View
13
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de La Recherche Scientifique
Université Larbi Ben M'hidi Oum El Bouaghi
Faculté Des Sciences Exactes et des Sciences de la Nature et de la Vie
Département des Sciences de la Nature et de la Vie
N ° d’ordre…… N ° de série…...
Mémoire
Présenté pour l’obtention du diplôme de
MASTER
Filière : Biologie
OPTION : Microbiologie Appliquée
Thème
Présenté par:
M elle
SAOUDI Safa & M elle
LAIB Souheyr
Devant le jury
Présidente Mme CHETTIBI F. M.C.B. Université OEB Rapporteur Mme AOUAR L. M.C.A. Université OEB
Examinatrice Mr MEDJOUDJ H. M.A.B. Université OEB
Année universitaire: 2017-2018
Production et extraction des molécules bioactives à partir d’une
souche d’actinobactérie (Streptomyces SRO1)
République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de La Recherche Scientifique
Université Larbi Ben M'hidi Oum El Bouaghi
Faculté Des Sciences Exactes et des Sciences de la Nature et de la Vie
Département des Sciences de la Nature et de la Vie
N ° d’ordre…… N ° de série…...
Mémoire
Présenté pour l’obtention du diplôme de
MASTER
Filière : Biologie
OPTION : Microbiologie Appliquée
Thème
Présenté par:
&
Devant le jury
Présidente Mme CHETTIBI F. M.C.B. Université OEB Rapporteur Mme AOUAR L. M.C.A. Université OEB
Examinatrice Mr MEDJOUDJ H. M.A.B. Université OEB
Année universitaire: 2017-2018
Production et extraction des molécules bioactives à partir d’une
souche d’actinobactérie (Streptomyces SRO1)
Remerciements
En première lieu, je remercie tout puissant de m’avoir donné la sante, le
courage et la volante pour mener a bien ce modeste mémoire et pour le
terminer dans les Meilleurs conditions.
Mes remerciements chaleureux vont directement vers mon encadreur
Mr. AOUAR Lamia pour ses précieux conseils, ces orientations et
ses encouragements.
Mes plus vifs remerciements vont aussi aux nombres du jury pour
L’intérêt qu’ils ont Porté à mon travail.
Enfin, nous veux remercier tous ceux qui m’ont aidé de près ou de loin
dans l’élaboration et finalisation de ce travail.
Dédicaces
Je dédie ce modeste travail aux êtres qui me sont les plus chers,
À mon père « Boukhmis » et ma mère « Leila », pour tout l’amour
et le soutien qu’ils m’ont donne.
Aucune dédicace ne saurait exprimer ma reconnaissance, mon
respect, mon amour et ma considération pour les sacrifices que
vous avez consentis. Mon instruction et mon bien être. Puisse dieu
le tout puissant vous accorde sante et longue vie.
A ma très chère sœur «Marwa» et mon adorable petit
frère «Acheraf Zin Elaabidine» que j’aime tant. Je vous souhaite
une pleine de bonheur et de réussite que Dieu vous partage et vous
garde.
Aux grandes familles « SAOUDI & BOUROUBI » je dédie tout
mon amour.
A ma très chère amie «Souheyr» pour sa précieuse collaboration
et son soutien Permanent tout au long de l’élaboration de ce
mémoire.
Safa
Dédicaces
Avec jolie et plaisir, fierté et respect, je dédie ce mémoire
à la source de tendresse à la grande partie de ma vie, celle qui
m’a tout appris dans ce monde, qui m’a construit et qui ma
donner le courage d’étudier.
À ma très chère mère que j’aime,
A mon très chère père qui m’a apporté soutien, affection, qui
exauce mes désirs et qui à fait de moi, ce je suis maintenant.
À mes Frères «Youcef» et « Adam»,
À mon fiancé «Walid»,
À mes grandes- pères et mes grandes -mères,
À mes cousins et mes cousines,
À tous mes amies en particulier à « Nader» et « Safa»,
À tous ceux qui m’ont apporté leur aide et leurs conseils, à tous
ceux que j’aime.
Souheyr
Sommaire
Table des Matières
Liste des abréviations I
Liste des figures II
Liste des photographies III
Liste des tableaux IV
Introduction ................................................................................................................ 01
Revue bibliographique
1 Les actinobacteries .............................................................................................. 2
1.1 Généralités .......................................................................................................... 2
1.2 Classification des actinobacteries ....................................................................... 2
1.2.1 Classe "Actinobacteria" ................................................................................... 3
1.3 Importance des actinobacteries ........................................................................... 3
2 Genre Streptomyces ............................................................................................ 4
2.1 Cycle de développement ..................................................................................... 4
2.1.1 Germination ..................................................................................................... 5
2.1.2 Croissance végétative ...................................................................................... 5
2.1.3 Croissance aérienne ......................................................................................... 6
2.1.4 La sporulation .................................................................................................. 6
2.2 Génétique ............................................................................................................ 7
2.3 Ecologie .............................................................................................................. 7
2.4 Bioactivité ........................................................................................................... 8
3 Production des antibiotiques par les Streptomyces ............................................. 9
3.1 Généralités .......................................................................................................... 9
3.2 Classification des antibiotiques......................................................................... 10
3.3 Antibiotiques produits par les Streptomyces ..................................................... 11
4 Résistance aux antibiotiques ............................................................................. 12
4.1 Types de résistance ........................................................................................... 12
4.1.1 Résistance naturelle ....................................................................................... 12
4.1.2 Résistance acquise ......................................................................................... 13
4.2 Mécanismes biochimiques de résistance bactérienne aux agents antibactériens
13
4.3 Destruction ou l’inactivation de l’antibiotique par production d’enzymes ..........
.......................................................................................................................... 13
Matériel et méthode
1. Matériel biologique .................................................................................................. 15
1.1 Souches des actinobactéries .............................................................................. 15
1.2 Souches test ....................................................................................................... 15
1.3 Champignons phytopathogènes ........................................................................ 15
2 Milieux de culture ............................................................................................. 16
3 Solvants d’extraction ........................................................................................ 16
1 Repiquage des souches ..................................................................................... 16
2 Activité antibactérienne .................................................................................... 16
2.1 Préparation des inocula des bactéries-test......................................................... 16
2.2 Mise en évidence des activités antibactériennes ............................................... 16
2.2.1 Technique des cylindres d’Agar .................................................................... 16
2.2.2 Inoculum fongique ........................................................................................ 17
2.2.3 Mise en évidence des activités antifongiques ............................................... 17
3 Production et préparation d’extraits riches en métabolites secondaires ........... 17
3.1 Fermentation liquide ......................................................................................... 17
3.2 Fermentation solide ........................................................................................... 17
4 Technique des disques de diffusion .................................................................. 18
Résultats et discutions
I. Résultats
1 Détermination de l’activité antimicrobienne .................................................... 19
2 Détermination de l’activité antifongique .......................................................... 19
3 Technique des cylindres d’agar ........................................................................ 20
3.1 Activité antibactérienne .................................................................................... 20
3.2 Activité antifongique ........................................................................................ 22
4 Activité antibactérienne par la méthode des disques de diffusions .................. 23
4.1 Activité antibactérienne des extrais obtenus sur ISP2 par fermentation liquide
et solide ........................................................................................................................ 23
4.2 L’activité antibactérienne des extrais obtenue d’AF par la fermentation liquide
et solide ........................................................................................................................ 26
5 L’activité antifongique par la méthode des disques de diffusion ..................... 29
5.1 L’activité antifongique des molécules obtenue à partir de milieu ISP2. .......... 30
5.2 L’activité antifongique des extraits obtenus par fermentation solide et liquide
sur milieu AF ............................................................................................................... 31
II. Discussion
Conclusion et perspectives ................................................................................................ 35
Références bibliographiques ........................................................................................... 37
Annexe
Résumé
Liste des abréviations
ADN : acide désoxyribonucléique.
ARN : acide ribonucléique.
BN : bouillon nutritif.
C : cytosine.
CaCO3 : carbonate de calcium.
G : guanine.
GN : gélose nutritive.
ISP : International Streptomyces Project.
rpm: rotations par minute.
Liste des figures
Figure 01 : cycle de développement des Streptomyces sur milieu solide (Hopwood et
al., 1985) ................................................................................................................................. 05
Liste des photographies
Photographies 01 : Les bactéries test sur différents milieux A) K. oxytoca ; B) E. coli ;
C) Enterobacter sp. ; D) P. aeruginosa ; E) S. aureus ; F) B. subtilis. .......................... 19
Photographies 02 : Les champignons test A) A. rabiei ; B) A. alternata ; C) B. cinerea ;
D) Trichoderma sp.; E) Fusarium oxysporum ; F) Penicillium sp. ................................ 20
Photographies 03 : L’activité antibactérienne de la souche SRO1 contre les souches
test A) S. aureus ; B) K. oxytoca ; C) Enterobacter sp. ; D) B. subtilis ; E) E. coli ; F)
P. aeruginosa par la technique des cylindre d’agar. ........................................................ 22
Photographies 04 : L’activité antibactérienne de la souche SRO1 contre les
champignons phytopathogènes A) A. rabiei ; B) A. alternata ; C) Trichoderma sp. ;
D) F. oxysporum. ......................................................................................................... 22
Photographies 05 : L’activité antibactérienne de la souche SRO1 contre les souches
test A) S. aureus ; B) K. oxytoca ; C) Enterobacter sp. ; D) B. subtilis ; E) E. coli ; F)
P. aeruginosa, par la technique des disques de diffusion. ........................................... 29
Photographies 06 : L’activité antifongique contre les champignons phytopathogènes
A) Ascochyta rabiei ; B) Botrytis cinerea, par la technique des disques de diffusion
...................................................................................................................................... 33
Photographies 07 : L’activité antifongique de la souche SRO1 contre les
champignons phytopathogènes par la technique des disques de diffusions A)
Fusarium sp. ; B) Trichoderma sp. ; C) Alternaria alternata. .................................... 33
Liste des tableaux
Tableau 01 : Nombre approximatif de métabolites secondaires produits par différents
groupes d’organismes (Kieser et al., 2001)............................................................... 10
Tableau 02 : Antibiotiques de Streptomyces utilise (Kieser et al., 2000 ; Madigan et
Martinko, 2007) ............................................................................................................. 11-12
Tableau 03 : Résultats de l’activité vis-à-vis les bactéries test par la technique des
cylindres d’agar sur les deux milieux ISP2 et AF........................................................ 21
Tableau 04 : Résultats de l’activité contre les bactéries test par la technique des
disques de diffusions sur milieu ISP2 .......................................................................... 24-25
Tableau 05 : Résultats de l’activité vis-à-vis les bactéries tests par la technique des
disques de diffusion sur milieu AF ........................................................................ 27-28
Tableau 06 : Résultats de l’activité contre les champignons par la technique des
disques de diffusion sur milieu ISP2. .......................................................................... 30
Tableau 07 : Résultats de l’activité contre les champignons test par la technique des
disques de diffusion sur milieu AF. ............................................................................. 32
Introduction
Introduction
1
Les antibiotiques sont des substances, naturelles ou synthétiques, détruisant les
microorganismes en ayant une action lytique ou en empêchant la prolifération du
microorganisme. Les antibiotiques antibactériens et antifongiques commercialisés sont
largement utilisés en médecine humaine ou vétérinaire et comme produits
phytopharmaceutiques (Smaoui, 2010).
La découverte de métabolites bioactifs d’origine microbienne a progressée de manière
exponentielle grâce aux progrès technologiques, malheureusement, parmi les molécules
découvertes, nombreuses sont des analogues des molécules déjà connues, des composés
n’ayant pas d’activités antibiotique encore des composés mineurs (Boughachiche, 2012).
