VIRUSOLOĢIJA (VĪRUSI UN ĀRPUSHROMOSOMU ĢENĒTISKIE ELEMENTI)

VIRUSOLOĢIJA(VĪRUSI UN ĀRPUSHROMOSOMU ĢENĒTISKIE ELEMENTI)

VĪRUSU UN ĀRPUSHROMOSOMU ELEMENTU GRUPAS

Transpozoni un plazmīdas

• Vispārējs raksturojums - rekombinācijas veidi

• DNS transpozoni

• Retrotranspozoni

• Retropozoni

Transpozoni

Transpozonu vispārējs raksturojums Rekombinācijas veidi:

Vispārējā jeb homoloģiskā rekombinācija (meijoze, garas homologas DNA secības)

Sait-specifiskā (starp divām noteiktām “specifiskām” DNA secībām, piem., un E.coli)

Transpozīcija jeb nelikumīgā rekombinācija illegitimate (viena DNS secība tiek iestarpināta citā bez kādas homoloģijas prasībām, DNS pavedieni tiek pārrauti un atkal savienoti)

Transpozoni

2x103 - 4x104 b.p. garas NS molekulas, spēj pārvietoties no viens integrācijas vietas uz citu viena replikona robežās vai starp replikoniem šūnā, nes gan pārvietošanās funkcijai nepieciešamos gēnus, gan arī papildus funkciju, piem., pretantibiotiku rezistences gēnus.

Transpozonu atklāšana

• 1949.g. - Nestabilās graudu krāsas mutācijas kukurūzai; B. McClintock

• 1963. - 1965. g.g. transpozīcijas baktēriju gal operonā, P. Starlinger, S. Cohen

Struktūra Gēni Pārvietošanāsveids

Piemēri

Ī si, invertēti DNAatkārtojumi galos

Transpozāze(tnpA)Rezolvāze(tnpR)

DNS formā;+/- replikācija

P-elementi (Drosophila)Ac-Ds (Zea mais)Tn3; IS1 (Escherichiacoli)

DNS transpozoni

60.-tie gadi: Shapiro (ASV), Satrlinger (Vācija) transpozīcija baktērijās

IS1 - 768 bp; IS2 - 1442 bp; IS5 - 1195 bp;

Tn 1000 - 9.5 kbp

Baktēriju vienkāršie DNS transpozoni:

Inserciju (IS) elementi

750 - 1x104 b.p. garas DNS molekulas, spēj pārvietoties no viens integrācijas vietas uz citu viena replikona robežās vai starp replikoniem šūnā, nes tikai pārvietošanās funkcijai nepieciešamos gēnus.

Baktēriju vienkāršie DNS transpozoni:

Tn3 (ampicilīna rezistences) grupa

Saliktie transpozoni (baktērijas):

• Tn 5 (KmR)invertēti flankējošo IS elementu atkārtojumi;

• Tn 9 (Cm R)tieši flankējošo IS elementu atkārtojumi;

• Tn 10 (TcR)

Saliktu transpozonu veidošanās

Transpozīcijas veidi:

• Replikatīvā transpozīcija - transpozons pārvieto savu kopiju citā DNA rajonā, saglabājot arī veco lokalizāciju (kointegrāts, resolvāze Tn 3; IS1);

• Konservatīvā transpozīcija - transpozons pārvietojas no vienas vietas genomā uz citu, neatstājot mutācijas donora saitā (Tn 5; IS1?).

Transpozonu vispārējs raksturojums

Saimnieka genoma secību atkārtojumu veidošanās transpozīcijas procesā

Nature Rev. Genetics, May, 2002

Augu transpozoni

Nature Rev. Genetics, May, 2002

Autonomie un atkarīgie replikatīvie transpozoni

Miniature Inverted-repeats Transposable Elements; MITE

Augu vienkāršie DNS transpozoni:

Ripojošā gredzena tipa ssDNS transpozoni – helitroni (2001)

Vladimir V. Kapitonov and Jerzy Jurka, TRENDS in Genetics Vol.23 No.10

The RepHel protein composed of the Rep and SF1 DNA Hel domains is shown in red, and the ssDNA-binding RPA is shown inblue. In some species, the RepHel protein contains additional domains: apurinic EN (in black); cysteine protease (CPR, in green); and different types of zinc fingers (ZF, inbrown).

