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TRAVAIL DE DIPLÔME
« Unité de toxicologie et de chimie forensique au Centre Universitaire Romand de Médecine Légale »
DÉVELOPPEMENT ET VALIDATION D’UNE MÉTHODE POUR LA QUANTIFICATION DES NEUROLEPTIQUES PAR
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE ET SPECTROMÉTRIE DE MASSE EN TANDEM (LC-MS/MS)
Aurore Cretignier
Tab 51ème volée
Lausanne le, 23 avril 2012
Responsables : Dr. Marc Augsburger, Dr. Frank Sporkert, Mme Catherine MeylanBohnenblust
SOMMAIRE
Les neuroleptiques sont dosés au Centre Universitaire Romand de Médecine Légale pour deux raisons principales : la recherche pour les causes de décès ainsi que dans les cas de contrôle routier chez les personnes vivantes.
Les neuroleptiques ou antipsychotiques sont des médicaments utilisés principalement pour les troubles du comportement comme la schizophrénie. Ces substances jouent un rôle sur le système nerveux central en agissant sur les neurotransmetteurs comme la dopamine, l’adrénaline et la sérotonine. Ce sont des molécules basiques liposolubles passant par la voie hépatique afin d’être métabolisé et par la suite éliminé par les reins.
Les neuroleptiques sont analysés dans le sang par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem. Une méthode de quantification existante a été optimisée afin de détecter spécifiquement notre panel de 24 substances présentes sur le marché suisse. L’échantillon nécessite une extraction sur phase solide et le mode de détection se fait par electro spray ionization en mode positif. Notre méthode est partiellement validée mais a déjà pu faire l’objet d’un dosage en routine.
ABSTRACT
The neuroleptics are measured out at the University of forensic medicine for two main reasons : the research of the cause of death and the traffic check at the alive persons.
The neuroleptics or antipsychotics are used for the behavior disorders as schizophrenia. These substances influence the central nervous system by acting on neurotransmitters as dopamine, adrenalin and serotonin. They are liposoluble basic molecules passing by the hepatic way to be metabolized and eliminated by loins.
The neuroleptic are analyzed in the blood by liquid chromatography and mass spectrometry in tandem. An existing method of quantification was optimized to detect specifically our panel of twenty-four substances present on the Swiss market. The sample requires an extraction on solid phase and the mode of detection is made by electro spray ionization in positive mode. Our method is partially validated but was already measured out in routine work.
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TABLE DES MATIERES
1 INTRODUCTION ............................................................................................................ 3
1.1 But du travail .......................................................................................................... 3
2 PARTIE THEORIQUE .................................................................................................... 4
2.1 Historique............................................................................................................... 4
2.2 Indications thérapeutiques ..................................................................................... 4
2.3 Classification selon Delay et Deniker ..................................................................... 5
2.4 Statistiques en Suisse ............................................................................................ 5
2.5 Pharmacodynamique ............................................................................................. 5
2.6 Mode d’action ........................................................................................................ 6
2.7 Pharmacocinétique ................................................................................................ 6
2.8 Métabolisation et élimination .................................................................................. 7
2.9 Effets indésirables .................................................................................................. 7
3 GENERALITES SUR LES NEUROLEPTIQUES ............................................................ 8
3.1 Classification .......................................................................................................... 8
4 GENERALITES LC-MS/MS ..........................................................................................12
4.1 Spectrométrie de masse .......................................................................................12
4.2 Chromatographie ..................................................................................................12
4.3 LC-MS/MS ............................................................................................................12
4.4 Ionisation ..............................................................................................................14
4.5 Choix analytiques ..................................................................................................15
4.6 Séparation Q0/Q1/Q2/Q3 ......................................................................................15
4.7 Détecteur ..............................................................................................................16
4.8 Avantages analytique par LCMS-MS ...................................................................16
5 PARTIE PRATIQUE ......................................................................................................17
5.1 Matériel biologique ................................................................................................17
5.2 Instruments ...........................................................................................................17
5.3 Matériel de Laboratoire .........................................................................................18
5.4 Réactifs .................................................................................................................18
5.5 Solutions ...............................................................................................................20
6 QUANTIFICATION DES NEUROLEPTIQUES ..............................................................20
7 INFUSIONS ...................................................................................................................21
8 PARAMETRES ANALYTIQUES DE LA METHODE .....................................................21
8.1 Paramètres LC initiaux ..........................................................................................22
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8.1.1 Résultat ...........................................................................................................22
8.1.2 Sélectivité ........................................................................................................24
8.1.3 Sélectivité ou Influence de la matrice ..............................................................24
8.2 Droites de calibration ............................................................................................25
8.2.1 Choix des Standards internes .........................................................................26
8.2.2 Choix du standard interne en fonction du standard .........................................27
8.2.3 Résultats de la sélectivité ................................................................................28
8.3 Sensitivité en fonction de l’extraction et du volume de la matrice ..........................29
8.4 Résultats ...............................................................................................................29
9 VALIDATION ................................................................................................................41
9.1 Droite 500 µl d’échantillon sans extraction ...........................................................43
9.2 Droite 200 µl avec extraction .................................................................................44
10 RENDEMENT D’EXTRACTION ....................................................................................44
10.1 Résultats ...............................................................................................................45
10.2 Tableaux récapitulatifs ..........................................................................................45
11 CONTROLES DE QUALITE INTERNE .........................................................................46
11.1 Résultats ...............................................................................................................47
12 CONCLUSION ..............................................................................................................48
13 PERSPECTIVES D’AMELIORATION ...........................................................................48
14 REMERCIEMENTS .......................................................................................................49
15 GLOSSAIRE .................................................................................................................50
16 REFERENCES ..............................................................................................................51
17 ICONOGRAPHIE ..........................................................................................................54
18 ANNEXE 1 PROTOCOLE 1 : PREPARATION DES SOLUTIONS ...........................55
19 ANNEXE 2 RESULTAT DES INFUSIONS ...............................................................57
20 ANNEXE 3 MODIFICATIONS DES PARAMETRES DE LA METHODE ..................58
21 ANNEXE 4 MELANGE DE SUBSTANCES ..............................................................60
22 ANNEXE 5 RESULTATS CHIFFRES DE LA SELECTIVITE ....................................61
23 ANNEXE 6 METHODE D’EXTRACTION DES NEUROLEPTIQUES ........................62
24 ANNEXE 7 METHODE D’EXTRACTION DES OPIACES.........................................63
25 ANNEXE 8 RESULTATS DE LA VALIDATION .......................................................65
26 ANNEXE 9 RESULTATS DES DROITES DE REGRESSION ..................................66
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1 INTRODUCTION [1] [2] [3]
Durant la période de stage datant du 31.10.2011 au 06.04.2012 à l’unité de toxicologie et chimie forensiques au Centre Universitaire romand de Médecine Légale, j’ai développé une méthode pour la recherche et la quantification des neuroleptiques dans le sang par chromatographie liquide et par spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS).
Les neuroleptiques ou antipsychotiques sont utilisés dans le cas de troubles confusionnels comme la schizophrénie, les psychoses, les troubles bipolaires. Ces médicaments permettent également de limiter les réactions parfois violentes engendrées par ces pathologies. Il existe trois groupes principaux d’antipsychotiques :
Phénothiazines neuroleptiques sédatifs
Butyrophénones neuroleptiques anti-hallucinatoires et sédatifs
Benzamides neuroleptiques désinhibiteurs
Les neuroleptiques agissent sur les zones du cortex principalement sur le système dopaminergique en diminuant la production de dopamine. Ces substances possèdent également des effets sur la noradrénaline et la sérotonine.
La méthode utilisée pour la détection de ces médicaments est la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem. Cette technique permet la séparation des différentes molécules par ionisation ainsi qu’une fragmentation précise pour une reconnaissance spécifique.
1.1 But du travail [4]
Les antipsychotiques interfèrent systématiquement les analyses évaluant l’aptitude à conduire mais également la capacité de discernement. Leurs effets secondaires provoquent des somnolences, des assoupissements et des troubles de la vision. Au Centre Universitaire romand de Médecine Légale, les neuroleptiques sont analysés pour deux raisons principales : la recherche des causes de décès et dans le cas de contrôles routiers chez les personnes vivantes. Mon but premier est de standardiser une méthode existante pour l’olanzapine, l’halopéridol et le rispéridone en un procédé regroupant un panel défini d’antipsychotiques présents sur le marché suisse. La méthode analytique par LC-MS/MS permet un traitement simplifié de l’échantillon ainsi qu’une réduction du temps d’analyse.
Fig.1 Action sur le système dopaminergique
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2 PARTIE THEORIQUE
2.1 Historique [5] [6]
1883 Les neuroleptiques sont développés comme colorants synthétiques
1949 Les phénothiazines attestent un effet inhibiteur sur la capacité physique des rats
1950 Synthétisation de la Chlorpromazine comme anesthésiant
1954 Observation : la chlorpromazine provoque des symptômes semblables à la maladie de Parkinson
1960 Découverte d’une réaction toxique potentiellement mortelle appelée syndrome malin des neuroleptiques (cf. 2.9 Effets indésirables).
1963 Découverte de l’efficacité des antipsychotiques contre la schizophrénie
1979 Jusqu’à 50% des patients développent une dyskinésie tardive (Cf. 2.9 Effets indésirables) suite à la prise de ces médicaments.
1994 Les chercheurs découvrent que les antipsychotiques engendrent une hypertrophie de la région caudale du cerveau
1998 L’usage fréquent des neuroleptiques provoquent des dégâts neurologiques
La prise simultanée de plusieurs neuroleptiques peut provoquer une mort prématurée
2.2 Indications thérapeutiques [7]
Personnes âgées : tremblements, excitation psychomotrice
Enfants : troubles du comportement
Tous : schizophrénies, psychoses, confusions mentales, dépressions, agressivité
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2.3 Classification selon Delay et Deniker [8] [9]
M. Delay psychiatre et son assistant M. Deniker ont proposé en 1957 une définition des neuroleptiques. La théorie définie par ces deux hommes devenus pharmacologues est toujours applicable de nos jours.
Création d’un état d’apathie motrice et psychique
Efficacité dans des états de surexcitation
Réduction des perturbations psychotiques
Production de syndromes tels que des tremblements, de la rigidité musculaire, d’une lenteur extrême des mouvements ainsi que des troubles neurovégétatifs
Effet sur les régions sous corticale du cerveau
2.4 Statistiques en Suisse [10]
Selon les statistiques, en 2008, sur 83 millions de diagnostics médicaux, 11% des cas concernent des troubles mentaux et comportementaux. La majorité des maladies psychiatriques en particulier les schizophrénies et les dépressions sont traitées par des médicaments et 27% d’entre-elles le sont par des antipsychotiques. Les neuroleptiques sont les médicaments prescrits en troisième position après les antidépresseurs et les tranquillisants.
2.5 Pharmacodynamique [11] [12] [13]
Lors de troubles psychotiques, l’influx nerveux entre les synapses, de nature électrique est perturbé. L’information entre les neurones ne se fait plus correctement et le potentiel d’action des neurotransmetteurs est diminué. L’un des neuromédiateurs le plus touché est la dopamine. Cette dernière est synthétisée à partir d’un acide aminé : la tyrosine. Cette substance est produite à travers des neurones se trouvant dans l’hypothalamus, le pédoncule cérébral et les corps striés. La dopamine fait partie de la famille des catécholamines comprenant également l’adrénaline et la noradrénaline. Cet ensemble joue un rôle essentiel dans la motricité ainsi que dans le ressenti émotionnel.
D1 D2
Fig.2 Synapse et récepteurs dopaminergiques
Synapse
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2.6 Mode d’action [12] [14] [15] [16]
Le mécanisme d’action des neuroleptiques n’est pas véritablement connu dans la littérature. Cependant, certains paramètres sont clairement explicités. La dopamine possède deux récepteurs liés à une protéine globulaire jouant respectivement le rôle agoniste pour le récepteur D1 et antagoniste pour le récepteur D2. Agoniste signifie une activation des récepteurs en augmentant l’adénylate cyclase. Cette dernière est une enzyme permettant de produire de l’AMP (adénosine monophosphate) à partir d’ATP (adénosine triphosphate). L’AMP a la fonction de messager après activation des récepteurs. A l’inverse, antagoniste signifie une diminution de l’adénylate cyclase qui induit une inhibition de la production d’AMP. L’information nécessaire à la libération de la dopamine ne s’opère plus normalement. Les neuroleptiques auraient une affinité particulière avec les récepteurs de type D2. Le blocage de ces derniers aurait comme influence une baisse de toutes sensations se rattachant au plaisir.
