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44 T2 MgCl2 To
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XC AT XC T MgCl2 To
Una nueva variante de Xanthomonas citri subsp. citri reduce el desarrollo del cancro cítrico
Roxana A. Roeschlin1; María Amalia Chiesa1; María Alejandra Favaro1; María Paula Filippone2; Atilio Castagnaro2; Frederick G. Gmitter Jr.3; José
Gadea Vacas4; María Rosa Marano1. 1 Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR. 2 Instituto de Tecnología Agroindustrial del Noroeste
Argentino (ITA-NOA); (EEAOC)-CONICET. 3 Universidad de Florida (IFAS), Citrus Research and Education Center Lake Alfred - U.S.A. 4 Instituto de Biología Molecular y Celular de
Plantas (IBMCP), Universidad Politécnica de Valencia - España
UV Visible
XC
T
XC
AT
Mg
Cl 2
E
E
Azúl de tripán
MC
Síntomas desarrollados a los 16 días post
inoculación (dpi) en la cara abaxial de hojas
de limonero inoculadas con XC AT y XC T
(cepa de referencia) transformadas con GFP
(proteína verde fluorescente) utilizando dos
metodologías de infección: A, infiltración (107
ufc/ml) y B, hisopado (109 ufc/ml). Los
síntomas fueron observados con lupa bajo luz
visible y UV (Escala, 10mm).
C. Muerte celular en hojas de limonero
inoculadas por hisopado. 48 hpi, hojas de
limonero fueron teñidas con azul de tripán y
observadas microscópicamente. Escala,
150µm; MC, muerte celular; E, estoma.
Sintomatología desarrollada durante la interacción XC AT-limonero
A. C.
UV Visible
B.
XC
AT
X
C T
5 hpi 24 hpi
XZ
XY
XZ
XY
A. Movimiento estomático en la superficie
abaxial de hojas de limonero. Luego de 1 y 4
hpi, impresiones del tejido epidémico se
observaron microscópicamente. Los datos
marcados con diferentes letras son
significativamente diferentes (p < 0.05).
B. Adherencia bacteriana en la superficie
abaxial de hojas de limonero utilizando cristal
violeta a 5 y 24 hpi. Las células teñidas
adheridas a la superficie de la hoja fueron
analizadas microscópicamente.
C. Formación de biofilm observada por
microscopía laser confocal a los 6 dpi. La
fluorescencia en rojo representa la
autofluorescencia de la clorofila; la fluorescencia
en verde corresponde a las bacterias
tranformadas con GFP. XY y XZ son las
imágenes proyectadas de los ejes XY y XZ.
Escala, 50 μm; E, estoma.
6 dpi
Caracterización biológica de la interacción XC AT-limonero
0
0.5
1
1.5
2
2.5
1 hora 4 horas
XCATXCTABAMgCl2
a a a
b
a
b b
b
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
1 hora 4 horas
XC AT
XC T
ABA
MgCl2
0
0.5
1
1.5
2
2.5
1 hora 4 horas
XCATXCTABAMgCl2
a
b
a
c
ab
c
c c
Ap
ert
ura
esto
má
tic
a (
µm
)
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
1 hora 4 horas
Infiltración (107 UFC/mL) Hisopado (109 UFC/mL)
0.0
A.
B. C.
XC
AT-G
FP
X
C T
-GF
P
E
E E
E
E
E
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0
500
1000
1500
2000
2500
3000 3000
2500
2000
1500
1000
500
3000
2500
2000
1500
1000
500
XC AT XC T XC AT XC T
Infiltración (107 UFC/mL) Hisopado (109 UFC/mL)
Nro
. d
e g
en
es
(≥ 2
fo
ld;
p≤0.0
5)
Reprimidos
anotados
Reprimidos
no anotados
Inducidos
anotados
Inducidos no
anotados
Perfil transcriptómico de Citrus limon en respuesta a XC AT y XC T
Análisis de la respuesta transcriptómica a
Xanthomonas citri en hojas de limonero utilizando
microarreglos de Citrus (Agilent). Expresión
diferencial de genes evaluados a las 48 hpi en
hojas de limonero inoculadas con XC AT y XC T
comparadas con una muestra de referencia (To)
utilizando: A. hisopado; B. infiltración. Las barras y
los números coloreados en verde y rojo
representan los genes inducidos y reprimidos,
respectivamente. Las barras más oscuras
representan los genes de Citrus que poseen un
ortólogo en Arabidopsis. 994 461 251
198 618 838 693
884 516 253
1845 2047
Diagramas
de Venn
A. B.
Procesos biológicos- Infiltración XC AT
(FDR)
XC T
(FDR)
Metabolismo de lignina 1.10E-07 n.s.
Deposición de calosa en la pared celular 1.54E-02 n.s.
Procesos apoptóticos 2.81E-02 n.s.
Metabolismo de especies reactivas del
oxígeno 4.70E-02 n.s.
Señalización mediada por etileno n.s. 1.52E-03
Respuesta de defensa a bacterias 8.66E-09 5.69E-08
Respuesta inmune 2.50E-08 1.52E-03
Respuesta a ácido salicílico 6.46E-06 6.61E-06
Respuesta a ácido abscísico 3.02E-04 3.06E-05
Respuesta a ácido jasmónico 7.17E-04 2.88E-04
Respuesta a auxina 1.04E-05 n.s.
