View
215
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
1
BIOFIZYKA
Wydział Biologii III rok: „Biotechnologia”
PLAN WYKŁADU
1. Fizyczne podstawy struktur cząsteczek oraz oddziaływań wewnątrz- i między-
cząsteczkowych (2 wykłady)
(a) energia cząsteczki; przybliżenie pola siłowego dla dużych biomolekuł
(b) parametry termodynamiczne układu cząsteczek w roztworze (energia swobodna
Gibbsa)
(c) struktura przestrzenna (konformacja) cząsteczki i oddziaływania stabilizujące
(wiązania wodorowe, oddziaływania hydrofobowe, oddziaływania warstwowe i
kation-)
(d) specyficzność wzajemnego rozpoznawania biomolekuł (komplementarność zasad,
wzajemne dopasowanie konformacyjne – „induced fit”).
2. Metody badania struktur i dynamiki białek i kwasów nukleinowych (4 wykłady)
(a) rozdział na podstawie różnic masy cząsteczkowej (ultrawirowanie, elektroforeza)
(b) spektrometria masowa (MS)
(c) spektroskopia molekularna ze szczególnym uwzględnieniem magnetycznego
rezonansu jądrowego (wielowymiarowy NMR, in vivo NMR, nieinwazyjne
obrazowanie MRI)
(d) dyfracja promieniowania rentgenowskiego na monokryształach (rentgenografia)
(e) mikroskopia sił atomowych (AFM)
(f) symulacje komputerowe dynamiki molekularnej (MD).
3. Budowa kwasów nukleinowych DNA i RNA (3 wykłady)
(a) struktura pierwszorzędowa – sekwencjonowanie
(b) struktury wyższorzędowe: drugorzędowe struktury helikalne i niehelikalne,
pseudowęzeł RNA, motyw A-minor, struktura tRNA
(c) modyfikacje DNA przez działanie czynników mutagennych.
4. Budowa białek globularnych, włóknistych i błonowych (3 wykłady)
(a) struktura pierwszorzędowa - sekwencjonowanie
(b) struktury wyższorzędowe: wykres Ramachandrana, domeny, podjednostki
(c) zwijanie białek (protein folding): komputerowe, in vitro, in vivo
5. Specyficzne oddziaływania międzycząsteczkowe z udziałem białek i kwasów
nukleinowych: enzym-ligand i zastosowania w projektowaniu leków, czynniki
interkalujące; aptamery; kompleksy białko-kwas nukleinowy, mikromacierze (2
wykłady)
LITERATURA
"Biofizyka kwasów nukleinowych dla biologów" pod red. M. Bryszewskiej i W. Leyko,
PWN Warszawa 2000.
S. Doonan „Białka i peptydy” PWN 2008
W. Saenger "Principles of nucleic acid structures"
T.E. Creighton "Proteins. Structures and molecular properies"
2
Wykład 1
Wstęp. Wykład BIOFIZYKA (PLANSZA 1) będzie obejmował zagadnienia
(PLANSZA 2) struktury, dynamiki i oddziaływań dwóch typów biopolimerów,
kwasów nukleinowych i białek, o fundamentalnym znaczeniu w funkcjonowaniu,
budowie i podziale komórki, oraz najważniejsze, biofizyczne techniki badania tych
zagadnień. Nie będą omawiane szczegółowo równie (oczywiście !) ważne ale bardziej
wyspecjalizowane biopolimery jak lipidy, składniki błon biologicznych (krótka
charakterystyka przy okazji omawiania błon) i polisacharydy pełniące funkcje materiału
zapasowego i budulcowego. Omówię także niektóre przykłady praktycznego
zastosowania osiągnięć biofizyki molekularnej w naukach medycznych. Plansze i tekst
wykładu: www.biogeo.uw.edu.pl/biofizyka_biologia (PLANSZA 1); dwa podstawowe
podręczniki: (PLANSZA 2; plus zaawansowane monografie w języku angielskim).
Kwasy nukleinowe i białka odgrywają kluczową rolę w procesie ekspresji genów,
czyli przekazywaniu informacji genetycznej z kwasu deoksyrybonukleinowego DNA do
funkcjonalnych cząsteczek białek i kwasów rybonukleinowych RNA (PLANSZA 3):
- kwasy nukleinowe DNA (genom): nośniki informacji genetycznej o budowie,
funkcjonowaniu i podziale komórkowym;
- kwasy nukleinowe RNA (transkryptom): bezpośrednie „robocze” kopie informacji
genetycznej, składniki struktur komórkowych, cząsteczki o funkcjach regulatorowych;
- peptydy i białka (proteom): wielofunkcyjne polimery decydujące o „materiałowych”
podstawach zachodzenia procesów biologicznych oraz ich regulacji.
Kompleksowe podejście do wymienionych zagadnień jest rozwijane w ramach
nowopowstałych dziedzin na styku biologii i biofizyki molekularnej: genomiki,
transkryptomiki, proteomiki i metabolomiki.
Założenie metodologiczne (paradygmat), które warunkuje przyjęte powszechnie
ujęcie zagadnienia roli biopolimerów, polega na przypisaniu ich szeroko rozumianej
strukturze na poziomie molekularnym zasadniczego znaczenia w określaniu mechanizmów
ich biologicznego funkcjonowania w żywej komórce, co określa się terminem SAR
(structure - activity relationship). Struktury chemiczne oraz przestrzenne biomolekuł i
dynamika ich ruchów molekularnych oraz przekształceń strukturalnych warunkują
zdolność do tworzenia funkcjonalnych kompleksów molekularnych o różnym stopniu
złożoności (PLANSZA 4). Wzajemne specyficzne rozpoznawanie biomolekuł
wchodzących w kompleksy jest niezbędne dla zachodzenia skoordynowanych, podległych
3
regulacji, wspólnych działań biomolekuł w procesach biochemicznych. Współczesne
metody strukturalne, głównie rentgenografia, pozwalają określać z rozdzielczością
atomową struktury kompleksów i fragmentów subkomórkowych o masie cząsteczkowej ~3
mln jednostek masy atomowej (Da): rybosom bakteryjny (2,7 mln Da) i rybosom
eukariotyczny drożdżowy (3,3 mln Da; Ben-Shem et al. Science 330, 1203, 2010).
Funkcjonalna analiza biopolimerów w ujęciu SAR wykroczyła w przypadku białek
i kwasów nukleinowych (PLANSZA 3) poza ramy badań ściśle podstawowych w
kierunku masowej („przemysłowej”) analizy wszystkich białek kodowanych przez coraz
szybciej sekwencjonowane genomy. W 2000 r. określono sekwencję genomu ludzkiego
6 x 109 par zasad (bp) i genomów szeregu innych organizmów, co stanowi jedno z
podstawowych zadań genomiki. Z kolei proteomika jako zasadniczy cel stawia pełne
scharakteryzowanie proteomu, czyli w przypadku człowieka charakterystyka ok. 300
tys. białek kodowanych przez ok. 30 tys. genów. W ramach proteomiki strukturalnej
działalność bardzo dużych, często międzynarodowych grup badawczych zrzeszonych w
LSF (large scale facilities) koncentruje się na kompleksowym i wysoceprzepustowym
(high throughput) wyznaczaniu struktur dużych klas białek (docelowo: wszystkich białek
proteomu), współdziałających w ramach określonych odcinków szlaków metabolicznych.
Pozwala to konstruować molekularne mechanizmy procesów biochemicznych, a w
konsekwencji dokonywać wyboru tzw. „tarcz” czyli receptorów białkowych, w tym
enzymów, dla których znana struktura na poziomie molekularnym umożliwia racjonalne
projektowanie specyficznie wiązanych przez nie ligandów jako środków
farmakologicznych (rational drug design): antynowotworowych, antywirusowych,
antybakteryjnych. Badania w zakresie transkryptomiki wymagają z kolei zastosowania
metod pozwalających na wyznaczanie profili ekspresji genów funkcjonującej komórki,
czyli transkryptomu (mikromacierze, sekwencjonowanie RNA).
1. Fizyczne podstawy oddziaływań wewnątrz- i międzycząsteczkowych (a)
Utworzenie przez biomolekułę niezbędnej do właściwego działania natywnej struktury
w roztworze wodnym lub błonie i tworzenie przez nią funkcjonalnych kompleksów z
innymi molekulami jest uwarunkowane PO PIERWSZE budową chemiczną. Z fizycznego
punktu widzenia (PLANSZA 5), niezbędnego w wyjaśnianiu stabilizacji struktury
molekuły i kompleksów molekuł, cząsteczka organiczna jest zbiorem tzw. zrębów
atomowych: jąder i elektronów powłok wewnętrznych, połączonych między sobą
wiązaniami kowalencyjnymi, utworzonymi przez elektrony powłok zewnętrznych, tzw.
4
elektrony walencyjne, które są odpowiedzialne za wiązania chemiczne. Ten stabilny układ
dodatnich i ujemnych ładunków jest opisany przez prawa mechaniki kwantowej,
rządzące procesami zachodzącymi w mikroświecie. Podstawowym postulatem mechaniki
kwantowej jest dualizm korpuskularno-falowy: przypisanie cząstkom tworzącym
molekułę, dodatnio naładowanym jądrom i ujemnie naładowanym elektronom własności
falowych. Własności te będą się przejawiać przede wszystkim w przypadku obiektów o
małej masie, tzn. elektronów i protonów, a w mniejszym stopniu cięższych jąder
składowych biomolekuł: węgli, tlenów, azotów, fosforów i siarki (najważniejsze
pierwiastki składowe) oraz jonów metali, często związanych z białkami i kwasami
nukleinowymi, lub tworzących dla nich środowisko buforowe: Na+, K
+, Mg
+2, Zn
+2, Ca
+2 i
in. Obiektowi kwantowemu: cząstce, cząsteczce chemicznej, przypisuje się długość fali
= h/mv, m - masa, v - prędkość ruchu obiektu, h = 6.62610-34
Js - stała Plancka.
Ponieważ cząsteczki składają się zarówno z cięższych jąder i lżejszych elektronów
klasyczne podejście, preferowane jako prostsze pojęciowo i obliczeniowo, zawsze
będzie tylko przybliżeniem, możliwym do zastosowania jeśli chodzi o niektóre aspekty
zachowania dużych cząsteczek.
W ścisłym opisie kwantowomechanicznym wszystkie parametry ruchu cząsteczki
jako obiektu fizycznego i jej elementów składowych uzyskuje się przez rozwiązanie
równania Schrödingera które jest kwantowym odpowiednikiem równania Newtona w
klasycznym świecie obiektów makroskopowych. Ma to dwie zasadnicze konsekwencje,
które będą podstawą dalszych rozważań (PLANSZA 6):
1. Energia cząsteczki nie ma charakteru ciągłego, ale przyjmuje wartości skwantowane,
tworzące układu poziomów energetycznych charakterystyczny dla tej cząsteczki i
zależny od jej budowy chemicznej i struktury przestrzennej a także, w znacznie
mniejszym stopniu od jej oddziaływań z innymi cząsteczkami i oddziaływań z polami
(siłami) zewnętrznymi.
2. Obowiązuje tzw. zasada nieoznaczoności Heisenberga: jednoczesne uzyskanie
pewnych informacji o układzie kwantowym NIE jest możliwe z dowolną precyzją, np.
możemy JEDNOCZEŚNIE wyznaczyć energię danego poziomu i czas życia tego
poziomu TYLKO ze skończoną dokładnością E ħ/2 (ħ = h/2). Jest to cecha
fizyczna a nie niedokładność przyrządów pomiarowych.
Na energię pojedynczej cząsteczki składa się w przybliżeniu zaniedbania
wpływu jąder jako obiektów ciężkich na ruch lekkich elektronów (stosunek mas
proton/elektron = 1836): energia elektronowa Eel (energia ruchu elektronów w polu jąder
5
cząsteczki i energia oddziaływania między elektronami), energia oscylacyjna Eosc (drgań
jąder), energia rotacyjna Erot (obroty całej cząsteczki i wewnętrzne wokół wiązań), energia
translacyjna Etr (ruch postępowy cząsteczek), jedyna o charakterze ciągłym,
nieskwantowanym dla cząsteczki swobodnej i, w przypadku przyłożenia pól
zewnętrznych, np. magnetycznego o indukcji B lub elektrycznego o natężeniu E, energia
oddziaływania elektronów i jąder z tym polem Eex. Tak wprowadzony podział energii
cząsteczki pozwala wyznaczyć schematycznie układ poziomów energetycznych ważnych
np. przy analizie widm spektroskopowych przy oddziaływaniu promieniowania
elektromagnetycznego z cząsteczkami. Układ poziomów pokazuje wzajemne relacje
między wartościami energii pochodzącymi od poszczególnych rodzajów ruchów:
Eel > Eosc > Erot > Eex; energia translacyjna jest nieskwantowana dla cząsteczek
swobodnych w gazie i roztworze i może być bardzo różna (proporcjonalna do
temperatury); odpowiednie różnice energii między poziomami są rzędu Eel ~ 10 eV,
Eosc ~ 10−2
eV, Erot ~ 10−4
eV, Eext ~ 10−6
eV, gdzie 1 elektronovolt = 1.610−19
J jest
energią kinetyczną elektronu przyspieszonego w polu elektrycznym o różnicy potencjałów
1 V (miara energii powszechnie stosowana w fizyce subatomowej). Na wykładzie
będziemy operowali energią w joulach: 1J = 1N 1m (1 joule = 1 newton razy 1 metr).
Wszystkie skwantowane poziomy energetyczne z wyjątkiem podstawowego, na
którym cząsteczka ma najniższą energię elektronową, tzw. zerowe oscylacje (cząsteczka
nie może całkowicie przestać drgać) oraz nie rotuje i nie oddziałuje z polami
zewnętrznymi, mają skończony średni czas życia . Cząsteczka która się tam znalazła
wraca w takiej skali czasowej na poziom podstawowy oddając energię na różne sposoby.
Z zasady nieoznaczoności każdy taki poziom ma skończoną szerokość E (E ħ/2).
W przypadku badania niektórych problemów związanych z ruchami
molekularnymi i oddziaływaniami cząsteczek można je traktować w przybliżeniu
KLASYCZNYM. Zrębom atomowym połączonym wiązaniami chemicznymi elektronów
walencyjnych, np cząsteczka kwasu octowego (PLANSZA 5):
H O H H O : H
| | . .
. .
H C C w innym zapisie H : C : C gdzie „:” oznacza parę elektronową,
| || . .
: :
H O H O
przypisuje się fragmenty rozkładu elektronowego (ruchy elektronów nie podlegają wtedy
analizie w tym ujęciu) uzyskując MODEL CZĄSTECZKI jako zbiór klasycznych
6
"atomów" C, O i H, o ładunku q dodatnim lub ujemnym każdy, czyli jąder wraz z
określonym rozkladem ładunku elektronów powłok wewnętrznych i walencyjnych,
trzymanych w cząsteczce przez siły wiązań chemicznych o naturze elektrycznej. Jest to
szczególnie przydatne dla dużych biomolekuł, białek i kwasów nukleinowych, których
pełny opis kwantowy, jako znacznie bardziej skomplikowany numerycznie i analitycznie,
jest obecnie niemożliwy. Dla nierotującej i spoczywającej cząsteczki złożonej z N
atomów o danej strukturze chemicznej energia minimalna odpowiada pewnemu
przestrzennemu ustawieniu atomów czyli strukturze przestrzennej.
Struktura przestrzenna jest zadana przez wartości współrzędnych przestrzennych
ir = (xi yi zi) wszystkich atomów składowych i = 1, 2,…, N w dowolnie przyjętym
układzie współrzędnych (kartezjańskim).
Zmiany struktury przestrzennej wynikają z możliwości obrotu wokół wiązań pojedynczych
i częściowo podwójnych, i prowadzą do różnych, dopuszczalnych przez strukturę
chemiczną form, tzw. konformacji cząsteczki. Każdej konformacji odpowiada określona
energia i istnieje jedna lub kilka konformacji o energii najniższej. Zwykle (chociaż
znane są wyjątki), najniższą energię przyjmuje funkcjonalna forma natywna
biopolimeru (białka, kwasu nukleinowego)
Klasyczne atomy cząsteczki obdarzone są wypadkowymi ładunkami
elektrycznymi i oddziałują ze sobą i z otaczającymi molekulami rozpuszczalnika jak
punkty materialne za pośrednictwem sił opisanych przez klasyczny potencjał
oddziaływania elektrycznego V (siły działające na punkt i-ty są pochodnymi potencjału
po położeniu tego punktu ir):
V = potencjały kowalencyjnych wiązań chemicznych (opisują drgania harmoniczne
wiązań, kątów płaskich i torsyjnych)
+ długozasięgowy potencjał kulombowski oddziaływania atomów odległych o r oraz o
więcej niż 3 wiązania chemiczne; zależność od odległości r między atomami jak 1/r
oraz od stałej dielektrycznej ośrodka
+ krótkozasięgowy potencjał van der Waalsa oddziaływania atomów odległych o r
oraz więcej niż 3 wiązania chemiczne; człon przyciągający o zależności 1/r6 i
odpychający o zależności 1/r12
oraz zależy od tzw. stałych Lenarda-Jonesa.
Atomy związane chemicznie przez jedno, dwa i trzy wiązania trzymane są w polu
wytwarzanym przez elektrony wiązań, a odległe o więcej wiązań w strukturze chemicznej
poprzez siły Coulomba i van der Waalsa. Oddziaływanie z otaczającym
7
rozpuszczalnikiem wodnym i jonami w nim zawartymi można uwzględnić przez
wprowadzenie stałej dielektrycznej (ekranowanie ładunków) lub traktując każdą
cząsteczkę otaczającej wody jako dodatkowe trzy punkty (H2O) oddziałujące z
biomolekuła i między sobą. To przybliżenie nosi nazwę pola siłowego (ang. force field
FF) i jest stosowane np. przy komputerowych symulacjach ruchu w ramach tzw.
klasycznej dynamiki molekularnej. Kwantowość jest tu ukryta w wartościach ładunków
przypisywanych „atomom”, wartościach stałych siłowych (wiązania chemiczne) i stałych
Lenarda-Jonesa (oddziaływania van der Waalsa), które można wyznaczyć tylko przez
rozwiązanie równania Schrödingera. Jeśli jednak potraktujemy np. białko jako obiekt
złożony zasadniczo z 20 (czy 22) typów aminokwasów a kwas nukleinowy z 4 typów
nukleotydów, potrzebne wielkości liczymy kwantowo dla małych elementów składowych
i przypisujemy odpowiednim cegiełkom składowym w polimerze. Możliwość klasycznego
podejścia zapewnia twierdzenie Hellmanna-Feynmana:
„jeśli rozkład gęstości ładunku w cząsteczce jest wyznaczony metodami kwantowymi
to ruch tych ładunków odbywa się pod wpływem klasycznych sił elektrostatycznych”
Wszystkie oddziaływania warunkujące kształt przestrzenny cząsteczki (konformacja) i
stabilizujące kompleksy molekularne mają więc charakter elektrostatyczny, z
wyróżnieniem hydrofobowych (pojęcie omówione na następnym wykładzie).
Oddziaływanie odpychające elektronów walencyjnych 1/r12
wyznacza
powierzchnię van der Waalsa albo powierzchnię molekularną cząsteczki, która
stanowi barierę dostępu innych fragmentów tej samej cząsteczki, i innych molekuł, w tym
cząsteczek rozpuszczalnika (PLANSZE 4 i 5). Powierzchnia ta powstaje przez połączenie
sfer van der Waalsa poszczególnych zrębów atomowych. Można ją również określić jako
powierzchnię kontaktu tocząc wokół danej cząsteczki cząsteczkę wody w postaci sfery o
promieniu 1.4 Å. Tak zdefiniowana powierzchnia odgranicza wnętrze molekuły, którego
zręby atomowe nie wchodzą w kontakt z otoczeniem. Cząsteczki wody i jony przy
powierzchni makrocząsteczki tworzą tzw. sferę hydratacyjną (ogólnie przy dowolnym
rozpuszczalniku sferę solwatacyjną), w której cząsteczki rozpuszczalnika są sztywniej
związane (mniej ruchliwe) i mają inne własności, np. gęstość, niż w jego dalszej części.
Między sferą hydratacyjną i pozostałym rozpuszczalnikiem zachodzi oczywiście wymiana
jonów i cząsteczek wody.
8
Wykład 2
1. Fizyczne podstawy oddziaływań wewnątrz- i międzycząsteczkowych (b)
Klasyczne metody badania cząsteczek zajmują sie makroskopowymi układami
molekularnymi w ciele stałym, cieczy czy roztworze lub w fazie gazowej, gdzie
obowiązują prawa termodynamiki i mechaniki statystycznej. Należy zaznaczyć, że
pojawiły się ostatnio metody badania pojedynczych cząsteczek tzw. nanotechniki, o
których jeszcze wspomnę. Jednak komórka czy organizm funkcjonują jako układy
makroskopowe i stosują się do praw termodynamiki. Procesy fizyczne i chemiczne w skali
makro są regulowane nie tylko relacjami energetycznymi (PLANSZA 6) ale również
stopniem uporządkowania (lub nieuporządkowania) struktur molekularnych, który jest
opisany przez pojęcie entropi. Jest to funkcja termodynamiczna, która jest parametrem
opisu (podobnie jak energia) zbioru cząsteczek (PLANSZA 7) Im więcej możliwych,
dostępnych stanów mikroskopowych P (struktur, konformacji) może przyjąć układ
cząsteczkowy w danych warunkach ciśnienia p, temperatury T, objętości V, masy M i
innych parametrów makroskopowych, które go opisują, tym większa jest wartość entropii
S, zgodnie ze wzorem:
S = klnP(p, T,...) k = 1.3804510-23
JK-1
jest stałą Boltzmanna;
a wartość maksymalną entropi układ izolowany (adiabatycznie w ścisłej terminologii
fizyki) przyjmuje w warunkach równowagi. Przykładowo, wprowadzenie ciepła Q do
układu powoduje wzrost entropii:
Q = TS gdzie T jest temperaturą wyrażoną w stopniach Kelvina [K]
Wszelkie procesy zachodzące w makroskopowym układzie molekularnym o energii tzw.
wewnętrznej U (oznaczenie inne dla odróżnienia od energii pojedynczej cząsteczki), który
wymienia ciepło Q, pracę W i masę M z otoczeniem opisane są przez pierwszą i drugą
zasadę termodynamiki, które łącznie można zapisać jako:
U = W + Q + M gdzie: W = -pV + Wnieobjętościowa, M = i
i ni
i oznaczają potencjały chemiczne poszczególnych składników i układu, w ilości ni
moli każdego
Każdy układ dąży do stanu równowagi termodynamicznej, który to stan musi
jednocześnie spełniać dwa kryteria:
(1) minimum energii wewnętrznej U
(2) maksimum entropii S (nieuporządkowania)
9
Układy w których zachodzi dużo sprzężonych procesów biochemicznych, takie jak żywa
komórka lub cały organizm stosują się do praw termodynamiki ale, znajdują się daleko
od położenia równowagi. Ten stan utrzymywany jest przez stały dopływ energii z
zewnątrz w postaci substancji odżywczych, tlenu, światła (rośliny). W końcu jednak każdy
żywy organizm znajdzie się w stanie równowagi termodynamicznej z otoczeniem, która
oznacza śmierć.
Stosunkowo proste (w porównaniu z całą komórką) procesy molekularne, które są
przedmiotem badań biofizyki molekularnej a więc i naszego wykładu, zachodzą wtedy,
gdy pewne, opisujące je potencjały termodynamiczne, dążą do minimum. Rozpatrywane
na wykładzie przypadki procesów zmian struktury chemicznej i konformacji biomolekuł
oraz tworzenie kompleksów molekularnych będą się z reguły odbywały w warunkach
stałej temperatury i ciśnienia. Procesy takie zachodzą w kierunku osiągania minimum
przez jeden z takich potencjałów energię swobodną Gibbsa G zwaną inaczej entalpią
swobodną:
G = U + pV - TS
Minimalizacja G obejmuje jak widać oba kryteria: osiągnięcie minimalnej energii (małe
U) i maksymalnej entropii (duże S - znak minus). Przykładowo:
(a) jeśli mamy do czynienia z tworzeniem kompleksu molekularnego złożonego z kilku
cząsteczek to:
G = Gkompleks - (Gskładnik_1 + G składnik_2 +.......) < 0
i w równowadze G = 0 tyle samo cząsteczek kompleksu powstaje ile się rozpada;
(b) jeśli w danych warunkach otoczenia białko globularne tworzy funkcjonalną formę
natywną to:
Gnatywna < Gzdenaturowana inaczej Gprzejścia = Gnatywna- Gzdenaturowana < 0
a w przypadku podziałania np. mocznikiem relacja między wartościami G dla obu form
białka ulegnie odwróceniu i zachodzi denaturacja.
Dotychczas wprowadziliśmy pojęcie energii pojedynczej cząsteczki E i energii
makroskopowego układu cząsteczek U. Energia U jest sumą energii Ei (energii
wewnątrzcząsteczkowych) i energii oddziaływań między cząsteczkami Eij, w tym
oddziaływania z rozpuszczalnikiem. W przybliżeniu słabych oddziaływań
międzycząsteczkowych w porównaniu z wewnątrzcząsteczkowymi U jest bliska sumie Ei:
U = i
ii
iji
i EEE
10
Poszczególne cząsteczki zajmują skwantowane poziomy energetyczne (PLANSZA 6)
zgodnie z rozkładem Boltzmanna (PLANSZA 7); ilości cząsteczek Ni na każdym z nich:
Ni = N0Z−1
exp(Ei /kT) N0 liczba wszystkich cząsteczek; Z = kexp(Ek/kT)
maleje eksponencjalnie ze wzrostem energii poziomu Ei tym szybciej im wyższa
temperatura T. Energia makroskopowego układu molekularnego jest więc proporcjonalna
do ilości cząsteczek i wyraża się w zwykle w [J/mol] lub częściej [kJ/mol] (1J = 0,239
cal). Ponadto, im wyższa temperatura tym większa energia układu ponieważ więcej
cząsteczek zajmuje wyżej położone poziomy energetyczne, a w ruchu translacyjnym
(energia nieskwantowana) cząsteczki poruszają się szybciej.
1. Fizyczne podstawy oddziaływań wewnątrz- i międzycząsteczkowych (c)
Struktura przestrzenna cząsteczek (spoczywających i nierotujących dla uproszczenia) o
określonej budowie chemicznej (skład atomów i układ wiązań) i przestrzennej
(konformacja) jest uwarunkowana przez oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe między
poszczególnymi „atomami” i oddziaływania międzycząsteczkowe z otaczającymi
cząsteczkami, w tym cząsteczkami rozpuszczalnika, czyli w przypadku białek i kwasów
nukleinowych z cząsteczkami wody, jonami buforu lub cząsteczkami kwasów
tłuszczowych dla białek zakotwiczonych w błonach biologicznych. W sumie
oddziaływania te składają się na stabilizację określonej struktury poprzez czynniki
energetyczne i entropowe.
Ilość dopuszczalnych konformacji w cząsteczkach białek i kwasów nukleinowych
jest olbrzymia, np. białko o 100 aminokwasach może przyjąć ponad P = 2100
(1030
)
różnych konformacji. Czynniki entropowe sprzyjają więc strukturze w której w
równowadze dynamicznej istnieje olbrzymia ilość różnych form przestrzennych
biomolekuły. Jest to struktura tzw. kłębka statystycznego jaką mają białka zdenaturowane i
pojedyncze nici kwasów nukleinowych. Aby powstała funkcjonalna struktura natywna
lub niewielka ilość funkcjonalnych konformacji ten niekorzystny czynnik entropii
konformacyjnej musi być przezwyciężony przez wewnątrzcząsteczkowe
oddziaływania stabilizujące w biocząsteczce z udziałem oddziaływań makromolekuła
- cząsteczki rozpuszczalnika i oddziaływań wewnątrz samego rozpuszczalnika. Każde z
nich ma charakter energetyczny i entropowy.
Wyróżnia się następujące oddziaływania stabilizujące konformację natywną
biomolekuły (PLANSZA 8) ORAZ wyznaczające specyficzność wzajemngo
oddziaływania czasteczek przy tworzeniu kompleksów:
11
1. Wiązania wodorowe. Polegają na uwspólnieniu protonu między dwoma atomami
elektroujemnymi, donorem i akceptorem, np. O lub N. Niekiedy donorem w słabych
oddziaływaniach wodorowych może być węgiel. Tworzy się w ten sposób liniowy układ
trzech atomów: donor - wodór - akceptor z wolną parą elektronową, o nadmiarowych
ładunkach minus - plus - minus. Przy silnych wiązaniach wodorowych donor i akceptor są
odległe od ok. 2.7 Å do 3.1 Å a układ trzech atomów jest zbliżony do liniowego
(odstępstwa od 180 dla kąta D-H-A nie przekraczają 25). Energia wiązania,
zdominowana przez oddziaływanie kulombowskie 1/r (r – odległość oddziałujących
ładunków) jest znacznie mniejsza niż energia typowego wiązania kowalencyjnego, rzędu
kilka razy energia związana z ruchami cieplnymi atomów, których miarą jest RT = 2.5
kJ/mol w temperaturze pokojowej 300 K (R = 8.3143 kJ/(molK) - stała gazowa, (patrz
dalej PLANSZA 9)
2. Mostki solne. Tworzą się między grupami atomów silnie naładowanych, o
przeciwnych znakach, w wyniku dysocjacji protonu H+ z jednej grupy (ładunek ujemny) i
przyłączeniu protonu przez drugą (ładunek dodatni). Siła Coulomba stabilizuje taką parę
np. dodatno naładowana grupa boczna lizyny CH2CH2CH2CH2NH3+ i ujemnie naładowana
reszta kwasu glutaminowego CH2CH2COO w białku, lub reszta lizyny i tlen grupy
fosforanowej -O-PO2-O- kwasu nukleinowego.
