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P d ió d b t i i biótiProducción de bacteriocinas y probióticos a partir de suero de leche
y su aplicación
en alimentación de animales monogástricos
Lorenzo Pastrana
Rafaela, 2010
Introducción
Piensos producción FormulaciónPrevenciónT t i t
Infecciones intestinalespindustrial de cerdos y pollos antibióticos Tratamiento
Promotores del crecimiento
R i t i i bi
Acidificantes
Efectos adversosResistencias microbianas
Restricciones uso
Aceites esenciales
Sustancias prebióticasAlternativas
Microorganismos probióticosMicroorganismos probióticos
Dificultad de obtener forma Productos comerciales
Sólida base científica (funcionalidad)
barata cultivos bacterianos concentrados
Extensión limitada
Composición del suero de leche (g/L)
SLC SLD
48 03
SLC
Carbohidratos totales 48,11 20,54
19 86
SLD
Azúcares reductores 48,03 19,86
5,02 2,04
1 05 0 45
Azúcares reductores
Proteínas
Nitrógeno total 1,05 0,45Nitrógeno total
Fósforo total
Cenizas
0,43 0,25
5 10 3 00CenizasResiduo sólido
5,10 3,00
62,70 26,60
Objetivos
Mejorar la calidad higiénica y funcional de piensos para alimentación de lechones y pollos incorporando
Reducir la incidencia de trastornos intestinales
para alimentación de lechones y pollos incorporando bacterias lácticas probióticas.
1. Seleccionar especies potencialmente probióticas
Sustituir la utilización de antibióticos
2. Diseñar un procedimiento de fermentación para obtener elevadas cantidades de biomasa probiótica y otras sustancias con actividad antimicrobiana.
2.1 Fermentación de sustratos de bajo coste: suero de leche
2.2 Suplementar el suero con extractos proteicos: harinas de soja y pescado
3. Formular un pienso con biomasa probiótica y/o bacteriocinas. Estudios de estabilidad y modelización de la supervivencia.
4. Evaluar la funcionalidad de los piensos con probiótico: pollos y lechones.4. Evaluar la funcionalidad de los piensos con probiótico: pollos y lechones.
Objetivo 1:
Potenciales bacterias probióticasPotenciales bacterias probióticas
Especie Clave* Procedencia
Lactobacillus casei Lb 3.04 CECT 4043
Criterio
Mayor producción láctico
Lactococcus lactis
Pediococcus acidilactici
Lc 1.04
Pc 1.02
CECT 539
NRRL B-5627
Productora nisina
Productora de pediocinaed ococcus ac d act c
Enterococcus faecium
E t
c 0
Ec 1.01
E 3 01
56
CECT 410
B t i i l d d
oducto a de ped oc a
Microbiota intestinal
M fi bilid dEnterococcus sp. Ec 3.01 Bacteria aislada de intestino de pollo
*Clave de las especies bacterianas utilizadas en el Grupo de Biotecnología,
Mayor fiabilidad identificación
Clave de las especies bacterianas utilizadas en el Grupo de Biotecnología,del Área de Nutrición y Bromatología de la Facultad de Ciencias de Ourense.CECT: Colección Española de Cultivos Tipo.NRRL: Nothern Regional Research Laboratory (Peoria, Illinois, EEUU).
Objetivo 1:
Potenciales bacterias probióticasPotenciales bacterias probióticas
BacteriasPotencial efecto probiótico
Bacterias candidatas Seguridad: carecer de toxicidad o patogeneicidad
Aptitud tecnológica Estabilidad y viabilidad celular Aplicación industrial bacterias lácticas
Obtener fácilmente elevados recuentos
Especialmente lábiles y p yespecialmente exigentes
• Obtener postincubados concentrados en IMPORTANTE biomasa y sustancias antimicrobianas
• Además de forma económicamente viable
Medio de cultivo barato Modalidad operatoria que conduzca a elevados rendimientos
Objetivo 2:
Producción de bacterias lácticasProducción de bacterias lácticas
Habitualmente:
Medios de cultivo convencionales t l MRS TGE Ventaja: concentraciones relativamente
elevadas de producto naturaleza cara: MRS, TGE
Modalidad proceso:Tipo batch
Problema: elevado costep
Tipo continuo
Nuestro laboratorio:
Medios de cultivo a base de efluentes residualessuero de leche
efluentes procedentes delefluentes procedentes del procesado del mejillón.
Objetivo 2.1: Producción de bacterias lácticas
Cultivos batchCultivos batch
D t ió d l lti
Pc 1.02 Lc 1.04 Lb 3.04 Ec 1.01
7
8
7
8
Detención del cultivo
Detención del cultivo
pH
4
5
6
7
g/L) 1,5
4
5
6
7
1,5 g/L)
pH
Bacterias lácticas Niveles: Biomasa, Láctico AA
C ?Limitación de
Bio
mas
a (g
0,0
0,5
1,0
g/L)
150,0
0,5
1,0
10
15
g/L)
Bio
mas
a (g
crecen en suero de leche ?
Inferiores medios convencionales:
MRS Lb 3 04
Causa ?Macronutrientes ?
Láct
ico
(g
0
5
10
A/m
L)
45
60
0
5
10
45
60
A/m
L)Lá
ctic
o (g
MRS :Lc 1.04Pc 1.02
Lb 3.04
AA
(UA
0
15
30
152025
0
15
30
152025
res
(g/L
)A
A (U
A
res
(g/L
)
Rothe : Ec 1.01
8
12
05
10
eína
(g/L
)
8
12
0510
eína
(g/L
)
Azú
car
Azú
car
0 5 10 15 200
4
Tiempo (h)
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
Prp
te
0
4
0 5 10 15 20
Prp
te
Objetivo 2.1: Producción de bacterias lácticas
Cultivos batch
Causas de las bajas producciones en suero:
Cultivos batch
C1. Carencia de algún micronutriente esencial
2. Fuente de nitrógeno y carbono inadecuadas si se comparan con medios complejos. Solución ?
3. pH inadecuado
4. Acumulación de sustancias antimicrobianas
(ácidos orgánicos y bacteriocinas)
Objetivo 2.1: Producción de bacterias lácticas
Cultivos batchCultivos batch
Causas de las bajas producciones en suero:
C1. Carencia de algún micronutriente esencial
2. Fuente de nitrógeno y carbono inadecuadas si se comparan con medios complejos.
3. pH inadecuado
4. Acumulación de sustancias antimicrobianas
Estrategias operativas:
(ácidos orgánicos y bacteriocinas)
