presente estudo descrevemos
a reduccedilatildeo na fagocitose e na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de
95
hidrogecircnio pelos macroacutefagos alveolares do grupo EX (FIGURAS 25 a 27) Contudo
evidenciamos que a HPIE agravou ainda mais esta situaccedilatildeo (FIGURAS 32 e 33)
pois a resposta de macroacutefago alveolar esteve significativamente reduzida no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg
A reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no subgrupo HPIE pos pode ser
explicada novamente pela HAIE com consequumlente inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO
(MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
favorecendo o aumento da permeabilidade capilar (KIKUCHI et al 2008)
provavelmente agravado pela ocorrecircncia de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica neste grupo (MILLS
e HIGGINS 1997)
Os mecanismos pelos quais o NO modula a permeabilidade microvascular
natildeo satildeo bem conhecidos Em cavalos de PSI de corrida a inibiccedilatildeo da NOS pela
administraccedilatildeo de L-NAME agravou a HPIE enquanto natildeo alterou a pressatildeo arterial
pulmonar (KINDIG et al 2000) e a inalaccedilatildeo de NO durante o exerciacutecio reduziu
ligeiramente a pressatildeo arterial pulmonar enquanto tambeacutem causou agravamento da
HPIE (KINDIG et al 2001) Parece que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete
em parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou mas agravou a HPIE
Adicionalmente corroborando com o aumento da bioatividade de PAF e
reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos o estudo de
KWASNIEWSKI et al (2008) com um modelo de lesatildeo e hemorragia em intestino
delgado demonstrou que o preacute tratamento com antagonista de PAF reduziu as
lesotildees enquanto a inibiccedilatildeo do NO endoacutegeno aumentou consideravelmente as
lesotildees hemorraacutegicas e a mortalidade Portanto o estudo citado demonstrou a
existecircncia da relaccedilatildeo entre PAF e NO na hemorragia ocorrida na microcirculaccedilatildeo
assim como reafirma o papel protetor do NO para os efeitos proacute inflamatoacuterios do
PAF (NEVIN e BROADLEY 2002 BRKOVIC e SIROIS 2007)
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
A hipoacutetese do presente estudo foi confirmada pois tanto o desafio ambiental
como o exerciacutecio causaram alteraccedilotildees no fluido broncoalveolar e modificaram a
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar Potros PSI de corrida jovem em treinamento para
corrida apresentaram depressatildeo da resposta imune inata mais especificamente do
macroacutefago alveolar induzida pelo exerciacutecio e agravada pela ocorrecircncia da HPIE
PAF influencia os neutroacutefilos do sangue bem como os macroacutefagos alveolares
de equinos e no presente estudo esteve presente na inflamaccedilatildeo pulmonar induzida
pelo exerciacutecio nos potros PSI durante o treinamento para corrida
Os achados relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e ao aumento da
bioatividade de PAF no fluido broncoalveolar dos potros exercitados estiveram
relacionados agrave HPIE e agrave presenccedila dos hemossideroacutefagos no LBA o que resultou
numa resposta de macroacutefago alveolar ainda mais reduzida
Desta forma assume-se que os resultados obtidos para o grupo EX podem
ser extrapolados para as populaccedilotildees similares de cavalos PSI jovens em
treinamento para a corrida
Finalmente sugere-se a conduccedilatildeo de novos estudos para o entendimento
dos mecanismos inflamatoacuterios envolvidos na HPIE bem como o papel do PAF neste
processo
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LISTA DE ABREVIATURAS
ACVIM American College of Veterinary Internal Medicine
AT Aspirado traqueal
CN Grupo Condiccedilotildees Naturais
DA Grupo Desafio Ambiental
DIVA Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas
DIVAI Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
DPOC Doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica
EX Grupo Exerciacutecio
HAIE Hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio
HPIE Hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
HRPO Horse radish peroxidase
IFN-γ Interferon gama
IL-1 Interleucina-1
IL-4 Interleucina-4
IL-8 Interleucina-8
IL-9 Interleucina-9
IL-17 Interleucina-17
LBA Lavado broncoalveolar
L-NAME N-nitro-L-arginina metil ester
LTB4 Leucotrieno B4
LTE8 Leucotrieno E8
MLCP Myosin light chain phophatase
NO Oacutexido niacutetrico
NOS Oacutexido niacutetrico sintase
NTCN Nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas
ORVA Obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas
PAF Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PAF-AH Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria acetilhidrolase
PAF-R Receptor de fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria
PBS Soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada
PMA Phorbol myristate acetate
PMN Polimorfonuclear
PRS Phenol red solution
PSI Puro sangue inglecircs
RNS Espeacutecie reativa do nitrogecircnio
ROS Espeacutecie reativa do oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Th2 Linfoacutecitos T helper 2
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE 20
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO SN-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL 24
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM
RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS 25
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E
SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE 30
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA
ASMA 31
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS 32
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO
A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR
(BAC) 36
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO
DERSKEN et al (2009) 38
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA
FARINGE 44
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS
ARITENOacuteIDES DE I A IV 44
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME
ENDOSCOacutePICO 45
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO
DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO
REGISTRADA A 510 nm 50
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA
ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 57
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA
AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 63
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS
DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 64
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO
ANTAGONISTA DE PAF BN52021 64
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO
ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 65
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 66
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR
PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF
BN52021 66
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++
EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 67
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO
EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA
ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 68
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A
PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 69
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO
SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 70
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX
(n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA 71
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) 72
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) 73
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) 74
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR
MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) 75
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) HPIE NEG (n=5) e EX NORMAL (n=4) 76
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE
POS (n=13) HPIE NEG (n=12) E EX NORMAL (n=8) 77
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) HPIE NEG (n=10) E EX NORMAL (n=7) 79
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS
CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) HPIE NEG (n=8) E EX NORMAL (n=5) 80
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS
POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) HPIE NEG (n=5) E EX NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE
POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 81
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE
PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) HPIE NEG (n=6) E EX
NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2
ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 82
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS
TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE
INGLEcircS DE CORRIDA 59
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGIANOS
OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS
DE I A IV 60
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS
CARTILAGENS ARITENOacuteIDES 60
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA
ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO
SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE
AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 61
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS
CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN
(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS
DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN
(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM
PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO
LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX E DOS
SUBGRUPOS HPIE POS HPIE NEG E EX NORMAL 76
RESUMO
A doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas (DIVA) e a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) satildeo comuns em cavalos de corrida resultando em interrupccedilatildeo no treinamento A hipoacutetese do presente estudo foi de que o ambiente e o exerciacutecio
causam estresse oxidativo produccedilatildeo do fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF) e inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas de potros PSI de corrida e que haacute uma relaccedilatildeo entre a DIVA e a HPIE Estudou-se potros PSI em ambiente natural (NC n=45) estabulados
por 30 dias (DA n=40) e treinados (EX n=34) Apoacutes os potros do grupo EX foram divididos em trecircs subgrupos HPIE pos (presenccedila de hemossideroacutefagos no lavado broncoalveolar - LBA) HPIE neg (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA) e EX
normal (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA e menos de 5 de neutroacutefilos e menos de 1 de eosinoacutefilos no LBA) Avaliou-se perfil citoloacutegico e paracircmetros do LBA relacionados a estresse oxidativo bioatividade de PAF atividade da catalase e
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar (MA) Os percentuais de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no LBA do grupo EX foram maiores (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 e 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectivamente) que os limites superiores para cavalos normais
(5 para neutroacutefilos e 1 para eosinoacutefilos) juntamente com um maior nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 ceacutelulasmicroL de LBA P=0017) evidenciaram a ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo pulmonar A bioatividade de PAF e a
concentraccedilatildeo de proteiacutenas no LBA foram maiores no grupo EX (relaccedilatildeo 340380 nm 0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg de proteiacutenasmL de LBA Plt0001) A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos no LBA foi maior
no grupo DA (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg de proteiacutenas Plt0001) e a atividade da catalase foi maior no grupo EX (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg de proteiacutenas P=0002) A fagocitose de MA (P=0006) bem como a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido (Plt0001) e peroacutexido de hidrogecircnio (P=0006) foram
significativamente menores no grupo EX Vinte e trecircs (622) potros do grupo EX foram HPIE pos e o LBA desse subgrupo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutenas (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) bioatividade de
PAF (relaccedilatildeo 340380 nm 0180 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 P=0042) e concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) significativamente maiores que o subgrupo HPIE neg A concentraccedilatildeo de nitritos
(008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) e a atividade de MA foi menor em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg O ambiente e o exerciacutecio modificaram o fluido broncoalveolar confirmando a hipoacutetese do presente estudo
Houve aumento da resposta de MA induzida pelo ambiente enquanto o exerciacutecio fiacutesico resultou em HPIE inflamaccedilatildeo pulmonar e diminuiccedilatildeo na resposta imune inata relacionada aos macroacutefagos alveolares nos potros PSI jovens durante o treinamento
para corrida e o PAF esteve presente nesse processo Sugere-se a conduccedilatildeo de novas investigaccedilotildees para elucidar os mecanismos inflamatoacuterios da HPIE bem como o papel do PAF neste processo como um potencial alvo terapecircutico
Palavras-chave cavalo fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria hemorragia pulmonar inflamaccedilatildeo pulmonar fluido broncoalveolar
ABSTRACT
Inflammatory airway disease (IAD) and exercise-induced pulmonary hemorrhage (EIPH) are common in racehorses during training being important ailments interrupting training of thoroughbred racehorses The present study hypothesis was
that stabling and exercise cause oxidative stress release of platelet-activating factor (PAF) and inflammation in airways of Thoroughbred colts and that there is an association between IAD and EIPH The subjects were colts in breeding farms (NC
n=45) stabled for 30 days (EC n=40) and race trained (EX n=34) Colts of the EX group were subdivided into three subgroups EIPH pos (presence of hemosiderophages in BALF) EIPH neg (absence of hemosiderophages in BALF)
and Normal EX (absence of hemosiderophages and less than 5 neutrophils and 1 eosinophils in BALF) Cytological profile and parameters of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) related to oxidative stress bioactivity of the pro-inflammatory
mediator PAF catalase activity and alveolar macrophage (AM) activity were studied Percentages of neutrophils and eosinophils in the BALF of the EX group were higher (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 and 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectively)
than the upper limits for normal horses (5 of neutrophils and 1 of eosinophils) that associated with a significantly higher total nucleated cell count (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 cellsmicroL of BALF P=0017) displayed pulmonary inflammation PAF
bioactivity and the total protein concentration in the BALF were higher in the EX group (0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 340380nm ratio P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg of proteinsmL of BALF Plt0001) Concentration of BALF hydroperoxides
was higher in the EC group (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg of proteins Plt0001) and catalase activity was higher in the EX group (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg of proteins P=0002) AM phagocytosis (P=0006) as well as production of superoxide anion (Plt0001) and hydrogen peroxide (P=0006) were
significantly lower in EX group Twenty three (622) colts of the EX group were EIPH pos and the BALF of this subgroup presented a significantly higher protein concentration (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg of proteinsmL of BALF P=0031) PAF
bioactivity (018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 340380 nm ratio P=0042) and lipid hydroperoxide concentration (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg of proteins P=0009) as well as lower nitrite concentration (008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007
absorbance 550 nm P=0049) and AM activity than EIPH neg subgroup Environment and exercise modified the bronchoalveolar fluid confirming the hypothesis of the present study Environment increased AM response as exercise resulted in EIPH
pulmonary inflammation and decreased innate immune response of alveolar macrophages in young Thoroughbred horses during race training and PAF participated in this event Further studies should be conducted to better understand
the inflammatory mechanisms of EIPH and the role of PAF in this process as a potential therapeutic target
Keywords horse platelet-activating factor pulmonary hemorrhage pulmonary
inflammation bronchoalveolar fluid
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
As doenccedilas respiratoacuterias satildeo comuns nos cavalos e as condiccedilotildees a que
estatildeo sujeitos fazem com que a inflamaccedilatildeo seja uma manifestaccedilatildeo frequumlente dessas
afecccedilotildees O epiteacutelio das vias aeacutereas superiores e dos pulmotildees estatildeo expostos a
patoacutegenos invasores e fatores ambientais Portanto o conhecimento dos
mecanismos da resposta inflamatoacuteria nas vias aeacutereas se faz importante a fim de se
estabelecer estrateacutegias para reduzir o impacto e os danos causados (THACKER
2006)
A inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apresenta um agravante o papel dos pulmotildees
na troca gasosa Assim as quatro principais consequumlecircncias de um processo
inflamatoacuterio desencadeado nas vias aeacutereas incluem vasodilataccedilatildeo e a reduccedilatildeo no
fluxo sanguiacuteneo resultando em capilares ingurgitados o aumento da permeabilidade
capilar permitindo a passagem de fluiacutedo e ceacutelulas para os tecidos o influxo e
acuacutemulo de fagoacutecitos e ceacutelulas ativadas no local e a bronconstricccedilatildeo (LUNN et al
2007)
O estudo das doenccedilas respiratoacuterias em cavalos eacute relevante particularmente
nos cavalos jovens de corrida onde a taxa de inflamaccedilatildeo detectada nas vias aeacutereas
eacute significativa (CHRISTLEY e RUSH 2007)
12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA)
Os termos ldquodoenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereasrdquo (DIVA) e ldquodoenccedila
inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferioresrdquo (DIVAI) tecircm sido usados para descrever uma
siacutendrome inflamatoacuteria do trato respiratoacuterio de cavalos de corrida (CHRISTLEY e
RUSH 2007)
Tem-se relatado que a DIVA ocorre em 11 a 50 dos cavalos de corrida em
treinamento chegando a afetar ateacute 80 dos cavalos de corrida de dois anos de
idade (CHRISTLEY e RUSH 2007) MALIKIDES (2003) estudou a prevalecircncia da
DIVA em cavalos de corrida na Austraacutelia evidenciando que 41 deles apresentaram
inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apoacutes duas semanas de iniciarem treinamento
19
A DIVA eacute considerada a segunda afecccedilatildeo mais comum a interromper o
treinamento para corridas (WILSHER et al 2006) podendo resultar em prejuiacutezos a
troca gasosa e diminuiccedilatildeo da capacidade atleacutetica (COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005)
Cavalos com DIVA ou com hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) apresentaram uma maior hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE)
(CHRISTLEY et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
(FIGURA 1)
FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE EIPH HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO IAD DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS UAO OBSTRUCcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS SUPERIORES FONTE SAacuteNCHEZ et al (2005)
Cavalos trotadores de corrida diagnosticados com DIVA tiveram a mecacircnica
pulmonar (volume corrente frequumlecircncia respiratoacuteria ventilaccedilatildeo pulmonar duraccedilatildeo da
inspiraccedilatildeo e da expiraccedilatildeo complacecircncia dinacircmica) alterada apresentaram um
significativo aumento da carga ventilatoacuteria e da energia requerida para a respiraccedilatildeo
sofrendo restriccedilotildees em seu rendimento atleacutetico (PIRRONE et al 2007)
Contudo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas dos cavalos atletas natildeo eacute entendida
por completo especialmente pela falta de consistecircncia e precisatildeo na definiccedilatildeo
dessa siacutendrome (CHRISTLEY e RUSH 2007)
Recentemente um painel de discussatildeo promovido pelo American College of
Veterinary Internal Medicine (ACVIM) definiu que a DIVA pode ocorrer em cavalos
de qualquer idade e eacute caracterizada pelo seguinte fenoacutetipo (COUEumlTIL et al 2007)
20
- Baixo rendimento desportivo intoleracircncia ao exerciacutecio
- Tosse com ou sem quantidade excessiva de muco traqueal
- Inflamaccedilatildeo natildeo seacuteptica detectada pela avaliaccedilatildeo citoloacutegica do fluido do LBA
ou disfunccedilatildeo pulmonar baseada em evidecircncia de obstruccedilatildeo de vias aeacutereas
inferiores hiperresponsividade das vias aeacutereas ou prejuiacutezo a troca gasosa durante o
repouso ou exerciacutecio
Este painel formado por experts e pesquisadores da aacuterea propocircs tambeacutem
alguns fatores de exclusatildeo para a DIVA
- Evidecircncia de sinais sistecircmicos de infecccedilatildeo (febre alteraccedilotildees hematoloacutegicas
compatiacuteveis com infecccedilatildeo)
- Aumento do esforccedilo respiratoacuterio durante o repouso
A etiopatogenia da DIVA eacute pouco definida Acredita-se que uma variedade de
fatores de risco estejam envolvidos variando nas diferentes populaccedilotildees de cavalos
baseado na alimentaccedilatildeo manejo praacuteticas preventivas distribuiccedilatildeo de agentes
infecciosos e influecircncias geneacuteticas (COUEumlTIL et al 2007)
Alguns autores encontraram uma reduccedilatildeo da incidecircncia desta afecccedilatildeo em
cavalos mais velhos (BURRELL et al 1996 CHAPMAN et al 2000 CHRISTLEY et
al 2001 WOOD et al 2005) sendo que a idade natildeo provocou diferenccedila no estudo
de McKANE et al (1993)
O ambiente da cocheira representa um risco adicional para a DIVA nos
cavalos (BURRELL et al 1996 HOLCOMBE et al2001 CLEMENTS e PIRIE
2007 BERNDT et al 2008) bem como para a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas das
pessoas envolvidas no trabalho com os cavalos (ELFMAN et al 2009)
HOLCOMBE et al (2001) associaram o manejo de estabulaccedilatildeo com a
ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas inferiores Estudaram 14 potros aacuterabes
que foram transferidos da pastagem para cocheiras com cama de palha Apoacutes 90
dias de estabulados houve um aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no
lavado broncoalveolar (LBA) Cavalos estabulados em cama de palha tambeacutem
apresentaram maior chance de apresentar DIVA em outros estudos (BURRELL et
al 1996 WOODS et al 1993)
No entanto em cavalos de montaria no estado norte-americano de Michigan
foi a permanecircncia em piquetes durante o inverno que esteve associado com
aumento do acuacutemulo de muco traqueal com maior nuacutemero de neutroacutefilos Neste
21
estudo a alimentaccedilatildeo com feno tambeacutem representou risco para a ocorrecircncia de
inflamaccedilatildeo (ROBINSON et al 2006)
Contudo o ambiente de cocheiras em modelos convencionais de manejo aos
quais os cavalos em treinamento estatildeo submetidos reconhecidamente apresenta
riscos para as vias aeacutereas Nestes haacute aumento nas concentraccedilotildees de partiacuteculas
inalaacuteveis contendo partiacuteculas orgacircnicas e inorgacircnicas incluindo endotoxinas β-D-
glucan partiacuteculas ultra finas (lt100 nm de diacircmetro) microorganismos esporos de
fungos material vegetal poeira inorgacircnica e gases toacutexicos (COUEumlTIL et al 2007)
Recentemente no estudo de BERNDT et al (2008) se demonstrou que o ambiente
de cocheira apresenta uma concentraccedilatildeo de endotoxinas 8 vezes maior que nos
piquetes
Aleacutem disso haacute muito jaacute foi descrita a presenccedila de actinomicetos termofiacutelicos
como a Micropolyspora faeni nos fenos fornecidos aos cavalos capazes de serem
inalados atingindo as vias aeacutereas inferiores (McPHERSON e THOMSON 1983)
Assim a praacutetica de encharcar o feno antes da administraccedilatildeo para diminuir a
quantidade de poeira disponiacutevel resultou em benefiacutecio agraves vias aeacutereas dos cavalos
(CLEMENTS e PIRIE 2007)
Por outro lado a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA ainda
natildeo estaacute bem esclarecida Cavalos com sinais cliacutenicos de inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas apresentaram maior frequecircncia de isolados bacterianos nos estudos de
CHRISTLEY et al (2001) e WOOD et al (2005) apesar de o painel do ACVIM
entender que a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA precisa ser
melhor estudada (COUEumlTIL et al 2007)
O exerciacutecio tambeacutem tem sido associado agrave inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas
inferiores dos cavalos atletas (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) A prevalecircncia da DIVA eacute maior em cavalos em treinamento
que em cavalos do mesmo grupo mas sem treinamento talvez pela inalaccedilatildeo de
maiores quantidades de partiacuteculas pela exposiccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores ao ar
frio ou pela ocorrecircncia da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (DAVIS et
al 2006 CHRISTLEY e RUSH 2007)
O diagnoacutestico da DIVA inclui a histoacuteria e o exame fiacutesico detalhados para a
identificaccedilatildeo de potenciais fatores etioloacutegicos A tosse durante o exerciacutecio ou
durante a alimentaccedilatildeo constitui a queixa mais comum (CHRISTLEY e RUSH 2007)
esteve associada agrave presenccedila de quantidades aumentadas de secreccedilatildeo traqueal bem
22
como a um maior percentual de neutroacutefilos tanto na secreccedilatildeo traqueal (CHRISTLEY
et al 2001) como no LBA (BENEDICE et al 2008) mas sua ausecircncia natildeo descarta
o diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
A presenccedila de descarga nasal mucopurulenta eacute achado comum em cavalos
de corrida de dois anos de idade sendo menos comum em cavalos mais velhos
Sua relaccedilatildeo com a DIVA todavia natildeo eacute sabida (COUEumlTIL et al 2007)
A auscultaccedilatildeo toraacutecica durante o repouso raramente evidencia alteraccedilotildees em
cavalos atletas com inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores (MAZAN e HOFFMAN
2003 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007) sendo necessaacuteria a
utilizaccedilatildeo de uma sacola para o cavalo respirar no seu interior ampliando o esforccedilo
respiratoacuterio (bdquorebreathing bagrsquo) podendo tornar audiacuteveis alguns sons anormais em
certos casos (MAZAN e HOFFMAN 2003 COUEumlTIL et al 2007)
MAZAN e HOFFMAN (2003) relataram que os testes de funccedilatildeo pulmonar
como o pneumotacoacutegrafo e o teste de broncoprovocaccedilatildeo com histamina podem
auxiliar tornando o diagnoacutestico da DIVA definitivo Contudo o diagnoacutestico precoce
da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores deve enfatizar a avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA
e natildeo os testes de funccedilatildeo pulmonar (COUEumlTIL et al 2007)
A avaliaccedilatildeo citoloacutegica do AT tambeacutem tem contribuido ao diagnoacutestico dos
processos inflamatoacuterios das vias aeacutereas contudo natildeo eacute considerado suficiente para
o diagnoacutestico da DIVA Isto se deve a falta de concordacircncia entre os achados
citoloacutegicos do AT e do LBA e da falta de estudos associando os achados no AT e o
rendimento atleacutetico (HODGSON e HODGSON 2003 HUGHES et al 2003
COUEumlTIL et al 2007) Ainda um cuidado a ser levado em conta quando da
realizaccedilatildeo de AT eacute o tempo da colheita jaacute que a realizaccedilatildeo de exerciacutecio
esteneuante pode aumentar o percentual de neutroacutefilos na amostra obtida
(MALIKIDES et al 2007)
O LBA por sua vez eacute o meacutetodo para a obtenccedilatildeo de amostras de ceacutelulas
presentes nas vias aeacutereas mais distais e espaccedilo alveolar (HOFFMAN 1999
FERNANDES et al 2000 LESSA et al 2005) considerado como uma bioacutepsia
liacutequida (MAZAN e HOFFMAN 2003) sendo a teacutecnica de avaliaccedilatildeo citoloacutegica
preferida para o diangoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)
Um aumento no percentual de ceacutelulas inflamatoacuterias no fluido do LBA eacute um dos
principais criteacuterios diagnoacutesticos para a DIVA Usualmente ocorre uma predominacircncia
de neutroacutefilos mas tambeacutem pode ocorrer aumento nos nuacutemeros percentuais de
23
eosinoacutefilos linfoacutecitos e mastoacutecitos normalmente associados com diminuiccedilatildeo no
rendimento desportivo e hiperresponsividade das vias aeacutereas (McKANE et al 1993
HARE e VIEL 1998 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007)
O perfil citoloacutegico de LBA mais comumente encontrado em cavalos com DIVA
eacute caracterizado por aumento no nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (NTCN) com
discreta neutrofilia (gt5) linfocitose e monocitose Tambeacutem pode ser encontrado
um aumento do nuacutemero percentual de eosinoacutefilos (gt01) e mastoacutecitos (gt2)
(HOFFMAN 1999 COUEumlTIL et al 2007)
O painel de estudo da DIVA promovido pelo ACVIM apontou direccedilotildees para as
pesquisas nesta aacuterea e dentre elas o estudo das citocinas e mediadores
inflamatoacuterios envolvidos no processo (COUEumlTIL et al 2007)
Sabe-se que ocorre um incremento da imunidade inata nas vias aeacutereas dos
cavalos estabulados com o envolvimento de IL-6 (RIIHIMAumlKI et al 2008a) Em
cavalos trotadores de corrida em treinamento ocorre uma eosinofilia transitoacuteria no
fluido broncoalveolar e um aumento da expressatildeo de IL-4 e IL-5 contudo natildeo foi
encontrada correlaccedilatildeo entre estes eventos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Dentre os mediadores quiacutemicos participantes do processo inflamatoacuter io nas
vias aeacutereas o PAF (platelet-activating factor) estaacute especialmente implicado na asma
sepse e injuacuteria pulmonar aguda (THACKER 2006) presente tambeacutem na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas em cavalos mais velhos
(FAIRBAIRN et al 1996) Contudo a participaccedilatildeo do PAF no processo inflamatoacuterio
nas vias aeacutereas de cavalos atletas ainda natildeo eacute conhecida
13 PAF E VIAS AEacuteREAS
O fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocoline)
eacute um potente mediador proacute inflamatoacuterio envolvido na angiogecircnese aterosclerose
anafilaxia cicatrizaccedilatildeo inflamaccedilatildeo apoptose e endotoxemia (MARATHE et al
2001 STAFFORINI et al 2003 OWEN et al 2005) O PAF eacute produzido por
eosinoacutefilos macroacutefagos alveolares neutroacutefilos plaquetas e ceacutelulas endoteliais
(BAKER et al 2002 STAFFORINI et al 2003 GAUDREAULT et al 2005 SUMITA
et al 2005) a partir de uma subclasse especiacutefica de fosfatidilcolina que conteacutem um
eacuteter ao inveacutes de um eacutester ligado a posiccedilatildeo sn-1 do esqueleto de glicerol (FIGURA
24
2) A fosfatidilcolina eacute o mais abundante fosfolipiacutedio presente nas membranas
bioloacutegicas (MARATHE et al 2001 OWEN et al 2005)
FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO sn-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL FONTE MARATHE et al (2001)
O PAF tambeacutem estaacute envolvido numa variedade de funccedilotildees pulmonares como
por exemplo no tocircnus vascular e das vias aeacutereas na frequumlecircncia de movimentaccedilatildeo
dos ciacutelios e na permeabilidade endotelial causando um aumento da secreccedilatildeo de
fluido traqueal broncoconstricccedilatildeo edema e hiperresponsividade das vias aeacutereas
resultando em prejuiacutezos a troca gasosa (CLAVIJO et al 2001 GABRIJELCIC et al
2003 ISHII et al 2004 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008)
Os efeitos do PAF sobre a circulaccedilatildeo pulmonar foram descritos por diversos
autores CHEN et al (1992) demonstraram um aumento das pressotildees arterial e
microvascular pulmonares e edema apoacutes a injeccedilatildeo de PAF SHIBAMOTO et al
(1993) estudaram os efeitos do PAF na circulaccedilatildeo venosa em pulmatildeo de catildeo onde
o PAF causou venoconstricccedilatildeo e aumento da pressatildeo capilar sem aumento da
permeabilidade vascular OHAR et al (1994) tambeacutem demonstraram
venoconstricccedilatildeo em estudo com pulmatildeo de coelhos mas demostraram que a
reduccedilatildeo da complacecircncia e aumento da resistecircncia vascular deveu-se a alteraccedilatildeo
estrutural vascular por perda de colaacutegeno intersticial induzida por PAF
Contudo o papel do PAF como causador de aumento da permeabilidade
vascular e edema pulmonar estaacute bem estudado devido a sua participaccedilatildeo na
fisiopatologia da anafilaxia da endotoxemia e da asma (EVANS et al 1987
25
CLAVIJO et al 2001 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008
MUEHLMANN et al 2009)
Em estudo preacutevio o extravasamento microvascular ocorrido apoacutes a infusatildeo de
PAF natildeo foi acompanhado de aumento da pressatildeo arterial pulmonar assim os
autores concluiacuteram que o edema pulmonar mediado por PAF resulta de aumento da
permeabilidade microvascular pulmonar (CLAVIJO et al 2001)
De fato demonstrou-se que o aumento da permeabilidade capilar induzida
por PAF ocorre pela formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular devido a
desorganizaccedilatildeo das proteiacutenas juncionais VE-caderina e ocludina (ZHANG et al
2003 JIANG et al 2008) mediada por receptores especiacuteficos (EVANS et al 1987)
e atraveacutes da ativaccedilatildeo da via do insositol trisphosphato e influxo de caacutelcio (GOumlGGEL
e UHLIG 2005) (FIGURA 3)
PLC phopholipase C IP3 inositol 145-trisphosphato IP3R receptor de IP3
MLCK myosin light chain kinase ML-7 5-iodonaphthalene-1sulphonyl-
homopiperazine L108 edelfosina Inibiccedilatildeo ativaccedilatildeo
FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS NO LADO ESQUERDO OBSERVA-SE O EFEITO DO PAF EM CEacuteLULAS ENDOTELIAIS NO LADO DIREITO OBSERVA-SE OS EFEITOS DO PAF EM CEacuteLULAS DA MUSCULATURA LISA VASCULAR E DAS VIAS AEacuteREAS A QUAL Eacute ALTAMENTE MEDIADA POR TROMBOXANO NESTE A VIA PRINCIPAL Eacute ATRAVEacuteS DA ATIVACcedilAtildeO DE RHO E PROTEIacuteNAS KINASES ASSOCIADAS Agrave RHO QUE ATENUAM A ATIVIDADE DA MLCP (MYOSIN LIGHT CHAIN PHOPHATASE) COM CONSEQUumlENTE AUMENTO DA FOSFORILACcedilAtildeO DA CADEIA LEVE DA MIOSINA E PORTANTO A CONTRACcedilAtildeO FONTE GOumlGGEL e UHLIG (2005)
26
Adicionalmente os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) (BELLAN et al 1992) O
aumento da produccedilatildeo de NO induzida por PAF via ativaccedilatildeo de receptor de PAF foi
demonstrado em ceacutelulas do endoteacutelio vascular humano considerado como um efeito
cardioprotetor (KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Contudo particularmente
na microcirculaccedilatildeo o NO contra-ataca muitos dos efeitos bioloacutegicos do PAF inibindo
a vasoconstricccedilatildeo arteriolar e o aumento da permeabilidade vascular aleacutem de inibir
a adesatildeo de plaquetas e de leucoacutecitos ao endoteacutelio (BRKOVIC e SIROIS 2007
KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Mas os mecanismos pelos quais o NO
modula a permeabilidade microvascular ainda natildeo satildeo bem entendidos podendo ser
confusos e dependentes do estado das ceacutelulas endoteliais (RAMIREZ et al 2006)
A inibiccedilatildeo da NO sintase (NOS) em ceacutelulas endoteliais atenuou o aumento da
permeabilidade microvascular induzida por PAF no estudo de ZHU et al (2004) Por
outro lado estudando a participaccedilatildeo de NO e PAF em lesotildees de intestino delgado
de ratos KWASNIEWSKI et al (2008) evidenciaram que a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de
NO endoacutegeno aumentou bastante as lesotildees hemorraacutegicas e a taxa de mortalidade
demonstrando o papel proacute inflamatoacuterio do PAF e o efeito protetor do NO na
microcirculaccedilatildeo Tal relaccedilatildeo tambeacutem foi descrita por BRKOVIC e SIROIS (2007)
estudando o papel do PAF e do NO nos efeitos proacute inflamatoacuterios resultantes da
participaccedilatildeo de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e concluindo que eacute
o PAF que diretamente aumenta a permeabilidade vascular sendo o NO um cofator
A atuaccedilatildeo do PAF como mediador inflamatoacuterio eacute bastante importante na
asma onde aleacutem de provocar aumento da permeabilidade vascular tambeacutem induz
uma neutropenia transitoacuteria seguida de neutrofilia resultando no recrutamento de
neutroacutefilos para o pulmatildeo evidenciado atraveacutes de estudo citoloacutegico do lavado
broncoalveolar (LEE et al 2002 GABRIJELCIC et al 2003)
No estudo de AU et al (2001) a ativaccedilatildeo de neutroacutefilos resultou em ativaccedilatildeo
dos receptores de PAF aumento da fagocitose de neutroacutefilos e subsequumlente
liberaccedilatildeo de interleucina-8 (IL-8) causando mais quimiotaxia de neutroacutefilos
Adicionalmente demonstrou-se que haacute envolvimento de receptor 1 de leucotrieno B4
(LTB4) nas atividades de neutroacutefilos humanos mediadas por PAF (GAUDREAULT et
al 2005)
Em indiviacuteduos asmaacuteticos e com doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC)
o influxo de neutroacutefilos mediado por PAF nas vias aeacutereas foi modulado pelo aumento
27
de LTB4 provavelmente pelo estiacutemulo de PAF para a liberaccedilatildeo de LTB4 dos
macroacutefagos alveolares (SHINDO et al 1998 GABRIJELCIC et al 2003 FINNEY-
HAYWARD et al 2009)
Nas vias aeacutereas dos cavalos se demonstrou a participaccedilatildeo do PAF na
fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas (ORVA) levando a um
aumento do recrutamento de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo resultando em
prejuiacutezos agrave funccedilatildeo pulmonar (FAIRBAIRN et al 1996)
O PAF tendo como uma de suas origens o macroacutefago alveolar eacute capaz de
modificar o comportamento de neutroacutefilos sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da
adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a
ORVA (MARR et al 2002)
A participaccedilatildeo do PAF na asma humana e em outras espeacutecies foi evidenciada
pela sua capacidade em reproduzir mecanismos fisiopatoloacutegicos tais como a
broncoconstricccedilatildeo hiperresponsividade das vias aeacutereas aumento da
permeabilidade na microcirculaccedilatildeo pulmonar e aumento na secreccedilatildeo de muco (LOU
et al 1998 ISHII et al 2004 MUEHLMANN et al 2009)
14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS
Os desafios indutores de alteraccedilotildees na funcionalidade dos macroacutefagos
alveolares resultando em quimiotaxia de neutroacutefilos para as vias aeacutereas levam a um
quadro inflamatoacuterio pulmonar acompanhado de hipersecreccedilatildeo de muco Por sua vez
o muco presente nas vias aeacutereas possui uma seacuterie de funccedilotildees essenciais que
coletivamente levam a proteccedilatildeo das vias aeacutereas Juntamente com as ceacutelulas
epiteliais forma o sistema mucociliar que associado agrave tosse eacute essencial para