3. Kontakty van der Waalsa. Atomy i grupy atomów w cząsteczce, nawet jeśli cała
cząsteczka jest elektrycznie obojętna lub zjonizowane/uprotonowane grupy równoważą
się, mają nadmiarowe ładunki dodatnie lub ujemne. Fragment lekko naładowany dodatnio
indukuje zwiększony ładunek ujemny w sąsiednim fragmencie i następuje przyciąganie
(słabe) - oddziaływanie indukcyjne i dyspersyjne van der Waalsa; w przeciwieństwie do
wiązań wodorowych oddziaływania te nie mają charakteru kierunkowego.
4. Oddziaływania hydrofobowe. Fragmenty cząsteczkowe źle oddziałujące z wodą
(źle rozpuszczalne w wodzie) wolą agregować ze sobą np. grupy alifatyczne CH3 czy
pierścienie benzenowe. Dobrym wizualnym modelem takiego oddziaływania jest
agregacja kropli tłuszczu w wodzie. Mówimy wtedy o oddziaływaniu hydrofobowym, w
którym decydujące znaczenie mają efekty entropowe, związane z reorganizacją wzajemną
cząsteczek wody w obecności hydrofobowych powierzchni cząsteczek rozpuszczonych.
Związanie reszt hydrofobowych minimalizuje powierzchnię kontaktu z wodą, która
jest tu bardziej uporządkowana (wyższa entropia), a więc pojawia się więcej wody
nieuporządkowanej i entropia rośnie. Typowym przykładem dużego udziału
12
oddziaływania hydrofobowego jest oddziaływanie warstwowe (stacking) dwóch
pierścieni aromatycznych. Ustawiają się one równolegle w odległości ok. 3.4 Å a woda
jest wyparta spomiędzy nich. W stackingu jest również udział sił van der Waalsa, a jeśli z
pierścieniem aromatycznym oddziałuje fragment naładowany dodatnio, pierścieniowy lub
nie, jak np. reszta lizyny, mówimy o tzw. oddziaływaniu lub stackingu kation - ze
znacznym udziałem sił van der Waalsa. (w przypadku tylko jednego pierścienia słowo
„stacking” nie jest w pełni adekwatne).
1. Fizyczne podstawy oddziaływań wewnątrz- i międzycząsteczkowych (d)
Specyficzne, silne wiązanie biomolekuł jest podstawą współdziałania różnych cząsteczek
w skomplikowanych i podlegających regulacji procesach biologicznych, takich jak
replikacja, transkrypcja czy translacja. Aby współdziałać, makromolekuły muszą się
rozpoznać i utworzyć funkcjonalne kompleksy molekularne. Miarą siły a więc także
specyficzności wiązania jest równowagowa stała asocjacji kompleksu wyrażona przez
stężenia [ ] poszczególnych składników (PLANSZA 9):
Kas = [kompleks]/([składnik_1][składnik_2] ....[skladnik_n]
Im wyższa stała asocjacji tym stabilniejszy kompleks. Niekiedy używa się odwrotności
stałej asocjacji czyli stałej dysocjacji:
Kd = 1/Kas
Stała asocjacji wiąże się bezpośrednio ze standardową energią swobodną Gibbsa
utworzenia kompleksu w warunkach równowagi termodynamicznej:
G = Gkompleks - (Gskładnik_1 + Gskładnik_2 +.......) = RTln Kas gdzie stała gazowa
R = 8.3143 kJ/(molK); symbol „” oznacza „standardowość” czyli odniesienie G do
stężeń jednomolowych.
Elektrycznie obojętne makromolekuły, ze względu na niesymetryczny rozkład ładunku
elektrycznego zwykle przyciągają się (siły van der Waalsa), ale tego typu oddziaływanie
nie jest silne i ma charakter niespecyficzny. - stałe asocjacji nie przekraczają 104 M
-1 (dla
kompleksów dwuskładnikowych). Oddziaływanie specyficzne charakteryzuje się
dopasowaniem powierzchni van der Waalsa biomolekuł i dopasowaniem ich rozkładów
ładunków tak aby maksymalizować stabilizujące oddziaływania elektrostatyczne:
wiązania wodorowe, mostki solne, słabe oddziaływania van der Waalsa i oddziaływania
hydrofobowe. Najsilniejsze, specyficzne kompleksy białko - kwas nukleinowy
charakteryzują się stałymi asocjacji:
13
Kas 1013
M-1
co odpowiada G 80 kJ/mol (energia wiązania kowalencyjnego
~300 400 kJ/mol).
Najsilniej związanym ze znanych kompleksów jest układ biotyny (heterocykl, witamina H
inaczej B7) z białkiem streptawidyną, Kas 1015
M-1
, stosowany np. jeśli obiekt typu
„mikro” lub „nano” chce się przyczepić do POJEDYNCZEJ MOLEKUŁY w celu
manipulowania tą molekułą.
Tworzenie kompleksu nie ma charakteru statycznego ale oddziałujące biomolekuły
zmieniają swoje konformacje, często w znacznym zakresie, aby wzajemnie dopasować do
siebie powierzchnie - wzajemne dopasowanie konformacyjne (ang. induced fit), co
zapewnia krótsze odległości między ładunkami, a w konsekwencji silniejsze związanie
(szerzej o modelach tworzenia kompleksów przy omawianiu oddziaływań z udziałem
białek i kwasów nukleinowych)
Tworzeniu kompleksu towarzyszą efekty związane z rozpuszczalnikiem o
charakterze entropowym (korzystne lub nie), takie jak:
(a) efekt polielektrolityczny: wymiana jonów (w tym protonów) między sferami
hydratacyjnymi biomolekuł lub wnętrzem molekuły i resztą rozpuszczalnika wodnego;
(b) hydratacja/dehydratacja: wymiana cząsteczek wody między sferami
hydratacyjnymi oddziałujących cząsteczek i rozpuszczalnikiem.
Typowym przykładem specyficznego rozpoznawania komplementarnych nici
polinukleotydowych jest struktura podwójnej helisy, oparta na tworzeniu
komplementarnych par zasad Watsona- Cricka: G : C i A : T lub A : U. Piewsza z par
stabilizowana jest przez trzy wiązania wodorowe , druga przez dwa wiązania (PLANSZA
10), a pary niekomplementarne mogą się tworzyć tylko z udziałem mniejszych ilości
wiązań wodorowych. W parach WC donory i akceptory protonu obu oddziałujących zasad
są odpowiednio zlokalizowane przestrzennie względem siebie. Powierzchnie
molekularne (kształty) zasad pozwalają na dostateczne zbliżenie donor - akceptor tak, że
ich ujemne ładunki przedzielone dodatnim ładunkiem protonu dają w efekcie
elektrostatycznie stabilny układ (siły elektrostatyczne zależą od odległości ładunków !).
14
Wykład 3
2. Metody badania struktur i dynamiki białek i kwasów nukleinowych
Ponieważ duże i skomplikowane biopolimery badane są z punktu widzenia różnych
informacji, jakie chcemy uzyskać o ich strukturze i funkcjonowaniu w komórce,
rozwinięto w tym celu znaczną ilość różnych metod. Na wykładzie skoncentruję się na
tych metodach, które pozwalają uzyskać przede wszystkim dane o strukturach
molekularnych, od struktur pierwszorzędowych czyli sekwencji monomerów
składowych, do struktur przestrzennych: drugo-, trzecio- i ew. czwartorzędowych. W tej
drugiej grupie skoncentruję się na metodach doświadczalnych dostarczających informacji
o strukturach przestrzennych białek i kwasów nukleinowych z rozdzielczością do
położenia poszczególnych „atomów”, czyli określenia współrzędnych atomów w
przestrzeni trójwymiarowej. Komputerowe metody projektowania struktur krótko omówię
w temacie zwijanie białek. W mniejszym stopniu będę omawiał metody badania dynamiki
ruchów molekularnych. Omawiane metody można zasadniczo podzielić na kilka typów
(PLANSZA 11), zależnie od informacji które chce się uzyskać:
(A) Metody wyznaczania mas cząsteczkowych i separacji cząsteczek na podstawie
różnic mas; na niektórych z tych metod oparta jest analiza struktur
pierwszorzędowych biopolimerów:
ultrawirowanie
elektroforeza żelowa (GE) i kapilarna (CE); sekwencjonowanie DNA i RNA
spektrometria masowa (MS); sekwencjonowanie białek
(B) Metody wyznaczania struktur przestrzennych z rozdzielczością atomową:
dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego (rentgenografia)
magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)
(C) Metody strukturalne (na średnim poziomie rozdzielczości) określania ogólnego
kształtu makrocząsteczek:
mikroskopia sił atomowych (AFM, atomic force microscopy) i mikroskopia
elektronowa pojedynczej cząsteczki (cryoEM)
(D) Metody badania dynamiki ruchów molekularnych:
magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) i inne metody spektroskopowe
(fluorescencja)
komputerowe symulacje dynamiki molekularnej (MD, molecular dynamics i
rMD, restrained molecular dynamics)
15
(a) Ultrawirowanie analityczne (PLANSZA 12) było jedną z pierwszych metod
określania masy cząsteczkowej i rozdziału dużych biomolekuł. Obecnie metoda przeżywa
swój „renesans” ze względu na nowe zastosowania. Cząsteczka w roztworze poddana
szybkiemu wirowaniu z częstością do 80 tysięcy obrotów na minutę (rpm; rotations per
minute) porusza się ze stałą prędkością w od osi rotora wskutek zrównoważenia siły
odśrodkowej, skierowanej od osi rotora (odpowiednik siły grawitacji w jednostkach g pola
ziemskiego) i sumy sił wyporu oraz tarcia, skierowanych do osi rotora. Dla cząsteczek w
odległości r od osi rotora (granica: zawiesina/klarowna ciecz) można wyznaczyć prędkość
ich ruchu, czyli szybkość sedymentacji w = dr/dt przez pomiar zmian stężenia c w czasie,
w funkcji r (równanie Lamma), metodami optycznymi np. pomiar absorpcji w zakresie
UV lub fluorescencji (prawa Lamberta-Beera). Stąd wyznacza się tzw. profil
sedymentacji:
g(S*) = ln[r/rm]/2t rm – odległość menisku cieczy w probówce wirowniczej
którego maksimum daje współczynnik sedymentacji
S = w/(2r) wyrażony w svedbergach, S = 10
-13 s.
Masa cząsteczkowa M może być wyznaczona z wartości S i niezależnie wyznaczonego
współczynnika dyfuzji D, np. z szerokości profilu sedymentacji g(S*):
M = NAvom = RTS/[D(1 - )]
NAvo=6.02252 1023
- liczba Avogadro, m - masa cząsteczki, - objętość właściwa
cząsteczki, - gęstość rozpuszczalnika, D - współczynnik dyfuzji, R - stała gazowa,
T- temperatura w K
Masa cząsteczek M jest proporcjonalna do S i w ten sposób można również rozdzielać
cząsteczki różniące się masą cząsteczkową - większe poruszają się szybciej. Lepsze
rozdziały uzyskuje się przez wirowania w gradiencie gęstości np. cukru lub chlorku cezu.
Gradient zapobiega ruchom konwektywnym i daje wyraźne przesuwające się pasma dla
poszczególnych cząsteczek.
Biolodzy molekularni często operują wielkościami makrocząsteczek, kompleksów
molekularnych, struktur subkomórkowych lub całych wirusów i komórek poprzez
podawanie odpowiednich wartości współczynników sedymentacji S. Do wyznaczenia
masy cząsteczkowej można także zastosować nieco inny, stacjonarny eksperyment
równowagi sedymetacji. Długie wirowanie (kilkadziesiąt godzin) przy relatywnie
niewielkich częstościach obrotu ok. 5000 rpm prowadzi do ustalenia gradientu stężenia
16
makromolekuł w wyniku równowagi termodynamicznej siły dyfuzji i siły odśrodkowej
minus siła wyporu. Pomiar stężenia metodami absorpcji w przynajmniej dwóch punktach
probówki wirowniczej pozwala określić wartość masy cząsteczkowej (wzoru nie podaję).
Metoda ultrawirowania daje możliwość wyznaczenia masy cząsteczkowej z dokładnością
do kilku procent wartości (lub współczynnika sedymentacji), w bardzo szerokim zakresie
wielkości cząsteczek, przy użyciu niewielkich, mikromolowych ilości substacji
(zależnie od czułości detekcji).
Spektakularnym przykładem zastosowania ultrawirowania analitycznego do
rozwiązania problemu biologicznego był eksperyment Meselsona-Stahla, uznany za
„najpiękniejszy” eksperyment biofizyczny. Wirowanie kwasu DNA bakterii hodowanych
na pożywkach wzbogaconych azotem N-15 pokazało semikonserwatywny charakter
replikacji DNA.
Elektroforeza żelowa (GE, gel electrophoresis PLANSZA 13), podobnie jak
ultrawirowanie pozwala oszacowywać masy cząsteczkowe i rozdzielać mieszaniny
makromolekuł na podstawie różnic mas. Cząsteczki naładowane poruszają się w roztworze
pod wpływem pola elektrycznego o natężeniu E (np. przez przyłożenie napięcia ok. 200 V)
z prędkością v proporcjonalną do natężenia pola oraz ładunku Z a odwrotnie
proporcjonalną do współczynnika tarcia f. Z kolei współczynnik tarcia zależy od masy
cząsteczkowej M, lepkości roztworu i w pewnym stopniu od kształtu cząsteczki. W
konsekwencji tzw. ruchliwość elektroforetyczna = v/E, która opisuje szybkość migracji
cząsteczki jest tym większa im mniejsza masa cząsteczkowa. Ściślej, zależność jest
logarytmiczna. Elektroforezę przeprowadza się na żelach czyli długich polimerach
liniowych o różnym stopniu usieciowania (rozmiarach porów). Żele działają jak sita
molekularne zwiększając zdolność rozdziału.
Białka poddaje się elektroforezie na żelach poliakrylamidowych CH2CH(CONH2)
w postaci zdenaturowanej tzn. po zniszczeniu struktury natywnej drugo- i
trzeciorzędowej (w tym mostków dwusiarczkowych), po rozpuszczeniu białka w
detergencie, soli sodowej siarczanu dodecylu CH3(CH2)11SO42
Na+
2, który wiążąc się z
aminokwasami nadaje białku duży ładunek elektryczny. Stąd skrótowa nazwa SDS
PAGE: sodium dodecyl sulphate poliacrylamide gel electrophoresis. Położenie białek na
żelu uzyskuje się w postaci prążków przez wybarwianie substancjami absorbującymi w
zakresie widzialnym, lub przez znakowanie przeciwciałami z grupami fluoryzującymi.
17
Czułość metody sięga 10 nanogramów (10-8
g) białka a dokładność oznaczenia masy
cząsteczkowej wynosi ~2% na podstawie równoległej elektroforezy markerów
białkowych o znanych masach cząsteczkowych. W przypadku konieczności rozdzielenia
mieszanin dużej ilości białek, nawet do 1000, stosuje się elektroforezę dwuwymiarową.
Najpierw białka separuje się w nieobecności SDS w gradiencie pH - wstępna elektroforeza
małych, wielonaładowanych polimerów ustala gradient. Białka migrują pod wpływem
własnego ładunku do punktu w którym są obojętne i tam zatrzymują się; tzw.
ogniskowanie izoelektryczne (isoelectric focusing). Rozdzielczość w tym wymiarze sięga
0.01 jednostki pH. W prostopadłym kierunku poddaje się białka zwykłej elektroforezie
SDS, gdzie rozdział zachodzi na podstawie różnic mas cząsteczkowych.
Kwasy nukleinowe mają własny duży ładunek ujemny grup fosforanowych więc
migrują na żelu bez SDS. Na żelach poliakrylamidowych fragmenty jednoniciowego DNA
i RNA do ok. 400 nukleotydów dzielą się pod względem długości z dokładnością do
jednego nukleotydu, a czułość jest podobna jak w przypadku białek. Dla dłuższych
fragmentów, także dwuniciowych, do 10 000 par zasad (bp) stosuje sie bardziej porowaty
żel agarozę. Rozdzielczość jest w tym przypadku mniejsza. Duże fragmenty, 105 do 10
7 bp
można rozdzielać przy zastosowaniu techniki pulsujących pól elektrycznych. Szybkie,
naprzemienne sekwencje dwóch pól elektrycznych pod odpowiednim kątem zmuszają
cząsteczki do reorientacji, co dłuższym zabiera więcej czasu i dlatego migrują wolniej.
Elektroforeza kapilarna (CE - capillary electrophoresis, PLANSZA 14) jest
szybko rozwijającą się ostatnio techniką, stosowaną w automatycznych sekwenatorach
DNA. Rozdzielanie cząsteczek następuje w wyniku ich migracji w poruszającym się
buforze, w cienkiej kapilarze, zwykle kwarcowej długości 30 - 100 cm i średnicy 20 do
100 m, między dwoma naczyniami wypełnionymi buforem. Zarówno tzw. przepływ
elektroosmotyczny buforu jak i migracja rozpuszczonych w nim cząsteczek następuje po
przyłożenia pola elektrycznego do elektrod zanurzonych w obu naczyniach przy różnicy
potencjałów do 30 kV (pola do 500 V/cm). Limit natężenia pola wynika z silnego
ogrzewania przez prąd płynący w kapilarze. Migrująca substancja jest oznaczana w
detektorze np. absorpcyjnym UV/VIS, fluorescencyjnym czy w spektrometrze masowym
MS. Od detektora zależy czułość metody; maksymalna jest w przypadku detektorów MS.
Przepływ cząsteczek buforu następuje w wyniku jonizacji ujemnej grup =SiOH =SiO
na ściankach kapilary (pH buforu > 3), tylko częściowo zrównoważonych kationami
buforu. Pozostałe grupy oddziałują z kationami warstwy ruchomej. Tworzy się dyfuzyjna
warstwa podwójna kationów dająca napięcie ścinające, które jest czynnikiem
18
różnicującym ruchliwość elektroforetyczną, podobnie jak sita molekularne w
elektroforezie żelowej. Ruchoma warstwa kationów porusza się w polu elektrycznym od
anody do katody "ciągnąc" bufor. Ruch cząsteczek rozpuszczonych w buforze jest
wypadkową ruchu buforu i wpływu pola elektrycznego na same cząsteczki i zależy od
pH buforu; im wyższe pH tym więcej kationów w warstwie. Ogólnie biorąc: cząsteczki
naładowane dodatnio poruszają się szybciej niż bufor (przepływ od anody do katody),
obojętne tak samo jak bufor a ujemne wolniej. W konsekwencji ruchliwość
elektroforetyczna substancji zależy masy cząsteczki, jej ładunku, lepkości i pH buforu.
Małe cząsteczki o dużym ładunku poruszają się szybciej niż duże cząsteczki o małym
ładunku, podobnie jak w elektroforezie żelowej.
(b) W spekrometrii masowej (MS, mass spectrometry) (PLANSZA 15)
cząsteczki poddaje się jonizacji do ładunku Z i wstępnie przyśpiesza w polu elektrycznym
o potencjale V. Po zogniskowaniu wiązka jonów wchodzi w obszar działania detektora. W
detektorze magnetycznym (już rzadko stosowany) siła Lorentza zakrzywia tor ruchu
jonów, a promień krzywizny r zależy od stosunku masy jonu m do ładunku Z:
m/Z = (H2/2V) r
Innym sposobem określania m/Z jest pomiar czasu przelotu jonu t w technice detekcji
TOF (time-of-flight) na drodze d (e - ładunek elementarny):
m/Z = (2V/ed2)t
2
W detektorze kwadrupolowym QIT (quadruple ion trap) pułapkuje się jony w
odpowiednio ukształtowanym (zmiennym) polu elektrycznym.
Wykres intensywności sygnału jonów mierzonych w detektorze w funkcji m/Z daje
widmo masowe, co przy znanym ładunku pozwala określić masę jonu. Technika jest
bardzo czuła: wymaga jedynie nanogramów substancji. Dla mniejszych cząsteczek
osiąga dokładność wyznaczania masy poniżej 5 ppm (0.0005%) - odseparowane piki od
cząsteczek lub ich fragmentów o różnym składzie izotopowym. Problem w tym, że przy
jonizacji cząsteczka ulega fragmentacji i nie zawsze można zarejestrować pik
odpowiadający pełnej masie cząsteczkowej tzw. jon molekularny. Z drugiej strony
fragmenty o różnych masach powstające z pękania określonych wiązań (znane preferencje
miejsc rozszczepiania) mogą dostarczyć informacji o strukturze chemicznej cząsteczki.
Przez długi czas biomolekuły trudno było zjonizować i przeprowadzić do fazy gazowej
bez fragmentacji, czyli poddać desorpcji niezbędnej dla wykonania widm MS.
19
Znaczące rezultaty dla biomolekuł uzyskano techniką desorpcji MALDI (matrix-
assisted laser desorption ionization) pod wpływem promieniowania lasera w silnie
absorbującym roztworze małych cząsteczek organicznych, tzw. matrycy. Drugą techniką
desorpcji dużych białek i fragmentów kwasów nukleinowych jest technika rozpylania w
polu elektrycznym czyli elektrosprej ESI (electrospray ionization). Biomolekuły są
zawieszane w kropelkach rozpuszczalnika formowanych na końcu igły i ładowane
elektrycznie przez pole elektryczne między igłą a elektrodą (3 - 6 kV). Podczas ruchu w
kapilarze kropelki szybko parują w przeciwbieżnym strumieniu gazu uzyskując duży
ładunek powierzchniowy, który je rozrywa wytwarzając sprej bardzo drobniutkich i dalej
szybko parujących kropelek. Pojedyncze cząsteczki w drobniutkich kropelkach spreju
przechodzą do fazy gazowej po odparowaniu reszty rozpuszczalnika. Widmo masowe
MSI stanowi seria pików odpowiadających kolejnym, wielokrotnie naładowanym i
uprotonowanym jonom molekularnym [M+zH]z+
, bez fragmentacji. Stąd można określić
masę cząsteczkową M z dużą dokładnością do kilku Da dla białek ok. 100 kDa, po
dekonwolucji do piku o pojedynczym ładunku Z = 1 na podstawie serii pików o ładunku
wzrastającym kolejno o jedną jednostkę.
20
Wykład 4
(c) Spektroskopia molekularna obejmuje dużą ilość technik badania cząsteczek w
różnych stanach skupienia (ciało stałe, ciecz, roztwór, gaz) poprzez rejestrację
oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego (światła) z cząsteczkami.
Zasadniczo można wyróżnić trzy sposoby takiego oddziaływania: (PLANSZA 16):
(1) Absorpcja kwantu promieniowania (fotonu) o częstości czyli długości fali =
c/, przez cząsteczkę (c - prędkość światła), czyli wzbudzenie cząsteczki, zachodzi jeśli
energia fotonu wzbudzającego h odpowiada różnicy energii między poziomem na którym
jest cząsteczka i poziomem energetycznym na który przechodzi:
Em - En = h lub: Em - En = ħ
ħ = h/(2) = 2
Z pomiarów absorpcji i fluorescencji można wyznaczyć stężenia substancji w roztworze;
(2) Emisja kwantu promieniowania (fluorescencja) po wzbudzeniu cząsteczki na
wyższy poziom energii z przejściem na poziom niższy, ten sam z którego zachodziła
absorpcja lub inny; emitowany foton ma częstość odpowiadającą różnicy energii obu
poziomów (analogiczny wzór jak przy absorpcji);
(3) Rozproszenie promieniowania przez cząsteczkę z zachowaniem lub zmianą
częstości (efekt Ramana) rozpraszanego fotonu.
Ponieważ cząsteczka ma wiele poziomów energetycznych związanych z różnymi
rodzajami ruchów (PLANSZA 6) przejścia absorpcyjne mogą zachodzić z poziomu
podstawowego lub blisko niego położonych poziomów rotacyjnych (tylko te poziomy są
obsadzone w standardowych temperaturach badania makrocząsteczek) do bardzo różnych
wyższych poziomów wzbudzonych: rotacyjnych, oscylacyjnych i elektronowych. Stąd w
różnych zakresach długości fali obserwuje się różne typy wzbudzenia i mamy do czynienia
z różnymi rodzajami spektroskopii absorpcyjnej, odpowiednio: zakres mikrofal MV
(micro wave), podczerwień IR (infra red) zakres widzialny i ultrafiolet UV-VIS.
Fluorescencję obserwuje się tylko w zakresie widzialnym i ultrafioletowym gdyż przy
większych długościach fali przejścia na niższe poziomy energii zachodzą tylko
bezpromieniście. Również nie wszystkie cząsteczki które zaabsorbowały energię i
przeszły na wzbudzony poziom elektronowy fluoryzują, gdyż zachodzą konkurencyjne
przejścia bezpromieniste z elektronowego poziomu wzbudzonego do niższych
poziomów. Przykładowe widma absorpcji i fluorescencji w zakresie UV-VIS pokazuje
PLANSZA 17.
21
Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR - nuclear magnetic resonance) jest
szczególną metodą spektroskopową (PLANSZA 18), standardowo stosowaną m. in. do
WYZNACZANIA STRUKTUR PRZESTRZENNYCH BIOMOLEKUŁ W
ROZTWORZE, a ostatnio również w ciele stałym (próbki amorficzne). W metodzie NMR
obserwuje sie tzw. rezonansowe przejścia pomiędzy poziomami energii, jakie jądra
danego typu w cząsteczce uzyskują w silnym, zewnętrznym, stałym polu magnetycznym o
indukcji B rzędu od 2.5 do 22 T [tesli] (zależnie od zastosowań i typu eksperymentu), co
odpowiada absorpcji promieniowania fal radiowych od ok. 10 do 900 MHz. Warunkiem
zachodzenia rezonansu jest posiadanie przez jądro momentu magnetycznego , co ma
miejsce wtedy gdy jądro charakteryzuje się niezerowym spinem I, parametrem ściśle
kwantowy, który odpowiada klasycznemu obrotowi wewnętrznemu jądra; I może być
równe 1/2, 1, 3/2,... itd. W zewnętrznym polu B jądro uzyskuje skwantowaną energię Em:
Em = B = ħmB, m = -I, -I+1,.., I-1, I,...itd.
Współczynnik żyromagnetyczny zależy od rodzaju jądra. Dla jąder o spinie I = 1/2, np.
1H,
13C,
15N oraz
31P, izolowane jądro ma tylko dwa poziomy E1/2 i E-1/2 między którymi
zachodzi przejście rezonansowe po wzbudzeniu polem elektromagnetycznym o częstości
rezonansowej:
= B
w wyniku oddziaływania ze składową magnetyczną B1 tego pola. Widać, że rezonans dla
różnych typów jąder zachodzi przy innej częstości rezonansowej , tzn. np. protony 1H
mają inną częstość niż węgle 13
C.
Jest bardzo dużo różnych eksperymentów NMR służących do wyznaczania
różnych parametrów molekularnych. Najprostszy, jednoimpulsowy eksperyment
NMR w celu uzyskania tzw. widma jednowymiarowego polega na wzbudzeniu jąder
określonego typu przez dostarczenie do niewielkiej próbki o objętości ok. 1 mililitra, w
środku magnesu nadprzewodzącego (PLANSZA 19), impulsu pola magnetycznego B1 o
niewielkiej mocy (impuls radiowy) i odpowiedniej dla danego typu jądra częstosci.
Całkowita magnetyzacja jądrowa M układu (PLANSZA 18), czyli suma momentów
magnetycznych wszystkich jąder, ustawia się prostopadle do pola statycznego B.
Rejestruje się powrót M do stanu równowagi wzdłuż pola B czyli zanik wzbudzenia w
czasie, w wyniku oddawania przez wzbudzone jądra energii do otoczenia molekularnego w
tzw. procesach relaksacji bezpromienistej. Procesy relaksacji prowadzą do równowagi
22
układu jąder po zaburzeniu przez absorpcję energii impulsu i zachodzą z szybkością
opisaną przez dwa tzw. czasy relaksacji T1 i T2. Te czasy można mierzyć w odpowiednich
eksperymentach NMR i ich wartości wynoszą w granicach od milisekund do sekund.