1. Cultivos realimentados con sustratos concentrados
2. Realcalinizaciones sucesivas
3. Fuente de carbono: glucosa o lactosa
4 Sustituir parte del volumen de medio4. Sustituir parte del volumen de medio fermentado por medio fresco.
C Ai
Sustrato (suero de leche)
NaOH 5N
Cepa Aire
pH7
de leche)
30ºC7 pHi= 7
0,5 L de aire/h200 rpm
AT20
t(h)12 24 Suero de leche
EPM
p
20
t(h)
Muestra
t(h)12 24
V de muestra = V de adición
Objetivo 2.1: Producción de bacterias lácticas
Cultivos realimentados realcalinizados
Cultivos realimentados realcalinizados:
• Diferentes medios de fermentaciónCaracterísticas intrínsecas de cada cepa
• Diferentes medios de realimentación
• Diferentes estrategias operativas
p
Necesidades de producciónDiferentes estrategias operativas
Objetivo 2.1: Producción de bacterias lácticas
Cultivos realimentados realcalinizados
Características generales:7
8
7
8Pc 1.02 Lc 1.04 Lb 3.04 Ec 1.01
H t lá ti (P )
1. Fermentaciones:4
5
6
4
64
5
6
4
6
pH(g
/L)
(g/L
)pH
Heteroláctica (Pc)
Homoláctica (Lb)Mixta (Lc y Ec)
3 Fuentes de N y P no se agotaron
0
2
4
40
60
0
2
4
40
60LácticoAcéticoEtanol
LácticoAcéticoEtanol
LácticoAcéticoEtanol
Bio
mas
a (g
/L)
(g/L
)B
iom
asa
2. Acumulación de lactosa. Consumo preferente de glucosa
3. Fuentes de N y P no se agotaron totalmente
4. Pérdida paulatina en la capacidad d d i l H
0
20
40
600
0
20
40
456075
Butanodiol
Láct
ico
(U
A/m
L)
UA
/mL)
Láct
ico
(
60
90
de reducir el pH
5. Rendimientos producto/biomasa superiores. Biomasa más productiva
0
300
152025
0153045
152025
Lactosa
Glucosa
AA
(U
ares
(g/L
)A
A (U
ares
(g/L
)
0
30
p p
6. Rendimientos producto/sustrato inferiores. Mayor consumo azúcares
8
12
05
10
8
12
0510
Glucosaeí
na (g
/L)
eína
(g/L
)
Azú
c a
Azú
ca
6. Eficiencias en cuanto al consumo de sustrato superiores0 50 100 150 200
0
4
50 150 250 50 150 250 3500
4
0 50 100 150 200
Tiempo (h)
Prp
te
Prp
te
Objetivo 2.1: Producción de bacterias lácticas
Cultivos realimentados realcalinizados
En conclusión:7
8
7
8Pc 1.02 Lc 1.04 Lb 3.04 Ec 1.01
• elevar rendimientos y eficiencias
• prolongar el periodo productivo
4
5
6
4
64
5
6
4
6
pH(g
/L)
(g/L
)pH
• prolongar el periodo productivo
• Eliminan los tiempos de parada, limpieza y carga
0
2
4
40
60
0
2
4
40
60LácticoAcéticoEtanol
LácticoAcéticoEtanol
LácticoAcéticoEtanol
Bio
mas
a (g
/L)
(g/L
)B
iom
asa
• Cultivos más concentrados0
20
40
600
0
20
40
456075
Butanodiol
Láct
ico
(U
A/m
L)
UA
/mL)
Láct
ico
(
60
90
producciones muy superiores a
las de cultivos batch
Estrategia adecuada para producir
postincubados concentrados0
300
152025
0153045
152025
Lactosa
Glucosa
AA
(U
ares
(g/L
)A
A (U
ares
(g/L
)
0
30
8
12
05
10
8
12
0510
Glucosaeí
na (g
/L)
eína
(g/L
)
Azú
c a
Azú
ca
0 50 100 150 2000
4
50 150 250 50 150 250 3500
4
0 50 100 150 200
Tiempo (h)
Prp
te
Prp
te
Utili ió d h i t i l f l ió
Objetivo 2.2:
Utilización de harinas proteicas en la formulación de medios de cultivo para bacterias lácticas
Utilización de harinas proteicas en la formulación d di d lti b t i lá ti
Objetivo 2.2:
de medios de cultivo para bacterias lácticas
Fuentes: Harinas de soja y pescado
Aptitud promover crecimiento
Optimización extracción proteica
pH alcalinos [NaOH] 0-1,12 N Cultivos con los T(ºC)
[NaOH](N)
T[NaOH]
Valores naturalesValores codificadosNúm. Comb.
Temperaturas superiores ambiente
Rango: 30-74ºCextractos proteicos
521 1201 2675340,12-1-14700,121-13341-112701111
( C)(N)
Plan factorial rotable orden 2 (α=±1,267)
3 tiempos y 3 bacterias
520 560010520,56009300,56-1,26708740,561,267075200-1,2676521,1201,2675
( )
Variables dependientes:
Proteínas NitrógenoAzúcares totales
Ácido láctico
Actividad antimicrobiana520,560013520,560012520,560011520,560010
p Azúcares totalesTirosina Grado hidrólisis proteínas
Utilización de harinas proteicas en la formulación de medios de cultivo para b t i lá tibacterias lácticas
Harinas soja y pescado NaOH
Incubar 1h 150 rpm
SB1PrecipitadoCongelar alícuota
para análisisCentrifugar 4000 rpm/10’/4-8ºC
EliminarpH=7
N OH/HCl NNaOH/HCl 5N
Centrifugar 4000 rpm/10’/4-8ºC SB2 SLC + H2OdPrecipitado
EliminarMedio de cultivo
3,5 g/L Pr20 g/L AT
Utilización de harinas proteicas en la formulación d di d lti b t i lá ti
Objetivo 2.2:
Proteína Nitrógeno Tirosina
de medios de cultivo para bacterias lácticas
640
2,0
2,5
2
4
1,010
20
30
1 0
g/L
0,5
1,0
1,5
2,0
1,0
00,0
0,5
1,0
3040506070
NaOH (N
)
T (ºC)
0
0
0,0
0,5
1,0
3040506070
NaOH (N
)
T (ºC)
0,0
0,5
0,0
0,5
3040506070
NaOH (N
)
T (ºC))
20 0
25,0
30,0
t*6,
25
Proteína
Nt*6,25
5,0
10,0
15,0
20,0
g/L
pro
t y g
/L N
t
0,0
,
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Utilización de harinas proteicas en la formulación d di d lti b t i lá ti
Objetivo 2.2:
de medios de cultivo para bacterias lácticas
Proteína Nitrógeno Tirosina
640 2,5
2
4
6
1 010
20
30
1 0
g/L
0 5
1,0
1,5
2,0
1 0
g/L g/L
00,0
0,5
1,0
3040506070
NaOH (N
)
T (ºC)
00,0
0,5
1,0
3040506070
NaOH (N
)
T (ºC)
0,0
0,5
0,0
0,5
1,0
3040506070
NaOH (N
)
T (ºC)
Utilización de harinas proteicas en la formulación d di d lti b t i lá ti
Objetivo 2.2:
B
L)
40[N O H] 1 12 N
A
) 40
de medios de cultivo para bacterias lácticas
Tiro
sina
x10
(g/L
20
30
T = 74ºC [NaO H] = 1,12 N
Tiro
sina
x10
(g/L
20
30
30 40 50 60 70
Prot
eína
y
0
10
0,3 0,6 0,9 1,2
Pro
teín
a y
0
10
T (ºC)
30 40 50 60 70
[NaOH] (N)
0,3 0,6 0,9 1,2
a
A
a 0 08
0,10B
0 08
0,10
T = 74ºC [NaOH] = 1,12 N
irosi
na /
Prot
eína
irosi
na /
Pro
teín
a
0,04
0,06
0,08
0,04
0,06
0,08
T
[NaOH] (N)
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
Ti
0,00
0,02
T (ºC)
30 40 50 60 700,00
0,02
[NaOH] (N) T ( C)
Utilización de harinas proteicas en la formulación d di d lti b t i lá ti
Objetivo 2.2:
de medios de cultivo para bacterias lácticas
0,10
0,12
0,14
teín
a0,04
0,06
0,08
Tiro
sina
/ Pr
ot
0,00
0,02
0 00 0,25 0,50 0,75 1,0030405060
T
T (ºC) 0,00 ,
NaOH (N)T (ºC)
Cómo influyen los diferentes extractosen las producciones ?
