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Valorización de la fracción proteica del agua de cola del
proceso productivo de la harina de pescado mediante
hidrólisis enzimática y filtración cerámica
Laura Pérez Megíasa*; Sandra Balsellsa; Sílvia Juncàb; Camilo Avedañoc; Edxon
Licon-Bernala, F. Xavier Simón Fonta; Montse Jorbaa; Julia García-Montañoa aCentro Tecnológico LEITAT, c/Innovació, 2, 08225 Terrassa (Barcelona) bLEF ingenieros, c/Francesc Macià, 25, 08755 Castellbisbal (Barcelona) cAZ Ingeniería y Ma´quinas Ltda., Av. Tobalaba 4033-B, Providencia Santiago (Chile)
* Persona de contacto (lperez@leitat.org)
RESUMEN
Durante la producción de varios alimentos y productos alimenticios del sector pesquero
ocurre una pérdida inevitable de proteína debido a la producción de harina de pescado.
La mayoría de estas pérdidas de productos valiosos se encuentran en el agua, por
ejemplo, cuando se lleva a cabo la deshidratación por centrifugación. El subproducto
acuoso en esas instalaciones se conoce como agua de cola o stickwater y puede
contener 8-10% de sólidos con un importante contenido proteico. Debido a ese
contenido de proteína, el agua de cola es una corriente de particular importancia desde
el punto de vista técnico, ambiental y económico. Además, las aguas residuales
producidas por la industria pesquera son la principal fuente de contaminación en el lecho
marino y el agua de mar cuando se derraman en el océano donde se establecen esos
tipos de plantas industriales. Por lo tanto, es importante crear una ruta viable para tratar
el agua de cola correctamente y, a su vez, recuperar sustancias valiosas presentes en
él. El presente estudio describe un método confiable que extrae, purifica y recupera la
proteína presente en el agua de cola mediante un proceso híbrido basado en hidrólisis
enzimática y tecnología de membrana.
Palabras clave: valorización de corrientes de proceso, economía circular, hidrólisis
enzimática, membranas cerámicas, filtración cerámica, agua de cola, harina de
pescado; recuperación de proteína
Inevitable loss of protein due to industrial fishmeal producing is occurring during the
production of several food and feed products. Most of these valuable product losses are
found in water, for example when dewatering by centrifugation is carried out. The
aqueous byproduct in those facilities is known as stickwater and it can contain 8-10%
solids with important protein content. Due to that protein content, stickwater is a stream
of particular importance from the technical, environmental and economic point of view.
Moreover, wastewater produced by fishery industry is the main source of pollution on the
sea sediments and seawater when it is spilled to the ocean where those kinds of
industrial plants are established. Therefore, it is important to create a viable route for
treating stickwater properly and in turn recovering valuable substances contained in it.
The present study describes a reliable method which extracts, purifies and recovers the
protein present in stickwater by a hybrid process based in enzymatic hydrolysis and
membrane technology.
Key Words: process streams valorization; circular economy; enzymatic hydrolysis;
ceramic membranes; stickwater; ceramic filtration; fishmeal; protein recovery
1. INTRODUCCIÓN
El agua de cola es una corriente de proceso muy importante en volumen que se genera
durante el proceso productivo de la harina de pescado (Figura 1). Esta corriente llega a
representar el 60% en volumen del pescado procesado y suele contener del orden de
un 10% de sólidos (mayoritariamente proteína1). Este sector de la industria pesquera,
comprometido con proyectos de mejora continua, ha dedicado esfuerzos a la
recuperación de la proteína contenida en el agua de cola por poseer un gran valor. De
hecho, su recuperación y posterior valorización como harina de pescado permite
aumentar la calidad del producto final –destinado a alimentación animal– y mejorar su
precio en el mercado.
