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Prof. Dr. Annette G. Beck-Sickinger
Leitung: Dr. Kathrin Bellmann-Sickert, bellmann@uni-leipzig.de
Praktikum Proteinchemie SS 19
Modul: 11-BCH-0414
11-111-1164-N (Chemiker)
Organisatorisches
• Ort: Praktikumssaal 7, 3. Etage Brüderstraße 34
• Schloß für Spind mitbringen
• Das Praktikum findet in Zweier- bis Dreiergruppen statt
Praktikumsbeginn Gruppe E: 29.04.2019
Praktikumsbeginn Gruppe D: 03.06.2019
• Praktikumszeiten:
Montag: 11:30 h – 19:30 h
Dienstag: 9:30 h – 16:30 h
Freitag: 10:45 h – 17:45 h
(abhängig vom Seminar,
bitte mit den Betreuern
abstimmen)
Gruppe Mo Di Fr
E 29.04. 30.04. 03.05.
E 06.05. 07.05. 10.05.
E 13.05. 14.05. 17.05.
E 20.05. 21.05. 24.05.
E 27.05. 28.05. 31.05.
D 03.06. 04.06. 07.06.
D frei 11.06. 14.06.
D 17.06. 18.06. 21.06.
D 24.06. 25.06. 28.06.
D 01.07. 02.07. 05.07.
Organisatorisches
• Vor jedem Versuchsblock muss ein Antestat abgelegt werden (i. d. Regel im
Seminarraum 324)
gestaffelte Testattermine:
Block 3: 11.30 Uhr
Block 2: 11.50 Uhr
Block 5: 12:10 Uhr
Block 4: 12.30 Uhr
Block 1: 12:50 Uhr
• Sollte etwas dazwischen kommen (z. B. Arzttermine, Kollisionen mit anderen
Veranstaltungen): bitte vorher mit der Praktikumsbetreuerin abklären!!!
Inhalte des Praktikums
• Ziele des Praktikums: Erlernen verschiedener proteinchemischer
(Expression, Proteinisolierung, -aufreinigung, -modifizierung) und
proteinanalytischer Methoden (SDS-PAGE, Western Blot,
Immunfärbung, CD-Spektroskopie, Fluoreszenzspektroskopie,
Massenspektrometrie)
• Beispiel: Expression, Isolierung, Aufreinigung, Modifizierung und
Analyse des enhanced Green fluorescent Proteins (eGFP)
• der Versuch zur Enzymkinetik wird an einem anderen Beispielprotein
durchgeführt (Laktatdehydrogenase)
• Skript, Zeitpläne im Netz
Versuchsblöcke
Block 1: Rekombinante Synthese
(Expression von eGFP in E. coli. Zellernte und Zellaufschluss)
Block 2: Reinigung und Modifizierung
(Affinitätschromatographie, Biotinylierung)
Block 3: Proteinanalytik I
(SDS-PAGE, Western-Blot)
Block 4: Proteinanalytik II
(CD-Spektroskopie, Fluoreszenzspektroskopie, Massenspektrometrie)
Block 5: Enzymkinetik
(Michaelis-Menten-Kinetik, Hemmung)
Block Mo, 11:30-19:30 h Di, 10-17 h Fr, 10:45-17:45 h
1Vorbereitung Expression, Animpfen der Vorkultur
Expression, Zellernte Zellaufschluss
2Affinitätschromatographie (Beladung der Chitinsäule)
Affinitätschromatographie
(Elution des EGFP-Thiolesters)
Biotinylierung
Größenausschluss-chromatographie
3SDS-PAGE 1
Western Blot
Immunfärbung
des Western Blots
SDS-PAGE 2
4Fluoreszenzspektroskopie
Massenspektrometrie
Fluoreszenzspektroskopie Massenspektrometrie
CD-Spektroskopie
Fluoreszenzspektroskopie Massenspektrometrie
5 Michaelis-Menten-Kinetik Enzymhemmung
Versuchsblöcke
Block 1
Expression
Block 2
Reinigung/
Modifizierung
Block 3
Proteinanalytik I
Block 4
Proteinanalytik II
Block 5
Enzymkinetik
Block 1-4 bauen aufeinander auf – Beispiel eGFP
Versuchsblöcke
Organisatorisches
• Pro Versuch muss jede Gruppe ein Antestat zum Versuch durchführen.
• Ohne bestandenes Antestat (sprich Vorbereitung) kein Versuch
• Zu jedem Versuchsblock muss ein Protokoll (pro Gruppe) geschrieben werden
(insgesamt 5). Zeitvorgabe: 1 Woche nach Beendigung des Versuchsblocks
Abgabe des ersten Protokolls zu Beginn der 3. Praktikumswoche!
elektronisch an bellmann@uni-leipzig.de
• Gruppe E: 11.06.19 Abgabe des letzten Protokolls
• Gruppe D: 11.07.19 Abgabe des letzten Protokolls
Inhalte des Protokolls: kurze Einleitung (max. 1 DIN A4 Seite)
Methoden (Vergangenheit, Passiv)
Ergebnisse (Textteil nicht vergessen, nicht bloß Abbildungen
aneinanderreihen)
Auswertung/Diskussion
Organisatorisches
• Für Biochemiker:
• das Modul wird mit einer Klausur (Vorlesung/Praktikum) abgeschlossen
• voraussichtlich
•Schein wird erst ausgestellt nach Bearbeitung aller Protokolle +
bestandener Klausur!
