SISTEMAS MICELARES DE DUAS FASES AQUOSAS. TENSOATIVOS E MICELAS IÔNICOS: brometo de...

SISTEMAS MICELARES  DE DUAS FASES

AQUOSAS

TENSOATIVOS E MICELAS

IÔNICOS:

brometo de dodeciltrimetilamônio CH3

CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-N-CH3+

Br-

CH3

dodecil sulfato de sódio

CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OSO3- Na+

cauda apolar

cabeça polar

Catiônicos

Aniônicos

Moléculas anfifílicas: grupo liofóbico grupo liofílico

TENSOATIVOS E MICELAS

NÃO-IÔNICOS: CH3-(CH2)9-OCH2CH2 -OCH2CH2 -OCH2CH2 -OCH2CH2 -OH

óxido de n-deciltetraetileno (C10E4)

ZWITERIÔNICOS: CH-CH2-PO4

--(CH2)2-N(CH3)3+

dioctanoil fosfatidil colina (C8-lecitina)

QUANTO À CAUDA:

CH3-(CH2)6-COOCHCH3-(CH2)6-COOCH

Saturada/insaturada Cadeias duplas Cadeia ramificada

halogenadas (fluorcarbonetos) cadeia de polióxido de propileno

Lisina (zweterion)

SURFACTANT = Surface Active Agent

Líquidos contração da superfície (< energia livre)

força de atração para dentro exercida pelas moléculas presentes na solução sobre as moléculas na superfície

TENSÃO SUPERFICIAL - (mN/m)

Moléculas anfifílicas – procuram orientar-se na superfície (< energia livre)

Interação H2O-Tens. < interação H2O-H2O

tensão superficial

Formação de micelas balanço complexo de forças intermoleculares:

van der Waals

eletrostáticas

hidrofóbicas estéricas

ligações de hidrogênio

MICELAS = agregados de tensoativos

Micelização = mecanismo alternativo à adsorção na superfície/interface para a remoção do grupo hidrofóbico do contato com a água.

Razão principal para a formação de micelas = obtenção de estado mínimo de energia livre

tensão superficial

CMC Concentração de tensoativo

condutividade

detergência

pressão osmótica

Tempo de reação: milissegundos a minutos

As micelas são colóides de associação

Dinâmicas, reversíveis, distribuição estatística de tamanhos (polidispersão)

micela esférica

bicamada

micela cilíndrica

TIPOS DE AGREGADOS FORMADOS (MICELAS)

vesícula (lipossoma)

temperatura

SEPARAÇÃO DE FASES

“Solução” micelar homogênea

Fase rica em micelas

Fase pobre em micelas

- turvação “cloud point” - “ponto de névoa”

- aumento da temperatura redução na solubilidade da micela

Extração Líquido-Líquido em Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas

PROCESSO DE SEPARAÇÃO DE FASES

Sistema Monofásico Sistema Bifásico

Fase Rica em

micelas

Fase Pobre

em micelas>> TºC tempo

SISTEMA MICELAR DE DUAS FASES AQUOSAS

Tem

pera

tura

T´

Região Bifásica

Região Monofásica Ponto Crítico

Linha de amarração “Tie-Line”

Ci CB CT

V’B V’T

Concentração de tensoativo

Cd Cc

V´c V´d

CURVA BINODAL (C10E4)

Cc e Vc

Cd e Vd

T (oC)

(ou vice-versa)

Yagui, C. O. R., Pessoa A., Blankschtein, d. Two- phase aqueous micellar systems - an alternative method for protein purification. Brazilian Journal of Chemical Engineering. 21(4):531- 544, 2004

DIAGRAMA DE FASES

Extração Líquido-Líquido em Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas - SMDFA

T (oC)

19,00

13,05C10E4 + 0,5 M Li2SO4

C10E4 + 0,5 M NaCl

C10E4

C10E4 + 0,1 M KI

23,60

4,75

Influência de alguns sais sobre o ponto crítico

SMDFA – aplicações: Purificar e concentrar compostos como: BSA, bacteriófagos, antibióticos,

colesterol oxidase, lisozima e outras enzimas, vitaminas lipossolúveis e compostos orgânicos.

