Técnicas moleculares: Extração de DNA, detecção de ... 2- PCR... · Técnicas moleculares:...

Profa. Renata Faier Calegario

Técnicas moleculares:Extração de DNA, detecção de ácidos

nucleicos e sequenciamento

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁSETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO

AF 060- Biotecnologia Vegetal

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

DNA DNA

RNA

PROTEÍNA

Transcrição

Tradução

Replicação

DNA RECOMBINANTE

Planta Transgênica

INTRODUÇÃO

Isolamento do DNA da planta

Fundamental para analisar se oDNA exógeno foi inserido nogenoma vegetal

• PCR = Presente ou Ausente

• Southern Blot = Nº de cópias

Planta Transgênica

Técnicas de detecção :

EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS

Diferentes protocolos => em função da espécie e do tecido

Maioria => variação de 2 protocolos básicos

• Dellaporta et al. (1983)

• Doyle & Doyle, (1987)Baseado na utilização do detergente CTAB

Baseado na precipitação de proteínas e polissacarídeos: por acetato depotássio na presença de SDS

Romper as membranas celulares para liberação do DNA

Romano, 1998

� Isolamento do DNA da planta

EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS

Você deve ter em mente:

� Isolar o DNA de outros constituintes celulares: lipídeos,proteínas e polissacarídeos

� Manter Integridade: informação/sequência

�Comp. fenólicos e polissacarídeos = interferem na atividadede enzimas usadas para manipulação de DNA=> ligases, polimerases e enzimas de restrição

� Use tubos plástico novos e esterilizados=> O DNA apresenta grande afinidade pelo vidro (evite-o)

EXTRAÇÃO DE DNA: MÉTODO CTAB

Romano, 1998

NaCl, Tris,

EDTA, βME

H2O Lise celular = liberar o DNA

Evita degradação do DNA

Desnatura proteínas

Lipídeos, polissacarídeos

DNA

Proteínas

Precipita DNA

EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS

Etapas básicas de protocolos de extração

� Lise celular = liberar o DNA

• N2 líquido

• Diretamente no Tampão de extração

Tampão de extração

• Tris pH 8.0 e 9.0 = mantém pH (desfavorável às DNAses, pH 7.0)

• EDTA = agente quelante Mg+2 e Ca+2 (co-fator de DNAses)

• β-mercaptoetanol = antioxidante e desnatura enzimas

=> DNA oxidado é inacessível às enzimas de restrição

EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS

� Tampão de extração (continuação)

• NaCl = liberação de proteínas ligadas aos ácidos nucleicos (íonsrompem ligações de cadeias polipeptídicas)

• CTAB e SDS = detergentes = lise das membranas celulares (liberaos componentes)

⇒ Junto com NaCl = forma um complexo com o DNA

⇒ Usado para precipitar o DNA seletivamente

• RNAse = elimina RNA

� Desnaturação das proteínas com solventes orgânicos• Fenol

• Clorofórmio:álcool isoamílico

⇒ Fase aquosa (superior): DNA + contaminantes (Polissacarídeos e RNAs)

⇒ Interface: proteínas desnaturadas

⇒ Fase orgânica (inferior): Lipídeos, polissacarídeos

� Recuperação do DNA: Precipitação

• Isopropanol ou álcool absoluto = DNA desidrata e precipita

• Acetato de amônio = remove fenóis ou polissacarídeos

• Acetato de potássio (+SDS) = precipita proteínas e polissacarídeos

Centrifugação

EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS

� Lavagem do DNA: remoção de sal

• Etanol 70%

� Contaminação por polifenóis: cor marrom do DNA(oxidação)

� Co-isolamento de polissacarídeos: aspecto gelatinoso emuito viscoso

� Presença de DNAses endógenas: visualização do DNAgenômico em gel de agarose – degradado (arraste vertical)

EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS

Problemas comumente encontrados:

Baixa qualidade do DNA

PROBLEMAS, CAUSAS E SOLUÇÕES

Ro

ma

no

& B

rasl

eir

o,

19

98

Continuação

Romano & Brasileiro, 1998

PROBLEMAS, CAUSAS E SOLUÇÕES

DNA absorve luz no λ 260 nm / Proteínas a 280 nm

• 1 OD 260 = 50 mg de DNA

[[[[DNA]]]] = leitura OD260 x 50 x fator de diluição

• Parâmetro da qualidade do DNA => Relação OD 260/OD 280

Valores < 1,8 => contaminação com proteínas

Valores >1,8 => contaminação com fenol

Avaliação DNA extraído: Concentração e Pureza

1. Análise da OD em espectrofotômetro

ANÁLISE DA EXTRAÇÃO

2. Eletroforese: Análise em gel de agarose

• Concentração: 0,8% e 1% (varia de acordo com tamanho DNA)

• Marcador: DNA de concentração conhecida = Padrão

• Amostras comparadas aos padrões: possível estimarconcentrações de DNA em cada amostra

ANÁLISE DA EXTRAÇÃO

ANÁLISE DA EXTRAÇÃO

1Kb = 1000pb

ANÁLISE DA EXTRAÇÃO

Análise em gel de agarose: DNA genômico de Plantas

1-4 = DNA Folha Tabaco 5-8 = DNA Arroz

http://www.uniscience.com/homogeneizador/bullet-blender-next-advance

Sorgo Folha Arroz Folha Trigo

Kit de extração DNA

HiPurA™ - Hemedia

Moléculas de DNA de mesmo tamanho = migram com diferentes velocidades na forma circular relaxada, linear ou supertorcida

5 Min 30 Min

Tratamento com Topoisomerase

ANÁLISE DA EXTRAÇÃO

A dupla-hélice enrola-se sob si

mesma

Promovem a quebra transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ouremovendo superenrolamentos

TESTES MOLECULARES DETECÇÃO

PCR: Polymerase Chain Reaction

� Método in vitro para produzir DNA

� Baseado nas propriedades do DNA:

Reação de Polimerização em cadeia

Elementos necessários:

⇒ DNA molde: Proveniente de extração

⇒ Componentes da Replicação: DNA polimerase, primers enucleotídeos

Karl Mullis: 1983Prêmio Nobel: 1993

Desnaturação

Renaturação

REPLICAÇÃO X PCR

Quais os elementos necessário para a Replicação do DNA?

DNA molde

Abertura das fitas = helicase

Adição de nt = síntese

Primers = Primase

Nucleotídeos

Temperatura

Primer: desenhar

DNA: extrair

Nt Sintéticos

DNA polimerase

CÉLULA IN VITRO

Todos elementos são adicionados ao tubo (eppendorf)

• DNA extraído: 20 a 200ng

• dNTPs: Nucleótidos A, T, C, G

• Par de Primers (iniciadores)=> anelando nas bordas daregião a ser amplificada

• Taq DNA polimerase: Thermus

aquaticus (estável em ↑ T°)

• Tampão 10X: estabiliza pH

• MgCl2: cofatores (Mg+2) Taq eajuda ligação dos primers

REAÇÃO DE PCR

H2O

dATP

dCTP

dTTP

dGTP

Primer5’ - 3’

Primer3’ – 5’

Taq DNA Polimerase

Mg+2

Tampão 10X

dNTPs

Figura: http://slideplayer.com.br/slide/366864/

DNA

25µL

=> Amplificação da sequência específica do DNA = fragmento

=> Tamanho e sequência definidos

=> Grande quantidade

Ao final da Reação:

PCR

Equipamento necessário:

⇒ Termociclador

⇒ Propicia temperaturas distintas

Desnaturação = 94°C

Anelamento = 54°C

Extensão = 72°C1 Ciclo

500 pb

700 pb750 pb

PRIMERS

O QUE É UM PRIMER?

� Sequência de nucleotídeos complementar às extremidadesda sequência alvo do DNA

� Tamanho: 17-25 nucleótidos

� Deve corresponder a uma sequência única dentro do DNA aser amplificado

COMO FAZER UM PRIMER ?