Figura 1. Harina de pescado
Aunque el concentrado de proteína obtenido de estas corrientes puede enriquecer la
harina de pescado u otros productos en contenido proteico, es necesario que tenga una
baja concentración de sales y aminas biogénicas, como la histamina, para que sea
adecuado para incorporarse a la harina de pescado u otras matrices y aumentar así el
valor nutricional y de mercado del producto (Tabla 1). Por lo tanto, es importante diseñar
un tratamiento viable para tratar adecuadamente el agua de cola (Tabla 2), de manera
que se pueda incrementar su contenido proteico y a la vez eliminar las sustancias no
deseadas (ej. histamina, sales).
Tabla 1. Estándares de calidad de la harina de pescado2
Harina de pescado Clasificación
Parámetros Unidades PREMIUM SUPER PRIME PRIME STANDARD
Proteína % min 70 68 67 65/64
Grasa % max 10 10 10 10
1 García, S.C.O. (2007). Generación de efluentes con baja carga contaminante y caracterización de sólidos derivados del agua de cola tratada por centrifugación y ajuste de pH. Tesis doctoral, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (Méjico) 2 http://www.hayduk.com.pe/harina_calidades.htm
Harina de pescado Clasificación
Parámetros Unidades PREMIUM SUPER PRIME PRIME STANDARD
Humedad % max 10 10 10 10
Ácidos grasos % max 7 7.5 10 -
Cenizas (sin sal) % max 14 14 15 -
Arena y sal % max 4 4 4,5 5
TVN 100mg/100g 86 100 120 -
Histamina ppm max 100 500 1000 -
Tabla 2. Caracterización del agua de cola
Determinación Resultado
pH 6,0
Conductividad (mS/cm) 37,9
MES- Materias en suspensión (filtro de microfibra de vidrio borosilicato de 1,2µm) 20-22ºC (%)
1,17 ± 0,05
MES-Materias en suspensión (filtro de nitrato de celulosa de 0,45µm) 75ºC (%)
1,25
Residuo seco (%) 14,33 ± 0,02
Mat. orgánica (%) 11,52 ± 0,03
Cenizas (%) 2,80 ± 0,02
Nitrógeno Kjeldahl (%) 1,93 ± 0,08
Nitrógeno Soluble membrana 1,2µm (20-22ºC) (%) 1,99 ± 0,08
Nitrógeno Soluble membrana 0,45µm (75ºC) (%) 1,75 ± 0,00
Nitrógeno volátil total (TVN) (%) 0,23 ± 0,01
Proteína Kjeldahl (%) 9,51 ± 0,44
Proteína total según método Biuret (%) 14,26 ± 2,18
Aminoácidos libres (%) 0,9 ± 0,03
Perfil proteico SDS-PAGE 5 - 150 kDa
Histamina (%) 0,31 ± 0,01
Grasa (%) 0,36 ± 0,02
2. OBJETIVOS
El presente estudio investiga un tratamiento que permita extraer y purificar la proteína
contenida en el agua de cola mediante dos etapas: un proceso basado en hidrólisis
enzimática seguido de un proceso de filtración mediante tecnología de membrana
(Figura 2). Por una parte, el estudio de hidrólisis enzimática investiga y selecciona:
enzimas, dosis, grado de hidrólisis y tiempo de aplicación. Por otra parte, el estudio del
proceso de filtración determina las condiciones de operación (presión, flujo y
temperatura de filtración) que maximicen el porcentaje de recuperación de proteína y la
eliminación de histamina y sales.
Figura 2. Proceso basado en hidrólisis enzimática y filtración cerámica
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Hidrólisis enzimática
3.1.1. Enzimas
La hidrólisis enzimática tiene como objetivos solubilizar la mayor parte de los sólidos
contenidos en el agua de cola (mayoritariamente proteína) e hidrolizar parcialmente los
péptidos de alto peso molecular. Por un lado, se reduce la viscosidad de la corriente
residual y, consecuentemente, se mejora la operación posterior de filtración con
membranas. Por otro lado, se obtiene un perfil proteico mucho más homogéneo en
comparación con el agua de cola original que contiene una gran variedad de pesos
moleculares, comprendidos entre 5 y 150 kDa. En la Figura 3 se muestra la distribución
de pesos moleculares por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) realizado
en un equipo Mini-PROTEAN Tetra cell de Bio-Rad.
