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TRATTAMENTO E CONSERVAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE
PER TECNICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA
Lab. Di Biologia della RiproduzioneResp.: Angela Ferri
Laboratorio Biologia della RiproduzioneLaboratorio Biologia della Riproduzione
OSPEDALE SAN CARLOAzienda Ospedaliera Regionale-PotenzaDIP. MATERNO INFANTILEDir.: Dott. Sergio Schettini
SPERMIOGRAMMA
PatologicoNormaleRipetere
Per conferma
RipetereVariabili
Laboratorio Patologico
Variazioni Individuali Anamnesi
Esame obiettivo
Alterazione delLiquido seminale
Azoospermia Dispermia Aspermia
RipetereAlmeno 3 controlli
(Ricerca spermatozoinel sedimento)
Oligo – Asteno – Teratospermia
SpermatozoiNelle urine
si no
Eiaculazioneretrograda
Aneiaculazione
•Permette la valutazione della qualità del seme
•Esame cardine per una corretta diagnostica in
campo seminologico
•Decisivo per l’iter terapeutico della coppia infertile
TESE TESA
SPERMIOGRAMMA
Caratteri Macroscopici
Zone di Spermioagglutinazione
Cellule Germinali
Motilità
ContaNemaspermica
Morfologia
Cellule diSfaldamento
Leucociti
Volume
pH
Viscosità
Aspetto
Fluidificazione
Concentrazione/ml
4 ore
2 ore
Cocentrazione/eiaculato
Forme Normali
Forme Anomale
SPERMIOGRAMMA
VALORI DI RIFERIMENTO
WHO 2000
Leucociti 1×106/ml
pH7.5 – 8.0
Concentrazione 20×106/ml
Volume 2.0 ml
Morfologia* (WHO)
14%(Kruger)
Numero totale diSpermatozoi 20×106/ml
Motilità50%(a+b)
CONDIZIONIPATOLOGICHE
OligozoospermiaConcentrazione
<20×106/ml
AstenozoospermiaMotilità
< 50%(a+b)< 25%(progr.lin.)
TeratozoospermiaMorfologia
<30% forme norm.
SPERMIOGRAMMA
Analisi quantitative Biochimiche
Swelling test
Mar testIBT test
Studio dellaFrammentazione
Eosin test
Indagini Genetiche(Cariotipo,
Delezioni cromosoma Y)
Indagini ormonali(LH,FSH)
PREPARAZIONE DEL LIQUIDOSEMINALE
Razionale:Il liquido seminale deve essere trattato allo scopo di indurre “ in vitro” la capacitazione; solo gli spermatozoi attivati (reazione acrosomiale) saranno in grado di fecondare gli ovociti maturi.
La scelta del metodo deve basarsi sulle caratteristiche del campione:Eliminazione del plasma seminale ed incrementare le forme
dotate di migliore motilità e morfologia;Concentrazione di spermatozoi mobili;Volume;Presenza di elementi e detriti cellulari,agglutinazioni;La scelta della tecnica da utilizzare deve essere:
La meno traumatica per la cellula nemaspermica,La più idonea per il tipo di situazione seminale da affrontare,Selezionare gli spermatozoi con buona motilità aumentandone la
cinetica e conservandola nel tempo,Selezionare gli spermatozoi adatti a fecondare e con un corretto
assetto cromosomico aploide
…..e tener conto della caratteristiche del campione
METODICHE DI PREPARAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE
SWIM – UP(sfrutta la capacità degli
spermatozoi di migrare nel mezzo di coltura)
STANDARD
Da PELLET
Indicate perparametri seminali
normali
GRADIENTI DI DIVERSE DENSITA’(separazione differenziata
per centrifugazione/sedimentazione)
Indicato per alterazioni dei parametri seminaliMEDIO/SEVERE
SPERM WASHING(semplici migrazione degli spermatozooi)
Indicato per alterazioni dei parametri seminali
SEVERE
METODICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA
TECNICHETECNICHE
I° LIVELLO
II°/III° LIVELLO
IUI
GIFT
ICSI
FIVET
La conoscenza degli eventi legati alla capacitazione ed alla fecondazione
Tecniche di preparazione per la PMA
ICSI (TeSE)
E’ consigliata nei casi di:- Infertilità maschile di grado severo;- Azoospermia ostruttiva e secretiva
(spermatozoi testicolari o epididimari);
- Mancata o ridotta fertilizzazione in precedenti cicli di fertilizzazione in vitro (FIV);
- Ovociti scongelati;- Ridotto numero di ovociti;- Seme crioconservato in relazione
alla qualità seminale successiva allo scongelamento.