Separar contaminantes com características hidrofóbicas presentes em soluções biológicas.

Primeiro trabalho - BORDIER (1981) - agente tensoativo não-iônico Triton X-114 - proteínas hidrofílicas X proteínas hidrofóbicas.

Pode ser aplicado a sistemas envolvendo células intactas.

Alternativa na purificação de proteínas de plantas - compostos presentes em plantas que interferem nas técnicas convencionais de extração, como fenóis e clorofila, podem ser facilmente removidos por SMDFA.

Pode separar: íons metálicos, estriol, progesterona, -estradiol, estrona, clorofila, bacteriófagos, células, fenóis e outras moléculas orgânicas de baixa massa molar.

SISTEMA MICELAR DE DUAS FASES AQUOSAS (SMDFA) APLICADO À PURIFICAÇÃO DE

PROTEÍNAS

Ambiente ameno para materiais biológicos;

Método seguro, não utiliza compostos inflamáveis ou explosivos;

Fácil ampliação de escala;

Baixo custo (em princípio requer somente um tensoativo e em baixas concentrações);

Gera resíduos de fácil manuseio (baixa toxicidade, fácil acondicionamento, etc.);

Micelas fornecem ambientes hidrofílicos e hidrofóbicos;

Controle e otimização da partição através do ajuste das características micelares (tamanho e forma);

Fácil separação do material desejado das moléculas de tensoativo após a purificação;

A seletividade da partição pode ser melhorada com a utilização de micelas contendo ligantes de afinidade ou misturas de tensoativos;

Técnica não interfere em metodologias como cromatografia líquida, eletroforese, ELISA, etc.

SISTEMA MICELAR NÃO-IÔNICO DE DUAS FASES AQUOSAS PARA PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

proteína hidrofílica

proteína hidrofóbica

BORDIER (1981) apresentou a possibilidade de separação de proteínas em SMDFA – tensoativo Triton X-114.

Purificação de proteínas hidrofóbicas: colesterol oxidase, lipase, proteínas de membrana.

Altos valores de Kp

EXPERIMENTO [C10E4] (% p/p)

T (oC)

R (Vt/Vb)

KG6PD BMG6PD (%)

1 2,50 19,5 0,76 0,53 0,04 97 9

2 3,60 20,0 1,00 0,36 0,00 104 4

3 3,25 20,4 0,60 0,33 0,01 108 7

4 3,00 21,5 0,35 0,20 0,04 101 6

5 5,00 22,0 0,60 0,10 0,01 101 2

PARTIÇÃO DA ENZIMA GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE (G6PD) EM SISTEMA

C10E4/TAMPÃO

SISTEMA MICELAR MISTO (NÃO-IÔNICO/IÔNICO) DE DUAS FASES AQUOSAS

- G6PD negativamente carregada

- C10E4

- CnTAB (n = 8, 10, or 12) – carga positiva+

- G6PD negativamente carregada

- C10E4

- CnTAB (n = 8, 10, or 12) – carga positiva+

- G6PD negativamente carregada

- C10E4

- CnTAB (n = 8, 10, or 12) – carga positiva+

- G6PD negativamente carregada

- C10E4

- CnTAB (n = 8, 10, or 12) – carga positiva+ ou

Micelas mistas são formadas in situ, sem necessidade de síntese como os polímeros + eletrólitos

Condições da solução (pH, FI) podem ser variadas

melhorar a partição alterando as interações eletrostáticas e de

volume de exclusão

Reverter as interações e separar as proteínas das micelas

TENSOATIVOS CATIÔNICOS X DESNATURAÇÃO PROTÉICA

0

20

40

60

80

100

0 100 200 300 400

Time (min)

Rec

over

y G

6PD

(%)