Figura 3. Perfil proteico del agua de cola a diferentes diluciones (1: Patrón Precision Plus Protein Dual Xtra Standard 2-250 kDa; 2: dilución 1/100; 3: dilución 1/50;
4: dilución 1/20; 5: dilución 1/10)
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
Sales y aminas biogénicas
Biorreactor agitado/calorifugado
Bomba
T
Recirculación de proteínas
A evaporador
Stickwater
Sales y aminas biogénicas
Proteínas hidrolizadas purificadas MF-UF-NF
cerámica
T
Se debe tener en cuenta que un grado de hidrólisis demasiado alto originará péptidos
de pequeño tamaño que permearán fácilmente a través de la etapa posterior de filtración
por membrana y se perderán, mientras que un grado de hidrólisis demasiado bajo el
beneficio operacional tendrá poco impacto y no compensará el coste de las enzimas.
Por estos motivos se plantea una hidrólisis parcial de la proteína.
La selección de enzimas viene dada por la necesidad de emplear aquellas que sean de
grado alimentario con el fin de asegurar la calidad de la harina de pescado para el sector
alimentario, y también, por el tipo de proteasa. Se seleccionan enzimas de grado
alimentario tipo endoproteasas, que actúan cortando internamente la proteína, en lugar
de exoenzimas. Las exoenzimas cortan preferentemente las proteínas en los extremos
terminales, liberando aminoácidos y péptidos de pequeño peso molecular, los cuales
podrían causar sabores amargos, sobre todo aquellos péptidos pequeños compuestos
de aminoácidos hidrofóbicos3,4,5. Además, estos péptidos pequeños podrían permear
fácilmente durante el proceso de filtración y perderse hacia el permeado durante el
proceso de filtración por membranas.
Las endoproteasas se seleccionan considerando el rango de pH y temperatura de
procesado industrial del agua de cola, para asegurar que sean activas en el nuevo
proceso. De entre una variedad de enzimas que cumplen estos criterios, se seleccionan
y se ensayan dos enzimas por presentar actividad en una mayor amplitud térmica.
3.1.2. Ensayos de hidrólisis enzimática
La Tabla 3 muestra un resumen de los diferentes ensayos realizados para determinar el
grado de hidrólisis óptimo del agua de cola, es decir, la dosis de enzima y el tiempo
necesarios para obtener una hidrólisis parcial adecuada.
Tabla 3. Protocolo experimental de los ensayos de hidrólisis enzimática
Condiciones fijas pH 5.9 (pH muestra)
Temperatura: 70ºC
Condiciones variables % Enzima respecto agua de cola
Enzima A y enzima B
Tiempo de aplicación: 10, 20 y 30 minutos
Ensayos enzimáticos: dosis de enzimas
respecto agua de cola
Dosis (en ppm): 0, 10, 25, 40, 50*, 500*, 1000* * dosis altas en 30 min
Inactivación Se inactiva la muestra por efecto en frío, para
poder parar la reacción y observar el perfil proteico en aquel tiempo concreto.
Determinación Perfil peptídico SDS-PAGE
3 Peter Amala Sujith and T.V. Hymavathi. Recent developments with debittering of protein hydrolysates.. As. J. Food Ag-
Ind. 2011, 4(06), 365-381 4 Badal C. Sahaa, Kiyoshi Hayashi. Debittering of protein hydrolyzates. Biotechnology Advances 19 (2001) 355–370 5 Heidi Geisenhoff. Bitterness of soy protein hydrolysates according to molecular weight of peptides. Thesis submitted to
the graduate faculty in partial fulfillment of the requirements for the degree of MASTER OF SCIENCE Iowa State University
3.2. Filtración con membranas cerámicas
3.2.1. Membranas cerámicas
Las membranas cerámicas (Figura 4) son adecuadas para esta aplicación ya que son
capaces de soportar condiciones de operación extremas6, como las altas temperaturas
(70-90 ºC) del proceso productivo de la harina de pescado.
