Úvod do molekulárnej medicíny

Úvoddo molekulárnej medicíny

MUDr. Ing. Bc. Peter Celec, PhD.

2

Linus Carl Pauling

(1901 – 1994)

Nobel prize

1954 – Chemistry

1962 – Peace

3

„Life is a relationship between molecules, not a property of any one molecule. So is therefore disease, which endangers life. While there are molecular diseases, there are no diseased molecules.“

Linus C. Pauling, 1962

4

Basics

5

Francis Crick

8.6.1916 – 28.7.2004

7

James Watson

6.4.1928 –

9

10

11

Molecular Medicine

Based on molecular knowledge Based on XNA Proteomics Genomics Molecular interactions

Regulations Signalling pathways

Gene therapy

12

What we will NOT talk about...

XNA structure Monogenic disorders Immunology Carcinogenesis

13

Genome (DNA)

Transcriptome (RNA)

Proteome (protein)

Metabolome (pathways)

Genome

14

15

Information processing

Communication Intercellular Intracellular

16

17

Signalling pathways

18

Ligands

Hydrophilic Small molecules Larges proteins

Hydrophobic Steroids Thyroxine Retinoids

19

Receptors

G-protein coupled Tyrosine kinases Ion channels Intracellular

20

Signalling pathways

21

Phosphate

22

G-protein coupled

23

G-protein coupled

Animation

24

Second messangers

cAMP cGMP IP3

DAG Ca++

25

Gene

„The gene is by far the most sophisticated program around.“

Bill Gates

26

Gene expression regulation

27

28

Jak – Janus (Roman god of gates and doors) KinaseJak – Just Another KinaseSTAT – Signal Transducers and Activators of TranscriptionAPS – Adaptor protein with Pleckstrin homology and Src homology 2 domains C-Cbl - Casitas B-lineage LymphomaEPO – Erythropoietin

29

Tyk2 – Tyrosine kinase 2mTOR – mammalian Target Of RapamycinMAPK – MAP (Microtubule Associated Protein) KinaseMAPK – MAP (Mitogen Activated Protein) KinaseISRE – Interferon-Stimulated Response ElementGAS – IFN-Gamma-Activation Site

30

GR – Glucocorticoid ReceptorFKBP – FK506 (tacrolimus)-Binding ProteinHSP – Heat Shock ProteinGRE – Glucocorticoid Response Element

31

c-Fos – FBJ (Finkel MP, Biskis BO, Jinkins PB) OsteoSarcoma virusAP-1 – Activator Protein 1

TGACTCA

32

FAPFAP – c-Fos AP-1 binding siteIP-1 – Inhibitory Protein 1

33

NFκB

34

FasL – Fas LigandTRAF – TNFα Receptor Associated FactorNIK – NFκB Inducing KinaseCBP – CREB Binding Protein

NFkB

35

MAP kinases

GEF – Guanine Nucleotide Exchange Factor

36

MAP kinases

Animation

37

...but...

38

Signalling pathways

39

Responses???

40

41

42

Apoptosis

43

Apoptosis

Videos

44

45

46

Autophagy

Macroautophagy Microautophagy

47

48

49

Oxygen sensing

50

HIF – Hypoxia Inducible FactorIGFR – Insulin like Growth Factor ReceptorEGFR – Epidermal Growth Factor ReceptorHER2 – Human Epidermal growth factor Receptor 2PI3K – PhosphatidylInositol-3-KinaseAKT – serine/threonine protein kinase BFRAP – FKBP rapamycin associated proteinPH – Prolin HydroxylasesHDAC – histone deacetylaseVHL – von Hippel-Lindau tumour suppressor proteinFIH – factor inhibiting HIF-1αB – elongin BC – elongin CC2 – cullin 2HRE – hypoxia response elementGLUT – glucose transporterARNT – Aryl hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator

51

52

Angiogenesis

53

54

55

AaronCiechanover

Avram Hershko

Irwin Rose

1/3 of the prizeIsrael

1/3 of the prizeIsrael

1/3 of the prize USA

Technion – IsraelInstutute ofTechnology Haifa, Israel

Technion – Israel Institute of Technology

Haifa, Israel

University of California Irvine, CA, USA

b. 1947 b. 1937 (Karcag, Hungary)

b. 1926

The Nobel Prize in Chemistry 2004"for the discovery of ubiquitin-mediated

protein degradation"

56

Ubiquitin

57

UbUb

E1E1

UbUb

E2E2

UbUb

E3E3

UbUb

2626SS prote proteaasome degradationsome degradation

TargetTarget

UbUbUbUbUbUb

Ubiquitin pathway

Ubi-activating E Ubi-conjugating E Ubi-ligase

58

Ub

ATP AMP + PPi

E1

Ub

E1C

E2C

E2

Ub

E3C

E3

Ub

Protein K

Protein

Ub

E3

E3

Protein K

Protein K

E2

Ub

E3

Ub

Protein K

E3

E2C

UbUb

Ub

Protein

Ub

UbUb

Ub

AMP + PPi

ProteinK

ProteinK

Pro

tein

KProtein K

Protein KProt

ein

KProtein K

Protein K

Proteosynthesis

Antigen presentation

H

A

B

C1

C2

D

E

Ub

Ub Ub

Ub

UbUb

UbUb

UbUb

Ub

Protein

Ub

ATP

Protein

Ub

UbUb

Protein

Ub

I

F

G

J

59

Molecular diagnostics

60

Kary Banks Mullis

(1944 – )

Nobel prize

1993 – Chemistry

61

PCR

62

63

PCR

Expensive?