REMARQUE : Le système sérotoninergique est également touché par certains neuroleptiques. Ces derniers ont un effet antagoniste sur les récepteurs 5HT2a et inhibiteur sur les récepteurs dopaminergiques.
2.7 Pharmacocinétique [12] [17] [18]
Les neuroleptiques peuvent être administrés de plusieurs manières. Les deux voies principales sont :
a) La voie orale
Lors de la prise orale, il y a une première étape d’absorption du médicament au niveau de l’intestin grêle. Cette phase dépend de l’affinité que possède la substance avec la protéine de transport (albumine) ainsi que de la solubilité du composé. Les formes galéniques sont généralement moins bien absorbées que les solutions médicamenteuses. Cette voie est généralement utilisée pour une action retardée.
b) La voie parentérale
La voie parentérale est généralement utilisée pour une action immédiate dans des cas d’urgence. Du fait de son action systémique, les concentrations plasmatiques sont à leur optimum. L’avantage de ce mode d’administration est que celui-ci ne passe pas par la voie intestinale et génère donc moins d’effets secondaires.
La concentration des neuroleptiques après absorption est plus importante dans les organes comme le cerveau, le foie, les reins, le cœur et les poumons. Ces substances passent la barrière hémato-encéphalique mais également la barrière placentaire en très forte concentration.
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2.8 Métabolisation et élimination [9] [15] [17]
Le but principal de la métabolisation est l’élimination des propriétés médicamenteuses d’un composé (xénobiotiques). Le processus biologique de ces différentes substances dépend de plusieurs facteurs : l’âge, le sexe et le mode d’administration. Les antipsychotiques sont des substances basiques liposolubles devant passer par la voie hépatique (cytochrome P450) afin d’être métabolisés. Les transformations par oxydation et désamination de ces substances s’effectuent dans le réticulum endoplasmique des hépatocytes. Le résultat de cette étape donne des molécules hydrosolubles pouvant être éliminées facilement par les reins (urine) mais également par la bile. La demi-vie d’élimination varie considérablement selon les substances et selon l’individu.
Exemples : [34]
2.9 Effets indésirables
Dyskinésie tardive [19] [20] se manifeste par des troubles moteurs notamment des mouvements incontrôlables des lèvres, du coup et du tronc.
Syndrome Parkinsonien [19] [21] se manifeste par un tremblement ainsi que des ralentissements de la mobilité.
Dystonies [19] [21] se manifeste par une déstabilisation de la posture ainsi que des ralentissements de la mobilité. Les masses musculaires peuvent être également disproportionnées.
Le syndrome malin des neuroleptiques [19] [20] se manifeste par une rigidité musculaire ainsi qu’une hyperthermie. Des troubles de la lucidité peuvent également survenir au cours du traitement.
Agranulocytose [19] [22] Absence de granulocytes neutrophiles. Aspect général d’une infection grave, fièvre, angine et peut parfois se compliquer par des affections hémorragiques.
Hypotension [19] [23] Pression artérielle très basse s’accompagnant parfois par des évanouissements, des faiblesses, des vertiges, des troubles de la vision et une accélération du rythme cardiaque.
Substance Demi-vie
Halopéridol 15-30 h
Quétiapine 7 h
Lévomépromazine 16-50 h
Rispéridone 3-20 h
Clozapine 6-26 h
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3 GÉNÉRALITÉS SUR LES NEUROLEPTIQUES
3.1 Classification [24]
Les neuroleptiques se laissent classer par leurs structures en trois groupes principaux. Le groupe des phénothiazines possède également des sous-groupes ayant chacun d’entre eux des similarités structurelles notamment un atome chimique.
GROUPES
PRINCIPAUX
Phénothiazines
Butyrophénones
Benzamides
REPRESENTANTS
Chlorpromazine,
Lévomépromazine, Fluphénazine, Promazine,
Perphénazine, Prométhazine
Halopéridol, Pipampérone
Amisulpride, Sulpiride, Tiapride
STRUCTURE CHIMIQUE
EN COMMUN [Fig. 3/4/5]
SOUS GROUPES DES PHÉNOTHIAZINES ATOMES CHIMIQUE EN COMMUN
Thioxanthènes
Flupenthixol
Chlorprothixène
Zuclopenthixol
Thiobenzothiazépines Un atome de soufre remplace un atome d’oxygène [25]
Olanzapine
Quétiapine
Clotiapine
Dibenzothiazépines Un atome de soufre remplace deux atomes d’oxygène [25]
Clozapine
Fig. 6 atome chimique en commun des thioxanthènes
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[24][27][28]
Substances Formules Masses molaires Structure Chimique
Chlorpromazine C17H19ClN2S 318.10 g/mol
[Chlopromazine-D3 C17H21ClN2S 321.10 g/mol]
CHLORO-2(DIMETHYLAMINO-3 PROPYL)-10 PHENOTHIAZINE CHLORHYDRATE
Levomepromazine C19H24N2OS 328.17 g/mol
(DIMETHYLAMINO-3 METHYL-2 PROPYL)-10 METHOXY-2 PHENOTHIAZINE
Fluphenazine C22H26F3N3OS 437.52 g/mol
DICHLORHYDRATE DE 2-{4-[3-(2-TRIFLUOROMÉTHYLPHÉNOTHIAZIN-10-YL) PROPYL] PIPERAZIN-1-YL} ÉTHYL
Promazine C17H20N2S 284.13 g/mol
Perphénazine C21H26ClN3OS 403.97 g/mol
[(CHLORO-2 PHENOTHIAZINYL-10)-3 PROPYL]-4 PIPERAZINYL-1>-2 ETHANOL
Prométhazine C17H20N2S 284.43 g/mol
(DIMETHYLAMINO-2 PROPYL)-10 PHENOTHIAZINE [21]
Flupenthixol C25H27F3N2O2S 434.5219 g/mol
DICHLORHYDRATE DE DÉCANOATE DE 2-{4-[3-(2-TRIFLUOROMÉTHYLTHIOXANTHÈN-9-YLIDÈNE)PROPYL]PIPERAZIN-1-YL}ÉTHYL
Chlorprothixene C18H18ClNS 315.08484 g/mol
CHLORHYDRATE DE (Z)-3-(2-CHLORO-9H-THIOXANTHÉN-9-YLIDÈNE)-N, N,DIMÉTHYLPROPAN-1-AMINE
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Zuclopenthixol C22H25ClN2OS 400.965 g/mol
cis (Z)-2-4-(3-(2-chlorothioxanthènylidène)-(9))-propyl) pipérazinyl-(1) éthanol (-1) dichlorhydrate
Halopéridol C21H23ClFNO2 375.14014 g/mol
[Halopéridol-D4 C21H27ClFNO2 379.14014 g/mol]
4-[4-(4-CHLOROPHÉNYL)-4-HYDROXYPIPERIDINO]-4'-FLUOROBUTYROPHÉNONE [21]
Pipampérone C21H30FN3O2 375.23221 g/mol
DICHLORHYDRATE DE 1'-[3-(P-FLUOROBENZOYL)PROPYL]-[1,4'-BIPIPÉRIDINE]-4'-CARBOXAMIDE
Clozapine C18H19ClN4 326.12982 g/mol
[Clozapine-D4 C18H23ClN4 330.12982 g/mol]
8-CHLORO-11-(4-MÉTHYL-1-PIPÉRAZINYL)-5H-DIBENZO(B,E)(1,4)DIAZÉPINE
Olanzapine C17H20N4S 312.14087 g/mol
[Olanzapine-D8 C17H28N4S 320.14087 g/mol]
2-MÉTHYL-4-(4-MÉTHYLPIPÉRAZIN-1-YL)-10H-THIÉNO[2,3-B][1,5]BENZODIAZÉPINE
Clotiapine C18H18ClN3S 343.09100 g/mol
CHLORO-2(METHYL-4 PIPERAZINYL-1)-11 DIBENZO(B,F)THIAZEPINE-1, 4
Quétiapine C21H25N3O2S 383.16675 g/mol
Sulpiride C16H25N3O4S 355.15659 g/mol
N-((ETHYL-1 PYRROLIDINYL-2)METHYL)METHOXY-2 SULFAMOYL-5 BENZAMIDE
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Amisulpride C17H27N3O4S 369.17224 g/mol
4-AMINO-N-[(1-ÉTHYL-2-PYRROLIDINYL)MÉTHYL]-5- (ÉTHYLSULFONYL)-2-MÉTHOXYBENZAMIDE
Tiapride C15H24N2O4S 328.14569 g/mol
N-(DIETHYLAMINO-2 ETHYL)METHOXY-2 METHYLSULFONYL-5 BENZAMIDE CHLORHYDRATE
Rispéridone C23H27FN4O2 410.4845 g/mol
3-{2-[4-(6-FLUORO-1,2-BENZISOXAZOL-3-YL)PIPERIDINO]ÉTHYL}-6,7,8,9-TÉTRAHYDRO-2-MÉTHYLPYRIDO[1,2-A]PYRIMIDIN-4-ONE
Palipéridone C23H27FN4O3 426.484 g/mol
Ziprasidone C21H21ClN4OS 412.936 g/molv
Aripiprazole C23H27N3O2Cl2 447.14804 g/mol
[Aripiprazole-D8 C23H35N3O2Cl2 455.14804 g/mol]
Cyamémazine C19H21N3S 323.14563 g/mol
CYANO-2(DIMETHYLAMINO-3 METHYL-2 PROPYL)-10 PHENOTHIAZINE
REMARQUE :
Les éléments (deutérés) mis entre crochets ne peuvent pas être considérés comme substances à doser. Ceux-ci seront explicités dans la partie pratique de mon travail.
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4 GÉNÉRALITÉS LC-MS/MS
4.1 Spectrométrie de masse [29]
Historique : Cette technique a été élaborée en 1912 par le physicien Joseph John Thomson et mise au point en 1918 par Francis William Aston et Arthur Jeffrey Dempster.
4.2 Chromatographie [30] [31]
Historique : Le terme chromatographie provient du grec Khrôma signifiant « couleur » et Graphein « écrire ». L’Ancien Testament fait référence à certain mécanisme chromatographique en mentionnant les propriétés d’absorption que possède le bois pour atténuer l’amertume de l’eau. Cette technique a été utilisée pour la première fois en 1906 par le botaniste russe Mikhail Tswett. En 1952, invention de la chromatographie liquide par le chimiste britannique Archer John Porter Martin et par le chimiste anglais Richard Laurence Millington Synge.
4.3 LC-MS/MS [29] [32]
La spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide a été conceptualisée en 1973 par McLafferty. Cette dernière est une technique d’actualité ayant quatre fonctions principales : la quantification, la qualification, la sensibilité et la spécificité.
Partie HPLC Partie MS/MS
Fig.7 appareils (LC-MS/MS) de laboratoire
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Partie HPLC [33] [34] [35]
En chromatographie liquide, la première étape est la séparation des différentes molécules selon leur poids moléculaire. Ces dernières vont passer au travers d’une phase stationnaire composée de particules de silice ayant une grande affinité ou non avec les substances passant au travers. Le choix de la phase stationnaire dépend des propriétés physico-chimiques des molécules recherchées en se basant principalement sur la volatilité et la polarité de ces dernières.
Principe d’adhérence
Deux cas de figures vont se présenter :
1) Les molécules n’ayant aucune affinité avec les groupes fonctionnels de la colonne ne vont pas adhérer et vont passer tout droit.
2) Les molécules ayant une grande affinité avec les composés de la colonne vont adhérer à la surface de celle-ci en formant une chaîne de 18 carbones (dans le cas des C18).
En fonction de l’interaction avec les phases stationnaires et mobiles, il existe plusieurs modes de chromatographie :
Chromatographie d’exclusion
Séparation des molécules en fonction de la taille.
