SVILUPPO E VALIDAZIONE SPERIMENTALE DI TERAPIE PER IL TRATTAMENTO DELLA GLICOGENOSI TIPO 1

SVILUPPO E VALIDAZIONE SPERIMENTALE DI TERAPIE SVILUPPO E VALIDAZIONE SPERIMENTALE DI TERAPIE PER IL TRATTAMENTO DELLA GLICOGENOSI TIPO 1PER IL TRATTAMENTO DELLA GLICOGENOSI TIPO 1

Luigi VaresioAIG Rimini 2012

TERAPIA GENICA

TERAPIA CELLULARE

TERAPIA GENICA vettori virali che esprimono il gene sano

Vettori adeno associati Reazione immunitariaReazione immunitaria

SpecificitàSpecificità di tessuto

Totale (KO)

(JY Chou)

• Vettori virali• Vettori cellulari

Condizionale

(A. Eva)

Fegato

• Danno epatico• Adenomi

Condizionale_Inducibile

(F. Rajas)

• Danno epatico• Danno renale• Danno intestinale

Naturale (KO)

(D.A. Weinstein

• Validità dei trattamenti

Modelli animali GSD1

Conoscere la malattiaConoscere la malattia

Sperimentare i trattamentiSperimentare i trattamenti

Modello condizionale fegato

Abbiamo prodotto dei topi che mancano dell’enzima G6Pasi solo nel fegato

X

Topo Cre-fegatoTopo condizionale

Topo KO solo fegato

2) L’ insorgenza di adenomi / carcinomi

1) Il danno al fegato della malattia

Questi animali servono per studiare:

I topi condizionali fegato

sono vitali

Sono ipoglicemici solo dopo digiuno

Hanno fegato

alterato

Istologia

normale KO condizionale

Glicogeno

normale KO condizionale

Grassi

normale KO condizionale

Glicemia

normale KO condizionale

---- digiuno

Glu

co

sio

(m

g/d

l)

---- digiuno

Terapia genica in topi KOTerapia genica in topi KO

Trattamento Fegato Rene Sopravvivenza

Adenovirus + +/- 1 mese

Adenovirus + +/- <12 mesi+ adeno associato 1

Adeno associato 1 + +/- <11 mesi

Adeno associato 8 + ? < 18 mesi

Conclusioni La terapia genica con vettori virali funziona per il

fegato ma non per il rene.

Zingone A et al., J Biol Chem 275:828–832, 2000Sun M-S et al., Hum Mol Gen: 11: 2155–2164, 2002Ghosh A, Gene Ther 13:321–329, 2006Yiu WH, Mol Ther. 18:1076-1084, 2010Grinshpun A et al., Mol Ther 18:1592–1598 2010

Modello murinoTerapia genica in cani KOTerapia genica in cani KO

Trattamento Fegato Rene Sopravvivenza

Adeno associato 1 e 8 + ? ~11 mesi

CONCLUSIONI

La terapia genica con vettori virali funziona anche per i cani

Koeberl DD, Mol. Ther. 16: 665–672, 2008Beaty1 RM, Gene Ther 9:1015–1022, 2002D. A. Weinstein et al. Hum Gene Ther 21:903–910, 2010.

Terapia cellulare per la GSD 1a

KOcontrol

Cellule: staminali ematopoieticheCellule: staminali ematopoietiche

Fonte: midollo osseo normaleFonte: midollo osseo normale

Via di inoculo: vena temporaleVia di inoculo: vena temporale

˜ ˜ ˜ ˜ ˜ ˜

Cellule staminali ematopoietiche

Età del topo malato: 2 giorniEtà del topo malato: 2 giorni

normali KO non trattati KO trattatiKO trattati

Analisi dei fegati dei topi KO a tre settimane dal trapianto di staminali

Rosa26 Rosa26 GFP GFP

a b c

20 m 20 m

Treated G6pc-/-

anti -galactosidase

Treated G6pc-/- Untreated G6pc-/-

-galactosidase activity

Rosa26

Liver repopulation by Rosa 26- and GFP-Tg-derived BMMs

2500 m

Treated G6pc-/-

HNF1

GFP

Albumin

Rosa26 GFP

d e

100 m

Treated G6pc-/-

100 m

Untreated G6pc-/-

Ripopolazione del fegato con mielomonociti di topi normaliAttività -galattosidasi

KO trattati

Anti -galattosidasi

KO non trattati KO trattati

KO trattati KO trattatiKO non trattati

Aspetto istologico dei fegati trattati Presenza di fusione cellulare

Ripopolazione del fegato Espressione e attività G6PasiCaratteristiche delle cellule fuse

Parametri funzionali e di sopravvivenza

Sopravvivenza Sopravvivenza

GiorniGiorni

% s

op

ravv

iven

za%

so

pra

vviv

enza

Non trattatiNon trattatiTrattatiTrattati

Parametri Parametri funzionalifunzionali

KO non trattatiKO non trattati(% del normale)(% del normale)

