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Aus der Klinik für Unfall- und Handchirurgie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Direktor: Univ.- Prof. Dr. med. J. Windolf
Untersuchungen zum Einfluss des Leukozyten-Inhibitions-Moduls auf die posthämorrhagische Inflammation und Gewebehypoxie im Tiermodell
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin Der Medizinischen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
vorgelegt von Alberto Felipe Schek
Düsseldorf 2010
Als Inauguraldissertation gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
gez: Univ.-Prof. Dr. med. Joachim Windolf Dekan
Referent: Univ.-Prof. Dr. med. Joachim Windolf Koreferent: Prof. Dr. med. Detlef Kindgen-Milles
Für meinen Onkel Pablo Ferrer
† 03.05.2008
Nunca olvidaré tu hermosa manera de ser.
Inhalt
IV I
Inhaltsverzeichnis IV
Abkürzungsverzeichnis VI
1. Einleitung 1
1.1 Der hämorrhagische Schock 2
1.1.1 Definition 2
1.1.2 Pathogenese 2
1.1.3 Pathophysiologie 2
1.1.4 Ischämie/Reperfusionssyndrom 4
1.1.5 Rolle der neutrophilen Granulozyten 6
1.1.6 SIRS, MODS, MOV 8
1.1.7 Bedeutung der Hypoxie im Schock 9
1.1.7.1 Lipidperoxidation 9
1.1.7.2 Häm und HO-1 11
1.1.7.3 Der Hypoxie-induzierbare Faktor 1α (HIF-1α) 14
1.2 Das Leukozyten-Inhibitions-Modul (LIM) 17
1.2.1 Definition 17
1.2.2 Makroskopischer Aufbau 18
1.2.3 Mikroskopischer Aufbau 18
1.2.4 Funktionsprinzipien 19
2. Ziele der Arbeit 20
2.1 Aufbau und Etablierung eines hämorrhagischen Schockmodells im
Schwein als Voraussetzung für die Überprüfung der posthämorrha-
gischen Immunantwort 20
2.2 Überprüfung der posthämorrhagischen Immunantwort anhand
inflammatorisch/hypoxischer Parameter 20
2.3 Testung der LIM-Effektivität und Unbedenklichkeit 20
3. Material und Methoden 21
3.1 Material 22
3.1.1 Versuchstiere 22
3.1.2 Zugänge/Katheter 22
3.1.3 Medikamente/Infusionen 22
3.1.4 Geräte/Software 22
3.1.5 Chemikalien 23
3.1.6 Primer/Antikörper 25
3.2 Methoden 26
3.2.1 Experimentelles Modell 26
3.2.1.1 Die Versuchstiere 26
3.2.1.2 Vorbehandlung und Anästhesie 26
3.2.1.3 Katheteranlage 26
3.2.1.3.1 Blasenkatheter 27
3.2.1.3.2 Arterieller Katheter 27
3.2.1.3.3 Sheldon-Katheter 27
3.2.1.3.4 Swan-Ganz Katheter 27
Inhalt
V I V
3.2.1.4 Versuchsablauf 28
3.2.1.5 Organentnahme und Histologie 29
3.2.1.6 Prädefinierte Blutabnahmen 29
3.3 Untersuchungsmethoden 30
3.3.1 Hämodynamik 30
3.3.1.1 Mittlerer arterieller Druck (MAP) 31
3.3.1.2 Herzfrequenz (HF) 32
3.3.1.3 Herzzeitvolumen (HZV) 33
3.3.1.4 Gemischtvenöse Sauerstoffsättigung (SvO2) 34
3.3.2 Laboranalysen 34
3.3.2.1 Leukozytenzahl 35
3.3.3 Proteinisolierung und –Bestimmung 36
3.3.4 RNA-Isolierung 36
3.3.5 Polymerase-Kettenreaktion 38
3.3.6 Western Blot 38
3.3.7 TBARS-Assay 39
3.3.8 Histologie 40
3.3.9 Statistik 41
4. Ergebnisse 42
4.1 Hypoxieanalysen im Gewebe 42
4.1.1 Hypoxie-Induzierter Faktor 1α (HIF-1α) 42
4.1.1.1 Gen- und Proteinexpression nach 48 Stunden 42
4.1.1.2 Gen- und Proteinexpression nach 72 Stunden 44
4.1.2 Hämoxygenase-1 (HO-1) 45
4.1.2.1 Gen- und Proteinexpression nach 48 Stunden 45
4.1.2.2 Gen- und Proteinexpression nach 72 Stunden 47
4.1.3 Lipidperoxidation (Malondialdehyd-Assay) 49
5. Diskussion 52
5.1 Das Fas/FasL-System als Zielobjekt bei hämorrhagischem
Schock/Reperfusion 53
5.2 Einstellung und Etablierung eines hämorrhagischen Schockmodells
im Schwein 54
5.3 Überprüfung der posthämorrhagischen Immunantwort anhand
inflammatorisch/hypoxischer Parameter 55
5.4 Testung der LIM-Effektivität und Unbedenklichkeit 57
6. Zusammenfassung 61
7. Referenzen 62
8. Danksagung 73
Abkürzungsverzeichnis
VI I V
Abkürzungsverzeichnis
+LIM LIM-Gruppe
µM Mikromolar ACCP American College of Chest Physicians ADH Antidiuretisches Hormon AhR Aryl hydrocarbon receptor AMP Adenosinmonophosphat ATP Adenosintriphosphat bHLH Basisches Helix-Loop-Helix-Protein bpm Beats per minute/Schläge pro Minute BV Biliverdin C3a Complement 3a C5a Complement 5a C5b-9 Complement 5b-9 Ca
2+ Calcium Ion
CD95 Cluster of differentiation 95
CD95L Cluster of differentiation 95-Ligand cDNA Complementäre-Desoxyribonukleinsäure cGMP Cyklisches Guanosinmonophosphat CHE Chloresterase CK Creatinkinase CK-MB Creatinkinase-MuscleBrain/Myokardspezifische Creatinkinase CLOCK Circadian locomoter output cycles kaput protein CO Kohlenmonoxid CO2 Kohlendioxid COOH Carboxylgruppe CYCLE Cyklisches Protein DEPC Diethylpyrocarbonat DREs Dioxin response elements EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EIT Extrakorporales Immuntherapeutikum EPAS-1 Endotheliales PAS-Protein 1 EPO Erythropoetin FasL Fas Ligand Fe²
+ Eisen Ion
FePP-IX Eisen-Protoporphyrin-IX, Ferroprotoporphyrin-IX GAPDH Glicerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase G-CSF Granulozyten-Kolonienstimulierender Faktor GM-CSF Granulozyten-Monozyten- Kolonienstimulierender Faktor GOT Glutamat-Oxalacetat Transaminase GPT Glutamat-Pyruvat Transaminase H2O Wasser H2O2 Wasserstoffperoxid HE Hämatoxylin-Eosin HF Herzfrequenz HIF Hypoxie-induzierter Faktor HLF/HRF HIF-like factor/HIF-related factor HO Hämoxygenase HPF High power fields HPLC High Pressure/Performance Liquid Chromatography HRE Hypoxie-responsive Elemente HZV Herzzeitvolumen IAPs Inhibitor of Apoptosis Proteins ID Inhibitorische Domäne Ig Immunglobuline IL Interleukin kDa KiloDalton KG Kontrollgruppe kg Kilogramm Krea Kreatinin
Abkürzungsverzeichnis
VII I V
Lac Lactat LIM Leukozyten Inhibitions Modul MAP Mean arterial pressure MCL Myeloid Cell Leukaemia MDA Malondialdehyd Mg Magnesium MODS Multiorgandysfunktionssyndrom MOV Multiorganversagen MPAP Mittlerer pulmono-arterieller Druck NaCl Natriumchlorid NADP Nicotinamidadenindinukleotidphosphat NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat in reduzierter Form NH Nitrogenhydrid nLIM nonLIM-Gruppe
NLS Nukleäre Lokalisationssequenz NO Stickstoffmonoxid NOS Stickstoffmonoxid-Synthase NP40 Nonyl phenoxylpolyethoxylethanol O2 Sauerstoff OD Optische Dichte ODD Oxygen dependent degradation domain OH
- Hydroxylradikal
PaCO2 Arterieller Kohlendioxid-Druck PaO2 Arterieller Sauerstoff-Druck
PAS PER-period clock protein, ARNT-aromatic hydrocarbon receptor nuclear translocator, SIM-single minded Protein
PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase-Kettenreaktion PCWP Pulmonocapillary Wedge Pressure/Pulmonokapillärer Verschlussdruck PHDs Prolyl-4-Hydroxylasen PMN Polymorphonukleäre Zellen Pro Prolin pVHL von Hippel-Lindau-Protein RNA Ribonukleinsäure RR Riva Rocci: Blutdruck SCCM Society of Critical Care Medicine SDS Sodium dodecyl sulfate SIRS Systemic inflammatory response syndrome SMC Standard medical care SOC Standard of care SvO2 Venöse Sauerstoffsättigung TAD Transaktivierungsdomänen Taq Thermus aquaticus TBA Thiobarbituric acid/Thiobarbitursäure TBARS Thiobarbituric acid reaktive Substanzen TBS Tromethamin buffered saline TNF-α Tumor-Nekrosefaktor alpha TropT Troponin-T UPM Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett-Strahlung VEGF Vascular endothelial growth factor/Vaskulär-endothelialer Wachstumsfaktor XOx Xanthinoxidase ZNS Zentrales Nervensystem ZVD Zentralvenöser Druck
1 Einleitung
1
1. Einleitung
Der hämorrhagische Schock ist trotz der ständigen medizinischen Fortschritte eine
der führenden Komplikationen und Todesursachen nach Unfällen (Moore, McKinley
et al. 2004). Hauptkomplikation nach hämorrhagischem Schock ist das Auftreten
einer Ganzkörperentzündungsreaktion (Systemic Inflammatory Response Syndrome;
SIRS), eines Multiorgandysfunktionssyndrom (MODS) (Bone, Sibbald et al. 1992)
sowie eines Multiorganversagens (MOV) (Eiseman, Beart et al. 1977; Baue, Durham
et al. 1998). Die Pathophysiologie des hämorrhagischen Schocks ist derzeit immer
noch nicht ausreichend erklärt. Die aktivierten neutrophilen Granulozyten, so
genannte „Polymorphkernige Neutrophile (PMN)“, spielen eine wesentliche Rolle bei
der Entstehung eines SIRS mit nachfolgendem MODS. Dies geschieht anfänglich
durch die Freisetzung zahlreicher Mediatoren, wie z.B. Tumor-Nekrosefaktor-
(TNF- ), Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-6 (IL-6) und Interleukin-8 (IL-8) (Rüter A.
2004). Diese inflammatorischen Reaktionen spielen sich hauptsächlich in Lunge,
Leber und Herz ab (Lomas, Chung et al. 2003) (McCloskey, Kameneva et al. 2004)
(Sato, Tanaka et al. 2007) (Toda, Takahashi et al. 2007) (Zakaria el, Campbell et al.
2007). Im Rahmen der vorliegenden Forschungsarbeit wird der Einfluss von
neutrophilen Granulozyten auf Organebene im hämorrhagischen Schock untersucht
und deren Inaktivierung anhand von membrangebundenen anti-Fas-Antikörper (anti-
CD95) in einem extrakorporalen Kreislauf. Das Ziel ist somit eine Eindämmung der
Schockfolgen zu erreichen. Vorherige Studien haben die Vorteile gezeigt, die die
schnelle Inaktivierung von neutrophilen Granulozyten mit sich bringt (Abdel-Rahman,
Margraf et al. 2007) (Scholz and Cinatl 2005) (Scholz, Cinatl et al. 2005) (Scholz,
Simon et al. 2004). Kürzlich wurde eine extrakorporale Immuntherapie mittels anti-
CD95 Antikörper getestet, die an Patienten während einer Herz-Bypass-Operation in
den vorhandenen extrakorporalen Kreislauf geschaltet war (Leukozyten Inhibitions-
Modul, LIM) beschrieben. Diese Methode erwies sich als hilfreich, da sie eine
Neutrophilen-Hyperaktivierung dämpfte, eine überschüssige Immunantwort
vorbeugte und die hämodynamischen Parameter der Patienten verbesserte (Scholz
and Cinatl 2005) (Scholz, Cinatl et al. 2005) (Abdel-Rahman, Margraf et al. 2007).
Aus diesen Erkenntnissen kann man postulieren, dass der Einsatz von LIM bei
kritisch kranken Patienten vorteilhafte Effekte erzielen kann.
1 Einleitung
2
1.1 Der hämorrhagische Schock
1.1.1 Definition
Unter einem hämorrhagischen Schock versteht man einen Zustand unzureichender
Durchblutung vitaler Organe mit konsekutivem Missverhältnis von Sauerstoff-
Angebot und –Verbrauch infolge einer akuten Blutung mit oder ohne wesentlicher
Gewebeschädigung, mit Volumenmangel und kritisch verminderter kardialer Vorlast
(Rüter A. 2004).
1.1.2 Pathogenese
Ursachen des hämorrhagischen Schocks sind akute äußere oder innere Blutungen.
Zu den äußeren Blutungen zählen z.B. Stich- bzw. Schussverletzungen; die inneren
Blutungen werden häufig durch gastrointestinale Pathologien wie Ulcera ventriculi
oder duodeni, Ösophagusvarizen, nichttraumatische Gefäßrupturen wie das
Aortenaneurysma sowie gynäkologische Blutungsquellen wie die
Extrauteringravidität oder postpartale Blutungen verursacht. Darüber hinaus kommen
nasopharyngeale Blutungen, Gefäßarrosionen bei Tumoren oder chronischen
Entzündungen u.a. in Betracht.
Im engeren Sinne definiert man einen traumatisch-hämorrhagischen Schock als
Folge von äußeren physikalischen oder chemischen Einwirkungen. Hierfür ist als
Beispiel das Polytrauma zu erwähnen.
1.1.3 Pathophysiologie
Der menschliche Körper ist in der Lage, auf verschiedene Art und Weise einem
akuten Blutverlust entgegen zu wirken. Der frühe kompensatorische Mechanismus
nach Blutverlust besteht in einer progressiven Vasokonstriktion, vermittelt über
sympatho-adrenerge Regulationsmechanismen, zur Erhöhung der Nachlast und
Aufrechterhaltung einer ausreichenden Versorgung von lebenswichtigen Organen
wie ZNS, Herz und Nieren. Diese Zentralisation des Kreislaufs führt v.a. zu einer
Verminderung der Perfusion von Haut, Skelettmuskulatur und des splanchnischen
Gefäßgebiets. Größere Blutverluste (>30%) führen primär zu einer Abnahme des
Herzzeitvolumens (HZV), jedoch erst nach dessen erheblicher Reduktion (40-50%)
zu einem messbaren Abfall des arteriellen Mitteldruckes (s. Tab. 1).
1 Einleitung
3
Hämorrhagie
Grad I Grad II Grad III Grad IV
Blutverlust (ml) <750 750-1500 1500-2000 >2000
Blutverlust (in % des
<15 15-30 30-40 >40 Gesamtvolumens)
Herzfrequenz (min) <100 >100 >120 >140
Blutdruck normal normal erniedrigt erniedrigt
Atemfrequenz (min) 15-20 20-30 30-40 >40
Diurese (ml/h) >30 20-30 <20 Anurie
ZNS, mentaler Status unauffällig aufgeregt verwirrt lethargisch
Tab.1 Organdysfunktionen in Abhängigkeit vom Schweregrad des Blutverlusts berechnet für einen 70kg schweren Erwachsenen (Rüter A. 2004). Durch das Absinken des Herzzeitvolumens werden Barorezeptoren in Aortenbogen
und Carotis-Sinus angeregt, die ihrerseits das Kreislaufzentrum in der Medulla
oblongata stimulieren. Dadurch wird reflektorisch eine sympatho-adrenerge Reaktion
ausgelöst, die zu einem erhöhten Sympathikotonus, einer vermehrten Freisetzung
von Katecholaminen (Adrenalin, Noradrenalin) und Stresshormonen (Kortisol,
Vasopressin/ADH u.a.) führt. Diese Effekte führen zu einem Anstieg der
Herzfrequenz und der myokardialen Kontraktilität sowie des systemischen
Gefäßwiderstandes durch periphere Vasokonstriktion.
Aufgrund dieser kompensatorischen Mechanismen treten die klinischen Zeichen
eines hämorrhagischen Schocks (arterielle Hypotonie, Verwirrtheit, Oligurie) erst in
der Spätphase bei einem Blutverlust >30% auf. Dies kann vor allem bei Jugendlichen
und Kindern dazu führen, den Ernst der Lage zu unterschätzen.
Das Versagen der kompensatorischen Mechanismen mit Minderperfusion von
Organen bringt eine Störung der Mikrozirkulation mit sich, die auch als
„schockspezifische Mikrozirkulationsstörung“ bezeichnet wird (Morini, Yacoub et al.
2000). Diese ist charakterisiert durch eine bestehende lokale Stase mit Akkumulation
von Leukozyten und Thrombozyten (sog. sludge) und anderseits durch eine zellarme
Plasmaströmung in der Mikrozirkulation. Ein abfallender Perfusionsdruck kombiniert
mit den veränderten Fließeigenschaften des Blutstroms führt zu einer verminderten
Elimination von sauren Stoffwechselprodukten und Akkumulation dieser im
hypoxischen Gewebe. Dies wird auch als „hidden acidosis“ bezeichnet (Bergentz,
Carlsten et al. 1969). Durch die Hypoxie im ischämischen Gebiet wird insbesondere
das Gerinnungs-, Fibrinolyse-, Komplement- und Kallikrein-Kinin-System aktiviert
und führt zur Freisetzung multipler Mediatoren (Mutschler 2004). Beim
hämorrhagischen Schock spielen die Arachidonsäure-Metabolite (Leukotriene,
1 Einleitung
4
Thromboxan) und bestimmte Zytokine wie TNF , IL-1, IL-6 und IL-8 eine besondere
Rolle (Tamion, Richard et al. 2001). Direkte Folgen dieser Mediatorenfreisetzung
sind Schäden des Kapillarendothels sowie inflammatorische Reaktionen mit
konsekutiver Organdysfunktion, die unter dem Begriff SIRS zusammengefasst
werden.
1.1.4 Ischämie/Reperfusionssyndrom
Folgende Mechanismen scheinen bei der Entstehung von
Ischämie/Reperfusionsschäden von Bedeutung zu sein: die Bildung freier
Sauerstoffradikale, Leukozytenaktivierung, Mikrozirkulationsstörung und Ca2+ -
Einstrom in die Zelle.
Bei Energiemangel wie zum Beispiel in der Ischämiephase kommt es zu einer
gesteigerten anaeroben Glykolyse und vermehrtem Abbau energiereicher Phosphate
wie ATP. Da diese wegen des Energiemangels nicht rephosphoryliert werden
können, akkumuliert AMP, welches durch die Xanthin-Oxidase (XOx) weiter zu
Hypoxanthin und Xanthin abgebaut wird (Mutschler 2004). Bei diesen Reaktionen
wird aus dem beteiligten molekularen Sauerstoff jeweils ein Superoxid-Radikal (•O2-)
freigesetzt. Körpereigene Kompensationsmechanismen bauen dieses unter
normalen Bedingungen zum weniger reaktionsfreudigen Wasserstoff-Peroxid (H2O2)
ab (de Groot 1994). Beim Wiedereinsetzen der Durchblutung in der Frühphase der
Reperfusion treffen große Mengen Substrat (Zakaria el, Campbell et al. 2007) und
aktivierte Enzyme (Xanthin-Oxidase) mit dem neu antransportierten Sauerstoff
zusammen, so dass es zu einer überschießenden Bildung von Radikalen kommt, die
der Körper nicht selbständig kompensieren kann (Frei, Stocker et al. 1988).
Sauerstoffradikale schädigen das Gewebe einerseits direkt durch Angriff auf
Membranlipide und Zellorganellen sowie auf Nukleinsäuren, was zu einer
Membrandesintegration, einem zellulären Ödem und zur Lyse der Zelle führt (Galli,
Piroddi et al. 2005). Dieser Vorgang wird als Lipidperoxidation bezeichnet (Rose S
1994). Dies bewirkt eine Schädigung von Zellmembranen, was als Hauptursache für
die Entwicklung generalisierter endothelialer Permeabilitätsstörungen (capillary leak)
angesehen wird (Suematsu, Goda et al. 1995). Andererseits werden durch die
Freisetzung proinflammatorischer Zytokine aus geschädigten Zellen Leukozyten aus
der Blutbahn rekrutiert (Kaminski, Bonda et al. 2002).
1 Einleitung
5
Calcium spielt insofern eine Rolle, da es bei Energiemangel in der Zelle kumuliert
und zusätzlich durch geschädigte Membranen eindringen kann. Calcium ist ein
osmotisch wirksames Elektrolyt und ist in der Lage, intrazelluläre Enzyme zu
aktivieren (Rosario, Waldo et al. 2004), die ihrerseits die Membranen, das Zytoskelett
und das Chromatin im Zellkern angreifen sowie die Xanthin-Oxidase aktivieren
(Sakorafas, Tsiotos et al. 2000).
Die Vorgänge während der Ischämiephase bilden die Grundlage dafür, dass in der
Reperfusion die eigentliche Schädigung des Gewebes stattfindet. Kommt es dann
zum Wiedereinsetzen der Perfusion, z.B. nach erfolgter Schockbehandlung oder
Reparation einer Gefäßverletzung, werden die toxischen Metabolite in die
Blutstrombahn ausgeschwemmt. Dies führt u.a. zur systemischen Aktivierung der
Komplementkaskade mit Bildung der potenten inflammatorischen Anaphylatoxine
C3a und C5a. Diese führen zu einer Rekrutierung und Aktivierung von neutrophilen
Granulozyten und zur Freisetzung proteolytischer Enzyme, was schlussendlich zu
einer erhöhten Membranpermeabilität, einem mikrovaskulären Schaden und
sekundärem Zelltod führt (Cotran R. 1999).
