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SEMINARIO: PCR EN TIEMPO REAL (qPCR) COMO TECNICA DE DIAGNOSTICO EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y ONCOLOGICAS
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PRACTICA N° 8 SEMINARIO: PCR EN TIEMPO REAL (qPCR) COMO TECNICA DE DIAGNOSTICO EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y ONCOLOGICAS
1. Prepare una tabla en la que compare las siguientes técnicas moleculares: PCR, qPCR, LCR, bDNA, TMA, Qβ Replicasa y Captura Hibrida, con respecto al tipo de amplificación, diana que utiliza como acido nucleico, el tipo de amplicon y las enzimas principales para cada tipo.
TIPIFICACION DIANA UTILIZADA TIPO DE AMPLICON
PRINCIPALES ENZIMAS
PCR Amplificación de pequeñas regiones específicas de ADN
secuencia de ADN concreta
Secuencias de ADN o ARN
Taq Polimerasa
Qpcr Se añade un componente fluorescente que permite medir la luz. A más luz, más cantidad del ADN detectado
secuencia de ADN concreta
Secuencias de ADN o ARN
Taq Polimerasa
LCR Se basa en la función de una ligasa termoestable
secuencia de ADN concreta
Secuencias de ADN o ARN
Ligasa de Thermus aquaticus
Bdna Se puede utilizar PCR competitiva o PCR cuantitativa
Secuencia de ARN viral
Secuencias de ADN
Taq Polimerasa
TMA Se estudia 1 gen (o su producto) en un gran número de tumores
Un gen en un gran número de tumores.
Secuencias de ADN o ARN
Qb REPLICASA se amplifica la sonda específica que se une a la secuencia de interés
Secuencia de interés
Secuencias de ADN o ARN
Qβ replicasa
CATURA HIBRICA Permite identificar la presencia del virus en las células y determinar el grupo al que
ARN del virus Secuencias de ADN o ARN
pertenece 2. Dos muestras de ADN, A y B, son sujetas a un experimento de qPCR en el cual se analiza el gen B- Actina. La muestra A produce un valor de Ct de 21,8. La muestra B produce un valor de Ct de 23,2. ¿Cuántas veces esta la cantidad de diana en la muestra A aumentada sobre la de la muestra B?
Se utilizó la siguiente formula 2−(ct p−ct ref )
Reemplazando en la formula
2−(23,2−21,8 )= 0,373. El kit de cuantificación absoluta para DNA humano ¨Quantifiler TM Human DNA Quantificaction Kit¨comercializado por Life Technologies para la cuantificación de muestras e DNA forenses contiene un DNA humano estándar con una concentración de 200ng/uL. El protocolo requiere que haga una serie de ocho diluciones del estándar en tampón TE(Tris/EDTA). Las muestras diluidas tendrán concentraciones de DNA de 50, 16.7, 5.56, 1.85, 0.62, 0.21, 0.068 y 0.023 ng/uL. Para cada muestra, prepara las diluciones dispensando 10uL de un tubo en el siguiente.
a) ¿Cuál es el factor de dilución necesario para preparar el primer tubo con DNA a una concentración de 50ng/uL?Usamos la formula C.V= C.V
200ngul×?=50 ng
ul×10ul=2.5
Fd= 10ul2.5ul
=4
b) ¿Cuál es el factor de dilución del segundo tubo con DNA a una concentración de 16.7 ng/ul?
200ngul×?=16.7 ng
ul×10ul=0.835
Fd= 10ul0.835ul
=11.9760
c) En que volumen el tampón TE deberían ser dispensados 10uL de la solución de DNA humano stock (a 200ng/uL) para generar el primer estándar con una concentración de DNA de 50ng/uL?
10−2.5=8.5ul
d) ¿En qué volumen tampón TE deberían ser dispensados 10uL de la dilución a 50ng/uL para preparar el segundo tubo con dilución estándar de manera que su concentración sea 16.7 ng/uL?
50ngul×?=16.7 ng
ul×10ul=3,34
10−3.34=6.66ulde tampon.e) ¿Cuáles son las diluciones que necesita hacer para preparar
toda la serie de diluciones? Dilución 50 ng/ul
200ngul×?=50 ng
ul×10ul=2,25 ul
Dilución 16.7 ng/ul.
200ngul×?=16.7 ng
ul×10ul=0.835ul
Dilución 5.56 ng/ul
200ngul×?=5.56 ng
ul×10ul=0.278ul
Dilución 1.85 ng/ul.
200ngul×?=1.85 ng
ul×10ul=0.093ul
Dilucion 0.62 ng/ul
200ngul×?=0.62 ng
ul×10ul=0.031ul
Dilucion 0.21 ng/ul
200ngul×?=0.21 ng
ul×10ul=0.0105ul
Dilucion 0.068 ng/ul
200ngul×?=0.068 ng
ul×10ul=0.0034ul
Dilucion 0.023 ng/ul
200ngul×?=0.023 ng
ul×10ul=0.0225ul
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