Rejestracja zaniku sygnału rezonansowego i jego przetworzenie komputerowe z zależności
czasowej na częstotliwościową (transformacja Fouriera) otrzymuje się widmo NMR jąder
danego typu np. widmo 1H NMR,
13C NMR,
15N NMR itp.(dla wszystkich jąder I różne
od 0), czyli zależności intensywności sygnału od częstości impulsu, jak w każdej
metodzie spektroskopowej. Intensywność sygnału jest proporcjonalna do ilości jąder w
próbce a także zależy od typu jądra czyli . Dlatego w prostym jednoimpulsowym
eksperymencie NMR można uzyskać widmo jedynie dla jąder o dużej czułości czyli dużej
zawartości izotopowej, np. 1H. Nota bene, spektroskopia NMR jest techniką znacznie
mniej czułą od innych technik spektroskopowych. Aby zarejestrować widma NMR
takich jąder jak 13
C, których jest 1% w składzie izotopowym węgiel czy 15
N, których jest
0.3% trzeba albo stosować związki znakowane blisko 100% tymi izotopami lub stosować
wielokrotną rejestracją sygnału rezonansowego i dodawać te sygnały do siebie. W
przypadku większych biomolekuł stosuje się oba podejścia. W najbardziej optymalnych
warunkach pomiaru dowolnego widma NMR w roztworze (1H NMR,
13C NMR itd.)
wymagane są rutynowo stężenia substancji rzędu 1 milimola w próbce ok. 1 ml, czyli
10 mg białka czy fragmentu kwasu nukleinowego o masie cząsteczkowej 10 kDa (i
odpowiednio więcej miligramów przy wzroście masy cząsteczkowej biomolekuły).
Najnowocześniejsze rozwiązania w zakresie detekcji sygnału (kriosondy) pozwalają
obniżyć stężenia do kilkudziesięciu mikromoli.
Postać widma zależy w decydującym stopniu od stanu skupienia układu
cząsteczkowego. Jądra danego typu cząsteczki w stanie stałym dają jedną szeroką linię
rzędu kilka- do kilkudziesięciu tysięcy Hz (kHz) szerokości. W cieczach i roztworach (a
także gazach) obserwuje się na widmie szereg wąskich linii o szerokościach od
dziesiątych części Hz dla małych cząsteczek organicznych do kilkudziesięciu Hz dla
biopolimerów. Przykładowe widmo np. 1H NMR prostej cząsteczki bromku etylu
(PLANSZA 20) pokazuje kilka charakterystycznych cech, które zadecydowały o
niezwykle szerokim zastosowaniu tej techniki, od fizyki ciała stałego po medycynę
kliniczną.
(A) Częstości rezonansowe poszczególnych protonów w cząsteczce różnią się wskutek
przesłaniania (ekranowania) zewnętrznego pola magnetycznego przez elektrony. Zjawisko
23
to nazywa się przesunięciem chemicznym , które można mierzyć w jednostkach ppm
(parts per million) względem sygnału rezonansowego wybranego wzorca:
= [( − wzorzec)/wzorzec] 106
Protony grupy metylowej ulegają rezonansowi przy nieco innej częstości (mają inne
przesunięcie chemiczne) niż protony etylenowe. Podobnie byłoby z sygnałami węgli 13
C.
Różnice częstości w ramach jednego typu jądra w różnych otoczeniach chemicznych
są rzędu kilku do kilkudziesięciu kHz a więc znacznie mniejsze niż różnice częstości
rezonansowych pomiędzy jądrami różnych typów, które wynoszą MHz - tysiąc razy
więcej.
(B) Sygnały rezonansowe poszczególnych jąder w cząsteczce mogą się rozszczepiać
wskutek tzw. sprzężeń skalarnych z innymi jądrami, takimi samymi i innego typu.
Sprzężenia skalarne zachodzą przez elektrony wiązań. Odpowiednie różnice położeń linii
w multipletach noszą nazwę stałych sprzężenia między każdymi dwoma jądrami, i-tym i j-
tym J(i,j). Wynoszą kilkaset - kilkadziesiąt Hz gdy oba sprzęgające się jądra dzieli jedno
wiązanie i szybko maleją do zera gdy ilość wiązań staje się większa niż 4. Z reguły
obserwuje się niezerowe sprzężenia dla jąder oddzielonych o 1 do 3 wiązań.
(C) Na podstawie widma danego typu można więc zidentyfikować poszczególne jądra
w cząsteczce czyli wykonać tzw. przyporządkowanie sygnałów widma NMR jądrom.
W przeciwieństwie do tego typu widm wysokiej zdolności rozdzielczej ("high
resolution") widmo naszego bromku etylu w ciele stałym dałoby jedną szeroką linię
pokrywającą cały zakres przesunięć chemicznych. Nie można wtedy identyfikować
poszczególnych jąder ale można z analizy kształtu tej linii wnioskować o parametrach
kryształu i samej cząsteczki (zagadnieniami NMR w ciele stałym nie będziemy się dalej
zajmować). Zależność widma NMR od struktury chemicznej cząsteczek legła u podstaw
niezwykle szerokiego zastosowania metody (PLANSZA 21). Najważniejsze z
biologicznych zastosowań to:
(I) BIOFIZYKA MOLEKULARNA:
(a) identyfikacja struktury chemicznej związków w roztworze;
(b) wyznaczanie struktury przestrzennej cząsteczek o znanej strukturze chemicznej,
zarówno małych molekuł organicznych jak i dużych polimerów biologicznych;
(c) analiza oddziaływań międzycząsteczkowych, np. z porównania widm
kompleksów molekularnych i cząsteczek składowych.
24
(II) BIOCHEMIA: śledzenie metabolizmu w żywych komórkach i tkankach na
podstawie rejestracji widm „in vivo NMR” i badanie dużych biopolimerów in vivo
metodami „in cell NMR”.
(III) MEDYCYNA KLINICZNA: nieinwazyjne obrazowanie narządów
wewnętrznych i tkanek oparte na zjawisku NMR - magnetic resonance imaging MRI.
Pierwsza klasa zagadnień jest najbardziej istotna z punktu widzenia głównej tematyki
wykładu, ale będą również omówione w skrócie podstawy pozostałych, istotnych dla
biologa zagadnień, in vivo NMR i MRI.
NMR w badaniach białek i fragmentów kwasów nukleinowych zwykle znajduje
zastosowanie w wyznaczaniu struktur przestrzennych tych biomolekuł o znanych
sekwencjach monomerów (znanej budowie chemicznej) w roztworze wodnym. Widmo
1H NMR niewielkiego białka 58 aminokwasów BPTI (inhibitor trypsyny trzustki wołowej;
PLANSZA 22) wskazuje na brak możliwości przyporządkowania sygnałów protonom
cząsteczki. Można "z grubsza" podać zakresy sygnałów protonów łańcuchów bocznych
alifatycznych np. treonin, aromatycznych np. tyrozyn, H i NH łańcucha peptydowego.
Opracowano więc eksperymenty NMR polegające na dostarczeniu do układu jądrowego
cząsteczki kilku impulsów i detekcji sygnału rezonansowego pod ich działaniem. W ten
sposób można zarejestrować widma dwuwymiarowe 2D NMR (PLANSZA 23). W
widmach tego typu obserwujemy sygnały pochodzące od par jąder, np. pary protonów o
różnych przesunięciach chemicznych lub dowolnej pary innych jąder, z których jedno jest
zazwyczaj protonem, i które oddziałują ze sobą magnetycznie.
Istnieją zasadniczo dwa typy takich oddziaływań:
(a) sprzężenie skalarne (omówione) momentów magnetycznych jąder przez elektrony
wiązań - różne od zera stałe sprzężenia J i rozszczepienia linii rezonansowych;
(b) oddziaływania dipolowe momentów magnetycznych jąder "przez przestrzeń";
intensywność oddziaływania rejestruje się poprzez intensywność pozadiagonalych
sygnałów widma efektu Overhausera NOE (nuclear Overhauser effect; eksperyment na
PLANSZY).
Widmo w formie przestrzennej, trzeci wymiar - intenywność sygnału, zwykle przedstawia
się w postaci przekroju poziomicowego, gdzie na osiach znajdują się odpowiednie
25
przesunięcia chemiczne. Odseparowanie nakładających się sygnałów od
poszczególnych jąder wynika z:
(a) rozciągnięcia widma jednowymiarowego w 2 wymiarach (jak elektroforeza 2D);
(b) rejestracja tylko tych sygnałów, które pochodzą od jąder oddziałujących ze sobą
magnetycznie; edycja czyli strata części sygnałów kosztem uproszczenia widma.
Jednakże w miarę wzrostu wymiarów biomolekuły nakrywanie się sygnałów wraca i dla
ich separowania rejestruje się widma trójwymiarowe (3D NMR; PLANSZA 24) a nawet
czterowymiarowe 4D NMR. Dzięki widmom wielowymiarowym 2D, 3D i 4D NMR
można uzyskiwać sygnały jednocześnie od protonów, węgli, azotów itd a także
kombinować ze sobą różne typy eksperymentów NMR np. rejestrować jednocześnie
sprzężenia skalarne i efekt NOE.
Wyznaczanie struktur przestrzennych białek i kwasów nukleinowych w
roztworze metodami NMR przebiega według następującego schematu (PLANSZA 25):
(A) Wykonanie przyporządkowania sygnałów NMR poszczególnym jądrom
cząsteczki o znanej sekwencji aminokwasów lub nukleotydów: przypisanie sygnałów
poszczególnym typom monomerów (aminokwasy, nukleotydy) i przyporządkowanie
sekwencyjne wzdluż łańcucha na podstawie znanej sekwencji i rejestrowanym
oddziaływaniom skalarnym i dipolowym jąder na sąsiednich monomerach (w miarę
standardowa procedura, której nie będę omawiał).
(B) Wyznaczenie parametrów opisujących strukturę przestrzenną cząsteczki:
- odległości proton − proton lub proton − heterojadro z efektu Overhausera;
intensywność oddziaływania dipolowo - dipolowego NOEij zależy jak rij-6
od odległości
między tymi protonami;
- kąty dwuścienne ij wokół wiązań z wartości stałych sprężenia skalarnego dwóch
jąder odległych o trzy wiązania (relacja Karplusa): 3J(i,j) = Acos
2ij + Bcosij + C, A,
B, C -stałe zależne od typu fragmentu chemicznego i rodzaju sprzęgających się jąder i-
tego i j-tego;
- inne parametry np. resztkowe sprzężenie dipolowe RDC (nie omawiam), które dają
informację o „globalnych” relacjach przestrzennych fragmentów molekularnych, np.
wzajemnym ustawieniu fragmentów drugorzędowych białek;
26
(C) Przejście od odległości, kątów i innych informacji przestrzennych na podstawie
struktury chemicznej (długości wiązań, kąty płaskie) do położeń zrębów atomowych
cząsteczki czyli współrzędnych atomowych:
- metody geometryczne tzw. geometria odległościowa (distance geometry);
- dynamika molekularna z wiązami doświadczalnymi NMR rMD.
(D) Weryfikacja uzyskanej struktury.
Przebieg łańcucha peptydowego czynnika 4E inicjującego translację w eukariotach, w
postaci zbioru 20 niskoenergetycznych struktur zgodnych z parametrami (więzami) z
eksperymentów 3D NMR, prezentuje PLANSZA 26. Dla porównania: 5 nałożonych
struktur białka BPTI, pierwszego, dla którego wyznaczono strukturę metodami 2D NMR.
Istnienie kilku podobnych struktur wynika z niepewności wartości doświadczalnych
parametrów: odległości proton-proton i kątów dwuściennych ALE jednocześnie większe
odchylenia w poszczególnych fragmentach sugerują obszary o większej ruchliwości
(dynamiczne) w białku.
Podobnie, strukturę przestrzenna w ramach nakreślonego schematu (A) - (D)
można uzyskać dla biomolekuł w ciele stałym - próbki proszkowe, co ma szczególne
znaczenie w przypadku białek nierozpuszczalnych i niekrystalizujących, takich jak
białka strukturalne, formy amyloidalne i (częściowo) białka błonowe. Zastosowanie
eksperymentów wieloimpulsowych i wielowymiarowych z użyciem techniki szybkiego
wirowania próbki ustawionej pod kątem tzw. „magicznym” (54,7 deg) w polu B, z
częstością kilkunastu - kilkudziesięciu tysięcy obrotów na sekundę MAS (magic angle
spinning) daje widma wysokiej zdolności rozdzielczej w ciele stałym.
27
Wykład 5
Widmo NMR można rejestrować nie tylko dla wyizolowanego związku
chemicznego w odpowiednio przygotowanej próbce ale także in vivo, dla nienaruszonych
zawiesin komórek bakteryjnych, roślinnych i drożdżowych, wypreparowanych tkanek lub
ich fragmentów w zapewniających ciągłość procesów metabolicznych specjalnych
układach perfuzyjnych, lub całkowicie nieinwazyjnie, dla wybranego obszaru całego
żywego organizmu, umieszczonego wewnątrz magnesu aparatu NMR. Te ostatnie
eksperymenty wymagają dodatkowego zastosowania technik obrazowania, o których
powiem w dalszej kolejności. W warunkach eksperymentu in vivo NMR (in vivo MRS -
magnetic resonance spectroscopy) wysokiej zdolności rozdzielczej rejestruje się sygnały
pochodzące od jąder cząsteczek metabolitów wykazujących:
(a) stosunkowo niewielką masę cząsteczkową;
(b) dostateczną ruchliwość tzn. nie związanych w kompleksach molekularnych lub w
błonach;
(c) dostatecznie wysokie stężenie powyżej ~10 M.
Nie rejestruje się sygnałów pochodzących od biopolimerów i struktur komórkowych w
stałym stanie skupienia. Przykładowe widma 31
P NMR, 13
C NMR, 1H NMR,
14N NMR
mięśnia wołowego (PLANSZA 27) pozwalają zidentyfikować szerg różnych metabolitów,
m. in. zawierającą fosfor fosfokreatynę i ATP, kwas mlekowy, dwupeptyd karnozynę,
glikogen. Wykonując widma NMR w określonych odstępach czasu można śledzić zmiany
zawartości metabolitów i ich przekształcanie w inne metabolity, np. wnikanie związku
do komórek i reakcje biochemiczne zachodzące wewnątrz. Przykładowo, zasadnicze
reakcje w mięśniach (PLANSZA 28) to transfer reszty fosforanowej między
wysokoenergetycznymi związkami: ATP i fosfokreatyną, katalizowany przez kinazę
kreatyny i hydroliza ATP do ADP. W procesie niedotlenienia mięśnia sercowego
(PLANSZA 29) widać na widmie 31
P NMR początkowo spadek zawartości fosfokreatyny
a następnie wyczerpywanie sie ATP i powstawanie fosforanu nieorganicznego. Powtórne
doprowadzenie tlenu przywraca poziom ATP i fosfokreatyny.
Podobna technika „in cell NMR” stara się uzyskać dane na temat białek w
naturalnym środowisku komórkowym. Rejestruje się widma białek wzbogaconych C-
13/N-15 wytwarzanych w komórce w odpowiednim stężeniu w procesie sterowanej
ekspresji. Chociaż jeszcze nie wyznacza się standardowo dokładnych struktur
28
przestrzennych białek z rozdzielczością atomową, ale badania zmierzają w tym kierunku
(Hamasu et al. J. Am. Chem. Soc. 135, 1688, 2013)
NMR pozwala również na nieinwazyjne obrazowanie struktur wewnętrznych
organizmu (PLANSZA 30) głównie poprzez mapowanie protonów wody, której zawartość
zmienia się w zależności od typu tkanki: mała zawartość w kościach, znaczna i
zróżnicowania w tkankach miękkich i największa w płynach ustrojowych (krew). W
przeciwieństwie do rejestracji widm w małej próbce (spektroskopia), na podstawie sygnału
1H NMR buduje się obraz tkanek i narządów wewnętrznych: MRI (magnetic resonance
imaging). Idea eksperymentu jest prosta. Gdybyśmy umieścili obiekt, np. dwa próbniki z
wodą w stałym polu magnetycznym Bo otrzymalibyśmy jeden zbiorczy sygnał NMR.
Jeżeli wzdłuż osi x ustawienia próbników przyłożymy liniowy gradient gx pola B
zjawisko rezonansu będzie zachodziło przy innych częstościach dla każdego z tych
próbników:
= (Bo + gxx).
Otrzymamy dwa sygnały osobno od każdego z próbników, a mierzonym różnicom
częstości rezonansowych odpowiada zmiana położenia x próbników:
x = /(gx).
Przykładając dwa gradienty gx i gy wzdłuż dwóch kierunków, o zmiennym czasie trwania
każdy, w eksperymencie dwuwymiarowego NMR rejestruje sie sygnały rezonansowe,
które można przetworzyć na obraz w postaci dwuwymiarowego przekroju przez obiekt
(kodowanie informacji o punkcie x przez modulację fazową rejestrowanego sygnału).
Złożenie kolejnych płaszczyzn uzyskiwanych przy pomocy trzeciego gradientu wzdłuż osi
z daje obraz trójwymiarowy. Obrazowanie wynika z różnic ilości protonów i czasów
relaksacji w sąsiednich punktach obiektu, przy czym te ostatnie decydują o kontraście. W
ten sposób ujawnią się zmiany chorobowe, np. tkanka nowotworowa daje inny sygnał
MRI niż normalna (PLANSZA 31). Można dodatkowo wprowadzać czynniki
kontrastujące w określone i pożądane miejsca.
Obrazować można bardzo różne obiekty, od całego człowieka do obiektów o
bardzo małych wymiarach - mikroskopia NMR, np. pojedynczej komórki (PLANSZA
32). W nowoczesnych aparatach MRS/MRI łączy się eksperymenty in vivo NMR i
obrazowanie spinowe przez rejestrację obrazu, wydzielenie pożądanego fragmentu i
rejestrację widma określonego typu od tego małego obszaru (PLANSZA 30). Tzw.
29
funkcjonalny MRI (fMRI) umożliwia rejstrację obrazów obszarów „pracującego” mózgu -
możliwość przyporządkowywania określonych typów aktywności grupom neuronów
(PLANSZA 33) i przeprowadzania eksperymentów psychologicznych (PLANSZA 34).
Rejestracja „czynnościowa” wynika z napływu krwi do aktywnych neuronów i zmian
własności magnetycznych żelaza w hemoglobinie wskutek redukcji.
(d) Rentgenografia czyli uzyskiwanie struktur przestrzennych cząsteczek w
monokryształach przez rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego jest najszerzej
stosowana metodą w przypadku białek, kwasów nukleinowych i ich kompleksów. Kryształ
molekularny np. białka (PLANSZA 35) tworzy regularną strukturę makroskopową
wynikającą z symetrii mikroskopowej jednej cząsteczki lub kilku cząsteczek w komórce
elementarnej sieci nkrystalicznej (PLANSZA 36). Przesuwanie takiej komórki wzdłuż
trzech osi a , b , c wypełnia całą przestrzeń bez pustych miejsc regularnie ułożonymi
cząsteczkami tworząc jedną z 14 możliwych sieci Bravais „abstrakcyjnych punktów”,
zebranych pod względem symetrii w 7 układów krystalograficznych. Obok symetrii
translacyjnej kryształ ma lokalną symetrię w każdym punkcie sieci, związaną z
odbiciami i obrotami wokół osi, czyli elementami symetrii cząsteczek w komórce (32
grupy symetrii, tzw. klasy). Wszystkie elementy symetrii mikroskopowej kryształu można
zebrać w przestrzenną grupę symetrii, jedną z 230 możliwych, i jednoznacznie
scharakteryzować przez podanie jej symbolu. Promieniowanie rentgenowskie o długości
fali rzędu odległości międzyatomowych (1 Å) ulega dyfrakcji, czyli ugięciu na
elektronach „atomów”. W pewnych kierunkach następuje interferencja wzmacniająca i
pojawia się prążek dyfrakcyjny zgodnie z prawem Bragga:
2dsin = n
n - liczba całkowita 1, 2, 3 itd.; d - odstęp płaszczyzn sieciowych (dających jeden prążek)
(A) Układ czyli położenie prążków dyfrakcyjnych jest uwarunkowany przez grupę
symetrii kryształu i wymiary komórki elementarnej (wartości a, b, c, i , );
(B) Intensywności prążków dyfrakcyjnych są uwarunkowane przez rodzaje
atomów i ich położenia w komórce elementarnej.
Mierząc intensywności poszczególnych prążków na dyfraktogramie można
wyznaczyć mapy gęstości elektronowej w komórce elementarnej a stąd wstawić w
odpowiednich miejscach poszczególne atomy i wiązania cząsteczki. Podstawowym
problemem w uzyskaniu mapy gęstości elektronowej z dyfraktogramu jest tzw. problem
30
fazowy. Wynika on stąd (PLANSZA 37), że zależny od położeń atomów i ich siły
rozpraszania czynnik strukturalny, który umożliwia wyliczenie intensywności prążków
dyfrakcyjnych, jest liczbą zespoloną F = a + bi = ba22
(cos + isin), i = 1 . Mając
strukturę można łatwo policzyć czynnik strukturalny F i intensywność I jako kwadrat jego
wartości bezwzględnej: I = |F|2. Aby wyznaczyć czynnik strukturalny z intensywności
trzeba niezależnie wyznaczyć fazę = arctg(a/b) dla każdego prążka, czyli liczbę z
przedziału [0, 360]. Problem fazowy rozwiązuje się jedną z trzech metod:
(1) podstawienie molekularne: zastosowanie znanych faz podobnych cząsteczek, które
podobnie wykrystalizowały, a których struktura przestrzenna w krysztale została już
wyznaczona;
(2) podstawienie izomorficzne MIR (multiple isomorphous replacement): rejestracja
dyfraktogramów od jednakowych (izomorficznych) kryształów: jeden „zwykły”, drugi i
trzeci z ciężkimi atomami (jonami) w każdej komórce elementarnej, silnie rozpraszającymi
promienie X, skąd można określić ich położenia w komórce jako punkt odniesienia;
(3) rozpraszanie anomalne w kilku długościach fali MAD (multiwave anomalous
diffraction) przy użyciu promieniowania synchrotronowego; w przypadku białek, które
zamiast metioniny z siarką zawierają selenometioninę.
Procedura wyznaczania struktury w krysztale jest następująca:
- uzyskanie kryształu o odpowiednio dobrej zdolności rozpraszania;
- wstawienie kryształu do dyfraktometru (PLANSZA 38) lub na wyjściu wiązki z
akceleratora, i zwykle szybkie zamrożenie (witryfikacja) kryształu w strumieniu ciekłego
azotu;
- uzyskanie dyfraktogramu w detektorze np. typu imaging plate (klisze fotograficzne
odeszły już do lamusa);
- wyznaczenie wstępnej struktury na podstawie intensywności prążków i
rozwiązanego problemu fazowego;
- iteracyjne uzgadnianie dyfraktogramu doświadczalnego i liczonego teoretycznie aż
do uzyskania wystarczającej zgodności opisanej przez tzw. czynnik R, który powinien być
mniejszy od 25%; czynnik R określa procentowe odstępstwo intensywności mierzonych
dla prążków na dyfraktogramie i liczonych teoretycznie dla danej struktury:
R = )obs(I/)]cal(I)obs(I[ kkk
k
31
)obs(Ik - obserwowana intensywność prążka dyfrakcyjnego
)obs(Ik - liczona teoretycznie intensywność prążka dyfrakcyjnego
Czynnik R zależy oczywiście od jakości kryształu (regularność, brak defektów), opisanej
przez tzw. zdolność rozdzielczą w Å: zdolność rozdzielcza poniżej 2Å zapewnia
określanie położeń wszystkich ciężkich atomów cząsteczki (tzn. z wyjątkiem wodorów) z
dokładnością do tysięcznych części Å. Jest to minimalna odległość między płaszczyznami
sieciowymi (rodzina płaszczyzn), które dają mierzalny prążek dyfrakcyjny.
Obok rozpraszania na monokryształach stosuje się rozpraszanie promieniowania X
na tzw. włóknach kwasów nukleinowych, wytrąconych z roztworu. Taki dyfraktogram
nie daje możliwości określenia struktury z dokładnością atomową, ponieważ włókno jest
regularne tylko w jednym kierunku. Pozwala jednak uzyskać wiele cennych informacji
strukturalnych np. o helikalności DNA czy RNA. Na podstawie rentgenografii włókien
Watson i Crick podali model podwójnej helisy DNA na początku lat 50-tych XX w.
Kluczowym zagadnieniem dla rentgenografii jest relacja między strukturą
przestrzenną biomolekuły w krysztale i jej strukturą natywną w roztworze wodnym lub
błonie, gdzie funkcjonuje. Kryształy białek i kwasów nukleinowych zawierają na szczęście
znaczne ilości wody, nawet do 60% masy kryształu. Jest to głównie woda
nieustrukturowana, nie związana w pierwszej strefie hydratacyjnej czy wewnątrz
cząsteczki, nieregularnie rozmieszczona w sieci krystalicznej i nie dająca wkładu do
prążków dyfrakcyjnych. Publikacja Garbuzynski et al. Proteins 60, 134, 2005 przedstawia
wyniki analizy rozbieżności metod NMR i rentgenografii dla 78 niehomologicznych
białek, dla których struktury uzyskano przy wykorzystaniu obu metod. Różnice w Å
mierzone wartościami parametru RMSD (root mean square deviation) czyli pierwiastka
średniego odchylenia kwadratowego położeń atomów okazały się bardziej znaczące w
przypadku 18 struktur. Zdarzają się także, chociaż stosunkowo rzadko przypadki
znaczących różnic konformacji w krysztale i roztworze, np. dla quadrupleksu
telomerowego DNA (Li et al. Nucleic Acids Research 33, 4649, 2005).
32
Wykład 6
(e) Bezpośrednie określanie struktur cząsteczek z rozdzielczością rentgenografii
czy NMR (poniżej 0,1 Å) nie jest możliwe jak na razie ani w mikroskopii optycznej ani
elektronowej. W mikroskopach optycznych granica dyfrakcyjna światła daje
rozróżnienie szczegółów powyżej 200 nm (2000 Å). Nowoczesne zdobycze optyki w
metodzie mikroskopii bliskiego pola NSOM (near-field scanning microscopy) czy
fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej pozwalają uzyskać teoretyczną rozdzielczość
ok. 20 40 nm. W przypadku najlepszych transmisyjnych mikroskopów elektronowych
pojedynczej cząsteczki w niskich temperaturach, tzw. cryoEM (cryo electron
microscopy), rozdzielczość uwarunkowana abberacją soczewek magnetycznych nie
przekracza 5 ÷ 10 Å. Do obrazowania EM wykorzystuje się falowe własności elektronu.
Porównywalną rozdzielczość jeśli chodzi o wyznaczanie kształtu makromolekuł
uzyskano za pomocą mikroskopów siły atomowej AFM (atomic force microscopy
PLANSZA 39). Pojedynczą makrocząsteczkę w kropli roztworu na płaskiej powierzchni
skanuje się bardzo ostrym rylcem. Siły molekularne van der Waalsa między ostrzem i
podłożem rzędu pikonewtonów (1 pN = 10-12
N) utrzymuje się na stałym poziomie
podczas skanowania dzięki ujemnemu sprzężeniu zwrotnemu: wychylenie wspornika po
natrafieniu na zakrzywienie powierzchni jest rejestrowane jako zmiana siły i
kompensowane odpowiednim przesunięciem rylca tak że odległość ostrze - powierzchnia
skanowania pozostaje stała. Służy do tego celu najczęściej wiązka laserowa odbita od
wspornika. W ten sposób rejestrowany jest obraz powierzchni, a więc dokładny kształt
umieszczonej na niej cząsteczki białka, kwasu nukleinowego czy kompleksu
molekularnego (PLANSZA 40). PLANSZA przedstawia fragment inicjacyjnego
kompleksu translacyjnego w eukaryotach, złożonego z trzech białek i mRNA,
przyczepionego 5'-końcem (cap) i 3'-końcem (poliA) do białek. Rejestracja obrazów w
czasie umożliwia śledzenie zmian w cząsteczkach w skali długoczasowej. W innym
modzie pracy mikroskopu AFM zaczepienie rylcem cząsteczki przytwierdzonej do
podłoża pozwala dokonywać manipulacji pojedynczą cząsteczką, poruszać nią i
rozciągać oraz mierzyć związane z tym siły molekularne od kilku do kilkuset pN, przy
odpowiednim wyskalowaniu wychyleń wspornika jak wagi sprężynowej, np. widmo sił
wymaganych do rozciągania kolejnych domen białka titin (PLANSZA 41).
Podobne manipulacje makrocząsteczką można wykonywać przy użyciu szczypiec
optycznych i szczypiec magnetycznych. W pierwszej metodzie przyczepia się do
33
makrocząsteczki paciorek dielektryczny, polistyrenowy lub krzemowy. Wiązka laserowa
utrzymuje paciorek w środku jak w pułapce (optycznej) i umożliwia jego przesuwanie
razem z przyczepioną cząsteczką. Przykład zastosowania (PLANSZA 42): śledzenie i
analiza ruchu cząsteczki białkowej kinezymy po mikrotubuli w postaci 8-nm skoków. W
szczypcach magnetycznych przyczepia się do cząsteczki paciorek ferromagnetyczny i pole
magnetyczne umożliwia zarówno przesuwanie jak i obracanie makrocząsteczki (przykład
będzie podany później w trakcie wykładu).