manter as vias aeacutereas desobstruiacutedas (ADLER 2005)
Por outro lado a produccedilatildeo excessiva de muco representa um fator importante
de morbidade e mortalidade nas doenccedilas das vias aeacutereas (THORNTON e
SHEEHAN 2004) Assim a resposta imunoloacutegica do epiteacutelio das vias aeacutereas frente
a infecccedilotildees virais e bacterianas e endotoxinas inaladas eacute caracterizada pela
liberaccedilatildeo de citocinas e pela produccedilatildeo de mucinas para prover proteccedilatildeo adicional
(HODGSON et al 2003 GERBER et al 2004 LORA et al 2005) Entretanto nos
quadros inflamatoacuterios os danos teciduais substanciais podem levar a produccedilatildeo
28
excessiva de muco e comprometimento da funccedilatildeo respiratoacuteria (LORA et al 2005
ROBINSON 2005)
O muco eacute uma mistura de aacutegua (~95) eletroacutelitos (~1) lipiacutedios (~1)
proteiacutenas (2-3) enzimas proteiacutenas seacutericas e mucinas (GERBER 2001) As
mucinas glicoproteiacutenas oligomeacutericas representam um constituinte importante do
muco sendo o gene responsaacutevel pela produccedilatildeo de mucinas o MUC5 (THORNTON
e SHEEHAN 2004)
Nas vias aeacutereas a produccedilatildeo de mucinas ocorre predominantemente pelas
ceacutelulas caliciformes do epiteacutelio e em menor parte nas glacircndulas da submucosa
(GERBER et al 2004 THORNTON e SHEEHAN 2004) A produccedilatildeo de
quantidades excessivas de muco pode representar a causa direta de obstruccedilatildeo
bronquial podendo amplificar o efeito de estreitamento luminal da broncoconstricccedilatildeo
e estar associada ao comprometimento da funccedilatildeo pulmonar tosse e capacidade
reduzida para a corrida em atletas humanos (HALLSTRAND et al 2007) e em
cavalos de corrida (CHRISTLEY et al 2001 HOLCOMBE et al 2006)
Assim a quantidade de muco secretado apresenta uma correlaccedilatildeo estreita
com a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas (GERBER et al 2004 ROBINSON et al 2003
HOLCOMBE et al 2006 ROBINSON 2005) De fato haacute uma evidente associaccedilatildeo
entre a hipersecreccedilatildeo de muco e presenccedila de quantidades aumentadas de
neutroacutefilos nas secreccedilotildees respiratoacuterias em seres humanos e em cavalos
(HODGSON et al 2003 ROBINSON et al 2003 ADLER 2005) Contagens de
neutroacutefilos no LBA menores que 30 ceacutelulasμL correspondem a pequenas
quantidades de muco nas vias aeacutereas e os acuacutemulos de secreccedilatildeo aumentam
quando as quantidades de neutroacutefilos estatildeo entre 30 e 100 ceacutelulasμL Entre 100 e
1000 ceacutelulasμL ocorre obstruccedilatildeo mensuraacutevel das vias aeacutereas Possivelmente esse
mecanismo pode estar relacionado com a secreccedilatildeo de proteiacutenas pelos neutroacutefilos
(ROBINSON et al 2003) De fato jaacute foi demonstrado que o neutroacutefilo secreta
elastase a qual estaacute associada com um aumento nas secreccedilotildees relacionadas com a
expressatildeo do gene MUC5 (SHAO e NADEL 2005) e metaplasia de ceacutelulas
caliciformes (VOYNOW et al 2004)
A expressatildeo anormal de neutroacutefilos e de moleacuteculas de adesatildeo em indiviacuteduos
com asma e doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC) foi demonstrada por
GABRIJELCIC et al (2003) Aleacutem do aumento no nuacutemero de neutroacutefilos tambeacutem
foram observados diferentes padrotildees de ativaccedilatildeo e niacuteveis aumentados de elastase
29
neutrofiacutelica e IL-8 Estes uacuteltimos bem como a expressatildeo do gene MUC5 estatildeo
associados a um aumento no estresse oxidativo pulmonar (DROST et al 2005
SHAO e NADEL 2005)
A associaccedilatildeo entre a severidade da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas e o estresse
oxidativo em cavalos com ORVA foi relatada por KIRSCHVINK et al (2008) os
quais relacionaram a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas ao aumento da glutationa oxidada
do aacutecido uacuterico e de isoprostano (8-iso-PGF2α) no LBA
15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO
Estresse oxidativo eacute o termo utilizado para descrever os danos causados
quando as espeacutecies reativas do oxigecircnio (ROS) superam a capacidade de defesa
antioxidante do indiviacuteduo (WOOD et al 2003)
Entretanto tanto as ROS como as espeacutecies reativas do nitrogecircnio (RNS)
ocorrendo em concentraccedilotildees pequenas a moderadas apresentam importante papel
na fisiologia celular incluindo a defesa contra invasores e atuando em diversas vias
de sinalizaccedilatildeo celular e na induccedilatildeo da resposta mitogecircnica O estresse oxidativo
propriamente dito ocorre quando o sistema redox sofre desequiliacutebrio pela produccedilatildeo
aumentada de ROS eou RNS ou produccedilatildeo reduzida de antioxidantes (VALKO et al
2007)
Os pulmotildees encontram-se sujeitos ao estresse oxidativo pois estatildeo
diretamente expostos a quantidades muito elevadas de oxigecircnio o que torna
imperativo que este oacutergatildeo possua um arsenal para a defesa contra possiacuteveis
ataques oxidativos Portanto os pulmotildees satildeo providos de um desenvolvido sistema
de defesa endoacutegeno constituiacutedo de agentes chamados antioxidantes Os
antioxidantes ajudam os pulmotildees a se livrarem dos efeitos de uma variedade de
oxidantes provenientes do oxigecircnio (ROS) como o acircnion superoacutexido radical
hidroxila peroacutexido de hidrogecircnio e do nitrogecircnio (RNS) como o oacutexido niacutetrico (NO)
peroxinitrito e nitritos endoacutegenos e do ambiente Os principais sistemas
antioxidantes natildeo enzimaacuteticos dos pulmotildees satildeo a glutationa a vitamina C a
vitamina E o beta-caroteno e o aacutecido uacuterico enquanto os antioxidantes enzimaacuteticos
satildeo as superoacutexido dismutases a catalase e as peroxidases (RAHMAN et al 2006)
(FIGURA 4)
30
FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE O2- AcircNION SUPEROacuteXIDO NO OacuteXIDO NIacuteTRICO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO ONOO- PEROXINITRITO FE2+ IacuteON FERROSO GPX GLUTATIONA PEROXIDASE FONTE RAHMAN et al (2006)
O estresse oxidativo pode resultar em muitos prejuiacutezos agraves funccedilotildees das vias
aeacutereas incluindo a contraccedilatildeo da musculatura lisa das vias aeacutereas a induccedilatildeo de
hiperresponsividade das vias aeacutereas a hipersecreccedilatildeo de muco danos ao epiteacutelio
respiratoacuterio e aumento da permeabilidade capilar (WOOD et al 2003)
A fisiopatologia da asma e da DPOC caracteriza-se por inflamaccedilatildeo crocircnica
localizada e estresse oxidativo O estresse oxidativo ocorre pelo aumento de
agentes oxidantes que satildeo inalados bem como por grandes quantidades de ROS
liberadas das ceacutelulas inflamatoacuterias Niacuteveis aumentados de ROS aumentam a
resposta inflamatoacuteria diretamente ou via formaccedilatildeo de produtos da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica levando a um aumento na severidade da doenccedila (KIRKHAM e RAHMAN
2006)
A peroxidaccedilatildeo dos lipiacutedios da membrana celular leva a geraccedilatildeo de
isoprostanos (FIGURA 5) um composto bioativo semelhante agraves prostaglandinas Os
isoprostanos satildeo produzidos independentemente das enzimas ciclooxigenases via
peroxidaccedilatildeo do aacutecido aracdocircnico catalizada por ROS apresentando potente efeito
31
constritor na musculatura lisa respiratoacuteria hiperresponsividade e exsudaccedilatildeo de
plasma nas vias aeacutereas (WOOD et al 2003)
FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA ASMA IL INTERLEUCINA TH2 CEacuteLULAS T-HELPER TIPO 2 ROS ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO O2
- AcircNION SUPEROacuteXIDO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO NADPH NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO REDUZIDA NADP NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO SOD SUPEROacuteXIDO DISMUTASE EPO PEROXIDASE EOSINOFIacuteLICA MPO MIELOPEROXIDASE NF FATOR DE TRANSCRICcedilAtildeO NUCLEAR FONTE WOOD et al (2003)
O oacutexido niacutetrico (NO) sintetizado enzimaticamente pela oxidaccedilatildeo do
aminoaacutecido L-arginina para L-citrulina apresenta diversas funccedilotildees fisioloacutegicas nas
vias aeacutereas como o relaxamento da musculatura lisa a regulaccedilatildeo da responsividade
e da permeabilidade das vias aeacutereas e na defesa contra invasores Contudo em
altas concentraccedilotildees o NO apresenta diversos efeitos proacute inflamatoacuterios participando
da infiltraccedilatildeo de ceacutelulas inflamatoacuterias e apresentando efeitos citotoacutexicos sobre
32
diversas ceacutelulas tal como a ceacutelula do epiteacutelio respiratoacuterio especialmente por
interagir com o acircnion superoacutexido formando o peroxinitrito (REDINGTON 2006)
As ceacutelulas inflamatoacuterias recrutadas agraves vias aeacutereas do indiviacuteduo asmaacutetico
apresentam excepcional capacidade de produccedilatildeo de oxidantes Eosinoacutefilos
neutroacutefilos e macroacutefagos bem como ceacutelulas do epiteacutelio respiratoacuterio podem gerar
oxidantes Inicialmente ocorre a formaccedilatildeo de acircnion superoacutexido no complexo
dependente de NADPH oxidase na membrana celular no sistema xantina oxidase
citosoacutelico e na cadeia respiratoacuteria mitocondrial (FIGURA 6) (CARAMORI e PAPI
2004) A seguir a interaccedilatildeo do acircnion superoacutexido com outros oxidantes e o ataque
oxidativo ao tecido pulmonar leva agrave peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e danos ao tecido pulmonar
(MILLS e HIGGINS 1997 KIRKHAM e RAHMAN 2006)
FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS FONTE CARAMORI E PAPI (2004)
O estudo do estresse oxidativo na asma se utiliza de modelos que podem
envolver os murinos (MUEHLMANN et al 2009) ou mesmo os cavalos jaacute que estes
naturalmente desenvolvem a ORVA doenccedila respiratoacuteria com diversas similaridades
com a asma humana (DEATON 2006)
33
Nos cavalos com ORVA os marcadores de estresse oxidativo estatildeo
aumentados e diretamente relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e infiltrado
inflamatoacuterio neutrofiacutelico (KIRSCHVINK et al 2008) ao aumento da produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por neutroacutefilos sanguiacuteneos apoacutes a exposiccedilatildeo agrave poeira orgacircnica
ambiental (MARR et al 1997) e ao aumento da secreccedilatildeo de muco apresentando
tambeacutem concentraccedilotildees reduzidas de aacutecido ascoacuterbico no fluido do epiteacutelio respiratoacuterio
(DEATON 2006)
O exerciacutecio fiacutesico por sua vez tambeacutem pode causar estresse oxidativo nas
vias aeacutereas em atletas humanos e em cavalos pela geraccedilatildeo de ROS e RNS (MILLS
e HIGGINS 1997 ART e LEKEUX 2005 KIRSCHVINK et al 2008)
Os cavalos de corrida apresentam a habilidade de aumentar o consumo de
oxigecircnio em 60 vezes durante o esforccedilo maacuteximo o que representa um fator de risco
ao estresse oxidativo nesses animais (ART e LEKEUX 2005)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica eacute o marcador de dano oxidativo poacutes exerciacutecio mais
estudado (DEATON e MARLIN 2003) Em atletas humanos houve aumento da
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes a realizaccedilatildeo de ultramaratona (MASTALOUDIS et al
2004) mas o treinamento produziu efeitos beneacuteficos e reduccedilatildeo dos marcadores de
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes um periacuteodo de treinamento (MIYAZAKI et al 2001
BALOG et al 2006) Em cavalos o exerciacutecio submaacuteximo induziu um aumento nos
hidroperoacutexidos lipiacutedicos plasmaacuteticos dentro de 5 minutos apoacutes o teacutermino (DEATON e
MARLIN 2003)
As ROS e seus produtos como os peroacutexidos lipiacutedicos podem diretamente
danificar o tecido pulmonar e causar um incremento da pressatildeo vascular pulmonar
pela liberaccedilatildeo aumentada de mediadores inflamatoacuterios vasoconstrictores (pex
PAF) interferindo na atividade do NO como vasodilatador podendo assim contribuir
na patogecircnese da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) nos cavalos
atletas (MILLS e HIGGINS 1997)
34
16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE)
A HPIE eacute caracterizada por hipertensatildeo pulmonar edema nas regiotildees de
troca gasosa ruptura dos capilares pulmonares e a presenccedila de sangue nas vias
aeacutereas (ERICKSON e POOLE 2007) sendo extremamente comum em cavalos de
corrida (PEREZ-MORENO et al 2009)
Tem-se relatado que a HPIE ocorre essencialmente em todos os cavalos
PSI de corrida em treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007) mas
tambeacutem constitui um problema em outras raccedilas de cavalos que realizam exerciacutecio
intenso como os trotadores e os quarto de milha e em cavalos realizando exerciacutecio
de menor intensidade como os cavalos de salto e traccedilatildeo (LAPOINTE et al 1994
ERICKSON e POOLE 2007 VICINO 2007)
O comprometimento ao rendimento desportivo causado pela HPIE natildeo havia
sido comprovado ateacute o estudo de HINCHCLIFF et al (2005a) quando demonstraram
que cavalos de corrida com HPIE grau 1 apresentaram 4 vezes mais possibilidades
de vencer em relaccedilatildeo a graduaccedilotildees mais elevadas de hemorragia
Cavalos PSI de corrida estatildeo sob maior risco de apresentar HPIE porque
apresentam pressatildeo capilar pulmonar mais elevada que cavalos de outras raccedilas e
atividades durante o esforccedilo maacuteximo (HACKETT et al 2003)
Adicionalmente a criaccedilatildeo seletiva de cavalos de corrida visando que sejam
cada vez mais capazes de atingir altas velocidades associado a consumo bastante
alto de oxigecircnio resultou em deacutebito cardiacuteaco substancial (WEST e MATHIEU-
COSTELLO 1994) e barreira alveacuteolo-capilar (BAC) bastante fina (WEST e
MATHIEU-COSTELLO 1999) A espessura meacutedia em micrometros do interstiacutecio da
BAC eacute 0175 plusmn 0010 em coelhos 0318 plusmn 0081 em catildees e 0390 plusmn 002 em
cavalos evidenciando que proporcionalmente a BAC dos cavalos eacute mais fina que a
de outras espeacutecies (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1999) Portanto haacute um dilema
envolvendo a evoluccedilatildeo da BAC dos cavalos Por um lado a necessidade de ser
extremamente fina para uma troca gasosa eficiente enquanto de outro a
necessidade de ser resistente o suficiente para suportar o estresse extremamente
alto na parede dos capilares pulmonares quando a pressatildeo capilar se eleva durante
o exerciacutecio (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
A pressatildeo hidrostaacutetica maacutexima nos capilares pulmonares humanos durante o
exerciacutecio supera 30 mmHg Nos cavalos PSI de corrida a pressatildeo capilar ultrapassa
35
100 mmHg aproximando-se da forccedila necessaacuteria para ocorrer a ruptura do colaacutegeno
que suporta a parede capilar na BAC (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)
Quando o estresse na parede capilar se eleva demasiadamente ocorrem
alteraccedilotildees ultra-estruturais na BAC uma condiccedilatildeo conhecida como falecircncia por
estresse descrita em atletas de elite humanos e em cavalos (WEST 2000)
BIRKS et al (1997) demonstraram a falecircncia por estresse e consequumlente
ruptura dos capilares pulmonares em cavalos exercitando a altas velocidades
havendo maior risco de ocorrecircncia da HPIE quando encontraram-se sob importante
aumento da pressatildeo arterial pulmonar (FIGURA 7)
FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) A ULTRAESTRUTURA CAPILAR NORMAL B RUPTURA DO ENDOTEacuteLIO CAPILAR (SETAS) COM ERITROacuteCITOS ADJACENTES (ASTERISCO) NOTA-SE TAMBEacuteM ERITROacuteCITOS NO ESPACcedilO ALVEOLAR (PONTAS DE SETAS) C ERITROacuteCITO NO INTERSTIacuteCIO (ASTERISCO) D RUPTURA DO EPITEacuteLIO ALVEOLAR (SETAS) A ALVEacuteOLO C CAPILAR BAR 2 microm FONTE BIRKS et al (1997)
36
Portanto a falecircncia por estresse dos capilares pulmonares eacute a teoria aceita
para a ocorrecircncia da HPIE sendo causada pela elevada pressatildeo transmural nos
capilares pulmonares resultado do aumento da pressatildeo arterial pulmonar somada agrave
pressatildeo pleural inspiratoacuteria negativa (WEST 2000) (FIGURA 8)
FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) TTMP TENSAtildeO CIRCUNFERENCIAL OU EM ARCO CAUSADA PELA PRESSAtildeO TRANSMURAL CAPILAR TEL Eacute A TENSAtildeO LONGITUDINAL NOS COMPONENTES DA PAREDE ALVEOLAR ASSOCIADA COM A INFLACcedilAtildeO PULMONAR PARTE DESTA Eacute TRASMITIDA Agrave BAC TST Eacute A TENSAtildeO DE SUPERFIacuteCIE DA CAMADA SUPERFICIAL ALVEOLAR ESTA APARENTEMENTE EXERCE UMA FORCcedilA DE ACcedilAtildeO INTERNA PARA SUPORTAR O CAPILAR QUANDO ESTE INTUMESCE PARA DENTRO DO ESPACcedilO ALVEOLAR A ALTAS PRESSOtildeES TRANSMURAL CAPILARES PALV PRESSAtildeO ALVEOLAR PCAP PRESSAtildeO CAPILAR FONTE WEST (2000)
Diversos estudos estiveram envolvidos em avaliar a participaccedilatildeo do NO no
aumento da pressatildeo arterial pulmonar no cavalo durante o exerciacutecio e na
fisiopatologia da HPIE Inicialmente evidenciou-se que cavalos realizando exerciacutecio
intenso apresentam hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE) (CHRISTLEY
et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 DEMPSEY e WAGNER 1999
SAacuteNCHEZ et al 2005) o que resulta na inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO abolindo o
relaxamento vascular dependente do endoteacutelio (MILLS e HIGGINS 1997)
Portanto acreditou-se que a reduccedilatildeo da produccedilatildeo do NO durante o exerciacutecio
intenso poderia contribuir para a alta incidecircncia de HPIE nos cavalos de corrida
Contudo a administraccedilatildeo do antagonista da oacutexido niacutetrico sintase (NOS) N-nitro-L-
arginina metil ester (L-NAME) mostrou que o NO endoacutegeno resulta numa maior
37
extraccedilatildeo de O2 no repouso e no exerciacutecio submaacuteximo mas natildeo causou alteraccedilatildeo no
exerciacutecio intenso (MANOHAR e GOETZ 1998 MANOHAR et al 2006) A
administraccedilatildeo de L-NAME por KINDIG et al (2000) resultou em agravamento da
HPIE nos cinco animais estudados contudo natildeo observou-se aumento da pressatildeo
arterial pulmonar
MANOHAR e GOETZ (1999) avaliaram os efeitos da infusatildeo intravenosa de
nitroglicerina em cavalos realizando exerciacutecio e natildeo observaram alteraccedilotildees sobre a
incidecircncia ou severidade da HPIE
Adicionalmente KINDIG et al (2001) estudaram os efeitos do exerciacutecio na
pressatildeo arterial pulmonar e na HPIE em cavalos inalando NO Comparados aos
controles o grupo que inalou o NO apresentou uma pequena mas consistente
reduccedilatildeo na pressatildeo arterial pulmonar maacutexima mas com um significativo aumento da
HPIE nesses animais avaliado pelo aumento na contagem do nuacutemero de eritroacutecitos
no LBA Os autores entenderam que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete em
parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou como agravou a HPIE
Portanto em face aos achados relacionados agrave participaccedilatildeo do NO e da NOS
no cavalo em exerciacutecio maacuteximo e na HPIE satildeo necessaacuterias outras investigaccedilotildees a
respeito dos efeitos da inibiccedilatildeo da NOS e da produccedilatildeo do NO na circulaccedilatildeo
pulmonar e na HPIE (KINDIG et al 2000)
Apesar da maior atenccedilatildeo aos efeitos da HPIE e da pressatildeo arterial pulmonar
em cavalos realizando exerciacutecios intensos a HPIE tambeacutem passou a ser
demonstrada em cavalos envolvidos em atividades de menor intensidade sugerindo
que outros mecanismos podem estar envolvidos na fisiopatologia (EPP et al 2006)
VICINO (2007) demonstrou a ocorrecircncia de HPIE em cavalos de salto sendo
que cavalos que participaram de provas na altura entre 130 m ndash 150 m
apresentaram maior incidecircncia que aqueles que saltaram provas entre 100 m ndash 120
