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Aus der Strahlenklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. R. Fietkau
_______________________________________________________________
Variabilität der vorbestehenden und unreparierten DNA
Doppelstrangbrüche in Lymphozyten bei Patienten mit
Rektumkarzinom
Der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Doktor der Medizin (Dr. med.)
vorgelegt von
Jana Christina Ulrich, geb. Kröber
aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. med. Dr. h. c. J. Schüttler
Gutachter: PD Dr. med. L. Distel
Gutachter: Prof. Dr. med. R. Fietkau
Tag der mündlichen Prüfung: 03.12.2013
Für meine Eltern und Christian
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung ............................................................................................. 5
1.1. Hintergrund und Ziele ..................................................................................... 5
1.2. Methoden ....................................................................................................... 5
1.3. Ergebnisse und Beobachtungen ..................................................................... 5
1.4. Praktische Schlussfolgerungen ....................................................................... 5
2. Summary ........................................................................................................... 6
2.1. Background ..................................................................................................... 6
2.2. Method ........................................................................................................... 6
2.3. Results and observations ................................................................................ 6
2.4. Conclusion ....................................................................................................... 6
3. Einleitung .......................................................................................................... 7
3.1. Strahlensensibilitätsdiagnostik ....................................................................... 7
3.2. γH2AX als Biomarker ....................................................................................... 7
3.3. Ziele dieser Arbeit ........................................................................................... 8
4. Material und Methoden ..................................................................................... 9
4.1. Studiendesign ................................................................................................. 9
4.2. Durchführung ................................................................................................ 10
4.3. Auswertung ................................................................................................... 11
5. Ergebnisse ....................................................................................................... 13
6. Diskussion ....................................................................................................... 20
7. Literaturverzeichnis ......................................................................................... 25
8. Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................... 29
9. Danksagung ..................................................................................................... 30
10. Lebenslauf ....................................................................................................... 31
5
1. Zusammenfassung
1.1. Hintergrund und Ziele
In den letzten Jahren wurde die Aufmerksamkeit stark auf γH2AX als sensitiven
Biomarker für DNA Doppelstrangbrüche (DSB) gerichtet. Man vermutet, dass γH2AX
die individuelle Strahlensensibilität vorhersagen könne. Das Ziel der Arbeit war es, die
Induktion und Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen mittels γH2AX in einer
großen Studienpopulation zu verfolgen.
1.2. Methoden
Die Lymphozyten von 136 Patienten mit kolorektalem Karzinom (CRC) und 59
gesunden Probanden wurden isoliert und in vitro bestrahlt. Somit wurden DNA Schäden
mittels γH2AX Foci für drei unterschiedliche Bedingungen verglichen, nämlich der
bereits vorhandene bzw. spontane DNA Schaden, der maximal induzierte DNA Schaden
nach einer Bestrahlung mit 0,5Gy und einer Inkubationszeit von 30 Minuten und
letztlich der fortbestehende bzw. nicht reparierte Schaden nach einer Bestrahlung mit
2Gy und einer Inkubationszeit von 24 Stunden.
1.3. Ergebnisse und Beobachtungen
Es wurde festgestellt, dass der durchschnittliche Wert der DNA Doppelstrangbrüche
nach der Reparaturzeit von 24 Stunden in der Patientengruppe höher war als in der
Kontrollgruppe. Das bestätigt die These, dass eine erhöhte Anzahl von DNA
Doppelstrangbrüchen bei Krebspatienten vorhanden ist. Zusätzlich fanden wir heraus,
dass in der Patientengruppe einige Ausreißer außerhalb der zweifachen
Standardabweichung der Gauß’schen Verteilung liegen. Dies gilt sowohl für die
Verteilung der spontanen DNA Doppelstrangbruchrate als auch für die Rate nach 2Gy
Bestrahlung und 24 Stunden Reparaturzeit.
1.4. Praktische Schlussfolgerungen
Wir konnten zeigen, dass die Anzahl der Foci bei Krebspatienten bereits spontan erhöht
ist und diese zusätzlich nach einer in vitro Bestrahlung schlechter repariert werden.
Somit liegt bei einem Teil der Patienten mit Rektumkarzinom eine verminderte
6
Reparaturfähigkeit vor. γH2AX ist in der Lage, diese Ausreißer, die vermutlich erhöht
strahlensensibel sind, aus einem homogenen Patientenkollektiv herauszufiltern.
2. Summary
2.1. Background
In recent years attention has focused on γH2AX as a very sensitive double strand break
indicator. It has been suggested that γH2AX might be able to predict individual radio
sensitivity. Our aim was to study the induction and repair of DNA double strand breaks
labelled by γH2AX in a large cohort.
2.2. Method
Lymphocytes of 136 Colorectal Cancer (CCRC) patients and 59 healthy individuals
were in vitro irradiated and initial DNA damage was compared to remaining DNA
damage after 2Gy irradiation and 24 hours repair time and not irradiated lymphocytes.
