Princípios de Clonagem Molecular

Princípios de Clonagem Molecular

Prof. Dr. Halbert Villalba

Clonagem Princípio - Isolamento de DNA e obtenção de

múltiplas cópias; A recombinação entre moléculas de DNA de

diferentes organismos é um fenômeno comum na natureza. Vírus como o fago l têm a capacidade de inserir o seu genoma no cromossoma de E. coli. Neste processo, eles podem mudar o conteúdo genético da célula e por vezes uma bactéria torna-se patogénica, ao receber nova informação genética de um vírus.

Clonagem Houve descobertas em biologia molecular, que

permitiram aos cientistas reproduzir no laboratório este fenômeno natural e desenvolver métodos para introduzir quase todo o tipo de informação genética num organismo. A maior parte destes avanços envolve a manipulação genética de bactérias como E. coli e B. subtilis, e a levedura S. cerevisae

Hibridoma Anticorpos

Proteínas InsulinalnterferãoAlbumina sérica humanaHormona humana do crescimentoActivador plasminogénico de tecidosAntitrombinaFactores de coagulação do sangueLuciferase (pirilampo)LinfocinasFactor da necrose tumoralGonadotropina humana

Agricultura Cereais resistentes a doençasTomates hidropónicosResistência a pesticidasBio-insecticidasFixação do azoto

Vacinas Hepatite BHerpesGripeMalária

Linguagem

Linguagem:Biblioteca: coleção de clones recombinantes

de uma fonte que sabidamente contém o gene, cDNA, ou outras sequências de DNA representadas na célula, tecido ou cromossomo original.

Clonagem - Linguagem

cDNA (DNA complementar): Um DNA sintético copiado do RNA mensageiro

(mRNA) pela enzima transcriptase reversa. Usado para referir-se a uma cópia de filamento único ou seu derivado de filamento duplo.

Clone:Molécula de DNA recombinante que contém um

gene ou outra sequência de DNA desejada.

Clonagem - Linguagem

Enzimas de Restrição: Enzimas que reconhecem sequências de DNA

de duplo filamento específicas e dividem o DNA no ou próximo ao sítio de reconhecimento.

Hibridização:O ato de duas moléculas de ácido nucléico de

filamento único complementares formarem ligações e se tornarem uma molécula de filamento duplo.

DNA Recombinante

Clonagem - Linguagem

Hospedeiro: O organismo usado para isolar e propagar

uma molécula de DNA recombinante. Em geral, uma cepa da bactéria Escherichia coli ou da levedura Saccharomyces cerevisiae.

Inserção:Fragmento de DNA humano clonado num

determinado vetor.

Clonagem - Linguagem

Ligação: O ato de formar ligações de fosfodiéster para unir duas

moléculas de DNA de duplo filamento por intermédio da enzima DNA-ligase. A Ligação é a etapa essencial na criação de moléculas de DNA recombinante.

Sonda: Uma molécula de DNA ou RNA clonada, marcada com

radioatividade ou outro marcador detectável, usada para identificar suas sequências complementares por hibridização molecular.

Clonagem - Linguagem

Southern blot: Filtro para o qual DNA é transferido, geralmente após digestão

por enzima de restrição e eletroforese em gel para separar as moléculas de DNA por tamanho (denominado em homenagem ao criador da técnica, Ed. Southern); também, o ato de produzir este filtro e hibridizá-lo com uma sonda.

Vetor: Molécula de DNA na qual é clonado o gene ou outro fragmento

de DNA desejado, capaz de se replicar num determinado hospedeiro. Os exemplos incluem plasmídios, o bacteriófago lambda, cosmídios e cromossomos artificiais de leveduras.

Princípios de Clonagem

1 – Isolamento da sequência de DNA desejada; 2 – Obtenção de múltiplas cópias da mesma

num organismo, em geral uma bactéria, que seja capaz de crescimento durante longos períodos;

3 – Grandes quantidades da molécula de DNA podem então ser isoladas na forma pura para análise molecular.

Princípios de Clonagem

Plasmídeos:São moléculas de DNA de duplo filamento

circulares que se replicam extracromossomicamente em bactérias ou leveduras.

Ideais para a produção de grandes quantidades de uma seqüência de moléculas curtas de DNA clonada.

Princípios de Clonagem

Plasmídeos: As bactérias, em particular a Escherichia coli, constituem

um dos principais materiais biológicos empregados na Tecnologia do DNA Recombinante. Isto se deve a vários fatores:- ciclo de vida rápido em relação aos organismos superiores.- cultivo de um grande número de indivíduos em um espaço pequeno- apresenta menor número de genes em relação aos organismos superiores- divisão celular por fissão binária.