Ripojošā gredzena tipa ssDNS transpozoni – helitroni

Saliktu transpozonu veidošanās ar

helitronu līdzdalību

synthesis-dependent strand annealing

Bernard La Scola et al.

The virophage as a unique parasite of the giant mimivirus Nature 455, 100-104 (September 4, 2008)

Yutin et al. Virology Journal 2013, 10:158http://www.virologyj.com/content/10/1/158

Virofāgi, polintoni, transpovironi: vīrusveida DNS transpozoni

Virofāgi, polintoni, transpovironi

tektivīrusi

N. Yutin, S. Shevchenko, V. Kapitonov, M. Krupovic, E. KooninA novel group of diverse Polinton-like viruses discovered by metagenome analysis

Yutin et al. BMC Biology (2015) 13:95 DOI 10.1186/s12915-015-0207-4

Adenovīruss kā transpozons:integrācija genomā veido >5000 bp garus IR

N.Hochstein, I.Muiznieks, L.Mangel, H. Brondke, W. DoerflerJOURNAL OF VIROLOGY, May 2007, p. 5349–5361

Adenovīruss kā transpozons:integrēta vīrusa DNS veido līdz > 400 kbp garu cilpu

Transpozīciju pašierobežošanas spēja un imunitāte

Hibrīdu disģenēze / sugu veidošanās modelis.

Drozofīlas. P+ līnija nes P-

elementu; P- līnija - bez P-elementa.

Hibrīdudisģenēze

Hibrīdu disģenēze

Hibrīdu disģenēzes fenotipu veido P elementu transpozīcija P līnijas tēviņu un M līnijas mātīšu krustošanā iegūtajās embrionālajās šūnās. Transpozīcija nenotiek somātiskajās šūnās, jo tikai embrionālajās šūnās veidojas transpozāzes mRNS specifiskais splaisings.Hibrīdu disģenēze novērojama P līnijas tēviņu un M līnijas mātīšu krustošanā, bet ne M līnijas tēviņu un P līnijas mātīšu (mušas ar autonomu P elementu) krustošanā, jo P līnijas mātīšu olas satur daudz represora proteīna, kas nepieļauj transpozāzes transkripciju. M līnijas mātīšu olās šī represora nav dod iespēju P līnijas tēviņu spermas transpozonu kustībai.

Garie RNS transpozoni

Struktūra Gēni Pārvietošanās veids Piemēri

Gari, tiešie DNA atkārtojumi galos

Revertāze, LTR, retrovīrusiem līdzīgi, bez env.

Ar RNA starpfor-mu, no promotera LTR sastāvā

Copia (Drosophila) Ty (Saccharomyces) Bs1 (Zea mais); THE-1

Retrotranspozoni

Transpozoni, kuru replikācijai nepieciešamas DNS-RNS-DNS stadijas, lai pārvietotos pa genomu, kodē šajā procesā piedalošos fermentu - atgriezenisko (reverso) transkriptāzi - revertāzi.

Īsie RNS transpozoni

Struktūra Gēni Pārvietošanās veids Piemēri

Revertāze Ar RNA starpfor-mu, no promotera ārpus Tn

F-elementi (Drosophila) Lines (Homo sapiens) Cin4 (Zea mais)

Retrovīrusiem līdzīgie transpozoni

Migrējošie gēni, vīrusu pēdas cilvēka genomā. Iespējamā vīrusu loma evolūcijas tempa paātrināšanā.

Saskaņotā (concerted) evolūcija. Transpozīciju sprādzieni

PLAZMĪDAS

• Vispārīgais raksturojums• Klasifikācija:

• funkcijas• replikācijas regulācija• nesavietojamība• transmisibilitāte

Plazmīdu vispārīgais raksturojums

Gredzenveida, retos gadījumos lineāri ekstrahromosomālās dsDNS elementi, 3x103 - 1x106 b.p., kas

baktēriju šūnās replicējas fiziski nesaistīti ar nukleoīdu; kodē šūnai nosacīti noderīgas ģenētiskās īpašības; dažreiz kodē proteīnus, kas veido specifiskas morfoloģiskas struktūras (pilus, piocīni) dažreiz spēj integrēties saimniekšūnas genomā (episomas)

Dabā sastopamo plazmīdu garums ~ 3 - ~ 300 kbp.