Procesos apoptóticos n.s. 1.30E-03
Señalización mediada por receptores
tirosin-kinasa 6.85E-04 1.10E-02
Procesos biológicos – Hisopado XC AT
(FDR)
XC T
(FDR)
Biosíntesis de flavonoides 3.62E-04 n.s.
Respuesta a ácido salicílico 2.47E-03 n.s.
Respuesta a ácido jasmónico 1.03E-02 n.s.
Metabolismo de glucosinolatos 1.60E-02 n.s.
Catabolismo de peróxido de hidrógeno n.s. 1.81E-04
Modificación de la pared celular n.s. 1.40E-02
Desenrrollamiento del ADN n.s. 2.84E-02
Respuesta a bacterias 1.60E-08 7.47E-07
Metabolismo de lignina 2.62E-03 n.s.
Respuesta a auxina 9.19E-03 n.s.
Señalización mediada por receptores de
superficie n.s. 2.94E-06
Respuesta inmune n.s. 3.19E-02
Señalización mediada por ácido abscísico n.s. 3.66E-02
Muerte celular 2.25E-05 9.80E-04
Categorización funcional de los transcriptos involucrados en estrés biótico
Análisis bioinformático utilizando el programa FatiGO (www.babelomics.bioinfo.cipf.es) y ortólogos de Arabidopsis. FDR:
False Discovery Rate. n.s.: no significativo. Los recuadros en verde y rojo representan genes inducidos y reprimidos.
0
0.5
1
1.5
2
44 T2 MgCl2
0
1
2
3
4
5
44 T2 MgCl2 0
0.5
1
1.5
2
2.5
XCAT XCT MgCl2
0
0.5
1
1.5
2
2.5
XCAT XCT MgCl2
XC
AT
X
C T
Visible UV
0.5
1.0
2.0
2.5
2.5
0.0
XCAT XCT XCAT XCT
Flavonoides Antocianinas
* *
XCAT XCT MgCl2
0.5
1.0
1.5
0.0
2.0
*
Expresión chs
1.0
2.0
3.0
0.0
4.0
Expresión pal1 5.0
*
MgCl2
0.5
1.0
2.0
1.5
2.5
0.0
MgCl2 XCAT XCT MgCl2
** ** ** **
**
**
*** **
Análisis transcriptómico y metabolómico de la interacción XC AT-limonero
A. Imágenes microscópicas del tejido vegetal y autofluorescencia de compuestos fenólicos en hojas inoculadas por hisopado.
La flecha indica la fluorescencia debida a compuestos fenólicos. B. qRT-PCR de pal1 y chs relativos a histona. La expresión
fue comparada con To (muestra de referencia). C. Determinación del contenido fenólico en hojas de limonero. La medidas de
absorbancia de los flavonoides se realizó a 310nm, mientras que el nivel de antocianinas se evaluó a través de: Abs
anthocyanins= Abs(530) - (0,25 Abs(657)). Los datos marcados con diferentes asteriscos son significativamente diferentes (p < 0.05).
A. B. C.
0
50
100
150
44 1 T2 1 Mg1
50
0
100
Expresión pr1 150
*
XCAT XCT MgCl2
**
** 0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
44 1 T2 1 Mg 1
Expresión wrky70
0.5
1.0
1.5
0.0
2.0
2.5
3.0 *
XCAT XCT MgCl2 0
XCAT XCT MgCl2 To
SA (pmol g-1 PS)
10000
20000
30000
40000
XCAT XCT MgCl2
JA (pmol g-1 PS)
2000
4000
6000
8000
0
*
** **
***
*
** **
To
A. qRT-PCR de wrky70 y pr1 relativos a histona. La expresión fue comparada con To (muestra de referencia). B.
Cuantificación de las hormonas ácido salicílico y jasmónico en hojas de limonero mediante LC-MS. PS: peso seco. Los datos
marcados con diferentes asteriscos son significativamente diferentes (p < 0.05).
XC AT
XC T
XC AT
XC T
0
60
120
180
240
XC T
+
XC AT
XC T
N° de cancros/cm2
A. B.
La respuesta inmune de XC AT disminuye la formación de cancros
A. Observación de la disminución de los
cancros en hojas de limonero co-
infiltradas con XC AT. Síntomas
observados con lupa bajo luz UV.
B. Cuantificación del número de cancros
en hojas de limonero inoculadas por
infiltración (XC AT: 107 UFC/ml; XC T: 103
UFC/ml)
*
Conclusiones:
XC AT induce una respuesta tipo hipersensible en limonero caracterizada por la acumulación de metabolitos secundarios como flavonoides y antocianinas junto con el incremento de ácido salicílico. Esta respuesta inmune es
capaz de disminuir el desarrollo del cancro cítrico en hojas de limonero y controlar el desarrollo de la enfermedad.
Comprender los mecanismos genéticos y moleculares de la defensa inducida por XC AT permitirá desarrollar estrategias biotecnológicas para el manejo de la cancrosis bacteriana de los cítricos.
Agradecimientos: * Préstamo BID PICT 2011 N° 1833. * Citrus Research and Education Center, University of Florida (Contrato UF1150 y UF13089).
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