Chromatographie d’affinité
La phase stationnaire contient des groupements ayant une grande affinité avec les particules recherchées. La phase mobile est une solution aqueuse.
Colonne de Silice
- SI - Silanol 18 C
Fig. 8 colonne Chromsep C18 et principe d’adhérence
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Chromatographie d’échange d’ions
Interaction entre la phase stationnaire ionique et l’échantillon ionisable. La phase mobile est une solution aqueuse.
Chromatographie d’adsorption / partage
Mode utilisé pour la détection des neuroleptiques
La phase stationnaire contient des particules polaires et la phase mobile est un solvant apolaire (Normal phase)
Inversement, la phase stationnaire contient des particules apolaires et la phase mobile est un solvant polaire (Reversed phase)
L’élution se fait par gradient de concentration variable des différents solvants. Dans un premier temps, il y a une forte concentration en solution aqueuse qui permettra aux molécules polaires de se détacher de la colonne. Au cours de l’injection, il y aura une augmentation prononcée en acétonitrile (solvant apolaire) qui permettra aux molécules apolaires de se détacher à leur tour.
Partie MS/MS [36] [37] [38]
4.4 Ionisation
Les molécules libres vont être mesurées par spectrométrie de masse. Pour se faire, elles vont se charger dans la source (Q0) par ionisation. Les molécules acides sont capables de céder un H+. Il y aura donc une augmentation des charges positives et l’analyse s’effectuera en mode négative. En parallèle, les molécules basiques sont aptes à capter un H+ il y aura donc augmentation des charges négatives et l’analyse s’effectuera en mode positive.
Il existe deux sources d’ionisation :
Atmospheric pressure chemical ionization (APCI)
L’échantillon entre dans une chambre tempérée pouvant atteindre les 500°C. Un nébulisateur présent dans ce compartiment transformera la matrice en particules gazeuses et celles-ci seront emmenées vers l’aiguille de Corona. Cette électrode provoquera une décharge source d’électrons servant à l’ionisation.
Fig.9 source d’ionisation
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Electro spray ionization (ESI)
Les molécules entrant dans la source sont chargées électriquement grâce à un électronébulisateur qui transformera la matrice en fines gouttelettes. Ces dernières subiront des déformations suite à l’évaporation du solvant. Cette étape provoquera une rupture de la paroi des gouttelettes et laissera place à des nano gouttelettes chargées.
4.5 Choix analytiques
Pour notre processus analytique, nous avons choisi de travailler par Electro Spray Ionization (ESI) en mode positif. Les tampons de prédilection contiennent de l’eau et de l’acétonitrile additionné d’acide formique supportant bien la protonation.
4.6 Séparation Q0/Q1/Q2/Q3
Ionisation détection
Q0: Ionisation dans la source avec sélection des ions parents en fonction de la
masse sur la charge (m/z). La m/z correspond à un ion contenant la totalité des atomes recherchés. Cela correspond à la masse moléculaire. Les molécules instables peuvent se fractionner durant cette étape.
Source
Fig.10 schéma pour l’Electro Spray Ionization (ESI)
Fig.12 photo du MS/MS au laboratoire
Fig.11 schéma de la séparation depuis la source jusqu’à Q3
Quadripôles
Q0
Sour
ce
Q1 Q2 Q3
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Q1: Filtration des ions fragmentés.
Q2 : Fragmentation des ions parents en ions fils grâce à la cellule de collision.
Principe de fragmentation :
L’échantillon va être bombardé par des électrons ayant une énergie cinétique définie. Cette étape se déroule dans une cavité sous vide. Le nombre d’ions produits est proportionnel à la pression de l’échantillon et l’intensité du courant électrique.
Q3: Filtration des ions fils
4.7 Détecteur [39][40]
La sensibilité du détecteur est très importante, le senseur doit être capable, dans un cours laps de temps, pouvoir compter les fragments un par un. Nous pouvons donc dire que cette étape se déroule en temps réel. Le temps de comptage s’effectue en même temps que l’image du spectre est étudiée à l’ordinateur.
Principe :
A l’intérieur d’une ampoule sous vide, un canon envoie des électrons. L’intensité de ces derniers est réglée par la tension entre la cathode et l’électrode (Wehnelt).
4.8 Avantages analytique par LCMS-MS [39][41]
1) Mode de traitement des échantillons simplifié car pas besoin de dérivatisation
2) Méthode qualitative et quantitative
3) Grande sensibilité et spécificité
4) Méthode sélective
5) Capacité à détecter un grand nombre de substances dans divers matrices
Fig.13 principe de fragmentation
Fig.14 principe du détecteur
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5 PARTIE PRATIQUE
MATÉRIEL
5.1 Matériel biologique
Sang de bovin négatif
Six sangs complets provenant de volontaires au laboratoire
20 ml d’un pool de sérum provenant de volontaires au laboratoire
CQ interne MassCheck Neuroleptics 1 Plasma Control level 2 Fournisseur : CHROMSYSTEMS N° de lot : 3811 Expiration : 2013-09 REF : 0210
CQ interne MassCheck Neuroleptics 2
Plasma Control level 2 Fournisseur: CHROMSYSTEMS N° de lot : 4110 Expiration : 2012-10 REF : 0227
5.2 Instruments
LC-MS/MS Modèle: 3200 Q TRAP Fournisseur: AB SCIEX N° de série : SN AF12870609 N° UTCF : IN1016
ASPEC
Modèle: GX-274 Fournisseur: GILSON N° de série : SN 260B9N053 N° UTCF : IN1032
Balance de précision Mettler
Agitateur horizontal Modèle : SM 30 Control Fournisseur : EDMUND BÜHLER Numéro de série inaccessible N° UTCF : IN2550
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Centrifugeuse Modèle : Multifuge 3s Fournisseur : HERAEUS N° de série : 40307429 N° UTCF : IN2206
Evaporateur à azote
Modèle : TurboVapLV Fournisseur : CALIPER LIFE SCIENCE N° de série : TV0707N13581 N° UTCF : IN2303
Vortex
Modèle : Vortex-Genie 2 Fournisseur : SCIENTIFIC INDUSTRIES N° de série : 2-140401 N° UTCF : IN2508
5.3 Matériel de Laboratoire
Colonne VARIAN Inertsil 3ODS-3 Chromsep 150*2 mm
Précolonne Chromsep 10 x 2 mm D.I.
Colonnes d’extraction Fournisseur : EVOLUTE CX 3 ml 50 mg
Tubes en verres de 10 ml, bouchons et téflons
Pipettes automatiques + embouts
Multipipettes + embouts
Pipettes pasteur en verre
Ballons jaugés de 10 ml et bouchons
Seringues (5-10-50-100-250-1000 µl)
Microvials en verre et bouchons correspondants
5.4 Réactifs
Formate d’ammonium 5mM pH 3.8 et 6.1 Fournisseur : FLUKA N° de lot : 63707/1 13701 REF : 17843 N° UTCF : IIF4c
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Mélange de tampon formate d’ammonium et d’acétonitrile (15 : 85 ; v/v)
Mélange de tampon formate d’ammonium et d’acétonitrile (50 : 50 ; v/v)
Carbonate d’ammonium 10 mM pH 9.3 Fournisseur : FLUKA N° de lot : 408719/2 20201 REF : 09716 N° UTCF : IVt8
Acétate d’ammonium 50 mM pH 5.0
1) Acétate d’ammonium Fournisseur : FLUKA N° de lot : BCBB9221 REF : 09690-506
2) Ajuster le pH avec de l’acide acétique glacial 99% Fournisseur : SIGMA-ALDRICH N° de lot : SZBB1470V REF : 33209-IL
Méthanol
Fournisseur : SIGMA-ALDRICH N° de lot : BCBG2171V REF : 65543-2.5L
1-Chlorobutane
Fournisseur : SIGMA-ALDRICH N° de lot : 1430474V REF : 19750-IL
Butylmethylether
Fournisseur : MERCK N° de lot : 326K19779143
Acétonitrile
Fournisseur : SIGMA-ALDRICH N° de lot : SZBB021MV REF : 33019-2.5L-R
Acide formique 50% Fournisseur : FLUKA N° de lot : 1347874 25107211 REF : 09676
H2O MilliQ
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5.5 Solutions
La concentration désirée pour chaque solution-fille est de 10 µg/ml. La masse prélevée pour une poudre contenant que de la substance pure est de 0.010g / 10 ml MeOH. Pour toutes particules couplées à un autre élément, en l’occurrence le HCL, la masse désirée doit être calculée en fonction du poids moléculaire de l’acide chloridrique ainsi que de la substance pure de base. Pour les ampoules nous pouvons directement effectuer une dilution pour arriver à la concentration voulue (cf. annexe 1)
6 QUANTIFICATION DES NEUROLEPTIQUES
Pour permettre le développement de notre processus analytique, nous allons suivre une procédure de validation bien précise que je vais expliciter au fur et à mesure de mon travail. Le but principal est de pouvoir déceler 24 substances présentes sur le marché suisse grâce à une seule méthode de quantification. Plusieurs optimisations devront être réalisées notamment au niveau de l’appareil et de la méthode d’extraction.
.
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7 INFUSIONS
Le terme infusion fait référence à une diffusion lente d’une substance. Cette dernière nous permet par spectrométrie de masse d’observer la manière dont la molécule se fragmente. Ce procédé nous donne les données suivantes : MW (masse molaire), Q1 (« precursor ion » masse molaire + 1H+), T1 (transition ou fragment 1), T2 (transition ou fragment 2). Pour chaque substance, le spectre de masse propose six fragments (Résultat des infusions en annexe 2). Nous en choisissons deux en fonction de l’aspect du pic, de la symétrie et de l’abondance de celui-ci qui doit être préférentiellement de l’ordre de la puissance six.
Pour ce faire, nous préparons des solutions méthanoliques à des concentrations de 100 ng/ml, 250 ng/ml et 1000 ng/ml à partir des solutions initiales à 10 µg/ml. Les substances réagissent toutes de manières différentes et il se peut dans certains cas qu’il y ait saturation (concentration > 1000 ng/ml) ou au contraire une intensité inférieure à la limite de détection (concentration < 100 ng/ml). Ces trois gammes de concentration m’ont permise d’obtenir pour chacune des substances deux transitions. Après avoir traité les résultats et en comparant mes choix à un article scientifique [41] nous arrivons aux résultats suivants :
Ces transitions vont êtres ajoutées dans la méthode analytique déjà existante pour permettre la reconnaissance spécifique de chaque molécule pour les étapes à venir.
8 PARAMÈTRES ANALYTIQUES DE LA MÉTHODE
Pour détecter un ensemble de substances, il faut paramétrer la méthode analytique notamment au niveau de la concentration des solvants ainsi que de la température jouant principalement un rôle sur la fragmentation. Pour ce faire, nous nous sommes basés sur le procédé existant pour effectuer un essai.
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8.1 Paramètres LC initiaux
Le gradient est trop raide car le plateau se retrouve très rapidement à 65% en solvant B (ACN). Après un premier essai, nous constatons que les molécules n’ont pas le temps de se différencier correctement et la durée de la méthode est trop courte pour détecter la totalité de notre panel. Pour se faire, nous avons dans un premier temps modifié le procédé et avons palié la concentration en solvant B. Ce changement de gradient devrait permettre une meilleure séparation des molécules en fonction du temps.
Après un second essai, les résultats ne sont pas plus concluants. Nous décidons d’effectuer toute une série de modifications des paramètres de la méthode en se fixant principalement sur la concentration en acétonitrile (cf. annexe 3). Nous nous sommes également basé sur une autre méthode analytique de routine pour les opiacés en comparant la distribution en acétonitrile tout au long de la méthode. Dans cette dernière, la concentration en solvant B entre 1 et 5 minutes est de 10 %. Après discussion, nous avons pris la décision de prendre en compte ce pourcentage et d’augmenter également le débit d’échantillon à 0.30 ml/minute au lieu de 0.20 ml/minute. Ces changements permettront aux molécules plus polaires de sortir plus rapidement.
8.1.1 Résultat
La base des pics est trop large et ceux-ci mettent trop de temps à être identifié. Pour améliorer ce phénomène, nous augmentons le débit à 0.35 ml/minute. Cependant, nous laissons la concentration en solvant B à 10% comme dans la méthode initiale des opiacés. La température joue également un rôle dans le temps que mettent les molécules à sortir et celle-ci est initialement de 30°C et est augmentée à 40°C ce qui permettra une détection plus rapide des substances.
