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ROLE DE L'ACTIVITE DEPENDANTE DU ROLE DE L'ACTIVITE DEPENDANTE DU CALCIUM AU COURS DU CALCIUM AU COURS DU
DEVELOPPEMENT ET DE LA DEVELOPPEMENT ET DE LA MATURATION DES NEURONES MATURATION DES NEURONES
GANGLIONNAIRES VESTIBULAIRES DE GANGLIONNAIRES VESTIBULAIRES DE
SOURISSOURIS Présentée par Laurence AUTRETPrésentée par Laurence AUTRET
Le 14 décembre 2005Le 14 décembre 2005
Directeur de thèse : G. DESMADRYLDirecteur de thèse : G. DESMADRYL
Unité 583 INSERMUnité 583 INSERM, INM, Montpellier, France, INM, Montpellier, France
Système vestibulaire
Oreille interne
GanglionVestibulaireOrgane
Vestibulaire
Cochlée
Ganglion vestibulaire
Le ganglion vestibulaire contient les corps cellulaires des neuronesqui connectent les cellules sensorielles et les noyaux vestibulaires
13 14 15 16 17 18 19 20 21 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
NAISSANCE
Mitoses terminales
Différenciation des ce llules sensorie lles
Maturation des ce llules (croissance des stéréocils )
CELLULES SENSO RIELLES
AFFERENCES
Synapses afférentes
Calyces afférents
EFFERENCES
Synapses efférentes
ACT IVIT E PHYSIO L O G IQ UE
MATURATION DES EPITHELIUMS SENSORIELS VESTIBULAIRES
Maturation du système vestibulaire
Canaux calciques dépendants du potentiel
H A U T
S E U IL
B A S
S E U IL
1 S
1 C
1 D
1 F
1 A
1 B
1 E
Ca v1.1
Ca v1.2
Ca v1.3
Ca v1.4
Ca v2.1
Ca v2.2
Ca v2.3
Type L
Type P/Q
Type N
Type R1 G
1 H
1 I
Ca v3.1
Ca v3.2
Ca v3.3
Type T
Deux grandes familles de courants calciques déterminées par leur seuil d’activation
Dans les courants calciques à haut seuil d’activation, plusieurs sous-types caractérisés par leur pharmacologie
Courant imposé Vo ltage imposé
pA
V m
V mIm
m V
HP
Patch c lam p sur ce llu le entiè re
Neuroneiso lé
M ic ropipe tte
Courantssortants
Courantsentrants
V
Deu x m od es d 'en reg istrem en t
Electrophysiologie
Evolution des courants calciques dépendants du potentiel à haut seuil
d’activation au cours du développement
Les conductances de type L restent constantes au cours du développement.
Les conductances de type N augmentent progressivement au cours du développement.
Les conductances de type P présentent un pic d’expression à E17 puis diminuent au cours du développement.
Les conductances de type Q augmentent jusqu’à la naissance puis restent constantes.
J.Physiology 1999, 518.1Chambard and coll.
Cu
rre
nt
de
ns
ity
(p
A/p
F)
(n=8)
*N -type IBa
10
20
30
40
(n=13)(n= 10) (n= 20)
(n=16)
10
20
30
40
L-type IB a
(n= 3)(n= 8) (n=8) (n= 12)
† †
P-type IBa
10
20
30
40
(n=11)
(n=7)(n=14)
Q-type IBa
E15 E17 P0 P4
10
20
30
40
Stage
*
(n= 9 )(n=4) (n= 8) (n=11)
Evolution des courants calciques dépendants du potentiel à bas seuil
d’activation au cours du développement
Le nombre de neurones exprimant un courantLe nombre de neurones exprimant un courantde type T diminue au cours du développement.de type T diminue au cours du développement.Ils ne sont que 20% à la naissance.Ils ne sont que 20% à la naissance.Lorsque la conductance de type T est présente,Lorsque la conductance de type T est présente,elle est soit de forte amplitude soit de faible amplitude.elle est soit de forte amplitude soit de faible amplitude.
J.Physiology 1999, 518.1Chambard and coll.
Cu
rre
nt
de
ns
ity
(p
A/p
F)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
100120
140
E 1 4 E 1 5 E 1 7 P0 P 4
Stage
Cu
rre
nt
de
ns
ity
(p
A/p
F)
0
20
40
60
80
100
120
140
E 1 4 E 1 5 E 1 7 P0 P 4
A
E 14 E15 E17 P0 P4
(n=13)
(n=51)
(n= 43)
(n= 69) (n= 126)
Ne
uro
ns
wit
h L
VA
IB
a (
%)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
100
Développement du système vestibulaire et évolution des courants calciques de type T
E17 P0 P6
POUSSE NEURIT IQUE POUSSE NEURIT IQUESYNA PT OGENESE
SYNA PT OGENESE
0
50
100%
L’expression des courants calciques de type T correspond à une période de pousse neuritique importante et de synaptogenèse
Proportion de cellules exprimant un courant calcique de type T
I- Caractérisation des sous-unités calciques de type T présentes sur le soma du neurone vestibulaire primaire
II- Etude de l’activité électrique
III- Rôle sur la pousse neuritique in vitro
Quelles sont les ou la sous-unités impliquées dans la genèse du courant calcique à bas seuil d’activation?