(f) Dynamika ruchów molekularnych cząsteczek biologicznych jest obok struktury
chemicznej i przestrzennej drugim zasadniczym elementem, który warunkuje mechanizm
działania na poziomie molekularnym. Opis dynamiki cząsteczki jest trudniejszy w języku
fizyki niż opis struktury. Podstawowym modelem jest model dyfuzyjny, w którym
cząsteczki wykonują przypadkowe ruchy:
(a) globalne translacje i obroty całej czasteczki;
(b) wewnętrzne ruchy lokalne: obroty wokół wiązań (zmiany konformacyjne), transfer
protonów i jonów między grupami naładowanymi;
(c) drgania wiązań, kątów płaskich i torsyjne (nieistotne z punktu widzenia biologii
układu molekularnego)
Mierzonymi doświadczalnie parametrami, które opisują ruchy tego typu są:
- średnie czasy życia danej formy przestrzennej [s] i średnie szybkości przejścia od
jednej formy do drugiej k = 1/ [s1
];
- średnie amplitudy ruchów, wyrażone w Å (zmiany odległości), stopniach (zmiany
kątowe) lub procentowo.
Parametry te wyznacza się najczęściej z:
(1) pomiarów czasów relaksacji T1 i T2 technikami NMR;
(2) pomiarów czasowych zmian anizotropii fluorescencji po wzbudzeniu
elektronowym cząsteczki impulsem (laserowym) światła spolaryzowanego liniowo;
Obrazy milisekundowych zmian strukturalnych uzyskuje się w rentgenografii
Lauego przy wykorzystaniu „białego” (niemonochromatycznego) promieniowania
rentgenowskiego dużej mocy z synchrotronu. Szybka, milisekundowa, rejestracja krok po
34
kroku obrazów dyfrakcyjnych daje jakby kolejne „klatki filmu” ewoluującego układu, np.
śledzenie reakcji enzymatycznej w krysztale odpowiednio zmutowanego białka
enzymatycznego dla zapewnienia spowolnienia katalizowanej reakcji enzymatycznej.
Bardzo dużo informacji o ruchach molekularnych nie tylko w postaci podanych
parametrów ale rejestracji zmian położeń poszczególnych atomów uzyskuje się za pomocą
komputerowych symulacji dynamiki molekularnej MD (molecular dynamics;
PLANSZA 43). Dla klasycznych "atomów" cząsteczki jako punktów materialnych
wyznacza się siły ze strony innych atomów z pola siłowego FF (potencjał V omówiony
poprzednio). Ruch atomów pod wpływem tych sił uzyskuje się z numerycznego
rozwiązania w komputerze równań Newtona w krótkich skokach czasowych ok. 1
femtosekundy (1 fs = 10-15
s) przez okres taki na jaki pozwalają nowoczesne
superkomputery tzn. do mikrosekund (1 ns = 10-6
s). W każdej chwili można podać obraz
przestrzenny cząsteczki, np. ewolucja podwójnej helisy DNA od klasycznej formy B do
bliższej rzeczywistości w roztworze formy nieregularnej (PLANSZA 44). Rozpuszczalnik
można traktować jak ośrodek ciągły o określonej stałej dielektrycznej albo uwzględniać
cząsteczki wody w równaniach Newtona na takich samych zasadach jak atomy cząsteczki
rozpuszczonej. Oczywiście można w ten sposób zaobserwować tylko takie ruchy
molekularne, których średnie czasy są krótsze od czasów symulacji ( < Tsymulacji).
Dynamikę molekularną stosuje się często do uzyskiwania struktur przestrzennych
cząsteczek na podstawie mierzonych parametrów NMR (PLANSZA 26), ponieważ układ
dąży do konformacji o minimalnej energii (swobodnej). Aby to zrobić w krótkim czasie,
krótszym niż dostępne czasy symulacji wprowadza się dodatkowe pseudosiły "ściągające"
cząsteczkę do konformacji opisanej znanymi z NMR parametrami przestrzennymi:
odległościami proton - proton i kątami dwuściennymi. Taką wersję MD nazywa się
dynamiką molekularną z więzami NMR, rMD (restrained molecular dynamics;
PLANSZA 43). Przykład ściągania rozwiniętego łańcucha peptydowego do formy -
helikalnej w czasie 10 ps przedstawia PLANSZA 45.
35
3. Budowa kwasów nukleinowych DNA i RNA.
Kwasy nukleinowe są liniowymi biopolimerami, zbudowanymi z zasadniczo
czterech monomerów, nukleotydów. Dwa podstawowe typy kwasów nukleinowych, DNA
i RNA, różnią się budową chemiczną nukleotydów i funkcjonowaniem w komórkach.
Kwas dezoksyrybonukleinowy DNA (PLANSZA 10) pełni rolę nośnika
informacji genetycznej. Składa się z 2'-deoksyrybonukleotydów: dwóch zawierających
zasady purynowe dGMP, dAMP, i dwóch pirymidynowych, dCMP i TMP, w których
cukrem jest -D-2'-deoxyrybofuranoza (-D-2'-deoxyryboza) (PLANSZA 46).
Numeracja w pierścieniach zasad i w części cukrowej (cyfry primowane) jest jednakowa
dla deoxy- i rybonukleotydów. Symbole i D opisują konfiguracją wokół atomów węgla,
odpowiednio C(1') i C(4'), podstawionych czterema różnymi podstawnikami. Takie
cząsteczki z asymetrycznym(i) atomem (atomami) węgla nie pokrywają się ze swoim
odbiciem zwierciadlanym i występują w postaci izomerów optycznych, skręcających
światło spolaryzowane liniowo w przeciwnych kierunkach. Zasada azotowa: guanina,
adenina, cytozyna i tymina, plus cukier czyli nukleozyd: 2'-deoxyguanozyna, 2'-
deoxyadenozyna, 2'-deoxycytydyna i tymidyna, łączą się ze sobą poprzez grupy
fosforanowe w nić polinukleotydową o wyróżnionym kierunku od 5'-końca do 3'-
końca. Sekwencja czyli kolejność nukleotydów (zasad) w kierunku 5' 3' określa
strukturę pierwszorzędową kwasu DNA. Podwójne helisy DNA o długości ponad 108bp
(par zasad), ok. 1010
÷1011
Da, po rozwinięciu osiągałyby kilka centymetrów.
W warunkach pH komórkowego grupy fosforanowe w nici polinukleotydowej są
zjonizowane i obdarzone ładunkiem ujemnym (pK ok. 1 - 2), zneutralizowane przez
kationy roztworu, np. K+, Na
+ czy Mg
2+. Grupy fosforanowe swobodnych nukleotydów
mogą oddysocjować dwa protony i w fizjologicznym pH zachodzi częściowo druga
jonizacja (pK2 ok. 6.5 - 7). Kwasy dezoksyrybonukleinowe powstają w procesie
semikonserwatywnej replikacji (eksperyment Meselsona - Stahla) w fazie S cyklu
komórkowego (PLANSZA 47): na dwóch niciach pierwotnych syntetyzowane są przez
polimerazy DNA nici potomne na zasadzie komplementarności: naprzeciw dA w matrycy
włączane jest T w postaci trifosforanu TTP, naprzeciw dG włączane jest dC, naprzeciw T
włączne jest dA a naprzeciw dC włączane jest dG. Powstaje w ten sposób helikalna
struktura DNA (PLANSZA 10). Niektóre wirusy syntetyzują DNA na matrycy RNA w
procesie odwrotnej transkrypcji.
36
Kwas rybonukleinowy RNA (PLANSZA 48) pełni szereg funkcji zależnie od
wielkości i struktury:
(a) mRNA - informacyjny (messenger RNA) jest roboczą matrycą do syntezy łańcucha
białkowego w procesie translacji; średnie długości pre-mRNA to ok. 6 000n a
dojrzałego mRNA ok. 1 500n (średnie białko globularne ok. 300 400 AA);
(b) rRNA - rybosomalny RNA jest składnikiem rybosomu; cząsteczki o długości od
120n do 4 700n;
(c) tRNA - transferowy RNA (75n do 90n) łączy się z właściwym dla siebie
aminokwasem i wprowadza go w miejsce na rybosomie, gdzie zachodzi włączanie do
powstającej nici peptydowej;
(d) snRNA - mały jądrowy (small nuclear) RNA jest składnikiem splicesome'u w
procesie składania mRNA w jądrze komórkowym - podobny do rRNA ale krótszy;
podobnie snoRNA (small nucleous) mały jąderkowy RNA;
(e) miRNA - mikro RNA, duża rodzina małych, ok. 20n, endogennych RNA o
funkcjach regulacyjnych;
(f) RNA wirusów - materiał genetyczny niektórych wirusów (HIV)
RNA (PLANSZA 46) składa się z rybonukleotydów: dwóch purynowych GMP,
AMP, i dwóch pirymidynowych, CMP oraz UMP - brak grupy metylowej w pozycji 5
uracylu w porównaniu z tyminą. Cukrem jest -D-rybofuranoza (-D-ryboza)
zawierająca 2'-OH w przeciwieństwie do 2’-deoksyrybozy w DNA. Rybonukleozydy:
guanozyna, adenozyna, cytydyna i urydyna łączą się w nić polinukleotydową poprzez
grupy fosforanowe. Sekwencja nukleotydów (zasad) w kierunku 5' - 3' wyznacza strukturę
pierwszorzędową RNA. Jonizacja grup fosforanowych jest podobna jak w przypadku
DNA. Kwasy rybonukleinowe powstają w procesie transkrypcji (PLANSZA 49):
polimerazy RNA syntetyzują nić polinukleotydową na matrycy jednej nici DNA, na
zasadzie komplementarności zasad: dA : U, T : A, dG : C i dC : G.
Badania krystalograficzne i spektroskopowe pokazują, że płaskie zasady azotowe
w krysztale i roztworze występują w dominujących formach tautomerycznych amino i
oxo (keto) (PLANSZA 46). Czułość bezpośrednich metod doświadczalnych sięga 99%
czyli 10-2
. Zmiana ustawienia protonów i reorganizacja wiązań podwójnych stwarza
możliwość powstawania mniejszościowych tautomerów imino i enolo (hydroxy)
(PLANSZA 50). Rzadkie tautomery były postulowane przez Watsona i Cricka (teoria
37
rozwinięta przez Topal i Fresco: Nature 263, 285, 1976) jako czynnik inicjujący mutacje
punktowe wskutek niekomplementarnego parowania zasad. Wiele nukleozydów z
modyfikowanymi chemicznie zasadami ma charakter promutagenny wskutek równowagi
tautomerycznej form o porównywalnej zawartości (populacji) z których każda może
parować komplementarnie z inną zasadą, np. izoguanozyna z równowagą form
iminoamino. Potwierdzenie hipotezy W.C. wymaga aby rzadkie formy tautomeryczne
występowały z częstością większą lub równą częstości mutacji punktowych, tranzycji i
transwersji (PLANSZA 51) nieskorygowanych przez mechanizmy naprawcze, czyli ok.
104
- jedna utrwalona, niekomplementarna para zasad na 104 nowosyntetyzowanych.
Obecność systemów naprawy DNA obniża częstości mutacji do 108
do 1011
.
Zagadnienie tautomerii zasad zwykłych i modyfikowanych stało się jednym z centralnych
problemów badań doświadczalnych i obliczeń kwantowomechanicznych w biofizyce.
Problem ten okazał się złożony m. in. ze względu na silny wpływ rozpuszczalnika na
równowagę tautomeryczną oraz przesuwanie tej równowagi w kompleksach zasad. Mimo,
że odkryto ok. 50% udział rzadkiej formy hydroksy w guanozynie i ok. 10% formy imino
w cytydynie techniką spektroskopii IR w niskotemperaturowych matrycach gazowych,
hipoteza inicjacji mutacji punktowych przez rzadkie formy tautomeryczne pozostaje
nierozstrzygnięta. Dla adenozyna i urydyny (tymidyny) szacuje się udział rzadkich
tautomerów poniżej 10-8
.
Konkurencyjną hipotezą (Sowers et al. Mutation Research 177, 201, 1987) jest
inicjacja mutacji punktowych przez błędne parowanie z udziałem zasad w formach
uprotonowanych i zdysocjowanych (PLANSZA 46). Stwierdzono, że adenina naprzeciw
cytozyny w syntetycznym, helikalnym 12-merze DNA (Nature 320, 552, 1986) w
krysztale jest uprotonowana (PLANSZA 52). Wartości pK naturalnych zasad różnią się o
ok. 3 jednostki od pH komórkowego co pozwala szacować prawdopodobieństwo
wystąpienia tych form na 10-3
. W końcu, eksperymenty z włączaniem przez polimerazę I
DNA trójfosforanu deoxyrybozydu z difluorotoluenem zamiast zasady (PLANSZA 53)
naprzeciw adeniny (Kool Biopolymers 48, 3, 1998) stały się podstawą stwierdzenia, że
błędne parowanie nie wymaga żadnych szczególnnych form a komplementarność
kształtu i steryczne dopasowanie zasad odgrywa nie mniejszą rolę niż komplementarność
wynikająca z układu wiązań wodorowych. Parowanie o mniejszej liczbie wiązań
wodorowych typu wobble G:T (PLANSZA 54) - błędne w DNA, jest "normalne" jako
G:U na trzecim miejscu parowania kodon mRNA : antykodon tRNA.
38
Wieloletnie badania zagadnienia tautomerii zasad kwasów nukleinowych
metodami doświadczalnymi i obliczenia kwantowe o zaawansowanym charakterze nie
rozstrzygnęły jednoznacznie zagadnienia inicjacji mutacji punktowych. Swój udział w tym
procesie mogą mieć zarówno rzadkie formy tautomeryczne, dysocjacja/jonizacja i błędne
parowanie wynikające z praw termodynamiki procesu (brak 100% dokładności).
Zasady w DNA i RNA są tzw. chromoforami czyli fragmentami molekularnymi
odpowiedzialnymi za absorpcję promieniowania elektromagnetycznego (PLANSZA
55) w zakresie UV (nukleotydy fluoryzują, ale bardzo słabo). Nałożenie pasm absorpcji
zasad daje wypadkową absorpcje DNA (RNA) w postaci dwóch charakterystycznych
pasm o maksimach przy 260 nm i 200 nm. Szczególnie to pierwsze jest wykorzystywane
we wszystkich detektorach do spektrofotometrycznej identyfikacji kwasów nukleinowych.
39
Wykład 7
Nukleotyd jest cząsteczką konformacyjnie "giętką" tzn. ze względu na
możliwość rotacji wokół wiązań pojedynczych występuje w roztworze w równowadze
dynamicznej szeregu konformacji (PLANSZA 56), o zbliżonych wartościach energii. W
krótkim czasie rzędu nanosekund (ns) konformery przechodzą jeden w drugi pokonując
niewielkie bariery energetyczne, nie przekraczające 25 kJ/mol czyli poniżej 10RT w
temperaturze pokojowej (RT jest miarą energii ruchów cieplnych). W makroskopowym
obrazie, każda z tych konformacji jest obsadzona przez pewien ułamek (procent)
wszystkich cząsteczek czyli tzw. populację. Każda konformacja jest scharakteryzowana
przez wartość kąta dwuściennego między wybranymi podstawnikami, przyłączonymi do
wiązania wokół którego zachodzi obrót, co obrazuje rzut Newmana. Według
nomenklatury komisji IUPAC-IUB (PLANSZA 57) poszczególnym zakresom kąta
dwuściennego odpowiada nazwa. Podstawniki mogą być następująco ustawione względem
siebie i zobrazowane w rzucie Newmana:
- transoidalnie czyli antiperiplanar (ap) lub anti z kątem dwuściennym ok. 180;
- cisoidalnie czyli synperiplanar (sp) lub syn z kątem dwuściennym ok. 0;
- naprzemiennie (gauche) czyli synclinical (sc), kąty dwuścienne ok. +60 lub −60.
Swobodne nukleotydy preferują następujące konformacje (PLANSZA 56):
(a) Zasada może wykonywać obrót wokół wiązania glikozydowego i przyjmować dwa
ustawienia: syn i anti, opisane przez wartości kąta O(4')C(1') N(1)C(2)
(pirymidyny) i O(4')C(1') N(9)C(4) (puryny). Zakres syn odpowiada 90 < <
+90 a zakres anti +90 < < 270 (90);
(b) Konformacja cukru jest opisana przez 5 kątów dwuściennych wewnątrz pierścienia;
Cukier nie jest płaski i może przyjmować dwa podstawowe formy (PLANSZA 58):
kopertową E, w której jeden atom pierścienia x jest wychylony w górę (endo) xE lub w
dół (exo) xE z płaszczyzny czterech pozostałych i skręconą T , w której dwa sąsiednie
atomy x i y są wychylone z płaszczyzny w przeciwne strony Txy . W modelu
pseudorotacji każda z tych konformacji jest opisana przez dwa parametry: kąt
pseudorotacji P od 0 do 360 i maksymalne pofałdowanie pierścienia max, które
zwykle zawiera się w graniczch 35 do 45 (kątowe wychylenie maksymalne). Tylko dwa
parametry jednoznacznie wyznaczają pięć kątów dwuściennych w pierścieniu (!)
Konformacje przechodzą jedna w drugą w sposób ciągły i cały zakres P obejmuje
40
wszystkie możliwe przypadki. W cyklopentanie pseudorotacja jest rzeczywistym ruchem
wewnętrznym cząsteczki nie wymagającym przechodzenia przez bariery energetyczne. W
pierścieniach podstawionych takich jak cukrowe dopuszczalne są tylko dwie konformacje
(PLANSZA 56), z zakresu N (north na kole pseudorotacji) z P od ok. 0 do 36, T32 do
T34 czyli wokół C(3')endo i z zakresu S (south na kole pseudorotacji), z P od ok. 135 do
190, T21 do T2
3 , wokół C(2')endo.
(c) Grupa egzocykliczna C(5')H2O obraca się wokół wiązania C(4')C(5') i może
przyjmować trzy klasyczne formy naprzemianległe +sc, -sc i ap, z kątami dwuściennymi
bliskimi odpowiednio +60, -60 i 180.
(d) Grupa fosforanowa może przyjmować w zasadzie trzy klasyczne formy wokół
wiązania C(5')O podobnie jak egzocykliczna, ale silnie preferowana jest jedna
konformacja ap z transoidalnym ustawieniem P i C(4'), kąt ok. 180. Ponieważ dla
nukleotydu w łańcuchu polinukleotydowym nie można jednoznacznie przypisać fosforanu
pozycji 5' trzeba również rozpatrywać 3'-nukleotydy. Fosforan preferuje silnie
konformację zbliżoną do transoidalnego ustawienia P i C(4') z kątem ~ 220 (40
odchylenia od ap).
Po włączeniu nukleotydu do łańcucha polinukleotydowego DNA lub RNA
pojawia się możliwość obrotu wokół wiązań fosfoestrowych i dodatkowe konformacje
opisane kątami i (PLANSZA 59). W sumie strukturę przestrzenną łańcucha
polinukleotydowego opisuje 6 wartości kątów dwuściennych dla każdego
nukleotydu, a pełen opis cząsteczki kwasu nukleinowego wymaga dodatkowo wartości
kąta glikozydowego oraz konformacji pierścienia cukru, parametry P i max (kąt ,
wspólny dla łańcucha i pierścienia nie definiuje jednoznacznie konformacji tego
ostatniego). Struktura przestrzenna cząsteczki kwasu nukleinowego może tworzyć różne
formy (typy) lokalne i globalne, które określa się terminem STRUKTUR
WYŻSZORZĘDOWYCH: drugorzędowych i trzeciorzędowych.
(a) Pierwszy krokiem w ustaleniu pełnej struktury cząsteczki kwasu nukleinowego
jest określenie sekwencji nukleotydów od 5'- do 3'-końca czyli STRUKTURY
PIERWSZORZĘDOWEJ. Naczelnym zadaniem genomiki jest ustalenie pełnej
sekwencji nukleotydowej DNA człowieka i innych organizmów. W czerwcu 2000 badacze
w ramach Human Genom Project i prywatna compania Celera Genomics ogłosiły
41
wykonanie sekwencjonowania DNA wszystkich chromosomów ludzkich - 6109 par
zasad (bp) na 46 chromosomach. Niezależnie od zastosowanej w obu przypadkach
techniki cząsteczkę DNA trzeba:
- pociąć endonukleazami (restrykcyjnmi) na krótkie fragmenty jednoniciowe;
- sklonować fragmenty (przypadkowe biblioteki), np. w E. coli;
- ustalić sekwencję każdego fragmentu przy pomocy jednej z dostępnych technik;
- złożyć sklonowane fragmenty we właściwej kolejności, np. „na zakładki” jednakowych
sekwencji’.
Uzyskana sekwencja stanowi kluczowe dane do annotacji regionów kodujących czyli
„określenie genów” (gene prediction strategy; Sleator Gene 461, 1, 2010).
Ustalanie sekwencji w krótkich fragmentach do ok. 400n można wykonać za pomocą
jednej z metod:
(1) chemiczne rozszczepianie Maxam-Gilbert'a, selektywnie w stosunku do typu zasady
(starsza, rzadko obecnie stosowana);
(2) kontrolowane przerywanie replikacji Sangera. (PLANSZA 60).
Metoda Sangera polega na enzymatycznej syntezie (polimeraza I) komplementarnej kopii
do nici DNA o poszukiwanej sekwencji. Materiał DNA czyli sklonowany fragment jest
rozdzielany na 4 porcje i dla każdej z nich jest prowadzona synteza, przerywana na ściśle
określonej zasadzie, komplementarnej do zasady analogu 2',3'-dideoxy-ATP, 2',3'-
dideoxy-GTP, 2',3'-dideoxy-CTP lub 2',3'-dideoxy-TTP, który po włączeniu do nici
terminuje syntezę wskutek braku 3’OH. Odpowiednia ilość 2',3'-dideoxy-NTP w każdej
z 4 reakcji zapewnia jego włączenie do nowo-syntetyzowanego DNA średnio 1:100 w
stosunku do zwykłych NTP. To zapewnia powstanie porównywalnych ilości fragmentów
różnej długości. Primery wymagane do zapoczątkowania działania polimerazy w każdym z
układów (lub same analogi 2',3'-dideoxy-NTP) posiadają inaczej fluoryzującą etykietę
(znacznik fluorescencyjny). Elektroforeza pod detektorami czułymi na 4 różne długości
fali pozwala identyfikować fragmenty różniące się długością o jeden nukleotyd i
zakończone na 3'-końcu określonymi zasadami (identyfikacja po długości fali emisji),
dając sekwencję nici komplementarnej, a stąd wyjściowej po uwzględnieniu primera.
Dominujacą techniką składania zsekwencjonowanych fragmentów we właściwej
kolejności jest whole-genome shotgun cloning (WGS) opracowany przez J. Craig Ventera
(Celera Genomics). Wykorzystuje się w tym celu komputery dużej mocy obliczeniowej,
które dopasowują „na zakładkę” miliony fragmentów we właściwej kolejności.
42
Oba etapy: sekwencjonowanie i składanie fragmentów można w pełni
zautomatyzować. W sekwenatorze ABI Prism3730XL (jeden z ostatnich modeli) stosuje
się do rozdziału elektroforetycznego CE (PLANSZA 14) 96 kapilar, co daje wydajność
ok. 1.6105 nukleotydów/doba. Łatwo policzyć, że sekwencjonowanie genomu ludzkiego
1.21010
n przy pomocy 100 maszyn trwa 2,5 roku. Celem praktycznym genomiki jest
opracowanie wysoce „zrównoległowionej” (massively parallel) techniki umożliwiającej
zsekwencjonowanie genomu (indywidualnego) człowieka w cenie ok. $1000 w
przeciągu ok. tygodnia; przegląd różnych platform sekwencyjnych: Mardis Nature
470, 198, 2011. Obiecująca jest technologia „high throughput” SOLEXA (Illumina Hi-
Seq 2000, poprawiona wersja SOLEXA Genome Analyser), gdzie w jednym przebiegu
sekwencjonowane jest kilkaset milionów przypadkowych, krótkich fragmentów DNA.
Krótkie (< 150n) fragmenty mocuje się do płaskiej, przepuszczającej światło powierzchni
celki przepływowej (flow cell) o gęstości ~10 mln fragmentów DNA/cm2. Fragmenty
namnaża się do ~1000 identycznych kopii każdy (bridge amplification) tak, że tworzą
klastry cząsteczek. Sekwencjonowanie polega na przyczepianiu i identyfikacji krok po
kroku pojedynczych, komplementarnych nukleotydów odwracalnie terminujących
syntezę przez polimerazę DNA. Identyfikacja jest oparta na wzbudzonej laserowo
fluorescencji etykiet o różnej długości fali emisji w przypadku każdego rodzaju
nukleotydu. Ze względu na krótkość fragmentów wydajne składanie całych sekwencji
odbywa się przez uszeregowanie względem sekwencji znanych, co zapewnia sukces przy
wyszukiwaniu różnic w stosunku do wzorca, np. identyfikacja różnic osobniczych, SNP
(single nucleotide polimorphism), ale raczej nie w sekwencjonowaniu nowego genomu.
Inne platformy sekwencyjne to: Roche 454 GS-FLX system, ABI SOLID sequencing
system, Pacific Biosciences (platforma III generacji).
Alternatywne podejścia sekwenatorów III generacji bazują na sekwencjonowaniu
POJEDYNCZEJ CZASTECZKI DNA - „minimum materiału, maksimum informacji”.
Przykładem jest praca opublikowana w 2006 r. (Greenleaf & Block Science 313, 801,
2006). Do jednego z końców DNA jest przyczepiony paciorek polistyrenowy
utrzymywany w laserowej pułapce szczypiec optycznych a drugie szczypce optyczne
trzymają paciorek polistyrenowy przyczepiony do polimerazy RNA, która na matrycy
DNA syntetyzuje nić RNA. Ruch polimerazy w trakcie transkrypcji zmienia długość
fragmentu nici DNA łączącej oba paciorki, co można rejestrować z dokładnością do kilku
Å czyli jednej pary zasad. Transkrypcje prowadzi się w 4 układach; w każdym z nich jeden
z czterech NTP jest w niskim stężeniu w stosunku do 3 pozostałych. Konieczność
43
włączenia mniejszościowego nukleotydu na zasadzie komplementarności z nukleotydem
matrycy DNA zatrzymuje na pewien czas ruch polimerazy a sekwencję nukleotydów
odczytuje się z „sekwencji zatrzymań”: pozycja włączenia vs. czas. Prawidłowość
odczytu wymaga właściwego uszeregowania względem siebie czterech zapisów na
podstawie regionów „flankujących” DNA o znanej sekwencji i znanych układach pauz
(odpowiednik primeru w metodzie Sangera). Długość sekwencjonowanego DNA jest
limitowana procesywnością polimerazy RNA czyli ok. 2000n, a dokładność ok. 95%.
(b) Globalna, funkcjonalna struktura przestrzenna DNA i RNA różni się od
siebie w znaczący sposób w wyniku odmiennych funkcji biologicznych obu rodzajów
kwasów nukleinowych. Bardzo długie cząsteczki DNA, 106bp (bakterie) ÷ 10
9bp
(chromosomy organizmów wyższych) są zintegrowane z białkami w nici
chromatynowej jako nośnik informacji genetycznej. Różne rodzaje RNA, o długości od
20n (miRNA) i 75-95n (tRNA) do ok. 5000 n (rRNA), przyjmują zróżnicowaną strukturę
globularną, raczej przypominającą białka globularne. Lokalne zwinięcie nici
polinukleotydowej i związane z tym różne formy struktury drugorzędowej są podobne w
DNA i RNA, i uwarunkowane przyjmowaniem określonych konformacji (PLANSZA
56) przez pojedyncze nukleotydy.
W omawianych łącznie strukturach drugorzędowe DNA i RNA można wyróżnić
następujące formy:
(1) helisy podwójne (dupleksy);
(2) helisy złożone z większej ilości nici, potrójne (tripleksy) i poczwórne (tetrapleksy
lub quadruplexy);
(3) pętle: typu szpilki do włosów (hairpin) i wewnętrzne w duplexach, oraz
wybrzuszenie (bulge).
Klasyczne dupleksy są złożone z dwóch przeciwnie skierowanych,
komplementarnych nici i zostały wymodelowane na podstawie obrazów dyfrakcyjnych we
włóknach. Wyróżnia się trzy główne rodziny helis podwójnych: B, A i Z (PLANSZA
61). DNA może występować w każdej z tych form drugorzędowych, natomiast RNA nie
występuje w formach z rodziny B ze względu na steryczne przeszkody między
fosforanami i 2'-OH. Każda z rodzin zawiera dodatkowe typy helis, nieco odmienne, ale o
podobnej strukturze, np. A', Z', a rodzina B: helisy C, D, E. Mogą również powstawać
helisy złożone z jednej nici DNA i jednej RNA (nie będę ich omawiał szczegółowo).
44
Niektóre z nich np. D czy E obserwuje się nie w DNA, ale w syntetycznych
polinukleotydach jak poli(dA-T), poli(dG-dC). Duplexy mieszane DNA/RNA powstają
przy transkrypcji. W każdej z tzw. klasycznych, regularnych helis wszystkie nukleotydy
składowe opisane są przez jeden zestaw wartości kątów dwuściennych czyli konformację
(PLANSZA 62; zaznaczone są nazwy konformacji w nukleotydach: grupa egzocykliczna
(), cukier przy kącie zdefiniowanym dla łańcucha () i zasada ()).
