RNDr.Radek Trojanec, Ph.D

RNDr.Radek Trojanec, Ph.D.

CYTOGENETICKÁ LABORATOŘ

Chromozómy a jejich aberace

Laboratoř experimentální medicíny (LEM)

www.LEM-Olomouc.cz

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

ZÁKLADNÍ TYPY CYTOGENETICKÝCH

ABERACÍ

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Změny (aberace, mutace)Numerické: aneusomie, polysomie: Pataův syndrom (trisomie 13, viz obr.), Downův sy. (trisomie 21), Edwardsův sy. (trisomie 18), aneusomie gonosomů (Klinfelterův sy. 47,XXY; Turnerův sy. 45,X atd.), onkologická onemocnění apod.

Strukturální: delece, translokace, amplifikace, inverze apod.: Cri du chat sy.(sy.kočičího křiku; 5p-), retinoblastom,onkologická onemocnění apod.

Jiné poruchy: uniparentální disomie (Prader-Willi sy.), syndromy chromosomální instability (xeroderma pigmentosum, ataxia telangiectasia) apod.

http://www.rodina.cz

Downův syndrom• incidence 1: 600-800• Trizomie chromozómu 21• při narození: hypotonie, šikmé

oční štěrbiny, anomálie uší, ploché záhlaví, opičí rýha, epikantus (vnitřní koutek), srdeční vady, vady dalších orgánů

• fenotyp starších jedinců: mentální retardace, hypogenitalismus ♂, porucha dentice, krátké, široké ruce, brachydaktylie, poruchy imunity, vyšší riziko nádorových onemocnění (leukémie)

EPICANTUS

www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf

http://www.rodina.cz/g/deti/postizeni/dite_down_syndrom.jpg

Klinefelterův syndrom 47, XXY

• incidence: 1: 1000

vysoká postava, průměrná inteligence, psychosexuální orientace mužská, hypoplázie testes, kryptorchismus, sterilita – azoospermie, gynekomastie

www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf

Supermale 47, XYYY

• mohutnější vzrůst, vysoká postava, průměrná inteligence, pohlavní vývoj normální, plodnost normální, neuvádí se vyšší riziko chromosomálních aberací pro potomstvo, neprokázán narušený psychosociální vývoj

dvojčata, vyšší 47, XYYwww.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf

Turnerův syndrom 45, X

• incidence 1: 5000 – 10000malý vzrůst – možnost hormonální terapie, gonadální dysgeneze, primární amenorea, normální inteligence, krátký, široký krk (pterygium colli), nízká vlasová hranice, štítovitý hrudník, edémy na HK i DK (novorozenci)

www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Balancované změny: „obsah“ DNA v buňce se nezmění

Nebalancované změny: v „obsahu“ DNA přebývají či chybí sekvence

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Delece: znamená ztrátu genetického materiálu. Může se jednat o deleci celých částí chromozomů, či například jen určitého genu

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Inzerce, duplikace : přidání genetického materiálu (párů bází) do DNA v chromozomu

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Amplifikace: specifický způsob přidání DNA sekvencí: Jedná se o zmnožení konkrétního genu v rámci chromozomu či určitého úseku v  chromozomu

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Inverze: vzniká po dvojnásobném zlomu v témž chromozomu. Příslušný úsek vymezený zlomy se z chromozomu odštěpí a připojí převrácený o 180°. Důsledkem je juxtapozice (přiblížení) určitého genu k jinému, což může způsobit tvorbu chimerického proteinu či kontrolu genu jiným promotorem.

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Translokace: vzniká výměnou úseků mezi různými chromozomy. Její důsledky jsou podobné, jako u inverze

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Ring chromozom: Je-li chromozom porušen 2 zlomy a následně spojen, vzniká kruhová struktura. Je-li v tomto útvaru zachována centromera, může být ring chromozom i mitoticky aktivní.