m
Neste contexto a associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar jaacute foi
demonstrada anteriormente (McKANE et al 1993 SAacuteNCHEZ et al 2005) Em
concordacircncia o estudo epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) evidenciou
38
uma significativa associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos puro
sangue inglecircs (PSI) jovens durante treinamento para corrida
O processo de hemorragia pulmonar pode culminar em irritaccedilatildeo e inflamaccedilatildeo
das vias aeacutereas o que exacerbaria a doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores
(ERICKSON e POOLE 2007) WEST e MATHIEU-COSTELLO (1999) sugerem que
alteraccedilotildees na BAC ativariam vias proacute inflamatoacuterias nas vias aeacutereas com a
participaccedilatildeo de LTB4 Possivelmente a membrana basal alveolar exposta apoacutes a
ruptura ativaria macroacutefagos alveolares sendo que estes satildeo ricos em LTB4
DERKSEN et al (2009) sugeriram uma hipoacutetese para a ocorrecircncia da HPIE
(FIGURA 9) onde a ocorrecircncia das altas pressotildees vasculares pulmonares levaria a
alteraccedilotildees venulares culminando na ruptura capilar sangramento inflamaccedilatildeo e
hemossiderose agravando o quadro da HPIE
FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO DERSKEN et al (2009)
Contudo mediadores bem como os mecanismos inflamatoacuterios que estatildeo
envolvidos na fisiopatologia da HPIE ainda precisam ser esclarecidos
O diagnoacutestico da HPIE pode ser feito pela evidecircncia de sangue na traqueacuteia
visiacutevel atraveacutes de exame endoscoacutepico (HINCHCLIFF et al 2005b ERICKSON e
POOLE 2007) pela contagem de eritroacutecitos no LBA (MEYER et al 1998) ou pela
39
presenccedila de hemossideroacutefagos (macroacutefagos contendo hemossiderina ou eritroacutecitos)
no AT (EPPINGER 1990 MICHELOTTO JUacuteNIOR et al 2007) eou no LBA
(DOUCET e VIEL 2002 SAacuteNCHEZ et al 2005 BIAVA et al 2006) realizado uma
hora apoacutes o exerciacutecio A presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA eacute considerada a
forma mais sensiacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993)
Em resumo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas acompanhada de
hiperresponsividade e hipersecreccedilatildeo de muco denominada doenccedila inflamatoacuteria das
vias aeacutereas (DIVA) bem como a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio
(HPIE) satildeo causas de enormes perdas econocircmicas e de queda de rendimento
desportivo interrupccedilatildeo nos treinamentos e de encerramento de campanha em
cavalos de corrida Apesar disso a maioria dos estudos sobre as doenccedilas
inflamatoacuterias das vias aeacutereas dos cavalos satildeo direcionados para a ORVA e a
fisiopatologia da DIVA ainda estaacute pouco esclarecida bem como os mecanismos
inflamatoacuterios da HPIE ainda precisam ser mais bem estudados
Tendo-se em vista estes aspectos a hipoacutetese levantada no presente estudo
foi de que o desafio ambiental e o exerciacutecio fiacutesico estejam acompanhados de
estresse oxidativo alterando o quadro inflamatoacuterio possivelmente por alterar a
produccedilatildeo de PAF no pulmatildeo com consequumlente alteraccedilatildeo da funcionalidade celular
e que a hemorragia pulmonar pode exercer influecircncia sobre essa situaccedilatildeo As
ceacutelulas estudadas foram os macroacutefagos alveolares os quais podem apresentar um
papel central na regulaccedilatildeo deste processo
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVOS GERAIS
Verificar alteraccedilotildees em paracircmetros cliacutenicos e inflamatoacuterios pulmonares em
cavalos puro sangue inglecircs (PSI) de corrida jovem submetidos ao desafio ambiental
e ao treinamento fiacutesico
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Avaliar os seguintes paracircmetros cliacutenicos e laboratoriais
- Avaliaccedilatildeo cliacutenica
- Avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas
- Avaliaccedilatildeo citoloacutegica das vias aeacutereas atraveacutes das teacutecnicas de aspirado
traqueal (AT) e de lavado broncoalveolar (LBA)
- Avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas
e a produccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos e nitritos no LBA
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por macroacutefagos alveolares
bem como a capacidade fagocitaacuteria e de adesatildeo
- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio
(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por neutroacutefilos do sangue
perifeacuterico bem como a capacidade fagocitaacuteria
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 REAGENTES E SEDATIVOS
O BN52021 (Gingkolide B) foi obtido da Biomol (Plymouth Meeting PA USA)
Fura-2 AM (cat num F-0888) PAF (β-Acetyl-γ-O-hexadecyl-L-α-
phosphatidylcholine P-4904) foram obtidos da Sigma (St Louis MO USA) A
coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacuteticoreg) foi obtida da Laborclin (Pinhais PR Brasil) e
a acepromazina da Univet (Satildeo Paulo SP Brasil) A xylazina e o butorphanol foram
obtidos do laboratoacuterio Fort Dodge (Satildeo Paulo SP Brasil) Todos os demais
reagentes foram comprados da Sigma (St Louis MO USA)
32 ANIMAIS
Foram utilizados equinos machos adultos jovens (potros) da raccedila puro sangue
inglecircs (PSI) de cinco diferentes criatoacuterios (haras) da regiatildeo metropolitana de Curitiba
estado do Paranaacute (Haras Cifra e Haras dos Girassoacuteis em Piraquara Haras
Palmerini e Haras Belmont em Satildeo Joseacute dos Pinhais e Haras Santa Rita da Serra
em Tijucas do Sul e potros de quatro diferentes cocheiras no Jockey Club do
Paranaacute (Av Viacutector Ferreira do Amaral 2291 Tarumatilde Curitiba PR)
Inicialmente os potros foram divididos em trecircs grupos O primeiro grupo foi
denominado grupo condiccedilotildees naturais (CN n=45) compreendendo os potros dos
haras vivendo soltos em piquetes dia e noite alimentando-se de gramiacuteneas e
leguminosas da pastagem mais complemento peletizado fornecido no campo A
meacutedia de idade dos animais deste grupo foi de 145 plusmn 04 meses O segundo grupo
foi denominado grupo desafio ambiental (DA n=45) constituiacutedo por potros
estabulados por 30 dias com o propoacutesito de preparaacute-los para o iniacutecio de treinamento
Estes animais eram mantidos em grupos de 15 a 20 potros sendo que permaneciam
em baias individuais com dimensotildees de 35m x 35m x 35m em meacutedia em cama de
serragem e alimentados duas vezes ao dia com aveia mais raccedilatildeo peletizada e feno
de gramiacutenea e de alfafa A meacutedia de idade dos potros do grupo DA foi de 217 plusmn 29
meses O terceiro grupo foi denominado de grupo exerciacutecio (EX n=34) onde foram
incluiacutedos potros ineacuteditos (satildeo considerados ineacuteditos animais que ainda natildeo correram
42
em hipoacutedromos oficiais) mas que estavam em treinamento para corrida haacute
aproximadamente cinco meses e mantidos nas mesmas condiccedilotildees de estabulaccedilatildeo e
alimentaccedilatildeo que os potros do grupo DA Estes animais foram acompanhados
durante o periacuteodo de treinamento sendo que a avaliaccedilatildeo cliacutenica endoscoacutepica e a
colheita de LBA ocorreu 24 horas apoacutes seu primeiro exerciacutecio intenso (15 ms ndash 16
ms) em 800m ndash 1000m de distacircncia na pista de areia do Jockey Club do Paranaacute A
meacutedia de idade dos potros do grupo EX foi de 270 plusmn 03 meses
A obtenccedilatildeo de dados para o presente trabalho de pesquisa ocorreu durante
uma sequumlecircncia de experimentos independentes durante um periacuteodo de 18 meses
Durante este periacuteodo grupos de potros foram acompanhados ateacute se encontrarem
nas condiccedilotildees estabelecidas para cada grupo quando entatildeo foram avaliados As
amostras do grupo CN foram obtidas de oito diferentes experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois durante o inverno trecircs durante a primavera e um no outono
As amostras do grupo DA foram provenientes de seis experimentos sendo dois
durante o veratildeo dois no inverno e dois no outono e para o grupo EX os resultados
advieram de amostras obtidas durante o veratildeo em cinco ocasiotildees e durante a
primavera em quatro totalizando nove experimentos independentes para este grupo
Os resultados apresentados para cada uma das anaacutelises provecircm de pelo menos
trecircs experimentos independentes
Todos os animais estudados eram pertencentes a estabelecimentos com
programa de desverminaccedilatildeo bimensal bem como foram todos vacinados
regularmente contra Influenza Equina e Herpes Viacuterus Equino tipos 1 e 4 A
alimentaccedilatildeo utilizada nos estabelecimentos que cederam os potros para o estudo
era similar bem como a anaacutelise da alimentaccedilatildeo utilizada para os potros dos trecircs
grupos natildeo diferiu no que se refere a constituintes essenciais que poderiam
influenciar nas avaliaccedilotildees realizadas no presente trabalho Os criteacuterios de inclusatildeo
para os potros dos trecircs grupos foram os estabelecidos e jaacute descritos previamente
nas caracteriacutesticas de cada grupo e a exclusatildeo do estudo ocorreu quando da
histoacuteria de doenccedila recente ou diferenccedilas em manejo
As comparaccedilotildees intergrupos foram feitas entre os grupos CN e DA (diferenccedila
ambiental) e entre os grupos DA e EX (diferenccedila no regime de exerciacutecio)
Na segunda etapa do trabalho dedicada ao estudo da hemorragia pulmonar
induzida pelo exerciacutecio (HPIE) avaliou-se somente os potros do grupo EX agora
com n=37 Este grupo foi dividido em subgrupos sendo o subgrupo HPIE pos (n=23
43
constituiacutedo por potros com qualquer percentual de hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo
citoloacutegica do LBA) e subgrupo HPIE neg (n=14 constituiacutedo por potros sem
hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA) Nesta etapa as comparaccedilotildees
realizadas foram entre os subgrupos HPIE pos e HPIE neg
33 ASPECTOS EacuteTICOS
Este trabalho de pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Experimentaccedilatildeo Animal (CEEA) do setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR sob o
nuacutemero de registro 168 e pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso de Animais (CEUA) da
Pontifiacutecia Universidade Catoacutelica do Paranaacute sob o nuacutemero de registro 129 e estaacute de
acordo com o Guiding Principles in the Care and Use of Animals
34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA
Preacutevio agrave colheita de material procedeu-se a avaliaccedilatildeo cliacutenica de cada potro
iniciada pela histoacuteria incluindo possiacuteveis ocorrecircncias meacutedicas relevantes agrave sauacutede do
sistema respiratoacuterio manejo alimentaccedilatildeo desverminaccedilatildeo e vacinaccedilatildeo Na histoacuteria
incluiu-se tambeacutem a informaccedilatildeo sobre a ocorrecircncia de tosse espontacircnea quando em
piquetes na baia no momento da alimentaccedilatildeo ou durante o treinamento O exame
fiacutesico incluiu a observaccedilatildeo da presenccedila de secreccedilatildeo nasal estiacutemulo da tosse
palpaccedilatildeo de linfonodos submandibulares e retrofaringeanos auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e
auscultaccedilatildeo traqueal e pulmonar (McGORUM e DIXON 2007)
35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS
A avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas foi realizada previamente a
realizaccedilatildeo do LBA com o animal tranquumlilizado atraveacutes da administraccedilatildeo de
acepromazina (acepran 1 Univet) (003 mgkg IM) e apoacutes 30 minutos seguindo-
se a administraccedilatildeo de xilazina (sedazine Fort Dodge) (03-05 mgkg IV) mais
butorfanol (torbugesic Fort Dodge) (005 mgkg IV) (HOFFMAN 1999 HEWSON e
VIEL 2002) Utilizou-se um fibroscoacutepio flexiacutevel Pentax de 170 cm de comprimento e
128 mm de diacircmetro para a avaliaccedilatildeo das vias aeacutereas superiores e inferiores ateacute a
bifurcaccedilatildeo da traqueacuteia
44
A presenccedila de foliacuteculos linfoacuteides na faringe foi graduada segundo RAKER e
BOWLES (1978) adotando-se a graduaccedilatildeo de I a IV (QUADRO 1) e graus III e IV
foram considerados como faringite
A movimentaccedilatildeo das cartilagens aritenoacuteides foi graduada de I a IV segundo
RACKESTRAW et al (1991) (QUADRO 2) e graus III e IV foram considerados como
anormais
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Faringe com poucos foliacuteculos claros na parede dorsal
Grau II Presenccedila de numerosos pequenos foliacuteculos juntamente a
hiperemia cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau III Presenccedila de grandes grupos de foliacuteculos hiperecircmicos
cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe
Grau IV Presenccedila de foliacuteculos grandes edematosos e hiperecircmicos
por toda a mucosa faringeana
QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA FARINGE FONTE RAKER E BOWLES (1978)
GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO
Grau I Movimentaccedilatildeo sincrocircnica e abduccedilatildeo completa das
cartilagens aritenoacuteides
Grau II Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo com abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) conseguida com a degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
Grau III Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores
fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda
durante qualquer fase da respiraccedilatildeo e a abduccedilatildeo
completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo
agrave direita) natildeo eacute conseguida na degluticcedilatildeo nem na
oclusatildeo nasal
Grau IV
(Hemiplegia
Laringeana)
Cartilagem aritenoacuteide esquerda posicionada
medialmente na glote e natildeo apresenta movimento
quando da degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal
QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE I A IV FONTE RACKESTRAW et al (1991)
45
Especial interesse foi dado agrave presenccedila de muco no lume traqueal e sua
quantificaccedilatildeo atraveacutes de graduaccedilatildeo de 0 a 5 conforme GERBER et al (2004)
(FIGURA 10)
FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME ENDOSCOacutePICO FONTE GERBER et al 2004
Quando da observaccedilatildeo de muco traqueal este foi aspirado atraveacutes de tubo
de silicone introduzido pelo canal de trabalho do endoscoacutepio sendo imediatamente
transferido para uma lacircmina de microscopia e deixado para secar ao ar As lacircminas
foram coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico Laborclin Pinhais PR
Brasil) e 500 ceacutelulas foram contadas em aumento de 1000X (HODGSON e
HODGSON 2003)
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o aspirado traqueal (AT)
contendo lt10 de linfoacutecitos lt1 de eosinoacutefilos e lt20 de neutroacutefilos (ROBINSON
2003 HODGSON e HODGSON 2007)
36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)
Para a realizaccedilatildeo do LBA foi utilizado um cateter flexiacutevel de silicone
especiacutefico para a obtenccedilatildeo de LBA de equinos marca Cook (V-PBAL-300 Cook Vet
Products Hamburg Alemanha) de 300 cm de comprimento e 8 mm de diacircmetro
Este foi introduzido agraves cegas via nasotraqueal preferencialmente do lado direito ateacute
se alojar em um brocircnquio quando o cuff na extremidade distal era inflado com 5-10
mL de ar Utilizou-se 300 mL de soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada (PBS) esteacuteril e
com heparina soacutedica (5 UImL de PBS) preacute-aquecidos a 37oC (HOFFMAN 1999
PICKLES et al 2002abc MORI et al 2003 RIIHIMAumlKI et al 2008b) O PBS era
infundido em aliacutequotas de 120 mL (HEWSON e VIEL 2002) aspirando-se
46
gentilmente apoacutes cada aliacutequota e dispensando-se o LBA recolhido em frascos
plaacutesticos esteacutereis mantidos em isopor com gelo Este procedimento foi repetido ateacute
que o volume de 300 mL era totalmente empregado O material recolhido foi mantido
refrigerado em isopor com gelo ateacute a chegada ao Laboratoacuterio de Metabolismo
Celular no Departamento de Fisiologia do Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR
para o processamento em menos de 3 horas apoacutes a colheita (PICKLES et al 2002c
VIEL e HEWSON 2003)
No laboratoacuterio o LBA era centrifugado a 340g (1300 rpm) por seis minutos a
40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA) e o pellet obtido foi
ressuspendido em 2 mL de PBS para a contagem do nuacutemero total de ceacutelulas
nucleadas (NTCN)
37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA
A contagem do NTCN foi realizada usando-se a cacircmara de Neubauer Uma
aliacutequota da suspensatildeo de ceacutelulas foi diluiacuteda 110 em PBS em um frasco de
centrifugaccedilatildeo de 15 mL de fundo cocircnico (Eppendorf) Desta uma aliacutequota de 50 microL
foi misturada a 50 microL do corante vital Azul de Tripan para a contagem das ceacutelulas
vivas A partir do nuacutemero de ceacutelulas vivas por mililitro da suspensatildeo de ceacutelulas a
concentraccedilatildeo da suspensatildeo de ceacutelulas foi ajustada para 5 x 106 ceacutelulasmL para as
avaliaccedilotildees da atividade de macroacutefago alveolar (fagocitose produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e adesatildeo ndash ver toacutepicos 315 316
317 e 318)
Para a avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA lacircminas para microscopia
foram preparadas a partir de 10 μL da suspensatildeo de ceacutelulas distribuiacutedos de forma
circular sobre a lacircmina secadas ao ar e coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski
(Panoacutetico Laborclin Pinhais PR Brasil) (HEWSON e VIEL 2002) e 500 ceacutelulas
foram contadas em aumento de 1000X
Foi considerado achado citoloacutegico normal para o LBA contendo em meacutedia
60 de macroacutefagos 35 de linfoacutecitos lt5 de neutroacutefilos lt2 de mastoacutecitos lt1
de eosinoacutefilos (ROBINSON 2003 MAZAN e HOFFMAN 2003 RICHARD et al
2009)
47
38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957)
Uma porccedilatildeo correspondente a 90 mg de pellet de ceacutelulas do LBA foi
ressuspendido em um solvente extrator (metanolclorofoacutermio12 volvol) na
quantidade de 18 mL e sonicado (6 ciclos de 4 segundos) Os tubos foram
deixados em gelo por 20 minutos
Na etapa seguinte mais metanol foi adicionado (324 microL o caacutelculo eacute a
quantidade de sovente extrator x 0180 resultando na quantidade de metanol em
mililitros) para reduzir a densidade do liacutequido e possibilitar assim a decantaccedilatildeo do
material particulado insoluacutevel no meio Apoacutes o material foi centrifugado a 5000g por
10 minutos a 40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
O sobrenadante foi transferido para tubos de vidro e clorofoacutermio foi
adicionado (648 microL ou seja o dobro da quantidade de metanol utilizada
anteriormente)
Na sequumlecircncia o extrato foi lavado uma vez com 19 mL de aacutegua ultra pura O
sistema bifaacutesico formado foi submetido a uma intensa agitaccedilatildeo ateacute natildeo serem mais
distinguiacuteveis as duas fases (forma-se momentaneamente uma emulsatildeo) Nesta
etapa substacircncias com maior afinidade agrave aacutegua do que ao solvente orgacircnico satildeo
solubilizadas no meio aquoso e portanto se separam dos lipiacutedios
Apoacutes a reconstituiccedilatildeo espontacircnea do sistema bifaacutesico o sobrenadante
(aquoso) foi removido com o auxiacutelio de uma micropipeta cuidando-se para natildeo
retirar o que se encontrava abaixo
Em seguida foi adicionado o FSP (CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM NaCl 497
mM clorofoacutermio 30 metanol 490 aacutegua ultra pura 480) lentamente (para
evitar a formaccedilatildeo de emulsatildeo) e de maneira que as paredes do tubo fossem lavadas
