Proteasas Extracelulares Producidas por Bacterias ... · Las bacterias marinas poseen sistemas...

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Ms. Sc. ANGEL CASTRO ALVARADOM. Sc. Willian Capa RoblesM. Sc. Julio Chávez Galarza

2012

Proteasas Extracelulares Producidas por Bacterias Extremofilas Aisladas del Ambiente Marino

RESUMEN

Se aislaron 10 cultivos procedentes de efluentes pesqueros enagar químicamente definido usando glucosa y gelatina atemperatura ambiente (25º C) durante 5 días.

Se evaluó la actividad proteolítica de los 10 cultivos en agarcomún suplementado con leche descremada y NaCl al 2%obteniendo 4 cultivos con buena actividad a las 96 y 120 horas.

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RESUMEN

Los cultivo L1 y P5 fueron los que tuvieron mayor actividad enzimática proteolítica y mayor actividad especifica al acabo de 96 horas de evaluación cuando se sembró en caldo común con caseína.

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I. Introducción

Las bacterias encontradas en las zonas marino-costerasguardan una relación más o menos directa con susparientes que habitan en suelos, pero en mar abierto,poseen características de microorganismos propiamentemarinos. En realidad, el que sean generalmente halófilos ypsicrófilos facultativos es la única característica que losdistingue de especies terrestres directamente emparentadasy con metabolismos similares.

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Las bacterias marinas poseen sistemasmetabólicos muy variadoLas bacterias proteolíticas las que abundan en elmedio marino, especialmente en lugares dondeexisten gran cantidad de material proteico comoen las sanguazas.

I. Introducción

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Las proteasas representan aproximadamente el40% de los las ventas totales de la enzima en losdiferentes sectores del mercado industrial, talescomo detergentes, alimentos, productosfarmacéuticos, cuero, diagnóstico, gestión deresiduos y recuperación de la plata.

I. Introducción

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¡ Objetivo GeneralAislamiento y selección bacterias con capacidad deproducir proteasas extracelulares de interés o aplicaciónbiotecnológica procedentes de agua superficiales de labahía el Ferrol.

¡ Objetivo EspecificoAislamiento y selección de bacterias que proteasasextracelulares usando medio de cultivo solido con gelatinaprocedentes de agua superficiales de la bahía el Ferrol.

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II MATERIAL Y METODOS

Recolección de muestras.Se obtuvieron 05 muestras de agua de mar superficial cercaa dos efluentes pesqueros, las que fueron colectadas enfrascos estériles de 250 mL de capacidad.

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II MATERIAL Y METODOSAislamiento de bacterias en agar químicamente definidoLas muestras colectadas fueron procesadas en ellaboratorio realizando diluciones seriadas y utilizandocomo diluyente agua de mar filtrada y esterilizada.El aislamiento y el recuento de bacterias marinas se realizosembrando alícuotas de las diluciones en medio de cultivoquímicamente definido usando como fuente de carbono aglucosa y como fuente de nitrógeno a gelatina (AQD), pH7,5 e incubados a 25 ºC por 5 días.

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II MATERIAL Y METODOS

Selección de cepas proteolíticas en agar común modificado con caseína. Para determinar la capacidad proteolítica de las cultivos setomaron alícuotas de los cultivos de 48 h y se sembraronpor estrías en agar común con NaCl al 2%, suplementadocon leche descremada al 6%, pH 7,5.Los cultivos fueron incubados a 25 ºC hasta por 5 días. La capacidad hidrolítica de los cultivos se reconoció mediante la formación de halos transparentes alrededor de las colonias; al cabo de 5 días. Las cultivos fueron mantenidas en AQD

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II MATERIAL Y METODOS

Evaluación de la actividad proteolítica.

Los cultivos seleccionados se reactivaran en caldo comúncon caseína, sembrándose 1 mL de cada cultivo (106

UFC/mL aproximadamente) en matraces conteniendo 100mL de caldo común, NaCl al 2% suplementados concaseína al 1%, a pH 7,5 e incubados a 25 ºC, sin agitacióncon una tasa de 5:1 de volumen: medio de cultivo durantepor 96 horas.

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II MATERIAL Y METODOS

Evaluación de la actividad proteolítica.

La actividad enzimática (U/mL) y actividad específica(U/mg de proteína) de los cultivos seleccionados fuerondeterminadas según la metodología recomendada por Nietoy Ellis (1986) y Takahashi y Osaka (1970).

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II MATERIAL Y METODOS

Evaluación de la actividad proteolítica.

Se tomaron los sobrenadantes de cultivos obtenidos y secentrifugó a 2500 rpm por 10 minutos a 4 °C, a las 24, 48 y96 h.Se uso 1 mL caseína al 1% y 1 mL del extracto crudo de laenzima. Se incubo a 25ºC durante 20 minutos deteniéndosecon 2 mL ácido tricloroacético al 10%. Se centrifugo a 2500rpm por 10 minutos a temperatura ambiente, y a cadasobrenadante se le midió la densidad óptica a 280 nm.

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Evaluación de la actividad proteolítica

¡ La unidad de actividad fue definida como lacantidad de enzima que libera un micromol deaminoácidos por minuto por mL.

¡ El contenido proteico de los extractos se realizo porel método de Lowry y seroalbúmina de bovinocomo estándar.

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II MATERIAL Y METODOS

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III RESULTADOS

a) Aislamiento de bacterias marina productoras deproteasas usando agar suplementado con caseína

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III RESULTADOSb) Elección de cepas proteolíticas en agar común modificado con caseína

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Evaluación de la actividad proteolítica

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IV CONCLUSIONES

Se aislaron 10 cultivos bacterianos en agar suplementadocon leche descremada encontrándose que la mayoríatuvieron la mayor actividad proteolítica a las 96 y 120horas.Se evaluaron 4 cultivos. Los que tuvieron la máximaactividad enzimática proteolítica y actividad específica alas 96 horas fueron los cultivos L1 y P5.

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GRACIAS POR SU ATENCIONaca1castro@gmail.com

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