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Genomický imprinting je proces, kdy je aktivita určitého genu regulována v závislosti na tom, od kterého rodiče byl gen zděděn. Ve většině případů to znamená, že pouze maternální nebo paternální alela je exprimována (je aktivní), kdežto druhá je utlumena.Uniparentální disomie - oba chromozómy v páru původem od jednoho rodiče)Angelmanův syndrom: absence mateřské kopie části chromosomu 15Prader-Williho syndrom: Absence otcovské kopie části chromosomu 15

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

problémy s pohybem, koordinací chůze a stabilitou nonverbální komunikační schopnosti jsou mnohem lepší než verbální mávání a vyvažování horními končetinami, vibrující paže zvláštní chování, velmi často se usmívá, obvykle má šťastnou náladu, v excitaci mává a tleská rukama

Angelmanův syndrom: „Happy puppet“, „Syndrom šťastného dítěte“ Nejčastěji:neschopnost mluvit, pouze minimum slov, komunikují nonverbálně, nonverbální komunikace převyšuje verbální opoždění psychomotorického vývoje, těžký zpomalený  vývoj

www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf

Prader- Williho syndrom -

NOVOROZENCI, KOJENCI:těžká hypotonie, neprospívání, opoždění vývoje, faciální dysmorfie

POZDNĚJŠÍ VĚK:mentální retardace, polyfagie – těžká obezita, hypogenitalismus, poruchy chování

www.vscht.cz/kot/resources/studijni-materialy/bc-p-004/prezentace.pdf

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

CYTOGENETICKÝ ZÁPIS

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

ISCN (2005): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Shaffer LG., Tommerup N. (eds); Karger S., Basel 2005

add = Addition material of unknown origindel = Deletionde novo = A chromosome abnormality which has not been inheritedder = Derivative Chromosomedic Dicentricdup = Duplicationfra = Fragile Siteidic = Isodicentric chromosomeins = Insertioninv = Inversioni or iso = Isochromosomemar = Marker chromosomemat = Maternal originMinus sign (-) = Lossmos = Mosaicp = Short arm of chromosomepat = Paternal origin Plus sign (+) = Gain

q = Long arm of chromosomer = Ring chromosomercp = Reciprocalrea = Rearrangementrec Recombinant chromosomerob = Robertsonian translocationt = translocationtel = Telomere (end of chromosome arm)ter = Terminal end of chromosomeupd = Uniparental disomy

46,XX - Normal Female Karyotype46,XY - Normal Male Karyotype

These descriptions say there are 46 chromosomes and that it is a male or female.

46,XX,del(14)(q23)

Female with 46 chromosomes with a deletion of chromosome 14 on the long arm (q) at band 23.

46,XY,dup(14)(q22q25)

Male with 46 chromosomes with a duplication of chromosome 14 on the long arm (q) involving bands 22 to 25.

46,XX,r(7)(p22q36)

Female with 46 chromosomes with a 7 chromosome ring. The end of the short arm (p22) has fused to the end of the long arm (q36) forming a circle or 'ring'

47,XY,+21

Male with 47 instead of 46 chromosomes and the extra chromosome is a 21. (Down Syndrome)

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

• VYŠETŘOVACÍ METODY

• PŘÍKLADY VYŠETŘENÍ

ONKOGENETICKÝCH

MARKERŮ

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Význam v prenatální dg. i v onkologii: RFC gen

(Reduced Folate Carrier Gene)

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Fluorescenční in situ hybridizace

(FISH)Metodou  fluorescenční in situ hybridizace lze lokalizovat cílové nukleotidové sekvence přímo v buňkách (in situ). Metoda FISH je založena na schopnosti jednořetězcové DNA sondy vázat komplementární úsek cílové DNA fixované na mikroskopickém skle.