KĄTY DWUŚCIENNE
B-DNA
314 214 36 (+sc) 156 (S) 155 264 262(anti)
A-RNA
293 186 50 (+sc) 82 (N) 207 294 202(anti)
Z-DNA
dG
dC
52
250
207
192
187 (ap)
54 (+sc)
76 (N)
147 (S)
288
257
102
296
89 (syn)
201(anti)
PARAMETRY HELIKALNE
syme-
tria
Xk
skok
P (Å)
skok/
bp
h=P/X
skręt
=360/X
()
nachy-
lenie bp
()
środek
bp
D(Å)
duża
bruzda
S G (Å)
mała
bruzda
S G(Å)
B-
DNA
101
33.8
3.38
36
-6
0.5
11.7 8.5
5.7 7.5
A-
RNA
111
30.0
2.73
32.7
18
4.4
2.7 13.5
11.0 2.8
Z-
DNA
65
43.5
7.25
-60
(-45 -15)
-5
brak
3.7 8.8
Podane parametry różnią się w niewielkim stopniu w przypadku A-RNA i A-DNA oraz Z-
DNA i Z-RNA. Wartości kątów dwuściennych w pełni opisują konformację helis, ale nie
oddają wizualnie kształtu poszczególnych helis. Dlatego wprowadza się tzw. parametry
helikalne. Helisa ma symetrię śrubową oznaczaną symbolem Xk. Obrót helisy o kąt =
k360/X i jednoczesne przesunięcie wzdłuż osi o (k/X)P, gdzie P jest długością jednego
skrętu helisy (PLANSZA 63), zachowuje te same co poprzednio położenia
poszczególnych nukleotydów. Symetria nie jest pełna, gdyż taka operacja nie
przeprowadza atomów w identyczne atomy, ale całe nukleotydy w inne, niekoniecznie
identyczne nukleotydy. Helisa może być prawoskrętna jak B lub A gdy obrót zachodzi
45
zgodnie z ruchem śruby prawoskrętnej lub lewoskrętna jak Z, gdy jest przeciwny. Obrót o
300 w prawo i przesunięcie o 5/6 skoku jest równoważny obrotowi o -60 czyli w lewo i
przesunięciu o 1/6 skoku. W przypadku helis A i B każdy nukleotyd przechodzi w sąsiedni
wzdłuż nici lub para zasad (nukleotydów) komplementarnych w sąsiednią parę - każdy
nukleotyd jest równoważny. W helisie Z, którą zaobserwowano dla naprzemiennych
sekwencji poli(dG-dC) i poli(G-C), cytozyna nie jest równoważna konformacyjnie
guanozynie (PLANSZA 62) i dwunukleotydowy fragment przechodzi w
dwunukleotydowy fragment obok w sekwencji lub dwie pary zasad komplementarnych w
dwie pary zasad komplementarnych. Na jedną parę zasad przypada skręcenie kolejno o 45
i 15. Z parametrów helikalnych widać charakterystyczne cechy kształtu helis (PLANSZA
61): nachylenie par zasad do osi opisane kątem : małe dla B i Z, duże dla A, odstęp
geometrycznego środka par zasad od osi helisy D, i wielkość dwóch wcięć w walcowym
kształcie helis, dużej i małej bruzdy, o szerokości Sz i głębokości Gł. Dupleksy są
stabilizowane przez dwa rodzaje oddziaływań wewnątrzcząsteczkowych:
(1) wiązania wodorowe w parach zasad komplementarnych, trzy w parze GC i dwa w
parze AT;
(2) oddziaływania warstwowe (stacking) między sąsiednimi parami zasad
oraz
(3) oddziaływanie z rozpuszczalnikiem: odpychanie elektrostatyczne ujemnie
naładowanych nici jest ekranowane przez dodatnie kationy związane z ujemnymi
resztami fosforanowymi.
Trzy wiązania wodorowe oraz stacking są silniejsze w przypadku par GC, a więc
fragmenty helis DNA i RNA bogate w te pary są stabilniejsze niż obszary bogate w pary
AT lub AU.
Ostateczne potwierdzenie struktury helikalnej kwasów nukleinowych nastąpiło
dopiero po badaniach krystalograficznych na monokryształach (a nie włóknach) i NMR
w roztworze, krótkich, syntetycznych fragmentów self-komplementarnych. Miało to
szczególne znaczenie dla DNA, gdzie cały model przekazu informacji genetycznej: kod
genetyczny, replikacja i transkrypcja jest oparty na strukturze podwójnej helisy.
46
Wykład 8
Badania krótkich fragmentów helikalnych DNA i RNA rzędu jednego skrętu helisy
pokazały, że struktura helis najczęściej odbiega od regularnej, klasycznej i każdy
nukleotyd jest opisany przez indywidualny, nieco różny, zestaw kątów dwuściennych. W
dalszym ciągu jednak nieregularne helisy należą do ściśle określonej rodziny A, B lub Z.
Trzeba więc wprowadzić więcej parametrów helikalnych opisujących te nieregularności
(PLANSZA 64); głównie chodzi o nieregularności we wzajemnym ustawieniu zasad, co
przenosi się na nieregularności łańcucha fosfocukrowego. Parametry te mają zerowe
wartości w helisach regularnych. Podane już parametry: , h, i D dalej obowiązują,
ale mają inne wartości w każdym fragmencie helisy (PLANSZA 65). Przykład
nieregularnej helisy A-RNA w monokrysztale pokazuje (PLANSZA 66), m. in. załamania
samej osi helisy, która w helisach regularnych jest linią prostą.
Przyjęcie przez DNA i RNA określonego typu struktury helikalnej jest uwarunkowane
przez dwa czynniki:
(1) sekwencja zasad:
(2) warunki środowiska: temperatura, stężenie soli, pH, warunki krystalizacji.
W krysztale obserwuje się krótkie DNA we wszystkich trzech formach: A, B i Z. Forma Z
wymaga naprzemiennych sekwencji dG-dC. RNA występuje w krysztale w formie A a
naprzemienne sekwencje G-C w formie Z. W roztworze wodnym fragmenty DNA
występują w formie B. Dodanie etanolu wymusza formę A. Naprzemienne sekwencje dG-
dC (DNA) i G-C (RNA) przechodzą w Z przy znacznych stężeniach soli, przy czym
formie Z znacząco sprzyja metylacja cytozyny w pozycji 5. Natywne, funkcjonalne
DNA przyjmuje najprawdopodobniej wszystkie trzy typy form helikalnych - istnieją
dowody biologiczne na obecność formy Z (przeciwciała anty-Z).
Struktura helikalna jest stabilna w roztworze w określonych warunkach
środowiska. Wzrost temperatury, obniżenie stężenia soli - szczególnie w przypadku
krótkich helis, skrajne pH powodują denaturację helisy i przejście do formy
pojedynczoniciowej. Proces jest odwracalny i helisa odtwarza się przy powrocie do
warunków sprzyjających. Takie odwracalne topienie helis np. wywołane zmianami
temperatury można go śledzić (PLANSZA 67) np.:
(a) spektrofotometrycznie w maksimum absorpcji UV 260 nm: absorpcja helisy jest
mniejsza niż dwu pojedynczych nici - hypochromazja;
47
(b) kalorymetrycznie (DSC – differential scanning calorimetry; różnicowa kalorymetria
skaningowa): zmiana pojemności cieplnej układu.
Topienie i powstawanie helisy zachodzi w wąskim przedziale temperatur i ma charakter
kooperatywny: przy tworzeniu helisy już utworzona struktura sprzyja łączeniu się
następnych par zasad i proces przypomina zamykanie zamka błyskawicznego; stała
równowagi K = sN, gdzie N- ilość nukleotydów w łańcuchu, - parametr nukleacji ~10
4,
s - parametr propagacji helisy ~10 dla T << Tm. W temperaturze Tm, tzw. temperaturze
topnienia helisy, współistnieje 50% formy helikalnej i 50% pojedynczo-niciowej. Im
wyższa wartość temperatury topnienia tym stabilniejsza helisa. Wzrost Tm następuje przy:
(a) wzroście długości helisy;
(b) wzroście stężenia soli w roztworze - lepsze ekranowanie ujemnych ładunków
fosforanów;
(c) wzroście zawartości par zasad GC - liniowa zleżność Tm od % par GC.
"Spłaszczanie" profilu topienia i jego "pofałdowanie" świadczy o zmniejszeniu
kooperatywności przejścia helisa - pojedyncze nici. Topienie i odtwarzanie helisy może
wtedy następować niezależnie w różnych fragmentach i charakteryzować się nie jedną ale
kilkoma wartościami Tm. Zmiany warunków środowiska mogą prowadzić również do
przekształcenia jednej formy helikalnej w inną, np. do przejść AB czy BZ.
Przykładowo, przy dużej zawartości naprzemiennych sekwencji dGdC znaczne stężenie
soli (chlorek litu) wymusza przejście od B-DNA do Z-DNA (PLANSZA 68) lub od A-
RNA do Z-RNA. Zanik formy B i pojawianie się formy Z widać na widmach 31
P NMR:
zanik pojedynczego sygnału od równoważnych fosforów formy B i powstawanie dwóch
sygnałów od nierównoważnych fosforów formy Z wskutek "załamania" łańcucha
fosfocuktrowego i nierównoważność chemicznego otoczenia fosforów: dGpdC i dCpdG.
W końcu lat 90-tych XX w. pojawiły się prace dotyczące kilku nowych, ciekawych
struktur helis podwójnych. M-DNA jest kompleksem DNA z dwuwartościowymi jonami
metali Zn+2
, Co+2
lub Ni+2
(PLANSZA 69). W warunkach lekko alkalicznych (pH > 8)
(badania NMR) protony iminowe NH wiązań wodorowych par komplementarnych
wymieniają się na jony metali, co wprawdzie w niewielkim stopniu modyfikuje strukturę
typu B-DNA ale nadaje helisie własności przewodzącego drutu molekularnego.
Praca Allemand et al. w PNAS (PLANSZA 70) relacjonuje uzyskanie nowej
struktury w 17 kDa plazmidowym B-DNA o dodatniej superskrętności (bufor fosforanowy
pH 8). W wyniku zastosowania szczypiec magnetycznych, ciagnięcie ze skręceniem z siłą
48
3 pN magnesem za paciorek magnetyczny przyczepiony do jednego końca helisy łączem
streptavidynabiotyna; drugi koniec unieruchomiony na płaskiej powierzchni szklanej
łączem digoxygenin (DIG)przeciwciało (antyDIG), daje tzw. strukturę P-DNA. Struktura
ta, dłuższa o 75%, z łańcuchami fosfocukrowymi splecionymi w środku, zasadami na
zewnątrz, 2.62 nukleotydu na skret helisy, była postulowana przez Corey’a i Paulinga w
1953 r. jako konkurencyjny model w stosunku do Watsona & Cricka. Pojawiły się
doniesienia o możliwości tworzenia tego typu struktury in vivo w fagu Pf1.
xDNA (PLANSZA 71), nazwa wzięta z nomenklatury oznaczeń rozmiarów
garderoby (X large) jest eleganckim przykładem modelowania molekularnego. Rozmiary
zasad azotowych zwiększono przez wprowadzenie dodatkowych skondensowanych
pierścieni benzenu TxT i dAdxA, bez naruszenia układu potencjalnych wiązań
wodorowych. Pojedyncze dupleksy z udziałem powiększonych zasad: xT:dA i T:dxA
destabilizują wprawdzie helisę, ale DNA zbudowane z naprzemiennych sekwencji tego
typu par lub helisy z jedną nicią xT a druga dA jest stabilniejsze niż analogiczne,
zwykłe DNA, ze względu na wzrost stackingu.
Podobnie jak w przypadku struktur duplexów zmiany warunków środowiska przy
odpowiedniej sekwencji nukleotydów oraz oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe mogą
prowadzić do przejścia cząsteczki kwasu nukleinowego w różne od helisy podwójnej
struktury drugorzędowe. W helisach podwójnych, złożonych z jednej nici
homopurynowej i jednej homopirymidynowej, poli(dA)poli(T), poli(A)poli(U),
poli(dA)poli(U), poli(A)poli(T), oraz w podobnych z udziałem G i C: poli(dG)poli(dC)
itd., w obecności jonów magnezu Mg+2
następuje rozseparowanie nici jednej z helis i
powstanie helisy potrójnej czyli tryplexu i jednej nici pojedynczej:
2poli(dA)poli(T) = poli(T)poli(dA)poli(T) + poli(dA)
2poli(dG)poli(dC) = poli(dG)poli(dG)poli(dC) + poli(dC)
lub w obniżonym pH (5-6):
2poli(dG)poli(dC) = poli(dC+)poli(dG)poli(dC) + poli(dG)
poli(dA)poli(T) + poli(dG)poli(dC) = poli(dA+)poli(dG)poli(dC) + poli(T)
i podobnie dla nici RNA i nici mieszanych DNA/RNA. Trzecia nić wiąże się w dużej
bruździe helisy podwójnej i wiąże z jedną z nici duplexu poprzez parowanie typu
Hoogsteena (PLANSZA 72). Długości dwóch wiązań wiązań wodorowych Hoogsteena są
takie jak W.C., 2.8 2.9 Å a kąty D-H...A nie odbiegają więcej niż 20 od liniowości;
49
podobne energie stabilizacji w obu typach parowania. PLANSZA obrazuje tryplex DNA
zbudowany z pojedynczej nici DNA o odpowiednio dobranej sekwencji. Tryplex jest
biologicznie ważną strukturą przejściową w procesie rekombinacji DNA (general
recombination; crossing over; mejoza) (PLANSZA 73), który prowadzi do wymiany
części nici w dwóch homologicznych podwójnych helisach DNA.
Homopirymidynowe nici oligo(dC) w obniżonym pH ok. 4.5 mogą tworzyć
ciekawą strukturę tetrapleksu, tzw. I-motif DNA (PLANSZA 74), złożoną z dwóch
równoległych dupleksów (a nie antyrównoległych jak w zwykłych duplexach).
Równoległe duplexy są stabilizowane przez 3 wiązania wodorowe dC+:dC i ustawione
antyrównolegle do siebie z naprzemiennym stackingiem par cytozynowych, tzn. para od
jednego duplexu interkaluje między dwie pary drugiego. Cała helisa jest prawoskrętna, jej
wszystkie cztery nici są konformacyjnie równoważne i należą do rodziny B-DNA. Motyw
występuje w wielu przypadkach DNA zawierających trakty oligoC/oligoG (nici bogate w
cytozyny) w Tetrahymena thermophilia, telomerach chromosomów ssaczych (3’-
"zwisające", niezwiązane komplementarnie końce chromosomów eukaryotycznych),
sekwencjach centromerycznych i promotorach onkogenów związanych ze wzrostem i
proliferacja komórek.
Inną strukturę tetrapleksową (G-quadruplex) mogą wykazywać fragmenty DNA
bogate w guanozyny, komplementarne do fragmentów bogatych w cytozyny, zawierające
sekwencje tandem repeat d(AlubT)(14)dG(18), np. w telomerach. Badania NMR w
roztworze pokazały przechodzenie w obecności jonów K+ dupleksów
d(G3T4G3)/d(C3A4C3) (PLANSZA 75) w dwuniciowe tetrapleksy d(G3T4G3)2 i dwie nici
pojedyncze d(C3A4C3). Stabilizacja 4xdG zachodzi poprzez parowanie Hoogseen'a.
DNA i RNA mają potencjalna możliwość tworzenia helis równoległych
stabilizowanych przez wiązania wodorowe par A:T typu odwrócona para W.C. (reverse
W.C.; do samodzielnego narysowania). Postuluje się, że psDNA (parallel stranded DNA)
może mieć istotne znaczenie w regulacji replikacji, transkrypcji, splicingu itd. Helisę
równoległą zaobserwowano we fragmencie 12-merowym:
5’-d(CCATAATTTACC-3’
5’-d(CCTATTAAATCC-3’
o pełnej komplementarności środkowego oktameru w ustawieniu równoległym i braku
komplementarności w ustawieniu antyrównoległym (Parvathy et al. Nucleic Acids Res.
30, 1500, 2002). Helisa jest dodatkowo spinana przez pary C+:C na końcach.
50
W przypadkach osłabienia stabilizacji struktury helikalnej:
(1) brak komplementarności na dwóch niciach podwójnej helisy;
(2) struktura helikalna oligo(T)/oligo(dA), np. w warunkach niższego stężenia soli,
mogą tworzyć się różnego rodzaju pętle. Dobrze scharakteryzowane strukturalnie są tzw.
wybrzuszenia (bulges) (PLANSZA 76), przykładowo dla extra dA5 lub dAATAA
obserwuje się ostre załamania (kink), których pozycja zależy od sekwencji warunkującej
stacking w wybrzuszeniu i na styku wybrzuszenie-helisa. Struktura wybrzuszenia DNA
jest potencjalnym miejscem wiążącym środki farmaceutyczne oraz białko p53 (tumor
supression protein). W RNA wybrzuszenia są ważnym elementem strukturalnym w
procesie self-splicingu i zwijania RNA (tertiary folding)
Kolejną strukturą drugorzędową jest pętla hairpin (PLANSZA 77), występująca
w RNA i w krzyżowych formach DNA. Szpilka do włosów jest zbudowana z helikalnego
trzonu i jednoniciowej pętelki, w której zasady pozostają zestackingowane. Najbardziej
stabilne są pętle DNA złożone z 4 do 5 nukleotydów i pętle RNA z 6 do 7 nukleotydów,
co wynika z budowy pętli (PLANSZA 78). Jeżeli w helisie B-DNA urwiemy jedną nić z
zachowaniem końcowej grupy fosforanowej a drugą kontynuujemy w kierunku 3', to
minimum odległości między fosforanami wystąpi dla trzeciego z kolei dobudowywanego
nukleotydu. Tę lukę ok. 12 Å można zamknąć jednym lub dwoma nukleotydami o
charakterze "ostrego zwrotu". W helisie A-RNA, tu hairpin antykodonu tRNAPhe
,
minimum odległości PP ok. 13 Å następuje przy rozbudowie nici w kierunku 5' dla
piątego nukleotydu. Lukę znów można zamknąć jednym lub dwoma nukleotydami. Pętle
mogą być dodatkowo stabilizowane wiązaniami wodorowymi, np. w hairpin antykodonu
między U33N(1)H i tlenem grupy fosforanowej A35p(+2)A36 (PLANSZA 77).
Omówione zasady konstrukcji nie wykluczają innych struktur typu pętli:
czteropętla (tetraloop) sekwencji 5’-GNRA (N - dowolny nukleotyd, R = G lub A) w
intronach grupy I, rRNA, retrowirusach, oraz trzypętle UNR.
Struktury trzeciorzędowe czyli organizacja przestrzenna struktur
drugorzędowych - ogólny fold cząsteczki różnią się zasadniczo w kwasach DNA i w
kwasach RNA. Funkcjonalne DNA tworzy, z wyjątkami takimi jak niektóre wirusy DNA,
strukturę trzeciorzędową chromosomu w powiązaniu z białkami (PLANSZA 79).
Następuje silne zwinięcie helikalnego DNA w następujących po sobie etapach:
nukleosomy (PLANSZA 80) w formie "paciorków na nici", 30 nm nić chromatynowa,
51
itd., aż do upakowania w sięgającego od 103 do 10
5 razy w jądrze eukaryotów o
wymiarach ok. 2 m (długość nici DNA/średnica bakterii lub jądra komórkowego).
Zdolność do takiego upakowania wynika z giętkości długich podwójnych helis DNA,
które bada się również w zrelaksowanym, pozbawionym białek DNA np. plazmidów. Ta
zdolność, i elementy struktury trzeciorzędowej DNA, które ją warunkują spełniają ważną
biologiczną rolę przez umożliwienie kontaktu fragmentów DNA odległych w
strukturze pierwszorzędowej. Przykładem takiej lokalnej struktury, która wykracza poza
prostą strukturę drugorzędową jest forma krzyżowa DNA, obserwowana pod
mikroskopem AFM (PLANSZA 81). Forma ta może powstać w sekwencjach tzw.
odwróconego powtórzenia (inverted repeat) przedzielonych fragmentem bogatym w
mniej stabilne pary A:T. Tworzą się wtedy dwie, skierowane do siebie trzonami szpilki do
włosów. Inną ważną cechą struktur trzeciorzędowych DNA, także funkcjonującego w
chromosomie, jest superskrętność (PLANSZA 82). Przejawia się w DNA kolistym jak w
plazmidach lub DNA, którego fragment jest unieruchomiony na bliskopołożonych
końcach jak w nukleosomie (PLANSZA 80). DNA nie może wtedy zmieniać
topologicznej liczby skrętów L czyli tego ile razy jedna nić jest opleciona wokół drugiej.
Jeżeli L jest mniejsze niż ilość skrętów T narzucanych przez typ helisy (ok. 10
nukleotydów na jeden skok helisy w B-DNA) pojawiają się ujemne superskręty w liczbie
W, tak aby:
L = T + W
Odwijanie helisy (bez rozcinania) w jednym miejscu powoduje jej "super" zapętlanie w
drugim. DNA w nukleosomach jest superskrętne w stopniu = (L Lo)/Lo ~W/Lo od -
0.03 do -0.09, gdzie Lo jest topologiczną liczbą skrętów w zrelaksowanym DNA.
Enzymami regulującymi topologiczną ilość skrętów są topoisomerazy, które przejściowo
rozcinają jedną (typ I) lub dwie (typ II) nici i zwijają lub odwijają je przy udziale ATP.
Struktura trzeciorzędowa cząsteczek RNA jest bardzo bogata i przypomina
struktury przestrzenne białek globularnych. W niewielkich, 75 do 90n cząsteczkach tRNA
(PLANSZA 83), elementy struktury drugorzędowej (głównie szpilki do włosów) tworzą
charakterystyczny motyw liścia koniczyny, i przez wewnątrzcząsteczkowe oddziaływania
tworzą strukturę trzeciorzędową, przypominającą literę L. Dwa A-helikalne trzony, T i
aminokwasowy tworzą jedną pseudociągłą helisę czyli złącze helis, a dwa pozostałe: D i
52
antykodonowy drugą, w sumie dwa ramiona L na giętkim zawiasie. Dwa podstawowe
typy oddziaływań stabilizują strukturę trzeciorzędową:
(1) interkalacyjny stacking, w którym zasada z jednego fragmentu nici wchodzi
pomiędzy dwie stackingujące zasady drugiego fragmentu np. C13 miedzy U8/A9,
zwykle na styku trzech nici, tu ściąganej przez wiązanie wodorowe W.C. i H.
m7G46:G22:C13 (ozn. h na PLANSZY); w sumie w układ połączenia (zawiasu)
zaangażowanych 10 nukleotydów;
(2) nietypowe wiązania wodorowe: wobble (a), Hoogsteen (b), puryna-puryna (d),
trójki zasad (f, g, h), zwykle z udziałem nukleotydów modyfikowanych, których jest ok.
10%, np. pseudourydyna , 7-metyloG.
Powszechnie spotykanym w RNA elementem trzeciorzędowym jest pseudowęzeł
(pseudoknot) (PLANSZA 84) W rozpowszechnionej wersji H (od: hairpin) następuje
parowanie W.C. nukleotydów w pętli hairpin z jednoniciowym fragmentem, co prowadzi
do struktury zbudowanej z dwóch obszarów helikalnych i trzech pętli. W niektórych
wersjach tego pseudowęzła jedna z pętli może być zredukowana do zera. Pseudowęzły
zapewniają ściągnięcie odległych fragmentów jednoniciowego RNA w zwartą strukturę
przestrzenną, np. w 5S RNA rybosomów. Spełniają różne funkcje:
-regulacja ekspresji genu na poziomie translacji wirusów, np. ribosomal frameshifting
onkogennego wirusa sutka myszy (mouse mammary tumor virus); dwa białka z jednego
RNA w określonym stosunku ilościowym przez przesunięcie ramki odczytu;
- regulacja procesu translacji: pseudowęzły na 5’UTR w regionie IRES (internal
ribosome entry side) mRNA do rekrutacji rybosomu w kap-niezależnej translacji;
- mimikra tRNA (TLS) ramienia akceptorowego 3’-końca genomu wirusów roślinnych
dla zapewnienia reaktywności katalizowanej przez enzym rozpoznający tRNA.
Przegląd innych typów pseudowęzłów: B, I, H-H kissing loops, podwójny (nested)
podaje praca Bierley et al. Nature Rev. 5, 598, 2007).
Motyw A-minor (PLANSZA 85). jest powszechnie występującym elementem
upakowania dużych cząsteczek RNA, w którym helikalne fragmenty wiążą się przez
oddziaływanie niesparowanej adeniny jednego elementu drugorzędowego z
komplementarną parą G:C drugiego elementu drugorzędowego od strony małej bruzdy.
Klasyfikacja: typ I lub typ II oparta jest na położeniu 2’OH adenozyny względem grup
2’OH cukrów pary G:C. Stabilizacja motywu zachodzi poprzez wiązania wodorowe
między grupą N2H2 guaniny par G:C i N3 lub N1 adeniny, oraz przez wiązania wodorowe
z udziałem grup 2’-hydroksylowych cukrów.
53
Zamek rybozowy (PLANSZA 86) między helisami stabilizowany jest przez
wiązania wodorowe grup 2’OH obu helis oraz między hydroksylami 2’ a N3 (puryny) i
C2=O (pirymidyny).
Motyw Z-kotwicy (Z-anchor; PLANSZA 87) w spliceosomie wiążący helisy IC i
I(ii) w ustawieniu „side-by-side” w formie „architektonicznej” przypominającej P-DNA
(PLANSZA 70).
Wymienione MOTYWY STRUKTURALNE plus ODDZIAŁYWANIA między nimi:
interkalacyjny stacking, nietypowe parowanie zasad, wiązania wodorowe z udziałem
grup hydroksylowych 2’OH, zapewniają zwinięcie RNA w funkcjonalne struktury
natywne, działające w kompleksach takich jak np. rybosom (PLANSZA 88).
(c) Duże cząsteczki kwasów nukleinowych podlegają stałym,
niekontrolowanym zmianom i modyfikacjom jako złożone układy termodynamiczne.
Jest to szczególnie istotne w przypadku olbrzymich i "nieodnawialnych" (w
przeciwieństwie do RNA) cząsteczek DNA, które powinny być możliwie trwałe w czasie
ze względu na niesioną informację genetyczną. Systemy naprawcze obniżają częstości
mutacji z 10-4
w systemach replikacyjnych in vitro do 10-8
do 10-11
w żywych komórkach,
od bakterii do eukaryotów. Latentne DNA w komórce podlega procesom (PLANSZA 89):
(a) spontanicznym, np. dezaminacja cytozyny do uracylu, który paruje z A zamiast z
G, depurynacja (odłączenie zasady purynowej);
(b) indukowanym przez czynniki chemiczne kancero- i mutagenne, które reagują z
zasadami (czynniki alkilujące, metoksyamina) i modyfikują je do form o innym typie
parowania (tautomeria) lub zaburzają strukturę helisy przez interkalację jak związki
wielopierścieniowe (piren)
(c) indukowanym przez czynniki fizyczne: promieniowanie jonizujące,
promieniowanie ultrafioletowe prowadzące do reakcji fotochemicznych zasad w
elektronowym stanie wzbudzonym (PLANSZA 16), np. dimeryzacja tymin lub oksydacja
zasad purynowych do pochodnych 8-oxo (pod działaniem rodników tlenowych).
Zaburzenia chemiczne i strukturalne, które mogą być przyczyną mutacji są
ustawicznie usuwane przez systemy naprawy DNA. W szczególności rozpoznawane są
błędne pary zasad po replikacji i usuwana jest zasada niekomplementarna w nowej nici a
zachowana "właściwa" na nici starej. Można wyróżnić szereg typów procesów usuwania
54
błędów w DNA, nakierowanych specyficznie na określone rodzaje uszkodzeń. U ich
podstaw leżą dwa zasadnicze mechanizmy:
(A) bezpośrednie przywrócenie nieuszkodzonego DNA (direct reversal);
(B) naprawa przez wycięcie (excision pathway).
Pierwszy system naprawy funkcjonuje przy usuwaniu niektórych modyfikacji
chemicznych i fotodimeryzacji pirymidyn (PLANSZA 90). Enzym fotoreaktywujący
rozpoznaje uszkodzenie nici DNA i przy pomocy absorbowanego światła z zakresu
widzialnego (a nie UV jak przy uszkodzeniu) katalizuje reakcję fotochemiczną
rozcinania dimeru do dwóch niepołączonych zasad. Drugi system naprawczy jest
kompleksem enzymatycznym. Uszkodzenie na nici (błędną parę czy fotodimer) jest
specyficznie rozpoznawane przez odpowiednią endonukleazę, która wycina uszkodzoną
zasadę lub cały fragment nici, która ją zawiera. Polimeraza DNA syntetyzuje brakujący
kawałek na matrycy drugiej, nieuszkodzonej nici, a ligaza zszywa nowopowstały fragment
na końcu z pozostałym fragmentem nici.