Influencia de las fuentes de nitrógeno sobre producciones de Lb 3 04
Objetivo 2.2:
producciones de Lb 3.04
8 horas 16 horas 28 horas
Actividad antimicrobiana
13,2 UA/mL
15 15 158,2 UA/mL 9,8 UA/mL
5
10
5
10
5
10A
A (U
A/m
L)
AA
(UA
/mL)
0
0,00,5
1,0
3040506070
[NaOH]
T (ºC)
0
0,00,5
1,0
3040506070
[NaOH]
T (ºC)
0
0,00,5
1,0
3040506070[NaOH]
T (ºC)
3,4 UA/mL
Influencia de las fuentes de nitrógeno sobre producciones de Lc 1 04
Objetivo 2.2:
producciones de Lc 1.04
40
8 horas
40
16 horas
40
28 horas
20
30
40
na (U
A/m
L)
na (U
A/m
L)
20
30
20
30
na (U
A/m
L)
0
10
0,00,5
1,0
3040506070
Nis
in
[NaOH]N
isin
0
10
0,00,5
1,0
3040506070NaOH] 0
10
0,00,5
1,0
3040506070
Nis
in
[NaOH]304050
[Na
T (ºC)
3040 [Na
T (ºC)
3040 [Na
T (ºC)
Influencia de las fuentes de nitrógeno sobre producciones de Lc 1 04
Objetivo 2.2:
Actividad antimicrobiana
producciones de Lc 1.04
Lc 1.04 Lb 3.048 horas
40
8 horas
10
15
20
30
40
a (U
A/m
L)
UA
/mL)
0
5
0,00,5
1,0
40506070OH]
0
10
0,00,5
1,0
40506070
Nis
ina
NaOH]
AA
(U
0,03040506070
[NaOH]
T (ºC)
0,030405060
[NaO
T (ºC)
Influencia de las fuentes de nitrógeno sobre producción de ácido láctico por Lc 1.04
8 horas 16 horas 28 horas4,3 g/L
3
4
5
co (g
/L)
co (g
/L)
3
4
5
3
4
5
ico
(g/L
)
0
1
2
3
1 0
Láct
ic
Láct
ic
0
1
2
3
1,0 0
1
2
01,0
Láct
i
1,6 g/L0
0,00,5
1,0
3040506070[NaOH]
T (ºC)
0
0,00,5
,
3040506070
[NaOH]
T (ºC)
0,00,5
3040506070
[NaOH]
T (ºC)
Influencia de las fuentes de nitrógeno sobre producciones de Pc 1 02
Objetivo 2.2:
8 horas 16 horas28 horas
producciones de Pc 1.02
30
40
(UA
/mL)
30
40
(UA/
mL)
UA/
mL)
30
40
0
10
20
0,51,0
Pedi
ocin
a
OH]0
10
20
0,51,0
H]
Pedi
ocin
a
Pedi
ocin
a (
10
20
30
1,00,0
,
3040506070[NaOH]
T (ºC)
0,0,
3040506070[NaOH]
T (ºC)
00,0
0,5
3040506070
[NaOH]
T (ºC)8 horas 16 horas 28 horas4,33 g/L
1 5
2,0
2,5
3,0
co (g
/L)
ico
(g/L
)
1 5
2,0
2,5
3,0
tico
(g/L
)
4
5
6
0,0
0,5
1,0
1,5
0 00,5
1,0
06070
Láct
ic
OH]
Láct
i
0,0
0,5
1,0
1,5
0 00,5
1,0
506070 OH]
Láct
0
1
2
3
0,00,5
1,0
3040506070NaOH]
0,03040506070
[NaOH]
T (ºC)
0,03040506070
[NaOH]
T (ºC)
304050[NaO
T (ºC)
Influencia de las fuentes de nitrógeno sobre producciones de Pc 1 02
Objetivo 2.2:
producciones de Pc 1.02
Ácido láctico
8 horas 16 horas 28 horas8 horas
2
3,0
2 5
3,0
16 horas
6
28 horas4,33 g/L
1,0
1,5
2,0
2,5
Láct
ico
(g/L
)
Láct
ico
(g/L
)
1,0
1,5
2,0
2,5
Láct
ico
(g/L
)
2
3
4
5
0,0
0,5
1,0
0,00,5
1,0
3040506070[NaOH] 0,0
0,5
,
0,00,5
1,0
3040506070
[NaOH] 0
1
2
0,00,5
1,0
3040506070[NaOH]
T
2 g/L
T (ºC) T (ºC) T (ºC)
Utilización de harina de pescado como fuente de nitrógeno para suplementar SLD
Recapitulación:
Objetivo 2.2: Utilización de harinas proteicas…
Recapitulación:
1. La producción de bacteriocina y ácido láctico —en los medios suplementados con los extractos proteicos— aumentó respecto al SLD sin suplementar.
2. Un elevado grado de hidrólisis de la proteína estimula las durante las primeras horas de cultivo (p. ej. láctico por Lc 1.04 y Pc 1.02). Sin embargo proteínas menos hidrolizadas estimulan la producción a tiempos más largos. (p. ej. láctico y pediocina por Pc 1.02).