com esta soluccedilatildeo Apoacutes a remoccedilatildeo do sobrenadante este procedimento foi repetido
mais duas vezes
A mistura de clorofoacutermio e metanol na qual estavam dissolvidos os lipiacutedios
foi evaporada em banho-maria a 370C sob corrente de nitrogecircnio O extrato lipiacutedico
seco foi armazenado a -800C em atmosfera de nitrogecircnio Para a determinaccedilatildeo da
bioatividade de PAF (toacutepico 310) esses extratos foram solubilizados em 100 microL de
DMSO sob agitaccedilatildeo intensa
48
39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS
O sangue de cavalo foi colhido em bolsas de transfusatildeo (CPDA-1 JP
Induacutestria Farmacecircutica SA Satildeo Paulo Brasil) atraveacutes de punccedilatildeo venosa jugular
O sangue foi diluiacutedo 11 (vv) em PBS e 40 mL do sangue diluiacutedo foram
adicionados a tubos para centriacutefuga esteacutereis (tubos Falcon de 50 mL) sobre 8 mL de
Ficoll Paque Plus e centrifugado (400g por 40 minutos a 40C) para o isolamento das
ceacutelulas PMN por gradiente
Apoacutes a centrifugaccedilatildeo a camada superior composta por plasma soluccedilatildeo de
Ficoll e ceacutelulas mononucleares foi descartada A camada inferior composta
principalmente por PMNs e eritroacutecitos foi dividida em duas aliacutequotas iguais as quais
foram separadas em dois tubos para centriacutefuga A cada aliacutequota foi adicionada
soluccedilatildeo hemoliacutetica (NH4Cl 077 tris[hydroxymethyl]aminomethane 021 pH 74
soluccedilatildeo aquosa) para completar 50 mL e incubadas por 20 minutos a 370C em
estufa
A seguir a suspensatildeo celular livre dos eritroacutecitos foi centrifugada (400g 6
min 4oC) O sobrenadante foi descartado e o pellet de ceacutelulas (basicamente PMNs)
foi ressuspendido em 5 mL de PBS contendo glucose 5 mM A densidade de ceacutelulas
foi determinada em cacircmara de Neubauer e ajustada para 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL
A viabilidade celular foi determinada atraveacutes do corante vital Azul de Tripan e
resultou aproximadamente 95 A percentagem de neutroacutefilos na suspensatildeo de
PMNs foi superior a 90 determinada pela coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico
Laborclin Pinhais PR Brasil)
310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE Ca++ EM PMNS INDUZIDO POR PAF
(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE et al 2001)
Agrave suspensatildeo de PMNs (toacutepico 39) na densidade de 10 x 107 ceacutelulas
viaacuteveismL foi adicionado FURA-2 AM (Sigma soluccedilatildeo estoque 1 nM em DMSO)
para concentraccedilatildeo final de 1 microM A suspensatildeo foi incubada em ambiente escuro a
37oC por 45 minutos
Nesta etapa os PMNs incorporaram o FURA-2 AM um indicador fluorescente
de caacutelcio Quando o FURA-2 AM estaacute ligado ao Ca++ haacute reduccedilatildeo da eficiecircncia de
49
excitaccedilatildeo a 380 nm e aumento da eficiecircncia de excitaccedilatildeo a 340 nm observados no
comprimento de onda de emissatildeo de 510 nm Com isso eacute possiacutevel quantificar a
concentraccedilatildeo de Ca++ intracelular nas ceacutelulas carregadas com FURA-2 AM atraveacutes
da relaccedilatildeo da intensidade de emissatildeo a 510 nm entre os comprimentos de onda de
excitaccedilatildeo de 340 nm e de 380 nm (relaccedilatildeo 340380 nm)
Apoacutes a incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram lavadas duas vezes com soluccedilatildeo de
Ringer (NaCl 1425 mM KCl 40 mM CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM 50 mM 4-(2-
hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid glicose 50 mM pH 74 soluccedilatildeo
aquosa) para a remoccedilatildeo do FURA-2 AM que natildeo foi incorporado agraves ceacutelulas
As ceacutelulas entatildeo foram ressuspendidas em soluccedilatildeo de Ringer para uma
concentraccedilatildeo final de 225 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL Esta foi a preparaccedilatildeo utilizada
na leitura de fluorescecircncia
A suspensatildeo de ceacutelulas foi mantida em gelo ateacute a sua utilizaccedilatildeo Aliacutequotas de
2 mL eram previamente incubadas em banho-maria por 4 minutos a 37oC no escuro
(tubo envolto em papel alumiacutenio) previamente a serem transferidas para uma cubeta
para a leitura da fluorescecircncia em espectrofluoriacutemetro acoplado a um
microcomputador (RF5301PC Shimadzu Kyoto Japatildeo) controlado pelo software
Super Ion Probe (Shimadzu Kyoto Japatildeo) Durante esta incubaccedilatildeo as ceacutelulas que
seriam utilizadas como controle negativo para PAF foram tratadas com antagonista
de receptor de PAF BN52021 (Biomol soluccedilatildeo 10 mM em DMSO)
Foi utilizada excitaccedilatildeo dual com comprimentos de onda 340 nm e 380 nm
(janela de leitura de 2 segundos) com emissatildeo registrada a 510 nm A temperatura
foi mantida em 37oC pelo sistema termostatisado do aparelho A leitura da
fluorescecircncia consistiu primeiramente da obtenccedilatildeo de uma linha de base nos
primeiros 50 segundos Apoacutes esta leitura inicial foram adicionados 10 microL do extrato
lipiacutedico (toacutepico 38) agrave suspensatildeo de ceacutelulas seguindo-se a agitaccedilatildeo (por 3
segundos) com uma barra magneacutetica presente dentro da cubeta A leitura foi feita
entatildeo por mais 100 segundos
Para cada amostra foram realizados os procedimentos descritos na presenccedila
e na ausecircncia de BN52021 A resposta maacutexima obtida pelo tratamento da
suspensatildeo de PMNs com extrato lipiacutedico na presenccedila de BN52021 foi subtraiacuteda da
resposta maacutexima obtida na ausecircncia deste antagonista O resultado desta subtraccedilatildeo
foi utilizado como indicador semiquantitativo da bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico e os resultados foram expressos como relaccedilatildeo 340380 nm
50
Antes de analisar as amostras de extrato lipiacutedico para a bioatividade de PAF
a cada experimento a suspensatildeo de PMNs tratada com FURA-2 AM foi testada com
PAF (1-0-palmitil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina soluccedilatildeo estoque de 3 mM em
DMSO da Sigma) nas concentraccedilotildees de 1 10 e 100 nM e com 100 nM na presenccedila
de 150 microM de BN52021 (concentraccedilatildeo suficiente para antagonizar 102 nM de PAF)
A resposta dos PMNs de equinos aos padrotildees de PAF eacute mostrada na FIGURA 11
sendo representativa dos dados obtidos em todos os experimentos
FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO REGISTRADA A 510 nm () SUSPENSAtildeO DE PMN () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 1 nM (diams) SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 10 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 100 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + BN52021 150 microM + PAF 100 nM A EMISSAtildeO BASAL DAS CEacuteLULAS PMN FOI REGISTRADA POR 50 SEGUNDOS PREVIAMENTE Agrave ADICcedilAtildeO DE PAF
Os PMNs do sangue de equinos foram utilizados no presente estudo como
uma ferramenta para a avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF (pelo influxo de Ca++ nos
PMNs induzido por PAF) Para a determinaccedilatildeo da viabilidade desta ferramenta
estudou-se a resposta dos PMNs do sangue de equino a diferentes concentraccedilotildees
de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na ausecircncia do antagonista de
PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose de neutroacutefilos e a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio por neutroacutefilos pelas teacutecnicas descritas
51
abaixo (ver toacutepicos 315 ndash fagocitose de macroacutefago alveolar 316 ndash produccedilatildeo de
acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar e 317 ndash produccedilatildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio por macroacutefago alveolar) sendo que para cada ensaio foram realizadas
quatro repeticcedilotildees Igualmente estudou-se a resposta do macroacutefago alveolar a
diferentes concentraccedilotildees de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na
ausecircncia do antagonista de PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose e a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem realizando-se quatro
repeticcedilotildees para cada anaacutelise
311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)
Em microplaca de 96 poccedilos 250microL de reagente de Bradford (100mg de
Coomassie Blue 50 mL de etanol 95 + 100 mL de aacutecido fosfoacuterico 85 completar
com aacutegua ultra pura para 1000 mL) foi adicionado a 10 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA) Nesta etapa o
corante Comassie eacute complexado por proteiacutenas presentes na amostra o que muda a
sua cor
Apoacutes 5 minutos em temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada a
595 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-Rad
Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) A concentraccedilatildeo de proteiacutenas foi determinada
interpolando-se os valores de absorbacircncia numa curva padratildeo resultante de
concentraccedilotildees conhecidas de albumina seacuterica bovina (Sigma) Os resultados foram
expressos como miligramas de proteiacutenas por mililitro de LBA
312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR e MARLETTA 1985)
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA foi utilizada como indicador da produccedilatildeo de
oacutexido niacutetrico na regiatildeo broncoalveolar
Em micro placa de 96 poccedilos adicionou-se 100 microL de reagente de Griess
(mistura de cloreto de naftiletilenodiamina a 005 e por sulfanilamida a 05 em
meio aacutecido proporcionado por H3PO4 a 25) a 100 microL de LBA sem ceacutelulas
(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu
processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA)
52
A sulfanilamida (um derivado de anilina) reage com o aacutecido nitroso e apoacutes
rearranjos intramoleculares forma o iacuteon diazocircnio Apoacutes o iacuteon diazocircnio reage com a
naftiletilenodiamina (um derivado de naftilamina) para formar pigmento roacuteseo
Depois de 5 minutos na temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada
a 550 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-
Rad Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) Os resultados foram expressos como
absorbacircncia a 550 nm
313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO
LBA (NOUROOZ-ZADEH et al 1994)
Utilizou-se uma aliacutequota de suspensatildeo de ceacutelulas de LBA na densidade de
15 x 106 ceacutelulasmL de LBA Esta foi ultrasonicada (6 ciclos de 4 segundos) em 1mL
de metanol sendo centrifugada em seguida a 5000g por 5 minutos a 40C
(Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)
Uma aliacutequota de 50 microL de sobrenadante foi armazenada para posterior
mensuraccedilatildeo da concentraccedilatildeo total de proteiacutenas
Para cada amostra aliacutequotas de 90 microL foram depositadas em seis frascos
para centriacutefuga (de 15 mL Eppendorf) foi agitada no voacutertex e incubada por 30
minutos a temperatura ambiente A trecircs desses tubos foram adicionados 10 microL de
soluccedilatildeo metanoacutelica de trifenilfosfina (TPP Sigma) 10 mM para ocorrer a reduccedilatildeo
seletiva de hidroperoacutexidos (os grupamentos hidroperoacutexido especificamente os
presentes em lipiacutedios satildeo convertidos a grupamentos hidroxila pela trifenilfosfina)
As amostras contidas nos trecircs tubos restantes receberam apenas 10 microL de metanol
Todos os tubos foram agitados vigorosamente e entatildeo incubados em temperatura
ambiente por 30 minutos
Apoacutes adicionou-se a todos os tubos 900 microL de reagente de FOX2 Este
reagente deve ser preparado no momento do uso consistindo de xilenol laranja 100
microM hidroxitolueno butilado (BHT) 400 mM aacutecido sulfuacuterico 25 mM e sulfato ferroso
de amocircnio 250 microM em metanol 90 (vv em aacutegua) Apoacutes agitaccedilatildeo o meio
reacional foi incubado por mais 30 minutos a temperatura ambiente
Nesta etapa os caacutetions ferrosos (Fe2+) do reativo de FOX2 satildeo oxidados por
hidroperoacutexidos presentes na amostra (tanto pelos hidroperoacutexidos lipiacutedicos quanto
por outros tipos de hidroperoacutexidos presentes na amostra) Como todos os
53
hidroperoacutexidos lipiacutedicos das amostras tratadas com TPP foram reduzidos a
produccedilatildeo de Fe3+ seraacute menor nestas do que nas amostras natildeo tratadas com TPP
O Fe3+ formado eacute entatildeo quelado pelo xilenol laranja o que faz a cor deste
indicador passar de laranja a azul-puacuterpura (passa a absorver luz em 560 nm)
Passado o tempo de incubaccedilatildeo a absorbacircncia foi mensurada a 560 nm
utilizando-se um espectrofotocircmetro (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil
Satildeo Paulo)
Subtraiu-se entatildeo o valor da absorbacircncia das amostras tratadas com TPP
(sem hidroperoacutexidos lipiacutedicos) do valor da absorbacircncia das amostras sem TPP O
valor obtido nessa subtraccedilatildeo (referente apenas agrave quantidade de ferro oxidado por
hidroperoacutexidos lipiacutedicos) foi utilizado na foacutermula da curva padratildeo de peroacutexido de
hidrogecircnio obtida com soluccedilotildees padratildeo de diferentes concentraccedilotildees (1000 500
250 125 62 31 e 16 microM) submetidas aos mesmos procedimentos descritos
acima para a dosagem de hidroperoacutexidos (com exceccedilatildeo ao tratamento com TPP) O
resultado obtido foi referente agrave concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos
Dividiu-se o valor da concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos pela
concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais do extrato metanoacutelico Os resultados foram
expressos como nmolesmg de proteiacutenas
314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984)
Utilizou-se 300 microL de uma suspensatildeo de ceacutelulas de LBA em PBS na
densidade de 5 x 106 ceacutelulasmL que foram centrifugados (10600g por 20min a
4oC) para remoccedilatildeo de partiacuteculas
Apoacutes foi colocada em banho com gelo Uma aliacutequota de 10 microL desse extrato
de ceacutelulas foi adicionada a 990 microL de meio reativo (soluccedilatildeo aquosa de H2O2 20 mM
tris[hidroximetil] aminometano 005M e EDTA 025 mM pH 74)
Imediatamente utilizando-se um espectrofotocircmetro acoplado a um
microcomputador (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil Satildeo Paulo)
monitorou-se a absorbacircncia a 220 nm por 90 segundos a 370C com intervalos de 2
segundos entre leituras consecutivas
A degradaccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio pela catalase causa uma diminuiccedilatildeo
gradual na absorbacircncia do meio reativo a 220 nm a qual indica a atividade da
catalase no extrato de ceacutelulas Os valores de atividade da catalase foram corrigidos
54
pela concentraccedilatildeo de proteiacutenas do extrato de ceacutelulas (realizado conforme descrito
no toacutepico 311) e foram expressos como micromoles de H2O2minmg proteiacutenas
315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA et al 1998)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL (= 5 x 105
ceacutelulaspoccedilo) e os macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A
suspensatildeo de ceacutelulas na densidade descrita foi obtida durante o processamento do
LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS e foram adicionados
20microL de zymosan corado com vermelho neutro (67 mgmL) mais 100 microL de PBS
sendo deixados a temperatura ambiente por 30 minutos
Em seguida depois de descartado o sobrenadante as ceacutelulas foram fixadas
com soluccedilatildeo de Baker (4 formaldeiacutedo 2 cloreto de soacutedio 1 acetato de caacutelcio
soluccedilatildeo aquosa) por 30 minutos
Apoacutes os poccedilos foram lavados com PBS para que o zymosan corado com
vermelho neutro natildeo fagocitado por macroacutefagos alveolares fosse retirado
Em seguida o corante vermelho neutro foi solubilizado em cada poccedilo com
200microL de soluccedilatildeo aacutecido-aacutelcool (aacutecido aceacutetico 1 etanol 50 soluccedilatildeo aquosa) e
deixado por 30 minutos
Apoacutes este periacuteodo a absorbacircncia foi mensurada a 550 nm Os resultados
foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 -
Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR
(DYRYNDA et al 1998)
Estimou-se a produccedilatildeo de acircnions pela da formaccedilatildeo de formazan produto da
reduccedilatildeo do NBT (nitroblue tetrazolium) pelo acircnion superoacutexido Avaliou-se a produccedilatildeo
de acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA
(phorbol myristate acetate) O PMA estimula o complexo NADPH oxidase na
membrana dos fagoacutecitos a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
55
mimetizando o resultado da fagocitose de um microorganismo (DEKKER et al
2000)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para a retirada das
ceacutelulas natildeo aderentes Em seguida adicionou-se a cada poccedilo 100 microL de PBS com
NBT 02 ou com NBT 02 mais PMA 11microM sempre em triplicatas para cada
potro
Apoacutes a incubaccedilatildeo por 1 hora a 370C e em ambiente escuro (a placa deve
estar envolta em papel alumiacutenio) a placa foi centrifugada (800g por 5 minutos a
40C) Em seguida o sobrenadante foi descartado e 100 microL de PBS foram
adicionados a cada poccedilo e a placa foi novamente centrifugada
Apoacutes o sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram fixadas com metanol
por 10 minutos Em seguida a placa passou por nova centrifugaccedilatildeo o sobrenadante
foi descartado e a placa foi deixada secar ao ar em estufa
Em seguida a placa foi lavada duas vezes com metanol 50 e o formazan
(produto da reaccedilatildeo entre o NBT e o acircnion superoacutexido) foi solubilizado atraveacutes da
incubaccedilatildeo por 30 minutos com 120 microL soluccedilatildeo aquosa de hidroacutexido de potaacutessio 2M
e 140 microL de dimetilsulfoacutexido por poccedilo
A absorbacircncia foi lida a 595 nm e os resultados foram corrigidos pela adesatildeo
de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago
Alveolar)
317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO
ALVEOLAR (PICK e MIZEL 1981)
Mensurou-se a produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) por macroacutefago
alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA atraveacutes da oxidaccedilatildeo do vermelho
fenol pela peroxidase onde esta enzima utiliza nesta reaccedilatildeo o H2O2 O composto
oxidado absorve luz em pH baacutesico com maacutexima intensidade em 550 nm
56
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS observando-se a retirada
de grumos presentes nos poccedilos Em seguida 100 microL de soluccedilatildeo de vermelho fenol
(PRS phenol red solution 140 mM NaCl 10 mM fosfato de potaacutessio 55 mM
dextrose 056 mM vermelho fenol 19 UmL de HRPO horse radish peroxidase pH
70 soluccedilatildeo aquosa) ou soluccedilatildeo de vermelho fenol + PMA 110nM foram adicionados
a cada poccedilo em triplicatas e deixados incubar por 1 hora a 370C no escuro
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo adicionou-se 10 microL de NaOH 1N para
interromper a reaccedilatildeo alcalinizar o meio e permitir a absorbacircncia da soluccedilatildeo que foi
lida a 595 nm apoacutes 30 minutos
Os resultados foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada
potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)
318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN e GORDON 1987)
Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de
100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os
macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas
na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)
Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para se selecionar as
ceacutelulas aderentes que a seguir foram fixadas com metanol 50 por 10 minutos