KO trattatiKO trattati(% del normale)(% del normale)

EpaticiEpatici

G6PasiG6PasiGlucosioGlucosioColesteroloColesteroloTrigliceridiTrigliceridiALTALTASTAST

11 1111 253253 629629 35035010551055

99 6060131131266266192192562562

RenaliRenali

AlbuminaAlbuminaCreatininaCreatinina

10301030 529529

12201220 448448

Il rene nei topi trattati con cellule staminali

Normali KO trattatiKO non trattati

Il trattamento dei topi KO neonati con staminali:

• determina un miglioramento dei valori metabolici epatici

• determina un miglioramento della sopravvivenza dei topi KO

• non ha effetto sul rene

Resaz R. et al. J. Hepatol. 2011

Sviluppo di strategie terapeutiche combinate

cellulari e virali per raggiungere il rene e

aumentare l’efficacia

Terapia combinata virale e cellulare

1) Terapia del fegato con cellule staminali ingegnerizzate con vettore virale• Aumentare l’efficienza e mimare la situazione del paziente

2) Terapia del rene con virus adeno-associato con tropismo renale• Curare il rene

Purificazione etitolazione del virus

Inoculo nel rene

Prelievo di cellulestaminali da femore di topo normale

Infezione delle cellulestaminali con il virus

Inoculo nellavena temporale delle cellule ingegnerizzateper il trattamento epatico

• Utilizzo di un vettore adeno-associato che esprime la G6Pasi umana sotto il controllo del promotore/enhancer del gene G6PC umano. (Yiu W H et al., Mol. Ther., 2010).

2) Terapia del rene con vettore virale adeno-associato con tropismo renale

Incisione della cute

Visualizzazione del rene

Inoculo del vettore virale nel rene

Procedura chirurgica

Un mese dopo

KO

WT

Terapia del rene con virus adeno-associato con tropismo renale

PRIMI ESPERIMENTI

Visualizzazione di cellule fluorescenti a due settimane dall’inoculo

20X 100X

Utilizzo di un vettore fluorescente per la visualizzazione in vivo delle cellule renali infettate

Dati preliminari

Topo Trattamento Glicemia Glicemia aTopo Trattamento Glicemia Glicemia a Peso fegato/ Peso fegato/ Peso rene nonPeso rene non mg/dl digiuno (12 ore) peso corporeo mg/dl digiuno (12 ore) peso corporeo trattato/pesotrattato/peso

mg/dlmg/dl % % corporeo (%)corporeo (%)

Normale Normale -------- 130 65-------- 130 65 4 4 1.21.2

KO -------- <40 <20KO -------- <40 <20 12 12 2.2 - 42.2 - 4

KO KO AAV + staminali 100 AAV + staminali 100 152 152 9 9 1.21.2

KO KO AAV 101 AAV 101 44 44 14 14 1.41.4

Topi inoculati nel rene con virus adeno-associato (AAV)

E’ possibile correggere il difetto de rene e del fegato causato dalla GSD1a utilizzando terapia genica con vettori cellulari e virali in combinazione

Glicogenosi 1b

Causa:

mutazione del trasportatore del glucosio-6-fosfato dal citoplasma al reticolo endoplasmatico.

Conseguenze:

• ipoglicemia, epatomegalia, nefromegalia, iperlipidemia, iperuricemia, acidosi lattica, ritardo della crescita, problemi epatici e renali a lungo termine (come per la GSD1a).

• neutropenia e disfunzione dei neutrofili .

• infezioni batteriche ricorrenti, malattia infiammatoria intestinale, o enterocolite.

G

Trasp

Reticolo endoplasmatico

G6P

Trasp

GG6Pasi

GSD1a

GSD1b

?

G6Pasi

Neutrofili

G6P

Neutropenia congenita severa

G6P

Trasp

G6Pasi

GSD1a

G6Pasi

FegatoReneIntestino

GSD1b

G6Pasi

G6Pasi

FegatoReneIntestino

Neutrofili

Neutropenia congenita severa

G6Pasi

Neutrofili

G

Nel midollo osseo si producono le cellule del sangueNel midollo osseo si producono le cellule del sangue

TERAPIA GENICA PER LA GLICOGENOSI 1b

Modello animale (J.Y. Chou) poco utilizzabile: morte precoce per infezione.Modello animale (J.Y. Chou) poco utilizzabile: morte precoce per infezione.

Problemi della terapia genica

Effetto transitorio Effetto transitorio sulla funzionalità e il numero di neutrofili.sulla funzionalità e il numero di neutrofili.Breve vita dei neutrofili il cui rinnovo dipende dalle cellule staminali multipotenti del midollo.Breve vita dei neutrofili il cui rinnovo dipende dalle cellule staminali multipotenti del midollo.