2.3. Results and observations
We found out that the mean number of DSB in the reparation time for the patient group
is higher as in the control group, associated with a higher number of DSB in cancer
patients. In addition we found that the patients’ collective has a number of outliers (2-
standard deviation) from a Gaussian distribution for the spontaneous DSB. Mainly the
same patients are also outliers for the normal Gaussian distribution for the 24 hours
repair time.
2.4. Conclusion
We are able to show that the number of DSB is elevated in cancer patients and γH2AX
is capable to detect those outliers of a homogenous patient collective who might be
increased radio sensitive.
7
3. Einleitung
3.1. Strahlensensibilitätsdiagnostik
In der Strahlentherapie ist es notwendig eine Methode zu entwickeln, mit der man die
individuelle Strahlensensibilität eines Patienten vorhersagen kann. So kann das Risiko
des Patienten, eine frühe oder späte Gewebereaktion zu entwickeln, prognostiziert
werden und die Dosis der Strahlentherapie dementsprechend angepasst werden. Ein
prognostischer Test der Krebspatienten vor Therapiebeginn würde die Möglichkeit
eröffnen die Therapie genau an den individuellen Patienten anzupassen und könnte
somit die Nebenwirkungen stark reduzieren. Es wurden bereits unterschiedliche Ansätze
dafür erprobt. Der am häufigsten getestete prädiktive Test dürfte die Messung der
Chromosomenaberrationen im G0 oder G2 – Assay sein. Häufig wurde auch die
Messung der Apoptose und der Zellzyklusregulation durchgeführt. Ebenso wurde das
Zellüberleben im Koloniebildungstest als prädiktiver Test ausprobiert.
Doppelstrangbrüche wurden auch mit gelelektrophoretischen Methoden durchgeführt,
die aber wesentlich aufwendiger und unsensitiver waren als die heutzutage zur
Verfügung stehenden Methoden.
3.2. γH2AX als Biomarker
Um die Entstehung von Doppelstrangbrüchen aufzuzeigen wurde in den letzten Jahren
γH2AX als Biomarker etabliert und seine Wertigkeit als prädiktiver Test erreichte große
Aufmerksamkeit. H2Ax gehört zu der Familie der Histon H2A Familie (Bonner et al.
2008). H2Ax wird, nachdem es ionisierender Strahlung ausgesetzt wurde, rasch
phosphoryliert. Die Phosphorylierung von γH2AX entsteht innerhalb von Minuten und
erreicht ihren Höhepunkt nach ungefähr 30 Minuten (Rogakou et al. 1999). Die Anzahl
der Foci korreliert direkt mit der Anzahl der Doppelstrangbrüche, die in einer Zelle kurz
nach der DNA Schädigung vorhanden sind (Sedelnikova et al. 2002), da gezeigt werden
konnte, dass ein γH2AX Focus einen Doppelstrangbruch (DSB) repräsentiert
(Rothkamm et al. 2002).
Rothkamm et al. proklamierten, dass die Phosphorylierung von γH2AX und dadurch die
Entstehung von Foci generell als konstant akzeptiert werden und somit als quantitativer
Marker für DSB angesehen werden kann, sogar dann wenn nur wenige Foci darstellbar
sind (Rothkamm et al. 2002). Die Effizienz des Nachweises von DNA
8
Doppelstrangbrüchen mittels γH2AX eröffnet die Möglichkeit dieses Protein als
therapeutischen Marker zu nutzen, um die Leistungsfähigkeit von Strahlentherapie,
Medikamenten und anderen Therapiemethoden zu optimieren (Halicka et al. 2009, Kao
et al. 2006, Kuefner et al. 2009).
Dickey et al zeigten, dass γH2AX ein sensitiver Indikator von DNA-
Doppelstrangbrüchen ist und daher möglicherweise als nützliches Werkzeug in der
Erkennung von genotoxischem Stress dienen kann. Solch ein Indikator könnte sowohl
für die Beobachtung von Krebsentstehung und –entwicklung als auch in anderen Fällen
von Zellstress wertvoll sein. Die zukünftige Arbeit in diesem Bereich muss darauf
abzielen, die γH2AX Methode für den klinischen Alltag nutzbar zu machen und so als
praktische Methode einzusetzen, um Krebs zu entdecken und den therapeutischen
Fortschritt zu überwachen (Dickey et al. 2009).
3.3. Ziele dieser Arbeit
Weiterhin besteht die Notwendigkeit dieses Verfahren genau zu untersuchen, um zu
sehen was die γH2AX Methode in der Lage ist zu erreichen. Wir haben es uns zum Ziel
gesetzt, diese Methode an einem großen Patientenkollektiv zu erforschen. Die
Fragestellung war, ob mit dieser Methode Patienten identifiziert werden können, die als
erhöht strahlenempfindlich kategorisiert werden müssten. Untersucht wurde ein
Kollektiv von Patienten mit Rektumkarzinom und diese wurden mit gesunden
Kontrollpersonen verglichen.