3. Cada una de las especies tiene requerimientos diferentes en cuanto a la naturaleza de la fuente de nitrógeno, y además estos requerimientos cambian en función del estado fisiológico edad de la célulaestado fisiológico —edad— de la célula
Incorporación de las bacterias lácticas l i
Objetivo 3:
a los piensos
Producción de probióticos: Efecto simbiótico de los productos de la fermentación
Nisina Láctico Acético 2,3-butanodiol
p
-1 -1 -1 -1
-1 -1 -1 1
-1 -1 1 -1
-1 -1 1 1
-1 1 -1 -1
-1 1 -1 1
-1 1 1 -1
-1 1 1 1
1 -1 -1 -1
1 -1 -1 1
1 -1 1 -1
1 -1 1 1
1 1 1 11 1 -1 -1
1 1 -1 1
1 1 1 -1
1 1 1 1
0 10 20 30 40 50 60
Unidades de Actividad
1 1 1 1
Producción de probióticos: Efecto del almacenamiento a -20ºC con leche descremeda en polvo (30% (p/v))
Ent. faecium
Ped. acidilactici L. lactisLact. casei
Producción de probióticos: Supervivencia en pienso a temperatura ambientep
Ped. acidilactici L. lactisEnt. faecium Lact. casei
D t i ió d l t l i l t t
Objetivo 3.4:
Determinación de la tolerancia al tracto gastrointestinal
Tolerancia a las condiciones ácidasObjetivo 3.4:
Pc 1 02 Lc 1 04
Tolerancia a las condiciones ácidas
Pc 1.02
L)8
10Lc 1.04
L)
8
10
log
(ufc
/mL
2
4
6
log
(ufc
/mL
2
4
6
pH 1pH 1
0 0Lb 3.04
10Ec 1.01
10
ufc/
mL)
4
6
8
ufc/
mL)
4
6
8
pH 1pH 1
log
(
0
2
4
log
(
0
2
4pH 1pH 1
Tiempo (h)0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5
Tolerancia a las condiciones gastrointestinales
Objetivo 3.4:
Condiciones gástricas (Pepsina y NaCl pH 2)
g(u
fc/m
L)
6
8
10
(ufc
/mL)
6
8
10
Pc 1.02
0 50 100 150
log
0
2
4
Lc 1.04
0 50 100 150
Lb 3.04
0 50 100 150
Ec 1.01
0 50 100 150 200
log
0
2
4
mL) 8
10
mL)8
10
Condiciones intestinales (Pancreatina y NaCl pH 8)
log
(ufc
/m
2
4
6
log
(ufc
/m
2
4
6
Pc 1.02 Lc 1.04 Lb 3.04 Ec 1.01
Tiempo (h)
0 100 200 3000
0 100 200 300 0 100 200 300 0 100 200 300 4000
ControlControl
Con enzimas
Evaluación del potencial probiótico en
Objetivo 4:
Evaluación del potencial probiótico en monogástricos (lechones y pollos)
4.1 Potencial probiótico en lechones
4.2 Potencial probiótico en pollos
Índices productivos:
• Recuentos en microbiota intestinal (microbiología clásica)
I t d• Índices productivos: Incremento de peso
Velocidad de crecimiento
Consumo
Índice de conversión
Evaluación del potencial probiótico en á t i l h
Objetivo 4.1:
Ensayo 1
• Tratamiento A: pienso blanco
Ensayo 2
• Tratamiento A: pienso blanco
monogástricos: lechones
• Tratamiento A: pienso blanco
• Tratamiento B: pienso con Pc 1.02
• Tratamiento C: pienso con Ec 1.01
• Tratamiento A: pienso blanco
• Tratamiento B: pienso con Lb 3.04
• Tratamiento C: pienso con Lc 1.04
Ensayo 1
p
• Tratamiento D: pienso con colistina
p
• Tratamiento D: pienso con colistina
Ensayo 2
ecto
al c
ontro
l
110
1150 días14 días28 días42 días
c/g)
6
9
ecto
al c
ontro
l
110
115
c/g)
6
90 días14 días28 días42 días2
6%
% d
e pe
so re
spe
100
105 log
(uf
0
3
% d
e pe
so re
spe
100
105log
(ufc
0
3%
5%0 10 20 30 40 Control EcPc Colistina
Tiempo (d)
00 10 20 30 40 50Control LbLc Colistina
Tiempo (d)
0 5%
Evaluación del potencial probiótico en á t i l h
Objetivo 4:
monogástricos: lechones
Lb 3.04 potencial probiótico ?
Evaluación del potencial probiótico en á t i l h
Objetivo 4:
monogástricos: lechonesEnsayo 3
• Tratamiento A: pienso blanco
• Tratamiento C: pienso con avilamicina
• Tratamiento A: pienso blanco
• Tratamiento B: pienso con Lb 3.04
Tratamiento C: pienso con avilamicina
ntro
l 108 6%sp
ecto
al c
on
104
106%
de
peso
res
100
102
Tiempo (d)
0 15 30 45
% 100
Experimental Postadministración
Evaluación del potencial probiótico en
Objetivo 4.2:
Evaluación del potencial probiótico en monogástricos ( pollos)
Evaluación del potencial probiótico en á t i ll
Objetivo 4.2:
monogástricos: pollos
Ensayo 4
• Tratamiento A: pienso blanco
• Tratamiento B: pienso con Lb 3.04
• Tratamiento C: pienso con Lc 1.04
• Tratamiento D: pienso con avilamicina
Ausencia efecto probiótico Metodología: Jaulas
Evaluación del potencial probiótico en condiciones de estrés nutricional
Objetivo 4.2:
en condiciones de estrés nutricional
Cama de viruta Número de animales por réplica es elevado
Facilita la transmisión de patógenosNuevo experimento:
Estrés nutricional Pienso a base de trigo y cebada
Aumentar la viscosidad intestinalAumentar la viscosidad intestinal
Potenciar la maortalidad producida por Clostridium
Pollos broiler
Evaluación del potencial probiótico en di i d t é t i i l
Objetivo 4.2 :
condiciones de estrés nutricional
Índice de conversión 3 Blanco
2
Lb 3.04Lc 1.04
1
Avilamicina
1
0
0-8
8-16
16-2
5
25-3
1
0-16
0-25
0-31
0-8
8-16
0-31
T iem po (d)
Evaluación del potencial probiótico de Lactobacillus caseib t i i l d i t d l i t ti d lly una bacteria aislada previamente del intestino de pollo
Evaluación del potencial probiótico de Lactobacillus casei y una bacteria aislada previamente del intestino de pollointestino de pollo
Enterococcus sp. Lactobacillus casei
(bacteria aislada de intestino de pollo)
(ligero efecto probiótico)
Efecto sinérgico
intestino de pollo)
Ensayo 6
• Tratamiento A: pienso blanco, trigo y cebada
• Tratamiento B: pienso probiótico, Lb 3.04 y Enterococcus sp. Tratamiento B: pienso probiótico, Lb 3.04 y Enterococcus sp.
