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Spectrométrie de masse – IntroductionIntérêts de la Spectrométrie de masse :
• Sensibilité, limite de détection faible ( fento mole dans certaines conditions )
• Variétés des applications : analyses chimiques quantitative et qualitative réaction ions molécule, cinétique des réactions.
• Progrès technologique rapide
1
Spectrométrie de masse –
Introduction - Principes
- Un spectromètre comprend :
- Système d’introduction ( GC, LC , sas d’intro direct, … )
- Source d’ionisation
- Analyseur ( un ou plusieurs )
- Détecteur pour compter les ions
2
- Détecteur pour compter les ions
- Système de traitement de donnée
Introduction ,GC, LC
Ionisation ,EI, CI
ESI, APCIFAB, …
AnalyseurSQ D,TQD,
EB, TOFDétecteur Logiciel
Spectrométrie de masse –
Introduction - Principes
Principes de la MS :
• 1er étape : Produire des ions
• La quantité de fragments produit dépend de la « force » de l’ionisation
3
Les ions sont ensuite séparés d’après leur masse et leur charge dans le système dispersif
Ils sont ensuite détectés.
Introduction ,GC, LC
Ionisation ,EI, CI
ESI, APCIFAB, …
AnalyseurSQ D,TQD,
EB, TOFDétecteur Logiciel
Ion moléculaire ou pseudoIon moléculaire ou pseudo --moléculairemoléculaire
Ion Ion pseudopseudo--moléculairemoléculaire : :
�� En mode En mode positifpositif : : ajoutajout d’und’un proton sur M : (M+H)proton sur M : (M+H) + + (masse : M+1, charge+1)(masse : M+1, charge+1)
�� En mode En mode négatifnégatif : : perteperte d’und’un proton : (Mproton : (M--H)H) -- (masse : M(masse : M--1, charge 1, charge --1)1)
ElectrosprayElectrospray
1. Massifs isotopiques
• Isotopes : atomes d’un même élément qui contiennent un nombre identique de protons mais un nombre différent de neutrons
• Abondance isotopique = pourcentage des isotopes d’ un élément dans la nature
• Masse moyenne pondérée (MM) = Masse atomique appara issant sur le tableau périodique et qui tient compte des isotopes et de leur abondance
Exemple : nbre de nbre deprotons : nucléons :
nbre nbre de nbre masse abondance abondanceatomique masse neutrons isotopique en % (1) relative (2)
nbre nbre de nbre masse abondance abondanceatomique masse neutrons isotopique en % (1) relative (2)
Chlore-35 17 35 35-17 = 18 34,97 75,8% 100Chlore-37 17 37 37-17 = 20 36,97 24,2% 32,5
Masse moyenne pondérée du chlore = ( 0,758 * 34,97 uma) + (0,242 * 36,97 uma) = 35,454 uma
6
(1) = nombre moyen d’isotope cité pour 100 atomes de l’élément(2) = nombre moyen d’isotope cité pour 100 isotopes majoritaires
Principaux isotopes en chimie organique
Elément isotope % Masse isotopique
isotope % Masse isotopique
isotope % Masse isotopique
Masse moyenne
C 12C 100 12.0000 13C 1.1 13.0033 12.011
H 1H 100 1.0078 2H 0.015 2.0140 1.0079
N 14N 100 14.0031 15N 0.37 15.0001 14.0067
O 16O 100 15.9949 17O 0.04 16.9991 18O 0.20 17.9992 15.9994
S 32S 100 31.9721 33S 0.789 32.9715 34S 4.44 33.9679 32.066
F
Cl
19F
35Cl
100
100
18.9984
34.968837Cl 31.98 36.9659 35.453
Br 79Br 100 78.9183 81Br 97.28 80.9163 79.904
Calcul de masses exactes
282
nbre masse masse A isotopique moyenne
Hydrogène-1 1 1.0078 1.0079Hydrogène-2 2 2.0140
Carbone-12 12 12.0000 12.011Carbone-13 13 13.0034
Soit la molécule d’eicosane C 20H42 :
Masse exacte M :(12C20
1H42)(20 * 12.000)
Masse exacte M+1Masse exacte M+1
Masse moyenne : (20 * 12.011)
+ (42 * 1.0079) = 282,55
(20 * 12.000)+ (42 * 1.0078) = 282,33
avec un 13C : (19 * 12.000)
+ (1 * 13.0034)+ (42 * 1.0078) = 283,33
Masse exacte M+1avec un 2H :
(20 * 12.000)+ (41 * 1.0078)+ (1 * 2.0140) = 283,33
La différence entre masse exacte M et masse moyenne MM augmente avec la taille de la molécule : ∆∆∆∆ entre
MM et M = ±±±± 1 Da / 1500 Da
Calcul de l’abondance relative des satellites isotopiques M+1, M+2 pour
des petites molécules
Typed’élément Caractéristiques Exemple Abondance relative du 2ème isotope*
1! Isotope ou F -Q plusieurs isotopes I -
dont un est majoritaire P -(A > 99,9%) H 0,015
Q+1 Isotope M+1 C 1,08 non négligeable N 0,37
* Abondancede l’isotope majoritaire = 100
analyse de spectres de masse 9
O 0,2Q+2 Isotope M+2 S 4,43 non
négligeable Cl 31,98Br 97,28