• Für Chemiker: Schein wird ausgestellt nach beendeter Protokollabgabe
• Note setzt sich zusammen aus Leistungen aus Testaten,
Versuchsdurchführung und Protokoll (Protokoll am höchsten gewichtet)
Arbeitsschutz
Laborordnung & Haftungsregelung
Universität Leipzig
Institut f. Biochemie
AK Prof. Beck-SickingerRRS Belehrung 2013_14
Seite 10
Fak. f. Biowissenschaften, Pharmazie & Psychologie
Institut für Biochemie
AK Prof. Dr. Annette Beck-Sickinger
Praktikumsleiter: Dr. Kathrin Bellmann-Sickert
Proteinchemie
Arbeitsschutz
Universität Leipzig
Institut f. Biochemie
AK Prof. Beck-SickingerRRS Belehrung 2013_14
Seite 11
Geltende Betriebsanweisung:
Verpflichtung zur Einhaltung der aushängenden Laborordnung
Informationspflicht bei Arbeiten mit Gefahrstoffen über H-und P-Sätze via Intranet o.ä.
GESTIS-Stoffdatenbank
Arbeitsschutz
Universität Leipzig
Institut f. Biochemie
AK Prof. Beck-SickingerRRS Belehrung 2013_14
Seite 12
Tragen von Schutzkleidung und Schutzbrillen sowie Handschuhen
Kennzeichnungspflicht der verwendeten Gefahrstoffe, auch bei kleinen Mengen
Das Berühren von Gegenständen außerhalb der Versuchsanordnung sowie
das Verlassen des Labors mit „kontaminierten“ Handschuhen ist untersagt.
Beim Umgang mit Gefahrstoffen möglichst unter einem Abzug arbeiten
Ordnung & Sauberkeit an den Arbeitsplätzen, Eintrag in Geräte-Kalender sofern
vorhanden
Arbeitsschutz
Universität Leipzig
Institut f. Biochemie
AK Prof. Beck-SickingerRRS Belehrung 2013_14
Seite 13
Pflicht, sich mit der Bedienung der Laboratoriumsgeräte vor deren
Benutzung vertraut zu machen und sorgsam damit umzugehen
sämtliche Defekte an Geräten sind dem Betreuer bzw. im Sekretariat
zu melden
Schlussdienst im Labor (Fenster & Türen verschlossen? ;
nicht benötigte Wasser- und Energiequellen abgestellt?)
Laborräume bei Abwesenheit verschließen
exp. Arbeiten nicht allein ohne weitere fachkundige Person ausführen
Arbeitsschutz
Universität Leipzig
Institut f. Biochemie
AK Prof. Beck-SickingerRRS Belehrung 2013_14
Seite 14
Gasanschlüsse in den Laboratorien nicht unsachgemäß benutzen,
techn. Wirkungsweise bei Bedarf erklären lassen
Anzeigepflicht einer bestehenden Schwangerschaft, damit alle Arbeiten
so organisiert werden können, dass die Gesundheit von Mutter und
Kind bestmöglich geschützt sind
Bei kleineren Verletzungen sollte Eintrag in kleines grünes Buch
(Sekretariat) erfolgen.
Abfallverminderung und – entsorgung (LM-Tonnen, Chemikalienreste
nicht in Schränken lagern, sondern zentraler Entsorgung
(Koll. Strohscheidt) zuführen
Arbeitsschutz
Universität Leipzig
Institut f. Biochemie
AK Prof. Beck-SickingerRRS Belehrung 2013_14
Seite 15
bei Verätzungen und/oder Verbrennungen mindestens 10 min mit
fließendem kalten Wasser, besser mit Kalziumgluconat (fest oder als
Lösung) spülen!!!
Spritzen nicht ohne Schutzhüllen entsorgen!
Essen und Trinken nur in den dafür vorgesehenen Räumen
Nicht unterwiesenen Personen ist das Arbeiten und der Aufenthalt in den
Laboratorien untersagt.
Arbeitsschutz
Universität Leipzig
Institut f. Biochemie
AK Prof. Beck-SickingerRRS Belehrung 2013_14
Seite 16
... In Gefahrensituationen...
Ruhe bewahren, geeignete Maßnahmen einleiten, Vorgesetzten informieren;
Dispatcher- und Notrufnummern an den Telefonen;
Feuerlöscher im Raum oder auf den Gängen sind universell einsetzbar.
Über Standorte & Fluchtwege informieren!
Arbeitsschutz
Universität Leipzig
Institut f. Biochemie
AK Prof. Beck-SickingerRRS Belehrung 2013_14
Seite 17
Praktikum Proteinchemie
Arbeitsschutz
Universität Leipzig
Institut f. Biochemie
AK Prof. Beck-SickingerRRS Belehrung 2013_14
Seite 18
Praktikum Proteinchemie
Die ständig steigenden Reparaturkosten haben zu den folgenden Anweisungen des
Institutsdirektors geführt:
Jeder Student muss für Glasbruch und sonstige selbst verschuldete Sachschäden in
Höhe von einem Drittel des Anschaffungspreises bzw. der Reparaturkosten selbst
aufkommen.