Apoacutes este periacuteodo o sobrenadante foi descartado e 100 microL de corante de
Giemsa a 02 foram adicionados a cada poccedilo e deixados por 40 minutos em
temperatura ambiente
Os poccedilos foram novamente lavados com PBS por duas vezes observando-se
a retirada de grumos nos poccedilos e 200 microL de metanol 50 foram adicionados
Apoacutes 30 minutos a absorbacircncia da suspensatildeo foi lida a 550 nm
A adesatildeo resultou menor no grupo DA (n=17) em comparaccedilatildeo ao grupo CN
(n=36) (P=0010) sendo que o grupo EX (n=26) apresentou adesatildeo maior que o
grupo DA (P=0001) (FIGURA 12) indicando diferenccedilas na capacidade de adesatildeo
em placa acriacutelica possivelmente devido a diferenccedilas no estado funcional das ceacutelulas
57
de cada grupo Por esta razatildeo utilizou-se o ensaio de adesatildeo de macroacutefago
alveolar realizado concomitantemente aos ensaios de funccedilatildeo de macroacutefago
(fagocitose e produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) a cada
experimento realizado durante o estudo A correccedilatildeo dos valores obtidos de
macroacutefago em funccedilatildeo da adesatildeo foi feito atraveacutes da divisatildeo da meacutedia final obtida
para o ensaio de funccedilatildeo de macroacutefago dividido pela meacutedia obtida no ensaio de
adesatildeo para cada potro avaliado e a cada experimento realizado
FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 (ROSEN e GORDON 1987) aP=0010 vs CN e bP=0001 vs DA
319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
A normalidade na distribuiccedilatildeo dos dados foi avaliada pelo teste de D‟Agostino
e Pearson Valores considerados outliers pelo teste de Grubb foram excluiacutedos das
anaacutelises Para os dados que apresentaram distribuiccedilatildeo normal dos valores
(distribuiccedilatildeo Gaussiana) (contagem percentual de linfoacutecitos concentraccedilatildeo total de
proteiacutenas do LBA bioatividade de PAF catalase hidroperoacutexidos nitritos fagocitose
de macroacutefago alveolar produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio
por macroacutefago alveolar) foi utilizado o teste t natildeo pareado Os dados com
distribuiccedilatildeo natildeo Gaussiana dos valores (contagens percentuais de neutroacutefilos de
58
eosinoacutefilos e de macroacutefagos multinucleados contagem do NTCN do LBA e adesatildeo
de macroacutefago alveolar) foram analisados pelo teste de Mann-Whitney A
comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos de funccedilatildeo de macroacutefago alveolar
estimulado e natildeo estimulado por PMA foi feita por teste t de Student natildeo pareado
Os achados cliacutenicos e endoscoacutepicos foram analisados por meio de teste de Mann-
Whitney A correlaccedilatildeo entre o percentual de um mesmo tipo celular no aspirado
traqueal e no lavado broncoalveolar foi analisada atraveacutes do teste de Spearman
Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas utilizando-se o programa GraphPad
Prism versatildeo 500 para Windows (GraphPad Software San Diego CA EUA) e os
valores apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia (SEM) Valores de
Plt005 foram considerados como significativos
4 RESULTADOS
41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO
411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica
Nenhum dos potros dos grupos CN e DA apresentou tosse segundo o
histoacuterico obtido Contudo oito potros (235) do grupo EX apresentaram tosse
espontacircnea na cocheira ou durante o treinamento o que resultou em diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0002) (TABELA 1)
A presenccedila de corrimento nasal seroso (coriza) observada nos trecircs grupos
estudados estaacute demonstrada na TABELA 1 Natildeo houve diferenccedila significativa entre
os grupos apesar de o percentual de potros com coriza no grupo DA ter reduzido
em relaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
Os linfonodos submandibulares eou retrofaringeanos estiveram aumentados
em 382 222 e 382 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
natildeo havendo diferenccedila entre os grupos (TABELA 1)
A auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e traqueal resultou normal em todos os potros
avaliados dos trecircs grupos estudados Contudo sons pulmonares crepitantes foram
audiacuteveis em 28 156 e 115 dos potros avaliados nos grupos CN DA e EX
respectivamente havendo um aumento do percentual de crepitaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo DA em ralaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)
TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DE CORRIDA
Grupos Tosse
Espontacircnea
Corrimento
Nasal
Linfonodos
Auscultaccedilatildeo
Pulmonar
CN 034
(0)
1534
(441)
1334
(382)
136
(28)
DA 045
(0)
1145
(244)
1045
(222)
745
(156)
EX 834
(235)a
1534
(441)
1334
(382)
326
(115)
aP=0002 vs DA
60
412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas
No iniacutecio da avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas primeiramente
considerando os foliacuteculos linfoacuteides faringeanos ou hiperplasia folicular linfoacuteide (HFL)
a distribuiccedilatildeo das diferentes graduaccedilotildees pode ser vista na TABELA 2
TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGEANOS OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS DE I A IV SEGUNDO RAKER E BOLES (1978)
Grupos HFL I HFL II HFL III HFL IV
CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)
DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)
EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)
Considerando as graduaccedilotildees de HFL III e IV como faringite esta
anormalidade foi observada em 546 286 e 539 dos potros dos grupos CN
DA e EX respectivamente Houve uma significativa reduccedilatildeo no percentual meacutedio de
observaccedilotildees de faringite para o grupo DA em comparaccedilatildeo ao grupo CN (P=0024)
enquanto no grupo EX o percentual de faringites foi significativamente maior em
relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0039)
Com relaccedilatildeo ao aspecto morfoloacutegico da epiglote um potro do grupo DA e um
potro do grupo EX evidenciaram epiglote com aspecto fraacutegil sendo que os demais
potros foram normais
Com relaccedilatildeo agrave avaliaccedilatildeo funcional da laringe todos os potros foram normais
apresentando graduaccedilotildees I ou II (TABELA 3)
TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE ACORDO COM RAKESTRAW et al (1991)
Grupos NLP I NLP II NLP III NLP IV
CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)
DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)
EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)
61
A quantidade de secreccedilatildeo observada no lume traqueal estaacute demonstrada na
TABELA 4
TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 SEGUNDO GERBER et al (2004)
Grupos 0 1 2 3 4 5
CN 233
(61)
933
(273)
933
(273)
1133
(332)
233
(61)
033
(0)
DA 742
(167)
1242
(286)
1242
(286)
742
(167)
342
(70)
142
(24)
EX 327
(111)
727
(259)
727
(259)
627
(223)
427
(148)
027
(0)
Quantidade de secreccedilatildeo traqueal acima de grau 2 considerada passiacutevel de
prejuiacutezo agrave troca gasosa e ao rendimento desportivo foi observada em 666 547
e 630 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente
413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT)
Os achados de anaacutelise citoloacutegica diferencial para os principais tipos celulares
do AT para os trecircs grupos de potros estudados estatildeo demonstrados na TABELA 5
TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN (n=20) DA (n=19) E EX (n=15) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
Grupos Mac Lin Neut Eos Mast Calic Multi Epit Sid
CN 429plusmn63 75
plusmn19
76
plusmn29
12
plusmn07
002
plusmn02
05
plusmn02
02
plusmn01
201
plusmn56
0
DA 591
plusmn41
141
plusmn24
85
plusmn23
11
plusmn05
0 01
plusmn01
11
plusmn02a
161
plusmn48
0
EX 593
plusmn42
134
plusmn23
171
plusmn49
09
plusmn03
0 05
plusmn03
08
plusmn03
71
plusmn32
09
plusmn04
Mac macroacutefago alveolar Lin linfoacutecitos Neut neutroacutefilos Eos eosinoacutefilos Mast mastoacutecitos Calic ceacutelulas caliciformes Multi macroacutefagos multinucleados Epit ceacutelulas epiteliais Sid hemossideroacutefagos aPlt0001 vs CN
62
414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA)
As quantidades de LBA recuperado estiveram entre 54 e 59 do volume
infundido para os grupos CN (n=16) DA (n=23) e EX (n=16)
415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
A contagem do NTCN e a contagem diferencial de ceacutelulas do LBA estatildeo
demonstradas na TABELA 6
TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN (n=45) DA (n=40) E EX (n=34) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM
CTCN
(ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Macroacutef
Multi
Hemosid
CN 395
plusmn 38
673
plusmn 17
294
plusmn 15
23
plusmn 04
05
plusmn 03
005
plusmn 004
04
plusmn 01
0
DA 343
plusmn 24
698
plusmn 14
281
plusmn 13
09
plusmn 02
12
plusmn 01
002
plusmn 002
11
plusmn 01d
0
EX 456
plusmn 28a
676
plusmn 18
229
plusmn 15
54
plusmn 11b
15
plusmn 07c
02
plusmn 01
13
plusmn 02
22
plusmn 06
CTCN = contagem total de ceacutelulas nucleadas Macroacutef = macroacutefagos Linfoacutec = linfoacutecitos Neutroacutef = neutroacutefilos Eosino = eosinoacutefilos Masto = mastoacutecitos Macroacutef Multi = macroacutefagos multinucleados Hemosid = hemossideroacutefagos aPlt001 vs DA bPlt0001 vs DA cPlt005 vs DA dPlt0001 vs CN
Hemossideroacutefagos foram observados somente no LBA dos potros do grupo
EX mais especificamente em 23 (622) deles representando 22 do total de
ceacutelulas A quantidade observada de hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 da
contagem citoloacutegica diferencial do LBA
A correlaccedilatildeo entre as contagens percentuais de um mesmo tipo celular no AT
e no LBA foi analisada para os potros do grupo CN (n=11) DA (n=18) e EX (n=12)
que tiveram material colhido para as duas teacutecnicas citoloacutegicas natildeo tendo sido
63
encontrada correlaccedilatildeo entre ambas as teacutecnicas de avaliaccedilatildeo citoloacutegica para
nenhuma das ceacutelulas
416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF
A resposta dos neutroacutefilos do sangue de equino frente ao PMA e frente ao
PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na ausecircncia e na presenccedila
do antagonista de PAF BN52021 estaacute demonstrado nas FIGURAS 13 a 15
FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF aP=0028 vs controle bPlt0001 vs sem BN52021 cP=0028 vs PMA
64
FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0007) 10nM (aP=0003) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA e PAF 1 e 10nM
FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF EM TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA ePlt0001 vs PAF 1nM e fPlt0001 vs PAF 1nM e 10nM
65
417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF
Tambeacutem se estudou a resposta dos macroacutefagos alveolares de equino frente
ao PMA e frente ao PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 demonstrado nas
FIGURAs 16 a 18
FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0003) 10nM (aPlt0001) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0010 vs PMA dPlt0001 vs PAF 01nM e PAF 1nM
66
FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0037) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA e PAF 01nM dPlt0001 vs PAF 1nM
FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 01nM e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA dPlt001 vs PAF 1nM e 10nM
67
418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos
foi mensurada pelo influxo de Ca++ em ceacutelulas PMN de equinos (FIGURA 19)
Registrou-se uma baixa relaccedilatildeo 340380 nm para os grupos CN (0005 plusmn 0002
relaccedilatildeo 340380 nm) e DA (0006 plusmn 0002 relaccedilatildeo 340380 nm) representando um
baixo niacutevel de bioatividade de PAF no LBA dos potros avaliados nestes grupos
Contudo a bioatividade de PAF do grupo EX (0068 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm) foi
significativamente maior em comparaccedilatildeo ao grupo DA (P=0017) Um graacutefico
representativo da bioatividade de PAF em uma das amostras do grupo EX na
ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 pode ser visto na FIGURA
20
CN DA EX000
002
004
006
008
010 a
Re
laccedil
atildeo
34
03
80
nm
Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedicodas Ceacutelulas do LBA
FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE AO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0017 vs DA
68
0 50 100
150
200
0
1
2
3
4
Tempo (segundos)
Bioatividade de PAFR
ela
ccedilatildeo
3403
80n
m
FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm A AMOSTRA Eacute ADICIONADA Agrave SUSPENSAtildeO DE CEacuteLULAS PMN APOacuteS 50 SEGUNDOS DE LEITURA BASAL (SETA)
419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi maior no grupo DA em relaccedilatildeo
ao grupo CN (014 plusmn 003 vs 003 plusmn 001 mg de proteiacutenasmL de LBA) (P=0001) O
grupo EX apresentou concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA (036 plusmn 006 mg de
proteiacutenasmL de LBA) significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001)
(FIGURA 21)
69
FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0001 vs CN bPlt0001 vs DA
4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos foi maior no LBA do grupo DA (019 plusmn 001
absorbacircncia 550 nm) em relaccedilatildeo ao grupo CN (014 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm)
(P=0011) O grupo EX apresentou uma reduccedilatildeo significativa na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA (008 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm) significativamente menor em
comparaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001) (FIGURA 22)
70
FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0011 vs CN bPlt0001 vs DA
4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (1047 plusmn 241 vs 66
plusmn 35 nmolesmg de proteiacutenas) (Plt0001) No grupo EX a concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos nas ceacutelulas do LBA apresentou reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo
DA (352 plusmn 84 vs 1047 plusmn 241 nmolesmg de proteiacutenas) (P=0007) (FIGURA 23)
71
Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos no LBA
CN DA EX0
50
100
150a
b
nm
ole
s
mg
de
pro
teiacuten
as
FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX (n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO APRESENTADOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNA DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aPlt0001 vs CN bP=0007 vs DA
4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA
No grupo EX a atividade da catalase nas ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol
H2O2minmg de proteiacutenas) (P=0002) natildeo havendo diferenccedila entre os grupos CN e
DA (FIGURA 24)
72
FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO microMOL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOMINUTOMILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0002 vs DA
4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
A fagocitose de macroacutefago alveolar foi significativamente maior no grupo DA
em comparaccedilatildeo ao grupo CN (223 plusmn 043 vs 072 plusmn 018 absorbacircncia 550
nmadesatildeo) (P=0002) Observou-se uma diminuiccedilatildeo na fagocitose no grupo EX em
relaccedilatildeo ao grupo DA (104 plusmn 027 vs 223 plusmn 043 absorbacircncia 550 nmadesatildeo)
(P=0006) (FIGURA 25)
73
FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A FAGOCITOSE PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (FAGOCITOSEADESAtildeO) aP=0002 vs CN e bP=0006 vs DA
4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar
A utilizaccedilatildeo de PMA aumentou significativamente a produccedilatildeo de acircnion
superoacutexido pelos macroacutefagos alveolares dos grupos DA (219 plusmn 053 vs 392 plusmn 062
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0049) e EX (060 plusmn 011 vs 090 plusmn 014
absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0031) A produccedilatildeo basal de acircnion superoacutexido foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (219 plusmn 053 vs 025
plusmn 007 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo DA (060 plusmn 011 vs 219 plusmn 053 absorbacircncia 595
nmadesatildeo) (P=0001) A produccedilatildeo de acircnion superoacutexido estimulada por PMA foi
significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (392 plusmn 062 vs 046
plusmn 016 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa
74
diminuiccedilatildeo na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido em comparaccedilatildeo ao grupo DA (090 plusmn
014 vs 392 plusmn 062 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) (FIGURA 26)
FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0049 vs DA bP=0031 vs EX cPlt0001 vs CN dP=0001 vs DA ePlt0001 vs CNe fPlt0001 vs DAe
4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
O PMA aumentou a produccedilatildeo de H2O2 pelos macroacutefagos alveolares nos
grupos CN (041 plusmn 008 vs 099 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0004) DA
(035 plusmn 005 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0002) e EX (010 plusmn
001 vs 034 plusmn 008 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) A produccedilatildeo basal de
H2O2 para o grupo EX foi significativamente menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (010 plusmn
001 vs 035 plusmn 005 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) Aleacutem disso a produccedilatildeo
75
de H2O2 estimulada por PMA diminuiu no grupo EX tendo sido significativamente
menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (034 plusmn 008 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia
595nmadesatildeo) (P=0006) (FIGURA 27)
FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0004 vs CN bP=0002 vs DA cPlt0001 vs EX dPlt0001 vs DA eP=0006 vs DAe
42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO
421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem
Diferencial de Ceacutelulas do LBA
Hemossideroacutefagos foram observados no LBA de 23 potros (622) sendo
que estes foram considerados no subgrupo HPIE pos A quantidade observada de
76
hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 A ausecircncia de hemossideroacutefagos foi
evidenciada em 14 potros (378) sendo que estes foram considerados para o
subgrupo HPIE neg
Dentre os potros avaliados 15 (405) deles (10 potros do subgrupo HPIE
pos e 5 potros do subgrupo HPIE neg) apresentaram mais de 5 de neutroacutefilos eou
mais de 1 de eosinoacutefilos na contagem diferencial de ceacutelulas indicando um perfil
citoloacutegico de LBA compatiacutevel com inflamaccedilatildeo pulmonar
Os valores do NTCN bem como da contagem diferencial de ceacutelulas para o
grupo EX e para os subgrupos estaacute demonstrado na TABELA 7
TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX (n=37) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=23) E HPIE NEG (n=14)
CTCN (ceacutelulasmicroL
de LBA)
Macroacutef
Linfoacutec
Neutroacutef
Eosino
Masto
Siderof
Grupo EX
456 plusmn 28
676 plusmn 18
229 plusmn 15
47 plusmn 10
13 plusmn 06
02 plusmn 01
22 plusmn 35
HPIE pos
571
plusmn 78a
645
plusmn 22b
240 plusmn 20
56 plusmn 12
09 plusmn 07
02 plusmn 02
34 plusmn 37
HPIE neg
348 plusmn 38
725 plusmn 30
207 plusmn 25
35 plusmn 18
19 plusmn 11
03 plusmn 01
00
CTCN contagem total de ceacutelulas nucleadas Macrof macoacutefagos Linfoc linfoacutecitos Neutrof
neutroacutefilos Eosinof eosinoacutefilos Mastoc mastoacutecitos Siderof hemossideroacutefagos aP=0005
vs HPIE neg bP=0020 vs HPIE neg
422 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA
A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA foi