• Tratamiento C: pienso probiótico acidificado, fórmico 0, 25%
T t i t D i idifi d• Tratamiento D: pienso acidificado
Evaluación del potencial probiótico de Lactobacillus casei y una bacteria aislada previamente del intestino de pollode pollo
19% 18
cont
rol
120
125
10
14%
%%
BlancoProbiótico
resp
ecto
al
110
115
%
Probiótico y fórmico
Fórmico
% d
e pe
so
100
105
110
11%7%
Tiempo (d)
0 15 30 45
100
Evaluación del potencial probiótico en monogástricos. En conclusión:en monogástricos. En conclusión:
La administración de piensos probióticos suplementados al 2% con La utilización de antibióticos para mejorar la salud y el crecimiento postincubados de bacterias lácticas (dosis 109) puede aumentar los
índices productivos en pollos y lechones.de pollos y cerdos puede reducirse mediante la suplementación
de los piensos con bacterias lácticas
Técnicas de biología molecular para el estudio de la microbiota intestinal
Técnicas de biología molecular para el estudio de la microbiota intestinalde la microbiota intestinal
O ti i ió 1 P j d b dF357GC/R518 Amplifican ADNr 16S Optimización: 1. Pareja de cebadoresF968GC/R1401
pDominio Bacteria
2. Concentración de ADN molde
F357GC/R518 F968GC/R1401 F357GC/R518
Técnicas de biología molecular para el estudio d l i bi t i t ti l
Objetivo 4:
de la microbiota intestinal
Optimización: 1. Pareja de cebadores (F357GC/R518)
2. Concentración de ADN molde
3. Porcentajes desnaturalizantes
40% 65%40%
60%
Técnicas de biología molecular para el estudio de la microbiota intestinalde la microbiota intestinal
DGGE
Índice de biodiversidad de Shannon Weaver
Índice de Shannon- Weaver: 3,0Índice de Shannon Weaver:
H = - [ pi . Ln (pi) ]2,5
Pi: proporción de la comunidad representada por especies i
H´
1,5
2,0
5 10 15 20 251,0
Com nidades con Tiempo (d)Comunidades con igual diversidad
peropero
Estructura completamente diferente de especiesdiferente de especies
Análisis cluster de la biodiversidad
Í di d i ilit d d Di
2nAB
Índice de similitud de Dice:
SD =nA+ nB Algoritmo de la media aritmética o
promedio entre grupos (UPGMA)
nA y nB son el número total de bandas en los perfiles A y B
n es el número de bandas comunesnAB es el número de bandas comunes a A y B
Algoritmo de la media aritmética (UPGMA)
Análisis cluster de la biodiversidad
8 dí Índice de similitud de Dice:8 días
Análisis cluster de la biodiversidad
18 días
Existen varios perfiles de bandas asociados al consumo de un determinado tipo de pienso
Algoritmo de la media aritmética (UPGMA)
Índice de similitud de Dice:
Análisis cluster de la biodiversidad
23 dí23 días
Secuenciación de bandas características
1 Bacillus fragilis 99%1. Bacillus fragilis 99%
3. Lactobacillus johnsonii 99% o Lactobacillus gasseri 98%g
5. Lactobacillus crispatus 99% Lactobacillus
casei
6. Lactobacillus salivarius con 100%
7. Ruminococcus hydrogenotrophicus con 100%hydrogenotrophicus con 100%
10. 98% de identidad con una bacteria de colon de pollo no cultivable.p
Secuenciación de bandas características
Bacterias estructurales:
1. Bacillus fragilis 99%
5 L t b ill i t 99%Lactobacillus
casei
5. Lactobacillus crispatus 99%
10. Bacteria no cultivable de colon de pollo con 98% de identidad.
Bacterias funcionales:
3. Lactobacillus johnsonii 99% o Lactobacillus gasseri 98%
6. Lactobacillus salivarius con 100%
7. Ruminococcus hydrogenotrophicus con 100%hydrogenotrophicus con 100%
Secuenciación de bandas características
Bacteria aislada de intestino de pollo
Lactobacilluscasei
Enterococcus sp.
Enterococcus durans
Enterococcus ratti
Enterococcus faecium
Enterococcus hirae
Comprobación de la capacidad de colonización
Pueden colonizar el intestino ?
Responsable mejoras í di d ti ?índices productivos ?
Enterococcus sp. Lactobacillus casei
Bacteria aislada deBacteria aislada de intestino de pollo adulto
Técnicas de biología molecular para el estudio de la microbiota intestinalde la microbiota intestinal
Desenvolvimiento de un método molecular para evaluar el
Nuevo proyecto titulado:
Desenvolvimiento de un método molecular para evaluar el efecto de los ácidos orgánicos sobre la microbiota intestinal en pollos
Financiado por:: Empresa Coren SCL
Xunta de Galicia
Nueva colaboración:
Departamento de Microbiología de la Universidad de Wageningen (Holanda)
CC
Producción de péptidos con acción antihipertensiva a partir de sueros de quesería
Universidad de Vigo
OOb 1) Puesta a punto de un método espectrofotométrico para la determinación
de la actividad de la ECA.
je
2) Selección de condiciones óptimas de hidrólisis de las proteínas séricasutilizando distintas proteasas y concentraciones de las mismas, tiempos ytemperatura de hidrólisise
ti
temperatura de hidrólisis.
3) Caracterización de los hidrolizados proteicos mediante determinación delíndice IC50 (concentración proteica necesaria para inhibir el 50% de la
iv
50actividad de la ECA) determinado a partir de modelos matemáticos dosis-respuesta.
os
Puesta a punto de un método espectrofotométrico para la determinación de la
ti id d d l ECAactividad de la ECA
Método descrito por Shalaby et al. (2006) N-[3-(2-Furil) acriloil]-L-fenilalanil-glicil-glicina (FA-PGG)
ECAFA-Phe-Gly-Gly FA-Phe + Gly-GlyFA Phe Gly Gly FA Phe + Gly Gly
1.7
pte con inhibidor
1.7
1.6
1.65
ncia (3
40 nm)
pte con inhibidor
1.6
1.65
ncia (3
40 nm)
1.5
1.55
Absorba
n
pte control (ECA)1.5
1.55
Absorba
n
1.45
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Tiempo (min)
1.45
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Tiempo (min)
% IECA= [1 – (pte inhibidor / pte control)] x 100
Puesta a punto de un método espectrofotométrico para la determinación de la
ti id d d l ECA
1. Selección de la concentración óptima de ECA
actividad de la ECA
r2 = 0,975
Futuros ensayos: 0,25
U/mL
r2 = 0,995
r2 = 0,990
● 1 U/mL ● 0,5 U/mL ○ 0,25 U/mL
,99
Puesta a punto de un método espectrofotométrico para la determinación de la
ti id d d l ECA
2. Selección de la concentración óptima de sustrato (FA-PGG)
actividad de la ECA
r2 = 0,990
Futuros ensayos:
r2 = 0,974
ensayos: 1,75 mM
● 1,75 mM ● 0,88 mM
Puesta a punto de un método espectrofotométrico para la determinación de la
ti id d d l ECA
3. Validación del método
actividad de la ECA
Captopril (D-3-mercapto-2-metilpropanoil-1-prolina)
Rango de concentraciones: 0,0028 μM-0,34 μM
IC50 = 0,08 μM
4,71 nM en el ensayo
Prácticamente igual al obtenido por Shalaby et al.
(2006) = 4,10 nM
OOb 1) Puesta a punto de un método espectrofotométrico para la determinación
de la actividad de la ECA.
je
2) Selección de condiciones óptimas de hidrólisis de las proteínas séricasutilizando distintas proteasas y concentraciones de las mismas, tiempos ytemperatura de hidrólisise
ti
temperatura de hidrólisis.