55
Wykład 9
4. Budowa białek
(a) Po zsekwencjonowaniu genomu ludzkiego i ponad 100 innych organizmów
naczelnym zadaniem biologii molekularnej stało się ustalenie funkcjonalnych struktur
wszystkich białek kodowanych przez genomy, których liczbę szacuje się na kilkaset
tysięcy, ok. 300 tys. w samym genomie ludzkim, kodowanych przez ok. 30 tys. genów.
Proteomika strukturalna stara się do tego problemu podejść w sposób kompleksowy,
przez wysoce wydajne (high throughput) ustalanie struktur całych klas białek
współdziałających w ramach określonych odcinków szlaków metabolicznych tak, aby
można było konstruować molekularne mechanizmy współdziałania całych kompleksów
białkowych. Wymaga to szerokiego wsparcia BIOINFORMATYKI („ontologia”
proteomiki). Celem praktycznym badań strukturalnych i dynamicznych jest wybór
właściwych "tarcz" czyli receptorów, głównie bialkowych dla różnego typu inhibitorów
czy aktywatorów jako środków leczniczych: antywirusowych, antynowotworowych,
cytostatycznych lub sprzyjących proliferacji określonych typów komórek. Zespoły
naukowe krystalografów i spektroskopistów NMR powołane do realizacji badań
strukturalnych w ramach tzw. Large Scale Facilities (w USA finansowanych przez NIH, w
EU finansowane w ramach Programów Ramowych) ściśle współpracują z firmami
farmaceutycznymi.
Białka są biopolimerami liniowymi, zbudowanymi z zasadniczo 20 typów
aminokwasów włączanych w procesie translacji mRNA, a w niektórych archea i
eubacteria z 22 typów aminokwasów, tzw. -aminokwasów (PLANSZA 91). Każdy
aminokwas ma przy węglu dwie grupy funkcyjne: aminową NH2 i karboksylową
COOH, a poszczególne aminokwasy różnią się typem reszty bocznej R (C i następne
atomy). Każdy aminokwas ma co najmniej dwie wartości pK, odpowiadające protonacji do
NH3+ i dysocjacji do COO
-. W pH zbliżonym do obojętnego dominują więc formy jonów
obojnaczych a wartość pH w której wszystkie cząsteczki są obojętne nosi nazwę punktu
izoelektrycznego pHi. Wylicza się ten punkt jako średnia z wartości dwóch pierwszych
pK: 1/2(pK1 + pK2), z wyjątkiem aminokwasów zasadowych z dodatkową grupą zasadową
w R: lizyny, argininy i histydyny, gdzie pHi = 1/2(pK2 + pK3). Aminokwasy w biochemii
oznacza się standardowymi trzyliterowymi skrótami (PLANSZA 92), a na potrzeby
komputerowych baz danych sekwencji białkowych skrótami jednoliterowymi. W
56
momencie utworzenia przez aminokwasy łańcucha peptydowego o ich własnościach w
białku decydują reszty boczne:
(a) aminokwasy alifatyczne, hydrofobowe, których łańcuchy boczne preferują
kontakty między sobą lub ze środowiskiem niepolarnym a unikają wody: glicyna, alanina,
walina, leucyna, izoleucyna i prolina; prolina jest iminokwasem z drugorzędową grupą
aminową po połączeniu między C reszty bocznej i azotu aminowego; spotyka się w
białkach także pochodną, -hydroksyprolinę (modyfikacja post-translacyjna, patrz dalej);
(b) aminokwasy zasadowe: lizyna, arginina i histydyna, w dwóch pierwszych reszty
boczne w białkach są zwykle naładowane dodatnio, w histydynie pK jest bliskie pH
fizjologicznego i może mieć ładunek dodatni lub nie, zależnie od otoczenia białkowego;
(c) aminokwasy kwaśne, ujemnie naładowane z grupą karboksylową w reszcie
bocznej: kwas asparaginowy i kwas glutaminowy;
(d) aminokwasy amidowe, silnie hydrofilowe ale niezjonizowane, preferujące
środowisko wodne: asparagina i glutamina; ich grupy boczne CONH2 są jednocześnie
donorami i akceptorami protonów w wiązaniach wodorowych;
(e) aminokwasy zawierające siarkę, słabo hydrofobowe; cysteina i metionina, oraz
zwierające hydroksyl, słabo hydrofilowe: seryna i treonina; grupa SH cysteiny jest bardzo
reaktywna i połączenie (utlenienie) dwóch grup cysteinowych daje mostek
dwusiarczkowy SS, wiązanie kowalencyjne, które stabilizuje struktury białkowe
(aminokwas taki nazywa się cystyną);
(f) aminokwasy zawierające pierścienie aromatyczne: fenyloalanina, tyrozyna i
tryptofan; dwie ważne ich cechy to:
(1) absorpcja (A) i fluorescencja (F) w zakresie ultrafioletu (PLANSZA 93, która
powoduje, że białka absorbują promieniowanie UV z maksimum ok. 280 nm (kwasy
nukleinowe 260 nm) i, w przeciwieństwie do kwasów nukleinowych, emitują
promieniowanie ze znaczną wydajnością;
(2) wchodzenie w oddziaływania warstwowe (stacking) między sobą i z innymi
pierścieniami aromatycznymi, lub w tzw. oddziaływania kation z grupami dodatnio
naładowanymi.
„Dodatkowe” aminokwasy, 21 i 22, to pyrolizyna (ozn. Pyl, O) z podstawnikiem
pyrolowym zamiast protonu na grupie aminowej reszty bocznej lizyny i selenocysteina
(Sec, U), z atomem Se w miejscu siarki (PLANSZA 94; Atkins & Gesteland Science 296,
1409, 2002)
57
Węgiel C wszystkich aminokwasów z wyjątkiem glicyny jest asymetryczny i
aminokwasy mogą występować w jednej z form izomerycznych L lub D (PLANSZA 91).
Wszystkie aminokwasy włączane do łańcucha białkowego w procesie translacji są typu L:
po ustawieniu trzech węgli C-karbonylowy, C i C w płaszczyźnie grupa aminowa jest
skierowana "do przodu" a proton "do tyłu". Można to również przedstawić w określonej
konwencji na płaskim rysunku. Jeśli w aminokwasach występują dodatkowe izomerie
optyczne ze względu na inne węgle podstawione czterema różnymi podstawnikami to
tylko jeden typ izomeru jest wbudowywany do białka.
W łańcuchach bocznych aminokwasów mogą zachodzić obroty wokół wiązań
pojedynczych, które prowadzą do różnych konformacji reszt bocznych: przykładowe
konformacje wokół wiązania CC pokazuje (PLANSZA 95). W swobodnych
aminokwasach w roztworze występuje równowaga dynamiczna czyli szybka wymiana
między klasycznymi konformerami, a odpowiednie wartości populacji można wyznaczyć z
wartości stałych sprzężenia NMR. Konformację pierścienia proliny można opisać
analogicznie jak konformację pierścienia cukrowego zamieniając tylko tlen O(4') na azot.
W roztworze obserwuje się równowagę dynamiczną dwóch konformacji N (bliska Cendo)
i S (bliska Cexo) o populacjach po ok. 50%. Jedynym problemem tautomerycznym w
jest migracja protonu N(1)HN(3)H w (płaskim) pierścieniu histydyny nieuprotonowanej
PLANSZA 92). W formie zwitterjonowej stosunek populacji obu tautomerów jest 1 : 3.
Aminokwasy są włączane w łańcuch peptydowy w procesie translacji mRNA
(PLANSZA 96) zgodnie z informacją zapisaną w „trzyliterowym” (trójka zasad – jeden
aminokwas) kodzie genetycznym (PLANSZA 97). Pyrolizyna jest kodowana przez kodon
UAG, a selocysteina przez UGA (PLANSZA 94), które są kodonami „stopu” translacji i
ulegają „przeprogramowaniu” w przypadkach kodowania aminokwasów. Utworzenie
wiązania peptydowego (PLANSZA 98) między grupą karboksylową pierwszego i grupą
aminową następnego prowadzi do elongacji łańcucha (PLANSZA 99) liniowego polimeru
o określonej kolejności czyli sekwencji aminokwasów w kierunku od aminokwasu z
wolną grupą aminową (N-koniec) do aminokwasu z wolną grupą karboksylową (C-
koniec). Określenie kolejności aminokwasów od N- do C-końca dokonuje się metodami
sekwencjonowania:
(1) enzymatyczne (lub chemiczne) pocięcie łańcucha peptydowego na krótkie
fragmenty;
58
(2) określenie sekwencji aminokwasów w poszczególnych fragmentach metodą
spektrometrii masowej (lub rzadko obecnie stosowana metodą chemicznej degradacji
Edmana);
(3) złożenie zsekwencjonowanych fragmentów peptydowych we właściwej kolejności.
Wykorzystanie spektrometrii masowej (PLANSZA 15) dało możliwość
sekwencjonowania całych białek i kompleksów wielu białek w bardzo efektywny sposób,
co jest nieodzownym warunkiem pracy w zakresie proteomiki. Przykładowo, w jednej z
pionierskich prac tego typu grupa M. Mann'a z EMBL (European Molecular Biology
Laboratory) scharakteryzowała 19 nowych białek kompleksu spliceosom'u komórek HeLa
(Neubauer et al. Nature Genetics 20, 46, 1998). Białka poddaje się:
(a) elektroforezie na żelu
(b) trawieniu peptydazami na żelu
(c) ekstrakcji i skierowaniu mieszaniny peptydów do spektrometru masowego w
systemie tandemu MS/MS (PLANSZA 100).
Pierwszy spektrometr masowy jest wykorzystywany jako filtr masowy do selekcji
kolejnych peptydów, najczęściej obdarzonych ładunkiem +2. Peptyd przepuszczany do
komory kolizyjnej ulega kontrolowanej fragmentacji przy zderzaniu z cząsteczkami
gazu (CID). W jej wyniku powstają fragmenty (Yn) różniące się kolejno o jeden
aminokwas w wyniku pękania głównie wiązań peptydowych z jednakowym, najczęściej
pojedynczym ładunkiem dodatnim. W drugim spektrometrze następuje rozdział i powstaje
widmo fragmentów, a z różnicy mas identyfikuje się kolejne aminokwasy łańcucha, z
wyjątkiem pary leucyna/izoleucyna. Peptydy o znanych sekwencjach składa się następnie
w całe białko na podstawie bazy danych sekwencji nukleotydowych genomu EST
(expressed sequence tags) przy pomocy programów komputerowych, np. PeptideSearch.
Ilość aminokwasów w białku może być bardzo różna. W komórce funkcjonują już
krótkie peptydy o długości kilku aminokwasów. Białka z rodziny CMTI (cucurbita
maxima trypsin inhibitor) mają długość ok. 30 AA, średnia długości białek globularnych to
300 400 AA, ale spotykane są bardzo długie białka długości kilku tysięcy aminokwasów
np. kolagen (MW ok. 300 000 Da). Białka pełnią w komórce bardzo różne funkcje:
(a) materiał budulcowy struktur komórkowych;
(b) enzymy, katalizatory reakcji biochemicznych;
(c) przeciwciała, funkcje odpornościowe organizmu;
(d) transport aktywny przez błony cząsteczek organicznych i jonów;
59
(e) energetyka, udział w procesach oddychania i fotosyntezy;
(f) praca mechaniczna kosztem energii chemicznej;
(g) regulacja działania genów, enzymów i procesów hormonalnych.
Ze względu na olbrzymią liczbę różnych rodzajów białek nie można podać prostej ich
klasyfikacji w oparciu o strukturę czy funkcje. Najwcześniejsza klasyfikacja dzieliła
białka na globularne, rozpuszczalne w wodzie i strukturalne (włókniste, fibrylarne),
nierozpuszczalne w wodzie i odporne na czynniki denaturujące oraz proteazy. Ze względu
na strukturę chemiczną można podzielić białka na proste, które zawierają tylko
aminokwasy oraz złożone, w których obok aminokwasów występują dodatkowe składniki.
Do pierwszej grupy należą m. in. albuminy, globuliny, histony skleroproteidy (kolagen,
elastyna). Wśród białek złożonych można wyróżnić nukleoproteidy (zawierające
fragmenty kwasów nukleinowych), glikoproteidy (zawierające oligosacharydy),
lipoproteidy (zawierające tłuszcze), fosfoproteidy (ufosforylowane), chromoproteidy
(hemoglobina, cytochrom) itd. Ze względu na cechy strukturalne białka można podzielić
trzy klasy, które zostana kolejno omówione:
(1) białka globularne
(2) białka strukturalne
(3) białka błonowe
Konformacja łańcucha peptydowego jest uwarunkowana charakterystycznymi
cechami wiązania peptydowego C N (PLANSZA 98). Ma ono częściowo podwójny
charakter co widać z jego długości 1.33 Å, pomiędzy 1.45 Å dla typowo pojedynczego i
1.25 Å dla typowo podwójnego. Często strukturę chemiczną fragmentu przedstawia się w
postaci równowagi dwóch form mezomerycznych o różnym rozkładzie ładunków i wiązań.
Układ złożony z dwóch atomów wiązania i czterech atomów podstawników jest plaski
(PLANSZA 99). Konformację wokół wiązania peptydowego opisuje kąt , który może
przyjąć wartość bliską 180, najczęstsze. transoidalne ustawienie węgli C, lub wartość
bliską 0 z cisoidalnym ustawieniem obu węgli. Struktura każdego z układów jest sztywna
a przejście konformacyjne między nimi poprzez rotację jest zahamowane - barierę
szacuje się na 60 120 kJ/mol. Forma trans jest energetycznie uprzywilejowana ok. 8.5
kJ/mol ze względu na niekorzystne sterycznie oddziaływania w formie cis C danego
aminokwasu i łańcucha bocznego aminokwasu poprzedzającego w sekwencji. W
przypadku wiązania peptydowego poprzedzającego prolinę takie sterycznie niekorzystne
60
oddziaływanie występuje w obu formach (PLANSZA 101) i ich energia jest zbliżona:
niektóre wiązania peptydowe przed proliną mogą mieć = 0.
Konformację łańcucha peptydowego opisują wartości dwóch kątów dwuściennych dla
każdego i-tego aminokwasu w sekwencji (PLANSZA 102):
(1) kąt między węglami karbonylowymi C' we fragmencie C'i Ci Ni C'i-1,
gdzie wartości dodatnie są przy obrocie zgodnym z ruchem wskazówek zegara patrząc
wzdłuż C i N i czyli przeciwnie do kierunku łańcucha;
(2) kąt między azotami amidowymi we fragmencie Ni Ci C'i Ni+1, gdzie
wartości dodatnie są przy obrocie zgodnym z ruchem wskazówek zegara patrząc wzdłuż
Ci C'i czyli zgodnie z kierunkiem łańcucha.
Dopuszczalne wartości kątów i wynikają głównie z odziaływań atomów wokół tych
wiązań i reszt bocznych aminokwasów (zakresy silnie redukują się w porównaniu z
zakresami dostępnymi dla pojedynczych aminokwasów lub bardzo krótkich peptydów).
Można to obrazować na tzw. wykresach Ramachandrana (PLANSZA 103), które
prezentują mapy dozwolonych obszarów w funkcji kątów i : zaznaczone zakresy
kątowe dla struktur drugorzędowych (lub energie na trzeciej osi). Wartości energii
rzędu RT (2,5 kJ/mol w temperaturze pokojowej) wyznaczają obszary energetycznie
dostępne dla łańcucha i wynikające głównie z oddziaływań „1 4” (poprzez 3
aminokwasy). Z map Ramachandra wynika, że łańcuch przyjmuje zasadniczo dwa typy
konformacji: helikalną, zwiniętą prawoskrętnie z kątami i ok. 60, i zbliżoną do
rozciągniętej z kątami i do 180 w strukturze -kartki: ok. 120 ÷ 140 i
ok. +110 ÷ +120.
61
Wykład 10
Helisy zwinięte lewoskrętne są teoretycznie możliwe, ale nie występują ze względu
na sterycznie niekorzystne oddziaływania łańcuchów bocznych aminokwasów w
konfiguracji L. Poszczególne fragmenty łańcucha peptydowego o różnej długości zwijają
się więc lokalnie w struktury drugorzędowe. Wyróżnić można kilka konformacji
helikalnych, z których główne to (PLANSZA 104):
(a) prawoskrętna, klasyczna helisa , oznaczana często jako 3.613;
(b) prawoskrętna, klasyczna helisa 310;
(c) prawoskrętna, klasyczna helisa , oznaczana często jako 4.416.
Helisy te określane są jako klasyczne gdyż każdy aminokwas w takiej strukturze
drugorzędowej ma jednakowe wartości kątów i (PLANSZA 105). Poszczególne
helisy różnią się stopniem zwinięcia, najbardziej zwinięta jest helisa 310 z 3 aminokwasami
na jeden skręt, dalej helisa z 3.6 aminokwasami na skręt i helisa z 4.4 aminokwasami
na skręt, co tłumaczy znaczenie „głównego symbolu” określającego rodzaj helisy.
Struktura helikalna jest stabilizowana przez wiązania wodorowe, w których donorem
protonu jest azot amidowy wiązania peptydowego (PLANSZA 98) a akceptorem tlen
karbonylowy tego wiązania. W helisie 310 takie wiązanie występuje między każdym i-tym
i i+3-cim aminokwasem w sekwencji (1-4, 2-5, 3-6 itd), w helisie między i-tym i i+4-
tym, a w helisie między i-tym i i+5-tym. Wiązanie wodorowe "zamyka" jak gdyby
fragment łańcucha, a ilość atomów wynosi odpowiednio 10, 13 i 16 dla trzech typów helis
(PLANSZA 104), co wyjaśnia znaczenie subskryptu w symbolu każdej z helis. Helisy w
białkach mogą być różnej długości; najkrótsza musi umożliwić powstanie chociaż jednego
stabilizującego wiązania wodorowego (odpowiednio 4, 5 i 6 aminokwasów). W białkach
globularnych helisy mają długości średnio 10 15 aminokwasów, ale spotyka się niekiedy
nawet do 50 aminokwasów długości.
Dwa lub więcej fragmentów rozciągniętego łańcucha peptydowego, tzw. -nici
(PLANSZA 106) może się ustawiać równolegle (kierunki N C takie same) lub
antyrównolegle (kierunki N C przeciwne) do siebie, tworząc strukturę płaską -kartki
(-sheet). Taka struktura drugorzędowa jest stabilizowana przez wiązania wodorowe
między nićmi z udziałem grup NH i C=O wiązań peptydowych. Kąty dwuścienne
(PLANSZA 105) nie odpowiadają niciom maksymalnie rozciągniętym, i po 180, ale
62
odbiegają od nich do ok. 120, przez co -kartka jest pofałdowana. Najczęściej występują
-kartki antyrównoległe, złożone z 2 do 3 nici, rzadziej mieszane, częściowo równoległe a
częściowo antyrównoległe od 3 do 15 nici, a najrzadziej równoległe, zwykle złożone z
ponad 4 nici.
Trzecim typem struktur drugorzędowych są ciasne pętle, tzw. -skręty i -skręty
(PLANSZA 107), na końcach struktur antyrównoległej -kartki, kiedy łańcuch peptydowy
wykonuje zwrot dla uzyskania tej struktury. W przypadku skrętu jeden aminokwas
wypada z układu wiązań wodorowych, a w przypadku skrętu wypadają dwa
aminokwasy. Struktury takich skrętów są dobrze zdefiniowane poprzez wartości kątów i
(PLANSZA 105). Istnieje ok. 8 różnych rodzajów -skrętów różniących się
konformacją; dane na kąty dwuścienne przytoczone są dla jednego typu tej struktury.
Statystycznie rzecz biorą w białkach globularnych ok. 31% aminokwasów jest w
strukturach helikalnych 28% w strukturach -kartek a pozostałe w różnego rodzaju pętlach
(PLANSZA 108), z których tylko ciasne skręty i uważa się za dobrze zdefiniowane
struktury drugorzędowe. Dłuższe pętle są obszarami nieustrukturowanymi
drugorzędowo. Helisy wszystkich typów oznacza się spiralami lub walcami natomiast -
nici tworzące -kartki w postaci strzałek wskazujących kierunek NC.
Poliprolina i poliglicyna, ze względu na nieco odmienną od pozostałych
aminokwasów budową łańcuchów bocznych, tworzą odrębne typy struktur
drugorzędowych (PLANSZA 105): poliprolina I i poliprolina II oraz poliglicyna II.
Struktury drugorzędowe organizują się przestrzennie w tzw. globalny fold
pojedynczego łańcucha peptydowego czyli strukturę trzeciorzędową, która wykazuje
zróżnicowanie zależnie od typu białka: globularne, strukturalne, błonowe. Dla białek
globularnych (PLANSZA 108) stabilizacja struktury trzeciorzędowej zachodzi poprzez
następujące (główne) typy oddziaływań (PLANSZA 8).
(a) Oddziaływania hydrofobowe reszt bocznych aminokwasów alifatycznych, które
prowadzą do powstania tzw. jądra hydrofobowego. Charakter hydrofobowy ma także
oddziaływanie warstwowe (stacking) aromatycznych pierścieni takich aminokwsów jak
tryptofan, tyrozyna i fenyloalanina oraz oddziaływania typu kation dodatnio
naładowanych łańcuchów bocznych (lizyna, arginina) i pierścieni aromatycznych.
(b) Aminokwasy polarne a przede wszystkim naładowane występują w przewadze na
powierzchni białka, zapewniając korzystne elektrostatycznie oddziaływanie z wodą i
63
jonami rozpuszczalnika. Woda jest w znacznym stopniu wyparta z wnętrza białek
globularnych i może tam występować jedynie w formie klastrów niewielu cząsteczek
oddziałujących z aminokwasami hydrofilowymi (polarnymi), np. tworząc wiązania
wodorowe. Woda i jony związane w sferze hydratacyjnej ulegaja wymianie z pozostałą
częścią rozpuszczalnika (bulk solvent)
(c) Pary aminokwasów naładowanych o przeciwnych znakach wewnątrz białka, np.
dodatnio naładowana lizyna czy arginina i ujemnie naładowany kwas asparaginowy czy
glutaminowy, wiążą sie w tzw. mostki solne.
(d) Kowalencyjne wiązania między grupami siarkowymi cystein SS, szczególnie w
przypadku mniejszych białek, np. CMTI (ok. 30 aminokwasów) i inhibitor trypsyny BPTI
(basic pancreatic trypsin inhibitor; 58 aminokwasów), mają po 3 mostki dwusiarczkowe.
Ponadto, występują liczne i nieukierunkowane oddziaływania stabilizujące van der
Waalsa między wszystkimi fragmentami (oddziaływania indukcyjne i dyspersyjne).
Struktura trzeciorzędowa mniejszych białek jest najczęściej globularna, "zwarta" w
pełni tego słowa znaczeniu. W przypadku białek większych, ponad 200 aminokwasów
może pojawić się struktura podzielona na domeny (PLANSZA 109). Każda domena
tworzy własną zwartą strukturę z własnym jądrem hydrofobowym, a połączenia między
domenami mają luźniejszy charakter i umożliwiają intensywniejsze ruchy molekularne
domen względem siebie.
Niekiedy pomiędzy strukturą drugorzędową i trzeciorzędową wyróżnia się
struktury pośrednie tzw. superdrugorzędowe (PLANSZA 110). Są to pewne
charakterystyczne i często spotykane motywy białkowe, zbudowa z kilku elementów
drugorzędowych blisko siebie położonych w sekwencji, np. motyw -- helisy łączącej
nici równoległej, dwuniciowej -kartki, czy klucz grecki złożony z dwóch -kartek, dwu i
trzyniciowej, ustawionych równolegle do siebie. Szereg motywów rozpoznających kwasy
nukleinowe (będę omawiał w dalszej części wykładu) np. motyw helisa-skręt-helisa,
można klasyfikować jako struktury superdrugorzędowe.
Poszczególne domeny klasyfikuje się z topologicznego punktu widzenia. Można
podzielić białka jednodomenowe i domeny pod względem struktur drugorzędowych:
(1) - zbudowane w przeważającej części z helis;
(2) - zbudowane w przeważającej części z nici rozciągniętych w kartkach;
(3) / - z przemieszanymi strukturami helikalnymi i -kartkowymi;
(4) + - z rozseparowanymi strukturami helikalnymi i -kartkowymi.
64
W ramach tak ogólnej charakterystyki definiuje się bardziej szczegółowo
scharakteryzowane topologicznie ponad 700 typów foldów (ciągle są odkrywane nowe).
Kilka przykładów dla białek enzymatycznych (PLANSZA 111) to: RRM (RNA
recognition motif), -propeller, P-loop. Klasyfikacja białek pod względem foldów w
bazach danych, takich jak SCOP, CATH, opiera się na podejściu hierarchicznym z
kolejnymi poziomami uogólnienia podobieństwa strukturalnego.
Przez długi czas uważano, że nić białkowa jest NIEZAPĘTLONA, tzn.
pociągnięcie za końce nie daje supełków. Ostatnio wzrasta liczba doniesień o białkach
tworzących supełki (ponad 100 przypadków), np. syntetaza S-adenozylometioniny.
PLANSZA 112: przedstawia mechanizm zapętlania w trakcie translacji.
Dla białek zbudowanych z jednej nici peptydowej struktura trzeciorzędowa jest
ostateczną, globalną strukturą. Funkcjonalne białka mogą być zbudowane z kilku,
najczęściej jednakowych nici peptydowych czyli podjednostek (PLANSZA 113), każda o
własnej strukturze trzeciorzędowej, połączonych ze sobą specyficznymi oddziaływaniami.
Takie białka mają określoną strukturę czwartorzędową złożoną z podjednostek (nie
mylić z domenami !!!). Ilość podjednostek może być różna: dwie, trzy, cztery, pięć, sześć
(heksamer insuliny), osiem i bardzo wiele w białkowych otoczkach wirusów.
Druga klasa białek tzw. strukturalne (włókniste, fibrylarne), w przeciwieństwie do
globularnych, charakteryzuje się nierozpuszczalnością w wodzie, odpornością na czynniki
denaturujące i enzymy proteolityczne. Struktury drugorzędowe są w białkach
strukturalnych takie jak w globularnych, ale oba rodzaje białek różnią się zdecydowanie
strukturą trzeciorzędową. Białka włókniste tworzą przeważnie bardzo wydłużone struktury
w jednym kierunku (włókna), gdzie jedna lub kilka typów struktur drugorzędowych
powtarza się. Struktura trzeciorzędowa i czwartorzędowa są jakby przedłużeniem struktury
lub struktur drugorzędowych. Omówię dwa charakterystyczne przykłady.
(1) Kolagen (PLANSZA 114), składnik szeregu tkanek ma w strukturze
pierwszorzędowej powtarzalne sekwencje aminokwasowe typu (GlyXaaYaa)n ze
znaczną zawartością proliny w miejscach Xaa i Yaa i lizyny w Yaa. Prolina jest często
hydroksylowana w pozycji do hydroksyproliny (PLANSZA 92). Kolagen tworzy
strukturę potrójnej helisy (PLANSZA 105): trzy łańcuchy peptydowe w formie
poliproliny II są zwinięte prawoskrętnie wokół siebie ze skokiem 30 Å, 10 aminokwasów
na skok. Struktura jest stabilizowana przez wiązania wodorowe między łańcuchami w
helisie (NH glicyny, C=O aminokwasu Xaa), ze znacznym udziałem -OH hydroksyprolin
65
jako donorów protonu. Obserwowano cząsteczki kolagenu o długości do 28 000 Å (ciężar
cząsteczkowy ok. 300 000 D), przy szerokości helisy 14 Å.
(2) Szereg cytoplazmatycznych białek nadających kształt komórkom tworzy
struktury superhelikalne, tzw. helisa helis (coiled coils), w których (PLANSZA 115)
dwie prawoskrętne -helisy zwinięte są równolegle i lewoskrętnie względem siebie.
Stabilizacja układu superhelikalnego zachodzi dzięki amfipatyczności. W strukturze
pierwszorzędowej występują powtarzające się kolejno sekwencje siedmiu aminokwasów
a-b-c-d-e-f-g-, gdzie dwa aminokwasy a i d są hydrofobowe (Leu, Ile, Ala), e i g
naładowane przeciwnie (Glu, Arg), a pozostałe aminokwasy są dowolne. Jedna strona helis
jest więc hydrofobowa i umożliwia ich łączenie, wspomagane przez przyciąganie
elektrostatyczne aminokwasów naładowanych. W ten sposób mogą powstawać superhelisy
złożone z trzech czy czterech helis, np. w jedwabiu pszczół.
(3) Jedwab pająków (PLANSZA 116) wykazuje strukturę (techniki solid state NMR
wirowania pod kątem magicznym CP MAS) włókien otoczonych twarda powłoką.