F faktors atklāts 1946. g. (Lederberg&Tatum); termins “plazmīda” 1952. g. (J.Lederberg)

Plazmīdu atklāšana

Plazmīda - vīruss

Lizogēns fāgs P2 spēj ieģērbt savu olbaltumvielu apvalkā plazmīdu P4, pārvēršot to par vīrusu; Epšteina-Barra vīruss vai -fāgs, kas zaudējis integrācijai nepieciešamos gēnus, spēj eksistēt šūnā autonomā formā.

Lizogēns fāgs

Baktēriju vīruss, kurš spēj eksistēt kā autonomā, tā arī hromosomā integrētā veidā.

Plazmīdu DNS topoloģija

Plazmīdu DNS topoloģija

Plazmīdu DNS topoloģija

Superspiralizācijas blīvums

Superspiralizācija un gēnu ekspresija

vektorplazmīdās

Funkcijas

• Fertilitāte [ F, Hfr; F’]• Rezistence [ R, rtf, modulārā struktūra]• Kolicinogenitāte [ColE, B, V, I, K, Clo]

• Enteropatogenitāte [K88; K98]• Biodegradācija [TOL; XYL]• Kriptiskās plazmīdas• Rekombinantās vektorplazmīdas

Plazmīdu klasifikācija

Fertilitāte [ F, Hfr; F’]

Konjugācijas procesā no šūnas uz šūnu tiek pārnests viens plazmīdas DNS pavediens

Rezistence [ R, rtf, modulārā struktūra]

Rezistence, pret antibiotikām rezistento celmu izplatība klīnikās

Kolicinogenitāte [ColE, B, V, I, K, Clo]

Rekombinantās plazmīdas un vektorplazmīdas – gēnu pārnese un klonēšana

Replikācija

Stingrā kontrole [saskaņoti ar nukleoīdu, neliels kopiju skaits]

Atslābinātā kontrole[nesaskaņoti ar nukleoīdu, liels kopiju skaits]

Plazmīdu klasifikācija

Replikācijas iniciācija ar RNS praimeru

Replikācijas iniciācija ar RNS praimeru

Replikācijas aktivitātes negatīva regulācija ar anti-sens RNS palīdzību

Rekombinantās plazmīdas un vektorplazmīdas – gēnu pārnese un klonēšana

Savienojamība: nejaušs sadalījums pie fiksēta kopējā skaita

Plazmīdu replikācijas stabilitāte:Varbūtība veidoties bezplazmīdu šūnām, ja nav aktīva plazmīdu sadalījuma mehānisma šūnās, kas satur n plazmīdu kopijas

Plazmīdu replikācijas stabilitāti raksturo augšanas ciklu skaits barotnē bez selektīva spiediena, pēc kura vēl 50%

baktēriju šūnu populācijā ir saglabājuši plazmīdu

Plasmid Maintenance Stability

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 3 6 10 20 40

Passages in non-selective media

% o

f A

b r

ezis

tan

t cells

R 6-5 pSC101 pBR322 pBR329

26

40

>40

Plazmīdu replikācijas stabilitāte:Rekombinācijas sitēmu, multimerizācijas efekts

Plazmīdu klasifikācija

SavienojamībaSavienojamības grupas –

vairāku plazmīdu spēja vienlaikus atrasties vienā šūnā

C, FI – FIII, H, I1, I2, J, L – P, S, T, W

Nesavienojamības grupa Plazmīdas FI F, R386 FII R1 FIII Col B-K99, Col B-K166 FIV R124 I R62, R64, R483 (vismaz 5 apakšgrupas) J R391 N R46 O R724 P RP4, RK2 Q RSF1010 T R401 W R388, S-a

Savienojamība:Replikācijas faktori,Piestiprināšanās vietas pie šūnas membrānas

Plazmīdu klasifikācija

Transmisibilitāte

Transmisiblas [ tra – gēni, operons]

Mobilizējamas [ mob saits]

Nemobilizējamas