Neben der erhöhten Gefäßpermeabilität kommt es zudem zur Auflösung der
interstitiellen Matrix und zur Aktivierung einer Kaskade von Stoffwechselwegen, die
in einer Produktion von Entzündungsmediatoren enden (Demling and LaLonde
1990). Die durch den Radikalen-Angriff veränderten Zellmembranen aktivieren
Leukozyten, führen zu Mikrozirkulationsstörungen und verursachen somit
multifaktoriell Zell- und Gewebeschäden (Granger 1988) (Abb. 1).
1 Einleitung
6
Abb. 1 Pathophysiologische Mechanismen des Ischämie-Reperfusionssyndroms (Rüter A. 2004).
1.1.5 Rolle der neutrophilen Granulozyten
Die neutrophilen Granulozyten gehören mit einem Anteil von 50–65 % zu den
häufigsten Leukozyten. Als Phagozyten sind sie Teil der angeborenen Immunabwehr
und dienen der Identifizierung und Zerstörung von Mikroorganismen. Neutrophile
Granulozyten werden innerhalb von 14 Tagen im Knochenmark gebildet und bleiben
in einem inaktiven Zustand, bevor sie in den Blutkreislauf gelangen. Einmal im
Blutkreislauf zirkulierend, verbringen sie 12-14 Stunden teilweise im Hauptstrom und
in einem marginalen Pool in Kontakt mit der Gefäßwand (Brown, Brain et al. 2006).
Bei Abwesenheit von aktivierenden Stimuli wie Bakterien oder andere Antigene
werden die neutrophilen in die Organe des retikuloendothelialen Systems, z.B Leber
(Suratt, Young et al. 2001) oder sogar zurück ins Knochenmark (Martin, Burdon et al.
2003) zurücktransportiert und unterlaufen dort Apoptose (Hengartner 2000), ohne
zellulären Schaden hervorzurufen.
Sobald ein lokaler Inflammationsstimulus im Organismus entsteht (Zellschaden),
kommt es zu einer lokalen Freisetzung von verschiedenen chemotaktischen
Faktoren, u.a. Complement 5a (C5a), Leukotrien-B4, plättchen-aktivierender Faktor
(PAF) und Interleukin-8 (IL-8).
1 Einleitung
7
Es wird neuerdings postuliert, dass eine körpereigene IgM-Subfamilie bei Ischämie
ebenfalls als potenter Stimulus zur Freisetzung von chemotaktischen Faktoren, vor
allem von Complement, führt (Hart, Ceonzo et al. 2005; Walsh, Mustafi et al. 2005;
McMullen, Hart et al. 2006; Zhang, Takahashi et al. 2006).
Daraufhin wandern neutrophile Granulozyten aus Regionen niedriger
Faktorenkonzentration (Hauptstrombahn, Gefäßwand) in die Region hoher
Faktorenkonzentration (Entzündungsherd) und beginnen unmittelbar deren
Aktivierung (Mollnes, Brekke et al. 2002).
Leukozyten verwenden Adhäsionsmoleküle (Selektine und Integrine) um sich an
Endothel zu befestigen und eine Extravasation zu erleichtern. Die Selektine fördern
das Verlangsamen der Neutrophilen und das Rollen entlang des Gefäßendothels.
Die Integrine sorgen entsprechend für die definitive Adhäsion der neutrophilen
Granulozyten (Gonzalez-Amaro and Sanchez-Madrid 1999). Integrine werden in zwei
Subfamilien unterteilt (β1 und β2). Auf der Neutrophilenoberfläche befindet sich das
L-Selektin, welches mit spezifischen Oligosacchariden der Endotheloberfläche
interagiert. An Endothel gebundenes E-Selektin und P-Selektin erkennt
entsprechende Kohlenhydrat-Motive auf der Neutrophilenoberfläche. Das transiente
„Rollen“ der Neutrophilen Granulozyten am Gefäßendothel ermöglicht den Kontakt
von Neutrophilen mit am Endothel haftenden Chemokine wie IL-8 und PAF. Diese
Interaktion stimuliert die Neutrophilen und führt zur Hochregulation und Zunahme der
β2-Integrinaktivität für das am Endothel befindliche Intrazelulläre Adhäsionsmolekül
ICAM-1. Die endotheliale Expression von ICAM-1 wird durch den Einfluss u.a. von
TNF-α, IL-1 und Lipopolysaccharid erhöht (Brown, Brain et al. 2006).
Die aktivierten und durch das Endothel gewanderten neutrophilen Granulozyten
setzen daraufhin eine Reihe verschiedener Substanzen wie kationische Proteine,
Elastase, Lysozym, lysosomale Enzyme und Myeloperoxidase. Zudem entstehen
freie Sauerstoffradikale im Entzündungsort, welche zytolytisch wirken(Welbourn,
Goldman et al. 1991; Carden, Xiao et al. 1998).
Die Aktivität und Lebenszeit neutrophiler Granulozyten wird von G-CSF und GM-CSF
beeinflusst. Beide Faktoren sind in der Lage, die im Blut zirkulierende
Neutrophilenfraktion zu erhöhen, die Reifung und Aktivierung zu fördern (Lieschke,
Grail et al. 1994) sowie die Neutrophilen-Lebenszeit zu verlängern (Lee, Whyte et al.
1993). Gesunde Individuen weisen sehr niedrige G-CSF Konzentrationen auf. Im
Falle einer akuten Entzündung steigt die G-CSF Konzentration um ein Vielfaches,
1 Einleitung
8
woraus eine deutliche Neutrophilen-Konzentrationserhöhung im Blut folgt (Tanaka,
Ishikawa et al. 1996).
Wie bereits beschrieben (s.o.) wird zudem das Apoptoseverhalten der neutrophilen
Granulozyten u.a. durch G-CSF beeinflusst (Lee, Whyte et al. 1993), sodass eine
längere Aktivitätszeit resultiert und bei systemischer Inflammation eine
überschießende Freisetzung von toxischen Metaboliten stattfindet (Quaid, Cave et al.
1999).
1.1.6 SIRS, MODS, MOV
Bei ausgeprägtem Gewebeschaden kommt es zu einer Überproduktion von
Mediatoren im Organismus mit daraus folgender zusätzlicher Gewebeschädigung.
Anhand von einfachen klinischen Kriterien wurde 1992 im Rahmen einer Konsensus-
Konferenz des „American College of Chest Physicians/Society of Critical Care
Medicine (ACCP/SCCM) das „systemic inflammatory response syndrome“ (SIRS)
definiert, wobei mindestens zwei von vier der folgenden Kriterien erfüllt sein müssen
(Mutschler 2004):
Herzfrequenz >90 Schläge/min
Atemfrequenz >20/min bzw. Abfall des PaCO2 unter 32 mmHg
Körpertemperatur <36°C oder >38°C
Leukozytenzahl >12000/mm³ oder <4000/mm³, oder mehr als 10% unreife
Granulozyten im Differentialblutbild
Die klinische Manifestation dieser systemischen Entzündungsreaktion ist eine
generalisierte Permeabilitätsstörung mit interstitiellem Ödem und multiplen
Einschränkungen der Organfunktion, wobei in den meisten Fällen ein pulmonales
Versagen beteiligt ist (Bone, Sibbald et al. 1992).
Sind gleichzeitig mehrere Organsysteme davon betroffen, spricht man von einem
Multiorgandysfunktionssyndrom (MODS) (Marshall, Cook et al. 1995).
Bis zu 30% aller Traumapatienten entwickeln ein Multiorganversagen, welches trotz
modernster therapeutischer Maßnahmen immer noch häufig letal endet.
Das MODS wird, abhängig vom Zeitintervall zwischen seiner Manifestation und der
verursachenden Noxe unterteilt in das:
1 Einleitung
9
primäre MODS, welches unmittelbar nach dem Organtrauma aufgrund der
Hypoxie entsteht oder sich infolge zahlreicher Transfusionen als
Gerinnungsstörung manifestiert, sowie in das
sekundäre MODS, das sich erst 3 bis 14 Tage nach dem schädigenden
Ereignis zeigt.
Charakteristisch für das MODS ist das Auftreten einer Dysfunktion von
Organsystemen, die primär keinen Schaden erlitten haben sowie durch sein
Auftreten Tage/Wochen nach dem initialen Trauma.
Als Multiorganversagen (MOV) wird das gleichzeitig oder rasch nacheinander
auftretende Versagen von zwei oder mehr vital notwendigen Organsystemen
bezeichnet (Baue 1975). Es wird zwischen einem frühen (primären) und einem
späten (sekundären) Multiorganversagen unterschieden. Ein primäres MOV kann
unmittelbar im Rahmen eines schweren Traumas, nach Operationen mit
ausgedehnter Gewebezerstörung oder nach ausgeprägten Schockzuständen
entstehen. Das sekundäre MOV entwickelt sich erst nach einer initial stabilen Phase
durch einen zweiten Insult, wie z.B. einer bakteriellen Infektion, im Rahmen eines als
Two-hit-Modells bekannten Pathomechanismus (Deitch 1992).
1.1.7 Bedeutung der Hypoxie im Schock
1.1.7.1 Lipidperoxidation
Oxidativer Stress im biologischen Organismus entsteht als Konsequenz eines
Ungleichgewichts zwischen prooxidativen und antioxidativen Systemen zu Gunsten
der Prooxidantien. Dies führt zu einer Schädigung von Biomolekülen wie
Nukleinsäuren, Proteinen, strukturellen Kohlenhydraten oder Lipiden (Sies and
Cadenas 1985). Insbesondere der Angriff auf Lipide führt zu einer vermehrten
Freisetzung hochreaktiver Substanzen (Gutteridge 1995).
Die Schädigung von Lipiden durch freie Radikale, insbesondere der mehrfach
ungesättigten Fettsäuren zellulärer Membranen, wird als Lipidperoxidation
bezeichnet. Diese entsteht durch Einfluss von radikalischen Oxidantien, wie das
Superoxidanionenradikal und das Hydroxylradikal. Diese Verbindungen verdanken
ihre hohe Reaktivität einem ungepaarten, sog. freien Elektron. Aufgrund dieser
hohen Reaktivität sind die freien Radikale in der Lage, ungesättigte Fettsäuren
anzugreifen und die Lipidperoxidation in Gang zu setzen (Abb. 2).
1 Einleitung
10
Abb. 2 Schematische Darstellung der Reaktionen bei der Lipidperoxidation (Young and McEneny 2001).
Die erste Reaktion bei der Lipidperoxidation mehrfach ungesättigter Fettsäuren
besteht im Entzug eines Wasserstoffatoms aus einer Doppelbindung zwischen zwei
Kohlenstoffatomen. Hierbei bleibt ein freies, ungepaartes Elektron an einem
Kohlenstoffatom zurück. Diese Verbindung unterläuft dann eine Umlagerung in ein
konjugiertes Dien, aus welchem unter Einfluss von Sauerstoff ein Peroxylradikal
entsteht. Das entstandene Peroxylradikal entzieht wiederum ein Wasserstoffatom
aus einer anderen mehrfach ungesättigten Fettsäure und somit wird die
Kettenreaktion in Gang gesetzt (Catala 2006).
Zur Unterbindung dieser Kettenreaktion kommt es bei Reaktion zweier Radikale
miteinander, Verbindung des Radikals mit einem Antioxidans wie z.B. Vitamin E
(Buettner 1993), oder mit Hilfe körpereigener Enzyme wie Superoxid-Dismutase,
Katalase, und Peroxidase.
Als Endprodukt der Reaktion eines Peroxylradikals mit einem Wasserstoffatom
entstehen verschiedene Hydroperoxide und zyklische Peroxide. Durch
Fragmentation entstehen Aldehyde, unter anderem Malondialdehyd, das als Marker
für abgelaufene Peroxidationsprozesse im Gewebe nachgewiesen werden kann
1 Einleitung
11
(Armstrong and Browne 1994). Diesen Mechanismus hat man sich im Rahmen
dieser Arbeit zu Nutze gemacht, um das Ausmaß des oxidativen Stresses auf
zellulärer Ebene beim hämorrhagischen Schock zu untersuchen.
An biologischen Phospholipidmembranen verringern Lipidperoxidationsprozesse die
Fluidität und Stabilität der Membran, führen zu einer erhöhten Permeabilität,
alterieren den Ionentransport und inhibieren metabolische Prozesse (Nigam and
Schewe 2000). Schließlich kommt es zum Abfall des Membranpotentials sowie zu
Membraneinrissen mit Freisetzung intrazellulärer Zellbestandteile (Esterbauer,
Schaur et al. 1991) mit zusätzlicher Schädigung der Mitochondrien und weiterer
Radikalbildung (Green and Reed 1998).
Hinzu kommt es durch Freisetzung intrazellulärer Metallionen, v.a. von Eisen und
Kupfer aus Zellspeichern, zur Verstärkung der Lipidperoxidation (Halliwell and
Gutteridge 1984).
1.1.7.2 Häm und HO-1
Häm gehört in die Gruppe der Metalloporphyrine und besteht aus einem planaren
Protoporphyrin-Ring, der aus vier durch Methin-Brücken miteinander verbundenen
Pyrrol-Ringen mit unterschiedlichen Seitenketten aufgebaut ist. Die Substituenten
sind für die Bindung an Proteine essentiell. Die zum Zentrum des Rings zeigenden
Stickstoff-Atome sind in der Lage, Übergangsmetalle zu komplexieren. Im Falle des
Häm ist ein zweiwertiges Eisen-Atom komplexiert, weshalb Häm auch als Eisen-
Protoporphyrin-IX (FePP-IX, Ferroprotoporphyrin-IX) bezeichnet werden kann
(Maines 1997).
Häm ist ein wesentlicher Bestandteil vieler Enzyme mit unterschiedlichen
Funktionen:
Sauerstoffbindung (Hämoglobin, Myoglobin)
Sauerstoff-Metabolismus (Peroxidasen) und Elektronentransfer (Cytochrome),
sowie
Synthese von Signal-Molekülen wie NO-Synthase, Cyclooxygenase,
Guanylat-Cyclase und Hydroxylasen (Ponka 1999; Wagner, Cadetg et al.
2003).
Es besitzt neben seinen nützlichen Eigenschaften allerdings auch solche, die
schädigend auf den Organismus wirken können: Freies zelluläres Häm ist ein Pro-
Oxidant, weshalb es vor allem in höheren Konzentrationen toxisch wirkt (Gutteridge
1 Einleitung
12
and Smith 1988; Balla, Vercellotti et al. 1991) und spielt eine Rolle bei der
Entstehung von oxidativem Stress und Zellmembran-Schädigung (Beri and Chandra
1993; Jeney, Balla et al. 2002; Wagener, Volk et al. 2003).
Der Häm-Abbau kann beim Menschen auf enzymatischem und nicht-enzymatischem
Wege erfolgen, wobei der erste der physiologisch bedeutsamere ist.
Die an mikrosomalen Membranen lokalisierte Hämoxygenase katalysiert den initialen
und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im enzymatischen Häm-Abbau. Aus der
von ihr katalysierten Reaktion gehen unter Verwendung von molekularem Sauerstoff
(O2) und NADPH äquimolare Mengen an Biliverdin (BV), Kohlenmonoxid (CO) und
zweiwertigem Eisen (Fe2+) hervor (Tenhunen, Marver et al. 1968; Tenhunen, Marver
et al. 1969; Maines 1988) (Abb. 3).
Abb. 3 Reaktionsweg der Hämoxygenase 1 (Tenhunen, Marver et al. 1968).
Bis heute wurden drei Isoformen der Hämoxygenase identifiziert, die dem Abbau von
toxischem Häm im biologischen System dienen. Dazu gehören die durch oxidativen
Stress induzierbare HO-1 aus der Familie der Hitze Schock Proteine (Choi and Alam
1996), die konstitutive HO-2 (Maines 1997) und die zuletzt identifizierte HO-3
(McCoubrey, Huang et al. 1997). Diese membrangebundenen Proteine sind
Produkte unterschiedlicher Gene und sind in den Organen unterschiedlich verteilt
(Maines 1988; Maines 1997). Die höchste Konzentration an HO-1 wurde in der Milz
und in der Leber gemessen, während HO-2 im Gehirn und in den Testes die
höchsten Konzentrationen aufwies (Maines 1997).
Neben den Hämoxygenasen finden sich noch andere, weniger bedeutsame
enzymatische Abbausysteme, unter anderem durch die Xanthin-Oxidase
(Guengerich 1978; Maines 1988). In den letzten Jahren wurde berichtet, dass der
1 Einleitung
13
Hämoxygenase und ihren Produkten protektive Eigenschaften zugeschrieben
werden können (Yachie, Niida et al. 1999; Kawashima, Oda et al. 2002).
Weiterhin konnte an verschiedenen Modellen von Zellschädigung der protektive
Effekt der Hämoxygenase gezeigt werden (Tullius, Nieminen-Kelha et al. 2002;
Schmidt, Hoetzel et al. 2004). Aus diesen Gründen wird postuliert, dass sie in
verschiedenen Stoffwechselvorgängen eine entscheidende regulatorische Rolle
spielen.
Unter der Vielzahl der aktuell bekannten Stressproteine scheint die Hämoxygenase-1
von besonderem Interesse zur Reduktion eines durch Ischämie hervorgerufenen
Gewebeschadens zu sein:
Kohlenmonoxid (CO) soll wie Stickstoffmonoxid (NO) über die Aktivierung der
löslichen Guanylat-Cyclase zu einer Zunahme des zyklischen 3‘ 5‘
Guanosinmonophosphat (cGMP) - Spiegels führen und dadurch eine
Gefäßdilatation bewirken (Furchgott and Jothianandan 1991; Utz and Ullrich
1991; Verma, Hirsch et al. 1993; Morita, Perrella et al. 1995).
Biliverdin wird durch die Biliverdin-Reduktase in Bilirubin, einem antioxidativ
wirkenden Molekül (Stocker, Yamamoto et al. 1987), reduziert (Kutty and
Maines 1981).
Eisen wird nach Induktion der Ferritinexpression durch HO-Aktivitätszunahme
an Ferritin gebunden und kann damit nicht mehr die Herstellung von
Sauerstoffradikalen, wie z. B. OH-, katalysieren (Halliwell 1978).
Aufgrund dieser antioxidativen und gefäßdilatierenden Eigenschaften spielt die
Hämoxygenase-1 eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung der zellulären
Homöostase und kann dadurch möglicherweise einen ischämischen Schaden
reduzieren. Aufgrund dieser Tatsachen spielt die HO-1 eine ausschlaggebende Rolle
innerhalb des Hämoxygenasesystems im Zellschutz bei oxidativem Stress wie z.B
im Rahmen eines hämorrhagischen Schocks (Rensing, Bauer et al. 1999; Kubulus,
Rensing et al. 2005).
Induktoren von HO-1
Wie kein anderes Enzym reagiert die HO-1 extrem empfindlich auf verschiedene
Stressoren, wie z.B. Hyper- (Okinaga and Shibahara 1993) und Hypothermie
(Kubulus, Roesken et al. 2004), Ischämie/Reperfusion (Kubulus, Roesken et al.
2004; Kubulus, Rensing et al. 2005) Hypoxie, Hyperoxie (Takahashi, Takahashi et al.
1 Einleitung
14
1999), inflammatorische Zytokine (Terry, Clikeman et al. 1998; Amon, Menger et al.
2003), Endotoxin (Camhi, Alam et al. 1995; Pellacani, Wiesel et al. 1998), Häm
(Taylor, Carraway et al. 1998), Metalle (Immenschuh, Iwahara et al. 1995), sowie die
portale Hypertension (Fernandez and Bonkovsky 1999).
Allen Induktoren gemeinsam ist, dass sie oxidativen Stress verursachen (Bauer and
Bauer 2002). Trotz der vielfältigen Induktionsmöglichkeiten ist Häm, und damit auch
Hämoglobin, der stärkste Induktor der HO-1, da dieses gleichzeitig das Substrat
dieses Enzymes ist.
1.1.7.3 Der Hypoxie-induzierbare Faktor 1α (HIF-1α)
Der menschliche Körper ist auf eine ausreichende Zufuhr an Sauerstoff zum
Überleben angewiesen und muss sich den Gegebenheiten anpassen. Ein Mangel an
Sauerstoff treibt die verschiedensten Stoffwechselvorgänge an, um den Organismus
unter diesen Bedingungen leistungsfähig zu halten. Diese Anpassungsvorgänge
bedürfen einer strikten Regulation sowohl der metabolischen, als auch der zellulären
Mechanismen.
Die Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF) spielen hier eine Schlüsselrolle (Semenza
2000). Sie regulieren auf transkriptioneller Ebene die wichtigsten Parameter, wie
Durchblutung und ATP-Gewinnung zur Instandhaltung des Sauerstoff-Metabolismus.
Struktur
HIF-1 ist ein heterodimeres Protein, welches aus einer 120 kDa schweren α- und
einer 91-94 kDa schweren β-Untereinheit besteht. Beide Untereinheiten gehören zur
PAS-Superfamilie, einer Gruppe von Sensorproteinen, die v. a. auf Umwelt- und
Entwicklungssignale spezialisiert sind und ihren Namen von den zuerst identifizierten
Proteinen: Per (Period), ARNT (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator) und
Sim (Single minded) erhalten haben (Taylor and Zhulin 1999). Weitere Mitglieder
dieser Familie sind CLOCK und MOP3 (CYCLE), die in den zirkadianen Rhythmus
regulierend einwirken (Gu, Hogenesch et al. 2000).
