THIS IS YOUR PRESENTATION TITLEStart Arg Pro Ala Stop Sunt codați 20 de aminoacizi prin secvențe...

Malbware

Varujan Pambuccian

Aceasta este o prezentare despre • Biologie sintetică • CRISPR • Malbware

și despre cum poate fi afectat genomul prin editarea genetică

Despre ADN 1

Banca de date europeană de proteine www.ebi.ac.uk/pdbe/

www.celldesigner.org

Site-uri pentru tineri

igem.org

Site-uri recomandate www.addgene.org

www.genome.gov National Human Genome Institute

Structura și organizarea ADN-ului 1.1

Câteva considerații despre ADN/ARN - Suportul

OO-

O

O-

P

C C

C

C

C

O

OO-

O

O

P

C C

C

C

C

O

OO-

O

O

P

C

...

C

C

C

C

O

OO-

O-

O

P Structura de suport a digiților

CO

H

O

H

H

O

C

C

CC

O

Legătură la digit

1'

2'3'

4'5'

Legătura la fosfat

Legătura la fosfat

Atomul de oxigen se

pierde în cazul ADN-

ului fiind înlocuit de

un hidrogen

Câteva considerații despre ADN – Structura dublă antiparalelă

5’

5’

3’

3’

...

OO-

O-

O

P

C

C

C

C

O

OO-

O

O-

P

C

OO-

O

O

P

C

OO-

O

O

P

C

C

C

C

C

O

C

C

C

C

O

...

O O-

O

O-

P

C

O O-

O

O

P

C

O O-

O

O

P

C

C

C

C

C

O

C

C

C

C

O

O O-

O-

O

P

C

C

C

C

O

Câteva considerații despre ADN/ARN - Digiții

N

N

H

N

H2

N

C

CC

C

C

N

Conector

N

N

H

N

NN

H2

O

C

CC

C

C

Conector

HN

N

H

O

O

CC

CC

Conector

HN

N

H

O

O

C

CC

Conector

N

N

H

O

N

H2

H

C

C

C

C

Conector

Adenină (A) Timină (T) Uracil (U)

Citozină (C) Guanină (G)

Câteva considerații despre ADN/ARN – Codarea proteinelor

A doua literă

U C A G

Pri

ma

lite

ră

U

UUU Phe

UCU

Ser

UAU Tyr

UGU Cys

U

A 3

-a li

teră

UUC UCC UAC UGC C

UUA Leu

UCA UAA STOP

UGA STOP A

UUG UCG UAG UGG Trp G

C

CUU

Leu

CCU

Pro

CAU His

CGU

Arg

U

CUC CCC CAC CGC C

CUA CCA CAA Gin

CGA A

CUG CCG CAG CGG G

A

AUU

Ile

ACU

Thr

AAU Asn

AGU Ser

U

AUC ACC AAC AGC C

AUA ACA AAA Lys

AGA Arg

A

AUG START ACG AAG AGG G

G

GUU

Val

GCU

Ala

GAU Asp

GGU

Gly

U

GUC GCC GAC GGC C

GUA GCA GAA Glu

GGA A

GUG GCG GAG GGG G

5’ ATGCGTCCGGCGTAG 3’

3’ TACGCAGGCCGCATC 5’

A T (ADN)

A U (ARN)

G C (ADN și ARN)

ATG CGT CCG GCG TAG (ADN )

TAC GCA GGC CGC ATC (ADN )

AUG CGU CCG GCG UAG (ARN)

Start Arg Pro Ala Stop

Sunt codați 20 de aminoacizi prin secvențe de 3 nucleotide (din 64 de posibilități codate așa)

Organizarea ADN-ului

5' 3'

Codon inițiator Codon terminator

START transcriere

STOP transcriere

Exon (Secvențe care codează

proteine)

Intron (Secvențe care nu codează proteine)

Secvență netranslatată

Secvență translatată

Structura unei gene

Structura ADN-ului uman

Geometria ADN-ului

• ADN-ul este un polimer cu lungimea de circa 2 m și o grosime de 20 Å (0,1 nm)

• Elicea dublă are circa 297 milioane de rotații complete și o rază a elicei de 1 nm

La nivelul genomului uman

1% din ADN codează proteine sau ARN 7% din ADN reglementează expresia genelor care codează proteine sau ARN

92 % din ADN are o utilitate nedescifrată încă

Codare

Expresie

Terra incognita

Mecanisme celulare de intervenție asupra ADN-ului

0.1

Enzime cu rol important în manipularea ADN-ului

Nucleaza este o enzimă capabilă să rupă permanent legăturile de fosfat la nivelul unui acid nucleic

Topoizomeraza derulează structura elicoidală și o face local planară desfăcând pentru un scurt timp și refăcând legăturile fosfatice. Rolul ei constă în detorsionarea structurii elicoidale.