9
4. Material und Methoden
4.1. Studiendesign
Die prospektive Studie umfasst eine Gesamtzahl von 195 Personen. Aufgenommen
wurden 136 Patienten mit kolorektalem Karzinom (CRC) und 59 gesunde Probanden.
Das Alter der Patienten liegt zwischen 23 und 87 Jahren, das durchschnittliche Alter
beträgt 63,7 Jahre. Das Alter der Personen der Kontrollgruppe liegt zwischen 27 und 80
Jahren, das durchschnittliche Alter beträgt 56,0 Jahre (Abbildung 1).
Abbildung 1
Geschlechtsverteilung der Studienpopulation
A). Die ganze Studienpopulation geteilt in Patienten- und Kontrollgruppe
B). Die Patientengruppe aufgeteilt nach Geschlecht
C). Die Kontrollgruppe aufgeteilt nach Geschlecht
10
Tabelle 1 gibt einen Überblick über das Stadium des CRC und die Radiochemotherapie
der Patienten.
Tabelle 1: Überblick über die Patientencharakteristika
Tumorstadium Chemotherapie
n/a 4,41% n/a 0,74%
1 0,00% 5-FU 25,74%
2 8,09% 5FU/Oxa 63,24%
3 71,32% Irinotecan wöchentlich 2,94%
4 16,18% keine 0,74%
FU/Irinotecan 3,68%
andere 2,96%
Metastasen Gesamtdosis
(Durchschnitt)
Dosis x
Volumen/Masse
(Durchschnitt)
Ja 89,47% 50,39Gy 0,23
Nein 10,53%
Alle Patienten und alle gesunden Probanden haben ihr schriftliches Einverständnis zur
Teilnahme an dieser Studie gegeben. Die Blutproben wurden kurz vor der ersten
Bestrahlung abgenommen. Danach erhielten die Patienten eine konventionelle
Strahlentherapie mit 1,8Gy pro Fraktion bis zu einer Gesamtdosis von 50,4Gy.
4.2. Durchführung
Die Blutproben der gesunden und kranken Probanden wurden in drei weitere Ansätze
unterteilt. Ein Ansatz wurde als Kontrolle genutzt, um die spontanen γH2AX Foci zu
ermitteln. Die anderen Proben wurden in vitro bestrahlt. Eine Probe wurde mit 0,5Gy
bestrahlt und wurde danach 30 Minuten bei 37°C inkubiert, die andere Probe wurde mit
2Gy bestrahlt und hatte eine Inkubationszeit von 24 Stunden. Die Lymphozyten wurden
mittels Ficollgradienten und Zentrifugation isoliert und auf einen Objektträger
zytozentrifugiert (StatspinCytofuge, Kreatech, Germany). Die Proben wurden mit
Methanol und Aceton fixiert und danach mit einer salzhaltigen, phosphatgepufferten mit
11
FKS versetzten Lösung gewaschen. Anschließend wurden die Proben mit dem anti-
γH2AX (Abcam, Cambridge, UK) inkubiert, erneut mit PBS gewaschen und danach mit
einem sekundären fluoreszierenden Antikörper (Molecular Probes, Karlsruhe,
Deutschland) inkubiert. Abschließend wurden die Lymphozyten erneut in PBS
gewaschen, mittels DAPI eingefärbt und mit Vectashield Medium (Vector
Laboratoriers, Peterborough, UK) eingedeckt.
4.3. Auswertung
Die Bilder wurden mit einem mittels Laser scannenden Mikroskop (Zeiss Oberkochen,
Deutschland) in 40 Z-Ebenen mit einem Abstand von 0,23µm (Metasystem, siehe
Abbildungen) aufgenommen und zu einem 3D Bild fusioniert, so dass die Foci aller
Ebenen dargestellt werden können (Abb. 2 + 3).
Abbildung 2
Mikroskopische Bilder der Zellen mit ihren Doppelstrangbrüchen, die durch Immunofluoreszenz sichtbar
gemacht werden. Man sieht die einzelnen Ebenen, die von dem Mikroskop gescannt wurden.
12
Abbildung 2 + 3:
Mikroskopische Bilder der Zellen mit ihren Doppelstrangbrüchen, die durch Immunofluoreszenz sichtbar
gemacht werden. Das Mikroskop scannt unterschiedliche Ebenen, die dann zu einem 3D Bild fusioniert
werden. Auf diese Weise können alle Foci einer Zelle erfasst werden, egal in welcher Ebene sie liegen.
Ein Bereich von 2mm2 (630x) wurde automatisch aufgenommen. Für jede der Proben
wurden mindestens 1000 Lymphozyten mittels einer Bildanalysesoftware (Biomas,
Erlangen, Deutschland) ausgezählt. Alle Kerne wurden nach morphologischen Kriterien
überprüft und bewertet, apoptotische Zellen und Zell-in-Zell-Fusionen wurden
ausgeschlossen. Mittels einer Bildanalysesoftware wurden die γH2AX Foci jedes
Kernes ausgezählt (Endt et al. 2011). Die Durchschnittswerte der Foci pro Zelle wurden
für jede Person vor Bestrahlung, nach 0,5Gy Bestrahlung und 30 Minuten
Inkubationszeit und nach 2Gy Bestrahlung und 24 Stunden Inkubationszeit bestimmt.