HIF-1 ist strukturell ein basisches Helix-Loop-Helix (bHLH)-Protein, das seine
Zielsequenz in der großen Furche der DNA bindet (Murre, Bain et al. 1994; Kewley,
Whitelaw et al. 2004).
Nur HIF-1α wird Sauerstoff-abhängig reguliert. Diese Untereinheit wird konstitutiv
transkribiert und translatiert, unter normoxischen Bedingungen aber nach einer
1 Einleitung
15
Ubiquitinierung durch das von Hippel-Lindau-Protein (pVHL) erkannt und im
Proteasom degradiert (Maxwell, Wiesener et al. 1999; Hon, Wilson et al. 2002; Min,
Yang et al. 2002).
HIF-1β hingegen ist ein ubiquitäres, nicht Sauerstoff-reguliertes Protein, das als
Heterodimerisierungspartner des Dioxin-Rezeptors (aryl hydrocarbon receptor, AhR)
transkriptionsinitiierend an spezifischen dioxin response elements (DREs) agiert.
Neben HIF-1α sind mittlerweile zwei weitere Mitglieder der HIF-Familie entdeckt
worden, deren Funktion noch nicht vollkommen geklärt ist. Sie werden, anders als
HIF-1α, nicht ubiquitär exprimiert (Talks, Turley et al. 2000). HIF-2α wurde initial als
„endotheliales PAS-Protein“ (EPAS-1), HIF-like factor (HLF) oder auch HIF-related
factor (HRF) beschrieben (Tian, McKnight et al. 1997). Der HIF-3α wurde erstmals
1998 beschrieben (Gu, Moran et al. 1998).
HIF-1α besitzt N- und C-terminal eine nukleäre Lokalisationssequenz (NLS) sowie
zwei Transaktivierungsdomänen (Taylor, Carraway et al. 1998), die für die Interaktion
mit Co-Aktivatoren zuständig sind. Die TA-Domänen werden von einer
inhibitorischen Domäne (ID) getrennt, welche unter normoxischen Bedingungen die
TAD-Aktivität unterdrückt. Die N-terminale TAD wird von einer sauerstoffabhängigen
Degradationsdomäne (oxygen dependent degradation domain, ODD) überlagert,
welche für die Instabilität von HIF-1α unter normoxischen Bedingungen
verantwortlich ist (Jiang, Zheng et al. 1997; Pugh, O'Rourke et al. 1997).
Regulation von HIF-1
Die HIF-1 Regulation erfolgt hauptsächlich auf post-translationeller Ebene anhand
der α-Untereinheit, und zwar direkt sauerstoffabhängig. Unter Normoxie ist die α-
Untereinheit instabil und wird schnell abgebaut (Wang, Jiang et al. 1995; Huang, Gu
et al. 1998). Dies geschieht durch die O2-abhängige Hydroxylierung an zwei Prolin-
Resten (Pro-402 und Pro-564) in der ODD durch Prolyl-4-Hydroxylasen (PHDs), die
molekularen Sauerstoff als limitierenden Faktor benötigen (Ivan, Kondo et al. 2001;
Jaakkola, Mole et al. 2001; Masson and Ratcliffe 2003). Die PHDs gehören zur
Enzymfamilie der 2-Oxoglutarat- und Eisen2+-abhängigen Dioxygenasen. Da das
Vorhandensein von Sauerstoff für die Enzymaktivität der PHDs unabdingbar ist,
werden sie auch als O2-Sensoren beschrieben (Epstein, Gleadle et al. 2001).
Durch die entstandene Hydroxylierung wird das von-Hippel-Lindau
Tumorsuppressorprotein (pHVL) aktiviert, welches seinerseits an Aminosäuren im
1 Einleitung
16
Bereich der ODD bindet, und als Substrat für die E3-Ubiquitinligase dient (Maxwell,
Wiesener et al. 1999; Ohh, Park et al. 2000). Die E3-Ubiquitinligase markiert HIF-1α
durch Polyubiquitinylierung für den anschließenden proteasomalen Abbau (Salceda
and Caro 1997; Huang, Gu et al. 1998).
Sauerstoffabhängige Wirkung von HIF-1α
Unter hypoxischen Bedingungen, wie z.B. beim hämorrhagischen Schock, kommt es
zur Akkumulierung von HIF-1α im Zytosol. Dieses wird dann phosphoryliert und in
den Zellkern transloziert. Dort wird es mit ARNT dimerisiert und kann dann als
Transkriptionsfaktor an die Hypoxie-responsiven Elemente (HRE) der Promotor- oder
Enhancerregion von sauerstoffabhängigen Genen binden (Semenza, Jiang et al.
1996; Camenisch, Stroka et al. 2001) (Abb. 4).
Abb. 4 Darstellung der Aktivitäts-Regulation von HIF-1α (Fandrey, Gorr et al. 2006)
Unter diesen zahlreichen Genen, die durch HIF-1α reguliert werden, befinden sich
solche, die für die Erythropoese und den Eisentransport zuständig sind, wie z.B. das
EPO- (Wang and Semenza 1993) und das Transferrin-Gen (Rolfs, Kvietikova et al.
1 Einleitung
17
1997). HIF-1α modulliert ebenfalls die Angiogenese und die Gefäßtonusregulation
durch Beeinflussung des VEGF (Forsythe, Jiang et al. 1996; Jubb, Pham et al.
2004), VGEF-Rezeptor-1 (Gerber, Kowalski et al. 2000), Plasminogen-Aktivator
Inhibitor-1 (Issbrucker, Marti et al. 2003), der induzierbaren (Palmer, Semenza et al.
1998) und der endothelialen (Coulet, Nadaud et al. 2003) NO-Synthase und der im
Rahmen dieser Arbeit näher untersuchten Hämoxygenase-1 (Lee, Jiang et al. 1997).
Hinzu kommt die Regulation mehrerer Gene in Rahmen des anaeroben
Stoffwechsels (Glukoseaufnahme und Glykolyse), Zellmigration und -adhäsion
(Metastasierung/Chemotaxis) und Wachstum/Apoptose (Tumorwachstum und -
progression).
Unter hämorrhagischen Bedingungen führen diese Regulationsvorgänge über die
oben genannten Mechanismen zu einer Adaptation des Organismus, um eine
Optimierung der Versorgung der Zelle mit Sauerstoff zu gewährleisten.
1.2 Das Leukozyten-Inhibitions-Modul (LIM)
1.2.1 Definition
Das LIM wurde entwickelt, um transient eine überschießende Immunreaktion mit
pathophysiologischem Charakter zu inhibieren. Das LIM kann bei herzchirurgischen
Patienten, die im Rahmen einer Operation ein SIRS entwickeln, aber auch bei
Patienten mit autoimmunen Erkrankungen eingesetzt werden. Bei Patienten mit
schwerem Trauma wurde das LIM noch nicht eingesetzt. Es soll langfristig geprüft
werden, ob LIM vorteilhafte Effekte bei Intensivpatienten hat und möglicherweise die
posttraumatische Entstehung von SIRS und Sepsis verhindert oder reduziert. Die in
dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen sind wichtige Vorarbeiten für einen
klinischen Einsatz in naher Zukunft.
1 Einleitung
18
1.2.2 Makroskopischer Aufbau
Abb. 5 Detaillierter makroskopischer Aufbau des Leukozyten-Inhibitions-Moduls
Das LIM (Abb. 5), wie es in der Herz-Lungen-Maschine derzeit in klinischen Studien
eingesetzt wird, besteht aus einem Polykarbonat-Gehäuse mit Blutein- und -
ausstrom. Im Gehäuse befindet sich ein offenporiger Polyurethanschaum, der mit
einem anti-Fas IgM Antikörper beschichtet ist. Der Antikörper ist kovalent gebunden
und wird durch eine speziell entwickelte Nachbeschichtung geschützt.
Das LIM hat gute rheologische Eigenschaften und erlaubt einen ausreichend
intensiven Kontakt der zirkulierenden Neutrophilen mit der biofunktionellen
Oberfläche. Es wurde bereits früher gezeigt, dass die Neutrophilen nach Kontakt mit
dem Antikörper sich vom Schaum ablösen und die präapoptotischen Neutrophilen
offenbar von der Milz degradiert werden (Scholz and Cinatl 2005). Toxische
Eigenschaften wurden bislang nicht entdeckt.
1.2.3 Mikroskopischer Aufbau
Die Beschichtung der Polyurethanoberfläche innerhalb des LIM wird in drei Schritten
durchgeführt. Die kovalente Bindung des Antikörpers an den Kunststoff erfolgt mittels
eines speziellen Silans. Zur Verhinderung der unspezifischen Ablösung unter
Flussbedingungen im Blutstrom werden die kovalent gebundenen Antikörper mit
einer Nachbeschichtung behandelt. Diese Nachbeschichtung erlaubt sogar eine
Sterilisation der biofunktionellen Oberfläche ohne nennenswerten Funktionsverlust.
1 Einleitung
19
Dies ist besonders beachtlich, da es sich um einen komplexen IgM-Antikörper
handelt, der in der Regel sehr instabil ist.
1.2.4 Funktionsprinzipien
Die funktionellen Einheiten des mit einer Nachbeschichtung überzogenen
Antikörpers sind überraschenderweise auch unter Blutflussbedingungen funktionell
aktiv. Die Neutrophilen, die kurzzeitig in Kontakt mit der biofunktionellen
Beschichtung kommen, werden innerhalb von Minuten inaktiviert und gehen später in
Apoptose (Abb. 6). Vermutlich wird ein großer Anteil sehr schnell vom phagozytären
Immunsystem des Patienten abgeräumt und degradiert. Daher findet man während
einer LIM-Behandlung eine geringere Zahl an zirkulierenden neutrophilen
Granulozyten.
Abb. 6 Funktionsprinzip des Leukozyten-Inhibitions-Moduls
2 Ziele der Arbeit
20
2. Ziele der Arbeit
2.1 Aufbau und Etablierung eines hämorrhagischen
Schockmodells im Schwein als Voraussetzung für die
Überprüfung der posthämorrhagischen Immunantwort
Ein geeignetes Großtiermodell (Schwein) zur Testung extrakorporaler
Immuntherapie-Ansätze gab es bei Beginn der Arbeit nicht in der Heinrich-Heine
Universität. Daher war es eine Voraussetzung für die Untersuchungen dieser Arbeit,
ein entsprechendes Modell zu etablieren. Aufgrund des großen Umfangs der Studie
wurde das hämorrhagische Schokmodell durch die gesamte LIM-Arbeitsgruppe der
Klinik für Unfall- und Handchirurgie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
etabliert und verifiziert.
2.2 Überprüfung der posthämorrhagischen Immunantwort anhand
inflammatorisch/hypoxischer Parameter
Nach Etablierung des Schockmodells wurden inflammatorische Parameter zur
Quantifizierung eines entstandenen Schadens zur Evaluierung einer extrakorporalen
Immuntherapie im Schweinemodell festgelegt. Die Parameter sollten der klinischen
Realität so nah wie möglich sein. Die im Rahmen dieser Arbeit ausgesuchten
Parameter zur Quantifizierung der posthämorrhagischen Immunantwort waren die
Gen- und Proteinexpression von Hämoxygenase-1 (HO-1) und vom Hypoxie-
Induzierten Faktor-1α (HIF-1α) und die Konzentrationsbestimmung von
Malondialdehyd-Addukte (MDA) in verschiedenen Organen.
2.3 Testung der LIM-Effektivität und Unbedenklichkeit
Die untersuchten Parameter MDA, HO-1 und HIF-1α wurden zwischen den
Untersuchungsgruppen +LIM und nLIM verglichen und zur Überprüfung der
Effektivität des Einsatzes von LIM herangezogen.
3 Material und Methoden
21
3. Material und Methoden
Die Aufzeichnung der im Rahmen dieser Arbeit unter 3.2.1, 3.3.1, 3.3.2, 3.3.8 und
3.3.9 präsentierten Methoden wurden durch die LIM-Arbeitsgruppe der Kinik für
Unfall- und Handchirurgie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf durchgeführt.
Die Durchführung der operativen Eingriffe, Blutabnahmen sowie die Erfassung von
Daten bzw. Laborparametern in der Tierversuchsalnage erfolgte durch die gesamte
Arbeitsgruppe. Die Arbeitsgruppe bestand aus 5 Mitarbeitern, die von Dr. med. Tim
Lögters betreut und von Prof. Dr. phil. nat. Martin Scholz geleitet wurde. Zudem
erfolgten weiterführende Auswertungen und Untersuchungen im Labor der Klinik für
Unfall- und Handchirurgie. Diese wurden durch die Mitarbeiter individuell
durchgeführt und ausgewertet.
Mitarbeiter und deren Arbeitsschwerpunkte:
Annina Ott: Einfluss des Leukozyten-Inhibitions-Moduls auf die
posthämorrhagische Aktivierung von neutrophilen
Granulozyten im Tiermodell
Sarah Sadek: Einfluss des Leukozyten-Inhibitions-Moduls auf die
posthämorrhagische Gewebeschädigung
(Serologie/Histologie/Elektronenmikroskopie)
Jessica Baltes: Untersuchungen zum Einfluss des Leukozyten-
Inhibitions-Moduls auf die posthämmorhagische
Apoptose im Gewebe (Bax, Bcl-2)
Ingo Witte: Einfluss des Leukozyten-Inhibitions-Moduls auf die
Hämodynamik im Tiermodell
Alberto Schek: Untersuchungen zum Einfluss des Leukozyten-
Inhibitions-Moduls auf die posthämorrhagische
Inflammation und Gewebehypoxie im Tiermodell.
Gen- und Proteinexpression von HIF-1α und HO-1,
Konzentration von MDA
3 Material und Methoden
22
3.1 Material
3.1.1 Versuchstiere
Münchner Miniaturschwein Tierversuchsanlage Heinrich Heine
Universität Düsseldorf
3.1.2 Zugänge/Katheter
5Fr arterieller Katheter Wygon, Ecouen, Frankreich
8Fr Einführungsschleuse Arrow Deutschland, Erding
Blasenkatheter Cystofix Braun, Melsungen
Dreilumiger 8Fr Sheldon-Katheter Arrow Deutschland, Erding
Endotrachealer Tubus 6-7 mm Malinckrodt, Athlone, Ireland
Periphervenöser Zugang Braun, Melsungen
Swan-Ganz Katheter Edwards Lifesciences, Irvine,
California, USA
3.1.3 Medikamente/Infusionen
Atropin Braun, Melsungen
Azaperon Janssen-Cilag GmbH, Neuss
Fentanyl Janssen-Cilag GmbH, Neuss
Inzolen-Lösung Dr. Franz Köhler Chemie, Bensheim
Isofluran (1%) Actavis GmbH, Langenfeld
Kaliumchlorid Braun, Melsungen
Ketamin Pfizer, Berlin
Lachgas-Sauerstoff-Mischung Linde AG, Pullach
Phenobarbital Desitin Arzneimittel GmbH, Aachen
Piritramid Janssen-Cilag GmbH, Neuss
Ringer-Lösung Fresenius Kabi, Bad Homburg
Thiopental Inresa Arzneimittel, Freiburg
3.1.4 Geräte/Software
ABL 700 Radiometer GmbH, Willich
Bio Photometer Eppendorf, Hamburg
3 Material und Methoden
23
Criterion Blotter BioRad, München
Geldokumentationseinheit Chemidoc BioRad, München
GraphPad Prism ver. 5.1 for Windows GraphPad Software, San Diego, USA
Kryostat 2700-Frigocut Reichert Jung, Nußloch
Mikroskop JEM 2000 CX JEOL, Arishima, Japan
Mini-PROTEAN Tetra Cell BioRad, München
PCR-Gerät MyCycler BioRad, München
Photometer Victor 3 Perkin Elmer, Waltham, MA, USA
PowerPac HC Power Supply BioRad, München
Quantity One Software BioRad, München
SAS/Stat for Windows software ver. 8 SAS Institute, Inc, Cary, USA
Sonifiziergerät Ultrasonic processor UP50H Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow
SPSS ver. 15 SPSS, Inc, Chicago, USA
Ultraschall-Prozessor UP50H Hielscher, Teltow
VET-abc scil animal care Company, Viernheim
Vortexer IKA MS3 basic IKA Works, Inc. Wilmington, USA
Zentrifuge Heraeus Fresco 17 Thermo Fisher Scientific, Bonn
3.1.5 Chemikalien
30 % Acrylamid/Bis Lösung 37,5 : 1 Roth, Karlsruhe
Agarosegel Sigma, München
Ammonium Persulfat Sigma, München
Bovines Serum-Albumin PAA Labs GmbH, Marburg
Bromphenolblau Roth, Karlsruhe
Chem.lum.-Substrat SuperSignal West pico Pierce, Bonn
Chloracetatesterase Färbung Sigma, München
Chloroform Sigma, München
Dc Protein Assay kit BioRad, München
ECL Western Blotting Substrate Pierce, Bonn
Epoxid-Resinat Durcupan-Epon Fluka Chemie GmbH, Buchs
Ethanol Merck, Darmstadt
Formaldehyd Merck, Darmstadt
Glutaraldehyd Merck, Darmstadt
Glycerol Roth, Karlsruhe
3 Material und Methoden
24
Glycin Roth, Karlsruhe
Hämatoxylin-Eosin Sigma, München
Isopropanol Merck, Darmstadt
Methanol Merck, Darmstadt
Milchpulver Roth, Karlsruhe
Molekularbiologisch reines Wasser Eppendorf, Hamburg
Natrium desoxycholat Roth, Karlsruhe
Natrium dodecyl Sulfat (SDS) Sigma, München
Nonidet-P40 (NP40) Sigma, München
Paraffin Sigma, München
PBS Dublecco w/o Mg/Ca Biochrom, Berlin
Ponceau S Färbung Serva, Heidelberg
Proteaseinhibitoren Complete Mini Roche, Mannheim
Reverse Transkriptase Omniscript Qiagen, Hilden
RIPA Puffer + 1% NP-40 (Nonidet-P40) Biomol, Hamburg
Roti-Mark Western Set Roth, Karlsruhe
Steriles RNAse-freies Wasser (DEPC) Invitrogen, Karlsruhe
Sybr Gold Färbung Invitrogen, Karlsruhe
Taq PCR Core Kit Qiagen, Hilden
TBARS Assay Kit Cayman Chemical, Ann Arbor, USA
TBS mit 0.1 % Tween-20 Sigma, München
TEMED Roth, Karlsruhe
Tris Roth, Karlsruhe
Trizol-Reagenz Sigma, München
Tween 20 Sigma, München
3 Material und Methoden
25
3.1.6 Primer/Antikörper
oligo (dT) 15 Primer Sigma, München
Gen-spezifische Primer-Sequenzen HO-1:
R:5’-CGTAGCGCTTGGTGGCCTGCG-3´; F:5’-CAGCCCAACAGCATGCCCCAG-3´
Genosys-Sigma, München
Gen-spezifische Primer-Sequenzen HIF-1α:
R:5’-AGGGACTCTGGATTTGGTTC-3´; F:5’-TTTAGATTTGGCACAATGAC-3´
Genosys-Sigma, München
Genspezifische Primer für Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH):
R:5’-GAAGTCAGAGGAGACCACCA-3´; F:5’-CACCACCATGGAGAAGGCTG-3´
Genosys-Sigma, München
Primäre monoklonale Antikörper:
Anti-Pig-HO-1 Stressgen, Victoria, Canada
Anti-Pig-HIF-1 Novus Biologicals, Littleton, USA
Rabbit anti-Beta-Actin Antikörper Stressgen, Victoria, Canada
Sekundäre polyklonale Antikörper:
Goat anti-mouse HRP Dako Cytomation, Glostrup, Denmark
Goat anti-rabbit HRP Dako Cytomation, Glostrup, Denmark
3 Material und Methoden
26
3.2 Methoden
3.2.1 Experimentelles Modell
3.2.1.1 Die Versuchstiere
Die zu Forschungszwecken speziell gezüchteten Schweine gehörten zur Rasse der
Münchener Miniaturschweine, die durch Kreuzung des Hanford-Minischweins mit
dem kolumbianischen Portionsschwein entstand. Die Tiere wurden in der
Tierversuchsanlage Düsseldorf gezüchtet und gehalten. 24 Schweine wurden in zwei
Gruppen unterteilt mit je 12 Schweinen pro Gruppe (n=12): +LIM (Leukozyten
Inhibitions Modul) und nLIM (Standard medical care). Das Gewicht der verwendeten
Tiere betrug im Durchschnitt 30,3 3,3 kg. 24 Stunden vor dem Versuch wurde
jedes Tier in einer einzelnen Box isoliert. Gleichzeitig wurde die Futterzufuhr bis
Ende des Versuchs eingestellt. Wasser stand den Tieren ad libitum zur Verfügung.
3.2.1.2 Vorbehandlung und Anästhesie
Die Tiere wurden aus dem Stall geholt und mit einer Einzeldosis Ketamin
intramuskulär betäubt. Nach Wirkungseintritt wurden die Schweine unter
Spontanatmung in die OP-Schleuse transportiert. Dort wurde ein periphervenöser
Zugang in die Ohrvene gelegt. Über diesen Zugang wurde die Narkose mit Stresnil,
Thiopental und Atropin eingeleitet. Nach endotrachealer Intubation mit einem 6-7 mm
Durchmesser Tubus wurden die Tiere nun in den OP-Bereich gebracht und in
Rückenlage fixiert. Die Ventilation erfolgte mittels Isofluran (1%) und Lachgas-
Sauerstoff-Mischung im Verhältnis 3:1 bei einem Tidalvolumen der an einem PaCO2-
Wert von 36-44 mmHg und einem PaO2-Wert von 100-150 mmHg angepasst wurde.
