Sinónimos: Manipulación genética Clonaje génico Tecnología

Es una revolución metodológica que ha puesto a nuestra disposición gran número de técnicas procedentes de diversos campos de la ciencia con un objetivo común muy importante: el acceso directo al gen

Sinónimos:•Manipulación genética•Clonaje génico•Tecnología del DNA recombinante

INGENIERÍA GENÉTICA

Ingeniería genética: avances importantes1953 Watson y Crick: estructura en doble hélice del DNA1957 Kornberg: DNA polimerasa1961 Marmur y Doty: renaturalización e hibridación del DNA1962 Arber, Nathans y H.Smith: enzimas de restricción1966 Niremberg, Ochoa, Khorana: código genético1967 Gellert: DNA ligasa1972-73 Boyer, Cohen y Berg: clonaje del DNA1975 Southern: hibridación a partir de geles1975-77 Sanger, Barrel, Maxam y Gilbert: secuenciación del DNA1981-82 Palmiter y Brinster: ratones transgénicos1985 Mullis: reacción en cadena de la polimerasa1990 Varios: Hibridación in situ fluorescente (FISH)1998 Varios: Paneles génicos2001 Venter y Collins: proyecto genoma humano

ANÁLISIS MOLECULAR

DNA

RNA

PROTEINAS

mRNA inmaduro

mRNA

gDNAunidad de transcripción

proteina

GENOMA

PROTEOMA

TRANSCRIPTOMA

transcripción

Procesamiento (montaje, splicing)

traducción

(exoma)

CLONACIÓN DE GENES

CLON

Aislamiento

Inserción en vector

Incorporación al hospedante

Amplificación

Purificacióndel inserto

3) Enzimas de restricción

4) Obtención de cDNA

1) Métodos físicos• Agitación• Sonicación

2) Síntesis química• Oligonucleótidos pequeños

AISLAMIENTO DE GENES

Endonucleasas de restricción

Ligasas

EcoR I Hind III Hpa I

Enzimarestricción

Acopla-miento

Ligacióncovalente

ENZIMAS

VECTORES GÉNICOS

Vector Capacidad (kb) HospedantePlásmido 8-9 E.Coli

Fago Inserción: 12Deleción-sustitución: 22

E.Coli

Cósmidos 45 E.ColiFago P1 70-100 E.Coli

PAC 130-150 E.ColiBAC 120-300 E.ColiYAC 250-400 Levadura

RECUPERACIÓN DE COLONIAS RECOMBINANTES

Métodoclásico

TetSAmpRTetSAmpR

TetRAmpR

TetRAmpR

E

E E

Plásmidorecombinante

Amp

Tet

Amp

TetX

X X

ColoniasrecombinantesAmp

Plásmidos portadores del gen lacZ

Plásmidorecombinante

Coloniasrecombinantes

(blanco)lacZ-AmpR

lacZ+AmpR

Plásmido norecombinante

Colonias norecombinantes

(azul)

IPTGX-gal

ampicilina

RECUPERACIÓN DE COLONIAS RECOMBINANTES

NEURONA LINFOCITO

gen A gen BDNA

TRANSCRIPCION

TRADUCCION

RNA RNA

Todas las células de un organismo contienen el mismo genoma pero en tejidos distintos se transcriben genes diferentes

RECORDAR

CONSTRUCCIÓN DE UNA LIBRERÍA gDNA

Obtención de cDNA

LIBRERÍASDNA genómico (gDNA)

DNA complementario (cDNA)

clonaje

mRNART

cDNA

clonaje

STS (sequence taged sites)

Librería cDNAEST (expresed sequence tags)

Librería DNA genómico

Clones de DNA genómico y cDNA derivados de la misma región del DNA

CLONACIÓN IN VITRO: PCR

1) Desnaturalización

2) Hibridacióniniciadores

3) Polimerización(Taq polimerasa)

94ºC 1 min.

72ºC 1 min.

58ºC 1 min.

http://www.uv.es/patobio/pcr/index.html

CLONACIÓN IN VITRO: PCR

DNA

apertura de cadenas hibridación de primers

Síntesis DNA

PRIMER CICLO2 DNA doble cadena

SEGUNDO CICLO4 DNA doble cadena

TERCER CICLO8 DNA doble cadena

etc

etc

etc

etc

etc

etc

etc

etc

PCR

2) Elevada sensibilidadTeóricamente, es posible amplificar fragmentos de DNA a partir de una sola molécula de doble cadena.En cualquier caso, basta una cantidad de muestra muy pequeña (unas pocas células)

Si se eligen bien los primers, solo se amplifica el fragmento deseado

3) Elevada especificidad

Se realiza en poco tiempoUtiliza reactivos no muy caros

4) Poco costosa

1) Hay que conocer previamente la secuencia que se quiere amplificar

APLICACIONESTEJIDOSCÉLULAS

GENCLONADO

ESTRUCTURAGÉNICA

Secuenciación de nucleótidos

Secuencia de aminoácidos

ESTRUCTURAPROTÉICA

SONDAMOLECULAR

DIAGNÓSTICO

INDUSTRIAFARMACÉUTICA

Obtención del producto génico

TERAPIA GÉNICA

TRANSGÉNICOS

KNOCK OUT

Introducción en células adecuadas

Hibridación in situ fluorescente (FISH)

GFP (green fluorescent protein)

El gen que codifica la GFP puede unirse a un extremo del gen que codifica una proteína de interés y permite observar la distribución de éste por el organismo o rastrear el movimiento de una proteína de interés en organismos vivos

Mario R. Capecchi Martin J. Evans Olivier Smithies

PREMIO NOBEL DE MEDICINA Y FISIOLOGIA2007

"for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells"

Ratón knock-out sin algunas neuronas olfativasPierde la sensación de peligro