ppt. ENZIMAS INMOVILIZADAS

Las enzimas son catalizadores de origen biológico (proteico), producidas por organismos vivos, que parecen cumplir muchos de los requisitos necesarios para impulsar esta nueva industria química.

¿Qué es una Enzima

Ventajas

Presentan una gran actividad catalítica;

Muestran una gran especificidad de sustrato

Son muy activos a temperatura ambiente y presión atmosférica

Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada día más numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos.

Inconvenientes

La mayoría de las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo.

Al ser solubles en agua, su separación de los sustratos y productos es difícil.

No se pueden reutilizar.

SOLUCIÓN

INMOVILIZACIÓN DE

ENZIMAS

¿Qué es la inmovilización?

Es un confinamiento de un biocatalizador (enzima o célula) en una determinada región

del espacio, de manera que su actividad catalítica se retenga y pueda ser reutilizada

MétodosRetención FísicaUnión química

Retención física

Atrapamiento Consiste en la retención física de la

enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa.

El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos.

La enzima no sufre ninguna alteración en su estructura.

Requiere control riguroso de condiciones de polimerización y comprobación de que la naturaleza química del proceso no altere los grupos reactivos de la proteína

Inclusión en membranas

MicroencapsulaciónLas enzimas están rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero no de enzima

Reactores de membranaEmplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo líquido de sustrato que atraviesa el reactor

Unión Química

Unión a soporte

OrgánicosTipos de soportes

Inorgánicos

Reticulado Reticulado propiamente dicho El método del reticulado consiste en uso de

reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las moléculas de enzima. (dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio)

Coreticulado Permite eliminar las pérdidas de actividad

enzimática debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de lisina.

Elección del método de Inmovilización

●● No hay un método universalNo hay un método universal

● ● ElecciónElección::

◦◦ Condiciones de la reacción Condiciones de la reacción biocatalizadabiocatalizada

◦◦ Tipo de reactorTipo de reactor◦◦ Tipo de sustrato procesadoTipo de sustrato procesado

MÉTODO Inclusión

en membranas

Atrapamiento

Reticulado

Adsorción química

Unióncovalente

Preparación Intermedia Difícil Intermedia Sencilla Difícil

Fuerza de unión Débil Media Débil-media Media Fuerte

Actividad enzimática Media-Alta Baja Baja Media Alta

Regeneración soporte Posible Imposible Imposible Posible Difícil

Costo proceso Medio-Alto Medio Medio Bajo Alto

Estabilidad Media Alta Alta Baja Alta

Validez General General Limitada General Limitada

Resistencia microbiana Sí Sí Sí No No

●● métodos de preparación métodos de preparación difícil y costososdifícil y costosos biocatalizadores más estables y biocatalizadores más estables y duraderosduraderos

●● métodos más sencillosmétodos más sencillos derivados inmovilizados con derivados inmovilizados con pérdidas de actividad y deben pérdidas de actividad y deben ser repuestos continuamenteser repuestos continuamente

Efectos de la inmovilización

●● Incremento en la estabilidadIncremento en la estabilidad

●● Actividad enzimática afectada por Actividad enzimática afectada por efectos:efectos: EstéricosEstéricos DifusionalesDifusionales Del microentornoDel microentorno

Incremento de la estabilidad

●● Estabilización conformacional (uniones multipuntuales Estabilización conformacional (uniones multipuntuales enzima-soporte)enzima-soporte)

●● Protección frente a las proteasas en el medio.Protección frente a las proteasas en el medio.●● Se evita la agregación intermolecularSe evita la agregación intermolecular●● Alteración del microentorno de la enzimaAlteración del microentorno de la enzima

Efectos en la actividad enzimática

Si se pierde la actividad puede ser debido aSi se pierde la actividad puede ser debido a::

Unión del soporte. Paso del sustrato Unión del soporte. Paso del sustrato impedido.impedido.

Reacción del soporte con parte del centro Reacción del soporte con parte del centro activo.activo.

Cambio conformacional Cambio conformacional Condiciones experimentales. Condiciones experimentales.

Desnaturalización o desactivación de la Desnaturalización o desactivación de la enzima.enzima.

Aplicaciones de las enzimas inmovilizadas

AnalíticasAnalíticas MédicasMédicas En la IndustriaEn la Industria

Biosensores: sensores de glucosa.Biosensores: sensores de glucosa.

cátodo de Ptaislante

buffer KCl

solución a analizar

membranaánodo de

Ag

Glucosa + O2 glucosa oxidasa ácido glucónico + H2O2

Aplicaciones analíticas

Aplicaciones médicas

Antitumoral

Cicatrizante

Farmacéutica: síntesis de antibióticos

Alimenticia: hidrólisis de proteínas e hidratos de carbono

Química: producción industrial de acrilamida

Tratamientos de aguas residuales: degradación del benceno

Aplicaciones en la Industria

Producción de EtanolProducción de Etanol Síntesis química: Mediante la Síntesis química: Mediante la

modificación del etileno por modificación del etileno por hidratación. hidratación.