13
5. Ergebnisse
Die Anzahl der γH2AX Foci pro Zelle wurde für die Gruppe der 136 CRC Patienten mit
den 59 gesunden Personen der Kontrollgruppe verglichen (Abbildung 4).
Abbildung 4:
Überblick über die Verteilung der Studienpopulation für die drei Bedingungen. Die Verteilung der
spontanen und 2Gy/24h Doppelstrangbruchrate sind signifikant unterschiedlich (p > 0,001). Außerdem
zeigt sich ein unterschiedliches Verteilungsintervall.
Die genaueren Patientendaten sind in Tabelle 1 aufgelistet. Pro Patient wurden drei
Blutproben analysiert. Die ermittelten γH2AX Foci vor Bestrahlung wurden als Rate der
spontanen Doppelstrangbrüche angesehen und von den anderen Werten als Hintergrund
abgezogen. Die initial induzierten Foci wurden anhand der Anzahl nach 0,5Gy
Bestrahlung und 30 Minuten Inkubationszeit bestimmt. Die unreparierten Foci wurden
nach einer Bestrahlung mit 2Gy und einer Reparaturphase von 24 Stunden ermittelt.
14
Zuerst wurde festgestellt, wie viele Zellen gezählt werden müssen, um zuverlässige
γH2AX Werte zu erhalten. Eine adäquate Mindestanzahl, um reproduzierbare γH2AX
Werte zu erreichen, wurde mittels einer Blend Altmann Analyse errechnet. Der Wert,
der eine exakte Übereinstimmung zeigt, soll 100% betragen und zeigt sich bei einer
Auswertung von 1000 Zellen. Abweichungen nach oben oder unten spiegeln sich in
höheren bzw. niedrigeren Prozentzahlen wieder. Eine Abweichung von ± 15% wurde
als Toleranzgrenze festgelegt. Wenn nur 400 unbestrahlte Zellen gezählt wurden, war
der Bereich, in dem sich die γH2AX Foci zeigten, sehr breit. Wenn 600 Zellen
ausgewertet wurden, befanden sich 75% der erhaltenen Werte innerhalb der
Toleranzgrenze (Abb. 5). 95% der Werte befanden sich innerhalb des Toleranzbereichs,
sobald man 800 Zellen auswertete. Daraus wurde erschlossen, dass ein Minimum von
600 Zellen ausgezählt werden muss, wenn möglich wurden jedoch 1000 Zellen
ausgewertet (Abb. 6).
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0
MItte
lwert
dif
fere
nz
Foci / Zelle
Abbildung 5:
Blend-Altmann-Blot für die Anzahl der Foci pro Zelle bei einer Bestrahlung mit 0,5Gy und einer
Inkubationszeit von 30 Minuten . Es wurde verglichen, wie hoch die Mittelwertdifferenz liegt, wenn man
600 Zellen im Vergleich zu 200 Zellen auszählt.
15
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0
MItte
lwert
dif
fere
nz
Foci / Zelle
Abbildung 6:
Blend-Altmann-Blot für die Anzahl der Foci pro Zelle bei einer Bestrahlung mit 0,5Gy und einer
Inkubationszeit von 30 Minuten . Es wurde verglichen, wie hoch die Mittelwertdifferenz liegt, wenn man
1000 Zellen im Vergleich zu 600 Zellen auszählt.
Die bereits vorbestehende Anzahl an γH2AX Foci war bei der Gruppe der Patienten mit
CRC im Vergleich zu der Gruppe der gesunden Personen (p < 0,001) signifikant erhöht.
Hingegen zeigte sich kein Unterschied zwischen den zwei Gruppen bezüglich der
initialen γH2AX Foci nach 0,5Gy Bestrahlung und 30 Minuten Inkubationszeit. Die
restlichen Foci nach 24 Stunden Erholungszeit waren wiederum bei der Gruppe der
Patienten mit CRC signifikant gegenüber den gesunden Probanden erhöht (p<0.001)
(Abbildung 4). Zusätzlich wurden in der Patientengruppe einige Personen mit einer
deutlich höheren γH2AX Anzahl beobachtet. Um diese Beobachtung zu analysieren,
wurden die γH2AX Foci pro Zelle sowohl von den gesunden Probanden als auch von
den Patienten für die drei unterschiedlichen Bedingungen mittels einer Gauß’schen
Verteilung dargestellt. Diese Aufstellung dient dazu, Probanden, die eindeutig nicht
unter die normale Standardverteilung fallen, herauszufiltern und als Ausreißer zu
klassifizieren.