C8TABC10TABC12TAB

2.5 mM CnTAB + 0.068 mg/mL G6PD

Rec

uper

ação

Tempo

TENSOATIVOS X DESNATURAÇÃO PROTÉICA

Tensoativos não-iônicos – apresentam apenas interações hidrofóbicas não-específicas em concentrações ~ CMC (exceção: BSA e Tritons)

Tensoativos iônicos: 1- interações eletrostáticas com resíduos de aminoácidos de carga oposta

na superfície da proteína (ligação sítio-específica)

2- interações hidrofóbicas das caudas apolares com o interior apolar da proteína (ligação cooperativa, não-específica).

maior a tendência a formar micelas - maior a afinidade pelas proteínas

em geral, tensoativos aniônicos interagem mais fortemente que os catiônicos

cadeias laterais da arginina e lisina (ligação com aniônico) são mais “projetadas” que as do ác. glutâmico e aspartato (ligação com catiônicos)

PURIFICAÇÃO DE G6PD EM HOMOGENEIZADO DE S. Cerevisiae

FONTE DE G6PD PROCESSO UTILIZADO KG6PD YG6PD (%)

Enzima pura sistema C10E4/C10TAB/tampão 7,7 71

Homogeneizado de S.cerevisiae

sistema C10E4/C10TAB/tampão 1,91 48

Homogeneizado de S.cerevisiae

purificação em dois estágios: I - C10E4/tampão

II -C10E4/C10TAB/tampão

I – 0,35 II – 3,82

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SISTEMA IC10E4/Tampão

separação de fases

coleta da fase Inferior

SISTEMA IIC10E4/C10TAB/Tampão

separação de fases

GFP CBM9

liga à celulose, di- e monossacarídeos

CBM9GFP

C10G1

Surfactant - C10G1

(Decyl -D-glucopyranoside)

+

EXTRAÇÃO DA PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTEGFPuv

UTILIZANDO LIGANTE DE AFINIDADE

C10G1 (5%) Lisado Celular + CBM9-GFP Tampão pH 7,2

29oC, após 6h Fase Pobre em Micelas

Fase Rica em Micelas (GFPuv)

Micela +

ligante + GFP

Procion red Cibacron blue

Inibidores de G6PD - Mimetizam a coenzima NAD(P)+

H

N

O

NH2

H H

O

OHOH

OP

OO

PO

-O O CH2

-O

N

N

N

N

NH2

H

CH2

HH

OROH

H

O

+

NADP+

UTILIZAÇÃO DE INIBIDORES ENZIMÁTICOS COMO LIGANTES DE AFINIDADE

PARTIÇÃO DOS LIGANTES CIBACRON BLUE E PROCION RED EM SISTEMA C10E4/TAMPÃO

0

5

10

15

20

25

30

35

Procion red Cibacron blue

K lig

ante

PARTIÇÃO DA G6PD EM SISTEMA C10E4/TAMPÃO CONTENDO CIBACRON BLUE E PROCION RED

0,20

0,30

0,40

sem ligante cibacron blue procion red

K G6P

D

Interações de afinidade não são suficientemente fortes para influenciar significantemente o perfil de partição da G6PD.

Ocorrência de interação do ligante com as micelas, diminuindo a probabilidade de formação de complexo enzima inibidor.

Estrutura da Endotoxina: LipoPoliSsacarídeo (LPS)

porç

ão

hidr

ofób

ica

por

ção

hidr

ofíli

ca

4-(C

8H17

)-C 6

H4-

(OCH

2CH

2)n-

OH

,n~

8

TRITON X-114 polioxietileno p-t-octil fenol

Remoção de Endotoxina (pirogênio) por Extração Líquido-LíquidoRemoção de Endotoxina (pirogênio) por Extração Líquido-Líquido

Tubo em câmara de

luz UV

Tubo visto aolho nu

Comportamento da GFPuv ( ) e do LPS ( ) na Extração em SMDFA Utilizando Triton X-114 ( )