E’ consigliata nei casi di:- Fattore tubo-peritoneale:
patologia tubarica acquisita o congenita;
- Infertilità maschile di grado moderato;
- Endometriosi di III o IV grado;- Infertilità inspiegata se il
trattamento precedente(IUI) non ha dato risultati;
- Seme crioconservato ;- Fallimento dell’iter
terapeutico di tecniche di I livello
IN QUALI CASI VENGONO CONSIGLIATE LE VARIETECNICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA
FIVET ICSIVS
FIVET
La La FIVETFIVET consiste nel far consiste nel far entrare in contatto in entrare in contatto in laboratorio (in vitro) i laboratorio (in vitro) i gametigameti femminili (femminili (ovocitiovociti) e i gameti ) e i gameti maschili (maschili (spermatozoispermatozoi) ) eiaculatieiaculati
FertilizzazioneInVitroEmbryoTransfer
ICSIICSI
• Intra
• Cytoplasmatic
• Sperm
• Injection
ovocita Singolo spermatozoo
La ICSI comporta l’iniezione La ICSI comporta l’iniezione
diretta di un singolo diretta di un singolo
spermatozoo all’interno del spermatozoo all’interno del
citoplasma ovocitario.citoplasma ovocitario.
TECNICHE DI PREPARAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE DOPO Te.S.E.
Recupero del frammento testicolare;Dissezione con 2 vetrini sterili;Verifica al microscopio;Centrifugazione;Coltura degli spermatozoi in terreno
tamponato;Eventuale congelamento (non
concomitanza pick-up);
CRITERI DI SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI
La motilità dello spermatozoo è un indicatore di vitalità Se non vi sono spermatozoi mobili: Swelling Test con utilizzo degli stessi per Icsi
Uso della Pentoxifillina:riconoscimento degli spermatozoi vitali tra quelli immobili inducendone la motilità. La qualità dello spermatozoo microiniettato è determinante nei processi di fertilizzazione e divisione embrionaria cosi come nella trasmissione di eventuali anomalie genetiche o cromosomiche. Solo gli spermatozoi che hanno completato la maturazione cellulare (citoplasmatica e nucleare) sono in grado di legarsi al terreno di coltura a base di ACIDO IALURONICO (HA). Una goccia di liquido seminale (1-2ul), concentrato secondo l’abituale protocollo di laboratorio, viene deposta in modo da toccare la goccia di HA.
PVP
Terreno tamponato per alloggiare gli ovociti
Terreno tamponato + pentoxifillina
spermatozoi migrati sul bordo della goccia
METODO CON PENTOXIFILLINA
Sperm slow
Zona d’intersezione
spermatozoi
Terreno contenenti ovociti
METODO CON ACIDO IALURONICO
L’Acido Ialuronico (HA) ricopre un ruolo fondamentale nella selezione degli spermatozoi .Gli spermatozoi maturi posseggono una glicoproteina di membrana,detta PH20, che svolge un ruolo bifunzionale: prima della reazione acrosomiale presenta attività ialuronidasica consentendo l’attraversamento delle cellule del cumulo, dopo la reazione acrosomiale interviene nel legame secondariotra lo spematozoo e la zona pellucida.
CRITERI DI SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI
Un metodo alternativo per selezionare gli spermatozoi per la ICSI è rappresentato dalla valutazione della morfologia spermatica ad altissimo ingrandimento (IMSI). Mediante sistemi di amplificazione d’immagine digitali in combinazione con specifici obiettivi (6600x), è possibile osservare gli spermatozoi ad alto ingrandimento permettendo così di esaminare la morfologia degli organelli spermatici(acrosoma,nucleo,mitocondri, cappuccio,coda….); Motile Sperm Organellar Morphology Examination (MSOME).
CRITERI DI SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI
• Uno spermatozoo mancante di solo uno di questi organelli viene escluso dalla inseminazione.
• La normale morfologia dell’intera cellula spermatica è stata correlata positivamente con i tassi di fertilizzazione e di gravidanza rispetto all’ICSI tradizionale.(B.Bartow et al.2003)
• La microiniezione di spermatozoi vacuolizzati sembra ridurre il tasso di gravidanza ed è associato ad aborti precoci.
• Indicazioni all’IMSI: ripetuti fallimenti di ICSI convenzionale
LA CRIOCONSERVAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE
Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme:
La crioconservazione di liquido seminale rappresenta una valida tecnica alternativa di autoconservazione( previo congelamento in azoto liquido a -196 C°) le cui finalità sono rivolte a:
Prevenire la sterilità
Eseguire una Fecondazione
assistita
E’ possibile crioconservare
Liquido Seminale
Prelievo bioptici testicolari
Spermatozoi da prelievo epididimario
Programma
Gestione pazienti
Gestione interna
Pz che accedono alla Banca del Seme
Analisi da effettuare pre-criocons.