Pojedyncze włókna sa zbudowane z równolegle ułożonych łańcuchów peptydowych w
formie -kartek zawierających głównie glicynę i alaninę, wymieszanych („posklejanych”)
z formami helikalnymi 31 (nie mylić z helisa 310): 3 aminokwasy na skręt, = 60, =
135 (oznaczenie 31 jest ścisłym oznaczeniem Xk symetrii śrubowej PLANSZA 65)
Białka błonowe są strukturalnie podobne do białek globularnych, ale naturalne
środowisko przynajmniej dla fragmentu cząsteczki ma charakter hydrofobowy, podwójna
warstwa lipidowa w której tkwi, złożona z reszt kwasów tłuszczowych. Fragmenty białek
błonowych mogą wystawać do środowiska wodnego i stosować się do reguł budowy
charakterystycznych dla białek globularnych, jednak jako całość białka te agregują w
wodzie i są w niej nierozpuszczalne ze względu na hydrofobowość powierzchni
kontaktu z błoną. Dopiero ostatnio udało się opracować metody krystalizacji białek tego
typu w środowisku buforowym z udziałem detergentów i ilość znanych struktur (ok. 150)
jest relatywnie niewielka w stosunku do liczby znanych struktur białek globularnych.
Znane są obecnie zasadniczo dwa typy struktur białek błonowych (PLANSZA 117):
- wiązka helis ( helix bundle), np. transpoter glukozy przez błonę erytrocytów;
- -baryłka (-barrel), np. bakteriorodopsyna: napędzana energią światła pompa
protonowa.
W 492 aminokwasowowym transporterze (PLANSZA 118) helikalne struktury
drugorzędowe białka tworzą dynamiczne kanały przez błonę, które wyłapują cząsteczkę
66
cukru na zewnątrz i wypuszczają w środku komórki. W białku można zaobserwować
charakterystyczny rozkład amfipatyczny aminokwasów hydrofobowych, polarnych oraz
dodatnio i ujemnie naładowanych. Naładowane i polarne znajdują się głównie we
fragmentach kontaktujących się z wodą, ale i tam występują hydrofobowe dla utworzenia
jąder hydrofobowych odpowiednich, wystających z błony domen. Z kolei znaczna
przewaga aminokwasów hydrofobowych występuje we fragmentach zaczepionych w
błonie, ale i tu występują w odpowiednich miejscach aminokwasy polarne, stabilizujące
strukturę kanałów i ułatwiające wnikanie polarnych cząsteczek cukru przez
oddziaływanie van der Waalsa. Oddziaływania stabilizujące białka błonowe są stosunkowo
słabo poznane. Zakotwiczone w błonie fragmenty mają wysoce stabilne struktury odporne
na termiczną denaturację, pomimo braku wyraźnie ukształtowanego jądra
hydrofobowego. Postuluje się: optymalne (lepsze niż w białkach globularnych)
upakowanie reszt bocznych, wiązania wodorowe aminokwasów polarnych we wnętrzu
białka, znaczna ilość słabych wiązań wodorowych CH…O=C.
Wyznaczanie struktur białek z rozdzielczością atomową metodami rentgenografii,
NMR i przez zwijanie komputerowe (powiem o tym w dalszej części wykładu) jest
naczelnym zadaniem proteomiki strukturalnej. Struktury te, w postaci położeń
poszczególnych atomów zapisywane są w bazach danych w standardowych formatach
(internet) w postaci tzw. PDB-files. W chwili obecnej zdeponowano ponad 100 000
struktur białkowych, z czego ponad 80% to struktury uzyskane metodą dyfrakcji
promieniowania rentgenowskiego na monokryształach. Dominują struktury białek
globularnych.
67
Wykład 11
(c) Stabilizacja struktur natywnych cząsteczek białkowych nie jest wysoka.
Wynosi od kilkunastu do kilkadziesięciu kilojouli na mol (PLANSZA 119) i wynika z
oddziaływań stabilizujących (G, H), o których mówiłem przy omawianiu białek
globularnych: hydrofobowe, mostki solne, wiązania wodorowe, oddziaływania van der
Waalsa, oddziaływania z rozpuszczalnikiem, w tym wymiana jonów i cząsteczek wody
między sferą hydratacyjną białka i bulk solvent (water release), które w sumie przeważają
nad wkładem destabilizującym, głównie entropii konformacyjnej (TS). Obliczenia
poszczególnych wkładów obdarzone są niestety błędami, które kumulują się w ostatecznej
wartości teoretycznej (zsumowanie daje 170 kJ/mol). Dla białek globularnych i błonowych
zmiany warunków środowiska mogą spowodować odwrócenie relacji stabilizacja -
destabilizacja struktury natywnej i przejście białka w formę zdenaturowaną kłębka
statystycznego (PLANSZA 120). Czynnikami denturującymi dla białek globularnych są:
(a) podwyższona temperatura wzmaga ruchy cieplne, które rozbijają oddziaływania
elektrostatyczne i van der Waalsa o energiach rzędu RT;
(b) chemiczne denaturanty np. mocznik, chlorek guanidyny wiążą się z powierzchnią
białka dążąc do jej maksymalizacji, a tak jest w strukturze rozwiniętej;
(c) pH roztworu: jonizacja i protonacja grup bocznych niszczy oddziaływania
stabilizujące struktur natywnych.
Należy wspomnieć, że białka niektórych organizmów wykazują znaczną stabilność w
skrajnych warunkach np. białka bakterii termofilnych nawet do 100 120C. Jak widać z
wykresów zależności stosunku zawartości formy zdenaturowanej do formy natywnej
przejście zachodzi dla wielu białek ostro jak topnienie i ma charakter odwracalny.
Usunięcie czynnika denaturującego powoduje powtórne zwinięcie się białka
zdenaturowanego do formy natywnej czyli refolding. Wynika to stąd, że informacja o
strukturze przestrzennej formy natywnej białka jest określona przez sekwencją
aminokwasów. Znając sekwencję aminokwasów istnieje możliwość teoretycznego
zwinięcia białka do jego formy natywnej, która według tzw. hipotezy Anfinsena jest
stanem o minimum energii swobodnej G.
Ten temat: zwijanie białek (protein folding) jest centralnym problemem biofizyki
(biologii) molekularnej i obejmuje następujące dwie klasy zagadnień.
68
(a) poszukiwanie komputerowych algorytmów wyznaczania struktury natywnej z
sekwencji aminokwasów; input - sekwencja, output – współrzędne atomow białka;
(b) doświadczalne poszukiwanie molekularnych mechanizmów (dróg) zwijania różnymi
metodami i teoretyczne ich modelowanie dla białek o znanej strukturze przestrzennej.
Problem leży w znalezieniu jednej konformacji z astronomicznej ilości możliwych (ponad
1030
dla białka o 100 aminokwasach). Ponieważ czasy zwijania różnych białek wynoszą od
milisekund do minut a nawet godzin, 105
s do 102s, więc są za długie do szukania
właściwej konformacji aktualnie stosowanymi metodami dynamiki molekularnej MD.
Nawet przy najlepszych obecnie superkomputerach i stosowaniu uproszczonych
(niepełnoatomowych) modeli białek o zredukowanej ilości stopni swobody, czasy
symulacji nie przekraczają mikrosekund (10-6
s), można więc uchwycić zaledwie efekty
początkowe, zaczątki struktury natywnej, np. formowanie się helisy czy -szpilki (-
hairpin, -turn). Komputerowe techniki zwijania głównie białek globularnych stosuje
się z sukcesem w trzech typach zagadnień:
(1) Wyznaczanie struktur drugorzędowych a więc lokalnych;
(2) Wyznaczanie struktur całkowitych w białkach o dużej homologii czyli
identyczności lub podobieństwie sekwencji do białek o stukturze znanej;
(3) Wyznaczanie struktur superdrugorzędowych i trzeciorzędowych de novo niezbyt
dużych białek metodami statystycznego próbkowania konformacji dla uproszczonych
modeli cząsteczek białkowych, np. zwijanie na siatkach czyli w nieciągłej przestrzeni
konformacyjnej.
Wyznaczanie struktur drugorzędowych opiera się na preferencjach
(prawdopodobieństwie) aminokwasów do znajdowania się w określonych typach
struktur drugorzędowych (PLANSZA 121). Dla każdego i-tego z 20 (22) aminokwasów
można określić liczbowo preferencje przebywania w strukturze x: helisie, -kartce i
skręcie, na podstawie analizy statystycznej baz danych sekwencji i struktur białek. Np.
glutamina (Glu) bardzo chętnie przebywa w helisie (P > 1), niechętnie w -kartce (P <
1), i nie ma preferencji ani braku preferencji jeśli chodzi o skręty , i pętle (Pt ok. 1).
Odwrotnie zachowuje się cysteina (Cys). Na tej podstawie tworzy się algorytm (np. jeden
z pierwszych Chou i Fasmana) przekładający preferencje strukturalne kolejnych
aminokwasów fragmentu białka na jego strukturę drugorzędową. Dokładność
przewidywań sięga 80%, co oddaje lokalne uwarunkowania struktur drugorzędowych,
które mogą być prawdopodobnie dodatkowo determinowane przez globalny fold białka.
69
Zwijanie na podstawie homologii sekwencji wykorzystuje znaną zależność, że
30% identyczności (podobieństwa) sekwencji białek daje ponad 70% podobieństwa ich
struktury trzeciorzędowej. Punktem wyjścia jest właściwe uszeregowanie sekwencji
białka o nieznanej strukturze w stosunku do homologicznego białka lub kilku białek
matrycowych (tarcz, wzorców) o znanych strukturach przestrzennych (PLANSZA 122).
Problem nie jest trywialny gdyż uzyskanie identyczności w jednym miejscu wymaga jej
poświęcenia w innym i trzeba w tym celu skonstruować algorytm oparty na punktowaniu:
- punkty dodatnie za identyczność aminokwasów;
- punkty ujemne za zamiany aminokwasów i wprowadzanie luk.
Maksymalna wartość punktowa dając właściwe uszeregowanie (programy FASTA,
BLAST, CLUSTAL W) wyznacza obszary strukturalnie zachowane SCR (PLANSZA
123). Kolejny program (np. MODELLER) „wpisuje” nieznane współrzędne badanego
białka w znane współrzędne białka homologicznego. Obszary SRC (zwykle struktury
drugorzędowe) trzeba następnie połączyć, najczęściej pętlami, również wziętymi z baz
danych. Minimalizacja energii (MM, MD) usuwa steryczne naprężenia w wymodelowanej
strukturze. Weryfikacja uzyskanej struktury odbywa się na podstawie szeregu kryteriów:
optymalne kontakty hydrofobowe i powierzchnia dostępu rozpuszczalnika, „właściwe”
położenia aminokwasów na diagramie Ramachandrana.
W trzeciej grupie technik przybliża się cząsteczkę białka przez uproszczony model,
np. sfery centrowane na C, wiązaniu peptydowym CN, i C (reprezentacja łańcucha
bocznego). Odpowiednio skonstruowane oddziaływania między sferami dają energie
dyskretnych (nieciągłych) konformacji, reprezentowanych przez położenia sfer
(pseudoatomów) na siatce. Próbkowanie statystyczne energii stanów konformacyjnych
przez zmiany położeń pseudoatomów oszczędnymi czasowo metodami Monte Carlo daje
globalnego minimum energetycznego odpowiadającego strukturze natywnej.
W modelowaniu komputerowym struktur rozgrywa się "zawody sportowe" w
ramach CASP (Critical Assesment of Structure Prediction): opracowane doświadczalnie,
nieopublikowane struktury są deponowane przez organizatorów. Sekwencje są
udostępniona na www grupom badawczym, które starają się wymodelować struktury
swoimi metodami. Aktualnie w CASP rozgrywane sa zawody w czterech konkurencjach:
- modelowanie homologiczne CP (comparative modelling);
- rozpoznanie foldu FR (fold recognition);
- nowe foldy NF (new folds);
70
- przewidywanie struktur drugorzędowych.
Sposób znalezienia przez cząsteczkę białka natywnej konformacji nie może się
opierać na przeszukiwaniu dostępnej przestrzeni konformacyjnej metodą prób i błędów.
Zagadnienie formułuje tzw. paradoks Levinthala: dla łańcucha peptydowego 100
aminokwasów takie próbkowanie 1030
konformacji z czasem 10-11
s każda wymaga 1019
s
czyli 1011
lat czyli dłużej niż wiek wszechświata. Model zwijania BIAŁEK
GLOBULARNYCH dobrze oddaje lejek zdarzeń równoległych (folding funnel,
PLANSZA 124). Każdy punkt na powierzchni lejka reprezentuje energie swobodną
Gibbsa G białka w funkcji kątów i opisujących konformację. Proces zwijania ma
charakter dyfuzyjny: przypadkowe ruchy łańcucha pod wpływem fluktuacji termicznych i
sił Browna, ALE przy ruchu po powierzchni lejka wcześniejsze etapy zwinięcia
sprzyjają następnym, czyli proces jest KOOPERATYWNY. Poszczególne cząsteczki
zwijają się niezależnie od siebie „spływając” po ściankach lejka jak niezależne krople
wody, startując z różnych form kłębka statystycznego na obrzeżu lejka. Zysk energetyczny
kontaktów stabilizujących strukturę natywną kompensuje spadek entropii związany z
zacieśnianiem ilości dostępnych konformacji. Przypadkowemu, niekooperatywnemu
przeszukiwaniu przestrzeni konformacyjnej odpowiadałoby błądzenie po płaskiej
powierzchni w poszukiwaniu małego „otworu” w środku.
Wyznaczanie form pośrednich ma duże znaczenie w określeniu mechanizmów i
dróg zwijania. Formy te, jeśli występują (nie jest to cecha wszystkich białek) mogą być
reprezentowane przez minima lokalne na pofałdowanym lejku zwijania. Nawet jeśli brak
wyraźnie ustrukturowanych form pośrednich na drodze zwijania, przyjmuje się w zwijaniu
białek globularnych ukształtowanie tzw. stopionej globuły (molten globule), w ktorej
białko ma już globalny kształt struktury trzeciorzędowej, ale nie występuje jeszcze
właściwe ustawienie łańcuchów bocznych aminokwasów; nie ma jądra hydrofobowego.
Jedną z dużej ilości metod badania dróg zwijania jest wyłapywanie intermediatów z
przypadkowo utworzonymi mostkami dwusiarczkowymi jak w białku BPTI
PLANSZA 125). Trzy mostki SS muszą się utworzyć w ściśle określonej kolejności na
drodze do formy natywnej. Można przerywać tworzenie struktury natywnej w określonych
momentach czasu (dla BPTI przez zakwaszenie) i określać struktury form przejściowych.
W przypadku BPTI widać np. że wcześniejsze utworzenie właściwego mostka 14-38 niż
wymaga tego droga zwijania prowadzi do niewłaściwej formy. Forma ta musi ulec
71
rozwinięciu, żeby białko weszło na właściwą drogę zwijania. Prawidłowa droga zwijania
prowadzi przez przejściowe utworzenie niewłaściwych mostków 5-38 i 5-14. In vivo
dobranie właściwych par cystein i katalizę tworzenia wiązania SS zapewnia enzym
izomeraza dwusiarczkowa.
Mechanizm zwijania, podobnie jak algorytmy przewidywania struktury
przestrzennej na podstawie sekwencji, są ciągle dalekie od dokładnego poznania.
Kontrowersyjne są zarówno pierwsze etapy tworzenia zaczątków struktury zwiniętej jak i
problem hierarchiczności procesu zwijania: czy najpierw powstają struktury
drugorzędowe, które łączą się w ostateczny fold przestrzenny, czy inicjacją procesu jest
„kolaps hydrofobowy” z utworzeniem jądra hydrofobowego, który narzuca ukształtowanie
struktur drugorzędowych.
Zdolność samoistnego zwijanie białek in vitro jest ważną cechą zwijania in vivo.
Maszyneria komórkowa podnosi efektywność, ale nie może „wymusić” zwinięcia
łańcucha peptydowego pozbawionego tej własności in vitro. Maszyneria translacyjna
rybosomu sprzyja przynajmniej częściowemu zwijaniu białek w trakcie powstawania czyli
kotranslacyjnie. Dzięki peptydom sygnałowym na N-końcu (kilkadziesiąt AA) białko
trafia we właściwe miejsce funkcjonowania w komórce lub na zewnątrz, w procesie
topogenezy (PLANSZA 126). Proces polega na przejściowym zatrzymaniu translacji
przez czynnik SRP (signal recognition particle), związaniu maszynerii translacyjnej z
błoną i odcięciu peptydu sygnałowego przez związaną z błoną peptydazę sygnałową, z
jednoczesnym przejściem przez błonę syntetyzowanego łańcucha peptydowego lub
zakotwiczeniem w błonie (białko błonowe).
Przynajmniej część białek wymaga udziału w zwijaniu posttranslacyjnym
pomocniczego systemu białkowych kompleksów opiekuńczych tzw. chaperonów,
często związanych z białkami szoku termicznego HSP. Najlepiej poznany jest system
bakteryjny GroEL/GroES (800+70 kDa), którego obie części zostały wykrystalizowane.
Po związaniu GroES z jednej strony cylindra i przy udziale ATP do środka cylindra GroEL
(PLANSZA 127) wchodzi białko źle zwinięte i (zależnie od hipotezy/modelu):
- jest rozwijane, aby mogło się zwinąć właściwie (IAM, iterative annealing model);
-jest właściwie zwijane w środku, w otoczeniu chaperoroninowym klatki Anfinsena
(ACM, Anfinsen cage model).
Kołyska GroEL jest podobna do proteasomu, gdzie białka kończą swój żywot pocięte na
kawałki, po uprzednim oznakowaniu cząsteczkami ubiquityny (79 aminokwasów), która
wiąże oznakowane białko z proteasomem.
72
Niewłaściwe zwinięte białka jak prion w chorobie Creutzfelda-Jacoba (wściekłych
krów) czy -amyloid w chorobie Altzheimera mogą agregować tworząc złogi zabójcze dla
komórek. Spektroskopia NMR w ciele stałym i mikroskopia elektronowa (STEM,
scanning transmission microscopy; PLANSZA 128) dostarczają rosnącą ilość informacji o
strukturach i kinetyce tworzenia złogów amyloidalnych. Na lejkach zwijania formy te
mogą być reprezentowane jako drugie dno lejka (PLANSZA 124). W przypadku -
amyloidu Alzheimera (PLANSZA 129) dwa fragmenty -kartkowe z ostrym skrętem
każdy są połączone oddziaływaniami hydrofobowymi i agregują między sobą do
struktury czterowarstwowej.
W ostatnim okresie pojawiła się rosnąca ilość doniesień literaturowych o białkach
lub domenach białkowych częściowo lub całkowicie nieustrukturowanych, które
przybierają natywną formę ustrukturowaną dopiero przy wiązaniu w kompleksy. Białka te,
określane jako natywnie rozwinięte (natively unfolded, structuraly disordered, intrinsicly
disordered - ID) są często zaangażowane w procesy regulacyjne i sygnałowe, a ich ilość
szacuje się na 30% wszystkich rodzajów białek w eukaryotach. Brak lub częściowy brak
struktury ma tę funkcjonalna zaletę, że umożliwia wiązanie w kompleksy z kilkoma
różnymi partnerami, z inną strukturą przestrzenną centrum wiążącego za każdym razem.
Zapewnia to (hipoteza) możliwość tworzenia kilku centrów wiążących przy zachowaniu
minimalnej wielkości białka, tzn. ustrukturowane białko z kilkoma różnymi centrami
wiążącymi musiałoby być kilkakrotnie większe.
Tematem analogicznym do zwijania białek jest zwijanie RNA (RNA folding) i
obejmuje te same dwie klasy zagadnień: teoretyczne przewidywanie struktury RNA na
podstawie sekwencji nukleotydów i charakterystyka mechanizmów zwijania na gruncie
modelu „lejka zwijania” (temat nie będzie omawiany szczegłówo). Całkowity czas
zwijania RNA jest podobny jak w białkach, od 105
s do 102s i dzieli się na wyraźne etapy
w hierarchicznej kolejności tworzenia, najpierw struktur drugorzędowych (silniejsze
oddziaływania stabilizujące), a następnie trzeciorzędowych (słabsze oddziaływania
stabilizujące). Silne pofałdowanie lejków zwijania RNA stwarza liczne pułapki
strukturalne i kinetyczne na drodze zwijania, usuwane przez mechanizmy komórkowe.
73
Wykład 12
5. Specyficzne oddziaływania międzycząsteczkowe z udziałem białek i kwasów
nukleinowych. Białka i kwasy nukleinowe tworzą ze sobą i z innymi cząsteczkami
funkcjonalne kompleksy o różnej ilości molekuł w kompleksie i wyrażanym przez stałe
asocjacji Kas (PLANSZA 9) różnym stopniu specyficzności. Stabilizację kompleksów
warunkują te same tpy oddziaływań jak przy stabilizacji struktur natywnych biopolimerów
(PLANSZA 8). Asocjacja molekuł jest procesem dynamicznym (PLANSZA 130).
Cząsteczki nie wpasowują się sztywno jak „klucz do zamka”, ale zmieniają konformacje
dopasowując swoje powierzchnie molekularne (induced fit) dla efektywnego działania
elektrostatycznych oddziaływań stabilizujących między optymalnie rozłożonymi
ładunkami. Temin „induced fit” wprowadził Koshland (lata50-tych XX) dla wyjaśnienia
powstawania aktywnej formy enzymu E po przyłączeniu substratu E*S ES. Mimo, że
zmiana konformacyjna składników kompleksu wiąże się z dodatkowym kosztem
energetycznym, lepsze dopasowanie powierzchni molekularnych daje obniżenie bariery
tworzenia kompleksu G# zapewniające wydajniejszą kinetykę wiązania oraz optymalne
ułożenie ładunków (podwyższenie energii stabilizacji G). Alternatywnym lub
komplementarnym modelem jest preselekcja właściwych konformacji przy wiązaniu.
W przypadku gdy jeden z partnerów kompleksu jest białkiem natywnie
rozwiniętym zaproponowano model „fly-casting”: jednoczesnego zwijania i
kompleksowania. Białko częściowo lub całkowicie rozwinięte może tworzyć wstępne
kontakty stabilizujące przy większych odległościach (Rcm na PLANSZY). Chociaż
relatywnie bardzo słabe, kontakty te umożliwiają „zahaczenie” białka „na tarczy”
partnera kompleksu z następującym jego nawijaniem na „tarczy” jak przy „łowieniu
pstrąga na muchę”. Zagadnienia oddziaływań stabilizujących kompleksy oraz
charakterystycznych motywów strukturalnych czasteczek biorących udział we
wzajemym rozpoznawaniu omówię na wybranych przykładach.
Interkalatory. Liczne związki organiczne o charakterze antybiotyków,
mutagenów, kancerogenów lub odwrotnie, środków przeciwnowotworowych oraz
środków przeciwwirusowych ma postać układów wielopierścieniowych (PLANSZA 131).
Tego typu związki mogą oddziaływać z helikalnymi formami DNA interkalując, czyli
wchodząc pomiędzy dwie zestackingowane pary zasad i oddziałując z nimi warstwowo.
74
Struktura helikalna nie jest przy tym niszczona, a tylko modyfikowana, co może prowadzić
do zaburzeń w ekspresji genów i efektów takich jak mutageneza czy kancerogeneza.
Przykładowo, cytotoksyczny antybiotyk adriamycyna (hydroksydaunomycyna) wymusza
przez interkalację przejście Z B helisy DNA (PLANSZA 132). Interkalatory zwykle
wykazują częściową specyficzność poprzez większe powinowactwo do obszarów DNA
bogatych w pary GC. Przy odpowienim stężeniu i odpowiednio wysokiej stałej asocjacji
mogą zapełnić do 40% dostępnych miejsc (PLANSZA 131), czyli wejść pomiędzy prawie
co drugą parę zasad.
Poliamidy. Odpowiednio zaprojektowane cząsteczki „białkopodobne” (PLANSZA
133), złożone z trzech typów pierścieni: pyrolu (Py), 3-hydroksypyrolu (Hp) i imidazolu
(Im) połączonych wiązaniami peptydowymi, wiążą się z helisami DNA od strony małej
bruzdy. W zależności od kombinacji dwóch pierścieni w pozycjach 3 i 6 łańcucha,
rozpoznają i selektywnie wiążą poszczególne pary zasad: A:T, T:A, G:C i C:G
(„chemiczne” odczytywanie informacji genetycznej). Odróżnienie opiera się na niskiej
stałej dysocjacji, poniżej 1 nM (inaczej wysokiej stałej asocjacji)::
KD = [poliamid][DNA]/[kompleks]
w wiązaniu wyróżnionej pary zasad. W przypadku trzech pozostałych par zasad i innej
kombinacji Py/Hp/Im, stała KD jest do dwóch rzędów wielkości wyższa. Specyficzność
jest uwarunkowana układem wiązań wodorowych pierscień poliamidu/pierścień zasady
oraz komplementarności kształtu powierzchni kontaktu (shape complementarity), co
szczególnie w przypadku odróżnienia pary A:T od T:A wiąże się z rozpoznaniem bardzo
małych różnic powierzchni molekularnych.
Aptamery. Szereg oligomerycznych fragmentów RNA i pojedynczoniciowych
DNA (kilkadziesiąt nukleotydów) wykazuje własności wiązania ligandów
niskocząsteczkowych, np. aminokwasy, nukleotydy, z wysokimi stałymi asocjacji i
wysoką specyficznością. Fragmenty te, tzw. aptamery pochodzą z selekcji in vitro, w
których startując z bibliotek sekwencji przypadkowych optymalizuje się te sekwencje w
kierunku wysokiego powinowactwa wobec określonych ligandów (SELEX - systematic
evolution of ligands by exponential enrichment). Własności konformacyjne i sposób
wiązania ligandów są w wielu przypadkach podobne we wszystkich aptamerach.
Przykładem może być 34n aptamer RNA wiążący AMP (PLANSZA 134), którego
strukturę wyznaczono metodami spektroskopii NMR (fragment widma odpowiada
75
protonom wiązań wodorowych). AMP jest wiązane w kieszeni utworzonej przez giętką
pętlę RNA, która w trakcie wiązania usztywnia się i przybiera właściwą konformację
jakby dwóch zintegrowanych szpilek do włosów z jednej nici (induced fit). Obszary
helikalne szpilek są nachylone do siebie pod kątem 106. Pętla jest zamknięta przez dwie
pary zasad G7:G11 i G17:G34, a AMP jest stabilizowane przez trzy wiązania wodorowe
(jedno do A12 i dwa do G8) i stacking typu sandwich czyli interkalacyjny, z dwoma
pierścieniami, A10 i G11. Aptamery zaobserwowano w regulacji ekspresji genów na
poziomie transkrypcji i translacji w strukturach tzw. „przełączników RNA” (RNA
switches): aptamer wiążący ligand plus platforma ekspresyjna, która transmituje sygnał
stanu związania poprzez zmiany konformacyjne. Przykłady: aptamery na 5’UTR
(untranslated regions) niekodującej części mRNA, który reguluje translację.
Kompleksy białko-DNA o bardzo wysokiej specyficzności od dawna były i są
centralnym punktem zainteresowania biofizyków i biologów molekularnych jako
podstawa zachodzenia i regulacji procesów ekspresji genu na poziomie transkrypcji i
transalacji oraz reakcji enzymatycznych z udziałem endonukleaz restrykcyjnych. Ze
względu na wielkość oddziałujących cząsteczek badania strukturalne ograniczały się
początkowo do fragmentów białkowych i oligonukleotydowych, które bezpośrednio
uczestniczą we wzajemnym rozpoznaniu. Obecnie określa się już struktury kompletnych
kompleksów (szczególnie kompleksów białko - RNA omówionych dalej). Według prac
przeglądowych znane są już struktury kilkuset kompleksów białko - DNA a ich ilość
szybko wzrasta. Kolejno będą omawiane charakterystyczne przykłady.
Kompleks fragmentu długości 69 aminokwasów białka represora faga 434 z 14
bp podwójną helisą DNA operatora zbadano rentgenograficznie (PLANSZA 135). Dwie
cząsteczki (dimer) białka wiążą się z DNA w postaci charakterystycznego motywu helisa-
skręt-helisa (helix-turn-helix), który stwierdzono również w innych kompleksach białko-
DNA. Motyw długości ok. 20 aminokwasów ma 6 AA ściśle „zakonserwowanych” we
wszystkich motywach rozpoznających helisy DNA o różnych sekwencjach
nukleotydowych. Jedna z helis motywu stanowi jakby platformę dla drugiej helisy, która
bezpośrednio wchodzi w dużą bruzdę DNA w konformacji B, przy czym DNA jest nieco
wygięte, mocniej zwinięte w środku o zwężonej małej bruździe. Wiązanie między
cząsteczkami zachodzi przez:
(a) wiązania wodorowe (5 wiązań) między resztami bocznymi glutamin 28, 29 i 33
oraz parami AT1, GC2, AT4 i AT5; dwie glutaminy tworzą wiązania typu podwójnego
76
(bidentate), gdzie C=O jest akceptorem a NH2 donorem protonu do par AT (N6H/O
4 i
N6H/N7), a trzecia glutamina jedno wiązanie (donor protonu) z O
6 guaniny pary GC z
wykorzystaniem akceptora do wiązania wodorowego w samym białku;
(b) oddziaływanie kulombowskie dodatnio naładowanych arginin (43, 41, 16) z
ujemnie naładowanymi tlenami grup fosforanowych DNA (mostki solne);
(c) oddziaływanie hydrofobowe grupy metylowej tyminy pary AT3 z hydrofobową
częścią łańcucha Gln29.