Pourcentage
Description de la méthode
0 à 1 min : 15% acétonitrile (ACN)
1 à 5 min : 40% ACN
5 à 10 min : 65% ACN
10 à 13.5 min : 80% ACN
14 à 15 min : 15% ACN
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Résultat du mélange de substances à 0.35 ml/minute, 10% solvant B,
température à 40°C
Toutes les substances sortent en l’espace de huit minutes. L’affinement des pics est le résultat de ce changement. De manière générale, chaque substance met environ 30 secondes à sortir. Ces essais nous ont permis de créer une méthode définitive pour la détection et la quantification des neuroleptiques.
Méthode définitive
Ab
on
dan
ce
Temps, min.
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Temps de rétention (TR) des neuroleptiques
Le temps de rétention est le temps que met la substance entre l’élution de la substance sur la colonne et le temps de détection. Les TR nous seront d’une grande utilité notamment en routine afin de nous orienter sur le bon pic à mettre en évidence.
8.1.2 Sélectivité L’étape suivant la mise au point de la méthode est la détection des interférences de la matrice. Cette étape s’appelle la sélectivité.
8.1.3 Sélectivité ou Influence de la matrice Pour cette étape, je vais effectuer:
Une droite sans extraction sans matrice (Bl-si, Bl+si, Stds)
Trois droites avec extraction ayant comme matrice respective l’eau, le sérum et le sang de bovin négatif (Bl-si, Bl+si, Stds)
Le « blanc-si » nous permet de vérifier la qualité de nos solutions en s’assurant que celles-ci sont exemptes de contaminations.
Le « blanc+si » nous sert de premier point de la droite, c’est le point 0.
Substances STDS RT Substances SI RT
Amisulpride 4.51 Aripiprazole-D8 7.05
Aripiprazole 7.36 Chlorpromazine-D3 6.42
Chlorpromazine 6.5 Clozapine-D4 5.93
Chlorprothixène 6.68 Halopéridol-D4 5.8
Clotiapine 8.52 Olanzapine-D8 5.64
Clozapine 5.96
Cyamémazine 6.08
Flupenthixol 7.03
Fluphénazine 6.8
Halopéridol 5.62
Lévomépromazine 6.11
Olanzapine 5.65
Palipéridone 5.25
Perphénazine 6.4
Pipampérone 5.58
Promazine 5.86
Prométhazine 5.85
Quétiapine 6.1
Rispéridone 5.51
Sulpiride 3.5
Tiapride 3.82
Ziprasidone 7.04
Zuclopenthixol 6.55
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Les standards correspondent aux substances à doser en concentrations croissantes connues dans une droite de régression et sont de simples substances méthanoliques. 8.2 Droites de calibration
Une droite d’étalonnage permet de mesurer la concentration des échantillons à analysé en faisant le rapport de la surface du standard interne / surface du standard. En utilisant cette fonction, nous pouvant également vérifier que les contrôles de qualité interne se retrouvent dans l’intervalle de confiance.
Une droite de calibration dans un dosage est définie selon les indications thérapeutiques, toxiques et létales de chaque substance. Pour ce faire, je me suis basée sur plusieurs sources littéraires [42][43][44] afin d’effectuer un tableau comprenant toutes les concentrations.
Concentration ng/ml
Surface du standard interne
Surface du standard
Echantillon
Droite de calibration à
concentration croissante
Surface du pic de
l’échantillon
Concentration de l’échantillon
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Après interprétation de ces données, nous décidons de mettre de côté les concentrations létales qui en réalité n’ont été décrites dans la littérature que dans de très rares cas. D’après les résultats chiffrés, nous pouvons diviser notre tableau en trois parties : les concentrations thérapeutiques faibles (droite 1), moyennes (droite 2) et hautes (droite 3).
Nous aurons donc trois droites de calibration différentes, capables de détecter les concentrations thérapeutiques et toxiques de la totalité des substances.
DROITE 1
Substances concernées: Fluphénazine, Palipéridone, Perphénazine, Rispéridone, Zuclopenthixol
DROITE 2
5 ng/ml 20 ng/ml 50 ng/ml 200 ng/ml 500 ng/ml
Substances concernées: Aripiprazole, Chlorpromazine, Chlorprothixène, Clotiapine, Flupenthixol, Halopéridol, Lévomépromazine, Olanzapine, Pipampérone, Ziprasidone
DROITE 3
50 ng/ml 200 ng/ml 500 ng/ml 1000 ng/ml 2500 ng/ml
Substances concernées: Amisulpride, Clozapine, Cyamémazine, Promazine, Promézhazine, Quétiapine, Sulpiride, Tiapride
Afin de faciliter la partie pratique, nous décidons de préparer un mélange de substances par gamme de concentration (cf. annexe 4).
8.2.1 Choix des Standards internes
Un standard interne est dans l’idéal, en spectrométrie de masse, une substance deutérée. Son nom vient du fait qu’une partie des molécules d’hydrogène ont été remplacées par un deutérium. Celui-ci est un isotope de l’hydrogène mais a pour différence son poids moléculaire double du à son noyau possédant un proton et un neutron en plus. Un standard interne deutéré doit se comporter chimiquement parlant de la même manière que le standard et montre le même temps de rétention. S’il n’y a pas un standard deutéré à disposition, le SI choisi devrait présenter un temps de rétention proche et une structure chimique similaire à la substance dosée.
0.5 ng/ml 2 ng/ml 5 ng/ml 20 ng/ml 100 ng/ml
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Lors de la détection, le signal est proportionnel à la surface du pic. Cependant, la perte de matériel au cours de l’analyse n’est pas négligeable et le standard interne nous permet de faire un rapport (aire du standard/aire du standard interne) permettant de calculer la linéarité.
8.2.2 Choix du standard interne en fonction du standard
Nous avons infusé un mélange de deutérés à une concentration de 1 µg/ml pour optimiser les conditions de fragmentations. Mélange de deutérés (SI)
Temps, min.
Ab
on
dan
ce
Olanzapine-D8
Halopérido-D4
Clozapine-D4
Chlorpromazine-D3
Aripiprazole-D8
Exemple
Clozapine-D4 Clotiapine
Fig. 14 / 15 structure chimique
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Les pics ont une bonne abondance et sont bien distincts les uns des autres et mettent environ 30 secondes à sortir. Ce sont les critères à respecter pour permettre une association avec les standards.
8.2.3 Résultats de la sélectivité
Dans nos trois droites, les « blanc-si » sont exempts de contaminations et les standards internes sortent pour toutes nos substances. Pour des droites ayant les mêmes gammes de concentrations nous observons des interférences plus importantes pour le sang de bovin négatif se manifestant par des pics irréguliers. Cette variation est due à des interactions endogènes due à la matrice. Dans le cadre de cette étape, nous avons utilisé six sangs provenant de volontaires au laboratoire et avons effectué pour chacun d’entre eux un « blanc+si » et un « blanc-si ». Ceci nous permet d’observer les éventuelles contaminations endogènes ainsi que l’interférence des deutérés. Résultat
0
500
1000
1500
2000
2500
Am
isu
lpri
de
Ari
pip
razo
le
Ch
lorp
rom
azin
e
Ch
lorp
roth
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e
Clo
tiap
ine
Clo
zap
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Cya
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azin
e
Flu
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ol
Flu
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Hal
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Levo
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rom
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Ola
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e
Ris
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ido
ne
Sulp
irid
e
Tiap
rid
e
Zip
rasi
do
ne
Zucl
op
enth
ixo
l
SANG BOVIN
SERUM
H2O
Sans matrice
Remarque : pour effectuer ce graphique, j ai effectué la moyenne de tous les standards (résultats chiffrés en annexe 5)
Nous choisissons le sang de bovin négatif pour continuer la quantification des neuroleptiques. Ces derniers seront dosés en routine dans le sang et nous devons donc trouver une méthode pouvant contourner les interférences endogènes et permettre la détection de toutes ces substances. Pour nos six sangs, nous distinguons bien le standard du standard interne. Il n y a donc pas d’interférences ou de contaminations qui pourrait empêcher une bonne détection. La matrice choisie, nous devons trouver un mode d’extraction adéquat. Cette étape s’appelle la sensibilité.
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8.3 Sensitivité en fonction de l’extraction et du volume de la matrice
Le but de cette étape est de trouver un mode d’extraction assez sensible permettant de déceler au travers d’une matrice tel que le sang la substance d’intérêt. Pour ce faire, nous allons effectuer une première méthode d’extraction existante en routine de type liquide/liquide ou LLE en se basant sur l’extraction des neuroleptiques (annexe 6) et une seconde de type liquide/solide ou SPE en se basant sur l’extraction des opiacés, également existante en routine (annexe 7). La principale différence entre ces deux, est la présence d’une colonne pour l’extraction sur phase solide (SPE). Cette dernière devrait, en théorie, permettre l’élimination des déchets et nous devrions donc obtenir une extraction de meilleure qualité. Nous allons également effectuer les tests avec deux volumes d’échantillons différents, 200 et 500 µl. Nous avons travaillé sur trois concentrations différentes (basse, moyenne et haute) et avons comparé la sensibilité en fonction de l’abondance des pics et selon le type d’extraction.
8.4 Résultats
La méthode d’extraction détectant le mieux l’Amisulpride est de type
liquide/solide (SPE) à 0.2 ml
Extraction Sample Name Amisulpride
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 2.44E+04
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 0.00E+00
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 8.67E+05
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 1.30E+05
LLE 0.2 ml Std [2] 0.20 ml neuro. 1.01E+05
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 1.42E+05
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 3.61E+06
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 3.60 E+05
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 2.41E+05
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 2.51E+05
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 8.63E+06
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 6.66E+05
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La méthode d’extraction détectant le mieux l’Aripiprazole est de type liquide/solide (SLE) à 0.2 ml
La méthode d’extraction détectant le mieux la Chlorpromazine est de type
liquide/liquide (LLE) à 0.2 ml
Extraction Sample Name Aripiprazole
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 3.87E+03
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 1.91E+02
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 6.32E+03
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 2.97E+02
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 3.39E+03
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 3.72E+02
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 1.27E+04
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 1.97E+03
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 4.12E+04
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 1.63E+03
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 4.58E+04
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 3.05E+03
Extraction Sample Name Chlorpromazine
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 1.12E+04
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 1.34E+03
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 6.50E+03
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 4.40E+02
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 2.34E+04
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 1.41E+03
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 1.52E+04
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 2.91E+03
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 1.53E+05
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 5.35E+03
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 4.69E+04
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 6.90E+03
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Le standard 1 (basse concentration) à une meilleure abondance avec une extraction de
type liquide/liquide (LLE) à un volume d’échantillon à 0.2 ml. Malgré cela, le Std 1 a également une bonne abondance avec une extraction de type liquide/solide avec le même volume. Du fait que les deux autres standards sortent mieux avec une extraction liquide/solide (SPE) à un volume d’échantillon à 0.2 ml nous garderons cette dernière comme méthode définitive.
Extraction Sample Name Clotiapine
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 3.75E+04
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro.
3.19E+03
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI
1.64E+05
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 3.63E+03
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 3.91E+04
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 4.56E+03
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 2.89E+05
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 2.37E+04
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 3.68E+05
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 1.31E+04
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 8.35E+05
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 4.50E+04
La méthode d’extraction détectant le mieux la Clotiapine est de type liquide/solide (SPE) à 0.2 ml
Extraction Sample Name Chlorprothixene
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 3.77E+04
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 9.37E+02
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 1.75E+04
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 1.01E+03
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 1.39E+04
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 1.09E+03
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 3.99E+04
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 6.40E+03
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 1.03E+05
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 3.72E+03
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 1.68E+05
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 1.01E+04
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Extraction Sample Name Clozapine
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 6.26E+05
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro.