M+1 ≈≈≈≈ (1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N )M
M+2 ≈≈≈≈ (31,98 . Nombre de Cl) + ( 4,43 . Nombre de S ) + ……M
Satellite M+1 :
Satellite M+2 :
100
100
Massifs isotopiques complexes
Exemple : Allure du massif isotopique de molécules contenan t 2 Cl, 3 Cl, 4 Cl
En Conclusion :
Chaque formule brute est associée à un massif isoto pique qui lui est propre
Pour des molécules de masse < 500 Da :
� L’abondance des pics « M+1 » renseigne sur le nombre d’éléments Q+1 :
M+1/M ≈≈≈≈ (1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N ) /100
� L’abondance des pics « M+2 » et suivants renseigne su r la présence d’éléments Q+2 (S, Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes :
analyse de spectres de masse 11
Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes :
Formules brutes* contenant 12C, 1H, 14N et 16Oentre 180.000 et 180.200 :
! Le nombre de formules brutes dont la masse est c omprise entre deux
valeurs données augmente avec la masse de l’entité
Formules brutes* Formules brutes* contenant contenant 1212C, C, 11H, H, 1414N et N et 1616O O entre 28.000 et 28.200 :entre 28.000 et 28.200 :
CO : 28.000N2 : 28.006N2 : 28.006
CH2N : 28.019*C2H4 : 28.031
La capacité d’un spectromètre à distinguer une mass e x d’une masse y dépend de la
résolution …
Résolution = m / ∆m
� Si la résolution est suffisante, on peut alors asso cier une masse donnée à une seule formule
brute
� ∆∆∆∆m = différence de masse correspondant à deux pics a djacents tout juste séparésm = masse du premier pic (ou moyenne des masses des deux pics)
� Dès lors, un spectromètre dont la résolution est de 2000 peut séparer des pics situés à des valeurs m/z de 2000 et 2001 (ou de 200 et 200,1 ou de 20,00 et 20,01)
analyse de spectres de masse 13
� Deux pics sont séparés si la profondeur de la vallé e qui les
sépare ne dépasse pas une fraction donnée de la hau teur du
pic le moins intense (généralement 10% pour la haut e
résolution et 50% pour la basse résolution)
� Autre définition (pour un pic isolé) = résolution F WHM : ∆∆∆∆m =
largeur à mi-hauteur. Définition plus flatteuse : résolution
FWHM / résolution à 10% = 2,2
Remarque : Un autre paramètre important de l’analyseur est
l’exactitude en masse càd la précision, ou plus exactement la
justesse des rapports m/z mesurés. Elle dépend de la stabilité et
du pouvoir de résolution de l’analyseur.
Résolution = m / ∆m
Remarque : Un autre paramètre important de l’analyseur est l’exactitude en masse càd
la précision, ou plus exactement la justesse des rapports m/z mesurés. Elle dépend de
la stabilité et du pouvoir de résolution de l’analyseur.
analyse de spectres de masse 14
Basse Résolution et Haute Résolution
Formule Brute : Masse exacte M12C 1H4 16,0313 13C
1H417,0346
12C2571H383
14N6516O77
32S6* 5 803,6377
13C12C2561H383
14N6516O77
32S6* 5 804,6401
14N2 28,0061512C 1H 28,0312
∆∆∆∆m R = m/∆∆∆∆m
1,0033 16
1,0033 6 000
0,025 1 100
SpectromètreHR ou BR ?
BR
HR
BR
Entitésidentiques dont l’une contient un 13C
analyse de spectres de masse 15
12C21H4 28,0312
12C9 14N4
16O 180,007312C11
1H2 14N 16O2 180,0085
12C2571H383
14N6516O77
32S6* 5 803,6377
12C2591H385
14N6216O78
32S6 5 803,6390
0,0013 140 000
0,0013 4 500 000
* Insuline
Les spectromètres commerciaux actuels peuvent avoir une résolution allant jusque 500 000 HR = haute résolution : R de l’ordre de 10 4 -105 - BR = Basse résolution : R de l’ordre de 10 3
BR
HR
Impossibleà séparer
Entités ≠ mais de masses très proches
En Conclusion :
� La résolution détermine la capacité d’un spectromèt re de masse à différencier deux masses : R = m / ∆∆∆∆m
Pour des molécules de masse < 1000 Da :
� Les spectromètres à haute résolution permettent d’a ssocier une masse donnée à une
formule bruteformule brute
Pour des molécules de masse > 1000 Da
� Ce n’est plus le cas. A haute résolution et selon la taille de la molécule, on peut parfois distinguer les satellites isotopiques ( ∆∆∆∆m = 1)
NB : N’oubliez pas que l’analyse des massifs isotopiques est une aide précieuse dans l’attribution d’une formule
brute
Spectrométrie de masse –
Quantification
La La sensibilité = recherche de la limite de détectio n(LOD) et Quantification (LOQ).