significativamente maior no subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg
(018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm P=0042) (FIGURA 28)
77
FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) e HPIE NEG (n=5) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO RELACcedilAtildeO 340380nm aP=0042 vs HPIE neg
423 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA
A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi significativamente maior no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (039 plusmn 008 vs 019 plusmn
004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) (FIGURA 29)
78
FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=13) E HPIE NEG (n=12) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS POR MILILITRO DE LBA aP=0031 vs HPIE neg
424 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA
A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos resultou
significativamente reduzida em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (008 plusmn 003 vs
012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) (FIGURA 30)
79
FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) E HPIE NEG (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 550 nm aP=0049 vs HPIE neg
425 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA
A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA dos potros do
subgrupo HPIE pos resultou significativamente maior que no subgrupo HPIE neg
(367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) (FIGURA 31)
80
FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) E HPIE NEG (n=8) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS aP=0009 vs HPIE neg
426 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar
Natildeo houve diferenccedila na fagocitose de macroacutefago alveolar entre os grupos
estudados
427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-)
A produccedilatildeo basal de O2- por macroacutefagos alveolares resultou similar entre os
grupos estudados A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0047) mas natildeo no subgrupo HPIE pos
(FIGURA 32)
A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA foi significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (081 plusmn 011 vs 124 plusmn
015 absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0042) (FIGURA 32)
81
FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2
-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) E HPIE NEG (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2
- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0047 vs HPIE neg bP=0042 vs HPIE neg e
428 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar
A produccedilatildeo basal de H2O2 por macroacutefago alveolar foi similar entre os grupos
avaliados no presente estudo A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA aumentou
significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0002) mas natildeo no subgrupo HPIE
neg (FIGURA 33)
A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA resultou significativamente menor no
subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (025 plusmn 003 vs 067 plusmn 014
absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0001)
82
FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) E HPIE NEG (n=6) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2 ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0002 vs HPIE neg bP=001 vs HPIE neg e
5 DISCUSSAtildeO
O estudo da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas de cavalos de corrida adultos jovens
em trecircs diferentes situaccedilotildees em seu ambiente natural foi possiacutevel devido agrave
utilizaccedilatildeo de um grande nuacutemero de animais Assim permitiu-se detectar diferenccedilas
entre os grupos mesmo havendo variaccedilotildees ambientais tais como estaccedilotildees do ano
condiccedilotildees climaacuteticas e diferenccedilas sutis em manejo Como os potros dos trecircs grupos
encontravam-se na mesma faixa etaacuteria de risco para as doenccedilas respiratoacuterias virais
e os experimentos foram realizados durante um mesmo periacuteodo as diferenccedilas entre
os grupos CN e DA foram consideradas como sendo devido ao ambiente e as
diferenccedilas entre os grupos DA e EX foram consideradas como sendo devido ao
treinamento
O grupo CN evidenciou um percentual de observaccedilotildees de faringite na
avaliaccedilatildeo endoscoacutepica (TABELA 2) maior que os 37 relatado por HOBO et al
(1995) em cavalos PSI de corrida de dois anos de idade Os potros deste grupo
foram mantidos integralmente em piquetes e nesta situaccedilatildeo a hiperplasia dos
foliacuteculos linfoacuteides da faringe em cavalos jovens pode ser uma resposta normal a
inalaccedilatildeo de antiacutegenos ambientais ou agentes infecciosos (HOLCOMBE e
DUCHARME 2007)
De fato as vias aeacutereas dos potros desse grupo deram mostra de estarem
sendo desafiadas pelo nuacutemero percentual de corrimento nasal linfonodos
aumentados e quantidades elevadas de secreccedilatildeo traqueal iguais aos demais
grupos (TABELAS 1 e 4) Possivelmente isso tambeacutem se deva a fatores climaacuteticos
pois no estudo de ROBINSON et al (2006) com cavalos de montaria de vaacuterias
idades aqueles que permaneceram fora dos estaacutebulos durante o inverno
apresentaram quantidades elevadas de muco traqueal No entanto diferentemente
do nosso estudo os cavalos avaliados por ROBINSON et al (2006) tiveram nuacutemero
percentual de neutroacutefilos aumentado na secreccedilatildeo traqueal enquanto os potros do
grupo CN resultaram em avaliaccedilatildeo citoloacutegica tanto de AT (TABELA 5) como de LBA
(TABELA 6) normais (ROBINSON 2003 HODGSON e HODGSON 2007)
evidenciando vias aeacutereas especialmente as vias aeacutereas inferiores saudaacuteveis
Com relaccedilatildeo ao desafio ambiental no presente estudo adotou-se um sistema
convencional de estabulaccedilatildeo pois estudos anteriores em modelos semelhantes ao
84
nosso jaacute demonstraram a presenccedila de altas concentraccedilotildees de endotoxinas
(BERNDT et al 2008) bem como de poeira e de aeroalergenos (WOODS et al
1993)
Contudo o desafio ambiental de 30 dias utilizado em nosso estudo resultou
em quadro comparaacutevel ao do grupo CN isento de processo inflamatoacuterio das vias
aeacutereas Possivelmente um periacuteodo maior de desafio pudesse causar um processo
inflamatoacuterio tal como foi demonstrado previamente por HOLCOMBE et al (2001)
onde potros da raccedila puro sangue aacuterabe que sofreram desafio ambiental de 90 dias
apresentaram aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no LBA Contudo no
estudo citado o material utilizado para a cama dos potros foi a palha que tambeacutem
representou um maior risco de desenvolvimento de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas dos
cavalos em outros estudos quando comparada a serragem utilizada na cama dos
potros do grupo DA (BURRELL et al 1996 VANDEPUT et al 1998 GERBER et
al 2000 KLEIBER et al 2005 DEWACHI et al 2006)
Entretanto ateacute o momento os efeitos dos fatores ambientais das cocheiras
nas vias aeacutereas foram relatados em sua maioria em cavalos apresentando ORVA e
natildeo em indiviacuteduos jovens e saudaacuteveis como os potros avaliados em nosso estudo
Nos animais com ORVA um curto periacuteodo de exposiccedilatildeo ambiental (6 a 48 horas)
em baia e recebendo alimentaccedilatildeo composta principalmente por feno causou
aumento da expressatildeo de algumas citocinas (pex IL-4 e IL-5) em alguns estudos
mas nenhuma alteraccedilatildeo em outros (GERBER et al 2000 AINSWORTH et al 2003
CORDEAU et al 2004 KLEIBER et al 2005) sendo que um longo tempo de
exposiccedilatildeo ambiental (variando de cinco semanas a trecircs meses) causou aumento da
expressatildeo de IFN-γ e IL-8 (AINSWORTH et al 2003) IL-9 (DEWACHI et al 2006)
IL-17 (DEBRUE et al 2005) e o desenvolvimento dos sinais cliacutenicos da ORVA
acompanhados de alteraccedilotildees na funccedilatildeo pulmonar (VANDEPUT et al 1998)
Contudo nos potros do grupo DA se evidenciou no AT (TABELA 5) e no LBA
(TABELA 6) um aumento significativo do nuacutemero percentual de macroacutefagos
multinucleados em comparaccedilatildeo ao grupo CN bem como nuacutemero percentual de
eosinoacutefilos acima do valor considerado limite para cavalos normais (ROBINSON
2003) sugerindo que houve uma resposta por parte do sistema de defesa nas vias
aeacutereas dos potros deste grupo
Os macroacutefagos multinucleados ou ceacutelulas gigantes multinucleadas satildeo
formados a partir da fusatildeo de dois ou mais macroacutefagos na resposta imune pulmonar
85
(ANDERSON et al 1999) representando especificamente uma resposta imune do
tipo Th2 com a participaccedilatildeo da IL-4 (HELMING e GORDON 2007) Em pessoas os
macroacutefagos multinucleados satildeo considerados como um achado indicativo de
reaccedilotildees inflamatoacuterias crocircnicas nas vias aeacutereas como a tuberculose por exemplo
(LEMAIRE et al 2006 HELMING e GORDON 2007) Em equinos satildeo escassos os
estudos envolvendo a citologia respiratoacuteria que descrevam o nuacutemero percentual
normal deste tipo celular De qualquer forma eacute relatado que pode ser observado em
pequeno nuacutemero em cavalos sem evidecircncias de doenccedila pulmonar sendo que uma
quantidade aumentada jaacute foi descrita associada agrave inflamaccedilatildeo crocircnica (DECONTO
1983 HODGSON e HODGSON 2007) Estas informaccedilotildees parecem natildeo corroborar
com o aumento no nuacutemero percentual de macroacutefagos multinucleados no grupo DA
em se tratando de potros jovens considerados saudaacuteveis o que demonstra a
necessidade de mais estudos para se entender o papel do macroacutefago multinucleado
no pulmatildeo saudaacutevel e na inflamaccedilatildeo pulmonar dos cavalos
Entretanto o nuacutemero percentual de eosinoacutefilos acima do limite normal no
LBA dos potros do grupo DA pode ser considerado como uma resposta ao
ambiente assim como eacute considerado em humanos (DENGUEZLI-BOUZGARROU et
al 2007) e jaacute relatado em cavalos (COUEumlTIL et al 2007)
O periacuteodo de treinamento por sua vez induziu inflamaccedilatildeo pulmonar nos
potros do grupo EX O nuacutemero significativamente aumentado de potros com tosse
(TABELA 1) constituiu a evidecircncia cliacutenica sugerindo inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas nos
potros desse grupo Cavalos saudaacuteveis raramente tossem (ROBINSON 2007)
sendo a tosse um sinal cliacutenico comprovadamente associado agrave inflamaccedilatildeo das vias
aeacutereas (BURRELL et al 1996 McGROUM e DIXON 2007) CHRISTLEY et al
(2001) correlacionaram a tosse com a presenccedila de faringite sendo que tal
associaccedilatildeo tambeacutem foi observada no grupo EX (TABELAS 1 e 2) Adicionalmente
BEDENICE et al (2008) estudaram a relaccedilatildeo entre a tosse e a inflamaccedilatildeo pulmonar
e descreveram que os cavalos avaliados por apresentarem tosse tiveram contagens
percentuais de neutroacutefilos no LBA maiores que 5
No presente estudo um aumento no NTCN e nas contagens percentuais de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos do LBA (TABELA 6) confirmaram a presenccedila de inflamaccedilatildeo
pulmonar no grupo EX (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
COUEumlTIL et al 2007) A neutrofilia no LBA de cavalos de corrida jaacute foi
correlacionada a um baixo rendimento desportivo e constitui sinal chave para o
86
diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007) A eosinofilia no LBA de cavalos de
corrida por sua vez pode ser um achado transitoacuterio (VIEL e HEWSON 2003)
apesar de tambeacutem ter sido associada a um baixo rendimento desportivo aleacutem de
hiperresponsividade das vias aeacutereas em cavalos de corrida jovens (HARE e VIEL
1998) Portanto tais evidecircncias podem ser consideradas como um risco ao futuro
potencial atleacutetico dos potros do grupo EX
No presente estudo natildeo houve correlaccedilatildeo entre os achados citoloacutegicos de AT
e LBA para nenhum dos trecircs grupos estudados e esta falta de correlaccedilatildeo entre AT
e LBA jaacute foi relatada anteriormente Portanto entende-se que os epiteacutelios traqueal e
broncoalveolar respondem diferentemente aos agentes agressores sendo que a
avaliaccedilatildeo de cavalos com tosse ou diminuiccedilatildeo de rendimento desportivo deve ser
realizada por ambas as teacutecnicas associadas (MALIKIDES et al 2003 CHRISTLEY
RUSH 2007 HODGSON e HODGSON 2007)
A ligaccedilatildeo entre o exerciacutecio e a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas provavelmente
envolve diversos mediadores proacute-inflamatoacuterios que uma vez identificados poderatildeo
ser alvo para abordagens terapecircuticas com o objetivo de minimizar os efeitos
deleteacuterios da inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos PSI de corrida jovens Neste
contexto um dos mais potentes e versaacuteteis mediadores proacute inflamatoacuterios envolvidos
na inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas eacute o PAF (UHLIG et al 2005)
PAF eacute quimiotaacutetico para bem como produzido por eosinoacutefilos macroacutefagos e
neutroacutefilos em resposta a estresse fiacutesico ou quiacutemico apresentando muitos dos
criteacuterios essenciais de um mediador proacute inflamatoacuterio (OWEN et al 2005)
De fato estudos realizados in vitro demonstraram que o PAF pode induzir a
migraccedilatildeo de neutroacutefilos e monoacutecitos do cavalo (DAWSON et al 1988) Aleacutem disso
demonstrou-se a quimiotaxia de eosinoacutefilos e neutroacutefilos no trato respiratoacuterio de
murinos e humanos induzida por PAF (LEE et al 2002 ISHII et al 2004) Em
cavalos com ORVA a administraccedilatildeo intravenosa de PAF promoveu uma reduccedilatildeo de
leucoacutecitos no sangue perifeacuterico e apoacutes alguns minutos houve um aumento de
neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo seguido de uma deterioraccedilatildeo cliacutenica e da funccedilatildeo
respiratoacuteria (FAIRBAIRN et al 1996) Portanto apoiado nestes estudos e nos
resultados de aumento do NTCN e de neutrofilia e eosinofilia no LBA do grupo EX
(TABELA 6) eacute razoaacutevel assumir que o PAF possa contribuir para a induccedilatildeo da
inflamaccedilatildeo pulmonar observada nos potros PSI jovens em treinamento avaliados no
presente estudo
87
A inflamaccedilatildeo pulmonar tambeacutem estaacute associada a um aumento nas
concentraccedilotildees de proteiacutenas no LBA principalmente devido ao extravasamento de
plasma (TSANGARIS et al 2003) que pode ser resultado da accedilatildeo de vaacuterios
mediadores proacute inflamatoacuterios tal como o PAF
Um aumento da permeabilidade microvascular induzida pelo PAF resultando
em extravasamento de plasma e edema foi demonstrado previamente no estudo de
CLAVIJO et al (2001) Aleacutem disso WEST et al (1997) demonstraram o acuacutemulo de
um fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar de cavalos exercitados a velocidades
entre 13 ms e 16 ms No presente estudo o significativo aumento da concentraccedilatildeo
de proteiacutenas no LBA dos potros do grupo EX em comparaccedilatildeo ao grupo DA (FIGURA
21) confirma que a permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) estava
aumentada nos potros do grupo EX e o PAF pode estar envolvido neste mecanismo
Diferentemente o significativo aumento de proteiacutenas no LBA do grupo DA em
comparaccedilatildeo ao grupo CN deve envolver outros mecanismos inflamatoacuterios pois natildeo
houve biotavidade de PAF significativa no LBA destes dois grupos (FIGURA 19)
Contudo os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser
dependentes em parte da disponibilidade de oacutexido niacutetrico (NO) (KIKUCHI et al
2008) Houve uma produccedilatildeo limitada de NO nas vias aeacutereas dos potros do grupo
EX esperada em cavalos realizando exerciacutecio moderado ou proacuteximo do maacuteximo
(MILLS e HIGGINS 1997) Isto pode ser explicado pela hipoxemia arterial induzida
pelo exerciacutecio (HAIE) descrita em atletas humanos (HOPKINS 2005) e em cavalos
exercitando a altas intensidades (MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999
DEMPSEY e WAGNER 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005) A produccedilatildeo de NO requer
normoxia (GRIMMINGER et al 1995) sendo que a anoxia abole o relaxamento
vascular dependente do endoteacutelio e a hipoxemia degrada o NO (De MEY e
VANHOUTTE 1980) Adicionalmente ocorre uma inibiccedilatildeo do NO pela hemoglobina
sendo que esta inibiccedilatildeo eacute inversamente proporcional a saturaccedilatildeo de oxigecircnio
(IWAMOTO e MORIN 1993)
A inibiccedilatildeo da siacutentese de NO resultou no aumento da permeabilidade vascular
no estudo de KIKUCHI et al (2008) concordando com os nossos achados
referentes agrave bioatividade de PAF aumentada associada ao aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas e agrave diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de nitritos no LBA
do grupo EX
88
De fato no estudo de BRKOVIC e SIROIS (2007) o PAF e natildeo o NO foi
considerado o mediador proacute inflamatoacuterio e causador do aumento da permeabilidade
vascular enquanto o NO foi considerado como um co-fator para as atividades
inflamatoacuterias do PAF Na relaccedilatildeo entre PAF e NO na microcirculaccedilatildeo parece que
NO apresenta um efeito protetor atenuando as atividades inflamatoacuterias de PAF
tendo inclusive reduzido a formaccedilatildeo de PAF em vecircnulas mesenteacutericas em ratos
(NEVIN e BROADLEY 2002)
Contudo o NO tambeacutem tem papel preponderante na defesa das vias aeacutereas
(NEVIN e BROADLEY 2002 XU et al 2006) e o aumento na concentraccedilatildeo de
nitritos no LBA do grupo DA pode ser considerado uma resposta aos poluentes
ambientais existentes nas cocheira dos cavalos (WOODS et al 1993 BERNDT et
al 2008) Aleacutem disso o NO reage com o acircnion superoacutexido (O -2) para formar
peroxinitrito (ONOO-) um forte oxidante capaz de provocar lesatildeo no tecido pulmonar
resultando em peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (XU et al 2006)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi investigada no presente estudo atraveacutes da
concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA que resultou
aumentada no grupo DA em comparaccedilatildeo com o grupo CN (FIGURA 23) A
peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi associada ao acuacutemulo de neutroacutefilos e produccedilatildeo de ROS por
esses nas vias aeacutereas de crianccedilas (BUSS et al 2000) e de pessoas com DPOC
(SANTUS et al 2005) Natildeo houve aumento de neutroacutefilos no LBA dos potros do
grupo DA mas os macroacutefagos alveolares dos potros deste grupo apresentaram
maior produccedilatildeo de ROS (FIGURAS 26 e 27) Isso pode ter contribuiacutedo para o
aumento da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA neste grupo como resultado da
modificaccedilatildeo da funcionalidade dos macroacutefagos alveolares induzida por fatores
ambientais como descrito em estudos em humanos (LUNDBORG et al 2007) e em
cavalos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento resultou em reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
hidroperoacutexidos lipiacutedicos no LBA em comparaccedilatildeo com o grupo DA No estudo de
MASTALOUDIS et al (2004) corredores de ultramaratona apresentaram aumento
da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica avaliada por marcadores do sangue destes atletas
Contudo outros relataram a reduccedilatildeo dos marcadores de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes
exerciacutecio intenso em corredores e esquiadores (URSO e CLARKSON 2003) em
indiviacuteduos treinados (BALOG et al 2006) em pessoas apoacutes 6 meses de
89
treinamento e tambeacutem apoacutes um programa de treinamento de 3 semanas (ALDRED