1.49E+03
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI
5.47E+05
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 5.54E+04
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 2.64E+06
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 1.66E+05
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 2.14E+06
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 2.06E+05
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 9.03E+06
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 4.87E+05
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 6.84E+06
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 3.65E+05
La méthode d’extraction détectant le mieux la Clozapine est de type
liquide/liquide (LLE) à 0.2 ml
Le standard 1 (basse concentration) à une meilleure abondance avec une extraction de
type liquide/liquide (LLE) à un volume d’échantillon à 0.2 ml. Malgré cela, le Std 1 a également une bonne abondance avec une extraction de type liquide/solide avec le même volume. Du fait que les deux autres standards sortent mieux avec une extraction liquide/solide (SPE) à un volume d’échantillon à 0.2 ml nous garderons cette dernière comme méthode définitive.
Extraction Sample Name Cyamémazine
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 2.37E+04
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro.
1.04E+02
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI
2.35E+04
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 2.26E+03
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 4.93E+04
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 3.97E+03
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 8.80E+04
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 9.06E+03
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 3.37E+05
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 1.31E+04
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 3.46E+05
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 1.78E+04
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La méthode d’extraction détectant le mieux le Flupenthixol est de type
liquide/solide (SPE) à 0.2 ml
Le standard 3 (haute concentration) à une meilleure abondance avec une extraction de
type liquide/liquide (LLE) à un volume d’échantillon à 0.2 ml. Malgré cela, le Std 3 a
également une bonne abondance avec une extraction de type liquide/solide avec le
même volume. Du fait que les deux autres standards sortent mieux avec une extraction
liquide/solide (SPE) à un volume d’échantillon à 0.2 ml nous garderons cette dernière
comme méthode définitive.
Extraction Sample Name Flupenthixol
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 4.16E+03
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 4.16E+02
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 1.65E+04
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 6.93E+02
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 1.07E+04
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 6.38E+02
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 4.26E+04
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 4.07E+03
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 6.74E+04
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 4.06E+03
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 1.32E+05
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 7.29E+03
Extraction Sample Name Fluphénazine
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 1.07E+03
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 7.32E+01
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 1.50E+03
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 1.05E+02
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 2.45E+03
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 1.37E+02
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 4.48E+03
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 5.02E+02
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 1.61E+04
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 8.69E+02
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 1.58E+04
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 1.14E+03
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La méthode d’extraction détectant le mieux l’Halopéridol est de type liquide/solide (SPE) à 0.2 ml
La méthode d’extraction détectant le mieux la Lévomépromazine est de type liquide/liquide (LLE) à 0.2 ml
Extraction Sample Name Haloperidol
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 5.65E+04
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 0.00E+00
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 8.33E+04
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 4.42E+03
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 1.95E+05
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 8.28E+03
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 2.00E+05
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 2.19E+04
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 6.97E+05
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 2.86E+04
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 7.81E+05
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 3.56E+04
Extraction Sample Name Lévomépromazine
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 3.92E+04
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 4.42E+02
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 6.80E+03
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 7.74E+02
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 8.33E+04
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 5.03E+03
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 3.81E+04
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 5.36E+03
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 5.79E+05
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 1.65E+04
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 9.81E+04
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 1.67E+04
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Extraction Sample Name Olanzapine
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 7.24E+04
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro.
0.00E+00
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI
9.10E+03
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 1.00E+03
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 3.68E+05
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 2.73E+04
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 3.12E+04
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 6.29E+03
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 1.32E+06
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 6.93E+04
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 7.25E+04
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 1.98E+04
La méthode d’extraction détectant le mieux l’Olanzapine est de type liquide/liquide (LLE) à 0.2 ml
Le standard 3 (haute concentration) à une meilleure abondance avec une extraction de type liquide/liquide (LLE) à un volume d’échantillon à 0.2 ml. Malgré cela, le Std 3 a également une bonne abondance avec une extraction de type liquide/solide avec le même volume. Du fait que les deux autres standards sortent mieux avec une extraction liquide/solide (SPE) à un volume d’échantillon à 0.2 ml nous garderons cette dernière comme méthode définitive.
Extraction Sample Name Palipéridone
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 8.98E+03
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 0.00E+00
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 1.56E+04
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 1.11E+03
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 5.77E+04
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 5.41E+03
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 6.83E+04
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 3.68E+03
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 1.35E+05
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 5.70E+03
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 1.26E+05
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 8.13E+03
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Extraction Sample Name Perphenazine
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 6.89E+02
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro.
1.08E+02
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 0.00E+00
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 6.28E+01
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 2.75E+03
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 1.63E+02
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 1.74E+03
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 3.15E+02
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 1.50E+04
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 8.76E+02
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 6.19E+03
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 6.62E+02
La méthode d’extraction détectant le mieux la Perphénazine est de type liquide/liquide (LLE) à 0.2 ml
Le standard 2 (moyenne concentration) à une meilleure abondance avec une extraction de type liquide/liquide (LLE) à un volume d’échantillon à 0.2 ml. Malgré cela, le Std 2 a également une bonne abondance avec une extraction de type liquide/solide avec le même volume. Du fait que les deux autres standards sortent mieux avec une extraction liquide/solide (SPE) à un volume d’échantillon à 0.2 ml nous garderons cette dernière comme méthode définitive.
Extraction Sample Name Pipamperone
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 6.83E+04
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 0.00E+00
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 1.92E+05
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 4.67E+03
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 5.09E+05
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 1.57E+04
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 3.33E+05
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 2.33E+04
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 8.43E+05
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 2.78E+04
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 7.15E+05
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 4.41E+04
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La méthode d’extraction détectant le mieux la Promazine est de type
liquide/liquide (LLE) à 0.2 ml
La méthode d’extraction détectant le mieux la Prométhazine est de type
liquide/liquide (LLE) à 0.2 ml
Extraction Sample Name Promazine
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 6.66E+05
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 0.00E+00
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 1.29E+05
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 2.51E+04
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 1.86E+06
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 8.91E+04
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 5.81E+05
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 1.08E+05
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 8.71E+06
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 3.23E+05
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 2.80E+06
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 2.63E+05
Extraction Sample Name Prométhazine
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 5.31E+05
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 0.00E+00
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 1.15E+05
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 2.31E+04
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 1.58E+06
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 7.78E+04
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 4.98E+05
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 8.81E+04
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 7.72E+06
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 2.54E+05
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 2.34E+06
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 2.26E+05
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La méthode d’extraction détectant le mieux la Quétiapine est de type
liquide/solide (SPE) à 0.2 ml
Extraction Sample Name Rispéridone
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 1.46E+04
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro.
0.00E+00
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI
1.23E+04
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI
1.83E+03
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 1.05E+05
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 5.12E+03
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 1.05E+05
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 7.05E+03
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 2.37E+05
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 1.29E+04
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 2.37E+05
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 1.37E+04
La méthode d’extraction détectant le mieux le Rispéridone est de type liquide/liquide (LLE) à 0.2 ml
Extraction Sample Name Quetiapine
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 7.94E+05
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 7.92E+04
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 8.12E+05
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 9.27E+04
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 3.41E+06
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 2.67E+05
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 3.74E+06
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 2.61E+05
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 9.16E+06
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 6.99E+05
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 1.03E+07
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 4.86E+05
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Extraction Sample Name Sulpiride
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 8.67E+03
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro.
0.00E+00
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI
7.40E+05
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 2.52E+04
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 7.01E+04
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 2.80E+03
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 3.56E+06
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 1.00E+05
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 9.71E+04
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 3.29E+03
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 8.08E+06
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 1.72E+05
La méthode d’extraction détectant le mieux la Sulpiride est de type liquide/solide (SPE) à 0.2 ml
La méthode d’extraction détectant le mieux le Tiapride est de type liquide/solide (SPE) à 0.2 ml
Extraction Sample Name Tiapride
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 5.84E+05
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 0.00E+00
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 1.09E+06
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 7.82E+04
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 3.01E+06
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 7.35E+04
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 3.84E+06
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 2.26E+05
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 7.23E+06
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 2.16E+05
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 1.00E+07
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 5.71E+05
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Le standard 2 (moyenne concentration) à une meilleure abondance avec une extraction de type liquide/liquide (LLE) à un volume d’échantillon à 0.2 ml. Malgré cela, le Std 2 a également une bonne abondance avec une extraction de type liquide/solide avec le même volume. Du fait que les deux autres standards sortent mieux avec une extraction liquide/solide (SPE) à un volume d’échantillon à 0.2 ml nous garderons cette dernière comme méthode définitive.
La méthode d’extraction détectant le mieux le Zuclopenthixol est de type
liquide/solide (SPE) à 0.2 ml
Extraction Sample Name Ziprasidone
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 4.38E+04
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 2.61E+03
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 4.32E+04
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 3.04E+03
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 9.67E+04
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 6.61E+03
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 1.73E+05
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 1.37E+04
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 6.06E+05
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 3.28E+04
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 4.69E+05
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 2.71E+04
Extraction Sample Name Zuclopenthixol
LLE 0.2 ml std [1] 0.20 ml neuro. 0.00E+00
LLE 0.5 ml std [1] 0.5 ml sg neuro. 7.12E+00
SPE CX 0.2 ml Std [1] 0.20 ml OPI 2.81E+02
SPE CX 0.5 ml std [1] 0.5 ml OPI 1.32E+01
LLE 0.2 ml std[2] 0.20 ml neuro. 0.00E+00
LLE 0.5 ml std [2] 0.5 ml sg neuro. 2.46E+01
SPE CX 0.2 ml Std [2] 0.20 ml OPI 3.03E+02
SPE CX 0.5 ml std [2] 0.5 ml OPI 6.31E+01
LLE 0.2 ml std [3] 0.20 ml neuro. 1.32E+03
LLE 0.5 ml std [3] 0.5 ml sg neuro. 9.11E+01
SPE CX 0.2 ml Std [3] 0.20 ml OPI 1.95E+03
SPE CX 0.5 ml std [3] 0.5 ml OPI 1.03E+02
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En regardant les résultats de ces graphiques, nous pouvons observer une sensibilité variable selon les substances et le type d’extraction utilisé. L’abondance des pics est dans tous les cas beaucoup plus importante avec un volume de 200 µl d’échantillon. Ce volume permet de diminuer le bruit de fond et ainsi faire ressortir de manière plus importante les substances à quantifier. Quelque soit la méthode utilisée avec un volume de 200 µl toutes les substances sortent. En résumé : Le tableau ci-dessous montre dans quelle méthode d’extraction à un
volume de 200 µl les substances démontrent une meilleure sensitivité.
Nous choisissons la méthode de type SPE car c’est ce type d’extraction qui fait ressortir de manière plus appréciable les substances.
Remarque
Lorsque que nous avons entré manuellement les concentrations des standards de la droite de calibration dans la méthode quantitative, il y a eu une erreur et les données pour la quantification ne sont pas correctes. Les résultats nous donnaient une sensibilité plus importante à un volume de 500 µl pour l’extraction de type SPE. Nous avons donc effectué les étapes à venir avec l’optique que celle-ci est meilleure avec un volume plus élevé.
Une fois la méthode définitive choisie, nous devons procéder à l’étape de la validation. Celle-ci va être explicitée dans mon travail mais ne pourra pas être prise en compte due à une erreur analytique explicitée dans l’encadré.
9 VALIDATION
Comme explicité précédemment, nous avons effectué cette étape avec un volume de 500 µl d’échantillon au lieu de 200 µl. La validation de la méthode s’effectue sur trois jours (J1, J2, J3) et permet de vérifier la répétabilité et l’exactitude des résultats.
Extraction de type SPE 0.2 ml Extraction de type LLE 0.2 ml
Extraction sur phase solide Extraction liquide/liquide
Amisulpride Chlorpromazine
Aripiprazole Clozapine
Chlorprothixène Lévomépromazine
Clotiapine Olanzapine
Cyamemazine Perphénazine
Flupenthixol Pipampérone
Fluphenazine Promazine
Halopéridol Promethazine
Palipéridone Rispéridone
Quetiapine Ziprasidone
Sulpiride
Tiapride
Zuclopenthixol
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Pour la partie pratique, nous devons effectuer chaque jour:
Bl-si / Bl+si / Stds correspond à la droite de calibration. Chaque droite est traitée de manière linéaire sans pondération.
