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27.04.2014
1
Pyrrolizidin-Alkaloide in Kräutertees für
Babies, Schwangere und StillendeTill Beuerle, LChG, Arbeitstagung 2014, Regionalverband Nord, Hamburg 25.03.2014
Pyrrolizidin-Alkaloide (PAs)
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 2
Necin Base(Retronecin)
O
OH
HO
OHOH
Senecionin Heliotrin
Necin Säure
27.04.2014
2
PA-Pflanzen
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 3
Boraginaceae
Asteraceae
Fabaceae
source: wikipedia.de
Orchidacea
Struktur Matrix
N
OO
HO
HOO
N
OO
HO
O
OH OH
N
OO
HO
O
HO
N
HHOO
OOH
OH
7
9
Senecionin Typ(~ 100 Strukturen)
Triangularin Typ(~ 50 Strukturen)
Monocrotalin Typ(~ 30 Strukturen)
Lycopsamin Typ(~ 100 Strukturen)
necicacid
necinebase
N
HO
OOH
OH
Supinin Typ(~ 15 Strukturen)
N
OO
OO
HOO
Otonecin Typ(~ 20 Strukturen)
� Ca. 600+ Strukturen in mehr als 600 Pflanzen
N
OO
HO
HOO
N
OO
HO
HOO
O
Tertiäres PA
PANO
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 4
27.04.2014
3
PA-Problematik
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 5
• Toxische pflanzliche Sekundärmetabolite
• Akute Toxizität: bei mg/kg KG über Tage/Wochen � Lebertoxizität
• Chronische Toxizität: Kanzerogen, Mutagen, Genotoxizität
• Risikobewertung durch EFSA (2011): 0.007 µg/kg KG p ro Tag
• PhytopharmakaVO (Deutschland, 1992): 1 µg pro Tagesd osis (intern; < 6 wk)0.1 µg pro Tagesdosis (intern; > 6 wk)
Warnhinweis: Nicht für Schwanger und Stillende
• Raffiniertes Echium-Öl: nach der Novel Food Verordnung max. 4 µg PAs/kg Öl
• Chronische Toxizität: Kanzerogen, Mutagen, Genotoxi zität
PA in Lebensmitteln
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 6
• Honig (ab 2004)
• Pollenprodukte (ab 2008)
• Honighaltige Lebensmittel (2011)
• Salate (2007)
• Medizinischer Honig (2011)
• Tierische Lebensmittel (Milch, Eier, Fleisch) (2000, 2011)
• Tee/Kräutertee (BfR, 2013)
• Futtermittel (2011)
• Küchenkräuter / „Frankfurter Grüne Soße“ (2013)
• Foodsupplements (Boraginaceae-Öl-Produkte) (2014)
• Tee/Kräutertee (BfR, 2013)
27.04.2014
4
Summenparameter-Ansatz
Key-features für Genotoxizität1,2-Doppelbindung
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 7
Simplifizierung
Umwandlung möglichst aller1,2-ungesättigter PAsin eine gemeinsame
Grundstruktur.