Die Gauß’schen Verteilungen für die Patientengruppe und die Gruppe der gesunden
Probanden wurden angepasst, so dass die Personen außerhalb der 2-fachen bzw. 3-
fachen Standardabweichung identifiziert werden konnten (Abbildung 7 - 9). Der
Kolmogorov-Smirnov Test zeigte, dass alle Gruppen normal verteilt waren. Hingegen
zeigte der strengere Lilliefors Test für alle Bedingungen und Gruppen eine
16
Normalverteilung, außer für die Gruppe der CRC Patienten für die vorbestehenden und
unreparierten γH2AX Foci
Nichts desto trotz, waren die durchschnittlichen Doppelstrangbrüche pro Metaphase für
die meisten Gruppen ähnlich oder nur leicht erhöht verglichen mit dem Mittelwert ihrer
normalen Verteilungen (Tabelle 2).
Tabelle 2:
Diese Tabelle zeigt wie viele Personen der gesunden Probanden (1. Spalte) bzw. der CRC Patienten (2.
Spalte) außerhalb der einfachen bis dreifachen Standardabweichung ihrer Gauß’schen Verteilung liegen,
sowohl für die spontanen, als auch für die unreparierten Doppelstrangbrüche. Die 3. Spalte zeigt das
Verhältnis an, nämlich wie viel Prozent der CRC-Patienten außerhalb der einfachen bis dreifachen
Standardabweichungen der Gauß’schen Verteilung der gesunden Probanden liegen.
Gruppe Gesunde Probanden CRC Patienten CRC Patienten
Verteilung Gesunde Probanden CRC Patienten Gesunde Probanden
Bedingung spontan 2 Gy, 24h spontan 2 Gy, 24h spontan 2 Gy, 24h
> 1 x SD 17,2% 11,9% 21,9% 21,2% 42,3% 33,6%
> 2 x SD 5,2% 3,4% 14,6% 8,8% 22,6% 14,6%
> 3 x SD 3,4% 0,0% 5,1% 2,9% 18,2% 8,8%
Eine Gruppe von Ausreißern konnte identifiziert werden, die außerhalb der zwei- bzw.
dreifachen Standardabweichung der Gauß’schen Verteilung liegt. Dies gilt in der
Patientengruppe sowohl für die bereits vorbestehenden γH2AX Foci sowie für die
unreparierten γH2AX Foci nach 2Gy Bestrahlung und 24 Stunden Reparaturzeit. Für die
Kontrollgruppe zeigte sich für alle drei Bedingungen durchwegs eine Normalverteilung
(Abb. 7 + 8).
Zusätzlich lässt sich anhand der Abbildungen 7 +8 feststellen, dass die Gauß’sche
Verteilung für die Patientengruppe bei den spontanen DSB und bei den DSB nach 2Gy
Bestrahlung und 24 Stunden Reparaturzeit nach rechts verschoben ist (Abb. 7 +8).
17
Abbildung 7:
Verteilungsbreite der individuellen DNA-Doppelstrangbrüche, die bei in vitro bestrahlten Lymphozyten
mittels Immunofluoreszenz gemessen wurde. Die Daten wurden anhand einer Gauß’schen Verteilung für
spontane DNA-Doppelstrangbrüche aufgetragen. Die vertikalen durchgezogenen Linien zeigen den Wert
der zweifachen und dreifachen Standardabweichung von dem Mittelwert der CRC Gruppe (Distel et al.
2006). Zusätzlich ist die Gauß’sche Verteilung der CRC Patienten nach rechts verschoben.
18
Abbildung 8:
Verteilungsbreite der individuellen DNA-Doppelstrangbrüche, die bei in vitro bestrahlten Lymphozyten
mittels Immunofluoreszenz gemessen wurde. Die Daten wurden anhand einer Gauß’schen Verteilung für
2Gy/24h aufgetragen. Die vertikalen durchgezogenen Linien zeigen den Wert der zweifachen und
dreifachen Standardabweichung von dem Mittelwert der CRC Gruppe (Distel et al. 2006). Zusätzlich ist
die Gauß’sche Verteilung der CRC Patienten nach rechts verschoben.
Hingegen zeigte sich, dass auch die Patientengruppe bei einer Bestrahlung mit 0,5Gy
und 30 Minuten Inkubationszeit gut durch eine Gauß’sche Verteilung gefittet werden
kann (Abbildung 9).
19
Abbildung 9:
Verteilungsbreite der individuellen DNA-Doppelstrangbrüche, die bei in vitro bestrahlten Lymphozyten
mittels Immunofluoreszenz gemessen wurde. Die Daten wurden anhand einer Gauß’schen Verteilung für
0,5Gy und 30min Reparaturzeit aufgetragen. Die vertikalen durchgezogenen Linien zeigen den Wert der
zweifachen und dreifachen Standardabweichung von dem Mittelwert der CRC Gruppe (Distel et al.
2006). Die Gauß’sche Verteilung zeigt eine Normalverteilung.