3) Caracterización de los hidrolizados proteicos mediante determinación delíndice IC50 (concentración proteica necesaria para inhibir el 50% de la
iv
50actividad de la ECA) determinado a partir de modelos matemáticos dosis-respuesta.
os
Actividad inhibitoria del suero frescofresco
Como paso previo al estudio de proteólisis con enzimas comerciales, se determinóp p pla actividad inhibitoria del suero deslactosado procedente de la empresa QUEIZÚARS.L. (A Coruña, España).
[Proteína] inicial del suero: 58 mg/mL
IC50 = 5431 μg/mL
IC50 captopril = o,o17 μg/mL(0,08 μM) ( , μ )
IC50 péptidos antihipertensivos = o,17-890 μg/mL
Actividad inhibitoria del suero frescofresco
Como paso previo al estudio de proteólisis con enzimas comerciales, se determinóp p pla actividad inhibitoria del suero deslactosado procedente de la empresa QUEIZÚARS.L. (A Coruña, España).
[Proteína] inicial del suero: 58 mg/mL
Necesidad de un proceso de hidrólisis que permitiera la liberación de péptidos con actividad inhibitoria de
la ECAla ECA
Hidrólisis de suero fresco utilizando una proteasautilizando una proteasa
Proteínas del suero lácteo
Hidrólisis (in vitro)Enzimas digestivas:
- tripsinaEnzimas microbianas:
- proteinasa kli i
Péptidos antihipertensivos
- α-quimotripsina - termolisina
Enzima Tampón Tª pHp p
Tripsina Tris-HCl 0,02 M-CaCl2 0,01 M 37º C 8,0
Termolisina Tris-HCl 0,02 M-CaCl2 0,01 M 37º C 8,0 E/S: 1/20
Quimotripsina Tris-HCl 0,02 M 25 ºC 8,0
Proteinasa K Tris-HCl 0,02 M 37º C 7,5
Hidrólisis de suero fresco utilizando una proteasautilizando una proteasa
● TermolisinaTermolisina
∆ Proteinasa k
Tripsina
Q i i i○ α-Quimotripsina
Termolisina y proteinasa k: valores máximos (~50%)
Tripsina: máximo de inhibición a las 24h (52%)
α-Quimotripsina: %IECA < 40%
Hidrólisis de suero fresco utilizando una proteasautilizando una proteasa
Análisis in silico PeptideCutter (http: //www expasy ch/tools/peptidecutter) PeptideCutter (http: //www.expasy.ch/tools/peptidecutter)
Determinar el número de sitios potenciales de corte teóricos que podríangenerarse mediante hidrólisis de las proteínas mayoritarias del suero lácteogenerarse mediante hidrólisis de las proteínas mayoritarias del suero lácteobovino (α-La y la β-Lg) con las 4 proteasas
Proteína del lactosueroProteasa
Proteína del lactosueroα-La β-Lg
α-Quimotripsina 37 10Tripsina 12 18
Proteinasa K 61 84Termolisina 41 61
H l í i t t t l t ti d l t li i l ECA l Homología existente entre los centros activos de la termolisina y la ECA en los que únicamente encajan péptidos pequeños y carentes de estructura
tridimensional
Hidrólisis de suero fresco utilizando una proteasautilizando una proteasa
Análisis in silico PeptideCutter (http: //www expasy ch/tools/peptidecutter) PeptideCutter (http: //www.expasy.ch/tools/peptidecutter)
Determinar el número de sitios potenciales de corte teóricos que podríangenerarse mediante hidrólisis de las proteínas mayoritarias del suero lácteo
Proteína del lactosuero
generarse mediante hidrólisis de las proteínas mayoritarias del suero lácteobovino (α-La y la β-Lg) con las 4 proteasas
ProteasaProteína del lactosueroα-La β-Lg
α-Quimotripsina 37 10Tripsina 12 18
Proteinasa K 61 84Termolisina 41 61
Hidrólisis de suero pretratado térmicamentetérmicamente
Los tratamientos térmicos moderados tienden a aumentar la susceptibilidad delas proteínas a la hidrólisis enzimática particularmente en las proteínas séricaslas proteínas a la hidrólisis enzimática, particularmente en las proteínas séricas(muy compactas y estructuradas)
Una combinación adecuada de la proteasa y del tratamiento previo del suero puedeser un factor clave para obtener hidrolizados con ↑ actividad
Estudiar la influencia de un pretratamiento térmico del suero lácteo sobre la producción de inhibidores de la ECAproducción de inhibidores de la ECA
Hidrólisis de suero pretratado térmicamente
Proteínas del suero lácteo
térmicamente
Tratamiento térmico 70ºC – 60 min
Hidrólisis (in vitro)Enzimas digestivas:
- tripsinaEnzimas microbianas:
- proteinasa kli i
Péptidos antihipertensivos
α-quimotripsina - termolisina
Enzima Tampón Tª pHp p
Tripsina Tris-HCl 0,02 M-CaCl2 0,01 M 37º C 8,0
Termolisina Tris-HCl 0,02 M-CaCl2 0,01 M 37º C 8,0 E/S: 1/20
Quimotripsina Tris-HCl 0,02 M 25 ºC 8,0
Proteinasa K Tris-HCl 0,02 M 37º C 7,5
Hidrólisis de suero pretratado térmicamentetérmicamenteTratado (70ºC/1h) Sin tratar
Conformaciones glóbulo fundido: estructura terciaria poco definida g pquedando expuestas al medio zonas hidrófobas, que en el estado nativo de la
proteína quedaban ocultas en el interior
Hidrólisis de suero pretratado térmicamentetérmicamenteTratado (70ºC/1h) Sin tratar
Valores máximos: termolisina
Valores mínimos: α-quimotripsina
Hidrólisis de suero pretratado térmicamentetérmicamenteTratado (70ºC/1h) Sin tratar
El tratamiento térmico del suero no ofrecía ninguna mejora g jsignificativa cara lograr hidrolizados con mejores propiedades como
inhibidores de la ECA
Efecto de la relación E/S sobre la hidrólisis del suero
Proteínas del suero lácteo
la hidrólisis del suero
Hidrólisis (in vitro)Enzimas digestivas:- tripsina
Enzimas microbianas:- proteinasa k
li i
Péptidos antihipertensivos
- tripsina - termolisina
Enzima Tampón Tª pHE/S 1/5
p p
Tripsina Tris-HCl 0,02 M-CaCl2 0,01 M 37º C 8,0
Termolisina Tris-HCl 0,02 M-CaCl2 0,01 M 37º C 8,0
E/S: 1/5
E/S: 1/20
E/S: 1/100Proteinasa K Tris-HCl 0,02 M 37º C 7,5
/ /
Efecto de la relación E/S sobre la hidrólisis del suerola hidrólisis del suero
1/5
1/201/20
1/100
Muy sensible a la variación de la relaciónMuy sensible a la variación de la relaciónE/S
Efecto de la relación E/S sobre la hidrólisis del suerola hidrólisis del suero
1/5
1/201/20
1/100
Los valores de inhibición obtenidos con E/S de Los valores de inhibición obtenidos con E/S de 1/100 igualan a las concentraciones más altas
Un aumento de [proteasa] en el medio de Un aumento de [proteasa] en el medio de reacción no implica un aumento de la
actividad inhibitoria de la ECA
Futuros ensayos: 1/100
Efecto de la Tª de hidrólisis utilizando termolisinautilizando termolisina
El pretratamiento térmico (60ºC/1 h) sólo permitió mejorar la producción deinhibidores de la ECA a tiempos cortos de hidrólisis cuando se utilizó termolisinainhibidores de la ECA a tiempos cortos de hidrólisis cuando se utilizó termolisina
Las proteínas lácteas se renaturalizan durante el proceso de proteólisis (37ºC)
Realizar el proceso de hidrólisis a ↑ Tas , de tal modo que se integrasen el proceso de desnaturalización parcial y la proteólisis enzimática
Efecto de la Tª de hidrólisis utilizando termolisina
Proteínas del suero lácteo
utilizando termolisina
Hidrólisis (in vitro) TERMOLISINA(termoestable)
Péptidos antihipertensivos
(termoestable)
Enzima Tampón Tª pHp p
Termolisina Tris-HCl 0,02 M-CaCl2 0,01 M
37º C
50ºC
60ºC8,0 E/S: 1/100
70ºC
Efecto de la Tª de hidrólisis utilizando termolisinautilizando termolisina
50ºC37ºC 60ºC 70ºC
A 37ºC %IECA ctes.