N
HO
O
O
OH
HO
O
N
OO
O
O
OH
HO
N
HOSi O
Si
Di-TMS-Heliotridin
Di-TMS-Retronecin
GC-MS Summenparameter Methode
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 8
27.04.2014
5
GC-MS Methode für pflanzliche Matrix
• Honig / Pollen
• PA-Pflanzen
• PA-Spurenanalytik inpflanzlicher Matrix
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 9
Überblick über die HPLC-ESI-MS/MS Methode
Lasiocarpin
Retronecin / Heliotridin Analyten
Senecionin
+
Summe der 1,2-ungesättigten Retronecin/Heliotridin-Typ
PAs/PANOs
SCX-SPE
1 M LiAlH 4 in THF 0.5 h
Heliotrin Lycopsamine-N-oxid Phthalsreanhydrid
Pyridin / 1 h
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 10
27.04.2014
6
Entwicklung HPLC -ESI-MS/MS Methodedeuterierter interner Standard
Isotopenanreicherungund chem. Reinheit ≈ 96%
Hydrolyse
Ba(OH)2
Oxidation
MnO2/KCN/AcOH
ReduktionLiAlD4
Veresterung
ButtersäureanhydridAceton
Monocrotalin Retronecin
di-Butyroyl-[9,9-2H2]-Retronecin
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 11
Überblick über die HPLC-ESI-MS/MS Methode
Lasiocarpin
Retronecin / Heliotridin Analyten
Senecionin
+
Summe der 1,2-ungesättigten Retronecin/Heliotridin-Typ
PAs/PANOs
SCX-SPE
1 M LiAlH 4 in THF 0.5 h
Heliotrin Lycopsamine-N-oxid Phthalsreanhydrid
Pyridin / 1 h
IST: di-butyroyl-[9,9- 2H2]-retronecin
D2-retronecin IST
SCX-SPE
1 M LiAlH 4 in THF 0.5 h
Phthalsreanhydrid
Pyridin / 1 h
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 12
27.04.2014
7
Berechnung der PA-Gehalte: RE-Äquivalente
RetronecinMw = 155 g/mol
Mw Retronecin
Mw PA* Konzentration PAKonzentration in RE =
Umrechnung von Einzel-PA-Bestimmung in Summenparameter RE
Faktor zur Umrechnungvon RE in PA
LycopsaminMw = 299 g/mol
1.9
SenecioninMw = 335 g/mol
2.2
Echimidin-NOxMw = 413 g/mol
2.7
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 13
2.1
PAs in Tee für Babies, Schwangere und Stillende
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 14
27.04.2014
8
Proben-Sampling
WWW
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 15
insgesamt45 Proben dieser Kategorie
Supermärkte, DrogeriemärkteApotheken (Fertigware)
4 Bundesländer +WWW
Oktober – Dezember 2013
Analytik:
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 16
Lasiocarpin
Retronecin / Heliotridin Analyten
Senecionin
+
Summe der 1,2-ungesättigten Retronecin/Heliotridin-Typ
PAs/PANOs
SCX-SPE
1 M LiAlH 4 in THF 0.5 h
Heliotrin Lycopsamine-N-oxid Phthalsreanhydrid
Pyridin / 1 h
A) 60%
N
OHOH
p-Toluoylsulfonylisocyanat
ACN / RT / 30 min
B)
Analyten
40%
27.04.2014
9
Ergebnisse:
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 17
• 38 von 44 Proben waren PA positiv (86%)
• PA-Gehalte von 0-391 µg RE/kg (0-821 µg PA/kg)
• Mittelwert 50 µg RE/kg (105 µg PA/kg)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
lactation pregnancy infants/babies kids pregnancy and
lactation
av
era
ge
µg
RE
/k
g p
rod
uct
Mittelwert
Ergebnisse: Bewertung
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 18
Herbal tea
consumption cups (g)/day
EFSAa adult 70 kg calc. dose
EFSAa infant 5 kg calc. dose
Regulation b < 6 wk d calc. dose
Regulation b > 6 wk d calc. dose
Regulation b preg./ lact. calc. dose
1 (2)
0.42d 0.21e
0.04d 0.21 e
1.0d 0.21 e
0.1d 0.21 e
0d 0.21 e
2 (4)
0.42d 0.42 e
0.04d 0.42 e
1.0d 0.42 e
0.1d 0.42 e
0d 0.42 e
5 (10)
0. 42d 1.05 e
0.04d 1.05 e
1.0d 1.05 e
0.1d 1.05 e
0d 1.05 e
EFSAEmpfehlung 2011
PhytopharmakaVODeutschland 1992
• 11 von 15 Szenarien würden zuviel PA enthalten• viele Szenarien der Zielgruppen Babies, Schwangere, Stillende
e (Werte umgerechnet in µg PA/kg)
27.04.2014
10
Ergebnisse: Bio / Konventionell
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 19
• 17 der Produkte waren Bio-Produkte (39%)
88% PA-positiv
Mittelwert 37 µg RE/kg
• 27 der Produkte waren Konventionelle-Produkte (61%)
85% PA-positiv
Mittelwert 58 µg RE/kg
Interpretation der Ergebnisse:
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 20
• Quelle der PA in den Produkten?- Kontamination durch mitgeerntete Unkräuter? Welche?- Teedrogen 70 – 80% ausländischer Herkunft - Bio/Konventionell- Anis/Fenchel/Kümmel? Früchte
• Abgrenzung Lebensmittel/Phytopharmaka- Monographien und Fixe Kombinationen (EAB und StZFAM)- (Soft) Health Claims
Unterstützung der Milchbildung / Magenfreundlich / wohltuend beruhigend auf Magen und Darm / Verdauungsfördernde Wirkung auf Magen und Darm
- PZN Nummer aber keine Zul. Nr.