20
6. Diskussion
Es gibt bereits mehrere Studien, die den klinischen Nutzen von γH2AX als einen
Marker für die individuelle Strahlensensibilität eines Patienten diskutieren. Olive et al.
proklamierten die These, dass die unterschiedlichen Reparatureigenschaften von DNA
Doppelstrangbrüchen zu einer unterschiedlichen Strahlensensibilität der Individuen
führen. Demnach wurde ein schnellerer Verlust von γH2AX Foci in menschlichen
Zelllinien mit höheren Überlebensraten in Verbindung gebracht, da diese eine bessere
Reparaturkapazität von DNA Doppelstrangbrüchen und dadurch eine höhere Resistenz
gegenüber ionisierender Strahlung indizieren (Olive et al. 2004). Das führt zu der
Schlussfolgerung, dass eine korrekt durchgeführte Schadensprozessierung der DNA
Doppelstrangbrüche mit dem zeitlichen Entstehen und Verschwinden von γH2AX Foci
assoziiert sein könnte (Werbrouck et al. 2009).
Eine andere Studie kam zu dem Ergebnis, dass eine durchflusszytometrische Methode,
die auf der γH2AX Induktion in periphere Blutlymphozyten von Patienten mit
strahlentherapeutischer Behandlung basiert, ein robustes, schnelles und zuverlässiges
Verfahren darstellen könnte, um normale Gewebsreaktionen während einer
Strahlentherapie vorhersagen zu können. Es wurden jedoch weitere Untersuchungen mit
einem größeren Patientenkollektiv gefordert, um die wichtige Studie zu validieren
(Bourton et al. 2011).
Allerdings gab es in letzter Zeit einige Studien die widersprüchliche Resultate
erbrachten und einige Schwächen der γH2AX Methode aufzeigten. Werbrouck et al
kamen durch ihre Studie zu dem Schluss, dass das Zählen von γH2AX Foci, nach einer
in vitro Bestrahlung von isolierten T-Lymphozyten bei gynäkologischen
Tumorpatientinnen, keine Vorhersage über spätere Gewebereaktionen treffen kann
(Werbrouck et al. 2009).
Die Autoren zeigten in einer weiteren Arbeit auch, dass keine Korrelation zwischen
dem γH2AX Foci Modell und dem Risiko für akute Gewebereaktionen bei Patienten
mit IMRT Behandlung bei Kopf-Hals-Tumoren gefunden wurde (Werbrouck et al.
2011).
21
Fleckenstein et al versuchten eine Korrelation zwischen dem Grad der Mucositis und
der Menge von γH2AX Foci nach 24 Stunden herzustellen. Hier zeigte sich jedoch
keine eindeutige Verbindung zwischen der Schwere der Mucositis und der Anzahl der
γH2AX Foci nach 24 Stunden. Es zeigte sich aber, dass die Patienten ein höheres Risiko
hatten, eine schwere Mucositis zu entwickeln, wenn die Anzahl der γH2AX Foci erhöht
war. Die Autoren führen diese Beobachtungen darauf zurück, dass nur eine Minderheit
der Patienten erhöht strahlensensibel ist und diese dadurch ein erhöhtes Risiko haben,
ernsthafte Gewebereaktionen zu entwickeln. Diese Gruppe wird von der Mehrheit der
Patienten mit normaler Strahlensensibilität übertroffen, die dennoch das Risiko haben
therapiebedingte Komplikationen zu erleiden, wenn auch mit einer geringeren
Wahrscheinlichkeit. Dadurch treten in der Gruppe der nicht erhöht
strahlenempfindlichen Patienten absolut mehr therapiebedingte Nebenwirkungen auf als
in der Gruppe der strahlenempfindlichen Patienten. Die Autoren sehen das als
Erklärung, warum keine enge Verbindung zwischen der Reparaturrate der
Doppelstrangbrüche und dem Grad der Mucositis hergestellt werden kann. Des
Weiteren vermuteten sie, dass das Auftreten einer Mucositis auch mit einer genetisch
determinierten, individuellen Doppelstrangbruchreparaturkapazität in Verbindung steht.
Der Grund dafür ist, dass sie einen Patienten entdeckten, der sowohl eine erhöhte
Doppelstrangbruchrate als auch schwerwiegende Gewebereaktionen zeigte
(Fleckenstein et al. 2011).
Aufgrund dieser unterschiedlichen Ergebnisse forderten Ivashkevich et al weitere
Untersuchungen der γH2AX Methode um zu zeigen, ob diese spezifisch genug ist,
strahlensensible Patienten vorherzusagen. Zugleich unterstützen die Autoren die
Meinung, dass das Verfahren die Möglichkeit schaffe, die spezifische Teilmenge der
strahlensensiblen Patienten mit einem defekten DNA
Doppelstrangbruchreparatursystem herauszufiltern, selbst wenn die Korrelation
zwischen der γH2AX Methode und der Strahlensensibilität im klinischen Gebrauch
ungenügend ist (Ivashkevich et al. 2012).
Dennoch gaben Dikomey et al zu bedenken, dass bei Patienten mit unterschiedlichen
Schweregraden von Spätkomplikationen die individuelle Strahlensensibilität vielleicht
nicht der ausschlaggebende Faktor in klinischen Studien sei (Dikomey et al. 2003).