L’émergence de la résistance des microorganismes pathogènes aux antibiotiques,
couramment utilisés en médecine, pose actuellement un sérieux problème. Pour combattre
cette situation alarmante, de nouveaux antibiotiques sont nécessaires. Ces derniers peuvent
être obtenus par voie naturelle à partir de nouvelles souches microbiennes notamment les
actinobactéries. Aussi, la lutte chimique contre les microorganismes phytopathogènes donne
de bons résultats à court terme mais à long terme, elle représente un danger pour
l’environnement. Ce problème agricole, économique et environnemental nécessite le
développement de produits de lutte biologique à base de microorganismes ou de leurs
métabolites (Joly, 2003 ; Sghairi, 2012).
Les actinobactéries sont bien connus pour leurs capacités métaboliques, en particulier
Streptomycessp. qui produisent des milliers d'antibiotiques (Berdy, 2005). Ce sont des
bactéries à Gram-positif, la plupart sont des saprophytes (Khamna et al, 2009) et sont
abondantes dans la rhizosphère (Sardi et al, 1992). Cet environnement a été jugé une source
riche pour l'isolement des agents producteurs de nouvelles molécules bioactives :
antibiotiques, agents de biocontrôle et des promoteurs de croissance des plantes(Jiménez-
Esquilin et Roane, 2005).
La présente étude, porte sur l’exploration d’une souche d’actinobactérie SO1
appartenant au genre Streptomyces à produire des molécules bioactifs.
Nous nous somme fixé comme objectifs:
La production de molécules bioactives sur deux milieux liquide et solides ISP2 et AF;
L’extraction des molécules par différents solvants organiques ;
La mise en évidence des activités antibactérienne et antifongique des extraits organiques
obtenus.
Revue bibliographique
Revue bibliographique
2
1 Les actinobactéries
1.1 Généralités
Les actinobactéries sont des bactéries à coloration de Gram positive, filamenteuses, ramifiées,
leur ADN contiennent un taux plus élevé de guanine – cytosine GC (plus de 55 pour 100).
Ces bactéries forment un vaste groupe de procaryotes appartenant à l’ordre des
Actinomycétales. Généralement ce sont des hétérotrophes, mais la majorité des espèces sont
capables aussi de croissance chimio-auto trophique. Des vitamines et des acides aminés sont
nécessaires à leur nutrition. Elles peuvent dégrader la cellulose, les protéines, et d’autres
matières organiques comme la paraffine et les résidus des plantes dans le sol (Ensigne et al.,
1993).
Les actinobactéries sont ubiquitaires, on les trouve dans tous les milieux naturels et on
été isolés à partir de différentes niches écologiques telles que : sols, aire, fumier, débris,
végétaux, lacs, sédiments marins, rivières, océans, déserts, sol polluée… (Williams et al.,
1983).
La morphologie des actinobactéries se caractérise par deux diversité importantes, on
distingue que la plupart des mycobactéries sont des simple bacilles, diphtérioides, et la forme
mycélienne comme le genre Streptomyces (Gottlieb, 1973). Les actinobactéries peuvent
présenter selon les conditions de leur culture en milieu liquide, deux catégories d’hyphes : les
hyphes en pellets et les hyphes dispersés. Dans la forme en pellets, il y’a limitation de la
diffusion d’O2 et de nutriments à travers les hyphes, ce qui fait une croissance limitée (Cox et
al, 1998).Les actinobactéries se développent à la fois à la surface du substrat, et à l’intérieur
de ce dernier, par la formation d’un réseau ramifié d’hyphes (Basilio, 2003).
Les actinobactéries jouent un rôle très considérable dans les phénomènes de
biodégradation permettant le recyclage de la matière première et empêchant l’accumulation
des déchets indésirables. Elles sont la plus importante source de production d’antibiotiques et
autres métabolites secondaires (Goodfellow et williams, 1983).
1.2 Classification des actinobacteries
Selon la classification du "Taxonomic Outline of The Procaryotes, Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology", Le Phylum Actinobacteria (bactéries à Gram positif et GC %
élevé) est constitué d'une seule classe dénommée également "Actinobacteria"
(Stackebrandtet al., 1997).
Revue bibliographique
3
1.2.1 Classe "Actinobacteria"
Phylum Actinobacteria
Le phylum "Actinobacteria" est bien soutenu par des analyses des gènes 16S et 23S, présence
d’insertions et de suppressions conservées dans certaines protéines, et des réarrangements
caractéristique de gènes (Goodfellow et Fiedler, 2010). Cette modification rend la taxonomie
du phylum "Actinobacteria" plus conforme à celle des autres procaryotes et facilite ainsi les
comparaisons entre les embranchements et le développement d’une classification unifiée à
travers toutes les bactéries et les archées.
En outre, ce changement réduit le nombre de subdivisions dans les rangs supérieurs de
six (classe, sous-classe, ordre, sous ordre, famille et genre) à quatre. La classe
"Actinobacteria" exclut maintenant les sous-classes Acidimicrobium, Coriobacteriaceae,
Nitriliruptoridae et Rubrobacteridae, avec l’élévation de ces sous-classes aux classes. En
outre, avec l’élévation des sous-ordres aux ordres, l’ordre Actinomycétales est maintenant
réservé aux membres de la famille Actinomycetaceae. De nombreux sous-ordres qui sont bien
établis dans la littérature, tels que Micrococcineae and Pseudonocardineae, ne sont pas
utilisés.
Taxonomic Outline of the phylum Actinobacteria édité en deux parties (partie A et
partie B) a été publié en mai 2012. Sous la direction et l’organisation de Michael Goodfellow
le grand travail a été accompli succès en mai 2012. Le phylum Actinobacteria comprend 6
classes, 22 ordres, 53 familles, 222 genres et environ 3000 espèces (Ludwig et al., 2012).
1.3 Importance des actinobacteries
Les actinobacteries suscitent beaucoup d’intérêts, car c’est la plus importante source de
production d’antibiotiques et autres métabolites secondaires bioactifs ce qui fait d’eux des
producteurs intéressants en industrie pharmaceutique (Boucheffa, 2011). Ainsi, d’autres
métabolites sont également synthétisés. On estime que les deux tiers des quelques six mille
antibiotiques isolés jusqu’ici sont produits par les actinobacteries.
La richesse des actinobactéries dans ce domaine à été démontré par Selman
Waksman. Dans ses laboratoires il a isolées quatre premiers antibiotiques : l’actinomycine
(1940), la streptomycine (1944), la néomycine (1949) et la candicidine (1953). Ainsi que
d’autres molécules avec des propriétés pharmacologiques intéressantes en tant que ligand des
stérols (Melouah, 2015). En plus de la production des antibiotiques, les actinobactéries ont
d’autres applications industrielles comme la production d’enzymes, de nucléotides, de
Revue bibliographique
4
certaines vitamines et les bioconversions. D’autre part, certains genres d’actinobactéries se
sont montrés efficaces dans la production de presque la totalité des aminoacides (Zouaghi,
2007).
2 Genre Streptomyces
Le genre Streptomyces c’est le genre le plus abondant d’actinobactéries et le plus performent
dans la production de métabolites secondaires importants. Les Streptomyces sont des
organismes aérobies, à coloration de Gram positive non acido-alcoolos résistants. Sont
capables d’utiliser de nombreux composés organiques comme seule source de carbone et
d’azote sous forme minérale. Se sont des bactéries filamenteuses, elles forment un mycélium
très ramifier qui se fragmente rarement, avec un diamètre qui varie de 0,5 à 2 µm c’est le
mycélium de substrat. Le mycélium aérien produit des chaines de spores de langueur variable
(Williams et al., 1989).
L’aspect des colonies est caractéristique, elles sont rondes, poudreuses, et légèrement
enfoncées dans la gélose : elles sont le plus souvent colorées, ces coloration sont très variées
et s’expliquent par la présence de pigments de nature très différentes. La pigmentation est le
plus souvent différente entre le mycélium substrat et les spores. De ce fait, la coloration est
rarement homogène au niveau da la colonie.
De plus, des pigments diffusibles peuvent être présents, dont la couleur est sensible ou
non au pH. Aussi, ces pigments peuvent être solubles dans le milieu ou précipitent ou
voisinage de la colonie. Selon la couleur des spores, il est possible de définir sept séries : gris
(de gris à brun), blanc, rouge (bronze, rose et rose pale), jaune (jaunâtre à jaune-verdâtre),
bleu (bleuâtre, à bleu-grisâtre pale), vert (verdâtre à gris-verdâtres pale) et le violet
(Stackebrandt et Schumann, 2006).
2.1 Cycle de développement
La synthèse des métabolites secondaires produits par les Streptomyces est régulée en
fonction de leur cycle de développement. Les Streptomyces se développent selon un cycle
complexe sur milieu solide qui débute par la germination d’une spore cette dernière donne
naissance à un mycélium primaire, ensuite la croissance aérienne et qui se termine par la
sporulation (Figure 1).
Revue bibliographique
5
Figure 1: cycle de développement des Streptomyces sur milieu solide (Hopwood et al.,
1985).
2.1.1 Germination
La germination des spores se caractérise par l’activation, l’imitation et l’émergence du tube
germinatif et sa croissance, pour les quelles la présence dans un environnement humide (le
degré hygrométrique) est important. Un choc thermique peut déclencher l’activation de la
germination, par exemple pour les spores de Streptomyces viridochromogenes elles sont
traitées pondant 5 min à 50 °C.
2.1.2 Croissance végétative
Le tube germinatif croit et donne des hyphes, cette dernières se ramifient de manière apicale,
l’ensemble de la colonie se développe de manière radial. Le mycélium primaire est ancré dans
le support solide, il épuise les nutriments. Cette morphologie leur permettent l’utilisation des
substances solides dans les sols, ce qui permet aux Streptomyces la colonisation des
substances solides en comparaison avec les microorganismes unicellulaire et immobiles
(Miguelez et al., 2000).
Revue bibliographique
6
2.1.3 Croissance aérienne
Lorsque les ressources nutritionnelles sont rares, ou il y’a un autre types de stress, le
mycélium végétatif va se différencier au niveau morphologique entrainant la formation du
mycélium aérien. Ce dernies se développe de façon perpendiculaire au milieu (dans l’air),
donc il ne puise pas les ressources nutritives dans le milieu. Pour pallier ce problème, le
mycélium aérien va utiliser le mycélium végétatif comme substrat. En effet, le mycélium
végétatif s’autolyse et les produits de la lyse sont cannibalisés par le mycélium aérien
(Miguélezet al., 2000).
La formation du mycélium aérien est influencée par plusieurs facteurs, notamment : la
composition du milieu de culture, la température d’incubation et la présence de composés
stimulants spécifiquement le mycélium aérien. Généralement, le mycélium aérien est plus
épais, et moins ramifié, que le mycélium de substrat, hydrophobe, et contenant des pigments
(Madigan et Martinko, 2007).
2.1.4 La sporulation
Les extrémités des hyphes aériens se cloisonnent et se différencient pour former des chaines
de spores uninuclés. Ces spores sont des agents de résistances et surtout de dissémination, ce
qui règle le problème de l’immobilité du mycélium de substrat. Les conidies peuvent suivant
les espèces, être produites en courtes ou longues chainettes qui peuvent êtres ramifiées ou
non, droites ou en spirales.
Elles contiennent la plupart des éléments du mycélium primaire : des ribosomes
dissociables en sous-unité 30 S et 50 S, un système membranaire intra-cytoplasmique, des
vacuoles, une membrane cytoplasmique, une paroi plus épaisse qui peut contenir jusqu’à trois
couches, mais leur contenu de génome est plus riche en ADN et moins en ARN que celui le
mycélium de substrat. Ces spores contiennent des quantités plus importantes de potassium, de
calcium, et de manganèse que dans le mycélium de substrat et englobent souvent des
pigments. Leur contenu en tréhalose, relativement abondant, aurait un rôle dans la dormance
et la résistance des spores (Mc Bride et Ensigne, 1986).
En milieu liquide, les cellules se développent uniquement sous forme de mycélium
primaire, même si certaines souches peuvent sporuler dans cet environnement (Madigan et
Martinko, 2007). En milieu solide, une différenciation morphologique et donc observée
tandis qu’en milieu liquide la différenciation et généralement physiologique par l’activation
Revue bibliographique
7
d’un métabolisme secondaire dans le cas d’un stress nutritionnel ou environnemental
ralentissant significativement la croissance (Hodgson, 2000).
