Sequenziamento: metodo di Sanger con ddNTP

Sequenziamento: metodo di Sanger con ddNTP

Sequenziamento con dideossonucleotidi

Sequenziamento automatizzato del DNA

+

Ligazione

Inserto Vettore

Clonaggio:

Trattamento del vettore con fosfatasi

GCTTAAp

pAATTC G

G A

ATTC

CTTA

ApGG

pAAT

TC

CTT

AA G

DNA ligasi

pAATTC G

GCTTAAp

EcoRI

GCTTAA

AATTC G

fosfatasi

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

Vettori plasmidici (pBR322)

Vettori plasmidici (pUC18)

•Ceppo di E.coli Lac Z mutante

•Vettore pUC LacZ parziale

Complementanoβ-galattosidasi

ATTIVA

•Ceppo di E.coli Lac Z mutante

•Vettore LacZ interrotto dal clonaggio

Non c’è complementazion

e

β-galattosidasiINATTIVA

Terreno + X-Gal

β-galattosidasi

ATTIVA

β-galattosidasi

INATTIVA

Metabolizzato

Non metabolizzato

Colonie Blu

Colonie bianche

X-Gal: 5-Bromo-4-Cloroindolil-β-galattoside (incolore)

DNA genomico

DNA genomico

Primer reverse

Primer forward

1° ciclo di PCR

5’ 3’

3’ 5’

5’3’

5’ 3’

C A G C A G C A G C A G C A C C T C A G

C A G C A G C A G C A C C T C A G G G G

ETEROGENEITA’ DEL TEMPLATO : ETEROZIGOSI PER UNA DELEZIONE

F

P

M

C/C G/-

C/- LOSS OF HETEROZYGOSITY

RNA sequencing Dopotrascrizione inversa

CTT

6 8

6 7 8

7/- 7/-

-/-

Figure 1: Illumina Flow Cell

Figure 2: Prepare Genomic DNA Sample

Figure 3: Attach DNA to Surface

Figure 4: Bridge Amplification

AdaptersDNA

Adapters

Dense lawnof primers

DNA

Figure 6: Denature the Double-Standed Molecules

Figure 5: Fragments Become Double Stranded

Figure 8: Determine First Base

Figure 7: Complete Amplification

Attachedterminus

Freeterminus

Attachedterminus

Attached

Attached

Clusters

Laser

Figure 13: Align Data

Figure 9: Image First Base

Figure 10: Determine Second Base

Figure 12: Sequencing Over Multiple Chemistry Cycles

Figure 11: Image Second Chemistry Cycle

GCTGA...

Laser