Zusätzlich haben genetische Tests, die sich mit feinen Variationen in Genen des DNA
Doppelstrangbruchreparatursystems beschäftigen (z. B. ein einziger Nukleotid
22
Polymorphismus) gezeigt, dass diese mit Strahlenschäden nach einer Strahlentherapie
assoziiert sind (Löbrich et al. 2005, Andreassen et al. 2003, Werbrouck et al. 2009).
Ergänzend proklamiert eine weitere Studie, dass eine Persistenz von γH2AX Foci nach
der initialen Schädigung der DNA impliziert, dass etwas von dem Schaden nicht
repariert wird und damit eine verminderte Reparaturfähigkeit vorliegt. Dies wiederum
macht γH2AX zu einem guten Kandidaten, um eine schnelle Beurteilung
strahlensensibler Personen durchzuführen (Hamasaki et al. 2007) und somit Zelllinien
und Personen mit defektem DNA Reparatursystem identifizieren zu können (Taneja et
al. 2004).
Zusätzlich wurde bereits veröffentlicht, dass eine erhöhte γH2AX Foci Anzahl oft in
menschlichen Krebsmodellen gefunden werden kann, wie zum Beispiel bei Zellen des
Gebärmutterhalskrebs (Banath et al. 2004, Yu et al. 2006), Melanoms (Warters et al.
2005), Kolokarzinoms, Fibrosarkoms, Osteosarkoms, Glioms und Neuroblastoms
(Sedelnikova et al. 2006). Die Ergebnisse lassen vermuten, dass eine erhöhte Anzahl
von Doppelstrangbrüchen bzw. DNA Schädigung ein generelles Charakteristikum der
Krebsentstehung ist (Banath et al. 2004, Yu et al. 2006, Warters et al. 2005,
Sedelnikova et al. 2006, Bartkova et al. 2005, Gorgoulis et al. 2005).
Diese Aussage korreliert mit unserem Ergebnis, dass die Gauß’sche Verteilung der
Patientengruppe nach rechts verschoben ist im Vergleich zur Kontrollgruppe für die
spontanen Doppelstrangbruchraten und die Doppelstrangbrüche nach 2Gy Bestrahlung
und 24 Stunden Reparaturzeit, die dadurch erhöhte Doppelstrangbruchraten für die CRC
Patienten zeigen (Abbildung 7 + 8). Abbildung 10 zeigt die Ausreißer, die außerhalb der
zwei- bzw. dreifachen Standardabweichung der Gauß’schen Verteilung der CRC-
Patienten liegen, sowohl für die spontanen Doppelstrangbrüche, also auch für die DSB
nach einer Bestrahlung mit 2Gy und anschließenden 24 Stunden Regenerationszeit.
23
Abbildung 10:
Überblick über den Zusammenhang der spontan vorliegenden DNA-Doppelstrangbrüche im Vergleich zu
den Doppelstrangbrüchen nach 2Gy Bestrahlung und einer 24 stündigen Reparaturzeit.
Hingegen zeigt die Gauß’sche Verteilung nach einer Bestrahlung mit 0,5 Gy und einer
Inkubationszeit von 30 Minuten, die uns den initialen Schaden darstellt, eine
Normalverteilung ohne Ausreißer (Abbildung 9). Wir schlussfolgern aus diesen
Beobachtungen, dass man anhand der Normalverteilung diejenigen Patienten als
Ausreißer ermitteln kann, die strahlensensibler sind (Abbildung 7 + 8).
Es gibt diese Gruppe von Ausreißern für die spontanen und die unreparierten
Doppelstrangbrüche, nicht aber für diese, die den initialen maximalen Schaden
darstellen. Daraus kann man wohl vermuten, dass dieser Beobachtung ein Mangel an
ausreichender Kapazität Doppelstrangbrüche zu reparieren zu Grunde liegt, egal ob
diese durch Umweltfaktoren oder Strahlung verursacht sind. Nicht ausschlaggebend
scheint zu sein, dass durch eine erhöhte Strahlensensibilität deutlich mehr
Doppelstrangbrüche initiiert werden. Als Konsequenz daraus lässt sich schließen, dass
diese Patienten wegen einer schlechteren Reparatur der DNA-Doppelstrangbrüche mit
einer erhöhten Wahrscheinlichkeit an einer Krebserkrankung zu erkranken behaftet
sind. Ebenso kann man postulieren, dass diese verminderte Reparaturfähigkeit für eine
erhöhte Normalgewebsreaktion verantwortlich ist und dies weniger von dem
24
verursachten Schaden als von einer verminderten Fähigkeit, DNA-Doppelstrangbrüche
zu reparieren, ausgeht.