2.2 Génétique
Les génomes de plusieurs espèces se Streptomyces ont été séquencés et assemblés. C’est le
cas des génomes de S. coelicor, S. avermitilis, S. griseus (Ohnishiet al., 2008). Les génomes
de Streptomyces sont composés d’une molécule linéaire d’ADN de grande taille, allant de 8 à
10 MB y’a un haut taux de G + C « 70 % ». Ils possèdent également de plasmides linéaires de
très grandes tailles ainsi que des plasmides circulaires.
La densité génique est élevé avec environ 1 gène tous les 1200 paire de bases, c’est
notamment le premier exemple de bactéries contenant plus de gène dans sans génome que
l’eucaryote Saccharomyces cerevisiae (Bentley et al., 2002).
2.3 Ecologie
Le genre Streptomyces regroupe les bactéries filamenteuses à Gram positive du sol,
strictement aérobie, et possédant un cycle de vie inhabituel chez des organismes procaryotes.
Comme beaucoup de microorganismes du sol, la plupart des Streptomyces se comportent en
bactéries mésophiles (dans une température variant entre 25 C° et 30 C°) et neutrophile
(croissance entre pH 5 et 9 avec un maximum autour de la neutralité). Cependant quelque
Streptomyces sont acidophiles et croissent à des pH entre 3,5 et 6,5 colonisant ainsi les sols
acides, ils ont la particularité de produire des hydrolases et des chitinases acides.
En milieux naturel le mycélium sécrète de nombreuses enzymes. Ces enzymes sont
capables de dégrader de nombreux biomatériaux tels que des restes de végétaux ou la cuticule
des arthropodes afin de les transformer en nutriments assimilables par le mycélium. Les
Streptomyces sont des organismes saprophytes et jouent donc un rôle important dans la
minéralisation de la matière organique. Ils sont également capables de dégrader des composés
toxiques comme herbicides, et jouent un rôle dans la neutralisation de pH acide de centaines
sols (Sette et al., 2004).
Dans la rhizosphère, les Streptomyces jouent un rôle très important dans la protection
des racines des plantes par inhibition du développement des champignons potentiellement
pathogènes par leur sécrétion d’antifongiques (Doumbou et al., 2001).
Les Streptomyces sont capables de se développer sur une large gamme de substrats, ils
possèdent un grand pouvoir d’adaptation aux conditions de l’environnement et peuvent en
Revue bibliographique
8
même temps l’influencer. Ainsi on les retrouve dans les eaux polaires gelées en permanence
tout comme dans les sols chauds et secs, dans le pétrole brut, les sols alcalins, les sols
hautement contaminés par les métaux lourds, les lacs extrêmement alcalins et les lacs salés
(Goodfellow et Williams, 1983).
Ils sont mêmes présents, comme espèces non pathogènes à la surface des feuilles
d’arbres fruitiers comme les feuilles de vigne et dans les racines de blé mais d’autres
provoquent des dégâts considérables sur la pomme de terre (S. scabies et S. acidiscabies
responsables de la gale de pomme de terre). Par contre, ils semblent être absents des eaux
minières très acides (pH<1) et des sources thermales très chaudes d’origine volcanique (Xu et
al., 1996).
Outre les sols, les Streptomyces sont capables de coloniser la rhizosphère où ils
apportent une résistance aux champignons pathogènes de par la production de molécules
antifongiques. Il a également été rapporté plusieurs cas de symbioses entre des bactéries du
genre Streptomyces et des insectes de la classe des hyménoptères. On peut notamment citer le
mutualisme avec les fourmis fongicultrices Acromyrmex octospinosus, où la bactérie prévient
le développement d’Escovopsis weberi, un champignon parasite des cultures (Seipke et al.,
2011) . Chez la guêpe européenne Philanthus triangulum, la présence de Streptomyces permet
aux larves de résister aux infections (Kroiss et al., 2010).
2.4 Bioactivité
Les Streptomyces produisent 70 à 80% des substances bioactives naturelles connues à
applications pharmaceutiques ou agrochimiques (Berdy, 2005). Continuellement de nouveaux
métabolites à différentes activités biologiques sont isolées de souches Streptomyces (Getha et
al.,2005). Le premier et le plus important produit des Streptomyces est les antibiotiques. A
partir de 1955 le genre Streptomyces devient, et va rester le grand fournisseur d’antibiotiques
nouveaux (Hwang et al., 2001 ; Marinelli, 2009). Ils constituent la source de substances
antibactériennes, antifongiques, antitumorales, antiparasitaires (Dietera et al.,2003),
antivirales, insecticides, pesticides et herbicides. Ils sont la source des substances
pharmacologiques comme les immuno-modulateurs (substances immunosuppressives et
immunostimulantes), les substances vaso-actives et les agents neurologiques (Sanglier et
Trujillo, 1997).
Revue bibliographique
9
Les enzymes sont les plus importants produits des Streptomyces après les
antibiotiques, comme les protéases, les lipases, les cellulases, les amylases, les pectinases et
les xylanases (Vonothini et al.,2008).
3 Production des antibiotiques par les Streptomyces
3.1 Généralités
La synthèse des antibiotiques est largement répandue chez les microorganismes fongiques et
bactériennes, ils inhibent ou tuant à faible concentration spécifiques d’autres microorganismes
(Marinelli, 2009).Un grand nombre d’antibiotiques a été identifie en milieu naturel, mais
moins de 1% sont connus pour leur application médicales. Beaucoup d’antibiotiques naturels
ont été structuralement modifiés en laboratoire pour augmenter leur efficacité formant la
classe des antibiotiques semi-synthétiques (Madingan et Martinko, 2007). Les antibiotiques
présentent un intérêt significatif dans les domaines de la sante animale, de l’élevage et de
l’agriculture (Berdy, 2005).
L’histoire des antibiotiques a débuté avec la découverte de la pénicilline par Fleming
dans les années 40, de puis, les microorganismes ont été considérablement étudiés, les
recherches entreprises ont permis de compléter l’arsenal antibactérien mis à la disposition de
la médecine, de tétracycline et terramycine furent isolées des 1953 , la découverte des agents
chimio thérapeutiques et le développement de nouveaux médicaments ont fortement diminué
la souffrance humaine (Prescott et al., 2007).
La majorité des antibiotiques et des métabolites secondaires biologiquement actifs sont
produits par le genre Streptomyces. Prés de 50 % des espèces de Streptomyces isolées sont
reconnus comme productrices d’antibiotiques (Madigan et Martinko, 2007).D’après le
Tableau 1, il apparait clairement que les actinobactéries synthétisent les deux tiers des
antibiotiques microbiens dont environs 80% sont isolés du genre Streptomyces. Même si on
inclut les autres métabolites secondaires. Les actinobactéries restent le plus grand fournisseur
(Boughachiche, 2012).
Revue bibliographique
10
Tableau 01 : Nombre approximatif de métabolites secondaires produits par différents groupes
d’organismes (Kieser et al., 2001).
Sources
Métabolites bioactifs
Antibiotiques Autres
Non-Actinobacteries 1400 (12%) 240 (9%)
Actinobacteries 7900 (66%) 1220 (40%)
Champignons 2600 (22%) 1540 (%)
Lichens 150 200-500
Algues 700 800-900
Plantes supérieures 5000 25000-35000
3.2 Classification des antibiotiques
Les antibiotiques peuvent être classés selon plusieurs critères :
Origine : élaboré par un organisme (naturel) ou produit par synthèse (synthétique ou
semi synthétique).
Mode d’action : paroi, membrane cytoplasmique, synthèse des protéines, synthèse
des acides nucléiques.
Modalité d’action : étude des interactions dans le temps enter des concentration
variables d’un antibiotique et bactérie.
Spectre d’activité : liste des espèces sur les quelles les antibiotiques sont actifs
(spectre étroite ou large).
Nature chimique : peuvent être classés selon leur composition chimique (Berdy,
2005).
Les aminoglycosides (streptomycine, néomycine, kanamycine, gentamycine).
Les macrolides (érythromycine).
Les anasamycine (rafamycine).
Les beta-lactames (thionamycine).
Les peptides (viomycine, théostrepton, actinomycin, pristinamycine).
Les tétracyclines (chloratetramycine, oxytetracycline).
Les nucleosides (puromycine).
Les polyènes (nystatine, candicidine, amphotoricine B).
Revue bibliographique
11
3.3 Antibiotiques produits par les Streptomyces
Les antibiotiques synthétisés par les Streptomyces, leurs classes chimiques, ainsi que leurs
applications sont détaillés dans le Tableau 2.
Tableau 2 : Antibiotiques de Streptomyces utilise (Kieser et al., 2000 ; Madigan et
Martinko, 2007).
Antibiotiques Producteur Classe chimique Applications
Acide
clavulanique
S. clavuligerus Beta- lactamine Antibactérien
Actinomycine D Streptomyces sp Peptide Antitimoral
Antimycine A Streptomyces sp Macrolide Insecticide
Ivermectine S. avermitilis Macrolide Antihellminthe
Bambermycine S. bambergiensis Aminoglycoside Favorise la croissance des
plantes
Bialaphos S.hygroscopicus Peptide Herbicide
Bléomycine S .verticillus Glycopeptide Antitimoral
Candicidine S.griseus Macrolide Polyène Antifongique
Céphamycine Streptomyces sp Beta-lactamine Antibactérien
Chloramphénicol S.venezuelae N-
dichloracylphenylpropanoide
Antibactérien
Chlortétracycline S. aureofaciens Tétracycline Antibactérien
Cyclosérine
S. orchidaaceus
Peptide cyclique
Antibactérien
Daptomycine S. roseosporus Lipopeptide Antibactérien
Daunorubicine S. peucetius Anthracycline Antimoral
Desferrioxamine S. pilosus Peptide Régulateur des
concentrations de
fer
Doxorubicine S. peucetius Anthracycline Antitimoral
K 506 S. hygroscopicus Macrolide Immunosuppreur
Fosfomycine Streptomyces sp. Anticorps phosphonique Antibactérien
Hygromycine B S. hygroscopicus Aminoglycoside Antihellminthe
Kanamycine S. kanamyceticus Aminoglycoside Antibactérien
Lasalocide S. lasaliensis Polyéther Antibactérien
Lincomycine S. lincolnensis Aminoglycide Antibactérien
Milbemycine S. hygroscopicus Macrolide Antibactérien
Mithramycine S. argillaceus Anticorps auréolique Antitimoral
Mitomycine C S. caespitosus
S.verticillatus
Anthracycline Antitimoral
Monensin
S. cinnamomensis
Polyéther Antibactérien
Natamycine S. nataensis Polyènetetraène Antifongique
Néomycine S. fradiae Aminoglycoside Antibactérien
Nikkmycine S. tendae Nuléoside Antifongique
Revue bibliographique
12
4 Résistance aux antibiotiques
La résistance aux antibiotiques est un phénomène aussi ancien que l’apparition des
antibiotiques. Les antibiotiques sont au départ des substances naturelles générées par des
champignons mais aussi par certaines bactéries pour se defender contre les autres bactéries.
(Loucif ; 2011).
4.1 Types de résistance
4.1.1 Résistance naturelle
est un caractère présent chez toutes les souches appartenant à la même espèce (Smaoui,
2010). Elle fait partie du patrimoine génétique normale du germe (Yala et al., 2001).