Beatmet wurden die Tiere mit einer Frequenz von 10-12/Minute, wobei das
Atemzugvolumen bei 300-500ml lag. Die Beatmung wurde anhand des
endexpiratorischen CO2 Gehaltes reguliert. Zur zusätzlichen Analgesie wurde
einmalig 1ml Piritramid verabreicht, was gegebenenfalls intraoperativ durch Fentanyl
ergänzt wurde.
3.2.1.3 Katheteranlage
Alle operativen Maßnahmen wurden unter strenger Asepsis und Antisepsis
durchgeführt.
3 Material und Methoden
27
3.2.1.3.1 Blasenkatheter
Als erstes wurde ein suprapubischer Blasenkatheter (Cystofix Blasenpunktionsset,
Braun, Melsungen) in offener Technik gelegt und mittels Tabaksbeutelnaht und
kutanen Einzelknopfnähten fixiert.
3.2.1.3.2 Arterieller Katheter
Nach Fixierung und Abdeckung des Blasenkatheters wurde ein medianer, ca. 15 cm
langer Hautschnitt ventralseits am Hals der Schweine durchgeführt und die Arteria
carotis aufgesucht, die dann in Seldinger Technik mit einem 5Fr arteriellen Katheter
versehen wurde. Dieser Katheter diente zur kontinuierlichen real-time Überwachung
der arteriellen Drücke und zur Entnahme arterieller Blutgasanalysen während des
Versuchs.
3.2.1.3.3 Sheldon-Katheter
Als nächstes wurde nach Freipräparation ein dreilumiger 8Fr Sheldon-Katheter in die
linke Vena jugularis externa ebenfalls in Seldinger Technik eingeführt, der sowohl zur
kontrollierten Schockeinleitung und -Erhaltung diente, als auch zur extrakorporalen
Zirkulation und Probeentnahmen seinen Einsatz fand.
3.2.1.3.4 Swan-Ganz Katheter
Zusätzlich zu den schon aufgeführten Kathetern wurde an der rechten Vena jugularis
externa eine 8Fr Einführungsschleuse angelegt. Nun wurde ein Swan-Ganz Katheter
(Edwards Lifesciences, Irvine, California) mit den entsprechenden Anschlüssen zur
Druckmessung, Sauerstoffsättigung, und Herzminutenvolumenbestimmung
verbunden. Diese wurden danach mit dem Monitor konnektiert, und der Katheter mit
einem aufgeblasenen Ballon mit dem Blutstrom in die Pulmonalarterie
eingeschwemmt. Die Lage des Katheters wurde durch Kontrolle der Druckkurven im
rechten Vorhof, über dem rechten Ventrikel, bis in die Pulmonalarterie ermittelt. Nach
Eichung und Funktionsprüfung des arteriellen- und Swan-Ganz Katheters erfolgte die
subkutane Fixierung dieser.
3 Material und Methoden
28
3.2.1.4 Versuchsablauf
Alle Tiere wurden über 15 Minuten beobachtet bevor der Schock durch
Blutentnahme aus dem Sheldon-Katheter eingeleitet wurde. Die Senkung des MAP
auf 35 5 mmHg erfolgte innerhalb von maximal 15 Minuten. Danach wurde der
hämorrhagische Schock über 30 Minuten bei einem MAP von 35 5 mmHg, und
weitere 15 Minuten bei einem MAP von 40 5 mmHg durch intermittierende
Blutentnahmen aufrechterhalten.
Daraufhin wurde mit der Reperfusion der Tiere mit Hilfe von intravenös applizierter
kristalloider (Ringer-) Lösung begonnen.
Mit Beginn der Reperfusionsmaßnahmen kam bei der +LIM-Gruppe (n=12) das LIM-
System zum Einsatz, welches vorher mit NaCl-Lösung geflutet und danach mit
heparinisierter Kochsalzlösung gefüllt wurde. Das LIM wurde mit einer
Entlüftungskammer über zwei Schenkel des Sheldon-Katheters in den Blutkreislauf
eingeschaltet, und bei einer extrakorporalen Flussgeschwindigkeit von 300 ml/min
über 3 Stunden eingesetzt (Abb. 7).
Abb. 7: Katheterlage und LIM-System im Überblick (Lögters 2010)
Bei der nLIM-Gruppe fand kein extrakorporaler Kreislauf statt. Nach drei Stunden
wurde das LIM erneut mit Kochsalzlösung geflutet und dann diskonnektiert. Im
Anschluss wurden die Wunden verschlossen, die Narkose beendet und nach
Extubation das erwachende Schwein in die Stallungen zurücktransportiert.
Alle Tiere wurden dann über 48 (n=12, sechs Schweine pro Gruppe) bzw. 72
Stunden (n=12, sechs Schweine pro Gruppe) in ihren Einzelboxen beobachtet. Den
Versuchstieren wurde Blut über ein frei liegendes Sheldon-Katheterlumen zu den
prädefinierten Zeitpunkten abgenommen.
3 Material und Methoden
29
Nach Ablauf der 48 bzw. 72 Stunden brachte man die Tiere wiederum analgosediert,
intubiert und beatmet in den Operationssaal. Alle oben genannten Messinstrumente
wurden wieder angeschlossen. Nach einem Steady-state von 30 Minuten maß man
über 15 Minuten wiederholt die hämodynamischen Parameter und die letzten
Blutentnahmen wurden durchgeführt. Der Tod der Tiere wurde durch Infusion einer
letalen Dosis Kalium als Bolus i.v. herbeigeführt. Abschließend transportierte man die
Körper in den Sektionssaal, wo letztendlich die Autopsie stattfand.
3.2.1.5 Organentnahme und Histologie
Nach der Tötung der Tiere wurden die Körper in den Sektionssaal gebracht und
autopsiert. Verschiedene Organproben wurden entnommen und unmittelbar danach
in Formaldehyd gelagert. Andere Proben wurden unmittelbar in flüssigem Stickstoff
schockgefroren. Alle Proben wurden nachträglich nach Bedarf weiterverarbeitet.
3.2.1.6 Prädefinierte Blutabnahmen
Die Blutentnahmezeitpunkte für die Labor- und Zellanalysen wurden zuvor
standardisiert und festgelegt. „Präschock“ beschreibt den Zeitpunkt direkt vor Beginn
des Schocks nach Anlage aller Katheter. Der nächste Zeitpunkt „Ende Blutung“
wurde 15 Minuten nach Beginn des Schocks abgenommen. Als nächstes wurde eine
Blutentnahme 1 Stunde nach Schockbeginn, also am Ende des Schocks
durchgeführt und als „Ende Schock“ bezeichnet. Unmittelbar nach diesem Zeitpunkt
wurde das LIM-System mit anti-CD95 Beschichtung (+LIM, n = 12) und die
Standardbehandlung ohne extrakorporalen Kreislauf (nLIM, n = 12) angeschlossen
und die Reperfusion mit Ringer-Lösung begonnen. 15 Minuten nach Anschluss des
LIM-Systems („15 Min. LIM“) fand die nächste Blutabnahme statt. Nach weiteren 10
Minuten schloss sich eine erneute Blutabnahme an („25 Min. LIM“). Es erfolgten
dann nach 45, 75, 135 und zuletzt kurz vor Ende der OP bei 180 Minuten nach
Anschluss des LIM-Systems weitere Blutentnahmen. Zu jedem dieser Zeitpunkte
wurde ein EDTA-Röhrchen für ein unmittelbares Differentialblutbild angefertigt.
Zusätzlich dazu wurden 2 Serum-Röhrchen abgenommen, die im klinikeigenen Labor
zentrifugiert und zur späteren Weiterverarbeitung eingefroren wurden.
3 Material und Methoden
30
3.3 Untersuchungsmethoden
3.3.1 Hämodynamik
Um die posthämorrhagische Immunantwort zu untersuchen, musste ein
Schockmodell am Schwein etabliert werden. Dies wurde im Rahmen des
Tierexperiments durchgeführt. Hierzu wurden die hämodynamischen Parameter
Herzfrequenz (HF), Blutdruck (RR), mittlerer arterieller Druck (MAP), zentralvenöser
Druck (ZVD), Herzzeitvolumen (HZV), Sauerstoffpartialdruck (PO2) Kohlendioxid-
Partialdruck (PCO2), gemischtvenöse Sauerstoffsättigung (Sv02), mittlerer
pulmonalarterieller Druck (MPAP), pulmonokapillärer Verschlussdruck (PCWP),
Blutentnahme, Substitutionsmenge und Körperkerntemperatur alle 5 Minuten über
den gesamten Versuch registriert. Alle 10 Minuten wurde eine arterielle
Blutgasanalyse abgenommen und vor Ort sofort gemessen (Tab.2).
Tab. 2 Hämodynamische Parameter (Lögters 2010)
3 Material und Methoden
31
3.3.1.1 Mittlerer arterieller Druck (MAP)
Der mittlere arterielle Druck (MAP) war vor Versuchsbeginn in beiden
Versuchsgruppen auf einem vergleichbaren Niveau (75,7 2,57 mmHg nLIM; 75,2
3,11 mmHg +LIM). Nach 15 Minuten ab Blutungsbeginn betrug der MAP in den
Gruppen +LIM und nLIM 34,0 1,3 mmHg (Tab. 2). Im Verlauf weiterer 45 Minuten
stieg der MAP langsam auf einen Wert von 41,0 2,6 mmHg. Zu diesem Zeitpunkt
war das Ende der Schockphase festgelegt. Der totale Blutverlust durch die
kontrollierte Entblutung ergab 586 22 ml. Dies ergibt bei einem mittleren
Blutvolumen von ca. 65 ml/Kg Körpergewicht und einem mittleren Gewicht der
eingesetzten Schweine von 30,3 kg, einen Verlust von ca. 30% des totalen
zirkulierenden Blutvolumens.
Nachdem der MAP gegen Ende der Schockphase bei der nLIM-Gruppe 42,2 ± 2,6
mmHg und bei der +LIM-Gruppe bei 38,3 ± 2,1 mmHg lag, stieg dieser innerhalb der
ersten 15 Minuten der Reperfusionsphase auf einen Wert von 63,0 ± 3,37 mmHg bei
der nLIM-Gruppe und 55,5 ± 3,86 mmHg bei der +LIM-Gruppe.
60 Minuten nach Reperfusionsbeginn stellte sich der MAP allmählich in beiden
Gruppen auf einen Wert von 57,92 ± 1,47 mmHg bei nLIM und 51,0 ± 1,53 mmHg
bei +LIM ein. Im Verlauf der zweiten Stunde sank der MAP auf Werte von 55,58 ±
1,69 mmHg (nLIM) und 51,41 ± 2,16 mmHg (+LIM). Nach dreieinhalb Stunden wurde
der letzte MAP-Wert registriert. Dieser betrug 71% des Ausgangs-MAP von der nLIM-
Gruppe (54,57 ± 2,08 mmHg) und bei der +LIM -Gruppe 72% des Ausgangs-MAP
(54,33 ± 3,56 mmHg) (Abb. 8).
Bei Beobachtung 48 h nach Reperfusion wurden keine signifikanten Steigerungen
bezüglich des MAP bei der +LIM-Gruppe festgestellt (40,3 4,86 mmHg [p<0,05]).
Das MAP der nLIM-Gruppe erreichte Werte von 44,9 2,64 mmHg [p<0,05]. Bei
Betrachtung des MAP nach 72 Stunden, erkennt man eine eindeutige Steigerung des
Wertes in der +LIM-Gruppe (52,9 2,54 mmHg), wobei bei der nLIM-Gruppe lediglich
ein Wert von 43,8 2,63 mmHg zu verzeichnen war.
Abschließend ist zu erläutern, dass der MAP in beiden Versuchsgruppen innerhalb
von 72 Stunden nicht annähernd zu dem oben genannten Ausgangswert gekommen
ist (Witte 2010).
3 Material und Methoden
32
Abb. 8 MAP im Verlauf Schock-Reperfusion
3.3.1.2 Herzfrequenz (HF)
Die Herzfrequenz hatte in beiden Versuchsgruppen einen mittleren Ausgangswert
von 96,2 4,37 (+LIM) und 86,7 3,41 (nLIM) Schläge pro Minute (bpm). 15 Minuten
nach Entblutungsbeginn stieg die HF um 32 8,89 bpm. auf Werte von 122,6 7,0
bpm. Nach weiteren 45 Minuten, am Ende der Schockphase, nahm die HF bei nLIM
und +LIM bis auf einen Wert von 142 19,07 bpm im Mittel zu. Hierbei tendierte die
+LIM-Gruppe während der Schockphase zu höheren Herzfrequenzwerten, als dies
der Fall bei nLIM war.
Nachdem bei der Schockphase die Herzfrequenz beider Gruppen hoch angestiegen
war, ging die Differenz zwischen +LIM und nLIM bei der Herzfrequenz etwas
auseinander.
Die +LIM-Gruppe steuerte nach 15 Minuten Reperfusion Werte von 136,9 8,3 bpm
an, wohingegen die nLIM-Gruppe bei einem Wert von 118,3 9,2 bpm blieb. Diese
Tendenz war nach 60 Minuten Reperfusion umso deutlicher. Die Werte der nLIM-
Gruppe von 123,9 8,8 bpm unterlagen denen von der +LIM-Gruppe mit einem Wert
von 157,5 7,0 bpm. Nach 2 Stunden Post-Reperfusion ging die Tendenz etwas
zurück und zeigte Werte von 153,5 7,3 bpm bei +LIM und 130,5 10,3 bpm bei
Shock phase Resuscitation phase + no tretatment/treatment
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270
time [min]
mea
n ar
teria
l pre
ssur
e [m
mH
g]
SOC group EITFas group
3 Material und Methoden
33
nLIM. Am letzten gemessenen Zeitpunkt nach 3 Stunden betrug die Herzfrequenz bei
nLIM 122,2 11,8 bpm, und bei +LIM 145,1 6,9 bpm.
In der Nachbeobachtungsphase entwickelte sich die Herzfrequenz bei der nLIM-
Gruppe von 91,9 6,59 bpm nach 48 Stunden, bis auf 95,6 9,77 bpm nach 72
Stunden.
Im Gegensatz dazu verlief die Herzfrequenz bei +LIM von einem Wert nach 48
Stunden von 105,9 6,63 bpm, bis zum Erreichen von 90,0 5,0 bpm nach 72
Stunden (Witte 2010).
3.3.1.3 Herzzeitvolumen (HZV)
Das Herzzeitvolumen (HZV) betrug vor Schockbeginn in beiden Gruppen 3,1 0,12
(+LIM) und 3,0 0,13 (nLIM) l/min. Im Laufe der ersten 15 Minuten nach
Blutungseinleitung sank das Herzzeitvolumen kontinuierlich bis auf Werte von 1,71
0,14 l/min. In den nachfolgenden 45 Minuten, also bis Ende der Schockphase, stellte
sich das HZV auf einen Wert von 1,64 0,13 l/min ein.
Unmittelbar nach Einleitung der Reperfusion und des LIM-Systems stieg das HZV
kontinuierlich an, welches nach 15 Minuten Reperfusion bei der nLIM-Gruppe schon
2,25 0,14 l/min betrug. Analog dazu stieg auch bei der +LIM-Gruppe das HZV, und
zwar bis auf 2,04 0,14 l/min. Nach einer knappen halben Stunde erreichte das HZV
in der nLIM Gruppe den höchsten Wert seit Beginn des Versuchs (nLIM: 3,57 0,26
l/m), und schoss sogar über den Ausgangswert hinaus (2,95 0,13 l/min). Bei der
+LIM-Gruppe war eine ähnliche Steigerung (3,04 0,18 l/min) zu verzeichnen.
nach 3 Stunden Post-Reperfusionsbeginn stellte sich ein HZV-Wert von 2,15 0,22
l/min bei nLIM und von 2,05 0,18 bei +LIM ein.
Im Nachbeobachtungszeitpunkt von 48 Stunden sah man keinen signifikanten
Unterschied zwischen den Gruppen +LIM (2,3 0,30 l/min) und nLIM (2,3 0,23
l/min) im Vergleich zum letzten gemessenen Zeitpunkt während der
Reperfusionsphase zwei Tage zuvor.
Hingegen nach 72 h Beobachtung erreichte das HZV der +LIM-Gruppe einen Wert
von 3,1 0,24 l/min. Dieser Wert war mit dem Ausgangswert von 3,1 0,12 l/min
vergleichbar. Diese Aussage ließ sich bei der nLIM-Gruppe nicht wiederholen. nLIM
konnte einen Wert von lediglich 2,2 0,08 l/min aufweisen, der weit entfernt von dem
Ausgangswert von 3,0 0,13 l/min lag (Witte 2010).
3 Material und Methoden
34
3.3.1.4 Gemischtvenöse Sauerstoffsättigung (SvO2)
Der mittlere Ausgangswert vor Schockeinleitung für die SvO2 betrug 82,9 2,69 %
bei +LIM und 86,9 0,95 % bei nLIM (Tab. 2). Dieser Wert fiel im Verlauf der ersten
15 Minuten nach Blutungsbeginn schnell auf 62 6 %. Am Ende der 60 minütigen
Schockphase hielt sich die SvO2 um 61,6 8 %.
Mit Beginn der Reperfusion fing auch die SvO2 in beiden Gruppen allmählich an zu
steigen. 30 Minuten nach Beginn der Reperfusion und Einsatz des LIM- Systems
stieg die SvO2 auf Werte von 81,7 5,23 % bei der nLIM-Gruppe, und 78,8 10,1
bei der +LIM-Gruppe.
Im Verlauf bis 60 Minuten post-Reperfusionsbeginn fiel die SvO2 langsam auf Werte
von 79,6 4,70 % bei nLIM und 76,4 11,30 % bei +LIM. Hier fällt die deutliche
Standardabweichung der Werte in der +LIM-Gruppe auf.
2 Stunden nach Reperfusionsbeginn glich sich die SvO2 beider Versuchsgruppen an
(81,78 ± 6,04 % bei der nLIM-Gruppe und 80,9 ± 7,45 % bei der +LIM-Gruppe).
Nach 3 Stunden ab Reperfusionsbeginn zeigten sich in beiden Gruppen erneut leicht
fallende SvO2-Werte (nLIM: 78,56 3,97 %; +LIM: 76,6 10,23 %). Auffallend ist hier
erneut die große Standardabweichung der Werte von +LIM.
Im Verlauf der Nachbeobachtung zeigte die SvO2 zum Zeitpunkt von 48 Stunden
einen Wert von 56,0 2,47 % bei der nLIM-Gruppe und einen leicht höheren Wert
von 57,7 6,44 % bei der +LIM-Gruppe. Diese Tendenz zeigte sich erst recht nach
72 Stunden mit einer gemessenen SvO2 von 63,1 5,77 % bei +LIM und einen im
Vergleich zum letzten Zeitpunkt dieser Gruppe niedrigeren SvO2 Wert von 49,1
3,70 % bei nLIM (Witte 2010).
3.3.2 Laboranalysen
Während des gesamten Experiments wurden in prädefinierten Abständen mehrere
Blutproben entnommen. Diese Entnahmen dienten der Erfassung von Werten wie
Blutgase, Differentialblutbild, Elektrolyte, Entzündungsparameter, Leberwerte,
Retentionsparamenter und Gerinnungsparameter im Verlauf. Die Blutgasanalysen
sowie die Differentialblutbilder wurden sofort nach Entnahme in der
Tierversuchsanlage gemessen (ABL 700, Radiometer GmbH, Willich; VET-abc, scil
animal care Company, Viernheim). Die restlichen Parameter wurden im Zentrallabor
3 Material und Methoden
35
der Universitätsklinik Düsseldorf sowie im eigenen unfallchirurgischen Labor
gemessen.
3.3.2.1 Leukozytenzahl
Die Analyse der Leukozyten wurde im Verlauf des gesamten Experiments
durchgeführt. Die Ausgangswerte der nLIM und +LIM-Gruppen waren vergleichbar
(im Mittel 10,349 0,731 x10³/mm³). Unmittelbar nach Schockbeginn fiel die
Leukozytenzahl drastisch ab auf einen Wert von 6,821 0,55 x10³/mm³. Nach 60
Minuten Entblutung, am Ende der Schockphase, stieg die mittlere Leukozytenzahl
und betrug zu diesem Zeitpunkt 7,575 0,739 x10³/mm³.
Dieser Trend lässt sich im kompletten Verlauf der Reperfusionsphase verfolgen.
Anzumerken bleibt jedoch, dass es bei der +LIM-Gruppe zu einer erneuten Senkung
der Leukozyten im Verlauf der Reperfusion kam, die 90 Minuten nach Einsatz des
LIM-Systems ihren Höhepunkt erreichte, mit einem Wert von 5,758 0,736 x10³/mm³
im Vergleich zu 7,860 0,70 x10³/mm³ von nLIM. Diese Tendenz blieb über die
nächsten 30 Minuten bestehen, wo man trotz Steigerung der Leukozyten einen
parallelen Verlauf der Kurven beobachten konnte (+LIM: 6,440 0,995 x10³/mm³;
nLIM: 8,958 0,637 x10³/mm³). Diese Beziehung blieb bis Ende der
Reperfusionsphase nach 3 Stunden bestehen, wo folgende Werte gemessen
wurden: +LIM: 8,608 1,062 x10³/mm³; nLIM: 10,170 1,081 x10³/mm³.
Bei den Messungen nach 24 Stunden (nLIM: 10.9 ± 0.6 x 103/mm3; LIM: 11.7 ± 0.8 x
103/mm3), 48 Stunden (nLIM: 9.2 ± 0.6 vs. LIM: 9.7 ± 0.8), und 72 Stunden (nLIM: 9.3
± 1.0; LIM: 11.5 ± 1.5) haben keine erwähnenswerte Unterschiede bezüglich der
Neutrophilenanzahl zwischen den Gruppen stattgefunden. Auch bei der
Lymphozytenanzahl war kein Unterschied innerhalb der entsprechenden Zeitpunkte
zu verzeichnen (Ott 2010).