Cas9 este un tip particular de nuclează

Enzime cu rol important în manipularea ADN-ului

Helicaza este o enzimă capabilă să rupă legăturile de hidrogen dintre digiții din ADN

ADN

dTTP

ATP

ATP

ADP

ADP

dTTP

dTTP

dTTP

dTTP

dTTP

Echipamente de laborator și producție

1.3

Echipamente de sinteză ADN/ARN/LNA

1200-3000$ (eBay) ADN only

15000-30000$

Secvențiatoare ADN/ARN

Illumina NovaSeq 6000 – 0.98 M$

Preț/1Gb secvențiat – 7$

CRISPR 2

1987 – Secvențe repetitive descoperite la Escherichia Coli

Yoshizumi Ishino Universitatea din Osaka

5’ 3’

(1452) CGGTTTATCCCCGCTGATGCGGGGAACACCAGCGTCAGGCGTGAAATCTCACCGTCGTTGC (1512)

(1513) GGTTTATCCCTGCTGGCGCGG GGAACTCTCGGTTCAGGCGTTGCAAACCTGGCTACCGGG (1573)

(1574) CGGTTTATCCCCGCTAACGCGGGGAACTCGTAGTCCATCATTCCACCTATGTCTGAACTCC (1634)

(1635) CCGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCG (1664)

CGG TTT ATC CCC GCT GG

AA CGC GGG GAA CTC

C G G T T T A

TCCCCGC

GCGGGGA

A T G C

T G G C

2005 – CRISPR

Gene CAS

Separator Secvență ADN viral

Zona CRISPR

Francisco Mojica Universitatea din Alicante, Spania

Christine Pourcel-Vergnaud Institut de Biologie Intégrative de la Cellule, Paris, Franța

2012 – Mecanismul CRISPR/Cas9

Emmanuelle Charpentier

Jennifer Doudna

Cas 9

5'

5'3'

3'5'

Pro

tosp

ace

r (2

0 n

ucl

eoti

de

)

3'

tracrRNA

crRNA

PAM

Componente moleculare utilizate în CRISPR/Cas9

• protospacer element – o secvență care conține de obicei 20 de nucleotide, complementară secvenței țintă din ADN

• crRNA (CRISPR RNA) – molecula care începe cu cele 20 de nucleotide din protospacer și se încheie cu o secvență complementară secvenței de început din tracrRNA.

• tracrRNA - (transactivating RNA) – hibridizează secvența complementară din crRNA și se leagă la Cas9

3'

5'

Protospacer (20 nucleotide)

crRNA

linker loop

tracrRNA

sgRNA

sgRNA (single guide RNA) = crRNA + linker loop + tracrRNA

Tehnologii anterioare CRISPR

Zinc finger

TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease)

150x mai ieftin 10-15x mai ieftin

în funcție de Cas

Proprietate intelectuală și echipamente

2.1

13 Iunie 2013 - Proprietatea intelectuală

Nu pot fi brevetate secvențele care se găsesc în natură Pot fi brevetate secvențele sintetice

2015 - CRISPR/Cpf1 – o problemă de brevetare

Jennifer Doudna, University of

California Berkeley

Feng Zhang, Broad Institute,

Cambridge, Massachusetts

Materiale și costuri

Material Producător Costuri

Fragment de ARN Laborator specializat 10-50$

Substanțe chimice și enzime On the shelf 30-40$

Kituri ieftine

75$ 1850$

Un instrument care dezvoltă rapid baza de cunoștințe

Aplicații ale CRISPR 2.2

Aplicații în medicina umană .2.1

Aplicații CRISPR – Tratarea cancerului prin reprogramarea celulelor T

Lu You, Universitatea Sichuan Proiect derulat între August 2015 și Aprilie 2018

Editas medicine

• Amauroza congenitală Leber o Cauza cea mai frecventă pentru orbirea infantilă o Este produsă de o mutație a genei CEP290 o Editas a primit aprobare pentru teste clinice pe oameni constând

în repararea genei CEP290 utilizând o tehnologie CRISPR/Cas9

Feng Zhang, Editas

• Deține 20 de brevete în domeniul CRISPR • Dificultăți în atribuirea patentului pentru tehnologia

cheie utilizată (CRISPR/Cpf1), obținut în favoarea Broad Institute of Harvard and MIT in 2014, contestat de Jennifer Doudna, University of California, Berkeley

CRISPR Therapeutics

Emmanuelle

Charpentier

Câteva aplicații în domenii nemedicale

2.2.2

În agricultură

Tomate care ajung la maturitate cu două săptămâni mai devreme

În horticultură

University of Tsukuba, Yokohama City University, și National Agriculture and Food Research Organization

Se pot crea noi specii

Fluture alterat prin CRISPR

Porci pitici ca animale de companie (de talia unui câine mediu) - China

Biohacking – 140$ kit CRISPR

Josiah Zayner - 2016

Malbware 3

Cum poate fi adusă o specie în extincție

Din ce rezidă pericolele potențiale pentru om?

1. Tehnologia permite personalizarea precisă a țintei selectând secvențe precise din ADN care să servească pentru ghidare

2. Tehnologia permite o ajustare scalabilă adresând secvențe ADN care pot caracteriza o singură persoană, o familie, un haplogrup sau o rasă.

3. Poate utiliza vectori invizibili, de regulă vectori de tip viral care se pot răspândi epidemic

4. Poate utiliza și vectori macroscopici de la insecte la vectori alimentari.

Mulțumesc!

varujanpamb@yahoo.com