Insecticide
Nosiheptide S. actuosis Thiopeptide Favorise la
croissance des
plantes
Novodiocine S.wiveus Glycoside Antibactérien
Nystatine S. noursei Macrolide Polyène Antifongique
Oléandomycine S. antibioticus Macrolide Antibactérien
Oxytétracycline S. vimosus Tétracycline Antibactérien
Paromomycine S. vimosus Aminoglycide Antiparasitaire
Phléomycine S. verticillus Glycopeptide Antitimoral
Polyoxine S. cacaoui Nucléoside peptide Antifongique
Pristinamycine S. pristinaespiralis Peptide macrolatone Antibactérien
Puromycine S. alboniger Purine nucléoside Antitimoral
Rapamycine S. hygroscopicus Macrolide Immunosuppresseur
Salinomycine S. abus Polyéther Antibactérien
Spectinomycine S. spectabilis Aminocyclitol Antibactérien
Spiramycine S. anbofaciens Macrolide Antibactérien
Streptogramines S. graminofaciens Lactones macrocyclique Antibactérien
Streptomycine S.griseus Aminoglycosides Antibactérien
Streptothricine S. lauedulaae N- glycoside Antibactérien
Thiénamycine S. cattlaya Beta-Lactamine Antibactérien
Tétracycline S. aurreofaciens Tétracycline Antibactérien
Thiostrepton S. azureus Thiopeptide Favorise la croissance
des plantes
Tobramycine S.tenebrarius Aminoglycosides Favorise la croissance
des plantes
Tylosine S. fradiae Macrolide Antibactérien
Validamycine S.hygroscopicus Aminoglycosides Favorise la croissance
des plantes
Virginiamycine S.virginiae Lactone macrocyclique Favorise la croissance
des plantes
Revue bibliographique
13
Klebsielle sp. produit naturellement des béta-Lactamase, et les bactéries anaérobies sont
naturellement résistances aux aminosides (Lozniewski et Rabaud, 2010).
4.1.2 Résistance acquise
à côte de la résistance naturelle, existe aussi des résistances acquises. C’est l’acquisition de
nouveaux gènes capables de rendre la bactérie insensible à un antibiotique ou a un groupe
d’antibiotiques. Ces nouveaux gènes peuvent être obtenus soit par mutation au niveau du
chromosome. Soit par transfert d’ADN des plasmides conjugatifs ou de transposons (Yala et
al., 2001).
4.2 Mécanismes biochimiques de résistance bactérienne aux agents antibactériens
Ils peuvent être regroupés en trois grands types de mécanismes diminution de la perméabilité
et efflux actif, modification de la cible des antibiotiques, production d’enzymes inactivant les
antibiotiques (Levry et Maishall, 2004)
Diminution de la perméabilité : par mutation affectant la structure des porines ou
diminuant leur synthèse, ainsi l’antibiotique ne peut pas pénétrer dans la bactérie
(Lozniewski et Rabaud, 2010).
Expulsion rapide de l’agent hors de la cellule avant qu’il puisse agir : un certain
nombre de bactéries possèdent une capacité intrinsèque de rejeter hors de la cellule la
substance qui vient d’y entrer. Cette propriété est très connue chez les bactéries à
Gram négatif (c’est le cas de Pseudomonas aerugenosa) qui possèdent dans leur
membrane des protéines, appelées pompes effluentes, qui expulsent les antibiotiques
(Jayaraman, 2009).
4.3 Destruction ou l’inactivation de l’antibiotique par production d’enzymes
Les antibiotiques sont susceptibles d’être dégradés par voie enzymatique. L’exemple le plus
connu est l’hydrolyse du noyau béta-lactame par des béta-lactamase dont certaines de ces
enzymes sont à spectre élargi (Braford, 2001). Le nombre de béta-lactamases plasmatiques
est très élevé et elles sont classées selon leurs vitesses d’hydrolyse, leurs constantes d’affinité
pour les béta-lactamine, leurs faculté à être inhibée par les inhibiteurs tels que l’acide
clavulanique (Lozniewski et Rabaud, 2010).
Les pénicillinases sensustricto : chez les espèces Staphylococcus aureus, elles
inactivent la pénicilline G, la pénicilline A, elles sont par contre sans action sur la
pénicilline M ainsi que sur les céphalosporines.
Revue bibliographique
14
Les pénicillinases à spectre élargi : ces béta-lactamase entrainent une résistance (ou
une diminution d’activité) vis-à-vis des pénicillines G, des pénicillines M, des
carboxypénicillines, des uréidopénicillines, des céphalosporines de la 1ère
et de la 2ème
génération.
Les Béta-Lactamase à Spectre Etendu (BLSE) : ces béta-lactamase dérivent de la
mutation des gènes codant pour les béta-lactamase à spectre élargi. Le profil de
résistance conféré est identique à celui conféré par les béta-lactamase à spectre élargi
mais il s’étend aux céphalosporines de la 3ème
génération et à l’aztréonam. Les béta-
lactamase à spectre étendu sont sensibles aux carbapénèmes (Bonnet, 2004).
Les béta-lactamases résistantes aux inhibiteurs ; les béta-lactamases résistantes aux
inhibiteurs dérivent de certains béta-lactamases à spectre élargi par mutation
ponctuelle. Le profil conféré est identique à celui des béta-lactamases à spectre élargi
mais ces enzymes ne sont pas inhibées par l’acide clavulanique, le sulbactam ou le
tazobactam. D’autres enzymes hydrolysent de nombreux antibiotiques, tels
céphotaximases (Bonnet, 2004). Les enzymes inactivant les aminosides sont divisées
en trois classes: aminosides-phospho transférases, aminosides-nucléotidyl transférases,
aminoacétyltransférases(Doi et Arakawa, 2007). Les stréptogramines sont inhibés par
streptogramine A (O-) acétyltransférase (SB (CO-) lyase (Mukhtar et al.,2001).
Matériel et méthodes
Matériel et méthodes
15
Objectif de travail
L’objectif principal de la présente étude, consiste à la production et l’extraction des molécules
bioactives à partir d’une souche d’actinobactérie « Streptomyces », par fermentation solide et
liquide sur deux milieux différents AF et ISP2.
Ensuite tester leurs activités par la technique des disques de diffusion vis-à-vis des
souches d’importance clinique et des champignons phytopathogènes dans le but de
sélectionner les meilleurs : milieu, solvant et technique d’extraction.
I. Matériel
1. Matériel biologique
1.1. Souches des actinobactéries
La souche étudié d’actinobactérie, codée SRO1, à été obtenue à partir d’un sol saharien
(aride) lors des travaux menés par Mehda et Khanfar (2013). La souche SRO1 a été isolée à
partir du sol rhizosphérique du palier dattier, cultivé dans la localité Mihouansa (wilaya d’El
Oued).
NB : La signification du code est la suivante : (S) sol, (R) rhizosphère, (O) El-oued.
1.2. Souches test
L’activité antibactérienne a été testée contre des bactéries d’importance clinique :
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella oxytoca, Enterobacter sp., Bacillus
subtilis, et Pseudomonas aeruginosa. Les souches cliniques sont fournies par Dr. Aouar
Lamia, enseignante à l’université Larbi Ben M’hidi, d’Oum El Bouaghi.
1.3. Champignons phytopathogènes
Six souches de champignons phytopathogènes, ont été utilisées comme des champignons test
pour la détermination de l’activité antifongique : Ascochyta rabiei, Alternaria alteranata,
Botrytis cinerea, Trichoderma sp, Fusarium oxysporum, Penicillium sp. Ces champignons
sont fournis par Dr. Aouar Lamia.
Matériel et méthodes
16
2. Milieux de culture
Pour réaliser la culture des bactéries, la production des molécules actives et la détection de
l’activité antimicrobienne, plusieurs milieux de culture de composition différente ont été
utilisés : ISP2+ CaCo3, AF, Hektoen, Chapman, Mueller Hinton, Bouillon Nutritif, gélose
nutritive.
3. Solvants d’extraction
Cinq solvants organiques non miscibles avec l’eau et de polarités différentes ont été utilisés à
fin de réaliser l’extraction de biomolécules : acétate d’éthyle, toluène, méthanol, butanol 1 et
hexane.
II. Méthodes
1. Repiquage des souches
Les actinobactéries sont repiquées, sur les milieux AF et ISP 2 + CaCo3. Cette dernière
opération est répétée jusqu’à l’obtention des souches pures et bonne sporulation.
2. Activité antibactérienne
2.1. Préparation des inocula des bactéries-test
Des cultures solides de 18 heures ont été obtenues sur milieu Chapman pour la souche de
Staphylococcus aureus, la gélose nutritive pour Bacillus subtilis et l’Hektoen pour les autres
souches. Une suspension de chaque bactérie-test est préparée dans l’eau physiologique. La
densité cellulaire de chaque suspension est ajustée par comparaison avec la solution 0,5 Mac
Farland de façon à obtenir une concentration d’environ 108 UFC/ml.
2.2. Mise en évidence des activités antibactériennes
2.2.1. Technique des cylindres d’Agar
La souche de Streptomyces est ensemencée en stries serrées à la surface des milieux AF et
ISP2. Après 7 jours d’incubation à 30 °C, Des cylindres de gélose de 6 mm de diamètre sont
prélèves et sont déposes à la surface des milieux ensemences avec les bactéries-test. Ces
dernières sont ensemencées à la surface par écouvillonnage sur milieu Mueller-Hinton Les
boites sont placées 18 heures à + 4°C pour permettre la diffusion des substances actives, les
boites sont ensuite incubées à 37°C pendant 24 à 48 heures (Tortorano et al., 1979).
Matériel et méthodes
17
2.2.2. Inoculum fongique
Les champignons filamenteux sont repiqués sur milieu PDA et incubés à28 °C pendant 5 à 7
jours. Une suspension dense de spores et de fragments mycéliens est obtenue par raclage des
cultures après addition d’eau physiologique. La suspension est diluée jusqu'a atteindre une
absorbance de 0,20 à 650 nm. Cette suspension diluée au 1/10ème
servira d’inoculum calibré.
2.2.3. Mise en évidence des activités antifongiques
La production de métabolites antifongiques par les souches Streptomyces est mise en évidence
par la technique des cylindres d’Agar en utilisant le milieu PDA pour les champignons.
L’incubation se fait à 28 °C pendant 5 jours pour les champignons filamenteux
(Boughachiche, 2012).
3. Production et préparation d’extraits riches en métabolites secondaires
Cette étape a pour but de préparer des extraits à partir du milieu de culture des espèces
d’actinobactéries purifiées.
3.1. Fermentation liquide
À partir de la culture d’actinobactérie SRO1, des colonies sont ensemencées dans des Erlens
de 250 ml contenant 70 ml de milieu AF et ISP2 liquide. Ensuite les cultures sont incubées
pendant 3 à 4 jours à 30 °C sous agitation constante à 180 rpm. Après la durée d’incubation,
les cultures sont centrifugées pendant 20 min à 3000 g. Chaque 70 ml de surnageant est
mélange avec 70 ml de solvant. Les extraits obtenus sont concentrés par évaporation à l’aide
d’un évaporateur rotatif -55 °C. Les résidus secs de chaque solvant sont ensuite repris dans 1
ml de méthanol et sont transvasés dans des Eppendorfs.
3.2. Fermentation solide
La souche étudiée est ensemencée en stries serrée sur milieu AF et ISP2. Après incubation à
30 °C pendant 5 jours, la gélose est fragmentée puis reparti dans des erlens contenant 70 ml
des différents solvants : méthanol, butanol 1, acétate d’éthyle, toluène et hexane. Après
agitation vigoureuse, les extraits organiques sont récupérés par centrifugation à 3000 g
pendant 20 mn puis testées par la technique des disques de diffusions (Boughachiche, 2012).
Matériel et méthodes
18
4. Technique des disques de diffusion
Les extraits organiques obtenus à partir des cultures liquides et solides sont testés par cette la
technique des disques de diffusion. Des volumes de 50 μl sont déposes par fractions sur des
disques de papier Whatman N°3 (6 mm de diamètre) stériles qui sont séchés sous un courant
d’air froid. Les disques sont, ensuite, déposés sur gélose Mueller-Hinton pour les bactéries et
PDA pour les champignons, préalablement ensemencée avec un microorganisme-test. Les
boites sont incubées à 37 °C pour les bactéries et 28 °C pour les champignons. La mesure des
diamètres d’inhibition est effectuée après 24 à 48 heures d’incubation pour les bactéries et 3 à
5 jours pour les champignons (Barry et al., 1970).