H A U T
S E U IL
B A S
S E U IL
1 S
1 C
1 D
1 F
1 A
1 B
1 E
Ca v1.1
Ca v1.2
Ca v1.3
Ca v1.4
Ca v2.1
Ca v2.2
Ca v2.3
Type L
Type P/Q
Type N
Type R
?1 G
1 H
1 I
Ca v3.1
Ca v3.2
Ca v3.3
Type T
W hole Brain
Vestibular Ganglia
500bp
500bp
W M
A
B
Caractérisation moléculaire par la technique de RT-PCR
Les ARNm des trois sous-unités sont présents à E17
Caractérisation électrophysiologique
Identification de deux populations de neurones en fonction de l’amplitude du courant calcique de type T
Neurones avec un grand courant : amplitude > 200 pA
Neurones avec un petit courant : amplitude < 60 pA
1 0 0 p A5 0 ms
2 0 0 p A1 0 0 ms
-1 0 0 mV+5 0 mV
1 0 0 p A5 0 ms
2 0 0 p A1 0 0 ms
Cinétiques d’activation et inactivation
200 pA
2 0 ms
-6 0 mV
-5 0 mV
-4 0 mV
-3 0 mV
-1 0 mV
-2 0 mV
-5 0 -4 0 -3 0 -2 0mV
0
4
8
1 2
1 6
2 0
A
ctiv
atio
n(m
s)
- 5 0 -4 0 -3 0 -2 0mV
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
In
act
iva
tion
(ms)
Cinétiques d’activation et d’inactivation rapides des courants calciques de type T pour les deux
populations de neurones :
Cav3.1 and/or Cav3.2
Les neurones ayant un grand courant calcique de type T
5 0 0 p A
1 0 ms
-1 4 0 -1 2 0 -1 0 0 -8 0 -6 00123456
mV
D
ea
ctiv
atio
n(m
s)
- 1 4 0 mV
-6 0 mV
5 0 p A
1 s0 1 2 3 4
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1 .0N
orm
aliz
ed
cu
rre
nt
Interpulse duration (s)
10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 10 -2
0
20
40
60
80
100
8 77
6
411
13
12
12
193 2
8
T-t
ype
curr
ent i
nhib
ition
(%
)
[N i 2+ ]
C o n trô le
R in ça g e
Ni2+ 0.3 µM
Constante de temps de déactivation= 5,28 ms à -60 mV et 0,52 ms à -140 mV : Cav3.2
Constante de temps de réactivation= 1394 ms (lente) et 117 ms (rapide) : Cav3.2
IC50 = 13,4 µM, grande sensibilité au Nickel : Cav3.2
La fraction majoritaire du courant calcique de type T est générée par La fraction majoritaire du courant calcique de type T est générée par CaCavv3.23.2
Identification d’une nouvelle propriété de la sous-unité Cav3.2 : mécanosensibilité
D
Identification d’une nouvelle propriété de la sous-unité Cav3.2 : mécanosensibilité
200 pA50 ms
c ontrol
perf us ion
-100 mV +50 mV
100ms
500 pA
20 s per f us ion
pA
0 200 400 600 800
-3 00
-200
-1 00
0
Time ( s )
1 0 0 p A
2 0 ms
Ca v 3 .2
5 0 p A
2 0 ms
1 0 0 p A
2 0 ms
Ca v 3 .3Ca v 3 .1
Neurones vestibulaires ayant un grand courant calcique de type T
Canaux calciques de type T recombinants
Seule la sous-unité Cav3.2 présente une mécanosensibilité.Seule la sous-unité Cav3.2 présente une mécanosensibilité.Cet effet est réversibleCet effet est réversible
Les neurones ayant un petit courant calcique de type T
200 pA10 m s
c ontrol
Ni 2 +
-1 4 0 -1 2 0 -1 0 0 -8 0 -6 00
2
4
6
8
1 0
1 2
mV
DE
AC
(ms)
200 pA
500 m s
20 pA
500 m s
0 1000 2000 3000 4000
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Norm
alis
ed
I ca
ms
1 = 704.82 = 448.7
Les observations faites sur cette population de neurones sont similaires à celles obtenues après application de 10 µM de nickel sur la population de
neurones ayant un grand courant calcique de type T
Constante de temps de déactivation= 8,6 ms à -60 mV et 1,1 ms à -140 mV
Constante de temps de réactivation= 665 ms
(lente) et 103 ms (rapide)
Ce courant calcique de type T semble généré par Ce courant calcique de type T semble généré par CaCavv3.13.1
Quelle est l’implication du courant induit par cette sous-unité dans la forme du potentiel d’action?