Wir denken, dass die Stärke der γH2AX Methode darin liegt, eine Gruppe von
Ausreißern zu identifizieren, die entweder eine defektes Reparatursystem für
Doppelstrangbrüche haben oder erhöht strahlenempfindlich sind, wodurch sie auch eine
erhöhte Tendenz zur Krebsentstehung haben. Den genauen Defekt aufzuzeigen, ist das
Verfahren jedoch nicht in der Lage. Um Spätkomplikationen mit den erhöhten γH2AX
Foci Werten in Verbindung zu setzen ist ein weiteres Follow-up in drei bis fünf Jahren
notwendig.
25
7. Literaturverzeichnis
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8. Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CRC Kolorektales Karzinom
DAPI 6-Diamidino-2-phenylindol
DNA Desoxyribonukleinsäure
DSB Doppelstrangbruch
DSBs Doppelstrangbrüche
FBS fetal bovine serum
Gy Gray
IR ionisierende Strahlung
PBS Phosphate buffered saline
PCNA proliferierende Zellkern-Antigen
SD Standardabweichung
u. a. unter anderem
z. B. zum Beispiel
γH2AX Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139)
30
9. Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen meiner Arbeit
beigetragen haben.
Ich danke Prof. Dr. med. Rainer Fietkau, Direktor der Strahlenklinik der Friedrich-
Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, für die Möglichkeit, eine klinisch-
experimentelle Arbeit mit einem so großen Patientenkollektiv durchführen zu können
und außerdem für das Bereitstellen des Arbeitsplatzes im Labor für Strahlenbiologie
und der zahlreichen Arbeitsmaterialien.
Ein ganz spezieller Dank gilt meinem Doktorvater PD Dr. med. Luitpold V. Distel, der
immer ein offenes Ohr für alle Fragen und Probleme hat und dessen Betreuung durch
seine stetige Anwesenheit im Labor einmalig ist. Vielen Dank für eine unkomplizierte,
offene und hilfsbereite Arbeitsatmosphäre.
Ein ganz besonders großer Dank gilt Elisabeth Müller und Doris Mehler für ihre
fortwährende Hilfe und Unterstützung in jeglicher Hinsicht, ohne die ein Arbeiten im
Labor so nicht möglich gewesen wäre und die diese Arbeit zu etwas ganz besonderem
gemacht haben.
Abschließend gilt mein Dank meinem Freund Christian Ulrich und meinen Eltern
Angela und Christoph Kröber, die mich stets unterstützt und ermutigt haben.
31
10. Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name: Jana Christina Kröber
Geburtsdatum: 21. Juli 1984
Geburtsort: Nürnberg
Eltern: Johann Christoph Kröber (Wirtschaftsberater)
Angela Elisabeth Kröber (Grundschullehrerin)
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand: ledig
Konfession: römisch-katholisch
1991-1995 Billroth Grundschule Nürnberg
1995-2004 Melanchthon Gymnasium Nürnberg, Abschluss:
Allgemeine Hochschulreife
08 - 12/ 2001 Schüleraustausch USA Wilson High-School Florence,
South Carolina
10/ 2002 - 06/ 2013 geringfügige Beschäftigung bei Christoph Kröber e.K.
10/ 2004 - 02/2005 Studium der Kulturwirtschaft an der Universität Passau
09/ 2005 – 02/2006: Praktikum am Caritas Pirckheimer Haus
04 - 08/ 2005 Pflegepraktika am Krankenhaus Martha Maria, Klinikum
Nürnberg Süd und Krankenhaus Altdorf
04/ 2006 - 05/2013 Studium der Humanmedizin an der Friedrich-Alexander
Universität in Erlangen
02/ 2007 - 11/ 2012 selbstständige Tätigkeit als Messehostess und für die
Firma Business & Service
10/ 2008 -02/ 2011 Studententutorin am Lehrstuhl Anatomie II für den Kurs
„Funktionelle Anatomie“
03/ 2009 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
08 - 09/ 2009 Famulatur Allgemeine und gynäkologische Onkologie,
Frauenklinik AKH Wien
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08 - 09/ 2010 Famulatur Unfallchirurgie und Traumatologie,
Berufsgenossenschaftlichen Unfallklinik Murnau
02 - 04/ 2011 Praxisfamulatur Chirurgische und Unfallchirurgische
Gemeinschaftspraxis Dr. Bäuerle, Dr. Mederer, Altdorf
02 - 06/ 2012 Praktisches Jahr: Medizinische Klinik 4, Schwerpunkt
Nephrologie / Hypertensiologie - Klinikum Nürnberg
seit 11/ 2010 Klinisch-experimentelle Promotion an der Strahlenklinik
der Universität Erlangen bei Prof. Dr. Fietkau unter
Betreuung von PD Dr. Distel
06- 09/ 2012 Praktisches Jahr: Allgemeinchirurgische und
Unfallchirurgische Abteilungen - Klinikum Nürnberg
10/ 2012 - 01/ 2013 Klinik für Frauenheilkunde – Universitätsklinik Erlangen
05/ 2013 Abschluss Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Ab 08/ 2013 Assistenzärztin an der Klinik für Unfallchirurgie und
Orthopädie des Klinikum Nürnberg Süds
Erlangen, Juli 2013
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