Résultats et discussion
Résultats et discussion
19
I. Résultats
1. Détermination de l’activité antimicrobienne
L’activité antimicrobienne de la souche SRO1 à été détectée suivant deux techniques : la
technique des cylindres d’agar et des disques de diffusion. Les souches test utilisées sont des
bactéries pathogènes à Gram négatif (Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Enterobacter sp.,
et Pseudomonas aeruginosa) et à Gram positif (Staphylococcus aureus et Bacillus subtilis)
(Photographie 1).
Photographie 01 : Les bactéries test sur différents milieux A) K. oxytoca ; B) E. coli ; C)
Enterobacter sp. ; D) P. aeruginosa ; E) S. aureus ; F) B. subtilis.
2 .Détermination de l’activité antifongique
Deux techniques sont utilisées pour déterminer l’activité antifongique : la technique des
cylindres d’agar et la technique des disques de diffusions. Les champignons test utilisés sont
des champignons phytopathogènes (Ascochyta rabiei, Alternaria alteranata, Botrytis cinerea,
Trichoderma sp., Fusarium oxysporum, Penicillium sp.) Photographie 02.
Résultats et discussion
20
Photographie 02 : Les champignons test A) A. rabiei ; B) A. alternata ; C) B. cinerea ; D)
Trichoderma sp. ; E)Fusarium oxysporum ; F) Penicillium sp.
3. Technique des cylindres d’agar
3.1. Activité antibactérienne
Les résultats de l’activité obtenus sont présentés dans le Tableau 03 et la Photographie 3, où
il apparait que la souche SRO1 a agi contre quatre bactéries test.
Les résultats montrent que les valeurs des diamètres d’inhibitions par rapport aux deux
milieux AF et ISP2 varies de (6,66 ± 2,08 mm) à (22± 2 mm). Le milieu ISP2 démontre la
plus forte activité que le milieu AF. Ainsi, les moyennes des diamètres d’inhibitions obtenues
par la souche SRO1 sur milieu ISP2 varient de (8,33 ± 2,08 mm) à (22±2 mm). Par contre,
sur le milieu AF, elles varient de (6,66 ±2,08 mm) à (19± 1,52 mm).
Parmi les souches test et selon la technique des cylindres d’agar, les entérobactéries
sont considérées comme les souches les plus sensibles vis-à-vis la souche antagoniste SRO1.
Les résultats obtenus par la souche SRO1 contre les Enterobacter avec les deux milieux ISP2
et AF d’une valeur (22,2 ± 2 mm) et (19,66 ± 1,52 mm), respectivement.
Résultats et discussion
21
Par contre les deux souches K. oxytoca et B. subtilis sont moins sensibles que les
Enterobacter sp. et cela est du au résultat obtenue sur milieu ISP2 (14,2±2 mm) et
(11,66±1,52 mm) et sur milieu AF (13,33±1,52 mm), (11,33±1,52 mm), respectivement. La
souche SRO1 montre une très faible activité contre S. aureus sur les deux milieux ISP2 (8,33
± 2,08 mm) et AF (6,66±2,08 mm). Par contre les souches E. coli et P. aeruginosa sont
résistantes.
Tableau 03: Résultat de l’activité vis-à-vis les bactéries test par la technique des cylindres
d’agar sur les deux milieux ISP2 et AF.
Bact
érie
s
Milieu ISP2 Milieu AF
Diamètre de la
zone
d’inhibions mm
(répétitions)
Moyen
ne
(mm
)
Eca
rt-t
yp
e
Diamètre de la
zone d’inhibition
mm (répétitions)
Moyen
ne
(mm
)
Eca
rt-
typ
e
S.
au
reu
s
06
09
10
08,33
2,08
05
06
09
06,66
2,08
K.
oxyt
oca
14
12
16
14
2
13
15
12
13,33
1,52
En
tero
bact
er
sp
22
20
24
22
2
18
20
21
19,66
1,52
B.
subti
lis
12
13
10
11,66
1,52
11
10
13
11,33
1,52
E. co
li
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
P.
aer
ugin
osa
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Résultats et discussion
22
Photographie 03 : L’activité antibactérienne de la souche SRO1 contre les souches test A) S.
aureus ; B) K. oxytoca ; C) Enterobacter sp. ; D) B. subtilis ; E) E. coli ; F) P. aeruginosa par
la technique des cylindre d’agar.
3.2. Activité antifongique
Par rapport aux résultats de l’activité contre les champignons phytopathogènes par la
technique des cylindres d’agar, nous constatons que tous les champignons : Ascochyta rabiei,
Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Trichoderma sp., Fusaruim oxysporum et Penicillium
sp., sont résistants vis-à-vis la souche de Streptomyces SRO1 sur les deux milieux AF et ISP2
(Photographie 4).
Photographie 4: L’activité antibactérienne de la souche SRO1 contre les champignons
phytopathogènes A) A. rabiei ; B) A. alternata ; C) Trichoderma sp. ; D) F. oxysporum.
Résultats et discussion
23
4. Activité antibactérienne par la méthode des disques de diffusions
Au cours de la fermentation liquide, les cultures sont vérifiées pour leur pureté. Ensuite, les
surnageants obtenus après centrifugation, ont fait l’objet d’une extraction par les solvants
organiques : l’acétate d’éthyle, hexane, toluène, butanol 1. Pour la fermentation solide le
méthanol a été employé pour l’extraction. Les extraits sont concentrés et récupérés dans le
méthanol. Ensuite, les disques de papier sont chargés avec ces extraits organiques. Ces
disques ont été déposés sur la gélose Mueller Hinton déjà ensemencée avec les cultures jeunes
des bactéries-test : Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa et Bacillus subtilis et Enterobacter sp.
4.1. Activité antibactérienne des extrais obtenus sur ISP2 par fermentation liquide et
solide
Pour les extraits obtenus par la fermentation solide sur milieu ISP2, on constate l’absence
absolu de l’activité antibactérienne avec l’extrait de toluène et hexanoique, contre les
bactéries test : Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Bacillus subtilis. Aussi contre
Staphylococcus aureus aucune activité antibactérienne n’a été détectée avec l’extrait
butanolique, et même résultat négatif pour Escherichia coli avec l’extrait méthanolique.
En ce qui concerne, les autres tests d’antagonisme on enregistre une activité
antibactérienne, donc la souche SRO1 présente une activité inhibitrice contre différentes
souches test, avec différents solvants. Les résultats montrent que les valeurs des diamètres
d’inhibition obtenues sur le milieu ISP2 varient de (9 ± 1 mm) à (28,3 ±2,08 mm). Les plus
grands diamètres ont été obtenus par les disques imprégnés d’extrait de méthanol envers les
deux bactéries-test klebsiella oxytoca (28,3±2,08 mm) et Enterobacter sp. (26 ±2 mm) suivie
des disques chargés par l’extrait hexanoique contre la bactérie Enterobacter sp. (26,3± 1,52
mm) et aussi les disques contenant l’extrait de acétate d’éthyle (25,6 ±1,52 mm). Les résultats
enregistrés sont portées dans le Tableau 04 et la Photographie 05.
Par apport aux extraits obtenus par la fermentation liquide sur milieu ISP2, on
distingue qu’il n y’a aucune activité antibactérienne avec l’extrait de l’acétate d’éthyle vis-à-
vis la bactérie Staphylococcus aureus, et aussi avec l’extrait hexanoique contre la souche
Escherichia coli.
Résultats et discussion
24
Les résultats révèlent l’activité antibactérienne de la souche SRO1, où certaines
souches test révèlent une sensibilité aux molécules bioactives produites, avec les différents
solvants. Les valeurs des diamètres d’inhibition varient entre (9 ± 1 mm) à (31 ± 2 mm), et les
grands diamètres ont été obtenus par les disques imbibés par l’extrait de toluène contre la
souche Bacillus subtilis (31 ± 2 mm), suivie des disques chargés par l’extrait butanolique vis-
à-vis la souche Enterobacter sp. (28,3 ± 1,52 mm). Pseudomonas aeruginosa est la seule
souche qui n’a exhibé aucune activité avec les différents solvants et par les deux techniques
de production solide et liquide. Ces résultats sont portés dans Tableau 04 et la Photographie
05.
Tableau 04 : Résultats de l’activité contre les bactéries test par la technique des disques de
diffusions sur milieu ISP2.
B
act
érie
s
Les
Solvants
Milieu ISP2
Solides Liquide
Diamètre de la
zone d’inhibition
par mm
(Répétitions)
Moyen
ne
(mm
)
Eca
rt-t
yp
e
Diamètre de la
zone d’inhibition
par mm
(Répétitions)
Moyen
ne
(mm
)
Eca
rt-t
yp
e
S
. au
reu
s
Hexane - - - - - 8 10 9 9 1
Toluène 9 11 10 10 1 9 9 11 9,99 1,15
Butanol-1- - - - - - 13 10 15 12,6 2,51
A. d’éthyle 24 24 26 24,6 1,15 - - - - -
Méthanol 20 22 19 20,3 1,52
K. oxyt
oca
Hexane 16 18 15 16,3 1,52 13 15 16 14,6 2,51
Toluène 16 16 18 16,6 1,15 23 20 24 22,3 1,52
Butanol-1- 15 17 18 16,6 1,52 24 26 27 25,6 2,08
A. d’éthyle 14 15 17 15.3 1,52 14 16 17 15,6 1,52
Méthanol 26 29 30 28,3 2,08
Résultats et discussion
25
Tableau 4 (suite) : Résultats de l’activité vis-à-vis les bactéries tests par la technique des
disques de diffusions sur milieu ISP2.
Bact
érie
s
Solvants
Milieu ISP2
Solides Liquide
Diamètre de
la zone
d’inhibition
(Répétitions)
Moyen
ne
(mm
)
Eca
rt-t
yp
e Diamètre de la
zone d’inhibition
(Répétitions)
Moyen
ne
(mm
)
Eca
rt-t
yp
e
En
tero
bact
er
sp.
Hexane 26 28 25 26,3 1,52 25 26 24 25 1
Toluène 16 18 20 18 2 21 20 21 20,6 0,57
Butanol-1- 18 20 21 19,6 1,52 27 30 28 28,3 1,52
A. d’éthyle 27 25 28 25,6 1,52 24 26 23 24,3 1,52
Méthanol 26 24 28 26 2
B. su
bli
lis
Hexane - - - - - 17 15 19 17 2
Toluène - - - - - 31 29 33 31 2
Butanol-1- 17 19 16 17,3 1,52 20 19 21 20 1
A. d’éthyle 14 12 16 14 2 13 15 11 13 2
Méthanol 21 22 20 21 1
E. co
li
Hexane - - - - - - - - - -
Toluène - - - - - 10 09 11 10 1
Butanol-1- 07 10 08 8,33 1,52 11 10 13 11,3 1,52
A. d’éthyle 08 10 09 9 1 19 21 18 19,3 1,52
Méthanol - - - - -
P. aer
ugin
osa
Hexane - - - - - - - - - -
Toluène - - - - - - - - - -
Butanol-1- - - - - - - - - - -
A. d’éthyle - - - - - - - - - -
Méthanol - - - - -
Résultats et discussion
26
4.2 L’activité antibactérienne des extrais obtenue d’AF par la fermentation liquide et
solide
La souche SRO1 a été cultivée dans le milieu AF selon deux méthodes : solide et liquide. Les
résultats de la technique de la fermentation solide indiquent qu’il n y’ a aucune activité
antibactérienne contre la souche Bacillus subtilis avec l’extrait de toluène. Escherichia coli est
juste sensible avec l’extrait d’acétate d’éthyle, et elle résiste aux molécules bioactives
produites avec les autres solvants. Par apport à la souche Staphylococcus aureus, elle a
présentée des zones d’inhibition juste avec l’extrait méthanolique, et elle a résisté aux autres
extraits.