La sous-unité Cav3.2 est majoritairement présente sur le soma des neurones vestibulaires à E17
Conclusion
Cette sous-unité s’active pour des potentiels proches du potentiel de repos de la cellule
Forme des potentiels d’action enregistrés à E17
Potentiel d’action suivi d’une dépolarisation post potentiel (ADP)
Potentiel d’action avec un épaulement sur la phase de repolarisation
Potentiel d’action avec une repolarisation rapide et une
hyperpolarisation post potentiel (AHP)
Induit par Cav3.2 ?
Induit par Cav3.2 ?
Effet de l’application de nickel sur les différentes formes de potentiels d’action
Le nickel induit une disparition de l’ADP
L’activation de ce courant calcique de type T L’activation de ce courant calcique de type T généré par généré par CaCavv3.2 induit une dépolarisation post 3.2 induit une dépolarisation post
potentielpotentielNi2+
Etude du potentiel d’action avec ADP ou potentiel d’action calcique
Corrélation entre la présence d’un grand courant calcique de type T et
une ADP suivant le PA
Le blocage des autres conductances calciques sont sans effet sur le PA
La TTX ne bloque pas la genèse du potentiel d’action calcique
Le grand courant calcique de type T est responsable de l’ADP ou Le grand courant calcique de type T est responsable de l’ADP ou PA calciquePA calcique
Etude du potentiel d’action avec épaulement
Quelle conductance ionique induit un épaulement lors de la phase de repolarisation du potentiel d’action au
cours du développement ?
Etude du potentiel d’action avec épaulement
Applications de 1µM et 10 µM de nickel n’ont pas d’effet sur
l’épaulement mais sur l’ADPApplication de 100µM de cadmium
inhibe l’épaulement
Application de 500 nM d’ω-agatoxine IVA (antagoniste de
canaux de type P/Q) bloque l’épaulement du potentiel d’action
L’ épaulement semble généré par un courant calcique de type PL’ épaulement semble généré par un courant calcique de type P
Conclusion
Cav3.2 génère un courant impliqué dans l’activité électrique
Présence d’une ADP et dans certains cas d’un potentiel d’action calcique.
Augmentation de l’excitabilité cellulaire et entrée massive de calcium
Rôle physiologique de cette activité électrique transitoire
dans la neuritogenèse?
Modèle in vivo impossible
Utilisation de culture de neurones vestibulaires primaires
Pas de pharmacologie spécifique de ces canaux ioniques
Utilisation de la stratégie antisens
Rôle physiologique de ce courant calcique généré par Cav3.2
Principe de la stratégie antisens
ADNc
ARNm
Hybride ARN-ADN
pas de traduction
Technique qui permet de vérifier l’effet de la disparition d’une protéineTechnique qui permet de vérifier l’effet de la disparition d’une protéine
Etude de la pousse neuritique
Cav3.2 Scramble
Les antisens ont été incorporés dans les cellules en vertLes neurones sont marqués en rouge (neurofilaments)
Antisens anti Cav3.2 diminue la pousse neuritique
Suppression du courant calcique de type T
Diminution significative de la pousse Diminution significative de la pousse neuritique dans les neurones transfectés neuritique dans les neurones transfectés avec l’oligonucléotide antisens de Cav3.2avec l’oligonucléotide antisens de Cav3.2
49
23
23
control
AS- Cav3.2
AS- Scramble
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
Long
ueur
des
neu
rites
(µ
M)
**
-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80
-1400
-1200
-1000
-800
-600
-400
-200
0
200
400
Am
plit
ud
e d
u c
ou
ran
t
Poten tie l m em brana i re (m V)
Neurone vestibulaire
Ca++
Cav3.2
PA avec ADP
Pousse neuritique
Effet sur la formation des synapses??
Conclusion générale et perspectives
Conclusion générale et perspectives
Faible amplitude de courant
Cav3.2Cav3.1
Apparition plus Apparition plus précoce dans le précoce dans le développement?développement?
PA avec épaulement
P/Q ???
Rôle au cours du développement ?Rôle au cours du développement ?
Maturation des conductances potassiques
Les oligonucléotides antisens sont dans le soma des neurones
Neurofilaments sont marqués en rougeLes oligonucléotides sont marqués en vert
Les oligonucléotides ont été intégré le soma des neurones vestibulairesLes oligonucléotides ont été intégré le soma des neurones vestibulaires
Images confocal
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