� Conhecer a sequência do gene

� Lembrar: Polimerização sempre 5’-3’

PRIMERS

…GTTCTAGGATCGACTCTAAGTTGAATTATGAGAAATTGTGTGATTTTGTCAACACTGAGTCGAGACCCCTGGCTAGGACTTTCCGTAGTCCTCCAGATGTTATGCCTACCGTATGCAGCAAATTTACGGTAAGTCACTTAAAGGCCTGACCATACAGTGTTTGAGCAAGAATCAGGACACTTCTCCAAGCGTCTCTAAGCTTGTTATCACAAAGAATTATAGGTTTGGACAGAATTTTATACGCGAAGTCTTTGATAAAATTGGACATGCTTAGCTTTTATGGTAATGGTGGTATGATCTTTACAGATTGCTGTAGTACTATACACCAGTTTCAGGGTAGTGACGCTGAATATGTTGTTGTCATGCGCCTGACATATGCTGAGTAAGTCTATTTTTATGGATGAAAGGCAATGTCTTGTCGCATAAGACTAGGCACACTATGCGAATGGTCTACG...

5’-

- 3’

Sequência do Gene

5’…GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’

3’…CAAGATCCTAGCTGAGATTCATTGAATTATGAGAAATTGTGTGATTTTC.…5’

5’…CAATGTCTTGTCGCATAAGACTAGGCACACTATGCGAATGGTCTACG...3’

3’- GTGATACGCTTACCAGATGC…5’

Fita 1 - Molde

Fita 2 - Complementar

Fita 1 - Molde

Fita 2 - Complementar

PRIMERS

5’- GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’Sequência do PrimerForward (Left)

Amplifica Fita 5’- 3’

molde

Sequência do PrimerReverse (Right) 5’- CGTAGACCATTCGCA TAGTG- 3’

Amplifica Fita 5’ - 3’

Compl.

PRIMERS

� Composição: 50% C+G

� Extremidade 3’: com G ou C

� Evitar três ou mais Gs ou Cs (3´) = Anelamento inespecífico em

regiões ricas em G ou C

� Evitar complementaridade de bases no próprio primer (hairpin,

estruturas secundárias)

PRIMERS

Características desejáveis dos Primers

� Temperatura alta: maior especificidade

� Temperatura baixa: menor especificidade

�Temp. Anelamento: ~ 5º C abaixo do menor Tm do par de primers

Tm varia de 55-72oC

Tm dos dois primers próximas

PRIMERS

Condições de Anelamento TEMPERATURA

Tm = 2 (A+T) + 4 (G + C)

Melting Temperature (Tm) = Temperatura Desnaturação

Fórmula de Wallace

PRIMERS

5’- GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’Sequência do PrimerForward (Left)

Tm = 2 (5 + 6) + 4 (5 + 4)

Tm = 58°C TA = 53°C

5º C abaixo da Tm

� Programa Primer 3

� http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/

� Colar a sequência do gene

� Pick Primers (Left e Right)

PRIMERS

Uso de Programas

PROGRAMA: PRIMER 3

Len: Oligo Length

tm: Melting Temperature

Any: Self Complementarity - a

measure of its tendency to anneal to

itself or form secondary structure

3' : Self Complementarity-taken as

a measure of its tendency to form a

primer-dimer with itself

rep : Mispriming or Mishyb

Library Similarity - The similarity

to the specified Mispriming or

Mishyb library.

seq : Primer Sequence, 5'->3‘ The

sequence of the selected primer or

oligo, always 5'->3', so the right

primer is on the opposite strand

from the one supplied in the source

input. The right primer sequence is

the sequence you would want

synthesized in a primer order.)

LEGENDA

PROGRAMA: PRIMER 3

PCR

⇒ O que acontece dentro do termociclador??

Desnaturação = 94°CAnelamento = 54°CExtensão = 72°C

1 Ciclo

REAÇÃO DE PCR

Anelamento

ou

Primer Forward

Primer Reverse

Forward

Reverse

REAÇÃO DE PCR

1° CICLO

APÓS REAÇÃO

Quantidade de cópias aumenta em progressão geométrica

Quantidade de cópias = 2 n

Onde, n = n° de ciclos

2 31 = 2 bilhões de cópias do fragmento

Cada uma das novas fitas de DNA sintetizadas a partir dos “primers”serve como molde para síntese de uma nova fita.