Les résultats montrent qu’il y’a un effet d’inhibition sur les souches test avec des
diamètres qui varient entre (29,3 ± 2,08 mm) pour Klebsiella oxytoca avec l’extrait de
méthanol et (9,33 ± 1,52 mm) pour E. coli avec l’extrait d’acétate d’éthyle. K. oxytoca et
Enterobacter sp. sont les souches les plus sensibles aux molécules bioactives obtenues. Les
diamètres les plus importants sont (29,3 ± 2,08 mm) pour Klebsiella et (28,6 ± 1,52 mm)
pour Enterobacter sp. avec l’extrait de toluène. Les résultats enregistrés sont portés dans le
Tableau 05 et la Photographie 05.
Pour la fermentation liquide, la souche Pseudomonas aeruginosa n’a aucune
sensibilité vis-à-vis les différents extraits, elle a résisté à toutes les molécules secrétées par la
souche SRO1. Les extraits du surnageant de la souche SRO1 par le solvant d’acétate d’éthyle
sont actif contre la majorité des souches. L’extrait d’hexane inhibe toutes les souches
bactériennes sauf E. coli. Les plus grands diamètres des zones d’inhibition ont été obtenus par
les disques chargés en extrait de butanol-1- (25,6 ± 1,52 mm) contre K. oxytoca, suivis des
disques chargés de l’extrait de toluène (23,3 ± 2,51 mm) contre Enterobacter sp. Les résultats
obtenus sont présentés dans le Tableau 5 et la Photographie 5.
Résultats et discussion
27
Tableau 5 : Résultats de l’activité vis-à-vis les bactéries tests par la technique des disques de
diffusion sur milieu AF.
Bact
érie
s
Solvants
Milieu AF
Solide Liquide
Diamètre de
la zone
d’inhibition
(Répétitions) M
oyen
ne
(mm
)
Eca
rt-t
yp
e Diamètre de
la zone
d’inhibition
(Répétitions)
Moyen
ne
(mm
)
Eca
rt-t
yp
e
S .au
reu
s
Hexane - - - - - 7 9 10 8,66 1,52
Toluène - - - - - - - - - -
Butanol-1- - - - - - 11 13 10 11,3 1,52
A. d’éthyle - - - - - - - - - -
Méthanol 29 27 29 28,3 1,154
K. oxyt
oca
Hexane 14 16 15 15 1 15 17 18 16,6 1,52
Toluène 17 15 18 16,6 1,52 13 17 15 15 2
Butanol-1- 14 16 15 15 1 24 27 26 25,6 1,52
A. d’éthyle 15 17 19 17 2 20 23 19 20,6 2,08
Méthanol 27 31 30 29,3 2,08
En
tero
bact
er sp
.
Hexane 24 25 24 24,3 0,57 21 20 21 20,6 0,57
Toluène 27 30 29 28,6 1,52 23 26 21 23,3 2,51
Butanol-1- 20 19 21 20 1 18 19 16 17,6 1,52
A. d’éthyle 22 20 24 22 2 19 20 18 19 1
Méthanol 27 29 25 27 2
Résultats et discussion
28
Tableau 5 (suite) : Résultats de l’activité contre les bactéries test par la technique des
disques de diffusion sur milieu AF.
Bact
érie
s
Solvants
Milieu AF
Solide Liquide
Diamètres
de la zone
d’inhibition
par mm
(Répétitions) Moyen
ne
(mm
)
Eca
rt-t
yp
e Diamètre
de la zone
d’inhibition
par mm
« Répétitions »
Moyen
ne
(mm
)
Eca
rt-t
yp
e
B
. su
bli
lis
Hexane 21 20 22 21 1 19 20 18 19 1
Toluène - - - -
- 19 20 18 19 1
Butanol-1- 14 16 12 14 2 19 17 21 19 2
A. d’éthyle 25 29 24 26 2,64 13 15 11 13 2
Méthanol 23 25 27 25 2
E
. co
li
Hexane - - - - - - - - - -
Toluène - - - - - - - - - -
Butanol-1- - - - - - 07 09 11 9 2
A. d’éthyle 08 09 11 9,33 1,52 - - - - -
Méthanol - - - - -
Résultats et discussion
29
Photographie 05: L’activité antibactérienne de la souche SRO1 contre les souches test A) S.
aureus ; B) K. oxytoca ; C) Enterobacter sp. ; D) B. subtilis ; E) E. coli ; F) P. aeruginosa, par
la technique des disques de diffusion.
5. L’activité antifongique par la méthode des disques de diffusion
Pour l’étude de l’activité antifongique de la souche SRO1, on a testé les extraits des
différents solvants sur des champignons phytopathogènes. Donc les disques de papier sont
chargés avec ces extraits organiques, ces disques ont été déposés sur la gélose PDA déjà
ensemencée avec les cultures sporulées des champignons phytopathogènes.
Résultats et discussion
30
5.1. L’activité antifongique des molécules obtenue à partir de milieu ISP2
Les résultats de la fermentation solide indiquent que l’extrait organique méthanolique donne
un résultat contre Ascochyta rabiei (12,66 ±2,8 mm) et Botrytis cinerea (20,33 ± 1,25 mm).
Les deux extraits butanolique et de toluène n’inhibe que la souche B. cinerea, les zones
d’inhibition sont (34± 2 mm) et (23,33 ± 2,08 mm), respectivement. L’extrait de toluène n’a
inhibé que la souche Ascochyta rabiei avec un diamètre (15,33 ± 1,52 mm).
Avec la fermentation liquide on a obtenu que deux activités inhibitrices, celle de
l’extrait de toluène contre Ascochyta rabiei (30,66 ± 2,08 mm) et celui de l’extrait
butanolique contre Botrytis cinerea (26 ± 2 mm). Les résultats sont présentés dans le Tableau
06 et Photographie 06.
Tableau 6: Résultats de l’activité contre les champignons par la technique des disques de
diffusion sur milieu ISP2.
Ch
am
pig
non
s
Solvants
Milieu ISP2
Solides Liquide
Diamètre de
la zone
d’inhibition
par mm
(Répétitions)
Moyen
ne
(mm
)
Eca
rt-t
yp
e
Diamètre de la
zone
d’inhibition
par mm
(Répétitions)
Moyen
ne
(mm
)
Eca
rt-t
yp
e
Asc
och
yta r
ab
iei
Hexane - - - - - - - - - -
Toluène 15 17 14 15,33 1,52 30 33 29 30,66 2,08
Butanol-1- - - - - - - - - - -
A.
d’éthyle
- - - - - - - - - -
Méthanol 11 15 12 12,66 2,08
Botr
ytis
cin
erea
Hexane - - - - - - - - - -
Toluène 24 25 21 23,33 2,08 - - - - -
Butanol-1- 34 36 32 34 2 26 28 24 26 2
A.
d’éthyle
- - - - - - - - - -
Méthanol 20 19 22 20,33 1,52
Résultats et discussion
31
5.2. L’activité antifongique des extraits de la fermentation solide et liquide sur milieu AF
Les résultats des tests des extraits obtenus par fermentation solide sur milieu AF contre les
champignons montrent que l’hexane et le butanol-1- n’ont aucune activité sur tous les
champignons sauf le Botrytis cinerea avec le butanol-1-. Cependant, les extraits de toluène et
de méthanol donnent une bonne activité avec les deux souches A. rabiei et B. cinerea (16,3 ±
3,75 mm), (23 ± 2 mm) avec le toluène et (14,3 ± 2,08 mm), (20,6 ± 1.52 mm) avec le
méthanol, respectivement. Le grand diamètre des zones d’inhibitions à été obtenu par le
disque qui contient l’extrait butanolique (24,6 ± 2,8 mm) contre B. cinerea. Pour la
fermentation liquide le seul extrait qui a enregistré une activité antifongique c’est le toluène
avec un grand diamètre égale à (30,6 ± 2,08 mm) contre Ascochyta rabiei. Les résultats
obtenues sont portés dans le Tableau 07 et Photographie 07.
Tableau 7 : Résultat de l’activité contre les champignons test par la technique des disques de
diffusion sur milieu AF.
Ch
am
pig
non
s
Solvants
Milieu AF
Solides Liquide
Le diamètre de
la zone
d’inhibition Par
mm(Répétitions)
Moyen
ne
(mm
)
E
cart
-typ
e Le diamètre de la
zone d’inhibition
par mm
(Répétitions) M
oyen
ne
(mm
)
Eca
rt-t
yp
e
Asc
och
yta
rabie
i
Hexane - - - - - - - - - -
Toluène 12 18 19 16,3 3,75 12 16 11 30,6 2,08
Butanol-1- - - - - - - - - - -
A. d’éthyle - - - - - - - - - -
Méthanol 12 16 15 14,3 2,08
Botr
ytis
ci
ner
ea
Hexane - - - - - - - - - -
Toluène 23 25 21 23 2 - - - - -
Butanol-1- 24 27 23 24,6 2,08 - - - - -
A. d’éthyle - - - - - - - - - -
Méthanol 19 21 22 20,6 1,52
Résultats et discussion
32
Photographie 06: L’activité antifongique contre les champignons phytopathogènes A)
Ascochyta rabiei ; B) Botrytis cinerea, par la technique des disques de diffusion.
Par contre les autres champignons, Alternaria alternata, Trichoderma sp., Fusaruim
oxysporum et Penicillium sp., se sont avérés résistants (Photographie 7).
Photographie 7: L’activité antifongique de la souche SRO1 contre les champignons
phytopathogènes par la technique des disques de diffusions A) Fusarium sp. ; B) Trichoderma
sp. ; C) Alternaria alternata.
II. Discussion
Le but de notre étude est de détecter l’activité antagoniste de la souche actinobactérie SRO1.
On a réalisé le test d’antagonisme sur milieu solide en utilisant la technique des cylindres
d’agar contre six souches bactériennes d’importance clinique et six champignons
phytopathogènes. Avec la technique des cylindres d’agar, quatre souches bactériennes (S.
aureus, K. oxytoca, Enterobacter sp., B. subtilis) (66,66 %) étaient sensibles envers la souche
SRO1, par contre l’absence totale de l’activité antifongique contre les champignons test (0%).
Résultats et discussion
33
L’activité de la souche SRO1 à été détecté aussi par la technique des disques de diffusion,
contre les bactéries test (83,33 %) et les champignons (33,33%).
D’après les diamètres d’inhibition, des bactéries test à Gram positif, à Gram négatif et
les champignons phytopathogènes semblent être sensible aux antibactériens et antifongiques
produits par la souche SRO1 étudiée, donc cette bactérie qualifié comme une souche à un
large spectre.
Il est à noter que la souche SRO1 n’exhibe aucune activité antibactérienne sur les deux
milieux solides et liquide, et par les deux techniques contre la bactérie test P. aeruginosa.
Certainement, elle a des mécanismes de lutte.
Les molécules bioactives qui inhibe la croissance de S. aureus sont des molécules
hydrophiles, solubles dans l’eau, car certaines zones d’inhibition ont été obtenues par la
méthode des cylindres d’agar. Aussi, elle est sensible aux molécules polaires et apolaires
produites par la souche SRO1, car des zones d’inhibition ont été obtenues par les extraits des
milieux AF et ISP2 selon la technique des disques de diffusion.
En ce qui concerne l’absence de l’activité antibactériens sur milieu AF par
fermentation solide. Il est possible que du à la méthode de production solide ou liquide. Dans
la fermentation liquide, les filaments de la culture bactérienne condensés entre eux et forme
une zone anaérobie, qui est une condition de stress respiratoire, ce qui favorise une production
élevée des molécules bioactive, donc le rendement des antibactériens est important que le
rendement dans la fermentation solide.
Les deux bactéries k. oxytoca et Enterobacter sp. Se sont avérées très sensibles envers
SRO1 et ceci sur les deux milieux et avec les différents solvants utilisés, donc ces deux
souches sont sensibles aux molécules hydrophiles polaire, apolaires et intermédiaires
produites par la souche SRO1.
En fonction de la nature des solvants et la composition des milieux, on a détecté une
activité antibactérienne de la souche SRO1 vis-à-vis la bactérie test B. subtilis. Cette dernière
est sensible aux différentes molécules hydrophiles, polaires, apolaires et intermédiaires
présentent dans les extraits de la souche SRO1. Par contre dans la fermentation solide, où les
molécules sont extraites par le toluène ne montre aucune activité contre la souche B. subtilis.
