VSTP-LT2

CHƯƠNG 2

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

VI SINH THỰC PHẨM

I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP

- Dùng để xác định các loại vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn: nấm men, tảo đơn bào, bào tử mốc

- Quy trình cho phép xác định nhanh chóng số lượng vi sinh vật

-Không phân biệt được tế bào sống và chết

-Không phân biệt được các tế bào vi sinh vật và hạt vật thể

-Hạn chế đối với huyền phù có mật độ thấp

Buồng đếm vi sinh vật

Đếm trực tiếp bằng buồng đếm

Goriep

Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào

Cách đếm tế bào trong buồng đếm

Quy trình:

- Pha loãng mẫu (5-10 tế bào/ô nhỏ)

- Nạp mẫu vào buồng đếm

- Đếm số lượng tế bào hiện diện trong 5

ô lớn

Tính mật độ:

Mật độ tế bào: N/ml = 0,25a x 106 tế

bào/ml

a: trung bình cộng số lượng tế bào

trong 5 ô lớn

Qui trình xác định số lượng tế bào vsv trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu

II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

- Dùng để xác định các loại vi sinh vật sống trong mẫu

- Độ nhạy cao, định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp

- Có thể định lượng các vi sinh vật kích thước nhỏ, di động

Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu

Không sử dụng nước cất và nước muối sinh lý để pha loãng mẫu thực phẩm

Các dung dịch pha loãng mẫu

• Buffered peptone water (BPW)

Saline peptone water (SPW)

NaCl 8,5g

Peptone 1,0g

Nước cất vừa đủ 1 lít

NaCl 5g

Peptone 10g

Nước cất vừa đủ

1 lít

Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu

pha loãng mẫu lỏng theo dãy thập phân Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng:

10g mẫu + 90ml dung dịch pha loãng => độ pha loãng 101

Các bước tiếp theo tương tự như pha loãng mẫu lỏng

Quy trình:

- Pha loãng

mẫu (25-250

khuẩn lạc/đĩa)

- Tạo hộp đổ

- Nuôi ủ, đếm

số lượng

Cấy mẫu vào môi trường

- Phương pháp cấy bề mặt- Phương pháp đổ đĩa

Phương pháp đổ đĩa

• Chuẩn bị đĩa petri vô trùng• Môi trường được chuẩn bị - hấp khử trùng và

được bảo quản mát ở 45oC trong bể điều nhiệt• Hút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ

thích hợp)• Đổ vào đĩa đã cấy 10 – 15ml môi trường, lắc

đều• Để nguội môi trường (thạch đông đặc)• Đem ủ ở nhiệt độ thích hợp

Phương pháp đổ đĩa

Ưu điểm- Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml)- Xác định được các VSV cần dinh dưỡng tiếp xúc từ nhiều phía- Cho phép đếm được mật độ VSV cao, khoảng 150-300 khuẩn lạcNhược điểm- Không định lượng được những VSV quá nhạy nhiệt- Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nhất định- Khó làm thuần một dòng VSV

Phương pháp cấy bề mặt

• Môi trường phải được chuẩn bị trên đĩa trước 1-2 ngày để khô mặt

• Phương pháp- Cấy 0.1 – 0,3ml vào đĩa môi trường- Trải đều trên mặt bằng que trang tam giác- Để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô mặt

Film

Phương pháp cấy bề mặt

Ưu điểm- Định lượng được các VSV nhạy nhiệt- Có thể nhận dạng đựơc dạng khuẩn lạc đặc trưng- Dễ dàng làm thuần chủng VSV mục tiêu

Nhược điểm- Chỉ cấy đựơc thể tích mẫu nhỏ- Chỉ cho phép đếm được số lượng khuẩn lạc thấp

Bút đếm khuẩn lạc

Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc

Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc

Máy đếm khuẩn lạc Máy đếm khuẩn lạc tự

động

PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

Tính kết quả:

Với : N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi

khuẩn trong 1g hay 1ml mẫuC: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa

petri đã chọn ni : Số hộp petri cấy mẫu tại độ pha loãng thứ idi: nồng độ pha loãng thứ i v: Thể tích mẫu cấy vào trong mỗi đĩa

)...()//(

11 iivdnvdn

CmlghayCFUCFUN

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH HIẾU KHÍ TRONG MẪU THỰC

10 g mẫu + 90 g Salin Pepton Watter

Đồng nhất bằng stomacher / 30 giây

Dung dịch 10 -1

Pha lõang 10-2, 10-3, 10-4,..