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Fluorescenční in situ hybridizace

(FISH)

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

E.Kočárek et al.:Vybrané kapitoly z lékařské cytogenetiky a genetického poradenství; Ústav biologie a lékařské genetiky FN Motol a UK 2.LF (2004)

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

WCP –Whole Chromosome Painting

(celochromozómové sondy)

CEP 17Her-2/neu

Jádro s normálním počtem kopií genu a chromozomu

Nepravá amplifikace (polyzomie)

Amplifikace

LABORATOŘ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY

LABORATOŘ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY

CEP 17Her-2/neu

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

t(9;22)(q34;q11) Philadelphia (Ph) chromozom (Nowell, Hungerford,1962) BCR-ABL CML, ALL, AML, ST STI-571 (Glivec)

t(15;17)(q22;q11-21) PML-RARA AML M3 (PML) ATRA

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

CGH (Kallioniemi, 1992)

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Mnohobarevná FISH

(M-FISH)

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Mnohobarevná FISH

(M-FISH)

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Multicolor banding

Microarrays

Her-2/neu (c-erbB-2)

•Receptor EGF

•Nejčastěji amplifikovaný onkogen u ca prsu (10-15%)

•Protein p185HER-2 – souvisí s maligní transformací a agresivitou choroby

•Pacientky s overexpresí proteinu a/nebo amplifikací genu indikovány k terapii monoklonální protilátkou trastuzumab (Herceptin)

•Různé metody vyšetření

LABORATOŘ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY

Vyšetření Her-2/neu (c-erbB-2): IHC x FISH

IHC fotografie byly získány ve spolupráci s Ústavem patologie LF UP

IHC:0 FISH: normální

IHC: 1+ až 2+FISH: normální nepravá amp. amplifikace

IHC: 3+FISH: amplifikace

CEP 17

Her-2/neu

CEP 17 LSI Her-2/neu

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

Her-/neu (c-erbB-2): amplifikované případy: senzitivita na antracykliny aplikace Herceptinu

TOP2A: Topoizomeráza II = cíl pro některé typy cytostatik: inhibitory topoizomeráz II

tj. senzitivita na antracykliny

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

EGFR1 (Her-1)• ca.plic

• FISH & sekvenace

• aplikace inhibitorů: Cetuximab (Erbitux). Gefitinib (Iressa),

erlotinib (Tarceva)…

Common Approaches to Targeting HER1/EGFR

Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. N Engl J Med. 2001;344:783-792; Mendelsohn J, Baselga J. Oncogene. 2000;19:6550-6565; Noonberg SB, Benz CC. Drugs. 2000;59:753-767; Raymond E, Faivre S, Armann JP. Drugs. 2000;60(Suppl 1):15-23; Arteaga C. J Clin Oncol. 2001;19:32s-40s; Pedersen MW, Meltom M, Damstrup L, et al. Ann Oncol. 2001;12:745-760.

Anti-HER1/EGFR-blocking antibodies

Anti-ligand-blocking

antibodies

TKinhibitors Ligand–

toxinconjugates

Antibody–toxin

conjugates

PP P

P

Sekvenace DNA

A T C C A C G G C T G

A T C C A C G G C T G

Priklad praktickeho vystupu analyzy DNA - detekce bodovych mutaci v sekvenci

CEP 17 LSI Her-2/neu

LASEROVÁ MIKRODISEKCE (LCM)LASEROVÁ MIKRODISEKCE (LCM) LCM je metoda která umožňuje isolaci buněk z komplexu tkáně.

Přístroj VERITAS pro LCM od firmy ARCTURUS.

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

TECHNIKA LASEROVÉTECHNIKA LASEROVÉ MIKRODISEKCEMIKRODISEKCE

Cytospin, buněčná linie K562

Cytologický preparát adenokarcinomu plic

Parafinový/kryořez nádorové tkáně

LABORATORY OFEXPERIMENTALMEDICINE

• Protoonkogeny rodiny MYC (c-myc, n-myc, l-myc aj.)

• Geny účastnící se regulace buněčného cyklu a n apotózy (geny pro CDK, CDK-I, cykliny)

• Tumor-supresorové geny (TP53, RB1)

• Protoonkogeny rodiny RAS

• BCL-2 a příbuzné protoonkogeny

• TOP2A, RARA a jiné

Některé další geny, účastnící se maligní transformace buňky