Résultats et discussion
34
L’étude du spectre d’inhibition de la souche d’actinobactérie antagoniste à relevé
qu’elle présente en plus de l’activité antibactérienne une activité antifongique, cette dernière
à été vérifiée contre les champignons phytopathogènes (Ascochyta rabiei, Botrytis cinerea,
Alternaria alteranata, Trichoderma sp., Fusaruim oxysporum et Penicillium). Un résultat
similaire a été obtenu par Aouar (2012), où des souches d’actinobactéries antagonistes ont
présenté une double action antibactérienne et antifongique.
La comparaison entre les résultats de l’activité antifongique réalisée sur milieu solide
(technique des cylindre d’agar), et celle réalisée sur milieu liquide et solide (technique des
disques de diffusion), révèle que les champignons phytopathogènes (A. rabiei, A. alternata,
Trichoderma sp., F. oxysporum et penicillium) résistent au extraits des milieux solides,
contrairement au A. rabiei et B. cinerea qui se sont avérées sensibles aux extraits des
fermentations solides et liquides.
Conclusion générale et
perspectives
Conclusion et perspective
35
Notre travail a porté sur la production d’antibactériens et d’antifongiques par la
souche Streptomyces SRO1 sur milieux solide et liquide par deux techniques les
cylindres d’agar et les disques de diffusion.
L’antagonisme vis-à-vis les six bactéries d’importance clinique et les six
champignons phytopathogènes, a montré que quatre bactéries test (66,66%) se sont
avérées sensibles par la technique des cylindres d’agar, par contre aucune activité n’a
été détecté contre les champignons par cette technique. Les résultats enregistrés avec
la technique des disques de diffusion, montrent que 33,33% des champignons ont
présenté des zones d’inhibition, et 83,33% des bactéries se sont révélées sensibles aux
extraits testés.
Par apport aux bactéries, le solvant qui à présenté la meilleurs zones
d’inhibition c’est le toluène contre la bactérie B. subtilis dans le milieu ISP2 suite à
une fermentation liquide, comparativement à l’hexane qui a présenté la plus faible
activité et ceci contre Staphylococus aureus dans le milieu AF par fermentation
liquide.
Les extraits du méthanol et de l’acétate d’éthyle ont exhibé la plus forte
activité antibactérienne par apport le milieu AF. Cependant par rapport au milieu ISP
2 solide et AF liquide, le méthanol est le meilleur solvant.
En ce qui concerne l’antagoniste contre les champignons phytopathogènes, les
résultats enregistrés montre que le bon solvant d’extraction des molécules bioactives
par fermentation solide sur ISP2 et AF c’est le butanol-1- vis-à-vis le Botrytis
cinerea, et pour la fermentation liquide c’est le toluène contre Ascochyta rabiei.
Au terme de ce travail, on conclut que :
Le méthanol est le meilleur solvant pour l’extraction par la fermentation
solide.
Le butanol -1- et l’acétate d’éthyle sont les deux préférables solvants
d’extraction pour fermentation liquide.
Le mieux milieu qui donne un bon résultat et meilleur extraction c’est ISP 2.
La meilleure technique d’extraction des molécules bioactives est la
fermentation liquide.
Conclusion et perspective
36
En perspectives on propose de
Compléter l’identification physiologique, biochimique et moléculaire de la
souche SRO1
Purifier et caractériser les molécules bioactives intéressantes.
Références
bibliographiques
Références bibliographiques
37
A
Aouar L. (2012). Isolement et identification des actinomycètes antagonistes des
microorganismes phytopathogènes. Thèse de doctorat en Biochimie et Microbiologie
Appliquée. Université Mentouri-Constantine.
B
Barry A.L., Garcia F. and Thrupp L.D. (1970). An improves single disk method
for testing the antibiotic susceptibility of rapidly growing pathogens. Am J
ClinPathol.53: 149-158.
Basilio A. (2003). Patterns of antimicrobial from soil actinomycetes isolated under
different conditions of pH and salinity.J. Appl. Microbiol. 95: 814-823.
Bentley S.D., Chater K.F., Cerdeno-Tarraga A.M., Challis G.l., Thomson N.R.,
James K.d., Harris D.E. et al. (2002).Complete genome sequence of the model
actinomyceteStreptomyces coelicolorA3 (2).Nature. 417:141-7.
Berdy J. (2005). Bioactive microbi0.al metabolites. J Antibiot. 58 :1-26.
Boucheffa k. (2011). Criblage des souches d’actinomycètes productrices
d’antifongiques non- polyéniques : identification des souches productrices et essai de
caractérisation des antifongiques produits. Mémoire de Magister. Université
Abderrahmane Mira Bejaia.
Boughachiche F. (2012).Etude de molécules antibiotiques secrétées par des souches
appartenant au genre Streptomyces, isolées de Sebkha. Doctorat en Sciences Option
Biotechnologies Microbiennes. Université Mentouri Constantine.
Bonnet R. (2004).Growing group of extended spectrum β-lactamases: the CTX-M-
enzymes. Antimicrobial Agents Chemotherapy.40: 1-14.
Bradfort P. A. (2001).Extended spectrum β-lactamases (ESBL) in the 21st .century:
Characterisation, epidemiology and detection of this important resistance threat.
Clinical Microbiology Reviews.48: 933-951.
C
Cox P.W., Paul G.C. and Thomas C.R. (1998). Image analysis of the morphology of
filamentous micro-organisms. Microbiol.144: 817–827.
Références bibliographiques
38
D
Dietera A., Hamm A., Fiedler H.P., Goodfellow M., Muller W.E., Brun R. and
Bringmann G. (2003).Pyrocoll, an antibiotic, antiparasitic and antitumor compound
produced by a novel alkaliphilic Streptomyces strain. J Antibiot. 56: 639-46.
Doi.Y. and Arakawa.Y. (2007). 16S ribosomal rRNA methylation: emerging
resistance mechanism against aminoglycosides. Clinical Infection Diseases.45: 88-94.
Doumbou C.L., HambySalove M.K., Crawford D.L. and Beaulieu C. (2001).
Actinomycetes, promising tools to control plant diseases and to promote plant
growth.Phytoprotection.82(3): 85-102.
Sette L., Mendonca Alves Da Costa LA., Marsaioli AJ. and Manfio GP. (2004).
Biodegradation of alachlor by soil streptomycetes. App Microbiol Biotechnol.
64(5) :712-7.
E
Ensign J. C., Normand P., Burden J.P. and Yallop C; A., (1993).Physiology of
some actinomecete genera Res Microbiol.144:657-660.
G
Getha K., Vikineswary S., Wong W. H., Seki T., Ward A. and Goodfellow M.
(2005). Evaluation of Streptomyces sp. strain g10 for suppression of Fusariumwilt and
rhizosphere colonization in pot-grown banana plantlets. J IndMicrobiolBiotechnol.32:
24-32.
Goodfellow M. and Fiedler H.P. (2010). A guide to successful bioprospecting:
informed by actinobacterial systematics. Antonie van Leeuwenhoek 98 : 119-142.
Goodfellow M. and Williams S.T. (1983). Ecology of Actinomycetes.Ann Rev
Microbiol. 37: 189-216.
Gottlieb D. (1973).General consideration and implication of the actinomecetales. In:
Actinomycétales characterisatics and pratical importance. Edited by G. Sykes and F.AS
kinner Academic Press, London, New York.
Références bibliographiques
39
H
Hodgson D.A. (2000).Primary metabolism and its control in Streptomycetes: most
unusual group of bacteria.AdvMicrob Physiol. 42:47 -238. Hopwood DA., Bibb MJ., Chater KF., Kieser T., Bruton CJ., Kieser HM., Lydiate
DJ Smith CP., Ward JM. and Schremph H. (1985).Genetic Manipulation of
Streptomyces: ALaboratory Manual. Norwich, UK: John Innes Foundation.
Hwang B.K., Lim S.W., Kim B.S., Lee J.Y. and Moon S.S. (2001).Isolation and in
vivo and in vitro antifungal activity of phenylacetic acid and sodium phenyl acetate
from Streptomyces humidus.Appl Environ Microbiol. 67: 3730-3745.
J
Jayaraman R. (2009). Antibiotic resistance: an overview of mechanisms and a
paradign shift. Current Science.96: 1475-1482.
JinenezJ. T., Sturdikova M. and Sturdik E. (2009).Natural products of marine origin
and their perspectives in the discovery of new anticancer drugs.ActachimicaSlovaca.2:
63-74.
K
Khamna S., Yokota A., Peberdy J. and Lumyong S. (2009).Antifungal activity of
Streptomyces spp. Isolated from rizosphere of Thai medicinal plants. Intern J Integr
Biol. (6) 3: 143-147.
Kieser T., Bibb M. J., Buttner M. J., Chater K F. and Hopwood D. A. (2000).
Practical Streptomyces Genetics.The John Innes Foundation, Norwich, UK: 613.
Kroiss J, Kaltenpoth M, Schneider B, Schwinger MG, Hertweck C, Maddula RK,
Strohm E and Svatos A. (2010). Symbiotic Streptomycetes provide antibiotic
combination prophylaxis for wasp offspring. Nat Chem Biol. 6(4):261-3.
L
Levy S. B. and Marshall B. (2004). Antibacterial resistance.Worldwide causes,
challenges and responses. NatureMedecine. 10: 122-129.
Loucif K. (2011). Recherche de substances antibactériennes à partir d’une collection
de souches d’actinomycètes. Caractérisation préliminaire des molécules bioactives.
Mémoire de Magister en Microbiologie. Université Mentouri-Constantine.
Références bibliographiques
40
Lozniewski A. and Rabaud C. (2010). Résistance bactérienne aux antibiotiques.
Fiche conseil pour la prévention du risqué inféctieux. Centre de Coordination de lute
contre les infections Nosocomiales-Sud Est.
Ludwig W., Euzéby J. and Whitman W.B. (2012).Taxonomic outline of the phylum
actinobacteria.In Beregy’s Manual of Systematic Bacteriology.5 :29-31.
M
Madigan M. T and Martinko J.M. (2007). Biologie des microorganismes. Pearson
Education France, 11eédition: 331-423, 686-718.
Marinelli F. (2009). Antibiotics and Streptomyces: the futur and antibiotic discovery.
Microbiology today.2: 20-23.
Mc Bride M.J. and Ensign J.C. (1986) Effect of intracellular trehalose content on
Streptomyces griseus spores. J Bactriole. 169(11): 4995-5001.
Melouah O. (2015). Production et extraction de quelques principes actifs isolés à
partir des actinomycètes. Mémoire de Master Académique, Université Kasdi Merbah
Ouargla.
Miguelez, E.M., Hardisson, C., and Manzanal, M.B. (2000). Streptomycetes: a new
model to study cell death. IntMicrobiol 3: 153–158. Molle, V., and Buttn.
Mukhtar T. A., Koteva K. P., Hughes D. W., Wright G.D. (2001).Vgb from
Staphylococcus aureusi nactivates streptogramin B antibiotics by an elimination
mechanism, not hydrolysis. Biochemistry. 40: 8877-86.
O
Ohnishi Y., Ishikawa J., Hara H., Ikenoya M., Ikeda H., Yamashita A., Hattori
M., Horinouchi S. (2008).Genome sequence of the streptomycin-producing
microorganism Streptomyces griseus IFO 1350. J. Bacterial. 190 (11):4050-60.
P
Prescott L.M., Harley J.P. and Klein D.A. (2007). Microbiologie. De Boek &
Larcier, Bruxelle: 805-825.
S
Sanglier J.J. and TrujilloM. (1997). Substances bioactives produites par les
actinomycetes et stratégie de sélection de souches. Bull Soc Fr Microbiol. 12: 13.
Références bibliographiques
41
Sardi P., Saracchi M., Petrolini B., Borgonovi G.E. and Merli S. (1992). Isolation
of endophitic Streptomyces strains from surface-sterilized roots. Appl. Env. Microbiol.
58(8), 2691-2693.