Consensi informati per la gestione del paziente e del seme crioconservato
Tempo di durata del deposito del seme
Materiali e metodi
FASE PRE-CONGELAMENTOFASE PRE-CONGELAMENTO
Esecuzione dello spermiogramma per la valutazione delle Esecuzione dello spermiogramma per la valutazione delle
caratteristiche del seme (numero, morfologia, motilità e vitalità) caratteristiche del seme (numero, morfologia, motilità e vitalità) Il paziente deve sottoporsi ad alcuni esami sierologici per evidenziare Il paziente deve sottoporsi ad alcuni esami sierologici per evidenziare
l’eventuale presenza di patologie infettive in atto (HBV, HCV, HIV, l’eventuale presenza di patologie infettive in atto (HBV, HCV, HIV,
VDRL). VDRL).
Medium di coltura Medium di coltura sperm freezing sperm freezing (glicerolo)(glicerolo)
Cryovials o vials da Cryovials o vials da 1,8 ml idonei al 1,8 ml idonei al congelamentocongelamento
Provette steriliProvette sterili Guanti criogeniciGuanti criogenici Occhiali di Occhiali di
protezioneprotezione
Cappa a flusso laminareCappa a flusso laminare CentrifugaCentrifuga Cane (stecche portafiale Cane (stecche portafiale
in alluminio)in alluminio) Tank o criobanca Tank o criobanca
(contenitore criobiologico (contenitore criobiologico in alluminio, che viene in alluminio, che viene costantemente alimentato costantemente alimentato ad Azoto Liquido)ad Azoto Liquido)
STRUMENTISTRUMENTI
Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme
Tipologia pazienti
Pz affetti da patologie che necessitano di terapie inducenti danni alla spermatogenesi (patologie neoplastiche, autoimmuni, ecc.)
Pz affetti da patologie che necessitano di interventi chirurgici all’apparato uro-genitale che possono ledere la funzione eiaculatoriaSoggetti che si sottopongono a vasectomia
Soggetti che per motivi di lavoro sono esposti a sostanze potenzialmente genotossiche.Pz con OAT che presentano transitori miglioramenti della qualità del semePz che mostrano un severo e progressivo peggioramento della qualità del seme
Pz criptozoospermici
Pz che hanno difficoltà a raccogliere il liquido seminale il giorno del prelievo ovocitario (difficoltà psicologiche o logistiche)
Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme
GESTIONE DEL
PAZIENTERequisiti
Età
Terapie
Raccolta
Astinenza
Analisi
Accertamento d’identità
Terapia antiblastica e radioterapia induttori di
danno genotossico
Crioconservazione
PrimaDopo due anni
dalla fine
Nel caso di utilizzo di farmaci che non agiscono
sul ciclo cellulare
Crioconservazione
Dopo tre mesi dalla Fine del trattamento
GESTIONE DEL
PAZIENTE
Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme
MarkersInfettivologici
Epatite B
Epatite C
Citomegalovirus
HIV
HBsAg (Antigene Australia)
HBsAb (Anticorpi anti HBs)
Anticorpi anti – HCV
HCV-RNA Qualitativo (nel caso di anticorpi
positivi)
Anticorpi anti IgG
Anticorpi anti IgM
Anticorpi anti - HIV
No crioconservazione
di liquido seminale o di tessuto testicolare in assenza di markers infettivologici
per pazienti infettivi se la banca non è attrezzata con
percorsi e contenitori dedicati ad ogni singolo virus
Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme
GESTIONE DEL
PAZIENTE
CONSENSI INFORMATI
E’ necessario un consenso per ogni campione seminale crioconservato
Per il rinnovo della crioconservazione
Per l’eliminazione del campione
Per il ritiroDi una o
più paillettes
Di tutto ilcampione
CONCLUSIONI
LIQUIDOSEMINALE
Diagniostica(relazionata
studio partner)Valutazione
Applicazione di Tecniche Selettive
In base alla Tecnica
IUI
ICSI
FIVET
Eventuale Crioconservazione
Gradienti
Swim - up
Lavaggio
HA
Pentoxifillina
IMSI
LA LEGGE 40/2004 DEL CODICE CIVILE ITALIANO IMPONE CHE NON PIU’ DI TRE OVOCITI POSSONO ESSERE FECONDATI AL FINE DI OTTENERE UN NUMERO MASSIMO DI TRE EMBRIONI, IN RELAZIONE A QUESTA CONDIZIONE E’ IMPORTANTISSIMA LA SELEZIONE DEGLI UNICI TRE OVOCITI E LA SELEZIONE DEI MIGLIORI SPERMATOZOI.
VALUTAZIONE CLINICA DI ALCUNE CONDIZIONI SPECIFICHE ALLA LUCE DELLA SENTENZA DELLA CORTE COSTITUZIONALE DEL I° APRILE 2009
(sent. n°151 pubblicato su GURI del 13 maggio 2009)
ORA
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