Cấy 1ml/petri – 3 độ pha loãng liên tiếp – 2 petri/độ pha lõang

Cho 15-20 ml PCA/petri. Lắc đều

Tổng VSV hiếu khí/g (TPC) N

TPC = n1V1F1 + ….+ niViFi

N: Tổng KL; n: số đĩa cho mỗi nồng độ

V: Thể tích cấy (=1) ; F: độ pha lõang

Để đông đặc

Lật ngược đĩa, ủ ấm 30±1oC/ 72±6h

Khuẩn lạc

Chọn đĩa có 25 – 250 khuẩn lạc đếm

III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC

- Định lượng vi sinh vật có mật độ thấp

- Định lượng thông qua số lượng khuẩn lạc hoặc theo phương pháp MPN

- Kích thước lỗ lọc: 0,45 m hoặc 0,2 m

- Thường dùng màng lọc kỵ nước, in các ô vuông ngăn cản sự mọc lan của khuẩn lạc

Bộ lọc và màng lọc vô trùng

Phương pháp màng lọc

• Kích thước lỗ lọc 0,47µm hay 0,22µm• Đường kính và hình dạng màng lọc phụ

thực vào đường kính phễu lọc• Đường kính màng thường là 45mm

Thiết bị lọc nhiều phễu

Phương pháp lọc VSV

• Phễu lọc, giá đỡ màng lọc phải được vô trùng sau mỗi lần lọc

• Mật độ VSV trong dịch lọc thích hợp: <150 khuẩn lạc/màng

• Thể tích dịch lọc trong 1 lần: 50 -100ml• Nếu thể tích dịch lọc nhỏ hơn thì phải pha loãng

bằng dd pha loãng hay nước cất vô trùng

Phương pháp màng lọc

• Ưu điểm– Xác định được mật độ VSV cụ thể trong

một thể tích mẫu lớn: 10ml, 100ml …• Nhược điểm

– Không thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn

Khuẩn lạc vsv mọc trên màng lọc

1A 1B

1C 1D.

2A 2B

2C 2C

E. coli trên môi trường ID Coli agar

Coliforms trên môi trường ID Coli agar

QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VSV BẰNG PP MÀNG LỌC

Quy trình:

- Khử trùng dụng cụ lọc

- Lọc chân không

- Nuôi cấy màng lọc trên môi trường dinh dưỡng

- Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa petri

Tính mật độ:

A (cfu/ml)= N*d/V

Trong đó: V: thể tích mẫu thể tích mẫu thử (50 or 100ml)

N: tổng số khuẩn lạc trên màng lọc

d: độ pha loãng mẫu

Vi khuẩn phát triển trên màng lọc

IV. PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM

- Kỹ thuật dùng kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí, coliform, coliform phân, nấm mốc, nấm men

- Kỹ thuật dễ thao tác

- Tiết kiệm không gian ủ, bảo quản, thời hạn sử dụng lâu

- Không cần hấp khử trùng môi trường

V. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER)

- Đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu

- Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau

- Kết quả định tính: sinh hơi, đổi màu, hoá đục của môi trường nuôi cấy dương tính

- Độ chính xác phụ thuộc vào số ống nghiệm lặp lại ở mỗi độ pha loãng (3 hoặc 5 lần)

- Phương pháp dùng định lượng mọi nhóm vi sinh vật nuôi trên môi trường chọn lọc, cho kết quả biểu kiến.

Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu.Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lập lại nhiều lần (3 – 10 lần)Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính.Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫu.