Durch die vorhergehenden Absätze 3.3.1 bis einschließlich 3.3.2 wurde gezeigt,
dass die Voraussetzungen, also das Herbeiführen eines adäquaten Schadens, zur
Überprüfung der posthämorrhagischen Immunantwort gegeben sind.
3 Material und Methoden
36
3.3.3 Proteinisolierung und -Bestimmung
Die in einem 1,5 ml großen Eppendorf-Gefäß befindlichen Gewebeproben wurden in
PBS, 1% Nonidet-P40 (NP40), 0.5 mM Natrium desoxycholat, 0.1 % Natrium dodecyl
Sulfat (SDS) suspendiert, und mit dem Protease-Inhibitor Complete- mini (Roche,
Mannheim) versehen. Danach wurden die Proben mit Hilfe eines Pistills mechanisch
homogenisiert, zusätzlich über Eis sonifiziert (Ultraschall-Prozessor UP50H,
Hielscher, Teltow) und bei 4°C für 15 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden
die Proben bei 8,000 g für 10 Minuten und 4°C zentrifugiert. Die
Proteinkonzentrationsbestimmung wurde mit dem Dc Protein Assay kit (Bio-Rad,
München) laut Herstellerangaben ermittelt.
3.3.4 RNA-Isolierung
Aus den bei -80°C gelagerten Gewebeproben wurden ca. 50 mg Gewebe gewonnen
und in 1 ml Trizol-Reagenz (Sigma, München) in 1,5 ml großen Eppendorf-Gefäßen
unter Benutzung eines Pistills homogenisiert. Das Homogenat wurde anschließend
fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um eine vollständige Dissoziation des
Nukleoproteinkomplexes zu erreichen.
Danach wurde die Phasenseparation durch Zugabe von 200 µl Chloroform (Sigma,
München) eingeleitet, die Proben dann mit Hilfe eines Vortexers 15 Sekunden lang
geschüttelt und nochmals fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Es folgte eine Zentrifugation der Proben für 15 Minuten bei 11200 UPM und 4°C.
Nach der Zentrifugation trennt sich das Probengemisch in eine untere rötliche Phase,
die aus Phenol-Chloroform besteht, in eine Interphase und in eine obere farblose
wässrige Phase. Die RNA befindet sich in der oberen Phase.
Diese Phase wurde vorsichtig abpippetiert und in ein frisches Reaktionsgefäß
überführt. Zur RNA-Ausfällung wurden 500 µl Isopropanol zugegeben, mit einem
Vortexer homogenisiert, 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend
10 Minuten bei 11200 UPM und 4°C zentrifugiert. Es entstand dabei ein RNA-
Präzipitat am Boden des Reaktionsgefäßes.
Der Überstand wurde vorsichtig entfernt und das RNA-Plättchen mit 1 ml 75 %
Ethanol versetzt, geschüttelt und anschließend mit 8800 UPM und 4°C zentrifugiert.
Der Überstand wurde verworfen und der Waschgang mit Ethanol wurde noch einmal
wiederholt. Am Ende des Verfahrens ließ man das RNA-Plättchen einige Minuten
lufttrocknen und löste es anschließend in 20 µl sterilem RNAse-freiem Wasser
3 Material und Methoden
37
(DEPC treated water, Invitrogen). 2 µl der Lösung wurden zur Bestimmung der
Konzentration entnommen.
Die RNA-Konzentration wurde mittels Spektralphotometrie bestimmt, wobei die
Probe im Verhältnis 1:40 mit DEPC-behandeltem Wasser verdünnt und die
Absorption bei 260 und 280 nm gemessen wurde.
Die Konzentration wurde gemäß folgender Gleichung errechnet:
c = OD260 x f x n [mg/dl]
c = Konzentration
OD = optische Dichte
f = Verdünnungsfaktor
n = 40 mg/dl für RNA
Die Reinheit der präparierten RNA wurde über das Verhältnis OD260 zu OD280
ermittelt.
3 Material und Methoden
38
3.3.5 Polymerase-Kettenreaktion
Die Total-RNA vom Gewebe wurde wie unter 3.3.3 beschrieben isoliert. 10 µl (=1µg)
dieser RNA wurden mit Hilfe einer reversen Transkriptase (Omniscript Reverse
Transcriptase, Qiagen, Hilden) und unter Benutzung von oligo (dT) 15 primer (Sigma,
München) laut Herstellerangaben in cDNA transkribiert. Die PCR (MyCycler, Biorad,
München) wurde mittels Gen-spezifische Primer-Sequenzen über 26 Zyklen für HO-1
(pHO-1-R: 5’-CGTAGCGCTTGGTGGCCTGCG-3´; -F: 5’-
CAGCCCAACAGCATGCCCCAG-3´, Genosys-Sigma, Munich, Germany) und 27
Zyklen für HIF-1α (pHIF-1α-R: 5’-AGGGACTCTGGATTTGGTTC-3´; -F: 5’-
TTTAGATTTGGCACAATGAC-3´, Genosys-Sigma, München) durchgeführt. Primers
für Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) (hGAPDH-R: 5’-
GAAGTCAGAGGAGACCACCA-3´; -F: 5’-CACCACCATGGAGAAGGCTG-3´,
Genosys-Sigma, München) wurden zur Qualitätskontrolle der eingesetzten cDNA mit
in die PCR eingeführt. 2.5 µl cDNA wurden unter Nutzung von Taq PCR Core Kit
(Qiagen, Hilden) amplifiziert. Die Produkte wurden auf 1.8% Agarosegel aufgetragen
und unter UV Licht nach Sybr Gold (Invitrogen, Karlsruhe) Färbung visualisiert
(Geldokumentationseinheit Biorad, München) und verarbeitet (Quantity One
Software, Biorad, München).
3.3.6 Western Blot
Je 30 µg Protein/Probe wurden mittels SDS Polyacrylamid Gel-Elektrophorese
getrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und mit Ponceau S
Färbung versetzt, um die entstandenen Banden sichtbar zu machen.
Diese Membranen wurden dann für 60 Minuten bei Raumtemperatur zusammen mit
TBS-Puffer inklusive 0.1 % Tween-20 und 5 % Milchpulver als blocking-Puffer
inkubiert. Nachfolgend fand die Inkubation mit dem primären Antikörper in TBS mit
0.1 % Tween-20 und 5 % bovines Serum-Albumin statt. Die eingesetzten primären
monoklonalen Antikörper gegen HO-1 und HIF-1 waren spezifisch gegen schweine-
HO-1 (Stressgen, Victoria, Canada) und HIF-1 (Novus Biologicals, Littleton, USA).
Nach drei Waschgängen in TBS + 0.1 % Tween-20 fand die Inkubation mit dem
sekundären, diesmal polyklonalen Ziege anti-Maus Antikörper (Dako Cytomation,
Glostrup, Denmark), in einer Verdünnung von 1:1,000 in TBS + 0.1 % Tween-20 für
60 Minuten, und nachträglich ebenfalls drei Mal gewaschen. Schließlich wurden die
entstandenen Banden mittels Chemilumineszenz visualisiert (SuperSignal West pico
3 Material und Methoden
39
Chemiluminescent Substrate, Pierce, Bonn, Germany). Nachträglich unterliefen die
Membranen einem Stripping, d.h. einem Waschen der Membranen zur Lösung vom
bereits vorhandenen Antikörper, um in einem nächsten Vorgang eine erneute
Inkubiation, diesmal mit einem polyklonalen Antikörper für Beta-Aktin (Santa Cruz,
Heidelberg, Germany) zu ermöglichen. Die Menge des spezifischen Proteins wurde
mittels Densitometrie quantifiziert (Quantity One, Bio-Rad, Munich, Germany).
3.3.7 TBARS-Assay
Die Messung von auf Thiobarbitursäure reaktive Substanzen (TBARS) ist eine
etablierte und gut durchzuführende Methode zum Screening und Monitoring der
Lipidperoxidation (Armstrong and Browne 1994; Yagi 1998). Lipidperoxide sind
Abkömmlinge von mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Diese sind instabil und
degradieren zu verschiedenen komplexen Verbindungen, unter anderen die
reaktiven Carbonylverbindungen wie das Malondialdehyd (MDA). Das MDA-TBA
Addukt wird durch die Reaktion von MDA und TBA bei hohen Temperaturen (90-
100°C) und saurem Milieu gebildet und wird kolorimetrisch bei 530-540 nm
gemessen.
Das TBARS Assay Kit (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI) besteht aus 5
Gefäßen, die folgende Reagenzien beinhalten:
Thiobarbitursäure (TBA) – Farbreagenz
TBA Acetsäure - 1:4 verdünnt mit HPLC-Wasser für Farbreagenz
TBA Natriumhydroxid (10x) -1:10 verdünnt mit HPLC-Wasser für Farbreagenz
TBA Malondialdehyd (MDA) Standard
TBA SDS Lösung.
Das TBARS –Assay kann mit verschiedenen Probetypen versetzt werden, wie z.B.
Serum, Plasma, Urin, Zell-Lysate und Gewebshomogenisaten. Im Rahmen dieser
Studie wurden Gewebshomogenisate verwendet.
Ca. 25 mg bei -80°C gefrorenes Gewebe pro Probe wurden in 1.5ml Eppendorf-
Gefäße überführt und mit 1ml RIPA Puffer, bestehend aus 1% NP-40 (Nonidet-P40,
Biomol), 0,5g 0.5%iges Na-deoxycholat, 0.1% SDS (Sigma) ad 100ml PBS
(Dublecco w/o Mg/Ca, Biochrom) mit Proteaseinhibitoren (Complete Mini, Roche)
versetzt. Nachfolgend wurde die Mischung mittels Pistill homogenisiert und
3 Material und Methoden
40
anschließend mit Hilfe von Ultraschall (Ultrasonic processor UP50H, Hielscher) für
15 Sekunden auf Eis sonifiziert. Die Röhrchen kamen dann bei 1600 x g für 10
Minuten und 4°C in die Zentrifuge. Der Überstand des Zentrifugats wurde mittels
Proteinkonzentrationsbestimmung (Dc Protein Assay, Biorad), auf 1mg Protein/ml
Lösung standardisiert, und für das für das TBARS- Assay am selben Tag
verwendet.
Alle Reagenzien, unter Ausschluss der Gewebeproben, wurden vor Assay-Beginn
auf Raumtemperatur äquilibriert. Daraufhin verteilte man alle Proben und Standards
nach vorgegebener Konzentration in Duplikat in eine 96-Loch-Platte.
Durchführung des TBARS-Assays
Alle 5 ml großen Proberöhrchen wurden nach Beschriftung mit 100 µl Gewebsprobe
oder Standard versetzt. Hinzu kamen 100 µl SDS-Lösung und die Mischung wurde
dann mit einem Vortexer homogenisiert. Anschließend fügte man 4 ml Farbreagenz
in jedes Röhrchen.
Die fertigen Röhrchen unterliefen einer Wärmebehandlung von einer Stunde bei
100°C im Wasserbad. Nach der Wärmebehandlung stoppte man die Reaktion, indem
man die behandelten Proben für 10 Minuten im Eisbad inkubierte. Nachträglich fand
die erneute Zentrifugation bei 1600 x g und 4°C statt. 150µl aus jedem Röhrchen
wurden dann in doppelter Ausführung in die 96-Loch-Platte hineinpippetiert.
Abschließend maß man die Farbabsorption bei 530-540 nm kolorimetrisch (Victor 3,
Perkin Elmer).
Die gemessenen Werte für MDA wurden für jede Probe nach Hersteller-Formel aus
der Standardkurve berechnet. Der dynamische Messbereich des Assays beträgt 0-50
µM (µM = µmol/Liter = nmol/ml) MDA Äquivalenten.
3.3.8 Histologie
Alle untersuchten Tiere innerhalb der Studie sowie auch fünf gesunde Tiere, die
ohne jegliche Therapie als Kontrollgruppe fungierten, wurden für die histologische
Weiterverarbeitung euthanasiert. Die Gewebeproben wurden in 4% Formaldehyd
fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet. Je 5 µm dicke Schnitte wurden mit
Hämatoxylin-Eosin für die histopathologischen Untersuchungen gefärbt. Ergänzend
wurde die Färbung mittels Chloracetatesterase durchgeführt, die als spezifische
3 Material und Methoden
41
Färbungsmethode für die Detektion und Quantifizierung der Gewebeinfiltration durch
neutrophile Granulozyten dient. Die neutrophilen Granulozyten wurden mit
standardisierten Zählkammern mikroskopisch gezählt (Axiovert 40, Zeiss, Jena).
Kurz darauf wurden unter Mikrometer-Einsatz (x10) die Neutrophilen in 10
verschiedenen Hochleistungsfeldern (engl. high power fields (HPF)) pro Schnitt
gezählt. Durchschnittswerte pro Organ und Tier wurden entsprechend in
prädefinierten Mengenbereichen eingeordnet (Zellen/0.09 mm2 [0-5, 6-10, 11-20, 21-
50, 51-100, 101-500]).
3.3.9 Statistik
Die statistische Analyse wurde mit Hilfe von SAS/Stat for Windows software (SAS
Institute, Inc, Cary, NC, version 8) und SPSS (SPSS, Inc, Chicago, IL, version 15)
berechnet. Die nicht-parametrische Varianzanalyse (ANOVA) der Rohdaten wurde
durchgeführt, um spezifische Unterschiede zwischen den untersuchten Gruppen
sowie auch im Zeitverlauf darzustellen. Die Daten wurden als signifikant eingestuft
bei einem p-Wert von <0,05. Der Van der Waerden two-sample test fand seinen
Einsatz bei der Bestimmung spezifischer Zwischengruppen-Unterschiede, und der
Wilcoxon paired test für die Verlaufsbeurteilung (Zeitpunkt versus Ausgangspunkt).
Alle Daten sind als Mittelwert +/- Standardfehler (SEM) dargestellt.
Für die Auswertung sowohl der Gen- und Proteinexpression von HIF-1α und HO-1
als auch der MDA-Konzentrationsanalyse wurde der nicht gepaarte t-Test benutzt,
ebenfalls mit einer statistischen Signifikanz ab p <0,05.
4 Ergebnisse
42
4. Ergebnisse
Im Folgenden werden die wichtigsten Ergebnisse zu den durch Hypoxie
beeinflussbaren Größen Malondialdehyd, Hämoxygenase-1 und Hypoxie-induzierter
Faktor 1α dargelegt.
Die dargebotenen Ergebnisse zu MDA, HO-1 und HIF-1α stellen den Schwerpunkt
der hier vorliegenden Arbeit dar und wurden selbstständig im Labor der Klinik für
Unfall- und Handchirurgie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf erarbeitet und
ausgewertet.
4.1 Hypoxieanalysen im Gewebe
Diese Untersuchung basiert auf dem Vergleich beider Versuchsgruppen, +LIM und
nLIM, und einem Bezug zu einer gesunden Kontrollgruppe (KG) unter Einsatz von
Hypoxieanalysen im Gewebe nach Euthanasie der Versuchstiere nach 48 bzw. 72
Stunden.
Zur Untersuchung eines möglichen hypoxisch bedingten Schadens auf Gewebe-
Ebene wurden drei durch Hypoxie beeinflussbare Größen herangezogen. Diese
sollten einen Vergleich zwischen den zwei untersuchten Gruppen +LIM und nLIM
ermöglichen bzw. dazu dienen, das Ausmaß einer hypoxischen Schädigung zu
quantifizieren.
4.1.1 Hypoxie-Induzierter Faktor 1α (HIF-1α)
Die Expression des Hypoxie induzierten Faktor-1α wurde auf Gen- und Proteinebene
analysiert.
Bei der Genanalyse mittels Polymerase-Kettenreaktion untersuchte man die
verschiedenen Gewebeproben auf eine erhöhte oder verminderte Expression von
HIF-1α nach 48 und 72 Stunden.
Die Proteinexpression wurde mittels Western Blot analysiert und die Gruppen +LIM
und nLIM zu den gleichen Zeitpunkten wie bei der Genexpression miteinander
verglichen.
4.1.1.1 Gen- und Proteinexpression nach 48 Stunden
Die Genanalyse von HIF-1α bei den nach 48 Stunden entnommenen Organen (Abb.
9-A) ergab am deutlichsten in der Lunge eine erhöhte Genexpression von HIF-1α
und zwar bei der nLIM-Gruppe mit einem Wert von 2,824 1,431 [n=3]. Die +LIM-
4 Ergebnisse
43
Gruppe hingegen zeigte eine relative Expression von 0,432 0,250 [n=3]. In der
Leber fand erneut bei nLIM die höchste Genexpression statt mit Werten von 1,136
0,490 [n=3] gefolgt von der Kontrollgruppe mit 0,508 0,249 [n=5]. An letzter Stelle
befand sich die +LIM-Gruppe mit einem Wert von 0,143 0,009 [n=3]. Im Herz war
die gleiche Relation wie in Lunge und Leber zu beobachten mit Werten von 0,828
0,383 [n=3] bei nLIM, 0,167 0,071 [n=5] bei der Kontrollgruppe und einem Wert von
0,109 0,029 [n=3] bei der +LIM-Gruppe. Bei der Auswertung der Expression in der
Milz sieht man eng beieinander liegende Werte bei nLIM (0,797 0,591 [n=2]) und
KG (0,770 0,307 [n=5]). Die niedrigste Expressionsrate ist in der +LIM-Gruppe zu
finden (0,204 0,084 [n=3]). Beim Vergleich der Werte in der Niere steigt die
Expression von HIF-1 ebenfalls bei nLIM am deutlichsten mit einem Wert von 0,635
0,572 [n=2]. Die Werte von +LIM und KG bleiben auf einem vergleichbar niedrigen
Niveau.
Die einzige Ausnahme in der Tendenz bildet der Darm, bei dem im Gegensatz zu
den anderen Organen dieser Reihe eine hohe Expressionsrate bei +LIM (0,862
0,726 [n=3] festzustellen ist, während nLIM (0,559 0,298 [n=3]) und KG (0,017 0
[n=1]) darunter liegen.
Abb. 9 Relative HIF-1α Gen (A)- und Proteinexpression (B) nach 48 Stunden
Bei Auswertung der Ergebnisse der Proteinexpression nach 48 Stunden (Abb. 9-B)
fällt eine Tendenz zu höheren Werten in den untersuchten Organen bei +LIM auf. Die
Lunge ist erneut das Organ mit der höchsten relativen Genexpression (+LIM: 4,471
2,221 [n=3]; nLIM: 2,723 0,057 [n=3]), diesmal gefolgt von Herz (+LIM: 2,841
4 Ergebnisse
44
0,640 [n=3]; nLIM: 1,796 0,302 [n=3]) und mit geringfügig niedrigerer Expression in
der Leber (+LIM: 2,797 0,967 [n=3]; nLIM: 1,953 0,432 [n=3]). Am wenigsten
auffällig verhält sich hier der Darm mit Expressionswerten von 1,319 0,537 [n=3]
bei +LIM und 1,953 0,432 [n=3]) bei nLIM.
4.1.1.2 Gen- und Proteinexpression nach 72 Stunden
Beinahe antiproportional zu den Werten nach 48 Stunden verhalten sich die
Ergebnisse bei der Genexpression nach 72 Stunden (Abb. 10-A). Die relative
Genexpression ist in der Lunge bei +LIM (3,792 0,450 [n=3]) signifikant am
höchsten [p=0,017], wobei nLIM einen Wert von 0,753 0,338 [n=2] aufweist. Auch
in dieser Reihenfolge verhält sich die Genexpression in Leber (+LIM: 0,977 0,521
[n=3]; KO: 0,508 0,249 [n=5]; nLIM: 0,330 0,162 [n=3]), Niere (+LIM: 0,857
0,466 [n=3]; nLIM: 0,512 0,221 [n=3]; KO: 0,087 0 [n=1]), Milz (+LIM: 0,845
0,511 [n=3]; KO: 0,770 0,307 [n=5]; nLIM: 0,523 0,210 [n=3]) und Herz (+LIM:
0,664 0,290 [n=3]; nLIM: 0,449 0,183 [n=3]; KO: 0,167 0,071 [n=5]). Der Darm
macht hier erneut die Ausnahme mit Werten von 2,702 1,466 [n=2] bei nLIM und
0,210 0 [n=1] bei +LIM.
Abb. 10 Relative HIF-1α Gen (A)- und Proteinexpression (B) nach 72 Stunden
( * = p<0,05)
Die Ergebnisse zur Proteinexpression nach 72 Stunden (Abb. 10-B) zeigen eine
allmähliche Angleichung der Werte gegenüber den Messungen nach 48 Stunden.
Allerdings wird die HIF-1 -Expression von +LIM im Herz (2,347 0,025 [n=3]) von
nLIM (3,148 0,341 [n=3]) übertroffen. In der Lunge lassen sich vergleichbare Werte
4 Ergebnisse
45
messen (+LIM:2,141 1,095 [n=3]; nLIM: 2,055 0,387 [n=3]) jedoch bei +LIM mit
einem außerordentlich großen Standardfehler. Die Leber zeigt annähernde Werte in
beiden Gruppen mit einem geringfügigen Überwiegen der Expression bei +LIM (1,640
0,356 [n=3]) verglichen mit nLIM (1,476 0,271 [n=3]). Der Darm weist erneut die
niedrigste Proteinexpression aller untersuchten Organe auf (+LIM: 0,713 0,215
[n=3]; nLIM: 0,623 0,141 [n=3]).