CQi 1 / CQi 2 correspond à la droite de quantification (explicité ultérieurement)
Nous traitons dans un premier temps la droite de calibration en comparant la répétabilité des résultats ainsi que le coefficient de détermination (annexe 8). Ce dernier, appelé R^2 permet de visualiser la qualité d’une droite de régression. Ce facteur prend en compte tous les points de la droite et doit être le plus proche de 1. Une droite optimale donne un coefficient = 1.
Résultats des coefficients de régression: Le coefficient de régression également appelé coefficient de corrélation permet de montrer la variabilité entre le résultat attendu et le résultat obtenu. Au niveau de cet exercice le coefficient de détermination n’est pas très important pour la répétabilité et c’est principalement ce que l’on regarde dans la droite de régression. Cependant, ce facteur nous permet en routine de valider notre processus analytique.
SUBSTANCE R^2
Jour1 R^2
Jour1 R^2
Jour1 R^2
Jour2 R^2
Jour2 R^2
Jour2 R^2
Jour3 R^2
Jour3 R^2
Jour3 Moyenne
Amisulpride 0.9871 0.9819 0.9848 0.9265 0.9776 0.9665 0.7721 0.9226 0.9044 0.9359
Aripiprazole 0.9975 0.9980 0.9979 0.9989 0.9980 0.9974 0.9990 0.9984 0.9988 0.9982
Chlorpromazine 0.9978 0.9997 0.9985 0.9963 0.9989 0.9975 0.9998 0.9993 1.0000 0.9986
Chlorprothixène 0.9927 0.9743 0.9702 0.9919 0.9900 0.9915 0.9895 0.9764 0.9793 0.9840
Clotiapine 0.9952 0.9778 0.9673 0.9723 0.9761 0.9882 0.9926 0.9974 0.9957 0.9847
Clozapine 0.9974 0.9981 0.9951 0.9825 0.9950 0.9985 0.9952 0.9997 0.9984 0.9955
Cyamémazine 0.9403 0.8030 0.8065 0.9091 0.9464 0.9555 0.9027 0.8797 0.8096 0.8836
Flupenthixol 0.9815 0.9465 0.9316 0.9826 0.9866 0.9928 0.9751 0.9374 0.9456 0.9644
Fluphénazine 0.9970 0.9912 0.9643 0.9957 0.9972 0.9984 0.9912 0.9765 0.9780 0.9877
Halopéridol 0.9834 0.9851 0.9980 0.9894 0.9980 0.9946 0.9983 0.9977 0.9985 0.9937
Lévomépromazine 0.9987 0.9947 0.9934 0.9950 0.9969 0.9969 0.9973 0.9938 0.9940 0.9956
Olanzapine 0.9869 0.9740 0.9832 0.9739 0.9900 0.9585 0.9928 0.9879 0.9979 0.9828
Pallipéridone 0.9812 0.9927 0.9906 0.9964 0.9953 0.9972 0.9735 0.9931 0.9923 0.9903
Perphénazine 0.9965 0.9970 0.9956 0.9768 0.9990 0.9990 0.9855 0.9845 0.9965 0.9923
Pipampérone 0.9776 0.9901 0.9805 0.9852 0.9955 0.9914 0.9231 0.9968 0.9819 0.9802
Promazine 0.9782 0.9374 0.9027 0.9027 0.9957 0.9864 0.9538 0.9544 0.9547 0.9518
Prométhazine 0.9717 0.9189 0.8858 0.8841 0.9888 0.9779 0.9380 0.9331 0.9372 0.9373
Quétiapine 0.9698 0.9655 0.9979 0.9424 0.9921 0.9898 0.9448 0.9526 0.9402 0.9661
Rispéridone 0.9815 0.9947 0.9911 0.9977 0.9971 0.9912 0.9716 0.9969 0.9958 0.9908
Sulpiride 0.9773 0.9900 0.9834 0.9432 0.9874 0.9701 0.8456 0.9787 0.9673 0.9603
Tiapride 0.9956 0.9106 0.9267 0.9056 0.9944 0.9681 0.8324 0.9663 0.9380 0.9375
Ziprasidone 0.9782 0.9935 0.9931 0.9712 0.9978 0.9953 0.9860 0.9977 0.9963 0.9899
Zuclopenthixol 0.9746 0.9382 0.9081 0.9494 0.9806 0.9909 0.8813 0.9482 0.9485 0.9466
r = ≥ 0.99
r = 0.98
r = 0.97
r = < 0.97
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Ce tableau représente les coefficients de corrélation pour chaque droite à triple effectué durant trois jours. Nous pouvons observer une certaine variabilité pour une même substance. Au niveau des résultats chiffrés (en annexe 8) ainsi que des coefficients de régression, nous observons une plus au moins bonne répétabilité ainsi qu’une bonne réponse des substances qui sont analysés avec leur deutéré correspondant. Cependant, certaines erreurs aléatoires se présentent à nouveau. Nous nous sommes aperçu que les hautes concentrations posent plus de problèmes. Ceci pourrait correspondre à une suppression d’ions. Avec 500 µl d’échantillon l’extrait ne pourrait pas être assez propre et il y aurait trop de matériel chargé dans la source (bruit de fond). De ce fait, il y aurait une baisse de signal importante. Pour nous permettre d’améliorer ce paramètre, nous allons effectuer une série d’essai. Nous allons dans un premier temps effectuer une droite à 500 µl d’échantillon mais cette fois sans extraction ainsi qu’une seconde droite à un volume d’échantillon de 200 µl ayant le sang de bovin négatif comme matrice et en procédant à une extraction de type SPE. D’autre part, un certain nombre de substances ont un temps de rétention similaire et il se pourrait que la distinction ne se fasse pas correctement. Certain temps de rétention sont très similaires mais cet effet ne devrait pas avoir d’importance si les masses molaires ainsi que les transitions sont différentes. Si ces paramètres sont trop proches, nous nous retrouverons dans le cas de figure montré ci-dessous.
Il y a deux substances qui ne se distinguent pas correctement : halopéridol et pipampérone. Il faudrait donc revoir les transitions et les modifier dans la méthode de quantification. Ces modifications feront partie des perspectives d’amélioration de la méthode. 9.1 Droite 500 µl d’échantillon sans extraction
A part le facteur de la matrice qui peut amener des interférences, nous pensons que le fait de ne pas effectuer d’extraction sur l’échantillon permet d’éviter la perte de standard et/ou standard interne. Lors de l’extraction, l’étape pouvant engendrée une perte de matériel est celle de l’évaporation des SI/Stds s’effectuant au début de la méthode.
Halopéridol
Pipampérone
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Cependant, nous nous sommes aperçus entre temps de notre erreur analytique et nous n’avons pas traité les résultats pour ces droites (erreur explicitée à la page 45). Nous avons juste remarqué que pour certaine substance comme promazine, prométhazine et cyamémazine les droites ne sont plus linéaires mais logarithmiques. Cet effet pourrait être du à une saturation du à une concentration trop élevée. Pour confirmer les résultats de la sensibilité, nous décidons d’effectuer une droite à 200 µl avec extraction de type SPE.
9.2 Droite 200 µl avec extraction
En théorie, lorsqu’un volume est diminué il y a une grande probabilité que le bruit de fond le soit aussi. Le but est d’arriver à obtenir une meilleure qualité d’extraction. Avec ce volume, nous pouvons observer une amélioration notamment dans les coefficients de régression (résultat en annexe 9). L’effet logarithmique dans les droites de calibration n’est plus présent. Ces dernières sont traitées de manière quadratic sans pondération. Ces deux essais suivant la validation ont pour intérêt de confirmer qu’un volume de 200 µl est nettement plus répétable et présente un bruit de fond diminué.
10 RENDEMENT D’EXTRACTION
Le but du rendement d’extraction est d’identifier une éventuelle perte de standard et/ou standard interne dans une droite de régression lors de la manipulation. Une telle perte engendre une diminution du signal lors de la détection. Pour ce faire nous allons effectuer : Une droite à triple comprenant trois points de concentrations différentes (basse,
moyenne et haute) en effectuant la méthode d’extraction normalement. Une droite à triple comprenant également trois points de la droite ayant les mêmes
concentrations que la première mais en traitant les échantillons différemment. En temps normal, nous spikons les standards internes en premier, les évaporons, mettons le sang de bovin et procédons à l’extraction. Pour cette deuxième droite, nous mettons le sang de bovin négatif, procédons à l’extraction et spikons les standards internes dans l’éluat.
Les résultats de base ont été traité en faisant la moyenne de chaque standard à triple et ceci pour chacune des substances. Pour certaines d’entre elles nous obtenons un rendement meilleur en spikant dans un premier temps les SI/Stds et pour d’autres un rendement optimum après l’extraction. Cependant, nous constatons que dans tous les cas la perte n’est pas excessive mais elle est plus marquée pour les hautes concentrations.
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Rendement d'extraction
0.0
0E
+00
1.0
0E
+07
2.0
0E
+07
3.0
0E
+07
4.0
0E
+07
5.0
0E
+07
6.0
0E
+07
Olanzapine
Pallipéridone
Perphénazine
Pipampérone
Promazine
Prométhazine
Quétiapine
Rispéridone
Sulpiride
Tiapride
Ziprasidone
Zuclopenthixol
Su
bsta
nces
Aires
Après extraction Moyenne Std 5
Avant extraction Moyenne Std 5
Après extraction Moyenne Std 3
Avant extraction Moyenne Std 3
Après extraction Moyenne Std 1
Avant extraction Moyenne Std 1
10.1 Résultats
Avant extraction Après extraction Avant extraction Après extraction Avant extraction Après extraction
Substances Moyenne Std 1 Moyenne Std 1 Moyenne Std 3 Moyenne Std 3 Moyenne Std 5 Moyenne Std 5
Amisulpride 1.08E+07 1.35E+06 1.37E+07 9.98E+06 2.12E+07 2.76E+07
Aripiprazole 5.73E+04 2.60E+04 1.21E+05 4.47E+06 7.05E+05 2.83E+05
Chlorpromazine 1.73E+05 8.75E+04 7.31E+05 2.57E+05 6.66E+06 2.68E+05
Chlorprothixène 4.55E+06 3.66E+06 4.20E+06 3.43E+06 9.03E+06 6.09E+06
Clotiapine 1.17E+06 9.75E+05 1.95E+06 1.47E+06 1.10E+07 8.99E+06
Clozapine 1.34E+06 1.06E+06 8.29E+06 7.58E+06 2.27E+07 1.93E+07
Cyamémazine 2.12E+05 7.15E+04 1.51E+06 7.54E+05 6.26E+06 4.47E+06
Flupenthixol 2.47E+05 1.67E+05 5.78E+05 2.77E+05 3.93E+06 1.86E+06
Fluphénazine 2.59E+04 1.60E+05 2.67E+05 1.72E+05 1.33E+06 7.02E+05
Halopéridol 1.11E+06 1.42E+06 1.93E+06 2.62E+06 6.55E+06 8.35E+06
Lévomépromazine 2.55E+05 6.63E+04 1.18E+06 2.29E+05 1.18E+07 3.97E+07
Olanzapine 4.66E+04 4.17E+03 2.23E+05 2.07E+04 5.32E+06 2.09E+06
Pallipéridone 3.66E+05 4.12E+05 5.24E+05 5.30E+05 2.89E+06 3.95E+06
Perphénazine 3.82E+05 2.67E+05 3.79E+05 2.69E+05 1.70E+06 9.09E+05
Pipampérone 3.58E+05 5.55E+05 1.14E+06 1.38E+06 6.83E+06 7.07E+06
Promazine 3.43E+06 9.32E+05 1.80E+07 7.89E+06 4.77E+07 3.41E+07
Prométhazine 3.11E+06 1.03E+06 1.34E+07 7.87E+06 3.73E+07 2.77E+07
Quétiapine 2.20E+06 1.88E+06 1.27E+07 1.25E+07 3.07E+07 3.00E+07
Rispéridone 7.97E+05 1.25E+06 1.09E+06 1.50E+06 5.07E+06 6.66E+06
Sulpiride 1.19E+04 4.92E+04 3.31E+05 5.13E+05 1.80E+06 2.30E+06
Tiapride 8.17E+05 7.31E+05 6.33E+06 7.91E+06 2.78E+07 3.22E+07
Ziprasidone 4.34E+04 2.16E+04 2.77E+05 1.41E+05 1.98E+06 1.19E+06
Zuclopenthixol 3.38E+04 2.40E+04 3.42E+04 2.43E+04 1.24E+05 6.80E+04
Après discussion, nous avons décidé de continuer à spiker nos standards et standards internes avant de procéder au reste de l’extraction. Pour démontrer visuellement cette différence j’ai effectué des graphiques qui nous permettent de vérifié qu’il n’y ait pas une manière analytique prédominante. 10.2 Tableaux récapitulatifs
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Rendement d'extraction
0.0
0E
+00
5.0
0E
+06
1.0
0E
+07
1.5
0E
+07
2.0
0E
+07
2.5
0E
+07
3.0
0E
+07
3.5
0E
+07
4.0
0E
+07
4.5
0E
+07
Am
isulp
ride
Arip
ipra
zole
Chlorp
rom
azine
Chlorp
roth
ixèn
eClotia
pine
Cloza
pine
Cya
mém
azine
Flupe
nthixol
Fluph
énazine
Halopé
ridol
Lévo
mép
rom
azine
Su
bsta
nces
Aires
Après extraction Moyenne Std 5
Avant extraction Moyenne Std 5
Après extraction Moyenne Std 3
Avant extraction Moyenne Std 3
Après extraction Moyenne Std 1
Avant extraction Moyenne Std 1
11 CONTRÔLES DE QUALITÉ INTERNE
Les contrôles de qualité interne font partie de la droite de quantification et démontrent la précision et l’exactitude d’une méthode analytique. Le but d’un CQ est également de pouvoir certifier nos résultats de routine. Pour choisir un contrôle de qualité et permettre la validation de celui-ci, plusieurs critères sont à prendre en compte. La spécificité
La spécificité permet la mise en évidence d’une substance au travers des interférences d’une matrice. La linéarité La linéarité permet d’obtenir un résultat proportionnel à la concentration dans l’échantillon. L’exactitude Petitesse entre la valeur trouvée et la valeur acceptée. Tous ces paramètres sont dépendants de la méthode analytique Intervalles de confiance Pour chaque contrôle de qualité commercial, le fournisseur garantit la présence de la substance recherchée dans une gamme de concentration définie. Le contrôle de qualité dans un mode analytique doit être compris entre les intervalles donnés par le fournisseur. Une valeur cible est également donnée par ce dernier. En routine, nous acceptons un écart de 20% entre la valeur cible et la valeur trouvée.