Princípios de Clonagem Plasmídeos:

Além do DNA cromossômico, a célula bacteriana contém pequenas moléculas de DNA circular denominadas PLASMÍDEOS.

Estes mantém uma existência independente do cromossomo; no entanto, sua duplicação é sincronizada com a da bactéria, garantindo assim sua transmissão para as bactérias-filhas.

Em Engenharia Genética, genes "estranhos" a bactéria podem ser incorporados aos seus plasmídeos, e assim, tais bactérias passam a produzir as proteínas que esses genes codificam.

Certos plasmídeos possuem genes responsáveis pela síntese de enzimas que destroem um antibiótico antes mesmo que ele faça mal a bactéria.

Princípios de Clonagem Plasmídeos:

Os plasmídeos portadores de genes que conferem resistência a drogas são chamados PLASMÍDEOS R (R Resistência).

Eles possuem também, genes que permitem sua passagem de uma bactéria para outra (RTF ou Fator de Transferência de Resistência).

Quando dois ou mais tipos de plasmídeos R estão presentes em uma mesma bactéria, os genes de um deles pode passar para o outro. Esse mecanismo faz com que surjam plasmídeos R muito complexos, portadores de diversos genes para resistência a diferentes antibióticos.

Essa propriedade de genes para resistência a antibióticos passarem de uma molécula de DNA para outra fez com que os cientistas os classificasse de transposons ou genes saltadores.

Princípios de Clonagem Bacteriófago Lambda:

Os vírus, principalmente o bacteriófago conhecido como fago lambda, são de grande utilidade na Tecnologia do DNA Recombinante.

Vírus bacteriano com uma molécula de DNA de duplo filamento relativamente grande.

Durante o crescimento em E. coli, o lambda replica-se produzindo números enormes de vírus infecciosos, depois destruindo as células bacterianas infectadas e liberando cerca de 1 milhão de bacteriófagos.

Durante esta fase infecciosa do crescimento, cerca de um terço do genoma do bacteriófago não é essencial, podendo substituir-se por outras seqüências de DNA, assim, é altamente adequado para clonagem de fragmentos relativamente grandes (até 20Kd) de DNA humano.

Princípios de Clonagem

Bacteriófago Lambda: A região mediana do cromossomo, onde se localizam

os genes dispensáveis, pode ser retirada e substituída por um pedaço de DNA de outro organismo. Sendo assim, quando o cromossomo viral se multiplica, o DNA estranho incorporado à ele também será multiplicado.Os cientistas têm utilizado essa técnica para conseguir a multiplicação de genes importantes a fim de obter grande número de cópias o que é necessário ao estudo de genes.

Princípios de Clonagem

Cosmídios: Fragmentos ainda maiores de DNA estranho podem

ser clonados em cosmídios vetores. São plasmídios que usam a capacidade das

partículas infecciosas de bacteriófagos lambda para acondicionar eficazmente grandes fragmentos lineares de DNA e introduzi-los em células bacterianas.

Após infecção de bactérias de maneira semelhante a de um vírus lambda, o cosmídio reassume a forma circular e replica-se como um grande plasmídio.

Princípios de Clonagem

Cromossomos artificiais:Até meados da década de 1980 - o maior

veículo de clonagem era o cosmídio;Olson e cols – Cromossomos artificiais,

técnica de clonagem de fragmentos muito maiores de DNA em vetores que se replicam e segregam no hospedeiro Saccharomyces cerevisiae (levedura de padaria).

Princípios de Clonagem

OBJETIVO: Isolar um determinado gene ou outra seqüência de

DNA em grandes quantidades para estudo adicionais; 1ª. Etapa - Biblioteca – conjunto de clones de DNA

recombinante de uma fonte que contenha o gene ou seqüência desejada.

2ª. Etapa – Identificar o clone ou clones interessantes usando métodos de triagem sensíveis que sejam capazes de encontrar a cópia do clone desejada.

Clonagem molecular Uma vez preparados os plasmídeos, a tarefa é inseri-los

em células bacterianas. Plasmídeos e células bacterianas são postos um em

contato com o outro. No entanto, apenas algumas bactérias conseguem

absorver o plasmídeo novo, sendo necessário agora, selecionar na população de bactérias aquelas que realmente incorporaram o plasmídeo com o gene novo.

Alguns plasmídeos de bactérias carregam naturalmente genes que lhes conferem resistência a certo antibiótico. Os pesquisadores escolhem para DNA recombinante, plasmídeos que já têm o gene para resistência ao antibiótico. Em seguida, esses plasmídeos são abertos, e os genes a serem enxertados são encaixados.

Clonagem molecular Esses plasmídeos são colocados em contato

com bactérias sensíveis ao antibiótico, sendo que algumas destas os incorporam.