Nguyên tắc

• Hai hệ thống MPN- Hệ thống 9 ống- Hệ thống 15 ống

• Đặc điểm- Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như

Sự tạo hơi: Coliforms …Sự đổi màu: S. aureus

- Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớn

Hệ thống 9 ống

10ml mỗi trường

Hệ thống 15 ống

ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

3.1 3.2 3.3 3.4 3.5

1 - Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượng

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

3.1 3.2 3.3 3.4 3.5

10-1

1ml

10-2

1ml

10-3

1ml

2 - Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

3.1 3.2 3.3 3.4 3.5

3 – Đem ống nghiệm ủ ở điều kiện thích hợp

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

3.1 3.2 3.3 3.4 3.5

4 – Quan sát các biểu hiện chứng minh sự phát triển của vsv cần kiểm định

Sựđổi

màu của môi

trường

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

3.1 3.2 3.3 3.4 3.5

5 – Ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng

5

2

1

+ + + + +

+

+

+

5 – Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSV

5

2

1

Tra bảngSố vsv: 70 MPN/g

Kết quả

ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

3.1 3.2 3.3 3.4 3.5

10-1

10-2

10-3

1ml

1ml

1ml

5

2

1

Tra Bảng

Số vsv: 70 MPN/ml

IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER)

Phương pháp MPN (loạt 5 ống)

Bảng tra MPN (loạt 3 ống)

Số lượng ống dương tính

Số MPN/100

mlSố ml mẫu sử dụng

10 1 0,1

0 0 0 -

0 0 1 3

0 0 2 6

0 0 3 9

… … …

3 3 0 240

3 3 1 460

3 3 2 1100

3 3 3 -

Bảng tra MPN (loạt 5 ống)

Quy trình:

- Pha loãng mẫu bậc 10,chọn 3 nồng độ liên tiếp

- Cấy vào loạt ống nghiệm (9 hoặc 15 ống) chứa môi trường chọn lọc một lượng mẫu xác định từ 3 nồng độ đã chọn

- Nuôi ủ, xác định số ống dương tính ở 3 nhóm

- Tra bảng Mac Cradytrị số MPN (a)

Tính mật độ:

Số MPN/100ml (MPN/1g) = a x x d

Với: a: trị số tra từ bảng Mac Crady

V1: thể tích mẫu sử dụng (thường là 1)

V2: thể tích mẫu theo bảng Mac Crady ở loạt ống đầu tiên (10ml)

d: độ pha loãng ở loạt ống đầu tiên

1

2

V

V

VI. PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC

PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC

- Độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với số lượng tế bào vi sinh vật có trong môi trường. Trong một thời gian nhất định, mối quan hệ giữa số lượng vi sinh vật trong nước tỷ lệ tuyến tính với độ đục của môi trường.

- Định lượng vi sinh vật trong môi trường bằng máy đo độ đục hay máy so màu ở bước sóng 550- 610nm.

- Trong phương pháp này cần xây dựng biểu đồ tương quan tuyến tính giữa độ đục và số lượng vi sinh vật trong môi trường bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp

PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC• Phương pháp tiến hành:

- Pha loãng huyền phù chứa vi sinh vật cần kiểm nghiệm

sao cho các dung dịch thu được khi đo trên máy so

màu ở bước sóng 610nm được các trị số OD gần 0,1;

0,2; 0,3; 0,4; 0,5.

- Dùng phương pháp đếm trực tiếp xác định số lượng tế

bào vi sinh vật có trong 1ml kí hiệu N/ml

- Tính giá trị log(N/ml) cho từng nồng độ pha loãng, Vẽ

đồ thị biểu diễn log(N/ml) theo các giá trị OD. Xác định

khoảng tuyến tính giữa log(N/ml) với OD.

• Tính mật độ

- Từ trị số OD đo được đối chiếu trên đồ thị tương quan

giữa mật độ tế bào và OD để xác định số lượng tế bào

có trong mẫu.

N/ml = 10a với a=log (N/ml).

VII. PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzym linked

immunosorbent asay)

- ELISA (Phương pháp hấp thụ miễn dịch dùng

enzyme) dựa trên nguyên tắc phản ứng kết

hợp giữa tế bào (kháng nguyên) với một

kháng thể đặc hiệu.

- Tín hiệu phản ứng miễn dịch được nhận biết

qua sự ngưng tủa, kết dính kháng nguyên

kháng thể hoặc bằng những kháng thể đã

được đánh dấu (phát huỳnh quang đồng vị

phóng xạ hay enzyme)

Đĩa giếng ELISA

HỆ THỐNG ELISA

Máy rửa Máy đọc

QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRONG THỰC PHẨM

CÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRONG THỰC PHẨM

1.Tổng vi sinh hiếu khí

2. Tổng nấm men, nấm mốc

3. Coliform tổng số

4. E.coli

5. Sallmonella

6. Staphylococcus aureus

7. Bacillus aureus

….