ANÁLISE DA PCR

Verificar se houve amplificação do fragmento de interesse

� Eletroforese: Análise em gel de agarose

• Concentração: 0,8% e 1% (acordo com tamanho fragmento)

• Marcador conhecido: para estimar o peso molecular

Presença de Banda = Positivo

Ausência de Banda = Negativo

• Amostras comparadas ao marcador determinando-se o tamanhodo fragmento de DNA amplificado

ANÁLISE DA PCR

Milho Bt - Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

Primers utilizados para PCR e oisolamento do Vip3A

Amplificação confirma a presença do gene

Gene 99,8% idêntico à sequência de nt publicadapara o gene Vip3A

Detecção do gene Vip3A: Bacillus turingiensis

ANÁLISE DA PCR

Calegario et al. Pesq. agropec. bras., Brasília, v.42, n.9, p.1335-1343, set. 2007

Detecção de begomovírus em plantas de Tabaco

Fragmento com aproximadamente 1.200 nucleotídeos para o DNA A,compreendendo as extremidades 5' dos genes Rep e Cp e toda região comum

Rep

CP

- Apresenta alguns falsos positivos

- Importante controles +/-

- Sensível (fentograma: 10-18) - Rápido- Grande n° amostras

Vantagens:

Desvantagens:

PCR

Controle positivo = amostra conhecidamente positiva

Controle negativo = sem DNA

Controle negativo = com DNA, sem primer

PCR

- Detecção de genes em DNA genômico

- Clonagem de DNA

- Sequenciamento

- Evolução molecular

- Análise de estrutura genômica

- Identificação de mutações

- Diagnóstico de doenças: humanos, animas e de plantas

- Teste de paternidade

APLICAÇÕES

.....

HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Ácidos nucleicos: capacidade de hibridização

Sequências complementares pareiam Estrutura Duplex

Teste de complementaridade

DNA

Southern Blot Northern Blot

RNA

Sonda: sequência complementar de DNA alvo

SOUTHERN BLOT

Detecta fragmento do DNA específico no DNA genômico

COMO?

Introdução de nucleotídeos marcados em sequências de DNA

� Sondas Radioativas = nt 32P

� Não-Radioativas = nt biotina/digoxigenina (colorimétrica ou quimioluminescente)

KIT DE MARCAÇÃO

Kit Dig DNA

Produto PCR purificado

Fervido: 100° C/10 min => Gelo

PCR desnaturadoNt (primers aleatórios - hexameros)dNTP- DigoxigeninaEnzima Klenow DNA Polimerase I

Δ 37°C 12hs

Gel: Fragmentos DNA

TRANSFERÊNCIA

HIBRIDIZAÇÃO

SOUTHERN BLOT

REVELAÇÃO

Tratamentos:

Depurinação

Desnaturação

Neutralização

-- --

-

-

-

-

--

-

-

--

-Lavagens

Retira excesso

de sonda

DNA (-) imobilizado

Sonda fria

Nucleotídeos marcados com

digoxigenina

E E E

Anticorpo contra digoxigenina

ligado a Fosfatase alcalina

Membrana (+)

Adição substrato da enzima Fosfatase alcalina (NBT/BCIP)

=> clivagem e precipitação sobre a membrana

O QUE ACONTECE NA MEMBRANA

Plantas Transgênicas de Soja: seleção de eventos positivos

SOUTERN BLOT

VIII Jornada Acadêmica da Embrapa Soja

Gel - 3hs

Hibridização 18hs

α32P: d-CTP3 3

4

1 11

4 4 6 66 6

4

Cópias do transgene

DNA total Hind III Separou o gene

PCR

SoutherBlot

SOUTERN BLOT

Plantas Transgênicas de Batata

DNA total digerido Eco RI

1 e 5: Marcador Peso Molecular

2 e 4: DNA total batata transgênica

digerido co Eco RI

3: DNA total batata Não-transgênica

digerido co Eco RI

Southern Blot do gel

� Possibilita rearranjos das inserções que podem levar a perdadas mesmas ou ao silenciamento