4.1.2 Hämoxygenase-1 (HO-1)
Die Expression von Hämoxygenase-1 wurde, wie auch diejenige von HIF-1α, auf
Gen- und Proteinebene analysiert. Bei der Genanalyse mittels Polymerase-
Kettenreaktion untersuchte man die verschiedenen Gewebeproben auf eine erhöhte
oder verminderte Expression von HO-1 nach 48 und 72 Stunden.
Die Proteinexpression wurde mittels Western Blot analysiert und die Gruppen +LIM
und nLIM zu den gleichen Zeitpunkten wie bei der Genexpression miteinander
verglichen.
4.1.2.1 Gen- und Proteinexpression nach 48 Stunden
Die relative HO-1 Genexpression nach 48 Stunden (Abb. 11-A u. B) war am größten
in der Milz, mit dem höchsten Wert in der KG (3,995 1,089; n=5), gefolgt von nLIM
(3,714 3,174; n=2) und zuletzt +LIM (1,077 0,286; n=3). Danach folgte die
Konzentration in der Lunge mit Werten von 3,574 1,732 bei nLIM (n=3) und 0,486
0,107 bei +LIM (n=3). An dritter Stelle kam die Leber (KG: 1,075 0,373 [n=5]; nLIM:
0,990 0,931[n=2]; +LIM: 0,252 0,139 [n=3]) gefolgt von Niere (nLIM: 0,832 0,767
[n=2]; KG: 0,440 0 [n=1]; +LIM: 0,213 0,007 [n=3]), Darm (nLIM: 0,787 0,336
[n=3]; KG: 0,417 0 [n=1]; +LIM: 0,348 0,245 [n=3]) und Herz (nLIM: 0,833 0,447
[n=3]; KG: 0,180 0,084 [n=5]; +LIM: 0,103 0,029 [n=3]) mit vergleichbar niedriger
Expression.
4 Ergebnisse
46
Abb. 11 Relative HO-1 Genexpression nach 48 Stunden. A: Diagramm; B: PCR
Zusammenfassend für diesen Zeitpunkt lässt sich festhalten, dass in der +LIM-
Gruppe vor allem in der Lunge der Nachweis einer stark erniedrigten
Hämoxygenase-1 Genexpression gegenüber der nLIM-Gruppe zu verzeichnen ist.
Außerdem sind in Darm und Niere ähnliche, wenn auch weniger ausgeprägte
Tendenzen zu beobachten. Allerdings sind einige Ergebnisse wegen der kleinen
Gruppenzahlen mit hohen Standardfehlern versehen.
Bei Betrachtung der relativen Proteinexpression nach 48 Stunden (Abb. 12) sieht
man im Vergleich +LIM [n=3] zu nLIM [n=3] den größten Unterschied in der Lunge, wo
die relative Proteinexpression von HO-1 bei +LIM den Höchstwert von 0,608 0,155
und bei nLIM einen Wert von 0,231 0,070 aufweist. Die Expression im Herz folgt mit
einem höheren Wert bei nLIM von 0,358 0,023, und +LIM mit 0,322 0,096. In der
Leber zeigen sich vergleichbare Werte, jedoch mit einem deutlicheren Unterschied
zwischen nLIM (0,326 0,036) und +LIM (0,197 0,033). Die niedrigste
Expressionsrate ist im Darm zu finden, wo +LIM (0,203 0,056) den geringfügig
höheren Wert aufweist. Die nLIM-Expression beträgt hier 0,173 0,040 und ist damit
die niedrigste des gesamten Mess-Zeitpunktes.
4 Ergebnisse
47
Abb. 12 Relative HO-1 Proteinexpression nach 48 Stunden 4.1.2.2 Gen- und Proteinexpression nach 72 Stunden
Die relative Genexpression von HO-1 nach 72 Stunden (Abb. 13) zeigt die höchsten
Werte in der Milz (KG: 3,955 1,089 [n=5]; +LIM: 1,799 1,011 [n=3]; nLIM: 1,509
1,047 [n=3]), gefolgt von Darm (nLIM: 3,909 2,953 [n=2]; KG: 0,417 0 [n=1]; +LIM:
0,191 0 [n=1]) und Lunge (+LIM: 3,830 1,497 [n=2]; nLIM: 1,046 0,712 [n=2]).
Niedrigere Werte wurden in Niere (nLIM: 1,668 0,804 [n=3]; +LIM: 0,813 0,564
[n=3]; KG: 0,440 0 [n=1]), Leber (nLIM: 1,338 0,785 [n=3]; +LIM: 1,274 0,609
[n=3]; KG: 1,075 0,373 [n=5]) und Herz (+LIM: 0,596 0,238 [n=3]; nLIM: 0,445
0,194 [n=3]; KG: 0,180 0,084 [n=5]) festgestellt.
4 Ergebnisse
48
Abb. 13 Relative HO-1 Genexpression nach 72 Stunden
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Tendenz zur höheren HO-1 Genexpression im
Darm aus Abb. 11-A bei der nLIM-Gruppe in diesem Zeitraum noch stärker zum
Vorschein tritt, ebenso in der Niere. Demgegenüber bleibt zu verzeichnen, dass es in
der Lunge zu einer Umkehr der in Abb. 11-A dargestellten Verhältnisse mit erhöhten
Werten bei +LIM kommt.
Bei Betrachtung der Proteinexpression nach 72 Stunden (Abb. 14 A u. B) fällt auf,
dass die relative Proteinexpression von HO-1 bei nLIM in allen gemessenen Organen
durchweg die höhere Konzentration aufweist als die von +LIM. In der Lunge
beginnend findet man eine relative Expression von 0,939 0,672 [n=2] bei nLIM und
bei +LIM von 0,427 0,255 [n=3]. Dahinter liegt das Herz mit Expressionswerten von
0,912 0,716 [n=2] bei nLIM und von 0,433 0,337 [n=3] bei +LIM. Im Darm bleibt
die Tendenz erhalten mit Werten von 0,696 0,451 [n=3] bei nLIM und von 0,237
0,232 [n=3] bei +LIM. Als letztes und mit einer fast deckungsgleichen
Proteinexpression erscheint die Leber mit einem Wert von 0,411 0,210 [n=2] bei
nLIM und von 0,409 0,336 [n=3] bei +LIM.
4 Ergebnisse
49
Abb. 14 Relative HO-1 Proteinexpression nach 72 Stunden. A: Diagramm; B: Western Blot
Bei Anblick der Ergebnisse der Genexpression von HO-1 nach 48 Stunden (Abb.11-
A u. B) und Vergleich mit den Ergebnissen der Proteinexpression von HO-1 nach 72
Stunden (Abb.14-A u. B) kann man eine Korrelation der Werte im Verlauf
beobachten. Diese zeigt, dass die Genexpression von HO-1 einen Höchstwert nach
48 Stunden und der Höchstwert für die Proteinexpression nach 72 Stunden erreicht
wird. Diese Ähnlichkeiten sind vor allem in Darm, Lunge und Leber reproduzierbar
und gelten sowohl für die +LIM-Gruppe, als auch für die nLIM-Gruppe. Diese
Tendenz wird in den anderen untersuchten Organen nicht gefunden.
4.1.3 Lipidperoxidation (Malondialdehyd-Assay)
Die Analysen zur Lipidperoxidation wurden, wie bei den Messungen von Gen- und
Proteinexpression von HIF-1α und HO-1, nach 48 und 72 Stunden durchgeführt.
Die Malondialdehydkonzentration als Anzeichen für erhöhte Lipidperoxidation im
Gewebe war in beiden Gruppen (+LIM-Gruppe, nLIM-Gruppe) in allen untersuchten
Geweben außer der Leber höher als die der Kontrollgruppe.
Bei Beobachtung der Werte nach 48 Stunden (Abb. 15) sieht man eine erhöhte
Konzentration von MDA pro mg Protein im Darm der nLIM-Gruppe (100 µM), gefolgt
von der +LIM-Gruppe (67 µM) und zuletzt die Kontrollgruppe (22 µM). In der Lunge
war der Unterschied zwischen nLIM und +LIM sehr gering (36 zu 38 µM) mit einer
erneut niedrigen MDA-Konzentration von 20 µM in der Kontrollgruppe. In der Leber
befand sich die niedrigste Konzentration aller Gewebe mit dem kleinsten
4 Ergebnisse
50
Konzentrationsunterschied zwischen den Gruppen (KG: 38 µM; nLIM: 22 µM; +LIM:
21 µM).
Abb. 15 Malondialdehyd (MDA)-Konzentration nach 48 Stunden
In der Analyse nach 72 Stunden erzielte die MDA-Konzentration im Darm der nLIM-
Gruppe erneut den höchsten, diesmal signifikanten Wert von 144µM [p=0,0104]
(Abb. 16) im Vergleich zu +LIM. Die Werte von +LIM und KG waren deutlich niedriger
(KG: 32 µM; +LIM: 20 µM). Die Ergebnisse der MDA-Konzentration in der Lunge
zeigten eine Erhöhung der Werte von +LIM und nLIM im Vergleich zu jenen nach 48
Stunden. Die Konzentration bei nLIM stieg auf 75 µM, wobei die +LIM-Konzentration
einen Wert von 50 µM erreichte. Die Kontrollgruppe zeigte einen kaum veränderten
Wert von 19 µM. Die Leber blieb bei Werten von 34 µM bei der Kontrollgruppe, 20
µM bei nLIM und 20,5 µM bei +LIM.
4 Ergebnisse
51
Abb. 16 Malondialdehyd (MDA)-Konzentration nach 72 Stunden ( * = p<0,05)
5 Diskussion
52
5. Diskussion
Die Hauptvoraussetzung für den Erfolg der Untersuchungen dieser Arbeit bestand in
der Herbeiführung eines reproduzierbaren Schadens durch akuten Blutverlust mit
nachfolgend ausreichender Stressreaktion im Schweinemodell.
In dem in dieser Arbeit etablierten Großtiermodell mit hämorrhagischem Schock
konnte eine deutliche Stressreaktion mit gestörter Hämodynamik, Gewebeinfiltration
mit neutrophilen Granulozyten, Lipidperoxidation in Darm, Lunge und Leber über
einen Beobachtungszeitraum bis 72 Stunden gezeigt werden.
Die schnelle unspezifische Hyperaktivierung des angeborenen Immunsystems nach
einem schweren Trauma wird als ein wesentlicher Auslöser für schwere
Folgeerscheinungen, wie etwa die Zerstörung der endothelialen oder epithelialen
Integrität mit Mikrozirkulationsstörungen und Organversagen, angesehen (Weiss
1989; Brown, Brain et al. 2006; Lenz, Franklin et al. 2007; Scholz, Cinatl et al. 2007;
van Meurs, Wulfert et al. 2008). Klinisch sind Darm, Nieren, Lungen, Leber und
Herz betroffen (McCloskey, Kameneva et al. 2004; Sato, Tanaka et al. 2007; Toda,
Takahashi et al. 2007; Zakaria el, Campbell et al. 2007). Neutrophile Granulozyten
sind wichtige Effektorzellen des angeborenen unspezifischen Immunsystems. Die
schnelle Aktivierung wird durch die Ausschüttung von 1011 Zellen pro Tag getrieben
(Brown, Brain et al. 2006; Lenz, Franklin et al. 2007). Chemokine, die in
geschädigten oder infizierten Geweben ausgeschüttet werden, locken zirkulierende
neutrophile Granulozyten an (Bone 1996; Lomas, Chung et al. 2003; Maier, Lefering
et al. 2007; van Meurs, Wulfert et al. 2008), worauf im Gewebe zusätzlich
schädigende Faktoren, wie proinflammatorische Zytokine, Proteasen und
Sauerstoffradikale ausgeschüttet werden bzw. entstehen (Bone 1996; Lenz, Franklin
et al. 2007; Scholz, Cinatl et al. 2007). Eine gestörte Gegenregulation dieser
neutrophilen Hyperaktivierung führt, vorangetrieben u.a. durch G-CSF u. GM-CSF,
zur Verlängerung der Neutrophilen-Lebenszeit sowie Verweilzeit innerhalb des
Gewebes (Keel and Trentz 2005), zur weiteren Zerstörung von zellulären Strukturen
und der Extrazellulärmatrix und zu oxidativem Stress mit Lipidperoxidation (Kaminski,
Bonda et al. 2002). Mechanismen, die zu einer verlängerten Lebenszeit der
Neutrophilen führt, sind verschiedene Faktoren, die den programmierten Zelltod der
Neutrophilen verhindern oder verzögern. Beispiele dafür sind die Inhibitoren von
Apoptoseproteine (IAPs), Granulozyten/Makrophagen kolonienstimulierende
5 Diskussion
53
Faktoren (GM-CSF) und Granulozyten kolonienstimulierende Faktoren (G-CSF)
(Lee, Whyte et al. 1993).
In einer eigenen Studie konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass Traumapatienten
sehr hohe Konzentrationen von GM-CSF im Serum aufweisen. Ein Zusammenhang
zwischen GM-CSF mit einer Apoptoseresistenz wurde bereits beschrieben (Watson,
Rotstein et al. 1997; Watson, Rotstein et al. 1997; Ertel, Keel et al. 1998).
Tatsächlich fanden wir eine erhöhte anti-apoptotische MCL-Genexpression und
Proteinexpression in frisch isolierten Neutrophilen aus Patienten mit schwerem
Trauma (Paunel-Gorgulu, Zornig et al. 2009). Die Arbeitshypothese unserer
Forschungsgruppe war daher, therapeutische Strategien zu entwickeln, die eine
Apoptose-Resistenz und somit die Entstehung Neutrophilen-vermittelter
Organschädigungen in der frühen posttraumatischen Phase überwinden.
5.1 Das Fas/FasL-System als Zielobjekt bei hämorrhagischem
Schock/Reperfusion
Das Fas/FasL (CD95/CD95L)-System ist möglicherweise das wichtigste
physiologische System zur Gegenregulation der Neutrophilen-Hyperaktivität. Darüber
hinaus spielt Fas/FasL offenbar auch eine bedeutende Rolle bei der Steuerung
wichtiger Effektorfunktionen (Cinatl, Blaheta et al. 2000; Peter, Budd et al. 2007). Wir
konnten beispielsweise kürzlich zeigen, dass membrangebundenes anti-Fas IgM
adhärierende Neutrophile in wenigen Minuten inaktivierte. Die chemotaktische
Aktivität, die transepitheliale Migration und die Zellmotilität waren nahezu blockiert
(Scholz and Cinatl 2005). Dies führte zu der Idee, dass immobilisiertes
agonistisches Fas für therapeutische Zwecke in extrakorporalen Immuntherapie-
Systemen eingesetzt werden könnte.
Die Machbarkeit solcher Systeme, bei denen ein agonistischer anti-Fas IgM-
Antikörper auf einer biokompatiblen Polyurethan-Oberfläche kovalent gebunden wird,
wurde bereits bei herzchirurgischen Patienten, in experimentellen Tierversuchen und
auch in klinischen Studien gezeigt. Zudem ist ein Verfahren mit Verwendung
immobilisierter biofunktioneller Effektormoleküle zur extrakorporalen Behandlung des
Patienten-Blutes wesentlich ungefährlicher als eine systemische Applikation z.B mit
therapeutischen Antikörpern. Experimentell konnte bereits gezeigt werden, dass
5 Diskussion
54
systemisch appliziertes anti-Fas zu Leberschädigungen und zu Lungenfibrose führt
(Ogasawara, Watanabe-Fukunaga et al. 1993; Hagimoto, Kuwano et al. 1997).
Um nun die Effekte einer extrakorporalen Immuntherapie auf der Basis von anti-Fas-
IgM auf die Limitierung von posthämorrhagischen Immunstörungen zu untersuchen,
wurde ein künstlicher Kreislauf, bestehend aus einem Sheldon-Katheter, einem
Schlauchsystem, einer Pumpe und einer funktionellen Einheit, für den Einsatz bei
Großtieren entwickelt. Die funktionelle Einheit wurde von unserer Forschungsgruppe
mitentwickelt und wird als Leukozyten-Inhibitions-Modul (LIM) bezeichnet.
5.2 Einstellung und Etablierung eines hämorrhagischen
Schockmodells im Schwein
Die Etablierung des Schockmodells im Schwein wurde im Rahmen dieser
Dissertationsarbeit durchgeführt. Das Modell wurde so gewählt, dass eine
Absenkung des MAP auf 35 +/- 5 mmHg über 45 Minuten standardisiert eingestellt
wurde. Eine erhöhte Herzfrequenz war ein Maß für die physiologische
Gegensteuerung des Tieres. Fünf gesunde Tiere dienten als Kontrolltiere zur
Bestimmung der Normalwerte und der normalen Histologie. Im Rahmen der Studie
wurde eine „Standard medical care“ (SMC) bzw. nLIM-Therapiegruppe mit einer
+LIM-Therapiegruppe verglichen.
Der den Schweinen zugefügte hämorrhagische Schaden hatte eine deutliche
Beeinflussung der Hämodynamik als Folge (Witte 2010), mit schocktypischen
Veränderungen in Herzfrequenz, mittlerem arteriellen Blutdruck und Herzzeitvolumen
(Allgower and Burri 1968; Birkhahn, Gaeta et al. 2005) (Falk, O'Brien et al. 1992).
Die schockspezifischen Laborveränderungen konnten teilweise repräsentiert werden.
So wurde ein deutlicher Anstieg der Leukozyten festgestellt. Man setzte auf diese
Erkenntnis basierend besonderes Augenmerk auf die Neutrophilen- und
Lymphozytenfraktion der Leukozyten (Ott 2010). Die neutrophilen Granulozyten
zeigten ein sehr ähnliches Verhalten im Verlauf wie das der Leukozyten, wohingegen
der Kurvenverlauf der Lymphozyten flach und nicht ansteigend war. Dies gilt als
Beweis, dass die neutrophilen Granulozyten durch Ischämie/Reperfusion isoliert
stimuliert wurden.
5 Diskussion
55
Zu diskutieren bleibt aber der in diesem Modell ausgebliebene Anstieg des
Lactatwertes als Zeichen eines hohen anaeroben Stoffwechsels und Indikator für
eine erhöhte Morbidität und Mortalität nach Trauma (Nguyen, Loomba et al.; Nguyen,
Rivers et al. 2004; Mikkelsen, Miltiades et al. 2009). Vergangene Studien konnten
u.a. den Lactatwert als Richtwert für die Magnitude eines hämorrhagischen Schocks
am Schwein verwenden (Rixen, Raum et al. 2001). Noch bleibt zu klären, aus
welchem Grund es im Rahmen unseres Schockmodells isoliert nicht zu einem
Anstieg von Lactat, jedoch zu einer relativen metabolischen Azidose kam. Dies kann
als Ausdruck eines nicht ausreichenden hämorrhagischen Schocks gewertet
werden. Eine andere Möglichkeit für die Diskrepanz der Lactatwete kann die für
unsere Studie gewälte Schweinerasse darstellen. Es liegen bislang noch keine
vergleichenden Studien über hämorrhagischem Schock am Münchner Minischwein
vor.
5.3 Überprüfung der posthämorrhagischen Immunantwort anhand
inflammatorisch/hypoxischer Parameter
Ziel der Überprüfung der hämorrhagischen Immunantwort war, anhand von drei
Größen die Unterschiede bezüglich posthämorrhagischer Organschädigung/
Hypoxieasusprägung von nLIM und +LIM zu untersuchen. Wie oben bereits erwähnt,
dienten dafür die Lipidperoxidation im Gewebe und die Expression von
Hämoxygenase-1 (HO-1) und Hypoxie-induzierter Faktor 1α (HIF-1α).
Die durchgeführten Untersuchungen zur Lipidperoxidation im Gewebe ergaben einen
Unterschied zwischen den Gruppen nLIM und +LIM, mit einer messbar verminderten
Lipidperoxidation im Gewebe der +LIM-Gruppe als Zeichen für einen niedrigeren
oxidativen Stress nach Hypoxie/Reperfusion. Dieser Unterschied zeigte die größte
Ausprägung im Darm, vor Lunge und Leber. Dies kann dadurch erklärt werden, dass
der Darm bei Hypoxie/Reperfusion als sehr anfälliges Organ reagiert, mit einer
deutlichen Empfindlichkeit gegenüber Hypoxiezuständen. Pathophysiologisch kann
folgendes postuliert werden: Eine erhöhte Lipidperoxidation im Darm führt zur
Ansammlung freier Radikale (Green and Reed 1998), Schädigung von
Lipidmembranen und Inhibierung metabolischer Prozesse in der Zelle (Nigam and
Schewe 2000). Als Folge dessen entsteht eine Permeabilitätsstörung auf zellulärer
Ebene, die ihrerseits die bekannten Schockfolgen im Darm hervorrufen können.
Dazu zählen unter anderem die postischämische Darmnekrose, die ischämische
5 Diskussion
56
Kolitis und schließlich die Sepsis aufgrund einer Durchwanderung von pathogenen
Erregern durch die vorgeschädigte Darmwand.
Die Untersuchungen zur relativen Expression von HO-1 ergaben eine verminderte
Gen- und Proteinexpression insbesondere im Darm der +LIM-Versuchsgruppe. Dies
kann als negative Folge des Einsatzes von LIM gewertet werden, da wie bereits
oben erwähnt, die Hämoxygenase einen protektiven Effekt bei Ischämie/Reperfusion
darstellt. Eine alternative Interpretation ist, dass von einer reaktiven HO-1 Expression
proportional zu einem Ischämie/Reperfusionsschaden ausgegangen wird. Ist diese
als Maß für eine mögliche Organschädigung definiert, bedeutet der Umkehrschluss,
dass bei der +LIM-Gruppe ein geringerer Organschaden stattgefunden hat. Im
Gegensatz dazu war die Lungen-HO-1 Expression bei der +LIM-Gruppe höher als die
der nLIM-Gruppe. Als Ursache dafür könnte eine gewisse Schädigung des
Lungengewebes durch den Einsatz von LIM zugrunde liegen. Dies konnte allerdings
histopathologisch nicht bestätigt werden (Ott 2010).