Bei Gruppenpraktika haftet die Praktikumsgruppe, wobei alle Studenten einer Gruppe
für die ausgehändigten Geräte quittieren.
Die Ausgabe der Praktikumsscheine erfolgt erst, wenn keine finanziellen Forderungen
seitens des Institutes mehr bestehen.
Der Abschluss einer Haftpflichtversicherung bzw. Glasbruchversicherung wird
empfohlen.
Haftungsregelungen
Belehrung nach der Gentechnik-
Sicherheits-Verordnung (GenTSV)
Alle in einer gentechnischen Anlage Beschäftigten müssen vor Arbeitsantritt
und dann einmal jährlich über die sicherheits-relevanten Aspekte der Arbeit
belehrt werden.
Was ist ein GVO (Gentechnisch Veränderter Organismus): Organismus, der mit
Hilfe eines Vektors neue DNA erhalten hat; auch gentechnisch veränderte
Viren sind laut Gesetz GVOs (Leitfaden S. 2).
DNA alleine (genomische, virale und Plasmid-DNA) ist kein GVO.
Beispiel: Isolierung eines rekombinanten Plasmids aus einem GVO ist
gentechnische Arbeit, Arbeit mit isoliertem rekombinanten Plasmid
(Restriktionsspaltung, Sequenzierung) ist keine gentechnische Arbeit.
Gentechnische Anlage = Labore, Flure, Treppenhäuser, Gewächshäuser,
Tierställe
Gentechnische Arbeit = Erzeugung eines GVOs, Verwendung, Vermehrung,
Lagerung, Zerstörung, innerbetrieblicher Transport, Zerstörung und Entsorgung
von GVOs
Belehrung nach der Gentechnik-Sicherheits-Verordnung
(GenTSV)
Sicherheitseinstufung der gentechnischen Arbeiten erfolgt entsprechend
ihrem Gefährdungspotential in 4 Sicherheitsstufen:
Sicherheitsstufe 1: es ist nicht von einem Risiko auszugehen
Sicherheitsstufe 2: geringes Risiko
Sicherheitsstufe 3: mäßiges Risiko
Sicherheitsstufe 4: hohes Risiko
für die menschliche Gesundheit oder die Umwelt. Bei Sicherheitsstufe 4 reicht
bereits der begründete Verdacht eines hohen Risikos aus.
Belehrung nach der Gentechnik-
Sicherheits-Verordnung (GenTSV)
Alle Räume in denen gentechnisch gearbeitet wird müssen genehmigt und gekennzeichnet sein, der Zutritt ist
nur belehrten Personen erlaubt.
Jacken/Taschen dürfen nicht mit in den S1-Bereich genommen werden.
Essen, Trinken, Schminken, Zigarettenschachteln (mit Inhalt) sind verboten
Es müssen Laborkittel getragen werden (auch von Personen, die sich im S1 Labor aufhalten ohne
gentechnisch zu arbeiten). Die Laborkittel müssen im S1 Bereich bleiben.
Fenster müssen während der Arbeit geschlossen sein
Vorratslagerung in den dafür vorgesehenen Schränken (keine Kisten auf dem Boden!)
Nur auf den dafür vorgesehenen Arbeitsflächen (mit Randerhöhung, Verfugung zu Boden und Wand)
darf experimentell gearbeitet werden. Die Arbeitsflächen sind mindestens einmal täglich zu reinigen
und zu desinfizieren.
Verwendung von Kanülen/Skalpellklingen ist auf ein Minimum zu beschränken, spitze Gegenstände müssen
so entsorgt werden, dass keine Verletzungsgefahr besteht (gilt auch für Glasabfall!)
Bei Arbeiten mit GVOs müssen Handschuhe getragen werden, die im S1-Labor entsorgt werden
müssen.
Arbeiten ohne Aerosolbildung (mit gestopften Pipetten, wenn lebende Zellen)
Autoklavieren von Müll, wenn dieser mit GVOs in Berührung kam
Aufbewahrung von GVOs bruchsicher in Gefäßen mit Schraubdeckel, deutlich entsprechend der
Gentechnikaufzeichnungen beschriftet (Zelle, DNA, evtl. Passagezahl, Name, Datum)
Transport in gekennzeichneten Gefäßen mit Deckel, geschützt vor Bruch und Verschütten
Die Hände sind nach Beendigung der Arbeit zu reinigen und zu desinfizieren. Spülbecken müssen mit
Desinfektionsmittel und Hautschutzcreme versehen sein. Es dürfen keine Stoffhandtücher oder
Putzlappen verwendet werden (nur Einwegmaterialien).
Meldungspflicht bei Unfällen
Aufzeichnungspflicht (S1: 10 Jahre; S2: 30 Jahre)
Zutritt während der Schwangerschaft nur nach Sondergenehmigung
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