2007) e em pacientes com DPOC apoacutes programa de exerciacutecios (PINHO et al 2007)
Provavelmente essa diminuiccedilatildeo na peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA dos potros do
grupo EX deveu-se a mecanismos protetores pois o treinamento influencia de forma
positiva a capacidade antioxidante do organismo em atletas humanos (URSO e
CLARKSON 2003 PARK et al 2005 BALOG et al 2006 ALDRED 2007 PINHO
et al 2007) e em cavalos (KIRSCHVINK et al 2008)
URSO e CLARKSON (2003) relataram um aumento significativo da atividade
da catalase uma enzima antioxidante nos eritroacutecitos de atletas humanos apoacutes um
exerciacutecio de corrida de longa distacircncia corroborando com os nossos achados de
aumento significativo da atividade da catalase no LBA dos potros do grupo EX em
comparaccedilatildeo com o grupo DA (FIGURA 24)
No presente estudo a atividade de macroacutefago alveolar foi investigada devido
ao papel inerente desta ceacutelula na defesa pulmonar O aumento na atividade dos
macroacutefagos alveolares no grupo DA foi discutida acima e provavelmente deveu-se agrave
presenccedila de aeroalergenos e endotoxinas presentes nas cocheiras dos cavalos
(RIIHIMAumlKI et al 2008b)
Por outro lado o treinamento reduziu tanto a fagocitose de macroacutefago
alveolar (FIGURA 25) como a capacidade de produccedilatildeo de ROS (acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio) (FIGURAS 26 e 27)
O macroacutefago alveolar eacute a ceacutelula efetora do sistema imune predominante nos
espaccedilos alveolares e nas vias aeacutereas condutoras responsaacutevel por ativar as
respostas inflamatoacuterias de forma suficiente a eliminar agentes agressores (PETERS-
GOLDEN 2004) Os macroacutefagos alveolares satildeo essenciais agrave sobrevivecircncia
devendo estar em harmonia com o sistema nervoso e endoacutecrino para responder a
estiacutemulos fisioloacutegicos bem como patoloacutegicos (GORDON 2007) sem exagerar na
resposta a fim de natildeo comprometer a troca gasosa (PETERS-GOLDEN 2004)
Apesar de KIZAKI et al (2008) terem demonstrado que o macroacutefago pode
sofrer uma adaptaccedilatildeo ao exerciacutecio melhorando sua funcionalidade os potros PSI
jovens em treinamento para corrida do grupo EX apresentaram supressatildeo da
imunidade especificamente a relacionada agrave resposta imune inata dos macroacutefagos
alveolares corroborando com estudos anteriores (HUSTON et al 1987 RAIDAL et
al 2000 RAIDAL et al 2001) que avaliaram o LBA de cavalos apoacutes exerciacutecio
90
realizado em esteira de alta velocidade e obtiveram resultados semelhantes aos
nossos
Outro aspecto ainda natildeo relatado em equinos mas demonstrado em
pessoas eacute que a melhora na atividade antioxidante induzida pelo exerciacutecio pode
resultar em diminuiccedilatildeo da atividade da NADPH oxidase na membrana dos
macroacutefagos consequumlentemente reduzindo a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e
peroacutexido de hidrogecircnio por essas ceacutelulas (PARK et al 2005) como observado no
grupo EX
Portanto a influencia do exerciacutecio sobre a funcionalidade das ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico como a observada nos macroacutefagos alveolares do grupo EX no
presente estudo explicaria a maior suscetibilidade apresentada por potros de corrida
sob treinamento intenso a infecccedilotildees respiratoacuterias (HINES et al 1996) Em
humanos o exerciacutecio intenso reduziu a capacidade de apresentaccedilatildeo de antiacutegeno
(CEDDIA e WOODS 1999) bem como a resistecircncia antiviral (DAVIS et al 1997) por
macroacutefagos O PMA (phorbol myristate acetate) utilizado nas avaliaccedilotildees da
atividade de macroacutefago alveolar (ver toacutepicos 4114 e 4115) teve como funccedilatildeo
estimular a NADPH oxidase a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio
(DEKKER et al 2000 NAKAJIMA et al 2000) mimetizando o estiacutemulo provocado
por agentes infecciosos (JI 2008) Isto de fato ocorreu no grupo EX jaacute que os
macroacutefagos estimulados apresentaram aumento significativo na atividade
comparando-se aos macroacutefagos natildeo estimulados (FIGURAS 26 e 27) entretanto a
atividade ainda foi significativamente menor que no grupo DA evidenciando a
reduccedilatildeo na atividade de macroacutefagos induzida pelo exerciacutecio
Os efeitos do PMA sobre os macroacutefagos alveolares e sobre os PMNs do
sangue de equino podem ser apreciados no experimento de validaccedilatildeo da teacutecnica
de estudo da bioatividade de PAF (FIGURAS 13 a 18) A teacutecnica utilizada para o
estudo da bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos potros
empregando-se PMNs de equinos como ferramenta para se avaliar o influxo de Ca++
induzido por PAF foi ineacutedita em estudos em cavalos Anteriormente a mesma
avaliaccedilatildeo foi realizada utilizando-se PMNs de humanos (GRYNKIEWICZ et al 1985
MARATHE et al 2001) Anteriormente os PMNs de equinos foram empregados
com ecircxito no estudo da bioatividade de PAF em extrato lipiacutedico obtido a partir de
amostras de pulmatildeo de ratos no estudo da asma (MUEHLMANN et al 2009)
91
Portanto a validaccedilatildeo desta teacutecnica se fez necessaacuteria e importante para o
reconhecimento dos resultados obtidos para a bioatividade de PAF no extrato
lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos investigados No presente estudo o PAF
ativou os PMNs do sangue do cavalo assim como os macroacutefagos alveolares de
forma concentraccedilatildeo dependente Portanto o PAF tendo como uma de suas origens
o macroacutefago alveolar eacute capaz de modificar o comportamento de neutroacutefilos
sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos
neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a ORVA (MARR et al 2002)
As influecircncias exercidas pelo PAF na circulaccedilatildeo pulmonar permeabilidade
capilar pulmonar e na agregaccedilatildeo plaquetaacuteria estimulou o estudo da HPIE nos potros
avaliados no grupo EX Para tal o hemossideroacutefago no LBA foi escolhido como o
marcador da HPIE porque a colheita do LBA 24 horas apoacutes o exerciacutecio resultou que
a observaccedilatildeo endoscoacutepica de sangue na traqueacuteia bem como a contagem do
nuacutemero de eritroacutecitos no LBA natildeo fossem teacutecnicas diagnoacutesticas indicadas nesse
momento
A observaccedilatildeo do hemossideroacutefago no LBA mesmo se constituindo numa
forma confiaacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993) poderia natildeo servir
aos nossos propoacutesitos de identificar diferenccedilas em marcadores inflamatoacuterios e de
estresse oxidativo bem como na funcionalidade de macroacutefagos alveolares dentro
de um mesmo grupo ateacute entatildeo considerado homogecircneo Contudo o
hemossideroacutefago presente no LBA foi confirmado no presente estudo natildeo soacute como
um marcador confiaacutevel da HPIE como tambeacutem foi capaz de diferenciar subgrupos
significativamente distintos dentro do grupo EX
Interessantemente observou-se um percentual de HPIE (determinado pela
presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA) maior que o de inflamaccedilatildeo pulmonar (gt5
de neutroacutefilos eou gt1 de eosinoacutefilos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA)
Isso nos leva a pensar que a HPIE precede a inflamaccedilatildeo no pulmatildeo dos cavalos de
corrida tal como foi sugerido por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) mas que
requer outras investigaccedilotildees para excluir que o contraacuterio estivesse acontecendo isto
eacute um processo inflamatoacuterio em periacuteodo anterior do treinamento que pudesse ter
deixado alguma fragilidade pulmonar Possivelmente o estudo de potros PSI de
corrida tatildeo jovens e em iniacutecio de treinamento permitiu tal discussatildeo visto que se
considera que a HPIE acometa praticamente a totalidade dos cavalos PSI em
treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007)
92
A associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo jaacute foi demonstrada anteriormente
(McKANE et al 1993) e foi considerada como sendo significativa no estudo
epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) apesar dos mecanismos pelos quais
esta associaccedilatildeo ocorre ainda serem apresentados de forma hipoteacutetica como no
recente estudo de DERKSEN et al (2009)
No estudo de COUEumlTIL e DENICOLA (1999) cavalos de corrida com HPIE
apresentaram na avaliaccedilatildeo do LBA um aumento no NTCN associado agrave neutrofilia
De fato isto ocorreu no subgrupo HPIE pos e esses achados de citologia
demonstram que a HPIE esteve associada agrave inflamaccedilatildeo pulmonar nos potros do
subgrupo HPIE pos
Outro achado comum entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar eacute o aumento da
concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA como observado no subgrupo HPIE pos em
comparaccedilatildeo com o grupo HPIE neg (FIGURA 29) evidenciando um aumento na
permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) no subgrupo HPIE pos
O acuacutemulo de fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar associado agrave
inflamaccedilatildeo pulmonar como demonstrado por TSANGARIS et al (2003) foi discutido
acima Contudo cavalos com HPIE exercitados a altas velocidades tambeacutem
apresentaram aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas no espaccedilo alveolar (WEST e
MATTHIEU-COSTELLO 1999)
Possivelmente o aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas associado agrave HPIE
possa ser devido ao aumento da pressatildeo transmural nos capilares pulmonares
resultando em falecircncia por estresse dos capilares como demonstrado por BIRKS et
al (1997) em cavalos exercitados nas mesmas velocidades que os potros avaliados
no presente estudo
Adicionalmente parece que a HPIE deflagrou um mecanismo inflamatoacuterio
causador de extravasamento de plasma no espaccedilo alveolar nos potros do subgrupo
HPIE pos e a bioatividade de PAF significativamente aumentada no subgrupo HPIE
pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (FIGURA 28) indica a participaccedilatildeo desse
mediador proacute inflamatoacuterio nesse evento
O extravasamento de plasma na microcirculaccedilatildeo pulmonar e a formaccedilatildeo de
edema pulmonar induzidos por PAF foram demonstrados anteriormente e jaacute
discutidos acima (EVANS et al 1987 CLAVIJO et al 2001) No caso da HPIE
provavelmente o PAF induza a formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular
atraveacutes da desorganizaccedilatildeo de proteiacutenas juncionais (JIANG et al 2008) Estes dados
93
concordam com a proposta de WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) de que a
altas pressotildees em capilares pulmonares ocorra a formaccedilatildeo de fendas nas junccedilotildees
entre as ceacutelulas endoteliais Desta forma as evidecircncias indicam que associado ao
evento mecacircnico na etiopatogenia da HPIE um evento inflamatoacuterio tambeacutem estaacute
presente o que representa um fator de risco para o agravamento do quadro
Adicionalmente os eventos inflamatoacuterios presentes na HPIE se constituem em
potencial aacuterea para investigaccedilotildees terapecircuticas visto que ainda natildeo se tem um
tratamento efetivo para a hemorragia pulmonar em cavalos atletas Recentemente
evidecircncias de que a suplementaccedilatildeo de cavalos atletas com aacutecidos graxos ocircmega-3
melhora a fluidez da membrana dos eritroacutecitos (PORTIER et al 2006) sugeriu que a
influecircncia beneacutefica na resposta inflamatoacuteria pulmonar pode reduzir os iacutendices HPIE
(ERICKSON et al 2007)
Portanto eacute razoaacutevel assumir um papel para o PAF na fisiopatologia da HPIE
pelas suas propriedades angiogecircnicas aleacutem de seus efeitos proacute inflamatoacuterios
(APONTE et al 2008) concordando com a hipoacutetese da patogecircnese da HPIE
proposta por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) onde a ruptura dos capilares
pulmonares resultaria em inflamaccedilatildeo sangramento e hemosiderose e
consequumlentemente a ocorrecircncia de angiogecircnese na circulaccedilatildeo bronquial e fibrose
agravando o quadro da HPIE
Adicionalmente ZHANG et al (2003) demonstraram que o aumento da
permeabilidade capilar induzido por PAF envolve a participaccedilatildeo de estresse
oxidativo visto que a enzima antioxidante superoacutexido dismutase (SOD) atenuou os
efeitos do PAF sobre o endoteacutelio De fato o grupo HPIE pos apresentou a
concentraccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos significativamente aumentada em comparaccedilatildeo
ao subgrupo HPIE neg sendo uma evidecircncia de estresse oxidativo no LBA dos
potros deste grupo possivelmente exacerbada pela alta quantidade de ferro da
hemossiderina presente no espaccedilo alveolar (DERSEN et al 2009)
A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica induz alteraccedilotildees patoloacutegicas no tecido pulmonar
destruindo pneumoacutecitos e ceacutelulas endoteliais do epiteacutelio levando a um aumento da
permeabilidade microvascular inibe a siacutentese e a liberaccedilatildeo de surfactante e interfere
negativamente na atividade do NO O conjunto dessas accedilotildees dos peroacutexidos lipiacutedicos
no pulmatildeo resulta em dano da estrutura pulmonar e leva agrave hipertensatildeo
representando um fator adicional contribuindo para a patogenia da HPIE (MILLS e
HIGGINS 1997)
94
Os macroacutefagos alveolares como ceacutelulas orquestradoras da resposta imune
pulmonar (PETERS-GOLDEN 2004) devem possuir um importante papel na
patogenia da HPIE visto que a obtenccedilatildeo de subgrupos significativamente distintos
a partir do grupo EX no presente estudo se deu pela presenccedila ou ausecircncia de
hemossideroacutefagos THACKER (2006) descreveu que os macroacutefagos ativados
secretam interleucina-1 (IL-1) que atrai e ativa a proliferaccedilatildeo de fibroblastos e a
siacutentese de colaacutegeno para reparar o tecido danificado Em estudo histopatoloacutegico do
pulmatildeo de cavalos com HPIE as aacutereas de ocorrecircncia de hemorragia caracterizaram-
se por hemossiderose e fibrose (DERKSEN et al 2009)
Adicionalmente WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) sugeriram o
envolvimento de leucotrieno B4 (LTB4) no mecanismo inflamatoacuterio envolvido na
HPIE apesar deste mecanismo ainda requerer comprovaccedilatildeo Neste evento a
ruptura do epiteacutelio alveolar com a exposiccedilatildeo da membrana ativaria os macroacutefagos
alveolares os quais satildeo ricos em LTB4
O LTB4 por sua vez tambeacutem conecta o PAF agrave HPIE HOPKINS et al (1997)
estudaram a HPIE em humanos avaliando o LBA de seis ciclistas de elite apoacutes 4 km
de esforccedilo maacuteximo Comparados aos controles os ciclistas que realizaram o esforccedilo
apresentaram altas concentraccedilotildees de eritroacutecitos proteiacutenas e LTB4 no LBA No
estudo citado exceto pelo aumento da LTB4 natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
percentual de neutroacutefilos e nem nos niacuteveis de IL-8 e TNF-α entre os grupos
suportando a hipoacutetese do estresse mecacircnico alterando a BAC na HPIE segundo a
conclusatildeo dos autores Contudo a associaccedilatildeo entre LTB4 e PAF foi demonstrada
anteriormente onde o receptor de LTB4 esteve envolvido com a quimiotaxia
pulmonar e degranulaccedilatildeo de neutroacutefilos induzida por PAF (GAUDREAULT et al
2005) Todavia ateacute o momento este tipo de associaccedilatildeo natildeo foi demonstrada em
cavalos apesar de ter-se relatada a neutrofilia nas vias aeacutereas de cavalos com
ORVA mediada por LTB4 (LINDBERG et al 2004) Portanto reunindo as
informaccedilotildees acima pode-se assumir a hipoacutetese de que a neutrofilia no LBA e o
aumento da permeabilidade da BAC nos potros do subgrupo HPIE pos tenha sido
induzida por PAF e mediada por receptor de LTB4
Adicionalmente reforccedila-se a evidecircncia da importacircncia dos macroacutefagos
alveolares na HPIE e por sua vez como a hemorragia pulmonar pode influenciar a
funcionalidade dos macroacutefagos Na primeira etapa do presente estudo descrevemos
a reduccedilatildeo na fagocitose e na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de
95
hidrogecircnio pelos macroacutefagos alveolares do grupo EX (FIGURAS 25 a 27) Contudo
evidenciamos que a HPIE agravou ainda mais esta situaccedilatildeo (FIGURAS 32 e 33)
pois a resposta de macroacutefago alveolar esteve significativamente reduzida no
subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg
A reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no subgrupo HPIE pos pode ser
explicada novamente pela HAIE com consequumlente inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO
(MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)
favorecendo o aumento da permeabilidade capilar (KIKUCHI et al 2008)
provavelmente agravado pela ocorrecircncia de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica neste grupo (MILLS
e HIGGINS 1997)
Os mecanismos pelos quais o NO modula a permeabilidade microvascular
natildeo satildeo bem conhecidos Em cavalos de PSI de corrida a inibiccedilatildeo da NOS pela
administraccedilatildeo de L-NAME agravou a HPIE enquanto natildeo alterou a pressatildeo arterial
pulmonar (KINDIG et al 2000) e a inalaccedilatildeo de NO durante o exerciacutecio reduziu
ligeiramente a pressatildeo arterial pulmonar enquanto tambeacutem causou agravamento da
HPIE (KINDIG et al 2001) Parece que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete
em parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das
pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o
exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo
ajudou mas agravou a HPIE
Adicionalmente corroborando com o aumento da bioatividade de PAF e
reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos o estudo de
KWASNIEWSKI et al (2008) com um modelo de lesatildeo e hemorragia em intestino
delgado demonstrou que o preacute tratamento com antagonista de PAF reduziu as
lesotildees enquanto a inibiccedilatildeo do NO endoacutegeno aumentou consideravelmente as
lesotildees hemorraacutegicas e a mortalidade Portanto o estudo citado demonstrou a
existecircncia da relaccedilatildeo entre PAF e NO na hemorragia ocorrida na microcirculaccedilatildeo
assim como reafirma o papel protetor do NO para os efeitos proacute inflamatoacuterios do
PAF (NEVIN e BROADLEY 2002 BRKOVIC e SIROIS 2007)
6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
A hipoacutetese do presente estudo foi confirmada pois tanto o desafio ambiental
como o exerciacutecio causaram alteraccedilotildees no fluido broncoalveolar e modificaram a
funccedilatildeo de macroacutefago alveolar Potros PSI de corrida jovem em treinamento para
corrida apresentaram depressatildeo da resposta imune inata mais especificamente do
macroacutefago alveolar induzida pelo exerciacutecio e agravada pela ocorrecircncia da HPIE
PAF influencia os neutroacutefilos do sangue bem como os macroacutefagos alveolares
de equinos e no presente estudo esteve presente na inflamaccedilatildeo pulmonar induzida
pelo exerciacutecio nos potros PSI durante o treinamento para corrida
Os achados relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e ao aumento da
bioatividade de PAF no fluido broncoalveolar dos potros exercitados estiveram
relacionados agrave HPIE e agrave presenccedila dos hemossideroacutefagos no LBA o que resultou
numa resposta de macroacutefago alveolar ainda mais reduzida
Desta forma assume-se que os resultados obtidos para o grupo EX podem
ser extrapolados para as populaccedilotildees similares de cavalos PSI jovens em
treinamento para a corrida
Finalmente sugere-se a conduccedilatildeo de novos estudos para o entendimento
dos mecanismos inflamatoacuterios envolvidos na HPIE bem como o papel do PAF neste
processo
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