Figura 4. Membranas cerámicas con distintas configuraciones para micro-, ultra- y nanofiltración.7
El correcto dimensionado involucra el diseño de un tren de filtrado que permita recuperar
el máximo % de proteína presente en el agua de cola. Usar membranas de tamaño de
poro grande conlleva a la pérdida de proteína por el permeado, mientras que usar
membranas de tamaño de poro pequeño implica una obturación de la membrana y,
consecuentemente, bajos flujos y altas presiones que hacen inviable el proceso.
La Tabla 4 muestra las características de las tres membranas cerámicas de Rauschert
/Inopor8 utilizadas en este estudio.
Tabla 4. Características de las membranas utilizadas
Tipo
Microfiltración (MF)
Ultrafiltración (UF)
Nanofiltración (NF)
Geo
metr
ía
Tamaño de poro [nm] 100 5 0.9
Diámetro exterior / interior - largo [mm]
10 / 7 - 500 10 / 7 - 500 10 / 7 - 500
Membrane Cut-off [Da] - 8500 450
Valo
res
esp
ecíf
ico
s
Área de membrana [m2] 0,011 0,011 0,011
Velocidad crossflow [m/s]
0,14 0,14 0,14
Mate
rial Soporte α-Al2O3 α-Al2O3 α-Al2O3
Membrana α-Al2O3 TiO2 TiO2
Porosidad 40-55% 30-55% 30-40%
6 Gitis, V., & Rothenberg, G. (2016). Ceramic membranes: new opportunities and practical applications. John Wiley & Sons. 7 https://rauschert.com/
8 http://www.inopor.com
3.2.2. Proceso de filtración
Después de unos ensayos preliminares (los datos no se muestran) se diseñan tres
trenes de filtrado diferentes con la finalidad de comparar los resultados y determinar qué
opción tiene un balance más equilibrado entre recuperación de proteína, eliminación de
histamina y gasto energético (mayoritariamente marcado por la presión de operación).
Las opciones que se han planteado contienen un proceso de pre-filtrado mediante
filtración a 1 micra para eliminar sólidos más gruesos, seguido de la hidrólisis enzimática
con una dosis determinada y finalmente el proceso de filtración múltiple que contiene
etapas de MF, UF y NF como se muestra en la Figura 5.
Opción 1: Prefiltro + Hidrólisis enzimática + MF + UF
Opción 2: Prefiltro + Hidrólisis enzimática + MF + UF + NF
Opción 3: Prefiltro + Hidrólisis enzimática + MF + NF
Figura 5. Tren de filtrado que incorpora: pre-filtración + hidrólisis enzimática + MF + UF + NF
Cada una de las etapas de filtración se lleva a cabo en el equipo de filtración MMS SW18
de MMS Membrane Systems (Figura 6).
Figura 6. Equipo de filtración MMS SW18 de MMS Membrane Systems
3.2.3. Análisis de proteína e histamina
Para determinar el porcentaje de recuperación de proteína y eliminación de histamina,
se realizan analíticas de las muestras rechazadas por las membranas de MF, UF y/o NF
que finalmente se reincorporarán al proceso de producción de la harina de pescado.
El cálculo de proteína se realiza mediante la determinación de nitrógeno Kjeldahl basado
en la norma UNE-EN 25663:1994, y multiplicando el valor de nitrógeno por el factor de
colágeno (5,6).
La determinación de histamina se realiza mediante cromatografía de líquidos (HPLC-
DAD Agilent 1200) según norma ME-711.04-070.