� Pode comprometer o desenvolvimento e metabolismo daplanta, pelo efeito posicional das inserções

Alto número de inserções do transgene:

SOUTERN BLOT

� Importante para a expressão estável

� Em estudos de expressão gênica => facilita a interpretação dareal interação entre as moléculas

Poucas cópias:

� Sensibilidade (fentograma)

� Quantitativa: nº de cópias do gene integradas ao genoma

� Envio de membranas para outro laboratório

� Demorado

� Caro

� Perigoso (sondas radioativas)

SOUTHERN BLOT

Vantagens:

Desvantagens:

- Importante experimentos de Transformação => Provamolecular da integração do gene exógeno no genoma vegetal

- Bandas com PM diferente do controle + => indicativo dealterações no material genético

- Detecta fragmento específico em meio a milhões defragmentos

- Usado para distinguir estirpes de um organismo

SOUTHERN BLOT

APLICAÇÕES

SEQUENCIAMENTO DO DNA

• Identificação da sequência exata dos nucleotídeos do DNA

Método Enzimático (Sanger): Similar à PCR

� Baseado no término da cadeia com um nucleotídeo modificado

Reagentes Necessários => Reação de sequenciamento

• DNA a ser sequenciado

• Primer (aprox. 20nt)

• Nucleotídeos: dATP, dGTP, dTTP e dCTP

• Nucleotídeos modificados: ddATP, ddGTP, ddTTP e ddCTP

• DNA polimerase

SEQUENCIAMENTO DO DNA

Nucleotídeos modificados: ddNT (didesoxirribonucleotídeos)

� Não apresentam OH no Carbono 3’

� Uma vez incorporados = impedem a adição de outro nucletídeo

� Termina o alongamento da cadeia

� São marcados: fluorocromo (emite fluorescência em determinado λλλλ)

SEQUENCIAMENTO DO DNA

Sequenciador de DNA: leitura dos nucleotídeos marcados

• Deposita amostras em placa (96 cavidades)

• Introduz a placa no equipamento

• Amostras correm pelos capilares preenchidos com um polímero

• Amostras migram ao longo dos capilares até atingirem região do laser

• Excita fluorocromo => emite fluorescência no λ correspondente a cada base

• Equipamento traduz e gera um gráfico = Eletroferograma

Fragmentos de diferentes comprimentos gerados a partir doprimer, interrompidos quando um ddNT é incorporado à fita

SEQUENCIAMENTO DO DNA

Os fragmentos migram no capilar (menores na frente)São iluminados por um feixe de laser emitem fluorescênciaquando atravessam a janela do feixe.

SEQUENCIAMENTO DO DNA

Feixe de laser

SEQUENCIAMENTO DO DNA

Eletroferograma

SEQUENCIAMENTO DO DNA

1. Amplificação do gene de interesse

2. Digestão do DNA e do plasmídeo com enzima de restrição

3. Ligação dos produtos de DNA e do vetor plasmídeo

4. Transformação da planta

5. Confirmação da presença do DNA na planta transformada:PCR, Southern Blot

6. Sequenciamento

SOMATÓRIO DE CONHECIMENTO

BIBLIOGRAFIA

1. Brasileiro, Ana Cristina MirandaManual de Transformação Genética de PlantasEMBRAPA SPI/EMBRAPA-CENARGEN, 1998

2. Oliveira, Márcia Cristina de SenaFundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e deamplificação de DNA por meio da técnica de reação em cadeia dapolimerase. EMBRAPA PECUÁRIA SUDESTE, 2007

3. Lima, et. alIdentificação do número de inserções via Southern blot emlinhagens de soja geneticamente modificadas VIII JornadaAcadêmica da Embrapa Soja - EMBRAPA SOJA/LONDRINA