Para selecionar as bactérias que ganharam o plasmídeo novo basta adicionar o antibiótico ao meio de cultivo.

Todas as bactérias sem o plasmídeo morrem, por não serem resistentes ao antibiótico, restando somente as que possuem o plasmídeo com o gene para resistência ao antibiótico.

Essas bactérias se reproduzem e todo o clone resultante possuirá o plasmídeo com o gene novo.

Expressão de genes clonados em bactérias Tão logo foram desenvolvidas as técnicas

básicas de clonagem molecular, os biólogos concluíram que um gene de interesse, se estivesse ligado a um plasmídeo e fosse introduzido em uma bactéria, poderia eventualmente funcionar.

As bactérias portadoras desse gene se transformariam em verdadeiras fábricas, produzindo quantidades ilimitadas de proteínas que o gene codifica.

Expressão de genes clonados em bactérias A primeira vez que se obteve síntese de uma proteína

humana por uma bactéria transformada foi em 1977. Um segmento de DNA de 60 pares de bases, contendo o

código para a síntese da somatotrofina (hormônio de crescimento). Foi ligado a um plasmídeo e introduzido em uma bactéria, a partir da qual foram obtidos clones capazes de produzir somatotrofina.

Outros genes que codificam proteínas de interesse médico têm sido transplantados para bactérias, onde passam a funcionar. Já é possível introduzir genes humanos que codificam insulina e hormônio de crescimento em bactérias, as quais passam a fabricar essas substâncias.

Uso do DNA Recombinante na Terapia

Gênica, e na produção de medicamentos Terapia gênica

Pela primeira vez, um método de terapia gênica reverteu os efeitos de uma doença genética chamada imunodeficiência combinada grave ligada ao cromossomo X (SCID). Pacientes que sofrem dessa doença, chamada SCID, são obrigados a viver em ambientes completamente isolados (como no filme "o rapaz da bolha de plástico"), pois o sistema imunológico não defende o corpo de infecções. No caso dos bebês da pesquisa, a doença impedia a produção de glóbulos brancos pela medula óssea.

Metodologia· Pesquisadores retiraram do vírus os genes que o tornam capazes de causar doenças. Em seu lugar foi inserido o gene remédio, isto é, que produzia corretamente a proteína defeituosa e que corrigia o problema nas células.· O vírus modificado foi misturado com células-tronco da medula óssea retiradas dos bebês. O vírus infecta as células e passa os genes terapêuticos.· Com o gene terapêutico, as células-tronco passam a produzir a proteína responsável pela estimulação das células de defesa, fazendo com que estas se desenvolvam, cresçam e se espalhem pelo corpo, destruindo os invasores.

Uso do DNA Recombinante na Terapia Gênica, e na produção de medicamentos Biotecnologia animal e produção de medicamentos

Quando se pensa nos animais como fábricas de proteínas interessantes para o Homem, o exemplo da insulina é o mais conhecido. No entanto, cientistas canadenses conseguiram transformar vesículas seminais de ratinhos em "biorreatores" (fábricas biológicas de substâncias de interesse).Para testar a viabilidade da técnica foi escolhida a proteína hGH (Hormônio de crescimento humano).

Metodologia· Para montar o "gene artificial", além da seqüência de bases contendo as instruções para produzir o hGH, foi utilizado também um promotor (seqüência especial de DNA que indica que tipo de tecido ou órgão o gene deve agir).· O DNA construído (transgene) foi microinjetado em vários embriões de camundongos. Obteve-se então, animais transgênicos produzindo hGH no seu sêmen.· O próximo passo é conseguir produzir o hormônio de crescimento (hGH) no fluído seminal do porco, dado que esse animal ejacula o maior volume de líquido seminal entre todos os animais domésticos.

Essa figura representa a introdução do DNA de uma pessoa com uma lesão (ex. neurológica) num óvulo “in vitro” com o objetivo de gerar um embrião.

No óvulo fecundado tem início a formação do embrião “in vitro”.

Após cinco dias de incubação “in vitro” do óvulo fecundado o número de células se multiplica formando o blastocisto. Essas células contêm células

pluripotenciais para formação dos diversos tecidos do organismo e são conhecidas por células tronco.

As células pluripotenciais são extraídas do blastocisto e colocadas em outro meio de cultura enriquecido com proteínas específicas para induzir a produção de

determinada célula tronco (no exemplo células tronco neurológicas). Por esse meio de clonagem terapêutica e com uso de meio de cultura com proteínas específicas

será possível no futuro induzir células tronco com especificidade para os tecidos do coração, pâncreas, fígado, ossos, sangue, rim, etc..