Smaoui S. (2010). Purification et caractérisation de biomolécules à partir de
microorganismes nouvellement isolés et identifiés. Thèse de Doctorat en Génie de
Procédés et Environnement Université de Toulouse. France. 251p.
Stackebrandt E. and Schumann P. (2006). Introduction to the Taxonomy of
Actinobacteria, dans: Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.,
Stackebrandt E. Prokaryotes. Springer Science, Business Media, LLC edition New
York, USA: 297-321.
T
Tortorano A. M., Cabrini E. and Viviani M. A. (1979). Sensibilité in vitro des
levures à cinq antifongiques. Comparaison de deux méthodes C. M. I en gélose et
méthode des disques. Bull. Soc. Fr. Myc. Med. 8: 69-74.
V
Vonothini G., Murugan M., Sivakumar K. and Sudha S. (2008).Optimization of
protease production by an actinomycete Strain, PS-18A isolated from an estuarine
shrimp pond. AfrJ Biotechnol. 7(18): 3225-3230.
W
Williams S. T., Goodfellow M., Wellington E. M. H. Vickers J. C., Alderson G.,
Sneath P. H. A., Sackin M. J. et al. (1983b).A probability matrix for identification
ofsome streptomycetes.J Gen Microbiol.129: 1815-18.
Williams S.T., Goodfellow M. and Alderson G. (1989). Genus Streptomyces, dans:
Williams S.T., Sharpe M.E. et Holt J.H. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology
(volume 4). Willliams& Wilkins, USA: 2452-2492.
Williams S. T., Goodfellow M., Alderson G., Wellington E. M. H., Sneath P. H. A.
and Sackin M. J. (1983a) Numerical classification of Streptomyces and related
genera. J Gen Microbiol.129: 1743-1813.
Williams S. T., Goodfellow M., Wellington E. M. H. Vickers J. C., Alderson G.,
Sneath P. H. A., Sackin M. J. et al. (1983).A probability matrix for identification of
some streptomycetes. J Gen Microbiol.129:1815-1830.
Références bibliographiques
42
X
Xu LH., Li QR. and Jiang CL. (1996). Diversity of soil actinomycetes in yunnan,
China. Appl. Environ. Microbiol.62: 244-248.
Y
Yala D., Merad A. S., Mohamed D. and OuarKorich M. N. ( 2001).Classification
et mode d’action des antibiotiques. Medecine de Maghreb. N° 91.
Z
Zouaghi A. (2007). Optimisation de la production de l’Oxytétracycline par
Streptomyces rimosus. Mémoire d’Ingéniorat. Université 7 Novembre de Carthage.
Annexe
Annexe 1
1. Composition de milieux de cultures
ISP 2 + CaCo3
Extrait de levure…………………………… 4 g
Extrait de malt…………………………….. 10 g
Glucose…………………………………….. 4 g
CaCo3……………………………………… 1 g
Agar……………………………………….. 20 g
Eau distillée……………………………… 1000 ml
pH = 7,3
Milieu AF
Extrait de Malt…………………………… 10 g
Extrait de levure………………………….. 4 g
Glucose…………………………………… 2 g
NaCl……………………………………… 2,5 g
CaCO3……………………………………. 1 g
Agar……………………………………… 15 g
Eau distillée qsp……………………….. 1000 ml
pH = 7,0
Muller Hinton
Extrait de viande…………………………… 2 g
Hydrolysat acide de caséine………………. 17,5 g
Amidon…………………………………….. 1,5 g
Agar………………………………………… 10 g
Eau distillée…………………………… 1000 ml
pH = 7,5
Chapman
Tryptone……………………………………… 05 g
Extrait de levure……………………………… 03g
Extrait de viande……………………………... 03 g
Chlorure de sodium………………………….. 70 g
Peptone bactériologique……………………….10 g
Mannitol…………………………………….....10 g
Rouge phénol………………………………...0, 05g
Agar…………………………………………… 18 g
Eau distillée............................................….1000 ml
pH = 7,4
Hektoen
Protéose peptone……………………………… 12 g
Extrait de levure………………………………. 03 g
Chlorure de sodium…………………………… 05 g
Thiosulfate de sodium………………………… 05 g
Sels biliaires…………………………………… 09 g
Citrate de fer et d’ammonium……………….....1,5g
Salicine………………………………………... 02 g
Lactose………………………………………… 02 g
Saccharose……………………………………... 12 g
Eau distillée…………………………………. 1000ml
pH = 7,6
GN
Extrait de levure…………………………….. 2g
Extrait de viande……………………………. 1g
Peptone……………………………................ 5g
NaCl…………………………………………. 5g
Agar………………………………………….. 5g
Eau distillée……………………………….. 1000ml
pH = 7,4
PDA
Glucose……………………………………….20g
Pomme de terre………………………………200g
Eau distillée…………………………………1000ml
Annexe 2
1. Préparation de la solution 0,5 de Mc Farland
1.1. Préparation de la solution 0,5 de Mc Farland.
0,6 ml Solution de BaCl2 à 1 %.
99,4 ml Solution de H2SO4 à 1 %.
1.2 Conditions de conservation de la solution 0, 5 de Mc Farland.
l’obscurité
Température de conservation : 20-25 °C
Durée de conservation : 6 mois
2. Polarité des solvants utilise
Solvant Polarité
Acétate d’éthyle 4.4 Intermédiaire
Butanol 1 - Polaire
n-hexane 0.1 Apolaire
Méthanol 5.1 Polaire
Toluène 2.4 Apolaire
Résumé
Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à la recherche de substances
antibactériennes à partir de la souche d’actinomycète SOR1. L’activité
antibactérienne des souches antagonistes a été mise en évidence envers deux bactéries
à coloration de Gram positive (S. aureus, B. subtilis), et quatre bactéries à coloration
de Gram négative (E. coli, P. aeruginosa, et K.oxytoca, Enterobacter) et six
champignons phytopathogènes (Ascochyta rabiei, Alternaria alteranata, Botrytis
cinerea, Trichoderma sp, Fusarium oxysporum, Penicillium sp). Elle a été réalisée par
deux techniques d’antagonisme (la technique des cylindres d’agar et celle des disques
de diffusion par fermentation liquide et solide). La souche SOR1 n’a pas d’activité
antibactérienne avec la bactérie P. aeruginosa, et a montré une activité sur les autres
bactéries-test soit par la technique des cylindres d’agar ou des disques de diffusion.
Les grandes zones d’inhibition sont enregistrées avec les bactéries B. subtilis (31±2
mm) avec l’extrait de toluène, Enterobacter (28,3± 1.52 mm) avec l’extrait
butanolique et K.oxytoca (29,3 ±2.08 mm) avec le méthanol. Par conter la souche
SOR1 a montré une activité antimicrobienne avec les champignons (Ascochyta rabiei,
Botrytis cinerea) par la technique des cylindres d’agar et la technique des disques de
diffusion. Les résultats obtenus ne détectent que la meilleure extraction des molécules
bioactives produite par la souche SOR1 c’est l’extraction par la technique des
disques de diffusion par fermentation liquide, le meilleure milieu est le ISP2 et le
butanol, acétate d’éthyle sont les meilleures solvants d’extraction.
Mots clés : Actinobactéries, antagonisme, solvants organiques, substances
antibactériennes.
: الملخص
خلال هذا العمل ، كنا مهتمين بالعثور على المواد المضادة للبكتيريا من سلالة
Actinobacteries SOR1 . اثنين وقد تجلى هذا النشاط المضاد للبكتيريا سلالات العدائية ضد
,E. coli)الجراثيم سلبية الغرام أربعةو، (S. aureus, B. subtilis )ماالبكتيريا إيجابية الجرمن
P. aeruginosa, et K.oxytoca, Enterobacter ) وستة الفطريات الممرضة للنبات(Ascochyta
rabiei, Alternaria alteranata, Botrytis cinerea, Trichoderma sp, Fusarium oxysporum,
Penicillium sp .) والأقراص انتشار عن أغارتقنية اسطوانة )عن طريق تقنيتين وقد نفذت
نشاط على عدم وجود أي .ليسا لها أي تأثير ما يدل غ SOR1(. طريق التخمير السائل والصلبة
و في كلتا البكتيريا مع باقي أظهرت النشاط و لكنها ، ,P. aeruginosa مضاد للجراثيم مع بكتيريا
ر كبيرآي ذات اكبر قط كبيرةالمناطق ال سجلت. "تقنية القرص نشر أجار أو اسطوانة" نالتقنيتي
Toluène التولوينو دلك مع المذيب العضوي ( مم 31 ±2) B. subtilis تثبيط البكتيريا معل
المذيب العضوي مع( ملم 2..3 ±1.52) Enterobacterالأمعائية و كذلك مع البكتيريا
SOR1أظهرت . مع الميثانول ملم ..2± 3..2ربقط K.oxytoca أيضاو . butanolلتا نوبي
بواسطة تقنية ( Ascochyta rabiei, , Botrytis cinerea)ط البكتيري مع الفطريات النشا
شاراسطوانات أجار والأقراص ت تقنية أقراص أن تالنتائج المتحصل عليها كشف. الان
SOR1ستخرا الجيياات الحيوية النشطة التي تنتجها سلالة الانتشار هي أفضل تقنية لا
أما بالنسبة الى كل من . ISP2هو أحسن وسط حيوي ئل، عن طريق التخمير السا يستخر
butanol ،acétate d’éthyle هي أفضل مذيبات الاستخلاص.
.الأكتينوميسيتات ، العداء ، المذيبات العضوية ، المواد المضادة للبكتيريا :الكلمات المفتاحية
Nom : SAOUDI
Prénom : Safa
Nom : LAIB
Prénom : Souheyr
Date de soutenance :
14 / 06 / 2016
Thème
Production et extraction des molécules bioactives à partir d’une
souche d’actinobactérie (Streptomyces SRO1)
Résumé
Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à la recherche de substances antibactériennes
à partir de la souche d’actinomycète SOR1. L’activité antibactérienne des souches antagonistes a
été mise en évidence envers deux bactéries à coloration de Gram positive (S. aureus, B. subtilis), et
quatre bactéries à coloration de Gram négative (E. coli, P. aeruginosa, et K.oxytoca, Enterobacter)
et six champignons phytopathogènes (Ascochyta rabiei, Alternaria alteranata, Botrytis cinerea,
Trichoderma sp, Fusarium oxysporum, Penicillium sp). Elle a été réalisée par deux techniques
d’antagonisme (la technique des cylindres d’agar et celle des disques de diffusion par fermentation
liquide et solide). La souche SOR1 n’a pas d’activité antibactérienne avec la bactérie P.
aeruginosa, et a montré une activité sur les autres bactéries-test soit par la technique des cylindres
d’agar ou des disques de diffusion. Les grandes zones d’inhibition sont enregistrées avec les
bactéries B. subtilis (31±2 mm) avec l’extrait de toluène, Enterobacter (28,3± 1,52 mm) avec
l’extrait butanolique et K. oxytoca (29,3 ±2,08 mm) avec le méthanol. Par conter la souche SOR1 a
montré une activité antimicrobienne avec les champignons (Ascochyta rabiei, Botrytis cinerea) par
la technique des cylindres d’agar et la technique des disques de diffusion. Les résultats obtenus ne
détectent que la meilleure extraction des molécules bioactives produite par la souche SOR1 c’est
l’extraction par la technique des disques de diffusion par fermentation liquide, le meilleure milieu
est le ISP2 et le butanol, acétate d’éthyle sont les meilleures solvants d’extraction.
Mots clés : Actinobactéries, antagonisme, solvants organiques, substances antibactériennes.
Laboratoire de recherche : Laboratoire de Microbiologie. Faculté des Sciences Exactes et
Sciences de la Nature et de la Vie. Université Larbi Ben M’hidi Oum-el- Bouaghi.
Devant le jury
Présidente : Mme CHETTIBI F M.C.B. Université OEB
Rapporteur : Mme AOUAR Lamia M.C.A. Université OEB
Examinateur : Mr MEDJOUDJ H. M.C.B. Université OEB
Recommended