64

65

PCR Analyzed by Electrophoresis

66

Real-time PCR

Quantitative PCR Fluorescent detection of PCR products in real

time

67

RFLP

68

RFLP & VNTR

Animation

69

Blotting

Western Southern Northern

70

Western Blot

71

Western Blot

Animation

72

Southern Blot

73

74

Southern Blot

Animation

75

RT PCR

Animation

76

FISH Procedure

77

FISH

78

Frederick Sanger(1918 –)Nobel prize1958 – Chemistry1980 – Chemistry

79

Sequencing

Animation

80

Microarray

2006 Ústav patologickej fyziológie

MUDr. Ing. Peter Celec, PhD.MUDr. Ing. Peter Celec, PhD.

Génová terapiaGénová terapia

DefiníciaDefinícia

PrincípyPrincípy

Rozdelenia Rozdelenia

VektoryVektory

KlinikaKlinika

ProblémyProblémy

Génová terapia

Definícia

Všetky prístupy na liečenie chorôb, ktoré Všetky prístupy na liečenie chorôb, ktoré využívajú nukleové kyseliny a génové inžinierstvo využívajú nukleové kyseliny a génové inžinierstvo

Princípy génovej terapie

Náhrada génuNáhrada génu

Zabitie Zabitie cieľovej cieľovej bunkybunky

Oprava mutácieOprava mutácie

Cielená iCielená inhibícia génovej expresienhibícia génovej expresie

Princípy génovej terapie

Náhrada génuNáhrada génu

Princípy génovej terapie

Zabitie Zabitie cieľovej cieľovej bunkybunky

Princípy génovej terapie

Zabitie Zabitie cieľovej cieľovej bunkybunky

Princípy génovej terapie

Zabitie Zabitie cieľovej cieľovej bunkybunky indukciou imunitného systému indukciou imunitného systému

Princípy génovej terapie

Oprava mutácieOprava mutácie

Princípy génovej terapie

Cielená iCielená inhibícia génovej expresienhibícia génovej expresie

Princípy génovej terapie

RNA interferenciaRNA interferencia

Rôzne delenia génovej terapie

Podľa funkčnej nukleovej kyselinyPodľa funkčnej nukleovej kyseliny

– DNA basedDNA based– RNA basedRNA based

Rôzne delenia génovej terapie

Podľa typu ovplyvnených buniekPodľa typu ovplyvnených buniek

– SomatickáSomatická– ZárodočnáZárodočná

Rôzne delenia génovej terapie

Rôzne delenia génovej terapie

Podľa prístupuPodľa prístupu

– In vivoIn vivo– Ex vivoEx vivo

Rôzne delenia génovej terapie

Podľa prístupuPodľa prístupu

Vektory

Vírusové Vírusové

NevírusovéNevírusové

BakteriálneBakteriálne

Vírusové vektory

RetrovírusRetrovírus

AdenovírusAdenovírus

Adeno-associovaný vírusAdeno-associovaný vírus

HerpesvírusHerpesvírus

AlfavírusAlfavírus

......

To integrate or not to integrate?

Nevírusové vektory

Nahá alebo obalená DNANahá alebo obalená DNA

Rôzne fyzikochemické transportné systémyRôzne fyzikochemické transportné systémy

Nevírusové vektory

Plazmidy PCR produkty

Injekcia nahej DNAElektroporácia

Gene gunLipoplexyPolyplexy

Oligodeoxynukleotidy

Bakteriálne vektory

BaktofekciaBaktofekcia– ListeriaListeria– EscherichiaEscherichia– SalmonellaSalmonella

Alternatívna génová terapiaAlternatívna génová terapia

Baktofekcia

Alternatívna génová terapia

Klinika

1990 – prvá klinická štúdia 1990 – prvá klinická štúdia

Severe combined immunodeficiencySevere combined immunodeficiency ((SCIDSCID))

Retrovírusový vektorRetrovírusový vektor

Integrácia do chromozómuIntegrácia do chromozómu

Ex vivoEx vivo

Klinika

Klinika

Klinika

Problémy GT

EtickéEtické

Prenos génuPrenos génu– ÚčinnosťÚčinnosť– ŠpecificitaŠpecificita– BezpečnosťBezpečnosť– Regulácia expresieRegulácia expresie

September 11, 2001September 11, 2001

February 15-16, 2001February 15-16, 2001