• Verbrauchererwartung
Senecio vulgaris
27.04.2014
11
Dank
Vielen Dank für`s Zuhören
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 21
LGL Nordbayern
Inga Mädge
Otonecin-Typ PAs
EFSA Report 2011
• Senkirkin in Honig3% der Honige enthielten Senkirkin (n = 14 604) aber weniger als 2 µg/kg (99th Percentile; LOD = 0.5 µg/kg).
• Senkirkin in Viehfuttersporatisch (n=312) und dann weniger als 5 µg/kg (99th Percentile; LOD= 4.5 µg/kg).
• Alle Proben die Senkirkin enthalten haben i.d.R. sehr viel größere Mengen an Senecionin etc.
Regionalverband Nord, LChG, Hamburg, 25.03.2014 / Till Beuerle / Seite 22
27.04.2014
12
Institut Kirchhoff Berlin GmbH, 26.02.2014 / Till Beuerle / Seite 23
ESI-EPI-MS/MS Daten120.0
149.0
94.0138.1 286.0 452.0304.1
250.0
m/z [Da]
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]
100
50
100 140 180 220 260 300 340 380 420 46080
N
O O
OOHO
O
C24H22NO8+
[M+H]+; mass: 452.1
O
OH
149
304(+H)
138 (+H)11
452 � 94
452 ���� 120452 � 149
m/z [Da]
Rel
ativ
e In
tens
ität [
%]100
50
100 140 180 220 260 300 340 380 420 46080
122.0
149.0
96.0 140.0 306.1288.1 454.0
454 � 96
454 ���� 122454 � 149
Chromatogramme: Kräutermischung - positiv
Institut Kirchhoff Berlin GmbH, 26.02.2014 / Till Beuerle / Seite 24
12 14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
3.0e4
6.0e4cps
TIC 15.34
16.7214.07
12 14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
2.0e4
4.0e4cps
Trace452 ���� 120 15.34
12 14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
2.5e3
5.0e3cps
Trace454 ���� 122
15.36
Analyten 452 ���� 120
IST 454 ���� 122
TIC Frische Kräuter für “Frankfurter Grüne Soße”(F_1)
27.04.2014
13
Institut Kirchhoff Berlin GmbH, 26.02.2014 / Till Beuerle / Seite 25
Chromatogramme: Kräutermix - negativ
3500
7000cps
14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
14.52
125
250cps
14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
14.55
2500
5000cps
14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
14.53
Blank – nur IST
250
500cps
14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
14.52
Analyten 452 ���� 120
4500
9000
14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
14.50
IST 454 ���� 122
7000
1.4e4cps
14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
14 16 18 20 22 24 26 28time [min]
14.50
Tiefkühlkräuter (DF3) + IST
TIC
Ca. 5%da nicht 100%-D 2
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