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Dans le cadre de la validation, nous avons effectué chaque jour deux contrôles de qualité à concentration faible, moyenne et haute. 11.1 Résultats Pour effectuer ce tableau, j’ai travaillé sur les résultats bruts en calculant la moyenne des résultats à triple pour chaque jour et pour chaque substance. Pour terminer, j’ai effectué une moyenne générale comprenant J1/J2/J3.
Après analyse de ces résultats, nous observons une bonne répétabilité notamment au niveau des faibles et moyennes concentrations. Cependant, le résultat obtenu pour certaines substances est beaucoup trop élevés (facteur x5 pour l’Aripiprazole). Ce phénomène se ressent principalement au travers des hautes concentrations. N’ayant pas plus de temps pour continuer la partie pratique, nous nous arrêtons là pour mon travail de diplôme. Afin que celui-ci puisse être repris dans le futur, je vais procéder à une conclusion ainsi qu’à des perspectives d’amélioration pour permettre une validation complète de ma méthode.
Substances moyenne Cqi jour 1 moyenne Cqi jour 2 moyenne Cqi jour 3 Moyenne Intervalles de confiance ng/ml
Amisulpride 449 659 668 592 342-512
Aripiprazole 1498 1546 1420 1488 226-340
Chlorpromazine
Chlorprothixène 343 500 853 565 209-313
Clotiapine
Clozapine 645 548 554 582 391-587
Cyamémazine
Flupenthixol
Fluphénazine
Halopéridol 17 16 14 16 10.7-16.1
Lévomépromazine 67 90 83 80 56.5-84.7
Olanzapine 79 99 70 83 49.5-74.2
Pallipéridone 73 47 48 56 49.5-74.2
Perphénazine
Pipampérone 201 289 344 278 265-397
Promazine
Prométhazine 317 463 559 446 267-401
Quétiapine 319 338 510 389 194-292
Rispéridone 17 11 11 13 11.0-16.5
Sulpiride
Tiapride
Ziprasidone 85 82 82 83 83.2-125
Zuclopenthixol
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12 CONCLUSION
Afin d’apporter des améliorations à la méthode de base existante en routine, nous avons travaillé sur divers éléments. Dans un premier temps, nous avons optimisé les paramètres pour la chromatographie liquide en effectuant des changements notamment sur la concentration en solvant B et en augmentant le débit. Cette étape nous permet aujourd’hui de mettre en évidence notre panel de neuroleptiques. Dans un second temps, nous avons optimisé les paramètres MS/MS grâce aux infusions. Les résultats de cette étape nous ont permis d’obtenir des fragments précis aboutissant à la reconnaissance spécifique des substances. Pour terminer, nous avons également mis en place une méthode d’extraction adéquate et avons pu partiellement valider notre méthode quantitative. A l’heure actuelle, nous avons réussi à créer une méthode quantitative pouvant déceler un panel défini de neuroleptiques. Cette dernière nécessite un traitement de l’échantillon par une extraction sur phase solide à un volume de 200 µl. Notre méthode n’étant pas complètement validée, elle a quand même pu être utilisée pour un cas de routine. Malgré cela, des perspectives d’amélioration doivent être proposées.
13 PERSPECTIVES D’AMÉLIORATION
N’ayant pas plus de temps pour aboutir mon travail, je ne peux que soumettre des propositions pour la suite. Dans un premier temps, il faudrait reprendre les transitions pour effectuer les changements notamment pour halopéridol et pipampérone. Il faudrait ensuite refaire une droite pour vérifier que ces dernières se distinguent correctement. Dans un second temps, il faudrait refaire une partie de la validation avec un volume d’échantillon à 200 µl, vérifier l’exactitude et la répétabilité des résultats ainsi que déterminer les limites de détection (LOD) et quantification (LOQ) pour chaque substance. Après discussion, nous souhaiterions dans l’idéal obtenir des pics plus fins pour une détection plus rapide. Pour ce faire, une nouvelle colonne est en cours d’essai. Cette dernière aurait pour avantage de supporter une tension plus élevée et nous pourrions donc augmenter le débit. Elle a été commandée dans le but principal d’aboutir à une détection plus rapide et de permettre une bonne séparation notamment pour les substances posant problèmes.
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14 REMERCIEMENTS
Je voudrais remercier M. Marc Augsburger pour m’avoir permis d’effectuer mon stage au Centre Universitaire romand de Médecine Légale et d’avoir mis à disposition tout le matériel nécessaire à la réalisation de mon travail de diplôme. Un remerciement tout particulier pour M. Franck Sporkert pour m’avoir suivi tout au long de ma formation en m’apportant de bonnes connaissances théoriques ainsi que des repères pour l’élaboration de mon travail de diplôme. Un grand merci à Mme. Catherine Meylan Bohnenblust pour m’avoir suivi et cadrer tant dans mon travail en routine que lors de mon travail de diplôme. Un merci tout particulier pour son engagement et ses compétences qui ont permis l’élaboration de mon TD. Pour terminer, je souhaiterai remercier toute l’équipe qui a fait preuve d’un grand soutien et m’a permis d’effectuer mon stage dans des conditions optimales dans un cadre jovial et familial.
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15 GLOSSAIRE [45]
Région caudale du cerveau
C’est une région du cerveau qui comprend le mésencéphale, le pont, le bulbe
rachidien let la moelle épinière.
Régions sous corticale du cerveau
C’est la partie qui se trouve sous le cortex cérébral ou se trouve les fonctions du
système nerveux les plus élaborées
Pédoncule cérébral
Servent à l’échange d’informations motrices et sensitives. Ces informations passent
de la moelle épinière, au bulbe rachidien, au pont, au cervelet, au thalamus et au
télencéphale
Corps striés
Eléments très important du SNC reliés à des composants constitués de substances grises [46]
Linéaire sans pondération
Linéaire : lorsque la droite passe par zéro et continue jusqu’au dernier point de la
droite sans variation
Sans pondération : c'est-à-dire sans marge d’erreur comprise entre le premier point
et le dernier point de la droite.
Quadratic sans pondération
Quadratic : les points sont reliés un par un du premier point de la droite au dernier en
tenant compte des variations.
Sans pondération : c'est-à-dire sans marge d’erreur comprise entre le premier point
et le dernier point de la droite.
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16 RÉFÉRENCES
[1] Denis Stora (2005) Pharmacologie B.P. classes pharmacologiques. 3ème
édition
[2] Collection Michel Vaubourdolle (2007) Médicaments. Tom 4, 3ème
édition
[3] Explications données par Mme Marie Fabricius, Doctorante au centre Universitaire Romand de médecine légale
[4] Eureka santé. (24 mars 2011). MN-net Les risques des différents médicaments sur la conduite automobile. VIDAL 2009-2012 [Page web]. Accès : http://www.eurekasante.fr/medicaments/prendre-traitement/medicaments-conduite-voiture.html (page consultée le, 8 février 2012)
[5] http://neuroleptiques.wordpress.com (page consultée le, 8 février 2012)
[6] Dominique Piettre Centre hospitalier Léon Binet. (2008). Les neuroleptiques. [Page web]. Accès : http://adiph.org/neuroleptiques_DP_06_2008.pdf (page consultée le 14 février 2012)
[7] Nicolas Franck. (janvier 2005). Les Neuroleptiques. Centre Hospitalier Le Vinatier & Institut des
Sciences Cognitives. [Page web]. Accès :
www.isc.cnrs.fr/jea/Neuroleptiques.ppt
[8] Dr. B. Tefahi maître assistante en psychiatrie Thérapeutiques, Thérapeutique en psychiatrie
Faculté de médecine Annaba. [Page web]. Accès :
www.facmed-annaba.com (page consultée le, 28 février 2012)
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[36] Laboratoire de Chimie Analytique Pharmaceutique- Genève, La chromatographie en phase liquide LC/HPLC. Page Web. Accès :
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[37] Documents de laboratoire effectué par Mme Catherine Meylan Bonhnenblust
[38] Applied Biosystems, 3200 Q Trap R LC/MS/MS system Training
[39] CHAPITRE IV: Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Page Web. Accès :
http://www.icsn.cnrs-gif.fr/IMG/pdf/chapitre4.pdf (page consultée le, 12 mars 2012)
[40] Catherine Zimmermann, André Deom, Dagmar Kesseler. (septembre 2009) FICHE TECHNIQUE 27: spectrométrie de masse (MS et MS/MS).Centre Suisse de Contrôle de Qualité. Page Web. Accès :
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[41] Patrick Edder, Didier Ortelli, Claude Corvi. (septembre 2010) Potentiel de la LC-MS/MS ESI pour l’analyse des résidus des médicaments vétérinaires. Service de protection de la consommation. Page Web. Accès :
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[42] Kristina Y. Rust, Markus R. Baumgartner, Natascha Meggiolaro, Thomas Kraemer, Detection and validated quantification of 21 benzodiazepines and 3 “z-drugs” in human hair by LC-MS/MS. Forensic Science International, Institute of legal Medicine, University of Zurich.