Efecto de la Tª de hidrólisis utilizando termolisinautilizando termolisina
50ºC37ºC 60ºC 70ºC
65%65%
A 24 h 60 y 70ºC% IECA similaresA 24 h 60 y 70 C
IECA ↓
Termolisina se inactiva porque ↓ su
estabilidad estabilidad
Efecto de la Tª de hidrólisis utilizando termolisinautilizando termolisina
50ºC37ºC 60ºC 70ºC
↓ En menor medida ↓ En menor medida que a 60 0 70ºC
Estabilidad de la termolisina
comprometida por las comprometida por las ↑Tas
Efecto de la Tª de hidrólisis utilizando termolisinautilizando termolisina¿Estabilidad de la termolisina comprometida?¿Estabilidad de la termolisina comprometida?
termolisina termolisina E/S: 1/1003h 6h
/ /
60ºC
%IECA = 69,5% %IECA = 60%
La estabilidad de la termolisina disminuye tras 3 h a 60ºC
La producción de péptidos inhibidores de la ECA no se mejora mediante di ió d d i di i l d l iadición de una dosis adicional de la enzima
OOb 1) Puesta a punto de un método espectrofotométrico para la determinación
de la actividad de la ECA.
je
2) Selección de condiciones óptimas de hidrólisis de las proteínas séricasutilizando distintas proteasas y concentraciones de las mismas, tiempos ytemperatura de hidrólisise
ti
temperatura de hidrólisis.
3) Caracterización de los hidrolizados proteicos mediante determinación delíndice IC50 (concentración proteica necesaria para inhibir el 50% de la
iv
50actividad de la ECA) determinado a partir de modelos matemáticos dosis-respuesta.
os
Determinación de los valores ICIC50
ÚÚnicamente los hidrolizados que producían porcentajes de inhibición de la ECA máselevados
2 hidrolizados obtenidos con termolisina a 60ºC (relación E/S: 1/100)
3 h
doble adición de termolisina (9 h)
Con fines comparativos
Suero fresco
Captopril
Soluciones de [proteína] decreciente %IECA
Determinación de los valores ICIC50
No es posible una extrapolación directa
de la IC50
Ajustar los resultados Ajustar los resultados experimentales a
diferentes modelos matemáticos
Determinación de los valores ICIC50
Modelo logístico modificado por Murado et al., (2007) :g p
con
K: inhibición máxima aparente (%).
D: dosis (µg/mL o µM)
µ: velocidad específica de inhibición aparente (mL/µg o L/µmol)µ: velocidad específica de inhibición aparente (mL/µg o L/µmol)
m: IC50 aparente (µg/mL o µM).
IC50: concentración inhibitoria real (µg/mL o µM)
Determinación de los valores ICIC50
Combinación de enzimas Sustrato Variables ā ± DE t p r2
- Suero
K 58,78 ± 1,46 40,23 <0,0001
0,9841µ 0,0005 ± 0,00003 13,75 <0,0001M 5030,13 ± 127,38 39,49 <0,0001
IC50 (µg/mL) 5430,91K 90 95 ± 7 50 12 12 <0 0001
- Captopril
K 90,95 ± 7,50 12,12 <0,0001
0,9640µ 16,43 ± 1,21 13,57 <0,0001M 0,026 ± 0,010 2,61 0,0099
IC50 (µM) 0,08
T li iK 89,32 ± 8,66 10,31 <0,0001
0 0007 ± 0 0001 6 55 <0 0001Termolisina(3 h) Suero 0,8768µ 0,0007 ± 0,0001 6,55 <0,0001
M 1827,36 ± 318,10 5,74 <0,0001IC50 (µg/mL) 2541,26
Termolisina+ Suero
K 64,96 ± 9,71 6,69 <0,0001
0 9124µ 0,0030 ± 0,0006 5,04 <0,0001Termolisina
(9 h)
Suero 0,9124M 334,86 ± 102,70 3,26 0,0018IC50 (µg/mL) 549,54
Valores significativos (p < 0,05)
Determinación de los valores ICIC50
Errores experimentales
r2 = 0,984 r2 = 0,964r 0,984 r 0,964-Barras de error en
cada pto de muestreo
E l d - Empleo de un sustrato sensible a la
precipitación y/o agregación
r2 = 0,877 r2 = 0,912g g
Determinación de los valores ICIC50
IC50 = 5431 µg/mL IC50 = 0,08 µg/mL50 543 µg/ 50 , µg/
IC50 captopril << IC50 suero
IC50 = 2541 µg/mL IC50 = 550 µg/mL50 54 µg/ IC50 550 µg/mL
IC50 78,35% inferior
Determinación de los valores ICIC50
Resultados alentadores ya que permiten:
Reciclaje e incorporación del suero lácteo, en un proceso de
Resultados alentadores ya que permiten:
j p , pproducción, evitándose así las desventajas, que su vertimiento en los
sistemas ecológicos podrían producir
Obtención de hidrolizados proteicos con actividad inhibidora de la ECA, pque se pueden incorporar en alimentos funcionales
Conclusiones
1) Se puso a punto un método para determinar la actividad de la ECA utilizandocomo sustrato FA-PGG, optimizando la concentración de sustrato y de la enzimaen el medio de reacción.en el medio de reacción.
2) Se comprobó que los hidrolizados de suero lácteo con termolisina y proteinasa Kpresentaban mayor actividad inhibitoria de la ECA que los hidrolizados de
i i d i i i Ad á d i ó i dtripsina y de α-quimotripsina. Además se determinó que cortos tiempos dehidrólisis eran suficientes para obtener péptidos inhibidores de la ECA. La rapidezde acción unida a la especificidad hacia aminoácidos hidrófobos pudo serresponsable de la superior eficacia de las proteasas de origen microbiano.responsable de la superior eficacia de las proteasas de origen microbiano.