Bioetanol: Procesamiento de materia Bioetanol: Procesamiento de materia biológica (biomasa). A partir de un biológica (biomasa). A partir de un gran número de plantas; como caña de gran número de plantas; como caña de azúcar, remolacha, melazas, etc.azúcar, remolacha, melazas, etc.

PROCESO BIOETANOLPROCESO BIOETANOL

Fermentación anaeróbica de Fermentación anaeróbica de azúcares llevada a cabo por azúcares llevada a cabo por bacterias o levaduras en solución bacterias o levaduras en solución acuosa y una posterior destilación.acuosa y una posterior destilación.

Investigación producción de ETANOL con células

inmovilizadasCepas de Zymomonas mobilis: var. mobilis (Zmm1 y Zmm2) pomaceae (Zmp1 y Zmp2)

Aisladas de muestras de melazas de caña con el propósito de realizar un estudio comparativo con resultados reportados anteriormente a partir de:

células libres,Zymomonas mobilis mobilis (CETC) 560, considerada alta productora de etanol.

Resultados de la Resultados de la investigacióninvestigación

Los resultados revelaron a una concentración de inmovilización del 2% p/v, un rendimiento de 92.1%, por parte de las cepas nativas Zmm1 y Zmm2 y de 97.85%, con Zmm 560, comparado con los rendimientos de etanol obtenidos a partir de células libres, de 72.9% por parte de Zmm1 y 76.74% con Zmm 560.

Ventajas del uso de células inmovilizadas

Teniendo en cuenta que la utilización de células inmovilizadas ha sido considerado un método eficaz en el aumento de producción de metabolitos por parte de las células ya que permite: la utilización de células por largos

periodos de tiempo, aumenta la estabilidad de las células permite ventajas en la configuración de

reactores entre las que se incluyen: un rápido control de pH y temperatura, mantener altas concentraciones de células no requiere sistemas de agitación.

Inmovilización de células Se utiliza un polímero en este caso alginato de calcio. Se deja gotear una solución de alginato de Na+ en

una solución de CaCl2 obteniéndose en tiempos cortos, bolillas esféricas de tamaño controlado y homogéneo. Es un método que presenta gran flexibilidad, pues alginatos de distinto peso molecular y distinta composición química rinden geles de muy buenas características químicas y físicas.

El rango de temperaturas de operación va desde 0 hasta 80 ºC.

Las bolillas que se obtienen presentan diámetros entre 0,1 y 5 mm. y pueden presentar una alta carga celular por entrampamiento directo (hasta 30 g de células húmedas por ml de catalizador).

Este sistema puede someterse a un secado parcial, con lo que el tamaño disminuye y aumenta la estabilidad mecánica sin variación en la porosidad.

Puntos destacables del método

Reversibilidad de la gelificación: obliga a tomar precauciones en cuanto a la composición del medio a utilizar, principalmente pH y presencia de agentes que puedan secuestrar a los contraiones por precipitación o por formación de complejos.

Buena estabilidad mecánica respecto al empaquetado en columna y a la agitación.

Formación de bolillas regulares, y con tamaño controlado.

Formación de redes macroporosas, que se conservan aún después del secado parcial.

Alta capacidad de carga sin pérdida de estabilidad mecánica, pero con pérdida de eficiencia debido a resistencias difusionales.

Rendimientos de actividad catalítica de entre 80 y 100% en condiciones de reacción controladas.

Método suave, que permite que las células mantengan viabilidad y estabilidad.

Flexibilidad y simplicidad

FERMENTACIÓN

Bioreactores para células inmovilizadas

Consideraciones para elegir el bioreactor

estudio de la variación de la velocidad inicial de reacción frente a la variación de las concentraciones de enzima y de sustrato.

efecto del tipo de buffer y del ph. limitaciones difusionales en el

sistema (efecto del tamaño de partícula y la carga enzimática)

grado de conversión frente a tiempo de residencia.

estabilidad del biocatalizador en el almacenamiento (velocidad inicial residual tras el almacenamiento a diferentes tiempos en diferentes condiciones).

estabilidad operacional (velocidad inicial residual después de diferentes ciclos catalíticos).

Agradecimientos:Agradecimientos: DR. Miguel ArroyoDR. Miguel Arroyo

Adriana Matiz, Claudia Torres y Raúl Pontou

Laboratorio de Biotecnología Aplicada Dpto. de Microbiología_ Facultad de Ciencias_ Pontificia Universidad Javeriana de Bogotá Colombia

Dr. CivitDr. Da SilvaIng. PuglisiIng. Fuentes Berazategui

Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular_Facultad de Cs. Biológicas Universidad Complutense de Madrid.