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[45] Nicole Menche.(2006). 3ème édition Maloine. Anatomie, Physiologie, Biologie
[46] Théorie explicitée au laboratoire
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17 ICONOGRAPHIE Fig. 1 page 3: Action sur le système dopaminergique
[Page web]. Accès : http://agidd-smq.forumactif.com
Fig. 2 page 5: Synapse et récepteurs dopaminergiques
[Page web]. Accès : http://www.hcplive.com
Fig. 3 / 4 / 5 page 8: Structure chimique en commun
[Page web]. Accès : http://chemistry.about.com
Fig. 6 page 8: Atome chimique en commun des thioxanthènes
[Page web]. Accès : http://fr.wikipedia.org
Fig. 7 page 12: Appareils (LC-MS/MS) de laboratoire
Photo effectuée par moi des instruments au laboratoire
Fig. 8 page 13: Colonne Chromsep C18 et principe d’adhérence
Graphique réalisé par moi-même en me basant sur le manuel de laboratoire Applied
Biosystems, 3200 Q Trap R LC/MS/MS system Training
Fig. 9 page 14: Source d’ionisation
Photo prise dans le manuel de laboratoire Applied Biosystems, 3200 Q Trap R LC/MS/MS system
Training
Fig. 10 page 15: Schéma pour l’Electro Spray Ionization (ESI)
Photo prise dans le manuel de laboratoire Applied Biosystems, 3200 Q Trap R LC/MS/MS system
Training
Fig. 11 page 15: Schéma de la séparation depuis la source jusqu’à Q3
Photo prise dans le manuel de laboratoire Applied Biosystems, 3200 Q Trap R LC/MS/MS system
Training
Fig. 12 page 15: Photo du MS/MS au laboratoire
Photo effectuée par moi des instruments au laboratoire
Fig. 13 page 16: Principe de fragmentation
[Page web]. Accès : http://gsite.univ-provence.fr/gsite/Local/lcp-ira/dir/Etienne/Cours%20MasS.pdf
Fig. 14 page 16: Principe du détecteur
[Page web]. Accès : http://membres.multimania.fr/juljefgui/1.htm
Fig. 15 / 16 page 17: Structure chimique
[Page web]. Accès : http://fr.wikipedia.org
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18 ANNEXE 1 PROTOCOLE 1 : PRÉPARATION DES SOLUTIONS
La concentration désirée pour chaque solution-fille est de 10 µg/ml. La masse prélevée pour
une substance pure est de 0.01g / 10 ml MeOH. Pour toutes particules couplées à un autre
élément (en l’occurrence le HCL) la masse désirée doit être calculée en fonction du poids
moléculaire de l’acide chloridrique ainsi que de la substance pure de base.
Masse molaire HCL : 36.4609 (tableau périodique des éléments)
Chlorpromazine HCL :
Mmol (subst.pure) 318.09576 0.01 g
Mmol (subst.liée) 354.55666 x
X= 0.0112 g
Fluphénazine dihydrochloride :
437.17487 0.01 g
Mmol (subst.liée) 510.09667 x
X= 0.0117 g
Promazine HCL:
Mmol (subst.pure) 284.13474 0.01 g
Mmol (subst.liée) 320.59564 x
X= 0.0113 g
Flupenthixol dihydrochloride :
Mmol (subst.pure) 434.16397 0.01g
Mmol (subst.liée) 507.08577 x
X=0.0117 g
Zuclopenthixol hydrochloride
Mmol (subst.pure) 400.13760 0.01 g
Mmol (subst.liée) 436.5985 x
X= 0.0109 g
Pipamperone hydrochloride :
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Mmol (subst.pure) 375.23221 0.01 g
Mmol (subst.liée) 411.69311 x
X= 0.0110 g
Tiapride hydrochloride :
Mmol (subst.pure) 328.14569 0.01 g
Mmol (subst.liée) 364.60659 x
X= 0.0111 g
Prométhazine HCL :
Mmol (subst.pure) 284.13474 0.01 g
Mmol (subst.liée) 320.59564 x
X= 0.0113 g
Lévomépromazine Hydrochloride :
Mmol (subst.pure) 328.16095 0.01 g
Mmol (subst.liée) 364.62185 x
X= 0.0111 g
La valeur des masses molaires a été prise à partir du volume 2 de Mass spectral and GC data, H.
Maurer, Karl Pfleger, A. Weber
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19 ANNEXE 2 RÉSULTAT DES INFUSIONS
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20 ANNEXE 3 MODIFICATIONS DES PARAMÈTRES DE LA MÉTHODE
Description de la méthode
0 à 1 min : 0% acétonitrile (ACN)
1 à 8 min : 20% ACN
8 à 14.5 min : 40% ACN
16 à 17 min : 0% ACN
Pourcentage
Description de la méthode
0 à 1 min : 0% acétonitrile (ACN)
1 à 5 min : 20% ACN
8 à 12 min : 40% ACN
13 à 16 min : 60% ACN
17 min : 0% ACN
Pourcentage
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Pourcentage
Description de la méthode
0 à 1 min : 0% acétonitrile (ACN)
2 à 5 min : 30% ACN
8 à 12 min : 50% ACN
13 à 18 min : 70% ACN
20 à 23 min: 90% ACN
Pourcentage
Débit
Description de la méthode
0 à 1 min : 10% acétonitrile (ACN)
5 à 8 min : 50% ACN
15 à 23 min : 90% ACN
24 min : 10% ACN
25 min : 0% ACN
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Mélange de substances
Gamme de [ng/ml ] [ ] 1 [ ] 2 [ ] 3 [ ] 4 [ ] 5
Mélange A 0.5 2 5 20 100 Solution à 100 ng/ml
Fluphénazine 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 500 µl
Palipéridone 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 500 µl
Perphénazine 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 500 µl
Rispéridone 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 500 µl
Zuclopenthixol 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 500 µl
Mélange B 5 20 50 200 500 Solution à 0.1 µg/ml
Aripiprazole 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 250 µl
Chlorpromazine 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 250 µl
Chlorprothixène 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 250 µl
Clotiapine 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 250 µl
Flupenthixol 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 250 µl
Halopéridol 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 250 µl
Lévomépromazine 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 250 µl
Olanzapine 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 250 µl
Pipampérone 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 250 µl
Ziprasidone 2.5 µl 10 µl 25 µl 100 µl 250 µl
Mélange C 50 200 500 1000 2500 Solution à 10 µg/ml
Amisulpride 2.5 µl 10 µl 25 µl 50 µl 125 µl
Clozapine 2.5 µl 10 µl 25 µl 50 µl 125 µl
Cyamémazine 2.5 µl 10 µl 25 µl 50 µl 125 µl
Promazine 2.5 µl 10 µl 25 µl 50 µl 125 µl
Prométhazine 2.5 µl 10 µl 25 µl 50 µl 125 µl
Quétiapine 2.5 µl 10 µl 25 µl 50 µl 125 µl
Sulpiride 2.5 µl 10 µl 25 µl 50 µl 125 µl
Tiapride 2.5 µl 10 µl 25 µl 50 µl 125 µl
21 ANNEXE 4 MÉLANGE DE SUBSTANCES
Calculs: C1 x V1 = C2 x V2
C1= concentration de la sol
V2= volume à calculer
C2= [ ] de la droite (ex:50)
V2= v de l'éch ( cf. méthode )
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22 ANNEXE 5 RÉSULTATS CHIFFRÉS DE LA SÉLECTIVITÉ
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23 ANNEXE 6 MÉTHODE D’EXTRACTION DES NEUROLEPTIQUES
ETAPES INFORMATIONS VISA
2.5 μl Halopéridol-D4, Chlorpromazine-D3, Clozapine-D4,
Olanzapine-D8, Aripiprazole-D8 [sol. à 10 μg/ml]
Préparé le
Droite 1 : Fluphénazine, Palipéridone, Perphénazine, Rispéridone,
Zuclopenthixol
Std : 0, 0.5, 2, 5, 20, 100 ng/ml
Prélever :
0, 0.25, 1, 2.50, 10, 50 [sol à 0.1 μg/ml]
Droite 2 : Aripiprazole, Chlorpromazine, Chlorprothixène, Clotiapine,
Flupenthixol, Halopéridol, Lévomépromazine, Olanzapine,
Pipampérone, Ziprasidone
Std : 0, 5, 20, 50, 200, 500 ng/ml
Prélever :
0, 2.5, 10, 25, 100, 250 [sol à 1 μg/ml]
Droite 3 : Amisulpride, Clozapine, Cyamémazine, Promazine,
Prométhazine, Quétiapine, Sulpiride, Tiapride
Std : 0, 50, 200, 500, 1000, 2500 ng/ml
Prélever :
0, 2.5, 10, 25, 50, 125 [sol à 1μg/ml]
Préparées le
Préparées le
_______________________
_______________________
________________________
________________________
Evaporer sous N2 à T°C ambiante
Ajouter 0.2 ml d’échantillon Peser le sang !
Ajouter 0.5 ml de tampon carbonate 10 mM pH 9.3 (IV t8) Préparé le
Ajouter 4 ml 1-chlorobutane (I C1) Lot N°
Vortexer rapidement, agiter environ 15 minutes.
Centrifuger 10 min, au minimum à 3500 t/min
Récupérer la phase organique (phase supérieure)
Evaporer sous N2 à T°C ambiante
Reprendre le résidu avec 100 µl d’un mélange (15 : 85 ; v/v) ACN :
Tampon formate d’ammonium 5mM pH 6.1 (IVt25) Préparer le jour même
Vortexer, transférer dans des microvials ou équivalents
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24 ANNEXE 7 MÉTHODE D’EXTRACTION DES OPIACÉS
ETAPES INFORMATIONS VISA
2.5 μl Halopéridol-D4, Chlorpromazine-D3, Clozapine-D4,
Olanzapine-D8, Aripiprazole-D8 [sol. à 10 μg/ml]
Droite 1 : Fluphénazine, Palipéridone, Perphénazine, Rispéridone,
Zuclopenthixol
Std : 0, 0.5, 2, 5, 20, 100 ng/ml
Prélever :
0, 0.25, 1, 2.50, 10, 50 [sol à 0.1 μg/ml]
Droite 2 : Aripiprazole, Chlorpromazine, Chlorprothixène, Clotiapine,
Flupenthixol, Halopéridol, Lévomépromazine, Olanzapine,
Pipampérone, Ziprasidone
Std : 0, 5, 20, 50, 200, 500 ng/ml
Prélever :
0, 2.5, 10, 25, 100, 250 [sol à 1 μg/ml]
Droite 3 : Amisulpride, Clozapine, Cyamémazine, Promazine,
Prométhazine, Quétiapine, Sulpiride, Tiapride
Std : 0, 50, 200, 500, 1000, 2500 ng/ml
Prélever :
0, 2.5, 10, 25, 50, 125 [sol à 1μg/ml]
Préparée le
Evaporer brièvement les tubes pour éviter des contaminations lors de
l’ajout des échantillons. !!! Pas obligatoire !!!
Dans un tube, peser 0.2 ml d’échantillon de sang
Pour les standards, peser 0.2 ml de matrice « sang négatif».
N°UTCF :
______________________
Préparer les Contrôles qualité internes : CQi Chromsystems Lot/ Exp :
Ajouter dans chaque tube 4.5 ml de tampon acétate d’ammonium
50 mM à pH 5.0 (IV t32) Préparé le
Vortexer brièvement.
Centrifuger 10 min. à 3500 rpm.
Transvaser le surnageant dans un nouveau tube de 10 ml si
l’extraction se fait sur l’extracteur automatique ASPEC GX-274
(Gilson).
Voir PR 32120.
Installer les colonnes « Evolute CX-50 » Biotage
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ASPEC Voir PR 32 120
Conditionner :
2 ml de méthanol (I M1a ou b). Les colonnes ne doivent pas
sécher !
Lot :
2 ml de tampon acétate d’ammonium 50mM à pH 5.0 (IV t32).
Les colonnes ne doivent pas sécher ! Préparé le
Faire passer les échantillons dans les colonnes par renversement
des tubes. Les colonnes ne doivent pas sécher !
Laver :
Ajouter 3 ml d’acide formique 2% (dans de l’eau), afin de
s’assurer de ioniser toutes les substances
Préparé le jour même.
Lot Ac. formique 98%
(IIIA4):_____________
Ajouter 4 ml de méthanol (I M1a ou b). Lot :
Sécher environ 15 min. sous vide.
Eluer :
2 fois avec 1 ml de méthanol/ammoniaque (I M1a ou b + IH3 95 :5
v/v). Récolter l’éluat.
Préparé le jour même.
Lot Méthanol : _____________
Lot Ammoniaque : ___________
Evaporer l’éluat sous azote à 37°C, environ 40 min.
Reprendre les échantillons avec 100 µl de mélange tampon formate
5 mM (IV t22) à pH optimum de 3.8 et d’ACN (50 :50) Préparé le jour même.
Vortexer, centrifuger 10min à 3500rpm et transférer dans des
microvials ou équivalents.
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25 ANNEXE 8 RÉSULTATS DE LA VALIDATION
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26 ANNEXE 9 RÉSULTATS DES DROITES DE RÉGRESSION
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