4. RESULTADOS
4.1. Determinación de la dosis de enzima y grado de hidrólisis
Los diferentes ensayos de hidrólisis parcial del agua de cola, determinaron que la
enzima B hidroliza más que la enzima A y, por tanto, es posible usar menos cantidad de
enzima. Además, se determinó que para ambas enzimas se empieza a observar una
ligera hidrólisis en el minuto 10, siendo la hidrólisis parcial completamente visible en el
minuto 30. Como se observa en la Figura 7, una dosis de tan solo 10 ppm de enzima ya
es suficiente para que se produzca una hidrólisis parcial, rompiendo las proteínas de
alto peso molecular superiores a 75 kDa.
1 2 3 4
Figura 7. Perfil proteico del agua de cola (1: Patrón Precision Plus Protein Dual Xtra Standard 2-250 kDa; 2: agua de cola original; 3: 10 enzima A, 30 min; 4: 10 ppm enzima B, 30 min)
4.2. Condiciones de operación durante el proceso de filtración
La temperatura de trabajo se mantuvo a 70-85ºC para todos los casos. La MF operó a
3 bares y 60 lmh9, la UF operó a 5 bares y 60 lmh y la NF operó a 10 bares y 5-10 lmh.
Se debe tener en cuenta el ensuciamiento o fouling de las membranas, la cual cosa
conlleva a la necesidad de limpiezas periódicas para asegurar el mantenimiento del flujo
de permeado.
4.3. Recuperación de proteína y eliminación de histamina
El tren de filtrado formado por MF + UF (Opción 1) es capaz de recuperar el 89,3% de
proteína y eliminar el 25,4% de histamina. Al añadir NF (Opción 2) incrementa la de
recuperación de proteína hasta un 95,7% pero baja la eliminación de histamina hasta el
13,5% de histamina. Finalmente, el tren de filtración formado por MF + NF (Opción 3)
recupera el 91,1% de proteína y elimina el 21,3% de histamina.
Como se puede observar el la Figura 8, la opción que es capaz de recuperar más
proteína es también la que elimina menos histamina. Es por ello que es necesario buscar
un balance entre estos dos porcentajes y el gasto energético que supone la filtración.
9 Se refiere al flujo de permeado a través de la membrana en L/(m2·h).
1 2 3 4 5
Figura 8. Recuperación de proteína y eliminación de histamina para cada unos de los trenes de filtrado
5. CONCLUSIONES
A temperatura ambiente, el agua de cola tiene un aspecto líquido de color marrón
oscuro, con un ligero olor a pescado. A temperaturas frías de 6ºC, el agua de cola
presenta un aspecto de gelatina sólida, pero este aspecto de gelatina se pierde si la
muestra se somete previamente a tratamiento enzimático. El estudio de hidrólisis
enzimática ha permitido correlacionar la observación de la pérdida de la capacidad de
gelificación a temperaturas frías con el perfil peptídico obtenido, establecer las
condiciones óptimas para obtener una hidrólisis significativa de los péptidos de alto peso
molecular y a la vez, obtener una muestra homogénea para obtener una harina de
pescado de mayor calidad, aplicando finalmente 10 ppm de la enzima B durante 30
minutos.
El estudio del proceso de filtración ha permitido determinar la necesidad de un pre-
tratamiento para la filtración de agua de cola y determinar las condiciones de operación
para cada una de las diferentes etapas de filtración. Las opciones estudiadas han
permitido recuperar más del 90% de proteína y eliminar del orden del 20% de histamina.
La Figura 9 muestra que para alcanzar una harina PRIME, es necesario añadir 1,7 litros
de agua por cada litro de stickwater. Mientras que para alcanzar una harina
SUPERPRIME, serían necesario añadir 2,2 litros de agua por cada litro de stickwater.
89,395,7
91,1
25,4
13,520,3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Opción 1 Opción 2 Opción 3
[%]
Recuperación proteína Eliminación histamina
Figura 9. Diafiltraciones necesarias para pasar de harina PRIME a SUPERPRIME
6. AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el soporte de las tareas realizadas en este estudio al proyecto
REFISHEIN (RDXI-1-0002), con el soporte de ACCIÓ en el marco del Programa
Operativo FEDER Catalunya 2014-2020.
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