Ein weiteres erwähnenswertes Ergebnis stellt die Korrelation von relativer Gen- und
Proteinexpression von HO-1 dar. Die Ergebnisse zur Genexpression nach 48
Stunden korrelierten im Darm, Herz und Lunge mit den Proteinexpressionswerten
nach 72 Stunden Beobachtungszeit. Dies kann als Zeitfenster von ca. 24 Stunden
zwischen Genexpression und Proteinexpression im Bezug auf einen hypoxischen
Stimulus gewertet werden. Allerdings konnten diese Ergebnisse nicht in allen
untersuchten Organen reproduziert werden. Die entsprechend durchgeführte
Analyse der Ergebnisse bei der Expression von HIF-1α zeigte ebenfalls keinerlei
Korrelation zu den Ergebnissen von HO-1, sodass diese Annahme möglicherweise
einen Zufall darstellen kann.
Bei Betrachtung der Gen- und Proteinexpressionsergebnisse von HIF-1α konnten
weder statistisch signifikante Ergebnisse noch richtungsweisende Tendenzen
interpretiert werden. Eine Auffälligkeit beschreibt die relative Genexpression von HIF-
1α nach 72 Stunden im Vergleich zu 48 Stunden. Der Darm bot als einziges Organ
einen antiproportionalen Verlauf der Genexpression von +LIM im Vergleich zu nLIM:
Zunächst kam es nach 48 Stunden zu einer höheren HIF-1α Genexpression im
Darm, entgegen der Expression in allen anderen Organen. Nach 72 Stunden zeigte
der Darm hingegen als einziges Organ eine geringere HIF-1α Genexpression. Eine
mögliche Erklärung für diese Beobachtung könnte mit dem zugrundeliegenden
höheren Zellumsatz im Darm zusammenhängen.
5 Diskussion
57
Die Interaktionen zwischen den Regulationsmechanismen von HO-1 und
insbesondere von HIF-1α sollten aufgrund ihrer Komplexität in Folgestudien näher
untersucht werden.
5.4 Testung der LIM-Effektivität und Unbedenklichkeit
Hauptvoraussetzung für den Einsatz von LIM am Menschen ist zum einen eine
Mortalitätssenkung im Vergleich zu den herkömmlichen Therapieverfahren und zum
anderen ein möglichst geringes Risiko an Nebenwirkungen und Komplikationen.
Die untersuchten Parameter zur Hämodynamik zeigten eine tendenzielle Besserung
bei der +LIM-Gruppe, insbesondere bezüglich des mittleren arteriellen Drucks. Bei
Betrachtung der Gesamtergebnisse von MAP konnte man gruppenspezifisch einen
Wert von 61 % bei der nLIM-Gruppe und 71,5 % bei der +LIM-Gruppe zum zuletzt
gemessenen Zeitpunkt im Vergleich zum Ausgangs-MAP feststellen (Witte 2010).
Dieses Ergebnis kann als Fundament für eine bessere postischämische
hämodynamische Antwort nach LIM-Therapie gedeutet werden.
Eine Erklärung für die verminderte Organschädigung durch die transiente Therapie
mit LIM ist die bereits früher nachgewiesene Hemmung der Neutrophilen-Motilität.
Dies könnte eine Inhibition der Fähigkeit der Neutrophilen in Gewebe zu migrieren
bzw. auf chemotaktische Reize zu reagieren zur Folge haben.
Histopathologische Analysen von post-hämorrhagischen Organen der +LIM-Gruppe
zeigten geringere Zahlen infiltrierter Neutrophilen in verschiedenen Organen im
Vergleich zur SMC-Gruppe (Abb.17), aber insbesondere in der Lunge (Ott 2010).
Dies war zum Teil in Einklang mit einer verbesserten Organfunktion zu sehen.
5 Diskussion
58
Abb. 17 Chloracetat-Esterase Färbung der Paraffinschnitte aus Lunge, Herz, Niere, Leber und Darm bei der Kontrollgruppe, nLIM und +LIM (Lögters 2010)
Die Hämoxygenase-Aktivität konnte durch den Einsatz von LIM verringert werden,
was als tendenzielle Reduktion des postischämischen Schadens zu werten ist.
In Bezug auf die Unbedenklichkeit von LIM galt als Herausforderung an die
Herstellung der funktionellen Einheit des LIM, die kovalent gebundenen Antikörper
resistent gegen Sterilisation zu machen. Dies gelang mit Hilfe einer speziellen
Beschichtung auf dem Polyurethanschaum. Andererseits durften sich die
gebundenen anti-Fas IgM Antikörper von der Polyurethanmembran nicht lösen, in die
Blutbahn gelangen und dabei potentiell systemische Schädigungen hervorrufen.
Inwiefern es durch die funktionelle Einheit von LIM zu einem Anstieg von HO-1 im
Lungengewebe kommen konnte, war histopathologisch nicht nachzuvollziehen.
Einen Anhalt für eine signifikante Gefahr von LIM konnte im Rahmen dieser Studie
nicht gefunden werden.
Ein entscheidendes Ergebnis dieser Arbeit ist, dass die Lipidperoxidation, also die
oxidativ bedingte Schädingung der Zellmembranen im Gewebe, in der +LIM-Gruppe
weniger ausgeprägt war als in der nLIM-Gruppe. Interessanterweise war die
Lipidperoxidation im Darm besonders stark. Dies entspricht der klinischen Situation,
bei der die Durchblutung des Darms von Patienten nach schwerem Trauma
schwerwiegend gestört ist. Eine Dysfunktion bzw. Perforation der Darmwand führt
wiederum zur Dissemination von pathogenen Erregern. In Folge davon ist das Risiko
SOC group
EITFas group
No shock
Lung Heart Kidney Liver Bowel
5 Diskussion
59
zur Erlangung einer Sepsis stark erhöht. Es bleibt daraufhin kritisch zu hinterfragen
bzw. untersuchen, inwiefern der LIM-Einsatz ein erhöhtes Risiko für die Entstehung
eines septischen Geschehens darstellt. Allerdings waren histologisch in den
Darmschnitten relativ wenige Neutrophile detektiert worden (Ott 2010). Ob die
schädigenden Granulozyten innerhalb des Darmgewebes möglicherweise schneller
umgesetzt werden, also schneller von phagozytierenden Zellen abgeräumt werden,
oder in Netose gehen, ist unklar.
Netose, ein neues Paradigma zur Rolle der aktivierten Neutrophilen, die durch
Auswerfen ihrer DNA bakterielle Keime abfangen, könnte auch eine
pathophysiologische Rolle in geschädigten Organen spielen, da die ausgeworfene
DNA bzw. die Netze proinflammatorische Zytokine und Effektormoleküle beinhalten.
Diese könnten auch nach Verschwinden der Neutrophilen-Hülle schädigend wirken.
Die Resultate aus dieser Arbeit unterstreichen die Wertigkeit einer extrakorporalen
Immuntherapie auf der Basis immobilisierter anti-Fas-Antikörper. Der Einsatz eines
solchen künstlichen Kreislaufs kann vermutlich nur auf Intensivstationen stattfinden.
Prospektive Analysen zum möglichen Einsatz des LIM bei Patienten auf der
Intensivstation werden derzeit durchgeführt. Fokus ist dabei, den besten Zeitpunkt
eines LIM-Einsatzes zu definieren. Patienten, die länger als zwei Tage auf der
Intensivstation sind und eine Indikation zur Hämodialyse haben, sollen in erster Linie
als Studienkohorte angesehen werden. Das LIM könnte in die bestehenden
Schlauchsysteme der Hämodialyse-Apparate integriert werden. Allerdings wird die
Hemmung von Neutrophilen bislang auch kontrovers diskutiert. So könnte bei einer
Kontamination mit pathogenen Keimen die anti-bakterielle Aktivität der Neutrophilen
gehemmt werden, so dass das Risiko einer Sepsisentstehung möglicherweise erhöht
ist. Der Vorteil einer LIM-Behandlung wäre andererseits die Prävention der
inflammatorisch bedingten Zerstörung von Darmepithelien und somit der Ansiedlung
von Pathogenen im Gewebe - ein wesentlicher Aspekt bei der Entstehung von
Sepsis.
Die präsentierten Ergebnisse im Rahmen dieser Studie dienen hauptsächlich als
Hinweis für eine erfolgversprechende Therapiemöglichkeit bei postischämischer
Inflammation im Rahmen eines hämorrhagischen Geschehens. Weiterhin bildet
diese Studie eine Basis für weiterführende Forschungsvorhaben, die sich mit dem
5 Diskussion
60
Thema LIM beschäftigen. Darunter seien die Schwerpunkte Polytrauma und Sepsis
genannt.
Es bleibt künftig anhand von Folgestudien zu belegen, wie die optimale Anwendung
des LIM den hier angedeuteten Therapieerfolg untermauern kann.
6 Zusammenfassung
61
6. Zusammenfassung
Ein hämorrhagischer Schock ist eng mit einer aberranten Neutrophilenfunktion und
daraus resultierender Organdysfunktion bzw. Organversagen assoziiert. Diese
experimentelle Studie am Schweinemodell wurde durchgeführt, um die
Auswirkungen einer extrakorporalen Immuntherapie mittels Leukozyten Inhibitions
Modul (LIM) auf Hämodynamik, Neutrophilenmigration ins Gewebe und
Gewebeschädigung durch diese Zellen bei hämorrhagischem Schock/Reperfusion zu
prüfen.
Im Rahmen dieser prospektiven kontrollierten zweiarmigen Studie in der
Tierversuchsanlage und im Labor wurde ein Tiermodell an 24 Münchner Mini Pigs
(30.3 ± 3.3 kg) etabliert. Die Schweine wurden in einen hämorrhagischen Schock
versetzt, für 45 Minuten in diesem Zustand erhalten und nachträglich mit kristalloider
Lösung bis zum Erreichen des Ausgangs-Blutdruckes reperfundiert. Mit Anfang der
Reperfusionsphase leitete man bei 12 Schweinen die extrakorporale Immuntherapie
(+LIM) für 3 Stunden ein. Weitere 12 Schweine wurden ausschließlich reperfundiert
und als „standard medical care“ (nLIM) definiert. Verschiedene Parameter wurden
während des gesamten Experiments gemessen. Die Schweine wurden 48 bzw. 72
Stunden nach Schock/Reperfusion euthanasiert. Aus den Organproben wurden die
Expressionen von HIF-1 , HO-1 bestimmt und die Lipidperoxidation im Gewebe
anhand von Malondialdehyd (MDA) gemessen.
In der +LIM Gruppe sank die Neutrophilenanzahl signifikant im Blut, verglichen mit
der nLIM-Gruppe. Die hämodynamischen Parameter nach 72 Stunden waren
ebenfalls in der +LIM-Gruppe besser. Histologische Analysen zeigten eine durch LIM
vermittelte Reduktion der Schock-assoziierten Neutrophileninfiltration im Gewebe
sowie auch eine niedrigere Lipidperoxidation und Hämoxygenase-1 (HO-1) Induktion
in verschiedenen Organen als Anzeichen für eine reduzierte Gewebeschädigung.
Die Fas-vermittelte extrakorporale Immuntherapie bietet während der frühen
posthämmorhagischen oder posttraumatischen Phase eine innovative Möglichkeit
zur Eindämmung der Gewebeinfiltration und -schädigung durch neutrophile
Granulozyten. Es bedürfen dennoch weiterführende Untersuchungen zur
Optimierung des klinischen Einsatzes.
7 Referenzen
62
7. Referenzen
Abdel-Rahman, U., S. Margraf, et al. (2007). "Inhibition of neutrophil activity improves cardiac function after cardiopulmonary bypass." J Inflamm (Lond) 4: 21.
Allgower, M. and C. Burri (1968). "Shock-index." Ger Med Mon 13(1): 14-9. Amon, M., M. D. Menger, et al. (2003). "Heme oxygenase and nitric oxide synthase
mediate cooling-associated protection against TNF-alpha-induced microcirculatory dysfunction and apoptotic cell death." Faseb J 17(2): 175-85.
Armstrong, D. and R. Browne (1994). "The analysis of free radicals, lipid peroxides,
antioxidant enzymes and compounds related to oxidative stress as applied to the clinical chemistry laboratory." Adv Exp Med Biol 366: 43-58.
Balla, G., G. M. Vercellotti, et al. (1991). "Exposure of endothelial cells to free heme
potentiates damage mediated by granulocytes and toxic oxygen species." Lab Invest 64(5): 648-55.
Baue, A. E. (1975). "Multiple, progressive, or sequential systems failure. A syndrome
of the 1970s." Arch Surg 110(7): 779-81. Baue, A. E., R. Durham, et al. (1998). "Systemic inflammatory response syndrome
(SIRS), multiple organ dysfunction syndrome (MODS), multiple organ failure (MOF): are we winning the battle?" Shock 10(2): 79-89.
Bauer, M. and I. Bauer (2002). "Heme oxygenase-1: redox regulation and role in the
hepatic response to oxidative stress." Antioxid Redox Signal 4(5): 749-58. Bergentz, S. E., A. Carlsten, et al. (1969). ""Hidden Acidosis" in Experimental Shock."
Ann Surg 169(2): 227-232. Beri, R. and R. Chandra (1993). "Chemistry and biology of heme. Effect of metal
salts, organometals, and metalloporphyrins on heme synthesis and catabolism, with special reference to clinical implications and interactions with cytochrome P-450." Drug Metab Rev 25(1-2): 49-152.
Birkhahn, R. H., T. J. Gaeta, et al. (2005). "Shock index in diagnosing early acute
hypovolemia." Am J Emerg Med 23(3): 323-6. Bone, R. C. (1996). "Toward a theory regarding the pathogenesis of the systemic
inflammatory response syndrome: what we do and do not know about cytokine regulation." Crit Care Med 24(1): 163-72.
Bone, R. C., W. J. Sibbald, et al. (1992). "The ACCP-SCCM consensus conference
on sepsis and organ failure." Chest 101(6): 1481-3. Brown, K. A., S. D. Brain, et al. (2006). "Neutrophils in development of multiple organ
failure in sepsis." Lancet 368(9530): 157-69.
7 Referenzen
63
Buettner, G. R. (1993). "The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, alpha-tocopherol, and ascorbate." Arch Biochem Biophys 300(2): 535-43.
Camenisch, G., D. M. Stroka, et al. (2001). "Attenuation of HIF-1 DNA-binding activity
limits hypoxia-inducible endothelin-1 expression." Pflugers Arch 443(2): 240-9. Camhi, S. L., J. Alam, et al. (1995). "Induction of heme oxygenase-1 gene expression
by lipopolysaccharide is mediated by AP-1 activation." Am J Respir Cell Mol Biol 13(4): 387-98.
Carden, D., F. Xiao, et al. (1998). "Neutrophil elastase promotes lung microvascular
injury and proteolysis of endothelial cadherins." Am J Physiol 275(2 Pt 2): H385-92.
Catala, A. (2006). "An overview of lipid peroxidation with emphasis in outer segments
of photoreceptors and the chemiluminescence assay." Int J Biochem Cell Biol 38(9): 1482-95.
Choi, A. M. and J. Alam (1996). "Heme oxygenase-1: function, regulation, and
implication of a novel stress-inducible protein in oxidant-induced lung injury." Am J Respir Cell Mol Biol 15(1): 9-19.
Cinatl, J., Jr., R. Blaheta, et al. (2000). "Decreased neutrophil adhesion to human
cytomegalovirus-infected retinal pigment epithelial cells is mediated by virus-induced up-regulation of Fas ligand independent of neutrophil apoptosis." J Immunol 165(8): 4405-13.
Cotran R., K. V., Collins T. (1999). Robbins Pathologic Basis of Disease.
Philadelphia, Saunders. Coulet, F., S. Nadaud, et al. (2003). "Identification of hypoxia-response element in
the human endothelial nitric-oxide synthase gene promoter." J Biol Chem 278(47): 46230-40.
de Groot, H. (1994). "Reactive oxygen species in tissue injury."
Hepatogastroenterology 41(4): 328-32. Deitch, E. A. (1992). "Multiple organ failure. Pathophysiology and potential future
therapy." Ann Surg 216(2): 117-34. Demling, R. H. and C. LaLonde (1990). "Early postburn lipid peroxidation: effect of
ibuprofen and allopurinol." Surgery 107(1): 85-93. Eiseman, B., R. Beart, et al. (1977). "Multiple organ failure." Surg Gynecol Obstet
144(3): 323-6. Epstein, A. C., J. M. Gleadle, et al. (2001). "C. elegans EGL-9 and mammalian
homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation." Cell 107(1): 43-54.
7 Referenzen
64
Ertel, W., M. Keel, et al. (1998). "Circulating mediators in serum of injured patients with septic complications inhibit neutrophil apoptosis through up-regulation of protein-tyrosine phosphorylation." J Trauma 44(5): 767-75; discussion 775-6.
Esterbauer, H., R. J. Schaur, et al. (1991). "Chemistry and biochemistry of 4-
hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes." Free Radic Biol Med 11(1): 81-128.
Falk, J. L., J. F. O'Brien, et al. (1992). "Fluid resuscitation in traumatic hemorrhagic
shock." Crit Care Clin 8(2): 323-40. Fandrey, J., T. A. Gorr, et al. (2006). "Regulating cellular oxygen sensing by
hydroxylation." Cardiovasc Res 71(4): 642-51. Fernandez, M. and H. L. Bonkovsky (1999). "Increased heme oxygenase-1 gene
expression in liver cells and splanchnic organs from portal hypertensive rats." Hepatology 29(6): 1672-9.
Forsythe, J. A., B. H. Jiang, et al. (1996). "Activation of vascular endothelial growth
factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1." Mol Cell Biol 16(9): 4604-13.
Frei, B., R. Stocker, et al. (1988). "Antioxidant defenses and lipid peroxidation in
human blood plasma." Proc Natl Acad Sci U S A 85(24): 9748-52. Furchgott, R. F. and D. Jothianandan (1991). "Endothelium-dependent and -
independent vasodilation involving cyclic GMP: relaxation induced by nitric oxide, carbon monoxide and light." Blood Vessels 28(1-3): 52-61.
Galli, F., M. Piroddi, et al. (2005). "Oxidative stress and reactive oxygen species."
Contrib Nephrol 149: 240-60. Gerber, H. P., J. Kowalski, et al. (2000). "Complete inhibition of rhabdomyosarcoma
xenograft growth and neovascularization requires blockade of both tumor and host vascular endothelial growth factor." Cancer Res 60(22): 6253-8.
Gonzalez-Amaro, R. and F. Sanchez-Madrid (1999). "Cell adhesion molecules:
selectins and integrins." Crit Rev Immunol 19(5-6): 389-429. Granger, D. N. (1988). "Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-
reperfusion injury." Am J Physiol 255(6 Pt 2): H1269-75. Green, D. R. and J. C. Reed (1998). "Mitochondria and apoptosis." Science
281(5381): 1309-12. Gu, Y. Z., J. B. Hogenesch, et al. (2000). "The PAS superfamily: sensors of
environmental and developmental signals." Annu Rev Pharmacol Toxicol 40: 519-61.
7 Referenzen
65
Gu, Y. Z., S. M. Moran, et al. (1998). "Molecular characterization and chromosomal localization of a third alpha-class hypoxia inducible factor subunit, HIF3alpha." Gene Expr 7(3): 205-13.
Guengerich, F. P. (1978). "Destruction of heme and hemoproteins mediated by liver
microsomal reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-cytochrome P-450 reductase." Biochemistry 17(17): 3633-9.
Gutteridge, J. M. (1995). "Lipid peroxidation and antioxidants as biomarkers of tissue
damage." Clin Chem 41(12 Pt 2): 1819-28. Gutteridge, J. M. and A. Smith (1988). "Antioxidant protection by haemopexin of
haem-stimulated lipid peroxidation." Biochem J 256(3): 861-5. Hagimoto, N., K. Kuwano, et al. (1997). "Induction of apoptosis and pulmonary
fibrosis in mice in response to ligation of Fas antigen." Am J Respir Cell Mol Biol 17(3): 272-8.
Halliwell, B. (1978). "Superoxide-dependent formation of hydroxyl radicals in the
presence of iron chelates: is it a mechanism for hydroxyl radical production in biochemical systems?" FEBS Lett 92(2): 321-6.
Halliwell, B. and J. M. Gutteridge (1984). "Lipid peroxidation, oxygen radicals, cell
damage, and antioxidant therapy." Lancet 1(8391): 1396-7. Hart, M. L., K. A. Ceonzo, et al. (2005). "Gastrointestinal ischemia-reperfusion injury
is lectin complement pathway dependent without involving C1q." J Immunol 174(10): 6373-80.
Hengartner, M. O. (2000). "The biochemistry of apoptosis." Nature 407(6805): 770-6. Hon, W. C., M. I. Wilson, et al. (2002). "Structural basis for the recognition of
hydroxyproline in HIF-1 alpha by pVHL." Nature 417(6892): 975-8. Huang, L. E., J. Gu, et al. (1998). "Regulation of hypoxia-inducible factor 1alpha is
mediated by an O2-dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome pathway." Proc Natl Acad Sci U S A 95(14): 7987-92.
Immenschuh, S., S. Iwahara, et al. (1995). "Expression of the mRNA of heme-binding
protein 23 is coordinated with that of heme oxygenase-1 by heme and heavy metals in primary rat hepatocytes and hepatoma cells." Biochemistry 34(41): 13407-11.