Generare un modello animale condizionale inducibileGenerare un modello animale condizionale inducibile(Progetto collaborativo con la Dr. Chou possibile)(Progetto collaborativo con la Dr. Chou possibile)

Trapianto di midollo osseo per il trattamento della neutropenia e della Trapianto di midollo osseo per il trattamento della neutropenia e della disfunzione dei neutrofilidisfunzione dei neutrofili

Trapianto di midollo osseo

Trattamento con vettori cellulari o virali

Iniezione delle cellule di midollo normali

Combatte le infezioni ricorrenti e l’infiammazione intestinale

Rigenerazione funzionalità epatica e renale

PRIMA DEL TRAPIANTO DOPO IL TRAPIANTO

Neutrofili 0.3-0.9 x 109/L (con G-CSF) 0.4-4.1 x 109/L (senza CG-CSF)

Piastrine 4-145 x 109/L 89-262 x 109/L

Movimenti intestinali 12-20 volte al giorno 1-2 volte al giorno

Trigliceridi 1.27-5.37 mmol/L 1.85-5.35 mmol/L

Colesterolo 1.9-2.7 mmol/L 2.3-4.4 mmol/L

Lattato 1.1-3.5 mmol/L .8-2.2 mmol/L

Urati 248-478 mmol/L 176-298 mmol/L

Ricoveri ospedalieri 13 in 12 mesi 2 in 14 mesi

Regime di nutrizione Naso-gastrico continuo (24 ore) Amido di mais ogni 4 ore

Trapianto di midollo nella Glicogenosi 1b

Bone Marrow Transplantation in Glycogen Storage Disease Type 1b

GERMAINE PIERRE, MBBS, MRCPCH, GEOTHY CHAKUPURAKAL, MRCP, PATRICK MCKIERNAN, BSC, MBBCH, FRCPCH,CHRIS HENDRIKSZ, MBCHB, MRCPCH, SARAH LAWSON, BSC, MBCHB, MRCP, FRCPATH, AND ANUPAM CHAKRAPANI, MD, FRCPCH

We report a case of glycogen storage disease type 1b that was successfully treated with bone marrow transplantation after life-threatening complications related to neutropenia and thrombocytopenia. Concomitant reduction in inflammatory bowel disease–related symptoms and improved metabolic stability were also observed. (J Pediatr 2008;152:286-8)

Clinical Trial negli USA

• Collaborazione NIH, Florida e Canada per trattare 10 pazienti adulti affetti da glicogenosi 1a con vettori virali • Il Trial è stato approvato da Food and Drug Administration

Istituto G. Gaslini, GenovaIstituto G. Gaslini, GenovaLaboratorio di Biologia MolecolareLaboratorio di Biologia Molecolare

• R. ResazR. Resaz• D. Segalerba D. Segalerba • C. VanniC. Vanni• A. EvaA. Eva• L. VaresioL. Varesio

Istituto G. Gaslini, GenovaIstituto G. Gaslini, GenovaLaboratorio di Biologia MolecolareLaboratorio di Biologia Molecolare

• R. ResazR. Resaz• D. Segalerba D. Segalerba • C. VanniC. Vanni• A. EvaA. Eva• L. VaresioL. Varesio

NationalNational Institutes of Health, Institutes of Health, (USA)(USA)• J. ChouJ. ChouNationalNational Institutes of Health, Institutes of Health, (USA)(USA)• J. ChouJ. Chou

IST, Genova, IST, Genova, • O. BarbieriO. Barbieri

IST, Genova, IST, Genova, • O. BarbieriO. Barbieri

Università di TorinoUniversità di Torino• G. TaroneG. Tarone

Università di TorinoUniversità di Torino• G. TaroneG. Tarone

Istituto G. Gaslini, GenovaIstituto G. Gaslini, Genova• A. SementaA. Sementa• M. DiRoccoM. DiRocco

Istituto G. Gaslini, GenovaIstituto G. Gaslini, Genova• A. SementaA. Sementa• M. DiRoccoM. DiRocco

La Dott.ssa Janice Y. Chou ci fornirà : La Dott.ssa Janice Y. Chou ci fornirà :

•i cloni del gene i cloni del gene G6PTG6PT per generare il modello animale condizionale per generare il modello animale condizionale inducibile inducibile

•Il vettore AAV-G6PT per produrre il virus per il trattamento del Il vettore AAV-G6PT per produrre il virus per il trattamento del fegato e del rene del topo inducibilefegato e del rene del topo inducibile

Topi trattati con virus adeno-associato con tropismo renale

Dati preliminari

Modelli animali GSD1

Topi Knock out (KO) Cane GSD

Totale (KO) (JY Chou) Condizionale (A. Eva)

Fegato

Condizionale_Inducibile (F. Rajas)• Fegato • Rene • Intestino

Totale (KO) (D.A. Weinstein)

Efficacia terapeutica cellule staminali ematopoietiche

Valutazione di:

•Aspetto istologico dei fegati trattati

•Presenza di fusione cellulare

•Espressione e attività dell’enzima G6Pasi

•Parametri funzionali epatici e renali

•Sopravvivenza dei topi

•Quantificazione di attecchimento nel fegato delle cellule staminali