Dopasowanie powierzchni obu cząsteczek i właściwe wzajemne rozmieszczenie grup
funkcyjnych o odpowiednich ładunkach zapewniających oddziaływania są niezbędnym
warunkiem silnego związania cząsteczek w kompleksie; przy niespecyficznym
odziaływaniu nastąpiłoby odsunięcie obu cząsteczek o 2 ÷ 3Å.
Omówione charakterystyczne typy oddziaływań stabilizujących kompleksy białko -
kwas nukleinowy będą się powtarzać we wszystkich przypadkach, z różnym udziałem
każdego z nich. Częściej w przypadku kompleksów z RNA, a stosunkowo rzadko w DNA
obserwuje się:
(d) oddziaływania warstwowe (stacking) pierścieni aromatycznych aminokwasów i
zasad nukleinowych.
Tego typu oddziaływanie pojawia się w potrójnym kompleksie transkrypcyjnym
(struktura krystalograficzna) eukaryotów: fragment białka TBP, które rozpoznaje TATA-
box w DNA, fragment czynnika transkrypcyjnego TFIIB i 14 bp podwójna helisa DNA
zawierająca sekwencję TATA (PLANSZA 136). Białko TBP w postaci dwudomenowej
antyrównoległej -kartki tworzy strukturę podobną do „siodła”, która wiąże DNA od
strony małej bruzdy. DNA ulega częściowemu rozwinięciu i wygięciu między dwoma
załamaniami (kinks) wywołanymi przez dwie pary fenyloalanin (F165/F148 i F57/F74),
spełniające jakby rolę „klinów” między TA3/AT4 i AT9/GC10; dwie z tych fenyloalanin
stackingują interkalacyjnie.
Motywem białkowym, rozpoznającym sekwencję par zasad z dużym udziałem GC
jest palec cynkowy (zinc finger, PLANSZA 137): struktura superdrugorzędowa, złożona z
helisy i dwuniciowej antyrównoległej -kartki, utrzymywane przez jon Zn+2
skoordynowany poprzez 4 łańcuchy boczne cystein lub 2 histydyny i 2 cysteiny. Zwykle
kilka palców połączonych linkerami o różnej długości oddziałuje (Zif263; mause
intermediate early protein) z sąsiadującymi sekwencjami po trzy pary 5’-GCG TGG GCG-
3’. Helisa białkowa wchodzi w kontakt z dużą bruzdą DNA poprzez podwójne wiązania
77
wodorowe między grupami NH2 reszty argininowej (donory) i N7/O6 guanin. Dodatkową
stabilizację tego układu dają wiązania wodorowe „niezaangażowanego” protonu grupy
NH2 Arg z kwasem asparaginowym w samym białku. Palec cynkowy jest przypadkiem
struktury rozpoznającej zarówno DNA jak i RNA, ale sposób wiązania RNA jest inny:
palec wiąże pętle RNA lub helisy RNA poprzez reszty fosforanowe a nie zasady.
W przypadku białek dimerycznych jak aktywator GAL4 drożdży (regulacja
katabolizmu galaktozy) dodatkowym czynnikiem stabilizującym kompleks DNA - białko
może być zamek leucynowy (leucine zipper). Dwie amfipatyczne helisy dimeru
białkowego oddziałują ze sobą hydrofobowo (PLANSZA 138) poprzez alifatyczne
leucyny, rozmieszczone po jednej stronie każdej z helis. W rozpoznaniu helisy bierze
udział zmodyfikowany palec cynkowy stabilizowany przez dwa jony Zn+2
.
Charakterystyczny fold dwunukleotydowy złożony z helis i -kartki (dinucleotide
fold, Rossmann fold) zaobserwowano w strukturze wysoce specyficznej endonukleazy
restrykcyjnej EcoRI tnącej palindromiczny fragment d(GAATTC) zostawiając „lepkie
końce 5’-AATT i TTAA-3’ (PLANSZA 139). Wysoka specyficzność enzymu w stosunku
do sekwencji DNA jest oparta na bardzo rozbudowanej sieci wiązań wodorowych białko-
DNA.
Kompleksy białko-RNA. Mała (o rząd wielkości) ilość poznanych struktur
kompleksów białko - RNA w porównaniu ze znaczną ilością kompleksów białko - DNA
wynika głównie z opóźnienia metodologii syntezy fragmentów RNA. Jednak właśnie w
zakresie tych kompleksów uzyskano rentgenograficzne struktury kompletnych
rybosomów: bakteryjnego (70S; 2,7 mln Da, 3 cząsteczki rRNA, 54 białka; Korostelev et
al. Cell 126, 1065, 2006) i rybosomu eukariotycznego (80S, 3,3 mln Da, 4 cząsteczki
rRNA, 79 białek; Ben-Shem et al. Science 330, 1203, 2010), plus (w każdym przypadku)
2÷3 cząsteczki tRNA oraz mRNA; rozdzielczość dyfraktogramów ~3,5 Å.
Powszechnie występującą domeną w białkach wiążących RNA jest motyw RRM
(RNA - recognition motif; RBD - RNA-bindig domain) (PLANSZA 140), pokazywany już
poprzednio jako przykład foldu trzeciorzędowego (PLANSZA 111), w postaci -kartki
otoczonej fragmentami helikalnymi i pętlami. Przy wiązaniu RNA międzycząsteczkowy
stacking obejmuje 4 układy -elektronowe pierścieni i reszty carboksylowej:
Phe56/A11/C12/Asp92.
78
Inicjacja procesu translacji w eukaryotach zachodzi poprzez specyficzne
rozpoznanie struktury kapu na 5'-końcu mRNA (PLANSZA 141) przez eukaryotyczny
inicjacyjny czynnik białkowy eIF4E (PLANSZA 142). Motyw wiążący kap w formie
kieszeni hydrofobowej utworzonej przez wygiętą jak dłoń antyrównoległą -kartkę, krótką
helisę i pętle S1,2 i S3,4 przypomina motyw RRM ale nie jest z nim tożsamy. Kluczowym
dla specyficzności oddziaływaniem jest stacking kation- typu sandwich
(interkalacyjny) dodatnio naładowanego pierścienia 7-metyloguaniny między dwoma
tryptofanmi. Podobny stacking obserwuje się w szeregu innych białek specyficznie
wiążących kap, przy czym pierścienie tryptofanu mogą być zastępowane przez tyrozyny.
Trzy wiązania wodorowe stabilizujące 7-metyloguaninę do reszty kwasu glutaminowego
E103–COO(–)
i NH w łańcuchu Trp102 NIE decydują o specyficzności, gdyż pierścień
guaninowy jest zdolny do utworzenia tych samych wiązań wodorowych ALE nie może
zastąpić 7-metyloguaninowego.
Inne motywy zaobserwowane w kompleksach białko-RNA (których nie będę
omawiał szczegółowo) to:
- fold dwunukleotydowy (podobnie jak w kompleksie endonukleaza restrykcyjna EcoRI -
DNA) w formie pięcioniciowej -kartka i czterech helis w syntetazie glutaminylo-tRNAGln
jest odpowiedzialny za wiązanie części akceptorowej tRNA i ATP;
- PWI w formie wiązki czterech helis w faktorze białkowym SRm160 w splicingu;
- motyw k-TURN w U4 snRNA w splicingu (także w rybosomie): 3-nukleotydowe
wybrzuszenie (PLANSZA 76) pomiędzy kanoniczną helisą i niekanoniczną helisą z dwu
parami G:A.
Szereg prób krystalograficznych doprowadziło do uzyskania odrębnych struktur
dużej (50S) i małej (30S) podjednostki rybosomu bakterii Thermus thermophilus, co
umożliwiło skonstruowanie modelu atomowego pełnego rybosomu prokariotycznego ze
związanym mRNA i tRNA (PLANSZA 143: duża podjednostka - „prawa strona, mała
podjednostka - „lewa strona, mRNA - żółte, rRNA - pomarańczowe, trzy tRNA -
czerwone, szare i fioletowe w reprezentacji czaszowej space filing, główne łańcuchy
białkowe - zielone i niebieskie), potwierdzony przez strukturę pełnego rybosomu (z
dwoma tRNA) w pracy Korostelev et al. 2006. Rozwiązane struktury dostarczają wielu
informacji o:
- trzeciorzędowych motywach strukturalnych RNA i oddziaływaniach składników w
kompleksach białko - RNA, a w konsekwencji:
79
- mechanizmie funkcjonowania rybosomu: np. induced fit struktury rybosomu pod
wpływem przyłączenia tRNA ze znaczącymi zmianami konformacji w centrum
katalitycznym transferazy peptydowej, rybozymu 23S rRNA katalizującego syntezę
wiązania peptydowego.
Relatywnie największa ilość badań w dziedzinie kompleksów molekularnych była (i
jest) poświęcona kompleksom warunkującym zachodzenie reakcji biochemicznych w
komórce, czyli kompleksom enzym – substrat. Terminem tym określam wszystkie typy
kompleksów związanych z reakcjami enzymatycznymi, a więc również kompleksy enzym
– inhibitor, enzym – koenzym, enzym aktywator (allosteryczny). Wyróżnić tu można
zarówno kompleksy z udziałem enzymów białkowych i enzymów RNA (rybozymów) oraz
ligandów niskocząsteczkowych, jak i kompleksy enzymatyczne z udziałem makromolekuł
typu białko – kwas nukleinowy.
Zagadnienia kompleksów enzymatycznych i kinetyki reakcji katalizowanych przez
enzymy nie będą omawiane szczegółowo, a jedynie w kontekście projektowania środków
farmakologicznych „drug design” (dalsza część wykładu).
80
Wykład 13
Badania największych kompleksów typu struktur subkomórkowych (rybosom)
jest domenę rentgenografii. Największą strukturą dla której zarejestrowano rozwiązywalne
widma NMR jest kompleks chaperoninowy GroEL/GroES o masie 872 kDa (Flaux et al.
Nature 418, 207, 2002), dla którego już wcześniej rozwiązano strukturę w krysztale
metodą dyfrakcji rentgenowskiej. Znajomość struktur tak dużych obiektów molekularnych
jest warunkiem koniecznym, ale niewystarczającym dla pełnego scharakteryzowania ich
mechanizmów działania. Pozostawia to duże pole do badań dynamiki przekształceń
konformacyjnych, technik manipulacji i spektroskopii pojedynczych cząsteczek oraz
badań strukturalnych metodami mikroskopowymi (średni poziom rozdzielczości).
Przykładowo, śledzenie działania pojedynczej cząsteczki polimerazy RNA (RNAP),
kluczowego białka enzymatycznego w procesie transkrypcji, w różnych układach (assays)
(PLANSZA 144) ze szczypcami optycznymi i magnetycznymi stwarza unikalne
możliwości analizy molekularnego mechanizmu procesu w czasie realnym, w tym:
- obrazowanie pojedynczych kompleksów;
- monitorowanie przebiegu reakcji;
- śledzenie zmian konformacyjnych biomolekuł zaangażowanych w procesie;
- pomiary względnych odległości między działającymi cząsteczkami;
- pomiary sił mechanicznych.
Różne wersje bead-based assays z zastosowaniem pułapek optycznych i magnetycznych
do manipulacji odpowiednio paciorkami dielektrycznymi (polistyren) i magnetycznymi o
mikrometrowych wymiarach pozwalają wyznaczyć parametry ruchu molekuł.
(a) W TPM assay monitorowanie zakresu fluktuacji Browna paciorka przyczepionego do
DNA daje bezpośredni odczyt wzrostu długości DNA między paciorkiem i przyczepioną
do podłoża polimerazą RNAP, czyli translokacji enzymu po nici DNA.
(b) W optical trap assays z różnymi ilościami pułapek i paciorków śledzi się ruch RNAP
z dokładnością do kilku Å w czasie oraz mierzy siłę działania RNAP poprzez wychylenie
paciorka z centrum wiązki laserowej;
(c) W pułapce magnetycznej monitoruje się skręcenie podwójnej helisy DNA, jej
zapętlanie (plectoneme) oraz momenty sił mechanicznych skręcających helisę.
Nieco odmienne podejście metodologiczne w badaniach struktur subkomórkowych
o masach cząsteczkowych rzędu 50 megadaltonów (o rząd wielkości więcej niż rybosom
eukariotyczny) zastosowano do analizy kompleksu białkowo-lipidowego NPC (nuclear
81
pore complex), złożonego z 456 białek błonowych 20 różnych typów nukleoporyn (dwie
publikacje: Alber et al. Nature 450, 683 & 695, 2007). Podejście polega na „składaniu
struktury z kawałków”:
- zebranie danych eksperymentalnych za pomocą maksymalnej ilości dostępnych
metod, dostarczających informacje o kształtach skladników kompleksu, ich lokalizacji i
wzajemnych kontaktach: ultrawirowanie, immunoblotting, mikroskopia, modelowanie itp.;
- konstrukcja więzów przestrzennych na wzajemne ustawienia składników;
- optymalizacja zbioru dopuszczalnych struktur kompatybilnych z więzami;
- wybór struktury optymalnej.
Osiągnięcie podstawowego celu GENOMIKI czyli zsekwencjonowanie genomu
ludzkiego przesunęły priorytety wysokoprzepustowych badań typu „omics” w kierunku
PROTEOMIKI STRUKTURALNEJ: wyznaczanie maksymalnej ilości reprezentatywnych
struktur cząsteczek białkowych o określonych typach foldów. Wybór dotyczy grup białek
współdziałających na określonych odcinkach szlaków metabolicznych w celu
konstruowaniu molekularnych mechanizmów procesów biochemicznych (funkcjonalne
scharakteryzowanie przez strukturę SAR). Praktyczny cel badań stanowi zaprojektowanie
środków farmakologicznych (antywirusowych, antynowotworowych) na podstawie
znajomości struktur i oddziaływań w centrach wiążących kluczowych receptorów
białkowych czyli tzw. „tarcz” (rational drug design). Ośrodki badawcze w zakresie
proteomiki dysponują szerokim i zautomatyzowanym zapleczem w zakresie inżynierii
genetycznej (Proteomic Analyser firmy Applied Biosystems; PLANSZA 145),
spektrometrami MS, NMR i dyfraktometrami rentgenowskimi. Szacuje się, że światowy
rynek na aparaturę, materiały i usługi związane z proteomiką przekroczył $6 mld w 2005 r.
Scharakteryzowanie proteomu obejmuje szereg działań (PLANSZA 146).
(1) Identyfikacja białek wytwarzanych w komórce danego typu czy tkance:
- dwuwymiarowa elektroforeza żelowa
- spektrometria masowa do określenia struktur pierwszorzędowych
(2) Określenie współdziałania białek w ramach funkcjonalnych kompleksów, np.
metoda tandem-affinity purification (Gavin et al. Nature 415, 141, 2002)
(3) Wyznaczenie struktur przestrzennych białek:
- pozyskanie przez nadekspresję w bakteriach, innych typach komórek i systemach
cell-free odpowiednich ilości białek modyfikowanych stosownie do metody
wyznaczania struktury przestrzennej:
82
zawierających selenometioninę do badań metodami dyfrakcji rentgenowskiej
(rozwiązywanie problemu fazowego metodą MAD)
I/LUB
podwójnie znakowanych 15
N/13
C i potrójnie znakowanych 15
N/13
C/2H do badań
metodami wielowymiarowego NMR
znalezienie białek o znanych strukturach i odpowiednio wysokiej homologii
sekwencji do zwijania komputerowego (data base search)
- przygotowanie próbek, często przy zastosowaniu modyfikacji (mutacje, delecje
fragmentów):
krystalizacja do eksperymentów dyfrakcyjnej rentgenowskiej
uzyskanie rozpuszczalności w wodnych roztworach buforowych i buforach
zawierających micelle lipidowe (ciekłokrystalicznych) do eksperymentów NMR
rozwiązanie struktury: budowa modelu przestrzennego czasteczki i jego
weryfikacja.
Przykładowy schemat praktycznego wykorzystania zdobyczy proteomiki do
projektowania środków farmakologicznych ilustruje (PLANSZA 147). Racjonalne
projektowanie wymaga znajomości struktury przestrzennej białka-tarczy, którego
zablokowanie (lub uaktywnienie) przez poszukiwaną cząsteczkę ligandu wywołuje
określony skutek farmakologiczny. Jest to albo nowe białko, które pojawia się w
zainfekowanej komórce i jest kluczowe dla rozwoju wirusa (bakterii) albo białko
zmodyfikowane w stosunku do funkcjonującego w normalnej komórce, najczęściej w
przypadku komórki nowotworowej. Procedury proteomiczne umożliwiają wyodrębnienie
takiego białka, uzyskanie odpowiednich ilości do badań i określenie struktury, np. metodą
dyfrakcji rentgenowskiej. Znając strukturę centrum aktywnego białka projektuje się
cząsteczkę ligandu, który efektywnie wiążę się w centrum aktywnym i blokuje działanie
białka. Projektowanie opiera się na analizie kontaktów stabilizujących w kompleksie
białko – ligand: wiązania wodorowe, mostki solne, oddziaływania hydrofobowe. W
przypadku białek enzymatycznych projektowany ligand powinien wiązać się lepiej niż
naturalny substrat. Potencjalny środek farmakologiczny powinien być przetestowany pod
kątem działań ubocznych.
Wiele wysiłku włożono w badania oddziaływań białek enzymatycznych z
ligandami różnego typu. Wymiar praktyczny dotyczy poszukiwaniu inhibitorów
określonych reakcji enzymatycznych jako środków farmakologicznych o charakterze
przeciwbakteryjnym, przeciwwirusowym i przeciwnowotworowym. Nie będę omawiał
83
szczegółowo kinetyki reakcji enzymatycznych, która dla reakcji wielosubstratowych i
wieloproduktowych z udziałem enzymów o strukturze czwartorzędowej może być złożona.
Enzymy, białka i cząsteczki RNA tzw. rybozymy, są katalizatorami biologicznymi reakcji
w żywych komórkach. W prostym (wystarczającym na potrzeby wykładu) modelu
Michaelisa-Menten reakcji z jednym substratem i jednym produktem (PLANSZA 148)
kinetykę (hiperboliczną) reakcji enzymatycznej opisują dwa parametry:
- stała Michaelisa Km (wyrażona w molach/litr [M]) charakteryzuje powinowactwo
substratu do enzymu, tzn im mniejsza wartość tym lepsze wiązanie, podobnie jak stała
dysocjacji kompleksu enzym-substrat, oraz większa efektywność zachodzenia reakcji;
- prędkość maksymalna Vmax zachodzenia reakcji w warunkach nasycenia wszystkich
miejsc wiążących enzymu przez substrat, wyrażona przez ilość mol produktu na sekundę
i stężenie enzymu (w mg białka na jednostkę objętości lub ilość jednostek enzymu U na
jedn. objętości; 1U = ilość enzymu katalizująca 1 mmol substratu w ciągu 1 min w
warunkach optymalnych).
Parametry te można wyznaczyć z hiperbolicznej krzywej zależności prędkości v reakcji od
całkowitego stężenia substratu [S0] (w nadmiarze w stosunku do stężenia enzymu), w
uproszczony sposób korzystając z liniowej reprezentacji np. Lineweavera-Burke’a:
zależność 1/v w funkcji 1/[S0].
Inhibitory osłabiają działanie enzymu np. inhibitory kompetycyjne blokują
miejsce wiążące dla substratu nie ulegając reakcji i dają podwyższenie stałej Km. Miarą
dobrego blokowania enzymu jest niska wartość stałej inhibicji:
Ki = [E][I]/[EI]
[I] - stężenie wolnego inhibitora, [E] - stężenie wolnego enzymu, [EI] - stężenie
kompleksu enzym - inhibitor
Dla analogów substratu Ki jest rzędu Km, ale np. dla analogów substratu w stanie
przejściowym może osiągać wartości do 1012
M.
Enzymy są jednymi z możliwych receptorów, których zablokowanie daje
określony efekt farmakologiczny, np. selektywne zablokowanie enzymu kodowanego
przez wirusa (komórkę nowotworu) przy słabszym wiązaniu inhibitora przez enzym
gospodarza może uniemożliwić namnażanie i spowodować zniszczenie wirusa
(nowotworu) przez system immunologiczny. Od dawna poszukiwano inhibitorów metodą
„prób i błędów” modyfikując chemicznie związek wyjściowy o pożądanym działaniu, tak
aby zwiększyć jego efektywność. Projektowanie leków (drug design) w oparciu o znaną
84
strukturę receptora – „tarczy”, np. określonego białka enzymatycznego, jest zdecydowanie
bardziej wydajne. Przykładem może być fosforylaza nukleozydów purynowych PNP
(PLANSZA 149), enzym występujący od bakterii do ssaków, który rozkłada nukleozydy
purynowe do zasady i cukru przez przecięcie wiązania glikozydowego w obecności reszty
fosforanowej. Enzym tnie różne nukleozydy, a więc i podawane z zewnątrz środki
farmakologiczne, które często są pochodnymi nukleozydów purynowych. Podanie silnego
inhibitora PNP razem z takim środkiem podniosłoby więc efektywność jego działania. W
oparciu o znaną strukturę krystalograficzną białka udało się zaprojektować związek, który
oddziałuje silnie ze wszystkimi trzema fragmentami centrum wiążącego substraty reakcji.
Przykładowa analiza oddziaływań w części wiążącej zasadę oddaje charakter
postępowania. Zamiana guaniny na 8-aminoguaninę daje jedno więcej wiązanie
wodorowe. Z kolei 9-deazaguanina zastępuje jedno słabsze wiązanie silniejszym, a
ponadto uniemożliwia enzymowi przecięcie wiązania typu CC zamiast CN. Niestety,
obie zmiany jednocześnie: podstawienie 8-NH2 i zamiana N9 na C9 dają w sumie
niekorzystny efekt steryczny i pogarszają oddziaływania w stosunku do każdej ze zmian
oddzielnie. Optymalna okazuje się 9-deazaguanina jako zasada, chlorobenzen jako
„cukier” a reszta kwasu octowego jako odpowiednik fosforanu. Uzyskany w ten sposób
inhibitor ma Ki ok. 100 razy mniejszą niż wszystkie inhibitory znalezione metodą
konwencjonalną.
Procedura rational drug design na podstawie struktury tarczy w połączeniu z
testowaniem doświadczalnym tylko dobrze rokujących związków modelowanych skraca
ok. trzykrotnie czas od badań podstawowych do klinicznych zastosowań leku.
85
Wykład 14
Niezwykle interesującym przykładem biologicznego i medycznego wykorzystania
wysokiej specyficzności rozpoznawania wzajemnego (wiązania) biomolekuł jest
konstrukcja tzw. mikromacierzy (microarrays) lub inaczej chip'ów DNA i białkowych.
W obu przypadkach łańcuchy polimerowe jednoniciowego DNA lub polinukleotydu są
unieruchomiane jednym końcem na powierzchni: szklanej, krzemowej, złotej,
syntetycznego polimeru, przez odpowiednio dobraną cząsteczkę linkera. Weźmy jako
przykład mikromacierz DNA (PLANSZA 150). Każde miejsce próbkujące tzw. probe site
lub spot zawiera jednakowe cząsteczki biopolimeru (ta sama sekwencja) o określonej
gęstości (density) czyli ilości cząsteczek na jednostkę powierzchni, a cały chip składa się z
dużej ilości takich spots, każda o innym typie sekwencji. Ilość różnych sekwencji
biopolimeru na chipie warunkuje jego tzw. gęstość informacyjną (complexity); obie
wielkości są parametrami charakteryzującymi chip. Potoczna nazwa „chip” bierze się stąd,
że pierwsze tego typu obiektu były wykonywane techniką fotolitograficzną jak w
produkcji mikroprocesorów komputerowych (computer chips).
Chipy DNA są złożone z syntetycznych oligomerów długości do 60 nukleotydów
lub cDNA (complementary DNA) - produktów PCR (polimer chain reaction) o długości do
300 nukleotydów, które mogą wiązać komplementarnie (hybrydyzacja) pojedyncze nici
DNA lub RNA. Wykorzystywane są zasadniczo do dwóch celów:
(1) Genotypowanie (genotyping): porównanie sekwencji DNA na chipie i DNA w
badanej próbce w celu określenia jakie geny występują w tej probce lub jaka jest struktura
pierwszorzędowa jeszcze niezsekwencjonowanego DNA.
(2) Wyznaczanie profilu ekspresyjnego (gene-expression profiling): które geny w
tkance uległy ekspresji.
Przykład tego drugiego zastosowania pokazuje testowanie zmian ekspresji genów np.
wątroby jako reakcja na podanie leku. Chip zawiera DNA fragmentów tysięcy genów, po
jednym na każdy spot. Po pobraniu dwóch próbek komórek wątroby, do jednej wprowadza
się testowany lek. Następnie z każdej zbiera się mRNA, przeprowadza odwrotną
transkrypcję do cDNA i wprowadza na nie znaczniki fluorescencyjne, o różnym kolorze,
np. czerwonym dla cDNA z próbki potraktowanej lekiem a zielonym dla próbki bez leku.
Po wprowadzeniu znakowanych cDNA do chipu zachodzi hybrydyzacja chip-
DNA/cDNA, dająca informację które geny uległy ekspresji czyli uległy transkrypcji i
86
powstalo mRNA. Za pomocą skanera oblicza się komputerowo stosunek czerwony/zielony
w każdym spot i generuje kolorowy "wydruk":
- silny wzrost aktywności genu po podaniu leku - czerwony,
- silny spadek aktywności po podaniu leku - zielony,
- geny jednakowo aktywne - żółty,
- brak aktywności danego genu w obu przypadkach - bez koloru.
Mając dodatkowo różne profile reakcji dla znanych toksyn wątroby można porównać z
nimi profil testowanego leku i szybko wykluczyć go na podstawie podobieństwa profilów
(kolorowego schematu) i/lub wytypować „kandydatów” nietoksycznych.
Innymi przykładem porównawczego zastosowania gene-expression profiling jest
"prognozowanie" rozwoju nowotworów.
„Wydajność" hybrydyzacji w układzie chip / badana próbka jest na tyle duża, że
pozwala na charakteryzowanie indywidulanych (osobniczych) różnic w sekwencjach
genomów SNP (single nucleotide polymorphism). Szczegóły chemiczne i techniczne
produkcji mikromacierzy DNA podaje przygląd w Angewandte Chemie International
Edition 41, 1276, 2002.
Chipy białkowe (PLANSZA 151) oparte sa na specyficznym wiązaniu antygen-
przeciwciało. Unieruchomione na chipie cząsteczki przeciwciał w stosunku do
charakterystycznych białek kodowanych przez bakterie i wirusy wiążą takie białka w
próbce krwi. Dodanie fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał w stosunku do innych
fragmentów tych białek ujawnia związanie się antygenu i przeciwciał na chipie przez
kompleks typu "sandwich". Zabarwienie określonego miejsca na chipie sugeruje
wystąpienie w krwi antygenu pochodzącego od jakiegoś czynnika patogennego. W wersji
tzw. funkcjonalnych chipów białkowych wprowadza sie na chip same białka (a nie
przeciwciała). Szczegóły techniczne podaje przegląd: Zhu & Snyder Current Opinion in
Chemical Biology 7, 55, 2003.
Alternatywą dla konwencjonalnych chips przy detekcji nie tylko sekwencji ale
także różnych substancji są biosensory czyli „nosy chemiczne” (Current Opinion Chem.
Biol. 6, 816, 2002).
87
Podsumowując wykład, zwracam jeszcze raz uwagę na kluczowe zagadnienia
współczesnej BIOFIZYKI MOLEKULARNEJ (PLANSZA 152), zarówno w wymiarze
badań podstawowych jak i zastosowań biomedycznych i biotechnologicznych.
W wyznaczaniu struktur przestrzennych biomolekuł: szczególnie białka błonowe,
włókniste i agregaty amyloidalne stanowią prawdziwe wyzwanie metodologiczne.
Olbrzymie bogactwo struktur obserwuje się dla świata cząsteczek RNA, a szczególnie
intensywne badania strukturalne DNA dotyczą sposobu organizacji podwójnej helisy w
strukturę chromosomu na poziomie zwinięcia nici chromatynowej - domeny chromosomu
bakteryjnego i chromosomu eukariotycznego.
Zwijanie białek to charakterystyczny przykład ścisłego współdziałania metod
doświadczalnych i komputerowych w poszukiwaniu mechanizmów zwijania i ich
wyjaśniania na gruncie fizyki oraz przewidywania struktur przestrzennych na podstawie
sekwencji aminokwasowej.
Zastosowanie metod single molecule w zakresie spektroskopii fluorescencyjnej,
obrazowania i manipulowania stwarza unikalne możliwości śledzenia skomplikowanych
procesów biologicznych na poziomie molekularnym.
Badania nanoukładów biologicznych zaczyna mieć kluczowe znaczenie w
dostarczaniu środków farmakologicznych do komórek i tkanek oraz konstrukcji wysoce
zminiaturyzowanych układów elektrycznych i komputerowych, w tym w systemach
hybrydowych z półprzewodnikami.
Nieinwazyjne obrazowanie tkanek i narządów oraz procesów które w nich
zachodzą dają możliwość jednoczesnego wglądu w anatomię i morfologię dla celów
diagnostyki i terapii.
Recommended