Issbrucker, K., H. H. Marti, et al. (2003). "p38 MAP kinase--a molecular switch
between VEGF-induced angiogenesis and vascular hyperpermeability." Faseb J 17(2): 262-4.
Ivan, M., K. Kondo, et al. (2001). "HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by
proline hydroxylation: implications for O2 sensing." Science 292(5516): 464-8.
7 Referenzen
66
Jaakkola, P., D. R. Mole, et al. (2001). "Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation." Science 292(5516): 468-72.
Jeney, V., J. Balla, et al. (2002). "Pro-oxidant and cytotoxic effects of circulating
heme." Blood 100(3): 879-87. Jiang, B. H., J. Z. Zheng, et al. (1997). "Transactivation and inhibitory domains of
hypoxia-inducible factor 1alpha. Modulation of transcriptional activity by oxygen tension." J Biol Chem 272(31): 19253-60.
Jubb, A. M., T. Q. Pham, et al. (2004). "Expression of vascular endothelial growth
factor, hypoxia inducible factor 1alpha, and carbonic anhydrase IX in human tumours." J Clin Pathol 57(5): 504-12.
Kaminski, K. A., T. A. Bonda, et al. (2002). "Oxidative stress and neutrophil
activation--the two keystones of ischemia/reperfusion injury." Int J Cardiol 86(1): 41-59.
Kawashima, A., Y. Oda, et al. (2002). "Heme oxygenase-1 deficiency: the first
autopsy case." Hum Pathol 33(1): 125-30. Keel, M. and O. Trentz (2005). "Pathophysiology of polytrauma." Injury 36(6): 691-
709. Kewley, R. J., M. L. Whitelaw, et al. (2004). "The mammalian basic helix-loop-
helix/PAS family of transcriptional regulators." Int J Biochem Cell Biol 36(2): 189-204.
Kubulus, D., H. Rensing, et al. (2005). "Influence of heme-based solutions on stress
protein expression and organ failure after hemorrhagic shock." Crit Care Med 33(3): 629-37.
Kubulus, D., F. Roesken, et al. (2004). "Mechanism of the delay phenomenon: tissue
protection is mediated by heme oxygenase-1." Am J Physiol Heart Circ Physiol 287(5): H2332-40.
Kutty, R. K. and M. D. Maines (1981). "Purification and characterization of biliverdin
reductase from rat liver." J Biol Chem 256(8): 3956-62. Lee, A., M. K. Whyte, et al. (1993). "Inhibition of apoptosis and prolongation of
neutrophil functional longevity by inflammatory mediators." J Leukoc Biol 54(4): 283-8.
Lee, P. J., B. H. Jiang, et al. (1997). "Hypoxia-inducible factor-1 mediates
transcriptional activation of the heme oxygenase-1 gene in response to hypoxia." J Biol Chem 272(9): 5375-81.
Lenz, A., G. A. Franklin, et al. (2007). "Systemic inflammation after trauma." Injury
38(12): 1336-45.
7 Referenzen
67
Lieschke, G. J., D. Grail, et al. (1994). "Mice lacking granulocyte colony-stimulating factor have chronic neutropenia, granulocyte and macrophage progenitor cell deficiency, and impaired neutrophil mobilization." Blood 84(6): 1737-46.
Lögters, T., Altrichter, et al. (2010). "Extracorporeal immune therapy with immobilized
agonistic anti-Fas antibodies leads to transient reduction of circulating neutrophil numbers and limits tissue damage after hemorrhagic shock/resuscitation in a porcine model." J Inflamm 7(1):18.
Lomas, J. L., C. S. Chung, et al. (2003). "Differential effects of macrophage
inflammatory chemokine-2 and keratinocyte-derived chemokine on hemorrhage-induced neutrophil priming for lung inflammation: assessment by adoptive cells transfer in mice." Shock 19(4): 358-65.
Maier, B., R. Lefering, et al. (2007). "Early versus late onset of multiple organ failure
is associated with differing patterns of plasma cytokine biomarker expression and outcome after severe trauma." Shock 28(6): 668-674.
Maines, M. D. (1988). "Heme oxygenase: function, multiplicity, regulatory
mechanisms, and clinical applications." Faseb J 2(10): 2557-68. Maines, M. D. (1997). "The heme oxygenase system: a regulator of second
messenger gases." Annu Rev Pharmacol Toxicol 37: 517-54. Marshall, J. C., D. J. Cook, et al. (1995). "Multiple organ dysfunction score: a reliable
descriptor of a complex clinical outcome." Crit Care Med 23(10): 1638-52. Martin, C., P. C. Burdon, et al. (2003). "Chemokines acting via CXCR2 and CXCR4
control the release of neutrophils from the bone marrow and their return following senescence." Immunity 19(4): 583-93.
Masson, N. and P. J. Ratcliffe (2003). "HIF prolyl and asparaginyl hydroxylases in the
biological response to intracellular O(2) levels." J Cell Sci 116(Pt 15): 3041-9. Maxwell, P. H., M. S. Wiesener, et al. (1999). "The tumour suppressor protein VHL
targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis." Nature 399(6733): 271-5.
McCloskey, C. A., M. V. Kameneva, et al. (2004). "Tissue hypoxia activates JNK in
the liver during hemorrhagic shock." Shock 22(4): 380-6. McCoubrey, W. K., Jr., T. J. Huang, et al. (1997). "Isolation and characterization of a
cDNA from the rat brain that encodes hemoprotein heme oxygenase-3." Eur J Biochem 247(2): 725-32.
McMullen, M. E., M. L. Hart, et al. (2006). "Mannose-binding lectin binds IgM to
activate the lectin complement pathway in vitro and in vivo." Immunobiology 211(10): 759-66.
7 Referenzen
68
Mikkelsen, M. E., A. N. Miltiades, et al. (2009). "Serum lactate is associated with mortality in severe sepsis independent of organ failure and shock." Crit Care Med 37(5): 1670-7.
Min, J. H., H. Yang, et al. (2002). "Structure of an HIF-1alpha -pVHL complex: hydroxyproline recognition in signaling." Science 296(5574): 1886-9.
Mollnes, T. E., O. L. Brekke, et al. (2002). "Essential role of the C5a receptor in E
coli-induced oxidative burst and phagocytosis revealed by a novel lepirudin-based human whole blood model of inflammation." Blood 100(5): 1869-77.
Moore, F. A., B. A. McKinley, et al. (2004). "The next generation in shock
resuscitation." Lancet 363(9425): 1988-96. Morini, S., W. Yacoub, et al. (2000). "Intestinal microvascular patterns during
hemorrhagic shock." Dig Dis Sci 45(4): 710-22. Morita, T., M. A. Perrella, et al. (1995). "Smooth muscle cell-derived carbon
monoxide is a regulator of vascular cGMP." Proc Natl Acad Sci U S A 92(5): 1475-9.
Murre, C., G. Bain, et al. (1994). "Structure and function of helix-loop-helix proteins."
Biochim Biophys Acta 1218(2): 129-35. Mutschler (2004). Praxis der Unfallchirurgie, Thieme. Nguyen, H. B., M. Loomba, et al. "Early lactate clearance is associated with
biomarkers of inflammation, coagulation, apoptosis, organ dysfunction and mortality in severe sepsis and septic shock." J Inflamm (Lond) 7(1): 6.
Nguyen, H. B., E. P. Rivers, et al. (2004). "Early lactate clearance is associated with
improved outcome in severe sepsis and septic shock." Crit Care Med 32(8): 1637-42.
Nigam, S. and T. Schewe (2000). "Phospholipase A(2)s and lipid peroxidation."
Biochim Biophys Acta 1488(1-2): 167-81. Ogasawara, J., R. Watanabe-Fukunaga, et al. (1993). "Lethal effect of the anti-Fas
antibody in mice." Nature 364(6440): 806-9. Ohh, M., C. W. Park, et al. (2000). "Ubiquitination of hypoxia-inducible factor requires
direct binding to the beta-domain of the von Hippel-Lindau protein." Nat Cell Biol 2(7): 423-7.
Okinaga, S. and S. Shibahara (1993). "Identification of a nuclear protein that
constitutively recognizes the sequence containing a heat-shock element. Its binding properties and possible function modulating heat-shock induction of the rat heme oxygenase gene." Eur J Biochem 212(1): 167-75.
Ott, A. (2010). Untersuchungen zum Einfluss des Leukozyten-Inhibitions-Moduls auf
die posthämorrhagische Aktivierung von neutrophilen Granulozyten im Tiermodell.
7 Referenzen
69
Palmer, L. A., G. L. Semenza, et al. (1998). "Hypoxia induces type II NOS gene
expression in pulmonary artery endothelial cells via HIF-1." Am J Physiol 274(2 Pt 1): L212-9.
Paunel-Gorgulu, A., M. Zornig, et al. (2009). "Mcl-1-mediated impairment of the
intrinsic apoptosis pathway in circulating neutrophils from critically ill patients can be overcome by Fas stimulation." J Immunol 183(10): 6198-206.
Pellacani, A., P. Wiesel, et al. (1998). "Induction of heme oxygenase-1 during
endotoxemia is downregulated by transforming growth factor-beta1." Circ Res 83(4): 396-403.
Peter, M. E., R. C. Budd, et al. (2007). "The CD95 receptor: apoptosis revisited." Cell
129(3): 447-50. Ponka, P. (1999). "Cell biology of heme." Am J Med Sci 318(4): 241-56. Pugh, C. W., J. F. O'Rourke, et al. (1997). "Activation of hypoxia-inducible factor-1;
definition of regulatory domains within the alpha subunit." J Biol Chem 272(17): 11205-14.
Quaid, G. A., C. Cave, et al. (1999). "Preferential loss of CXCR-2 receptor
expression and function in patients who have undergone trauma." Arch Surg 134(12): 1367-71; discussion 1371-2.
Rensing, H., I. Bauer, et al. (1999). "Differential expression pattern of heme
oxygenase-1/heat shock protein 32 and nitric oxide synthase-II and their impact on liver injury in a rat model of hemorrhage and resuscitation." Crit Care Med 27(12): 2766-75.
Rixen, D., M. Raum, et al. (2001). "A pig hemorrhagic shock model: oxygen debt and
metabolic acidemia as indicators of severity." Shock 16(3): 239-44. Rolfs, A., I. Kvietikova, et al. (1997). "Oxygen-regulated transferrin expression is
mediated by hypoxia-inducible factor-1." J Biol Chem 272(32): 20055-62. Rosario, H. S., S. W. Waldo, et al. (2004). "Pancreatic trypsin increases matrix
metalloproteinase-9 accumulation and activation during acute intestinal ischemia-reperfusion in the rat." Am J Pathol 164(5): 1707-16.
Rose S, B. D., Chandler J, Blum U, Dike J, Wierkinski A, Mutschler W (1994).
"Respiratory failure in polytrauma patients: Role of altered PMNL-signal transduction and free radical injury." Int Care Med 20(2): 89.
Rüter A., T. O., Wagner M. (2004). Unfallchirurgie. Sakorafas, G. H., G. G. Tsiotos, et al. (2000). "Ischemia/Reperfusion-Induced
pancreatitis." Dig Surg 17(1): 3-14.
7 Referenzen
70
Salceda, S. and J. Caro (1997). "Hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1alpha) protein is rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome system under normoxic conditions. Its stabilization by hypoxia depends on redox-induced changes." J Biol Chem 272(36): 22642-7.
Sato, H., T. Tanaka, et al. (2007). "Role of p38 mitogen-activated protein kinase on
cardiac dysfunction after hemorrhagic shock in rats." Shock 28(3): 291-9. Schmidt, R., A. Hoetzel, et al. (2004). "Isoflurane pretreatment lowers portal venous
resistance by increasing hepatic heme oxygenase activity in the rat liver in vivo." J Hepatol 41(5): 706-13.
Scholz, M. and J. Cinatl (2005). "Fas/FasL interaction: a novel immune therapy
approach with immobilized biologicals." Med Res Rev 25(3): 331-42. Scholz, M., J. Cinatl, et al. (2005). "First efficacy and safety results with the antibody
containing leukocyte inhibition module in cardiac surgery patients with neutrophil hyperactivity." Asaio J 51(2): 144-7.
Scholz, M., J. Cinatl, et al. (2007). "Neutrophils and the blood-brain barrier
dysfunction after trauma." Med Res Rev 27(3): 401-16. Scholz, M., A. Simon, et al. (2004). "In vivo inhibition of neutrophil activity by a FAS
(CD95) stimulating module: arterial in-line application in a porcine cardiac surgery model." J Thorac Cardiovasc Surg 127(6): 1735-42.
Semenza, G. L. (2000). "HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological
responses to hypoxia." J Appl Physiol 88(4): 1474-80. Semenza, G. L., B. H. Jiang, et al. (1996). "Hypoxia response elements in the
aldolase A, enolase 1, and lactate dehydrogenase A gene promoters contain essential binding sites for hypoxia-inducible factor 1." J Biol Chem 271(51): 32529-37.
Sies, H. and E. Cadenas (1985). "Oxidative stress: damage to intact cells and
organs." Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 311(1152): 617-31. Stocker, R., Y. Yamamoto, et al. (1987). "Bilirubin is an antioxidant of possible
physiological importance." Science 235(4792): 1043-6. Suematsu, M., N. Goda, et al. (1995). "Carbon monoxide: an endogenous modulator
of sinusoidal tone in the perfused rat liver." J Clin Invest 96(5): 2431-7. Suratt, B. T., S. K. Young, et al. (2001). "Neutrophil maturation and activation
determine anatomic site of clearance from circulation." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 281(4): L913-21.
Takahashi, S., Y. Takahashi, et al. (1999). "Positive and negative regulation of the
human heme oxygenase-1 gene expression in cultured cells." Biochim Biophys Acta 1447(2-3): 231-5.
7 Referenzen
71
Talks, K. L., H. Turley, et al. (2000). "The expression and distribution of the hypoxia-inducible factors HIF-1alpha and HIF-2alpha in normal human tissues, cancers, and tumor-associated macrophages." Am J Pathol 157(2): 411-21.
Tamion, F., V. Richard, et al. (2001). "Induction of heme-oxygenase-1 prevents the
systemic responses to hemorrhagic shock." Am J Respir Crit Care Med 164(10 Pt 1): 1933-8.
Tanaka, H., K. Ishikawa, et al. (1996). "Changes in granulocyte colony-stimulating
factor concentration in patients with trauma and sepsis." J Trauma 40(5): 718-25; discussion 725-6.
Taylor, B. L. and I. B. Zhulin (1999). "PAS domains: internal sensors of oxygen,
redox potential, and light." Microbiol Mol Biol Rev 63(2): 479-506. Taylor, J. L., M. S. Carraway, et al. (1998). "Lung-specific induction of heme
oxygenase-1 and hyperoxic lung injury." Am J Physiol 274(4 Pt 1): L582-90. Tenhunen, R., H. S. Marver, et al. (1968). "The enzymatic conversion of heme to
bilirubin by microsomal heme oxygenase." Proc Natl Acad Sci U S A 61(2): 748-55.
Tenhunen, R., H. S. Marver, et al. (1969). "Microsomal heme oxygenase.
Characterization of the enzyme." J Biol Chem 244(23): 6388-94. Terry, C. M., J. A. Clikeman, et al. (1998). "Effect of tumor necrosis factor-alpha and
interleukin-1 alpha on heme oxygenase-1 expression in human endothelial cells." Am J Physiol 274(3 Pt 2): H883-91.
Tian, H., S. L. McKnight, et al. (1997). "Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1), a
transcription factor selectively expressed in endothelial cells." Genes Dev 11(1): 72-82.
Toda, Y., T. Takahashi, et al. (2007). "A neutrophil elastase inhibitor, sivelestat,
ameliorates lung injury after hemorrhagic shock in rats." Int J Mol Med 19(2): 237-43.
Tullius, S. G., M. Nieminen-Kelha, et al. (2002). "Inhibition of ischemia/reperfusion
injury and chronic graft deterioration by a single-donor treatment with cobalt-protoporphyrin for the induction of heme oxygenase-1." Transplantation 74(5): 591-8.
Utz, J. and V. Ullrich (1991). "Carbon monoxide relaxes ileal smooth muscle through
activation of guanylate cyclase." Biochem Pharmacol 41(8): 1195-201. van Meurs, M., F. M. Wulfert, et al. (2008). "Early organ-specific endothelial
activation during hemorrhagic shock and resuscitation." Shock 29(2): 291-9. Verma, A., D. J. Hirsch, et al. (1993). "Carbon monoxide: a putative neural
messenger." Science 259(5093): 381-4.
7 Referenzen
72
Wagener, F. A., H. D. Volk, et al. (2003). "Different faces of the heme-heme oxygenase system in inflammation." Pharmacol Rev 55(3): 551-71.
Wagner, M., P. Cadetg, et al. (2003). "Heme oxygenase-1 attenuates
ischemia/reperfusion-induced apoptosis and improves survival in rat renal allografts." Kidney Int 63(4): 1564-73.
Walsh, A. M., D. Mustafi, et al. (2005). "A surfactant copolymer facilitates functional
recovery of heat-denatured lysozyme." Ann N Y Acad Sci 1066: 321-7. Wang, G. L., B. H. Jiang, et al. (1995). "Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-
loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension." Proc Natl Acad Sci U S A 92(12): 5510-4.
Wang, G. L. and G. L. Semenza (1993). "Characterization of hypoxia-inducible factor
1 and regulation of DNA binding activity by hypoxia." J Biol Chem 268(29): 21513-8.
Watson, R. W., O. D. Rotstein, et al. (1997). "Augmented intracellular glutathione
inhibits Fas-triggered apoptosis of activated human neutrophils." Blood 89(11): 4175-81.
Watson, R. W., O. D. Rotstein, et al. (1997). "Impaired apoptotic death signaling in
inflammatory lung neutrophils is associated with decreased expression of interleukin-1 beta converting enzyme family proteases (caspases)." Surgery 122(2): 163-71; discussion 171-2.
Weiss, S. J. (1989). "Tissue destruction by neutrophils." N Engl J Med 320(6): 365-
76. Welbourn, C. R., G. Goldman, et al. (1991). "Neutrophil elastase and oxygen
radicals: synergism in lung injury after hindlimb ischemia." Am J Physiol 260(6 Pt 2): H1852-6.
Witte, I. (2010). Untersuchungen zum Einfluss des Leukozyten-Inhibitions-Moduls auf
die Posthämorrhagische Hämodynamik im Tiermodell. Yachie, A., Y. Niida, et al. (1999). "Oxidative stress causes enhanced endothelial cell
injury in human heme oxygenase-1 deficiency." J Clin Invest 103(1): 129-35. Yagi, K. (1998). "Simple assay for the level of total lipid peroxides in serum or
plasma." Methods Mol Biol 108: 101-6. Young, I. S. and J. McEneny (2001). "Lipoprotein oxidation and atherosclerosis."
Biochem Soc Trans 29(Pt 2): 358-62. Zakaria el, R., J. E. Campbell, et al. (2007). "Postresuscitation tissue neutrophil
infiltration is time-dependent and organ-specific." J Surg Res 143(1): 119-25. Zhang, M., K. Takahashi, et al. (2006). "Activation of the lectin pathway by natural
IgM in a model of ischemia/reperfusion injury." J Immunol 177(7): 4727-34.
8 Danksagung
73
8. Danksagung
Bedanken möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. med. J. Windolf, dem Direktor der
Klinik für Unfall- und Handchirurgie der Heinrich-Heine-Universität in Düsseldorf für
die Überlassung des Themas und die wissenschaftliche Unterstützung bei der
Durchführung dieser Arbeit.
Mein ganz besonderer Dank und Hochachtung gilt Herrn Prof. Dr. phil. nat. M. Scholz
für die wissenschaftliche Betreuung, seine stetige Förderung, die motivierenden
Gespräche und Hilfeleistungen bei Inspirations-Engpässen und für sein Engagement
und seine Begeisterungsfähigkeit, die diese Arbeit überhaupt ermöglichten.
Es ist mir ein besonderes Anliegen, mich ganz herzlich bei meinen Kollegen/Innen
der Arbeitsgruppe LIM , Dr. med. Tim Lögters, Frau Annina Ott, Frau Sarah Sadek,
Frau Jessica Baltes und Herrn Ingo Witte zu bedanken. Für die freundliche, lustige,
und dennoch zieloritentierte Atmosphäre, durch welche die Arbeit im Labor und vor
allem in der TVA viel Spaß gemacht hat, möchte ich mich ebenfals bedanken.
Bei dem Team der Tierversuchsanlage, insbesondere Hern Dr. Sager, Frau Dr.
Engelhardt und Frau Schrey möchte ich mich für die Hilfestellung bei vielen
Problemen und die gute Zusammenarbeit ganz herzlich bedanken.
Einen besonderen und nicht zu unterschätzenden Dank hat das gesamte Team des
wissenschaftlichen Labors der Klinik für Unfall- und Handchirurgie der Uni Düsseldorf
verdient: Frau Dr. rer. nat. Adnana Paunel Görgülü für die wichtigen Details, Frau
Samira Seghrouchni und Frau Jutta Schneider. Die perfekte Mischung aus
Professionalität und Harmonie hat die Arbeit im Labor unvergesslich gemacht.
Frau Dr. med. Julia Kuhlemann hat einen liebevollen Dank für ihre Unterstützung und
Motivation bei der Verarbeitung des mit Strapazen und Rückschlägen überfüllten
Endspurtes verdient. Danke dafür, Julia.
Abschließend möchte ich mich bei meinen Eltern, Anabel Ferrer und Hartmut Schek,
und ganz besonders bei meinen Geschwistern Anabel, Alexander, Andreas und
Adriana Schek herzlichst bedanken. Ohne sie hätte der Jüngste nicht all die
Motivation und das Durchsetzungsvermögen erlernt.
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