3) Un tratamiento térmico del suero, previo a la proteólisis, no ofrecía ningunamejora significativa en la producción de péptidos inhibidores de la ECA. Sin
b l ili li i li d l j lembargo, al utilizar termolisina como catalizador, se lograron mejorar losporcentajes de inhibición al aumentar la temperatura del proceso de proteólisishasta 60-70ºC.
Conclusiones
4) Se caracterizaron dos hidrolizados de suero lácteo obtenidos contermolisina mediante cálculo de la concentración proteica necesaria paratermolisina mediante cálculo de la concentración proteica necesaria parainhibir el 50% de la actividad de la ECA (IC50). Los valores de inhibiciónobtenidos a distintas concentraciones de proteína se ajustaron a una curvadosis-respuesta aplicando distintos modelos matemáticos. Los mejoresp p jajustes se obtuvieron aplicando un modelo logístico modificado porMurado et al. (2007).
5) Se comprobó que la sola utilización de termolisina durante 3 h producía5) Se comprobó que la sola utilización de termolisina durante 3 h producíaun hidrolizado con una IC50 de 2,54 mg/mL, que se reducía 5 vecescuando se realizaba una doble adición de termolisina (0,55 mg/mL). Estevalor aunque superior al del inhibidor comercial captopril (0,17 μg/mL),q p p p μgera inferior al del suero fresco sin tratar (5,5 mg/mL).
CC
Producción de péptidos con acción antihipertensiva a partir de sueros de quesería
Natalia Estévez TelleUniversidad de Vigo
Antecedentes: Experiencia previa:Fermentación de suero desproteinizado con gránulos de kéfir
Entrenamiento de Andrea Pataro, licenciada procedente del CIDCA y miembro de la red Red Iberoamericana 108RT0362 del Área de
MATERIA PRIMA: Suero dulce obtenido de la quesería Prado de Lugo, España.
miembro de la red Red Iberoamericana 108RT0362 del Área de agroalimentación del CYTED
COMPOSICIÓN:Lactosa: 34.7 g/LAzúcares reductores: 24.8 g/LAzúcares reductores: 24.8 g/LProteínas: 11.5 g/LpH inicial: 4.86
CONDICIONES DE CULTIVOCONDICIONES DE CULTIVO:
Medio de cultivo: Suero dulce, desproteinizadoTemperatura: 30ºCpAgitación: 200 rpmpH inicial: 6.5Tiempo fermentación: 80 horasI ó l 1 L l h f t d 0 5 K fiInóculo: 1 mL leche fermentada y 0.5 g KefirFermentador: Matraces de 250 mL de capacidad conteniendo 50 mL de medio decultivo
Antecedentes: Fermentación de suero desproteinizado congránulos de kéfir. Primeros resultados
5
6
7
1.0
1.5
3
4
5
0.5
1 5
2.0 9
2 0
Cinética de la f t ió d SLDdP
0.5
1.0
1.5
3
6 fermentación de SLDdP ( ) y leche ( ) con gránulos de kéfir.
45
60
0
4
0
15
302
00 20 40 60 80
Horas
00 20 40 60 80 1000 20 40 60 80
Horas
Antecedentes: Fermentación de suero desproteinizado tamponado, con gránulos de kéfir
5
6
1.10
1.65
Cinética de la fermentación del SLDdP
3
40.55
fermentación del SLDdP y tamponado a pH inicial de 6.5 con tampón biftalato-sosa 3 0
4.0 6
2 0
p(0.1 M), con gránulos de kéfir.
1.0
2.0
3.0
2
4
24
32
0
4
0
8
16
24
2
00 20 40 60 80
Horas
00 20 40 60 80 100
Antecedentes: Fermentación de suero desproteinizado congránulos de kéfir
Optimización de la composición del suero lácteo tamponado a pH inicial de 6.5 contampón biftalato sosa.
Fuente de N (extracto de carne, peptona bacteriológica y extracto de levadura) y
Tabla 1 Dominio experimental y valores utilizados en el plan ortogonal ensayado
( , p p g y ) y
Fósforo: K2HPO4
Tabla 1. Dominio experimental y valores utilizados en el plan ortogonal ensayadopara estudiar la influencia de las fuentes de N y P sobre la producción desustancias antimicrobianas y el crecimiento de los gránulos sobre suero lácteodesproteinizado y tamponado a pH inicial de 6.5.p y p p
Valores Codificados Valores Naturales
Fuente N (g/L) Fuente P (g/L)
-1.267 0.00 0.00
-1 2.32 0.21
0 11.01 1.00
1 19 70 1 791 19.70 1.79
1.267 22.00 2.00
Antecedentes: Optimización: Resultados
Antecedentes: Resultados del plan factorial. Modelos
11.. CrecimientoCrecimiento deldel gránulogránulo (PSG(PSG enen g)g)::11.. CrecimientoCrecimiento deldel gránulogránulo (PSG(PSG enen g)g)::
PSG = 0.046 + 0.008*N + 0.006*P – 0.002*N*P – 0.006*N2 – 0.005*P2
Óptimos: N = 0.528 (18.79 g/L) y P = 0.487 (1.38 g/L), Ymax = 0.05 g
2 Producción de Acido Láctico (AL en g/L):2 Producción de Acido Láctico (AL en g/L):2. Producción de Acido Láctico (AL en g/L):2. Producción de Acido Láctico (AL en g/L):
[AL] = 5.66 + 0.53*N + 0.53*P – 0.55*P^2
Óptimos: N = 1.267 (22.00 g/L) y P = 0.47 (1.37 g/L), ALmax = 6.5 g/L
Producción de Ácido acético (AA en g/L):Producción de Ácido acético (AA en g/L):
[AA] = 22.06 + 1.76*N + 2.77*P – 6.91*N^2 (2)[ ] ( )
Óptimos: N = 0.127 (12.12 g/L) y P = 1.267 (2.00 g/L), AAmax = 25.7 g/L
[N]media = 17.64 g/L; [P]media = 1.58 g/L
Antecedentes: Fermentación de suero desproteinizado congránulos de kéfir. Efecto de la agitación y la aereación
Efecto de la agitación y la aireación (T = 30ºC; t = 80 h)
Series Vol. Matraz(mL)
Vol. Suero (mL)
Inóculo Agitación (rpm)
1 250 50, pH 6.5 0.5 g kéfir 1 mL lechefermentada
200
2 250 100, pH 6.5 1.0 g kéfir 2 mL lechefermentada
0 a 24hs: 20024 a 48 hs: 0
48 a 72hs: 20072 a 96hs: 0
3 150 90, pH 6.5 0.9 g kéfir 1.8 mL lechef t d
0
fermentada
Antecedentes: Fermentación de suero desproteinizado congránulos de kéfir. Resultados
6
7
3
4
5
1.0
1.5
4
6
8
3
Serie 1
32
0
0.5
0
2
4 Serie 1Serie 2Serie 3
8
16
24
32
9
18
27
0
8
0 20 40 60 80Horas
0
9
0 20 40 60 80 100
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