En analyse Qualitative , la LOD est la quantité minimal d’échantillon nécessaire àl’obtention d’un spectre de masse de qualité.
En analyse Quantitative la LOD est la quantité minimal détectable d’une molécule parrapport au bruit de fond.
17
LOD = 3 S/N
LOQ = 10 S/N
Plusieurs paramètres conditionnent la LOQ :
- Paramètre de source du spectromètre de masse
- La technique d’ionisation
- les solvants et tampon en ESI
18
Spectrométrie de masse –
Analyse de Biomolécules
MRM, des limitations …
1. La molécule doit s’ioniser, surtout en ESI2. La molécule doit fragmenter, mais pas trop3. Linéarité de 4 ordres de grandeurs ( TOF) jusqu’à 6 (TQD )3. Linéarité de 4 ordres de grandeurs ( TOF) jusqu’à 6 (TQD )4. Précision des mesures : 10%5. LOD , LOQ variable en fonction des molécules, des appareils ( 20 pg pour la
carnitine sur TQD Waters de 2000), inférieur sur une Maxis Q-TOF de 2009.6. Répétabilité des aires : mauvais d’un jour à l’autre
1. lié à l’encrassement2. Effet matrice en ESI ( pas en EI ).
On préfère toujours la solution de l’étalon interne à la courbe de calibration externe
Idéalement, l’étalon interne est la molécule marqué iso topiquement ( Testostérone D3, Carnitine D3.
Spectrométrie de masse –
Quantification
La spectrométrie de masse apporte :La spectrométrie de masse apporte :
- Spécificité
- La sensibilité
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La La spécificité est obtenu par :est obtenu par :
- La préparation de l’échantillon pour séparer la molécule cyble des interférences.
- Le spectromètre de masse en lui même
La La sensibilité est obtenu par :est obtenu par :
- La technologie employée
- Les modes du spectromètre de masse
Spectrométrie de masse –
Quantification La La spécificité est obtenu par :est obtenu par :
- La purification de l’échantillon
- Extraction ( liquide liquide )
- SPE / MIP
- La dérivatisation : augmentation du poids de la molécule d’intêret et ciblage d’ion caractéristique de masse supérieur.
- Le spectromètre de masse.
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- Le spectromètre de masse.
- Augmenter la résolution
- R= 2000 TQD
- R= 20 000 Q-TOF
- - mode SRM ( Single Reaction Monitoring ) .
Quantitatif
1. Etablir une courbe de calibration avec toujours la même quantité d ’étalon interne.2. Concentré l’échantillon avec la même quantité d’étalon interne que pour la calibration3. Comparer le rapport A Atrazine / A IS pour obtenir la quantité d’étalon interne.
Cpd # Formula RT Mass [M+H]+
DEDIA C3H4N5Cl 145.0155 146.0227
DIA C5H8N5Cl 173.0468 174.0540
DEA C6H10N5Cl 187.0625 188.0697
Quantitatif
DEA C6H10N5Cl 187.0625 188.0697
ATRAZINE C8H14N5Cl 5.01 215.0938 216.1010
ATRAZINE-D5 C8H9D5N5Cl 5.02 220.1252 221.1324
Qualitatif
1. Définir les paramètres optimaux de sources.
2. Réaliser la Courbe de calibration1. Toujours la même quantité d’étalon interne dans les 200µl2. Faire varier la quantité d’atrazine de 20ng ( limite haute de la réglementation)3. 20 ng4. 10 ng5. 5 ng6. 1 ng7. 0.5 ng7. 0.5 ng8. 100 pg9. 10 pg
3. Comparer le rapport de l’aire de l’atrazine / Aire de l’atrazine D5après extraction en HR-MS
Transition M.R.M pour l’ATRAZINE et son étalon interne
MRMCompound Name ISTD? Precursor Ion MS1 Res Product Ion MS2 Res Dwell Fragmentor Collision Energy Cell Accelerator Voltage PolarityATRAZINE-D5 True 221.1 Unit 179.1 Unit 200 120 17
7 PositiveATRAZINE-D5 True 221.1 Unit 69.1 Unit 200 120 41
7 PositiveATRAZINE False 216.1 Unit 174.1 Unit 200 110 13
7 PositiveATRAZINE False 216.1 Unit 104 Unit 200 110 29
7 Positive
HPLC : colonne type C18 2.1 x 100 mm, 2.6µm
Debit 300µl/min Temps B% Débit
Solvant A H2O 5mM Acétatate d'ammonium 0 3 300 µl/minSolvant B Méthanol 0.5 3 300 µl/min
5 90 300 µl/min7 90 300 µl/min
7.05 3 300 µl/min9 3 300 µl/min
QQQ.Vcap 3500 VGAS Temp 350 °CDrying gaz 12 L/minNebuliseur 45 psiFragmenteur 120 VESI Positif
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